Цитолитические и антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

<->и^4ьоа 16

Василевский Александр Александрович

ЦИТОЛИТИЧЕСКИЕ И АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ ИЗ ЯДА ПАУКА Lachesana tarabaevi

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

3 0 ОПТ ?гпп

Москва-2008

003450816

Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, чл.-корр. РАН Гришин Евгений Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Колб Вячеслав Адамович

кандидат химических наук Овчинникова Татьяна Владимировна

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта

Защита диссертации состоится в на заседании

Диссертационного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан Л

-1 .

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Пептидные соединения, функция которых связана с взаимодействием с биологическими мембранами или структура которых обеспечивает эффективность этих взаимодействий, получили общее название мембрано-активных пептидов (МАП). МАП представляют обширный и гетерогенный класс веществ, используемых живыми организмами от бактерий до человека в различных целях. В основе такой универсальности МАП лежит способность взаимодействовать не со специфическим белковым рецептором, а с липидным бислоем, неотъемлемым компонентом клеточных форм жизни. Благодаря этому свойству МАП являются вездесущими участниками внутри- и межвидовых отношений.

Наиболее характерная черта большого числа МАП - способность к дестабилизации мембраны-мишени, приводящей к клеточной гибели. МАП, функция которых состоит в разрушении мембраны и поражении клетки, называют цитолитическими пептидами (ЦП). ЦП представляют собой одно из наиболее простых по механизму действия и структурной организации, а также наиболее древних по происхождению и универсальных по сфере применения орудий в борьбе организмов друг с другом.

Разнообразные пептиды с выраженным антимикробным действием (т.н. антимикробные пептиды, АМП) проявляют также цитолитические свойства. У высших организмов (как животных, так и растений) АМП являются важнейшей частью системы врожденного иммунитета, характерного, в отличие от приобретенного, практически для всех многоклеточных, а не только для высших позвоночных. Таким образом, для многих ЦП (АМП) характерна защитная функция. Не менее эффективно ЦП могут быть использованы и в целях нападения. ЦП - распространенные эффекторные молекулы-участники в конкурентной борьбе микроорганизмов. Однако наиболее ярким примером служат ЦП, продуцируемые ядовитыми животными. Некоторые из этих молекул являются наиболее значимым компонентом их яда, выполняющим главную функцию убийства/парализации жертвы и/или отпугивания агрессора.

МАП являются удобной моделью для изучения белок-мембранных взаимодействий и, таким образом, представляют фундаментальный интерес. ЦП и АМП считают принципиально новым классом антибиотических веществ, которые будут введены в клиническую практику. Способность быстро поражать клетки-мишени, широкий спектр действия, активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также трудность в селекции устойчивых к ЦП и АМП мутантов позволяют рассматривать эти соединения в качестве основы для создания новых лекарств, особенно на фоне глобальной проблемы снижения эффективности обычных антибиотиков. ЦП и АМП представляют также инструмент инженерии устойчивости растений к патогенам и могут быть использованы в «зеленой» биотехнологии.

Цель и задачи работы

Цель настоящей работы состояла в изучении цитолитических и антимикробных пептидов (ЦП и АМП) из яда среднеазиатского паука ЬавИезапа ¡агаЬаехч. В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:

а) Провести идентификацию и выделение ЦП и АМП из цельного яда;

б) Установить первичную структуру активных пептидов;

в) Осуществить функциональную характеристику новых веществ;

г) Изучить аминокислотную последовательность предшественников ЦП и АМП;

д) Разработать систему гетерологичной экспрессии генов новых пептидов.

Научная новизна работы

Впервые проведен комплексный анализ МАП из яда паука. Установлена первичная структура 41 новых пептидов, образующих 13 новых семейств. Для восьми семейств ЦП и АМП проведена характеристика их биологической активности. Открыты уникальные компоненты яда паука, обладающие одинаково значимой цитолитической, антимикробной и инсектицидной активностью, формирующие новый класс ЦП и АМП - цито-инсектотоксины.

Обнаружено (впервые для паукообразных) широкое разнообразие строения молекул предшественников новых МАП. Предложена схема биосинтеза пептидов; показана функция пропоследовательности в нейтрализации активности зрелой цепи.

Выдвинута гипотеза о «биомолекулярном» разнообразии компонентов природных ядов, в частности, компонентов с цитолитическими свойствами. Предположено, что паук Ь. 1агаЬае\ч относится к новой группе ядовитых животных в классификации согласно молекулярному составу яда. Выдвинута гипотеза об эволюции компонентов яда с появлением «модульных» токсинов сложного строения.

Практическая ценность работы

Полученные в ходе выполнения данной работы АМП представляют большой практический интерес, поскольку могут быть использованы в качестве антибиотиков нового типа. По антимикробной активности полученные пептиды не уступают лучшим мировым аналогам. Серьезным препятствием к широкому применению АМП в клинике служит высокая стоимость производства. Альтернативой дорогостоящему химическому синтезу является биотехнологическое получение АМП. В рамках настоящей работы впервые проведено получение МАП из яда паука в бактериальной системе экспрессии. Результаты работы предполагается использовать для создания технологии производства АМП.

Новые АМП предполагается также использовать в сельскохозяйственной биотехнологии с целью инженерии устойчивости культурных растений к бактериальным и грибным патогенам.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на 15-м мировом конгрессе по токсинам животных, растений и микробов (Глазго, Великобритания, 2006), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), 2-м симпозиуме по биофизике мембрано-активных пептидов (Лиссабон, Португалия, 2007), Гордоновской научной конференции «Механизмы мембранного транспорта» (Тилтон, США, 2007), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды». (Пущино, 2007), симпозиуме «Нейрорецепторы: структура, механизм действия и роль в патологиях» (Москва, 2007), XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 16-м собрании Европейской секции международного общества токсинологии (Лёвен, Бельгия, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано пять статей в международных журналах и глава в монографии.

