Разработка метода препаративного выделения аминокислот из белковых гидролизатов микробиологического происхождения с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ км. М.В. ЛОМОНОСОВА

Специализированный совет Д 063. 41. 01

На правах рукописи

Егорова Татьяна Анатольевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПРЕПАРАТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ КЗ БЕЛКОВЫХ. ШР0ЛИЗАТ0& МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПОМОЩЬ» ОБРАИШО-ОАЗОВОЙ ВЭП

Специальность 02.00.10 - Бноорганическая химия, 1иыня природных

,н физиологически активны! веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1993

Работа вквояаека на кафедре биотехнологии Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной академии гонкой химической технологии иы. Ю. Ломоносова.

йоучннй руководитель: доктор нш чески наук, профессор Звонхова Е.Н.

Официальные оппонент в: доктор хедических наук , профессор Мярошпиков А.И. кандндзт Онологических наук, вод.науч.сотр. Складнев Л.А.

Еедущая организация: Институт биотехнологии н бкофармации. А/0 Биотехнология.

Защита состоится "15 * нояЗря 1993 г. в 15 час.

\

на заседании специализированного совета Д 063. 41. 01 прк Московской ГосударС№йШйа£ академии гонкой химической технология тш, К.ВЛЬиокоСоНй1 вЧ?5?Г, Косова, нр-т Вернадского, 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 1СИТХТ ни.

■ > '

¡ОЛомойосова (119831 ?Йск'ва, ул. И. Пироговская, )}.

Автореферат ра-ослан * " _октября 1993 г-'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. В настоящее время болыюй научный и практический интерес представляет комплексная переработка биомассы и оптимизация препаргтивного получения аминокислот. меченных стабильными изотопами, из белкоьых гидролизам- различных микробиологически! источников о примеаением современных методов разделения таких как ВЭНХ.

До сих пор основное внимание исследователей сосредоточено на разяаботхо с помощьп ВЭКХ микрометодов анализа белковых и пептидных гидрог-затоз. д™ препаративного разделения аминокислот главным образом . вриаененялась ионообменная хроматография, обраще-нпо-фазовая ВЭЖХ использовалась в ограниченной степени. Представляет интер с реализация преимуществ нрепаративной обраиенно-фазовой ВЭХХ при получении оптически ак*ивных специфически мэчен-иих аминокислот и их производных в коль яствах, необходимых для биохимических, бсокедшдоских гсг ледований, изучения их метаболических путей в организме с использованием системы биологического мониторинга ¡n vivo.

При ВЭХХ разделения аминокислот яярово применяется предколо- ' ночная и псслеколоночн.я модификация аминокислот. Лля послеколоно-чной уодификации главным обрагоы используется нянгидряч и ортофта-левый альдегид (OPA), флуорескамиа, а для вредколоночной - в основном OPA, флуореюшаетилкарбонилхлорид (ШС-СЬ), фенилизотсоциа-нвт (PITC), дйметиламиЕонафхалинсульфонилморид (DAlío-Gl), дике-тилзииЕаазобонзолсульфонилхлорил (DABS-CLJ, нитроЗензоксодиазол-фторид (НВВ-Р). Кроме того, описано применение, метилнзогиоциана-та, дкфекилинденонклизотиоциаяата.(115), дкметиламигоазобензолизо-гиоцианата (ГАВ.Т5С), нэфтилхлорформиатэ (Ш), Л-сукцкнимидал-Г-

нафтокскацетага (SNA).

Нами выбран в качестве модифицирующего реагента карбобензвк-сихлорвд - высоко реакционноспосоОный реагент, который используется для введения защит аминогруппы в пептидном синтезе. Бензилок-сикарбонильные производные аминокислот сравнительно легко получаются, довольно устойчивы, кроне того, бензилоксикарбонильпая ааши-та легко удаляется. При удалении этой защиты получаются оптически активные аминокислоты., что трудно достигается при использовании других модифицирующих реагентов, условия удаления которых часто приводят к образовании рацемических смесей аминокислот (PIIC, FM0C). Следует отиетить, что карбобензоксихлорид существенно дешевле других модифицирующих реагентов и более доступен.'

