Выделение и изучение антибиотика - полипептида 3 802 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М. В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 615.332

ЯССЕИН

Мохи Эль Днн Абдель Фаттах Абд Эль Ати

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКА-ПОЛИПЕПТИДА 3802

Специальность — 02.00.10 — Биоорганическая химия, природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1992

Работа выполнена lia кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Г. С Катруха; кандидат биологических наук, старшин научный сотрудник Г. Б. Федорова.

Официальные оппоненты: доктор химических паук, профессор А. С. Мезенцер; доктор биологических наук Т. И. Орлова.

Ведущая организация — ВНЦД—ВНИИ антибиотиков.

Защита состоится 25 февраля 1992 г. в 16 час. на заседании специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: ГСП 119899 Москва В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан Dl JU64 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

И. Г. СМИРНОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

~ Актуальность проблемы. Антибиотики продолжают оставаться важнейшими химиотерапевтическими препаратами, получившими широкое применение в медицинской практике для лечения тяжелых заболеваний. Возникновение устойчивых форм патогенных бактерий, необходимость снижения побочного действия лекарственных средств на микроорганизмы требуют постоянного развития исследований по скринингу новых антибиотиков, разработке методов их выделения и идентификации.

В ходе скрининга антибактериальных антибиотиков во ВНИИНА АМН была выделена редкая культура актиномицета - штамм И НА-3802, близкая по некоторым таксономическим признакам к роду Асипор1апез. Было показано также, что антибиотик 3802, продуцируемый этим актиномицетом, обладает выраженным терапевтическим эффектом при лечении стафилококкового сепсиса белых мышей, что представляет значительный интерес для практики. Кроме того, важно было гнать особенности химического строения нового антибиотического вещества и групповую принадлежность по принятой классификации биологически активных веществ.

Цель работы заключалась в разработке оптимального способа выделения и очистки антибиотика 3802, определение его компонентного состава, а такие в изучении физико-хиглческих свойств компонентов и их идентификации. -Для этого необходимо было: I) Разработать рациональный способ выделения антибиотика 3802 из куль-туральной жидкости (КЖ), позволяющий наиболее полное извлечение его как из мицелия, так и из нативного раствора продуцента; 2) Разработать оптимальные условия очистки антибиотика 3802, позволяющие получать препараты высокой степени чистоты; 3) Изучить

компонентный состав антибиотического комплекса 3802 и разработать условия разделения его на индивидуальные компоненты; 4) Разработать методы контроля за стадиями получения и очистки препаратов антибиотика, включающие электрофоретические, хроыатографичес-кие (ТСХ, ВЭКХ), спектрофотометрические и другие методы анализа; 5) Определить химическую природу антибиотика и найти его место в химической классификации биологически активных веществ, разработанной Я.Берди (Венгрия); 6) Изучить физико-химические и биологические свойства антибиотика и его компонентов; 7) Провести идентификацию основного компонента антибиотического комплекса по химическим показателям.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенного исследования выделен антибактериальный антибиотик полипептидной природы, представляющий собой комплекс по крайней мере 6 компонентов. Установлено, что основным компонентом комплекса является антибиотик 3802-1У-3, идентифицированный с актагардином - серусодержащим полипептидом группы лантибиотиков; компоненты 3802-У-4 и 3802-У1-7 являются новыми антибиотиками этой группы и представляют собой соответственно w-ацетил- и метиловый сфир н-ацетил-производного актагардина с высокой активностью в отношении грамполояительных микроорганизмов. Впервые обнаружено, что при кислотном гидролизе в присутствии солей Fe3+ (но не Fea+) остатки лантионина (Lan) и метиллантионина (MeLan) окисляются до цистеиновой кислоты (cyS03H), которую количественно можно определить на аминокислотном анализаторе; в этих условиях цистинсодернащие пептида дают çysOjH и аспа-рагиновую кислоту, а в присутствии солей те2+ - цистин полностью разрушается, a Lan - не изменяется. Показано также, что в компоненте 3802-1У-3 сера одного из остатков Lan (MeLan), а в компо-

ненте 3802-1У-4 - трах остатков Lan (неьап) окислены до суль-фоксида.

Результаты работы имейт значение для проведения селекционных работ по направленному биосинтезу высокоактивного компонента 3802-У1-7 и др., а также для раэвития работ по выяснению взаимосвязи между структурой и функцией в ряду антибиотиков группы лантибиотиков.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на П Всесоюзной семинаре "Актуальные направления поиска антибиотиков" (г. Алма-Ата, 1989 г.), на Всесоюзной конференции "Современные методы выделения, очистки и идентификации микробных метаболитов" (Пущино-на-Оке, 1991 г.), на Ш Всесоюзном семинаре "Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения" (Степно-горск, 1991 г.), на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, 1991 г.).

Публикации. Содержание работы опубликовано в двух работах, две статьи находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного выделению и изучению триптофан-содержащих антибиотиков-полипептидов, обсуждения результатов* экспериментальной части, выводов и списка цитированной лите^у-ры. Работа изложена на страницах машинописного TeKcïà'/

содержит- таблиц, схем и рисунков. Список лэт^^ату-ры включает наименований.