Настоящая работа выполнена ь райках плановых исследований, проводили на кафедре БХ ИИТХГ по теме N 107-866/П-3.1.17 "Биосинтетическое получение изотопно-меченных аминокислот и других биологически активных веществ из кикроводорослей и микроорганизмов" в рамках PHTII "Наукоемкие химические технологии'.'

Цель работы.состояла в разработке эффективного препаративного метода выделения оиинокгсдот из белковых гидролнзатов микробиологического происхождения с помоцыо обрацеино-фазовой ВЭХХ с предко-лоночной модификацией в виде бензилоксикарбошшных производных.

Научная новизна г практическая ценность. Разработан новый метод разделения стандартной снеси аминокислот в виде Сензилоксикар-бонильных производных с помощью обраденно-фазовой ВЭХХ в режиме градиентного актирования в аналитическом и препаративном варианте, а такае методика предколоночной дэриватизации стандартной сиеси аминокислот.

Применимость метода показана на примере выделения десяти ами-

нокислот с хроматографической чистотой не менее 96 % из гидролиза-та уреазы из соевых бобов.

Практическая ценность разработанного метода продемонстрирована в ходе препэратизного разделения с помощьв ОФ ВЗ£Х бензилокси-карбонильных производных аминокислот из гидролизатов белков, получениях из биомассы различных микроорганизмов (зеленых микроводороСЛей Chlorella sp. К., Dunallella salina, ЦИЭНООаКТерИИ Splrulina platensls, галобактерии Halobacterluw haloblum, меТИЛОТрОфНЫХ МИК-рооргаиизмов - Hethylobacl1¡us Г1agel¡atura, Brevlbacterium meihy-iicum ), а также при выделении секретируемых аминокислот - фенил-аланина, лейцина, образующихся в ходе ферментации мутантов метило-ТрОфНЫХ микроорганизмов Brevibacterlunt methyílcum. При ЭТОМ ВО всех случаях аминокислоты получены с высокими выходами и хроматографической чистотой порядка 87%.

Нэ примере разделения дейтерий меченных аминокислот белкового гидролизата Methylobacillus riagellatum Показана ВОЗМОЖНОСТЬ Применения разработанного метода для получения аминокислот, меченных за счет биоконверсии CD30D и Ю20. Разработанный метод может быть применен к разделение аминокислот других изотопно меченных белковых гидролизатов.

На защиту выносятся слэдущие полоаэния:

1. Метод аналитического разделения стандартной смеси 20 бея-зилоксикарбонильных производных аминокислот с помощью сбращекно-Ф330В9Й ВЭ8Х.

2. Методика предколовочной дервва'гкзании стандартной смеси аминокислот.

3. Подбор условий для препаративного разделения эквимолекулярной смеси 16 бензилокенкзрбошшлшх производных аминокислот с но-

ыощьв оОрааенао-фазовой ВЭХХ.

4. Применение разработанного метода на примере выделения чистшс аминокислот из гидролиза?а уреазы из соевых бобов.

5. Адаптация метода для препаративного выделения аминокислот, в той числе меченша стэбвльнкш изотопами, из гидролизатов белков ынкрооргашшюв, а такие из культуральной жидкости продуцентов отдельных аминокислот.

¿дробацая. Результаты исследования били доложены на Путинских чтениях по фотосинтезу н конвенции стран СНГ "Структурво-функционзльиэя организация фотосвнтетически1 иеыбран и их моделей" (иай, 1993), паучноы семинаре Международного Сооза "Экология человека" (Москва, сентябрь, 1933), VI симпозиума по молекулярной сидкостной хроматографии (Москве, октябрь, 1993).

КуДдккпцкк. По материалам диссертации опублшсоваиы две статьи, тезкси одного доклада.

Обгоу а структура работы. Л^ссертацея состоет вз следушпх разделов: ваодсагвч, сбзор, обсуаденЕв результатов,

жящ&лпшхн&рчазт.вив .агхгск лптсрагури. Работа цзяш-азнил'&Р (Яркзаег- дошкмдоаого-- ии», вышчая /^"таблиц к рлоуюов^. (йкмда цг5кру&ыо2'' гюгоргту^Р содэп^цт^/^сси^.э!'..

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСШЕНИЕ 1. Подбор условий разделения стандартной сиеси бекзилоксикарСсяи-лыш! производных аминокислот а аналитической варианте. Методика продколопочной дериватлзацин.