- 4 -

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Выделение антибиотического комплекса 3802 из КуЛЬТурЭЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Асапор1апез Бр.

шт. И НА-3802

Антибиотик 3802 накапливается как в мицелии, так и в натив-нои растворе (НР) продуцента и монет быть выделен из обоих источников экстракционным методом. Из НР после отделения мицелия антибиотик экстрагировали органическими растворителями различной полярности (н.-бутанолом, хлороформом, этилацетатом) при различных значениях рН (4,5; 7,0; 8,5). Наиболее полное извлечение антибиотика происходит при экстракции н.-бутанолом при рН = 4,5; при щелочных значениях рН антибиотик практически не переходит в органическую фазу, что указывает на присутствие в его молекуле кислых функциональных групп.

Для извлечения антибиотика из мицелия проводится обработка мицелия ацетоном с последующей фильтрацией и отгонкой ацетона в вакууме, а антибиотик переводился в н.-бутанол при рН = 4,5. Из суммарного бутанольного экстракта, после его концентрирования в вакууме антибиотик осаждали избытком ацетона (схема I).

Электрофоретический анализ при рН 1,7-2,4 полученного таким образом препарата с последующим биоавтографическим проявлением показал, что обнаруживаются два биологически активных вещества -■одно нейтральное - остающееся в точке нанесения, и второе - основной природы, мигрирующее к катоду (рис. I). Оба вещества имели положительную реакцию с реактивом Эрлиха на триптофан и иод-азидным реагентом на серу, основной компонент проявляется также нингидрином, что указывает на присутствие в нем свободной аминогруппы. Однако, помимо двух биологически активных компонентов,

Схема I.

Схеиа выделения и фракционирования антибиотика 3802

- б -

препарат на данной стадии получения содержит еще значительные количества примесей, проявляющихся нингидриновым и СГ^-бензидино-выи реактивами. Для выделения небольших количеств активных нейтрального (3802-Н) и основного (3802-00) компонентов использовали метод препаративного электрофореза на бумаге в 30$-й СН3С00Н, 600 В, 3 час. с последующей элюцией компонентов уксусной кислотой той же концентрации.

о

-I Рис. I. Электрофореграмма компонентов из нативного "г раствора. Электролит 30?£-я .з СН3С00Н, 600 В, 2 час.

- ч

На основании данных электрофоретического анализа была разработана дальнейшая схема экстракционной очистки препарата-сырца 3802 и разделения его на две фракции - нейтральную и основную. С атой цълью мы также использовали органические растворители различной полярности, однако экстракцию проводили из растворов антибиотика з 0,5-1,0 н.соляной кислоте.

Экстракция этиловым эфиром позволила освободить препарат от примесей липидной природы; фракция 3802-Н, содержащая нейтральный антибиотик, переходит в этилацетатный экстракт. Смесью этилаце-тат-н.-бутанол (1:3) экстрагируется основной антибиотик 3802-0С, обладающий положительным зарядом. Контроль за разделением на фракции и очисткой препарата-сырца 3802 осуществляли методами электрофореза на бумаге и ТСХ на силикагеле с биоавтографическим и хими-

* & » т • ' * , <' V

Реакт;т Нигтвдргш Бноагго -Эрлиха гранта

ческим проявлением о использованием реактивов Эрлиха, нингидрина, С12-бензидина;и раствора гюю4 (рис. 2).

Б

0

ч 49 /

1 г

Реактив Зрдкха

Реактив Зрлпха

Рис. 2. Электрофорез (А) и ТСХ (Б) этилацетатного (точка I) и ПВиОН-К«ЭАС (точка 2) экстрактов из порошков-сырцов антибиотика 3802. Проявление -биоавтография (обведено пунктиром). Электролит - 2 н. СН3СООН, 600 В, 2 час.

Таким образом, методом избирательной экстракции нам удалось разделить препарат-сырец антибиотика на нейтральную (3802-Н) и основную (3802-СС) фракции, однако эти фракции еще содержали различное количество неактивных примесей и поэтому требовалась их дополнительная очистка, что необходимо для определения компонентного состава антибиотика, получения индивидуальных компонентов в хроматографически чистом виде и изучения их физико-химических свойств.

2. Разработка способа очистки антибиотиков 3 802-Н и 3802-С1С

План дальнейшей очистки выделенных антибиотиков основывался на полученных данных по их электрофоретической и ТСХ-подвижности в различных электролитах и хроматографических системах и растворимости в органических растворителях при экстракции из кислых водных растворов. Эти данные указывают на неполпрний характер их молекул и, по предварительным масс-спектроыетричоским данным (из)

на достаточно высокую мол. массу 1900 а.е.м.). Поэтому били испытаны два различных метода - метод гельфильтрации на сорбенте тоуореаг1 ни-5о, позволяющий провести разделение по мол.массам и иетод гидрофобной л иопо-обменной хроматографии на концентрирую-цих "патронах" с модифицированными силикагелем или макропористым стеклом, а именно: "Диапак-С1б", "Диапак-Сульфо", "Диапак-Феиил" и "МПС-2000". Эти сорбенты характеризуются различным соотношением гидрофобных и полярных свойств. "Патроны" "Диапак-С16" и "Диа-пак-Фенил" сорбируют вещества гидрофобной природы; вещества, обладающие полярными свойствами, можно удалить в ходе промывания подходящим буферным раствором; "Диапак-Сульфо" - сильный катио-нит, а сорбент "МПС-2000" используется для обращзнно-фазовой хроматографии низкомолекулярных пептидов.