В процессе применения практически любой реакции предколоноч-но8 модификации аминокислот используют в первую очере..ь производные по а- и с-аминогруппам. В ряде случаев модифицируются и другие реакционоспособные группы, содержащиеся в Соковой цепи трифункцио-налъных аминокислот, например ииидазольная, фенольная, гилро.чсильная, сульфгидрильная. Образование «оно-, ди-, три- производных для некоторых аминокислот существенно затрудняет идентификацию пиков в хроматограммах 1 ВЭЖХ. Поэтому мы специально - получили ди-г-производные, лизина, тирозина, серинэ, треонина, гистидипа, цистеина, три-г-производное аргинина и изучили их в режиме хрока-тографирования. Реакцию бензилоксикарбонилирования отрабатывали на отдельных аминокислотах и стандартной смеси аминокислот в условиях 4-5 кратного избытка карбобензоксихлорида (г-СЬ) в сильно иелочной ! среде при рН 9-1 ь. При этом образовывались производные ! з,»-трябензилоксикарСонил-Ь-аргннинз, а,е-дибензилоксикарбонил-1-лизина, /т,з-диОеазилоксикарОонил-Ь-гистидина, Н,5-"дибензнлокси-кэрбонвл-1-цистеина. Для тирозина, сервна, треонина наряду с моно-провзводакми было характерно наличие ди-г-проазводннх: О.Н-диОензидоксикарбонил-Ь-тироззиа, ОД-дибеязилоксичарСонил-Ь-серннэ, О.Я-дябензилокснкарСокил-Ь-треонинз.

При проведении предколоиочвой модификации аминокислот учитывалась необходимость проведения деривзтиззаии до конца, необходимость удаления избытка реагента до разделения, а также устойчи-

вость модифицированных производных, так как задержка между дерива-тизаиией и инжекцией сильно влияет на результаты, что особенно существенно для производных гнстидина, ди-2-нроизводиые которого неустойчивы и при задержке между дериватизацией и инхекцией Солее чем на 20 минут усложняется идентификация пиков в хроматограммах ВЭКХ. При работе с цистеином предварительно его окисляли до .истина и получали в ходе дераватизации устойчивый в используемых условиях B3SX ли-г-цистин.

При разделении эквимолекулярной смеси 20 бензилоксикарбоииль-них ароизводни аминокислот на кидксстнои хроматографе фирмы "Knauer" (Германия), снабкеннок насосом "Knauer", 5Ф-детекторон 2563, интегратором C-R ЗА (Shlnadzu, Яаония) и самописцем TZ-4620, ии прснеля; ряд экспериментов по выбору условий ВЭНХ, а именно: подбор неподвижной фаза, элюзвта, режима элонрования.

При разделении бензилоксикарбоннльвых производных аминокислот^ использовала следующие колонки; лнхросфер ,100 RP-18, 5 шш, 15 » 150 мм ГНегсК"); лахросорО RP-18, 5 мкм, 4.6 «"250 ми ("Knauer"); дкасорб 130 08, 7 мкм, 4 « 150 мм (ШПО "Элснко"); сепарон SGX СЮ, ? мкм, 3 » 150 игл ("Кота". ТСФР) : эконосил CJ8, 5 мкм, 4.6 « 250 ым (МНПО "Злсйко"); гиперсил ODS, 5 мкм, 3 « 250 мм (ШПО "Элсико"); силасорб СЗ0, 12 мкм, 10 « 250 мм CKova", ЧСФР).

При элвировании использовали систему растворителей с добавлением трифторуксусной кислоты для подавления дассоцпаЬг; болеплок-сикароонильных груса жинокислот. Как известно, СвпзЕ-'.j¿сьнарбони-льная защита симаетс-я ® кислых условиях. В нашем сл/'/cj прп используемых концентрациях трифторуксусной кислоты снятие боизплок-сикарбонвльной защити представляет собой процесс длительнш! и значительно превышает врекя анализа. Элвированве проводили системами

»гстворителоЯ: . - '¿ода/трвфторзкоуовая кислота 'lOü / 0.1-0.5 v/yb В - эцетонитрял/трифторуксусная кислота (100 / 0.1-0.5 v/v) при различиях градиентных рзжимах. Бензилокс..¡арбонилььый производные аыиюкислот детектировали по поглощению прл 254 нн.

Как известно, в условиях "бращенно-фазовой хроматографии прй нзскратическом реяиме хороно рэзделягтся только такие соединения, которые значительно отличаются друг от друга по полярности. Поэтому разделение бензчлоксякарбонильных производных аминокислот мы про^дили в режгче градиентного эл.оированкя, при этом руководствовались следующими возможностями оптимизации условий: состав элген-"э в начале разделения, фо^ыз градиента, состав злтента в ксние разделения, объемная'скорость, программирование времени (рис. 1ь

Наилучиее разрешение достигается при линейном грчдиенте от О до 60 % В за 60 минут, при этом удается разрешить трудно разделяемые аары Ser/Thr, которые на разреаартся при лнЕейном градиенте . от 0 до .00 %. Трудности, возникиие яри разделении "he/leu/De, ми попнталиы преодолеть путем соответствующего выбора неподвижной фазы, такке меняющей селективность и разрешение при разделении. Поскольку нэибольоее. распространение получили обращенные фазы с углеродными цепями 018 и С8, намг проведено разделоние бензилоксп-кгрбонильных лроизводных не ряде неподвианых фаз. Проолгш, возникающие при разделении гру..ь Ser/Glu, Tyr/Iro, Het/V&l на реподвиж-ных фазах лихиосорб С18, сепароя S0X 8, разрешаются при использовании для разделения зконосил С18 и гипсрсил ODS, хотя гак и не удалось достичь успела при разделении груэпы ibe/Leu/Ile.

30 40

Рис 1. Раздеяевш эквишшхулярной сиеси 20 бензилсксикербо-нильных проигводинх ашшоккскот иеюдси обраценно-Овзовой ВЗХХ.

Неподвмаая фаза: эконооил С)8, 5 шш; 4.6 « 250 им; эл»ент; А - водь/ТМ (100/0.5 v/y), В - ацетодигрил/ТФУ (100/0.5 v/v); градиентное аяюированиэ от 0 до 50 X В за 60 мин, от 60 до 100 * Б за 5 мин; скорость потока 1.5 мл/мен. 1 - Gin, 2 - Asn, Э - Авр, 4 - Glu, 5 - Ser. 6 - ïhr. 7 - Gly, 8 - ¿la. 9 - Н1в, 10 - Pro, 11 - Туг> 12 - Val. 13 - Hat, 14 - РЬе. 15 - Lett, 16 - lie, 17-Trp, 18- lye, 19 - Cys, 20 -Arg.

2, Препаративное разделение эквимолекулярной cuera le бензшшхсвкарбонильинх производив! аминокислот.

Как известно, гидролиз белков кислотой или велочью приводит к потере некоторых Аминокислот и их производных. В общепринятых условиях исчерпывающего гидролиза (6 н HCL, 18-24 ч, 110 С) полностью рааруизвтся триптофан, аспарагин, глугамип, частично теряются серии, треонин, тирозин, поэтому условия препаративного разделения мы отрабатывали на эквимолекулярной смеси 16 аминокислот: Asp, Glu, Ser, ihr, Gly, ¿la, Fro, Туг, Met, Val, Leu. Ile, Phe, Lys, Arg, Hid (рис. 2). Прямое масштабирование оптимальных аналитических условна для препаративного разделения грйводило к сливкой длительному временя анализа и нзлипнему расходу злиентов, поэтому мы использовали Coxèe крутые формы градиентов (рис. 2). Данный градиент представляет собой компромисс между разрешением и временем анализа.

3. Исследование гидроляэага уреззы из соевых бобов,

В качестве модельного белка нами была выбрана удеаза из сое-акх бобсв, в торой представлены все аминокислоты СЬб 1). Мы ст.звили перед собой звдачг получить оптически активные а мичо кис лоты, поэтому гидролиз уреазы проводили в условиях исчерпывающего кислого гидролиза.

Дериватиззцив гздролизата уроазы проводили з услопиях 5-кратного избытка Z-CL, при этой образовывались производные трибеч-зилоксикарборчларгинина, дибензилоксикарбошшизинэ, дибевзилокси-карбонилгистидина, дибензилоксикарбонилтярозянэ.

» ,1шн

Рис. 2. Препаратзвнсе разделэнкь эквимолекулярной смеси 16 ОензилоксакарСонЕЛьнш йроизЕодие: а^шюг.ислот шзтодок обрацеиио-фазовой ВЭКХ.