В ходе исследования было обнаружено, что на патроне "Диапак-Сульфо" основной компонент десорбируется одновременно с пингид-ринположитальными примесями водой и более интенсивно - в кислой среде - смесью сн3сы - 0,1$ ТФУ ('1-0:60), что свидетельствует о неизбирательности процесса. При работе с патроном "¡Я1С-2000" была обнаружена его низкая емкость по отношению к основному компоненту 3802-00. В этом случае проблемой было накопление в достаточных количествах целевого продукта. Аналогичные результаты были получены па патроне "Диапак-С16". С другой стороны, на патроне "Дыапак-Фонил" сорбируются как нейтральное (3802-Н), так и основное (3802-0С) вещества, и поэтому вакно было найти условия избирательной десорбции биологически активных компонентов и отделение их от примесей. С этой целью испытывались различные элюзн-ты - вода, буферные растворы с рН 2,0-6,0, водные растворы ТФУ, смеси, содержащие воду, ТФУ и ацетонитрил различной концентрации. Было установлено, что, если вначале проводить последовательно

элюцию водой, раствором 0,1/5 ТФУ, водным 20/» ацэтонитрилои, то можно вымыть с колонки все примеси - нингидрин И беНЗИДИНПОЛОЕИ-тельные вещества, а компоненты 3802-Н и -ОС остаются на сорбенте. Если же после этого проводить элюцию смесью ацетонитрил - 0,1% водная ТФУ в соотношении 40:60 - начинает выходить нейтральный компонент 3802-Н, а затем его смесь с компонентом 3802-00. После полной десорбции компонента 3802-Н, содержание ацетонитрила увеличивали до 50-70/5 и в этo?J случае наблюдалась десорбция индивидуального компонента 3802-00. Контроль за ходом разделения осуществляли с помощью метода электрофореза на бумаге в 30%-й СН^СООН с последующим биоавзографическин проявлением на Bac.subti.iis и параллельно - нингидрином и реактивом Эрлиха на тгр (рис. 3).

0

1

3

4

см

Нингидрин + бпоавтография. Реактив Орлиха + бпоавтография.

Рлс. 3, Электрофореграмма динамики хроматографического анализа порошка-сырца на патроне "Диапак-Фенил". I. Раствор после нанесения антибиотика. 2. Элюция водой. 3. Элюция 0,1$ ТФУ. 4. Элюция 20% сн3см. 5. Элюция 40% сн3сн + 60% 0,1% ТФУ. 6. Элюция 70% сн3сы .+ 30% 0,1% ТФУ. Электролит - 2 н. СН5С00Н, 600 В, 2 час.

Таким образом, с помощью метода твердофазной экстракции на гидрофобном сорбенте "Диапак-Фенил" нам удалось очисгить сырцу антибиотиков 3802-Н и 3802-0С и накопить их в количествах, необходимых для дальнейших исследований.

и

. о I О о

о ¡3»

©» О

о

о

<2®

111

3

6

( Ф

3 Ж 6 --—

О »

- ю -

3. Исследование компонентного состава антибиотиков 3802-Н и 3802-0G

Электрофоретический а-нализ полученных после очистки на патроне "Диапак-Фенил" антибиотиков 3802-Н и 38Q2-CC показал, что они злектрофоретически однородны и проявляются одним пятном в районе точки нанссения (3802-Н) и в 2-3 см от старта (3802-0С) (рис. 3).

Однако, хорошо известно, что больиинство антибиотиков продуцируются в виде комплекса (5-15 соединений) близкородственных веществ, которые можно разделить только с использованием современных методов анализа. Прежде всего мы провели ТСХ-анализ антибиотиков на пластинках 20x20 см tieselgel 60 F254 ("Merck", ФРГ) в различных системах растворителей. Оптимальной оказалась система н.-бутанол-метанол-вода (4:1:3), в которой оба антибиотика разделялись на несколько компонентов с близкими значениями Rf.

Разделение на компоненты было достигнуто также с поморю метода ВЭЖХ на колонке zorbax ods с^ (250x^,6 им) с размером частиц 5 мкм и с использованием в качестве подвижной фазы системы ацетонитрил - 0,05% ТФА в градиентном режиме 38$ - 100% ацетонит-рила и детекции при 280 нм. Как видно из рис. 4А, в этих условиях антибиотик 3802-0С, содержащий небольшое количество 3802-Н, разделяется на 8 компонентов. Причем, компоненты имеют близкие значения rt, и преобладающим в количественном отношении является компонент 1У, в значительно меньших количествах содержатся компоненты I-Ш, У1-УП. Четкого разделения пиков УН и УШ достичь не удалось, возможно, из-за элюции в используемых условиях гидрофобных примесей липидиого характера.