Неподвижна)! ф»за: оиласорб С18, 12 мкм. 10 « 250 ям; элдент: А - всда/ТМ (100/0.5 v/\), В - ацетониарил/ТФ¥ (100/0.5 v/v), градиентное элвлрование ог 10 до 80 * В за 30 минут, от 80 до ЮС % В за 5 минут, скорость потока 5 ил/мня. i - Asp, 2 - Glu, 3 -Els, 4 - Ser, 5 - Ihr, 6 - Gly. 7 - ¿.la, 8 - Pro, 9 - Туг, 10 -Met, 11 - Val. 12 - РЬе, 13 - leu, 14 - Ile, 15 - lys, 16 - Arg> '

èiaz.s~>zssoTKiâ caerás усчазг. яз ccrel-j colon. Гезу.-ьгзтн йрепзрзтггпого рзздзлгяня csir^arxn'tsTConinbTbX пропзь^лккх

! ÍV2 .C'.'.TZT.QZZ V j - "."j "i ' « « ЗКХОД, Ï

ilz S. V ..... 75

¿sp 16. 56

Are i. ó 68

Суз ' i Q -

Glu 13! 3

Gly 9. 4

bis lie leu ?.. 5.' 3 8 1 'б5 £5

lys 8 79

Set 2. 6 - Í

Pie 2. 3 -

Ггг 5. 0 53

Ssr , 5. -

îhr • 6.

Trp 0. S " í¡

Туг 2. 5

Val 6 75

выход приведен для сьибодных ачяиокталог поело спятйя z-зааиты

ПропаратквЕсз разделение дерзват?скропанного пшшизата уреазы было проведено в две стадия: градиентное элв'ированио с последующей рехроиатографией ^слученных фраш;а з ябскратэтесклх условиях (для фрэкииз 1-5 прБ ¿1, 29. 43, 47, 52 % В соответствен? i/o) (рис 3). После рехромэтографеи }далось аочупзть Сензилоксякир-ронильиве зроиззоляве ¿зр, 51«. Ala. Val. Ile, leu, ¿уз, ¡ra-

u

í.keh

Рис.3. Препаратявное разделение бензилоксакарСойильша производных аминокислот гидролизэта уреааы из соевых бобов мчтодом обрацвЯЕО-фазозой ВЗКХ.

Незолвийная фаза: силэссрб С18, 12 кяи, 10 • 250 мы; элиент: А - всда/ГФУ (160/0.5 7/v), ь - ацетснятрнлЛФУ (100/0.5 v/v); градиентное слюирование от ,0 до 80 X В ьа 30 минут, от 80 до 100 % в па 5 «ину*. ..Скорость потока Г> нл/мга. Еихи 1, 2, 3. 4, 5 -сы. таб. г. ■

Рехроматографкя фрякций I - 5 Сеязилогссикарбоянльяых производных аминокислот гидролязата уреази из ссевых Сооов.

номер пка . аминокислотный состав • чистста %

1 Asp / Olu, 1 : 1 96

г Gly 95

Ala 98

3 Val .,96

4 leu / lie, 1:1 9G

5 Lys 98

дивндуольность которшс была предварительно опэнена с помощью ТСХ, а затеи доказана аминокислотным анализсм поело снятия бензилокси-харбонпльной защити. (Тгб.2).

Аминокислотный анализ проводили на жидкостном хроматографе фирмы "Вбскшап" (США) . модель "Gold system" по методике Plcotag фирмы "Waters"(США). обращзнно-фазовое разделение РИС-амниот-ло*. детектирование при 254-269 нм, Разработанным метозом удалось препаративно выделить десятки миллиграмм бенлиюксЕкзрбоняльннх производных аминокислот иг нескольких сотен миллиграмм гидрэлизатг уреазы. (

Л?'-, -г-./ц.;:- - -v. .oc.t.io? .i ьядь йонзалокс

нча в10'»зесдкч1- мь 6äi.:'->es;s г/./ьолиза-гоа ра&лачкн1 ус^очеикоз и Культуре ibircS Hi.'.iOCTi! ttrovibbclerlnn netiiylicum.

Т?л; кjл п^я paf'Oü's о бяомасо'.-2 возникают пробпемы, связанные с очнсгко£ от сопугстяуаюк Ееи*от2 пр? Еыделеяии белков, необходимо Очло ириг/снять различные подходы при выделении суыы белков из расичных источников.