Для исследования химической природы основного (3802-1У) и других компонентов Шпо проведено их накопление с помощью югода

А. Препаративная БЭЖХ на колонке С-18 "весктап", градиент 38% - 100% ацетонитрила в 0,057» ТФУ. Б. ТСХ на сили-кагеле компонентов антибиотика 3802 после повторной очистки методом ВЭЖХ. Система: н.Бутанол-Метанол - Н2О (4:1:3). Проявители: реактив Эрлиха и биоавтография (обведено пуня-

пиков разделяли на 2-3 фракции, которые собирали на коллекторе, а затем анализировали методами ТСХ и электрофореза с использованием дли выявления активных веществ биоавтографии с Аас.тусохае»

в качестве тест-организмз, а также химическое проявление с помощью нингидрина и реактива ирлиха. Параллельно били получены УФ-спектры в области 22.0-300 т в водной спирте. Результаты анализа фракций представлены га рис. '(Б и 5.

Из данных электрофоретичсского анализа с-вдует, что полученные компоненты делятся па двз типа - нейтральной и основной природы, однако по данным ТСХ они различаются м.'вду собой: с увеличением номера фракций увеличивается значение е£ компонента. Причем компоненты П-1У имеют близкие значения , п у компонентов У-УП - значения % существенно увеличиваются как между собой, так и в сравнении с компонентами 1-1У. Это свидетельствует о возрастании гидрофобных свойств компонентов о высокими номерами. Наблюдается различие и е УФ-спектрах: компоненты 1У-У1 имеют УФ-спектр типичный для трипю^онсодержащих полипептидов, в то хе время максимум поглощения компонента ПВ смещен з коротковолновую область, а у компонента ¡¿В - четкий максим.ум отсутствует, что позволяет сделать вывод о наличии в этих фркчннх примесей непредельного- характера. Компоненты 1-11), УП и Уй получены с низким выходом и в дальнейшем но изучались.

4. Физико-хим.чческэн згпрзитеристика гег.-пглшптов 1У-.УТ! антибиотика ЗРС2

Основные физико-хгп;нс. оте свойств;] ¡^-соЗлздэдщкх в количественном отношении Сиологич&ски активных кямнокинтив антибиотика 3802 представлены в тзб;глцс I. Из таблицы о;-: ;уот, что компоненты имеют мол.массу в прг^'-.хи 1890-1946 г>, мектиччый .УФ-епектр с максимумами поглоаениа, / 1Гбктсрннми дли иидошмй группы и ИК-спектр, укззнвтц;2 из -мличче в кол,- ч;,:ю емидглс: группировок (полосы поглощении (.и л-7) и 1г-20 {."г.-д-И). Два и» в.и лили-

Таблица I,

Зизико-хвмические свойства некоторых компонентов 3802 и актагардина

:-.нт1-б::отик

Брутто-форнула,!(М+Н)+!УФ-спектр,! Rf*

! "El

ШК-спектр, ¡Качественные реакции

(кол.масса) |fab-ks| ' ¡(система)|в см от т.н.¡ (квг)' ¡нингид-¡реактивреактив

этанол

sio„

¡(электролит)!í , clT-1

! рин .'Эрлиха !на s ¡ r ¡ _j HaK3-I,

3e02-xv-3 cs1h124h20°24s4 18s0 275

2S0

í1s89; 288

3í:02-iv-4

itüí—V—4

SiOZ-VI—?

c81h1261,22°24s4 1919 (I?-, 8)

c83k126í:20025s4 1932' (1931)

c64h128n20°25s4 1946 (1945)

273

279 288

273 2S0 288

273

280 290

0,44(t-l) (+)1,3(e-1) ü.j2(t-7) (i-)1,8(e-2) (-)l,0(e-4)

0,37(T-7) (+)1,3(E-1) (+)1,0(Б-4)

O,45ÍT-7)

0,63(T-7)

(E-1) ÍE-2)

(E-1) (Б-2)

3500-3300 ¿960,1670 1 540,147r0 1400,1240 1150,1050

3500,2960 1670 1560,1460 1360,1050

3500,2960 1730,1570 1560,1460 1360,1050

3500,^980 1730,1670. 1560,1460 1380,1230 1050

+ I

,:cT5!fií для ТСХ: T-I: bBuoh - Ac0H-H20 (4:1:1), T-7: nButOH-KeOH-H2o (4;is3).

?е::трофоретвческэя подзианость, "+" - миграция к катоду, - миграция к аноду, электролиты: E-I: :0:'Н-.чсЗЬ;-Н20 (28:20:52), 300 В, 3 час; Е-2 - 2 н.АсОН, 600 В, 2 час. Е-4: Пиридин-Ас0Н-Н20

Е'й:9:г71;, -300 В, 2 час.