Рнбор подсодяадгс метода выделе na;i бельй иолесообрезно осу-1.зссвля'хь с учетом особенностей бкс-логичаского ксточнгка, из которого его можно пплучиь. Ггдрофобиый интегральный Оелок Сэнсрио-

• рОДОПОЕБ ИЗ пурпурных-Keuöpau Halobscleri um haloblum БЫДСЛЛЛИ CO

^сбилкзацией препарата пурпурных .тембрзц в О.Ь 8 растворе доде-цглоульс$ата нзтри.ч о последующем осаждением белка метанолом.

При аад'ЗленЕЕ фико5илипротеипов - светособдрэюаш пш^ентоь сиье-зедаяъх ас ю-юслсй Suirmina pi. - клетки суспендировали в tdас - буфере , цент^нфугировали с воолмуэдэй экстренней фи'чэби-чилрог-ейноз Tpic-öjöepoi-. С^рой экстракт, содерхьике фикобилипро-теан^, которое ясляюгси водорйствсрпмюн белками, отделяли от хло-рофиллов уль'рацеитряфугировэЕи-зу илк аростын ьишззнием белков водой аз рбзруиеаяш клеток.

Яря'Быдэлеьм $ралции сунмарши белков из биокасс-ц растительных >'икроойгаки&моЕ&( зеленых ипкроводорос-г.ой Chlorella sp, к., cu/isiieiia nan os, HKahcöbvrepaii Sri-unna pj.) учитывалось наличие в ниц угле во дол. 11?. ки асаодьгов&лЕЗь богатые белкои иаммп со сравнительно кебслыш! содерказиен углеводов в них, гидролизу в 1'.гчестьа фракции оумаарных белхв чопо^гглк остаток гс-сде нечер-.пчзаюцего отделения пигментов а лэтшкоь экстракцией. 3 других ол„-

чаях для полного отделения от полисахаридов прибегала я ос задели» белков. Количество углеводов оценивали, используя антроновый метод.

При работе с метилотрофнкмя микроорганизмами Hethyiobaciilus tlagellatum, Brevlbactertum methylicum ГИДрОЛИЗу в качестве фракции Суммарных белков подвергали остаток после исчерпывающего отделения лшшдов экстракцией.

Общая схема выделения аминокислот представлена на рис 4. Основные этапы заключаются в культивировании микроорганизмов, разрушении клеток полученной биомассы, выделении белков с последующим гидролизом, дериватизации гидролизата с помощью бензилоксокзрбо-нилхлорида, разделении суммы бензалоксвкарбонильных производных с помощью обращенно-фазовой ВЭНХ с получением индивидуальных Z-производних или свободных аминокислот после снятия Z-защиты.

Во всех случаях гидролиз белков проводили в S н HCl в течение 24 ч. при 110°С. Ери работе с тог-альио меченным Озлеом из Hethyio-baciïius tlagellatum, для предотвращения возможного D-H обмена для гидролиза использовзли б н дейтеросоляную кислоту (DC1).

Лериватиззцзв гкдролззато'з и секрзгаруэмнх аминокислот лиофа-лизнрованной культуральной яидкссти проводили по разработанной нами методике, причем секреткруемке аминокислоты культуральной жидкости выделяли в свободном виде sr.и деривагизировали остаток ли-офилизирозанной культуральной жидкости, что значительно упрощало отделение 2-пропзводных аминокислот от метаболитов и других компонентов преды.

Препаративное разделение Z- производим аг,:чкнгслот выполняли нз колонках Hypsrsyl ODS, 5 мгм, 3 s 250 мм, Silasorb С18.12 мкм, 10 х 250 см. с вослс-луте!* гиярочэтсграС'-оИ схэтязх фровшй!.

Индивидуальные Z-правзводные аминокислот Рис 4. Общая C2GH3 выделения ^игкокяслот кз белковых гидродизатов и культурагьноЁ ikïkoctk.

Данные по выделении аминокислот из различных источников представлены в таблице 3. Хроматогрэфическое разделение амипокислот также проводили в условиях, исключэюаих возможный Ю-Д обмен.