--

руеыых компонентов (1У-3 и 1У-4) обладают положительным зарядом и мигрируют в кислой области рН к катоду, у двух других (У-4 и У1-7) аминогруппа отсутствует, поскольку они остаются при электрофорезе на линии старта и не проявляются нингидрином.

Положительная реакция Эрлиха для всех компонентов подтверждает наличие остатка триптофана, а 12-пая3~ реакция - атомов серы, что следует также из данных элементного анализа основного компонента, на основании которого определена брутто-формула преобладающего в количественном отношении компонента 3802-1У-3. Исходя из данных рав-из - анализа сделан вывод, что компонент 3 802-1У-4 является диамидом дисульфоксида исходного компонента 3802-1У-3, компонент 3802-У-4 - N -ацетильным производным этого же компонента, а компонент 3802-У1-7 - метиловым эфиром компонента 3802-У-4. Увеличение гидрофобных свойств в направлении от компонента 1У-3 к компоненту У1-7 наблюдается также при ТСХ и ВЭЖХ-анализе полученных антибиотиков (рис. 4, 8). В последнем случае для уменьшения времени удерживания при изократической обра ценно-фазовой ВЭХХ требуется увеличить концентрацию ацетонитрила в подвижной фазе с 44% до 60%.

Анализ полученных данных позволил нам сделать вывод, что выделенные антибиотики 3802-1У-3 - 3802-У1-7 являются высокомолекулярными серусодержащими полипептидами.

Для подтверждения этого предположения и дальнейшей идентификации антибиотиков необходимо было определить их качественный ч количественный аминокислотный состав.

5. Аминокислотный анализ компонентов 3802-1У-3 - 3802-У1-7

Для определения аминокислотного состава компонентов проводили их кислотный и щелочной гидролиз в течение 24-96 часов при

I06°C, a также кислотный гидролиз в 6 h.HCI в присутствии тио-гликолевой кислоты для определения триптофана. Гидролизаты анализировали методами одномерной и двумерной хроматографии на силика-геле и бумаге, электрофореза на бумаге при pH г,4 и 4,3, а также на аминокислотном анализаторе (рис. б, 7). В результате проведенного анализа установлено наличие в каждом из компонентов следующих аминокислот: Ser (I)*, Glu (I), Gly (2), Ala (I), Val (2), île (2), Leu (I), тгр (I). Количественное содержание триптофана было определено методом спектрофотометрического титрования N-бромсукцинимидои •(hbs).

¡í-i

irr":«*

« t«'

• Cl

• >4

• TVp

____Jj.o

ET

tr*n A

fitp I Tyi* 4

Thr« tfi* T rp<

Pro« «

и

cutCk IV" Ь СИЯД.ГИС1» Xi Xi *-*-»-*-

в Glu < «k Ser

«E» Vai

S1&H la WGIy

61ц . ZW

> Lut i Val

► Ala

В

•^P E tm •»

-Ш—Ф-

Ктгидрин

Рис.

г Нингвдрин

Анализ-кислотного гидролизата антибиотика 3802-УГ-3 (6 н.НС1 + 4% тиогликолевой кислоты, Юб°С, 24 час.). А. Хроматография на бумаге в системе н. вион-сн3соон-н2о (4:1:1). Б. Электрофорез на бумага в электролите НСООН-СН3С00Н-Н20 (28:20:52), 400 В, 3 час. В. Электрофорез на бумаге в электролите пиридин-СН3С0ОН-Н2О (2:4:994), 600 В, 2 час.

о

* Число остатков на моль антибиотика.

V

546

ч

А'Ii

k<U. , в/а ,<af Hb I «

IO

L

JLaOjJl

llt LU

щ А

з8ог-й-5 1 Б

Ы. Ак-ТЯМрДМН ^Jl ' ^^ __ _

- 1- - 1 -—Т — '----»"

60

-t мин

Рис. V. Лшшошслотный анализ п.ЕМ'Лиэатов 3802-1У-3 и актагапя.-■ на, • иолучешшх:А. с вн.HCl, Г. а Ъ. - с 6н.НС1+0,1МРе013,Ю6 С,L'-i-

Постепенное прибавление раагонга nbs приводит к изменению характерного спектра антибиотики, а появление поглощения в области 250-260 нм указывает на образ.шанне оксиндола. По полученным кривым было найдено, что антибиотик 3802-1У-3 содержит I остаток ■триптофана. Кроме того, в гидролизатах по данным электрофореза и хроматографии присутствовали па белковые аминокислоты JCj и Х^,, совпадающие по положению на карте аминокислотного аналиаа с местоположением пролина. Поэтому для его идентификации в кислотной гидролизате были проведены две специфические реакции I) дезамиш;-рования U-аминокислот с азотистой кислотой и 2) тринитрофешш;-ровании с 2,4,6-тринитроб|?;1зол-сул14окислотцй (ТНБО):

( FiCIICU ,11) I 2 ■

мм

----t- 1КСНСП_Н)

I 2 " ОН

(RCHCO,)»

ю..