Развитие изотопно-чувствительной техники - прежде всего ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрии (НС), ИК-спектроскопии Фурье - способствовало более интенсивному использований веществ, меченных стабильными изотопами. в биофизических, биохимических, Сиомедицинских исследованиях разнообразного характера.

Отсутствие радиационной опасности и возможность определения локализации метки в молекуле прямыми методами создают тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов по сравнение с радиоактивными.

Аминокислоты, печенные стабильными изотопами,, используются в исследованиях пространственной структуры белка, метаболически и фзркакологических исследованиях, медицинской диагностике, .синтезе меченых пептидных гормонов п нэйротрзномиттеров. Мзченко аналоги аминокислот удобна для изучения истодами ЯИР-спектроскории конфор-мацик биологически активных певтидов, химических и динеыаческвх свойств индивидуальных остатков аминокислот, изучения взаимодействия биологически активных пептидов с рецепторами и другими макромолекулами, важными в проявлении биологических свойств физиологически активных соединений.

Ключевым моментом в исследованиях с участием змпног:слот, меченных стабильными изотопами, является разработанность самих методов получения. Наиболее подходящими источникам!! печенных биологически активных соединен::?, являются гтроЕодоросп п кетилотрофнув микроорганизмы, раступяе на ерглх, содорпгзах т-оченяге субстрата.

Выделение аминокислот белковых гилроляззтов из различных источников в ьидо бензилопсикьрбонильпых производных с помощь» Oi ВЭКХ.

0 б Amrkokkcj 0 T к

18ПИ KËÇ/ Glu Cly Aie тут гго Val Leu île Iho a rg lys

Зеленые Chloreliii sp. К ^ + . + + + + + + + + + X

мпг.рово доросли Dunaliella sali па ^ + + + t + 4- + + + +

Цяанобактерап 2 Spinjlina рГ. (фикобиллпротенны) + -r + + + + + + + + +

ГалоСактеркя Halobactcrium hclobium + + + ■f + + + + + + +

Кэтклг -рофяые }fr khylobaci 2 lui: FlagalJatum ^ ' + + + + + + + + + + +

мккроорганкзмы

Brcvibncte. ium J melhylictm - - - - - - + - - -

биомлссы золоиых микроводорослей, нетилотрофиых микроорганизмов, пурпурные мембраны галобактерик Hdlobacterium halobiua, бЫЛИ ЛЮбОЗНО ПреДОСТЭВЛеНЫ СОТруДНИКЭНИ КВфОДрЫ БТ ДОЦ., K.X.II.

Карнауховой Е.Н., u.c., к.х.н. Мизшной ИЛ!.

2 эта часть работы выполнялась в Ордена Трудового Красного Знамени Институте Биопрганической Химии им. М.М. Иемякииа и Ю.А.Овчинникова под руководством ст.н.с., к.б.н. Харченко С.Г.

3 данные приведены для выделения виннокислот вз культуральнов жидкости.

Таблица 4.

Выделение аминокислот из белковых гкдролизатов и культуралъког жидкости различных историков в ьиде беизилоксикарбонилышх производных методом обрадепяо-фззовой ВЭ2Х.'

Аминокислота Объект Содернание % на aöc.cyx. биомассу Выход ы Чястота 0! *

t 2 3 4 5

Фикобилилротеины ( Spiral Ina } 5.3/8.2 71 93

Asp/Glu Суммарные белки ( Chlorella ) 4.3/3.6 73 94

Суммарные белки (Methylobaclllus Clagellatum 3.8/4.6 74 95

Фикобилипротеияк ( Splrullna ) 4.2 79 86

Ala Суммарные белки ( Chlorella ) 4.1 73 85

Суммарные Селки (Wethylobaclllus fiagellatum) 2.7 74 87

Фякобилипротешш ( Spiralina ) 3.1 75 32

г Tal Суммарные оелкя ( Chlorella ) 2.7 73 93

Суммарные белки. (Methylobaclllus flagellJtumJ 1.8 71 89

t 1 г 3 л 5 !

> Php. • Kj'JiLTypaJifcHai SBlKOOTi (Srcv Itiicterlvm ire t hyi i cum) 0.6*. 03 96

CyMi.:sptius OejK!< (Hut tiylvbjct 11 us flageli»tun, ■ 1.8 79 93

Arg {HK&tfH-Mioorerew ( Cpirulina ) Cyr iapHkv OewtM i Chloralla ) 3.7 3.1 69 68 85 88

SHKO^HJianpcTCKHK (ilpi rul Ina) 2.6 74 BS

Lys CyrWf:pHLTe CeiKH ( Cfilorc! 13 ) 3.3 73 H?