¡¡(II

'""Х.У

[ 1—сопн ж . " н

Обе реакции необратимо модифицируют оС-амикокислоты, в то время как иминокислоты в реакции не вступают и могут быть легко отделены от производных ы. -аминокислот и определены методами хроматографии. Таким путем было показано, что пролин, оксипролин и н-метиламинокислоты в гидролизате компонента 3 802-1У-3 отсутствуют. Следовательно, на аминокислотном анализатора вместо про-лина выходят небелковые аминокислоты. Для их идентификации йлло проведено препаративное выделение аминокислот Xj и Xg методом бумажной хроматографии и изучены их физико-химические свойства, приведенные в таблице 2. В качестве свидетеля был взят лзнтионин (Lan) поскольку предварительно было показано, что Xj и Xg дают положительную иод-азидную реакцию на серу.

Таблица 2.

Физико-химические свойства аминокислот <j, и лантионина

n Î;? !

н/п !

Метод исследования

Ч

2

! Lan

1. Хроматография на бумаг", ?f. система T-I*

2. ТСХ, 3io2 I) система T-Ï

Rf 2) система T-'i

3. Аминокислотный анализа !■ -а , RT , МИН.

'). FA3-M3, (И + 1 ) +

M о л. va с с 1 ¡л с че г на я

Кэчествзшше реакции: -нчнгилрш

- I,

liai!

-i

0,35

0,08 0,16

21,50

209 208

ч

+

' 0,09

0,10

0,20

20,45

223

222 ♦

+

0,05

0,08 0,16

21,50

209

208 +

+

-нитропруссчд На -1шт[.о;|руссид на +

* пвион-Агон-н2о ('r.i:I); Т-4: пзиап - штридин-АсОЧ-^О (15:10:3:121.

- 18 -

Сравнение полученных данных позволило заключить, что в состав антибиотика 3802-1У-3 входят небелковые аминокислоты лантио-нин (Xj) и р -метиллантионин (Xg):

сн3

HOOC XOOH НООС. I J^COOH

■^CH-CH.-S-CH -CHQ )GH-CI!-S-CH2-CH4

Н2их ¿ ¿ ХИН2 H2N^ xWHa

Lan (x,) • MeLan (x2)

Ala Ala ot-Abu Ala

Другие серусодержащие аминокислоты в гидролизатах компонентов 1У-УП обнаружены не были. Количественное определение серы (6,3%) свидетельствует, что при мол. массе компонента 3802-1У-3 равной 1889 D, в его молекуле содержится 4 атома серы и, следовательно, четыре аминокислоты лантионинового ряда. Из них - один остаток лантионина и 3 остатка р> -метиллантионина, что следует из соотношения высот пиков этих аминокислот на аминокислотной карте с аминокислотного анализатора и расчета числа остатков, исходя из иол, массы 1889 D. Одновременно было установлено, что рекомендуемые в литературе условия окислительного кислотного гидролиза в присутствии ДМСО или после окисления антибиотика наднура-вьиной кислотой, не приводят к полному окислению и распаду лантион нов, что затрудняет количественное определение на анализаторе глу-таыинсвой кислоты и пролила. Мы предположила, что при гидролизе антибиотика в присутствии более сильного окислителя - хлорного нелеза (Fe3+), окисление s-содержащих аминокислот до Cyso3n будет более полным. Это предположение подтвердилось в опытах с мидельным Lan, окисленным глутатионом, компонентом 3802-1У-3 и . антибиотиками низином и актагардином, s которых содержатся остатки Lan и ..HeLan. На рис. 7 видно, что в Hci/Feci3 гидролизатах 3802-1У-3 и актагардина пики MeLan и Lan полностью ис-

чезают и появляются болышэ пики, отнесенные к cyso3H и аммиаку. Очевидно, в присутствии Fe3* происходит разрыв s-c - связи по остатку <¿-Abu или Ala с последующим окислением серы до so3H-группы (образование Cyso3H) и образованием -непредельных аминокислот («£,у!5-ДАЬи иДА1а) , которые распадаются с выделением аммиака по схеме:

сн—R

Ре3Уны ЮбвС

SO^H

I3

сн.

Н2Н

NCOOH

R

• I

СН

с

/\ HgN COOH

R

I

СН

I

+ NH 2 3

о=с-соон .

Су^о^н

В присутствии соли зэкисного железа гезо4 такой распад не наблюдается. Одюко, в гид роли зате окисленного глутатиона, содержащего один остаток щютина, полностью отсутствовали цистин'и суБО^). Эти данные позволяют предположить, что кислотный гидро-

3+- 2+

лиз в присутствии Ре и отдельно - с Ре можно будет использовать для идентификации в полипептидах остатков цистина и лантио-нинов.

Результаты аминокислотного анализа компонентов 1У-У1 антибиотика 3802 представлены в таблице 3.

Из данных таблицы следует, что по аминокислотному составу компоненты антибиотика 3 802 практически не различаются между собой. Лишь в компоненте 1У-4 обнаруживается небольшое количество суэо3н, образовавиееся, очевидно, при гидролизе из сульфона лан-тионина.