CyMM3?ainj flejiKH (Met hylot>a>.il 1 i/s D^grellaiVn) 3.1 75 92

$SKo(5EJiMcci-eHi'.w ( Splrvl.'na ) 4.5/2.7 . 6S 89

Leu/lie CyMvapHU? itiflKH ( Chi ore1'J ) 4.1Л .6 73 86

CyfeuapEbre ce.iKH {Ke t hvloba ci Jltis riagollatum) 2.9/i.7 73 86

* данные привалены з г/л культ.уралькой жидкости

Хрэматографическое разделение лсЗтерий меченных амянокчелот из униформно меченного суммгпног.? белка бчэмгссы факультативного метилотрофа heihylcbactllus { ■ agellatLfn- К.улЬ'сивнровмного на синтетических средах с 2 $ CD30D 5 р&зличаьши «онцегтрацпями Р20 (99.9, 7Ь как и следовало ожидать, не отличается от разделения аминокислот гкдрелязатэ немеченого суммарного белка микроорганизмов, поскольку изотопное обогащение ¡фактически не сказывается на хромзтографических характеристиках.

Полученные нзми кодкчзственные г качественные данные для некоторых аминокислот (Asp/Giu, ála, Val, Рйг, Arg. Ьуз, leu/Ile), выделенных нз белковых гидролгзатов различии источников, приведены в таблице 4. Сравнительный анализ результатов свидетельствует о том lío независимо от биологического источника белка, разработанный нами метод по а во к?, р. т получать оптически чистые аминокислоты с высоким выходом и хронэтографичзской чистотой не менее 87 %.

В Ы В О Д til

■ !> t. Разработай новый метод аналитического разделения стандартней смеси 20 аминокаслог, вк лечащий предколокочнув модификации с помощь» Z-C1 е разделение Сенаипокспкарбонильмй проааьодных аминокислот ü иомоцьй обрасенно-фязовой взк? в ренине градиентного элвирования.

2. Разргботапа «столика лярлззтззацяи erльдзртноЗ смеси 20

4. Иг пригаре выделения десяти аминокислот с чистотой не менее 95 % из 1ид])олизэта jpoaaa из соевых бобов, показана возможность применения разработанного метода для препаративного получения чистых аминокислот.

5. Доказано, что разработанный метод пригоден для зыделения аминокислот из биомассы различных микроорганизмов, а такне из ку-льтуральной акдкости Brevibacleriuie methylicum, СекреТируЩСЙ ЗМИ-нокислоты. Сравнительный анализ результатов свидетельствует о том, что независимо от биологического источмкэ белка, используя разработанный метод, мокно получать оптически активные аминокислоты с высоким выходом и хроматографичоской чистотой пэрядка 87 %.

6. На примере выделения дейтерий мочоииих аминокислот из белкового гидролиззгa MethyiobadMus fiageUatuin, показана возможность получения разработанный методом аминокислот, меченных стабильными изотопами,

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТУ ДИССЕРГАЦШ! ОПУБЛИКОВАНЫ В РАБОТАХ:

î. Т.Д. Егорова, С.Б. Еремкн, Б.И. .Чиинер, E.H. Звонкова, В.И. Швец. Разработка метода препаратиьногс выделения аминокислот из белковых гидролизатов в вида бензилоксикарбонильных производных. - Биотехнология. 1993. N.5. - С. 32 - 36.2. Т.А. Егорова, O.S. Мосин. C.B. Еремкк, E.H. Карнаухова, E.H. Звонкова, В.И. Овец, препаративное раз/~ленае аминокислот белковых гидролизатов из различных источников в виде беизилоксикарбонильных производных. - Биотехнология. 19ЭЗ. К.8. - С. 16 - 21.

3. С.Г. Харченко, Т.А. Еюров?. Состояние пигментного аппарата фотосинтезирусцих микроорганизмов. Тезисы докл. Пуачнскиз чтения по фотосинтезу и конференция стран СНГ "Структурно-фуншюиальиая организация фо^осиитетических чомбр«« и нх Mojrn«?.."- )'уг;ит. 1393. - С, //.