На основании данных аминокислотного анализа компоненетов, определения иол.массы методом рав-нз, их хроматографического (ТСХ и ВЭ1Х, см.рис. 8) и электрофоретического поведения можно сделать вывод, что основным компонентом антибиотического комплек-

Таблица 3.

Аминокислотный состав изкоаорых компонентов антибиотика 3802 и актагардина (число остатков/моль)

Аиииокислота 1 П-3 1 1У-4 ! У-4 ! У1-7 !Актагардин

Бег I I Г I I

Ии I I I I I

в1у 2 2 2 2 2

А1а I I I I I

УаХ 2 2 2 2 2

Не 2 2 2 2 2

Ьеи I I I I I

Тер I I I I I

(Ьап-с НеЬап) 4 3 4 4 4

А1а-302-А1а - X - - -

Мол.масса 1889 1919 1931 1945 1889

са 3802 является компонент 1У-3 с мол.массой 1889 Р. Тогда компонент 1У-4 с мол. массой 1919 б представляет собой диамид-сульфон-1У-3, компонент У-4 - н -ацетильное производное компонента 1У-3, а У1-? - метиловый эфир компонента У-4.

Для подтверждения строения двух последних компонентов ыы провели обработку антибиотика 3802-1У-3 уксусным ангидридом в метаноле, а часть полученного продукта - смесью МеОН/НС1 для его этери-фикации. Продукты реакции исследовали методами ТСХ и.рав-мз:

Соединение ! ТСХ, % , Т-7с | рав-мэ (п+н)+

__ . _ __ __

1У-3 + Ас20 0,48 1932.

• ХУ-3 + Ас20 + М90Н/НС1 0,63 1946

П-7 0,63 1946

Данные этой таблицы подтверждают выводы о строении компонентов У-4 и У1-7.

Ванным этапом в исследовании антибиотиков-полипептидов явля-ится определите их н- и С-концевых аминокислот. Однако, лримене-

Рис. 8. ВЭ1Х на приборе "Милихром-1В" отдельных компонентой антибиотика 3G02 и актагардииа. Колонка "Сепарон C-I8", 5 шсм. Детекция при 280 пм. Подвижная фаза: ацетошярил - 0,1% ТФУ с содержанием ацетопитрила для Л - дДя Б - 46/S, для В - 60/5.' Над пиками указано время'вихода в сок.

ние для определения N-концевой группы в 1У-3 распространенных в аналитической химии пептидов динитрофенильного и дансильного методов, несмотря на широкое варьирование условий, не дало положительных результатов: полного модифицирования аминогруппы компонента 1У-3 достичь не удалось, всегда оставался свободный антибиотик. Это наводит на мысль о стерической недоступности аминогруппы для таких объемных реагентов как 2,4-динитрофторбензол и 5-диметилами-но-нафталин-1-сульфохлорид. Поэтому в дальнейшем мы использовали высокоактивный реагент - метилизотиоцианат (МИТЦ), который нашел применение в пептидной химии для шределения и-концевой последовательности по методу Эдмана (Степанов, 1968 г.):

Л, Еэ Н К1

Г I2 он 9 5 ' 1 1

i. сн ксэ + н иснсошснсо-... г" сн ис-кнснсоынснсо-... -—

3 2 3 I

Б

4. н2

Н3° I

—_ — л-сн— с=о + н„м-снс0-...

II II 2

л

МТР-аминокислоты Контроль за ходом карбамилирования (I стадия) и циклизацией (П стадия) осуществляли методом электрофореза на бумаге. Было установлено, что I стадия проходит полностью и н-метилтиокарбамил-3802-1У-3 при электрофорезе остается в точке нанесения. После П стадии метода Эдмана на электрофореграмме появляется нингидрин-положительное пятно с зарядом +1, что свидетельствует об образовании метилтиогидантиона N-концевой аминокислоты.'Однако обнаружить МТГ-производное с помощью ТСХ нам не удалось. Поэтому Шло проведено исследование кислотного гидролизата МТГ-3802-1У-3, в результате которого было установлено, что после циклизации на хромато-графической карте с анализатора уменьшается пик ^ -метила нти они на. Следовательно, один из остатков в антибиотике 3802-1У-3

- 23 -

занимает н-концевое положение.

Для идентификации полученных антибиотиков мы провели поиск аналогов по компьютерной базе данных природных биологически активных веществ, разработанной Я.Берди (Венгрия). На 1991 год в базе данных содержались сведения о свыше 16 тыс. антибиотических веществ природного происхождения. Поиск проводили путем введения в- компьютер полученных аналитических данных по мол.массе, УФ-спектру и элементному составу компонентов антибиотика 3 802.

В результате компьютерного поиска мы вышли на антибиотик-полипептид актагардий, который относится к новой группе антибиоти-. ков - лантибиотиков. Актагардин представляет собой 19-членный полипептид, строение которого (см. рис. 9) было установлено недавно итальянскими исследователями (j.г.rettenring et ai., 1990 г.) с использованием современных методов 2D ЯМР.

^•ч^со» yTrp-G.^ Lau агС V.t S«rN

R-NH-Al. «¿и-«\. AI« АЬ"

Рис. Строение актагардина и компонентов антибиотика 3802.

R 1 X

Актагардин Н ОН

1У-3 Н он

1У-4 Н NH2 + -S^

У-4 сн3со ОН

У1-7 СН3СО осн3, ОН'

- 24 -

Дальнейшая идентификация проведена с помощью метода ВЭЙХ на приборе "Милихром-1В" в изократическом режиме с изменением концентрации ацетонитрила в подвижной фазе от 44% до 60% (рис. 8). Данные анализа свидетельствуют, что компонент 1У-3 идентичен ак-тагардину, компоненты 1У-4, У-4 и У1-7 - по времени удерживания существенно отличаются от актагардина. Однако, итальянскими исследователями описан также диамид актагардина (.ьк.ке^епгапд, 1990), которому соответствует компонент 1У-4. В то же время, поскольку в компьютерной базе данных Я.Верди и в литературе отсутствуют сведения об антибиотиках с мол. массой 1931 и 1945, можно считать, что выделенные нами из антибиотического комплекса 3802 компоненты 3802-У-4 и 3 802-У1-7 являются новыми антибиотиками. В таблице 4 приведены сравнительные данные по биологической активности полученных антибиотиков.

Таблица 4.

Антибиотическая активность компонентов антибиотика 3802 и актагардина в отношении вас.тусо1<1ез (МПК, мкг/мл)

Антибиотик МПК*

3802-1У-3 оТзТ

3802-У-4 0,39

3802-У1-7 0,17

Актагардин 0,22

34 Определение методом серийных разведений.

Из таблицы 4 видно, что полученные нами антибиотики, несмотря на некоторые структурные различия, обладают близкой антибиотической активностью, сравнимой с активностью актагардина. Известно, что актагардин обладает способностью подавлять биосинтез пеп-тидогликана клеточной стенки бактерий. Антибиотики с таким механизмом действия представляют клтерес для биохимиков и практической медицины, и поэтому работы по изучению строения и взаимосвязи

меяду строением и биологической зкгмностъс з ряду компонентов антибиотического комплекса 3802 будут продолжлш.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема выделения и фракционирования антибактериального антибиотика 3802 из кулътуральной жидкости штамма-продуцента Actinoplanes sp. ИТ. 1Ш-3802.

2. Методом обращенно-фазовой ВЭКХ показано, что антибиотический комплекс 3802 содержит 6-7 близкородственных компонентов, из которых преобладающим является антибиотик 3802-1У-3. Осуществлено препаративное выделение и очистка компонентов 3802-1У-3, -1У-4, -У-4 и -У1-7, изучены их физико-химические и биологические свойства и установлено, что они являются серусодержащими антибиотикам - полипептидами группы лэнтибиотиков.

3. На основании полученных аналитических данных антибиотик 3802-1У-3 идентифицирован с антибиотиком группы ланткбиотипов -актагардином, а антибиотик 3802-1У-4 - с сульфоном'его днамидэ; антибиотики 3802-У-4 и 3802-У1-7 не имеют аналогов в литературе

и являются новыми перспективными представителями группы лэнтибио-тиков.

Впервые показана возможность дифференцированного определения в полипептидах s-содержащих аминокислот ( (Lan, HeLan и цистина) путем-кислотного гидролиза в присутствии солей Fe3+ и Fe2+ : в первом случае с Fe3+ s -содержащие аминокислоты окисляются до цистеиновой кислоты, во втором - с Fe2+ лантионины не модифицируются, а цистин полностью разрушается и но обнаруживается методами хроматографии.

- 26 -

Список работ по теме диссертации:

1. Федорова Г.Б., Яссеин М., Архангельская Н.Ы., Лайко A.B., Трифонова 1.П., Катруха Г.С. Выделение и химическая характеристика антибиотика-полипептида 3802.//Актуальные управления в технологии получения антибиотиков и других биологически актив- . них соединений микробного происхождения. - Тез. докл. Ш Всесоюзного семинара. - Степногорск. - 1991. - С. 35.

2. Федорова Г.Б., Яссеин М., Архангельская Н.М., Лайко A.B., Токарева Н.Л., Катруха Г.С. Выделение и определение компонентного с'остава антибиотика 3802 из культуральной жидкости штамма продуцента ИНА-3802. //Антибиотики и химиотерапия. - 1992. -

Т. 37 (в печати).

3. Катруха Г.С., Яссеин М., Федорова Г.Б., Трифонова 1.П., Косын-кина Л.А., Архангельская Н.М., Розынов Б.В. Физико-химические свойства некоторых компонентов антибиотического комплекса 3802. //Антибиотики и химиотерапия. - 1992. - Т. 37 (в печати). Катруха Г.С., Яссеин М., Федорова Г.Б., Трифонова Ж.П., Архангельская Н.М., Косынкина Л.А., Лайко A.B." Использование метода твердофазной жидкостной экстракции для выделения и идентификации антибиотика-полипептида 3 802. // Жидкостная экстракция органических соединений. - Тез. докл. Международной конференции. - Воронеж. - 1992 (в печати).