Патенты

В рамках выполнения диссертационной работы получено шесть патентов Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на страницах, содержит

рисунков и таблиц, имеет традиционную структуру и состоит из

следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект исследований

В качестве объекта исследования был выбран яд среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi Zonstein et Ovtchinnikov, 1999 из семейства Zodariidae («пауки-муравьеды»). Яд этого паука обладает наиболее выраженным цитолитическим действием в отношении различных клеток среди ядов около ста различных видов членистоногих из 25 семейств, имеющихся в коллекции лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН. Цельный яд обладает также высокой антимикробной активностью в отношении Escherichia coli со значением минимальной ингибирующей концентрации (МИК) 10 мкг/мл и высокой инсектицидной активностью против личинок серой мяской мухи Sarcophaga carnaria со значением средней летальной дозы (ЛД50) при инъекции 3 мкг/г. Мы предположили, что яд L. tarabaevi является богатым источником новых ЦП и АМП.

Стратегия исследований

Для изучения ЦП и АМП из яда L. tarabaevi мы использовали комплексный подход, объединивший в себе две независимых стратегии. Первая и более традиционная заключалась в выделении из яда индивидуальных активных соединений и установлении их аминокислотной последовательности. Вторая предусматривала анализ in silico транслированных нуклеотидных последовательностей из библиотеки кДНК ядовитых желез паука, имеющейся в лаборатории, и выявление потенциальных МАП. Сравнение двух групп данных позволило получить наиболее полную информацию о МАП яда.

Выделение активных молекул

Была выбрана следующая методика выделения ЦП и АМП из цельного яда L. tarabaevi: первоначальное разделение препарата яда с помощью гель-фильтрации (рис. 1А) с последующей обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ОФ-ВЭЖХ) активных фракций (рис. 1Б). После каждой стадии разделения проводилось тестирование полученных фракций на наличие антимикробного эффекта в отношении Е. coli, а также их масс-спектрометрический (МС) анализ.

В результате на 2-й стадии разделения цельного яда для ряда веществ была достигнута степень очистки свыше 70%. Окончательная очистка активных компонентов (3-я стадия) осуществлялась с помощью ОФ-ВЭЖХ в условиях, отличных от 2-й стадии выделения. В чистом виде (степень очистки >95%) получены 17 компонентов, обладавших антимикробной активностью. Полученные соединения имели молекулярную массу в пределах 2-10 кДа, что совпадает с типичным интервалом значений для пептидных нейротоксинов пауков. Анализ молекулярных масс выделенных компонентов позволил выделить две группы - с массами порядка 2-4 и 6-9 кДа, что также совпадает с типичным «бимодальным» распределением молекулярных масс компонентов яда. Общее содержание антимикробных компонентов в яде L. tarabaevi составило более 70% сухого веса.

t, мин

t, мин

Рисунок 1. Разделение яда L. tarabaevi.

(А) Эксклюзионная хроматография 10 мкл цельного яда на колонке TS К 2000SW (7,5 х 600 мм, Beckman). Элюент - 10% CH3CN, 0,1% трифторуксусная кислота; скорость потока 0,5 мл/мин. Детекция по оптическому поглощению элюата при 210 нм. Отмечены полученные фракции - А, В и С. Сверху указаны места выхода молекулярных стандартов и их массы в кДа.

(Б) Обращенно-фазовая хроматография 1/10 части наиболее активной фракции В на аналитической колонке Vydac 218ТР54 Cis (4,6 х 250 мм, Separations Group) в 0,1% трифторуксусной кислоте и градиенте концентрации ацето-нитрила (указан линией); скорость элюции 0,7 мл/мин. Детекция также по оптическому поглощению при 210 нм. Сверху отрезками отмечены места элюции компонентов с антимикробной активностью в отношении Е. coli (Antimic), а также следующих групп веществ: цистеин-содер-жащих антимикробных пептидов (Cys), повторяющихся пептидных элементов (Rpe), цито-инсекто-токсинов (CIT), латарцинов (Ltc), мет-лизинов (Mlys).

Целый ряд физико-химических свойств (молекулярная масса, хроматографическая подвижность, спектр поглощения) указывает на пептидную природу выделенных веществ, что подтвердилось при анализе их химической (первичной) структуры.

Установление первичной структуры новых пептидов

Проведение реакций восстановления дисульфидных связей и алкилирования тиольных групп выявило несколько дисульфид-содержащих активных компонентов с массами 6-9 кДа (СуБ на рис. 1Б). Это один из первых примеров цистеин-содержащих ЦП и АМП из яда пауков, их изучение осталось за рамками настоящей работы.

Для пептидов с молекулярной массой 2-4 кДа, т.е. с длиной менее 40 аминокислотных остатков, получивших название латарцины (Ыс) (табл. 1) от латинского названия паука, полная • последовательность была установлена с помощью автоматического УУ-концевого секвенирования по методу Эдмана. Всего было охарактеризовано семь латарцинов: Ыс 1, 2а, За, ЗЬ, 4а, 4Ь и 5.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности латарцинов

пептид1 аминокислотная последовательность2 длина3 масса4

1 10 20 30

Ыс 1 бшзсшкккьккьшаькккьксе 25 3073,8

Г Ыс 2а а,рскь iккрсика1б уаукка1узкн 26 2902,6

Ыс 2Ь сьрскьiккесика1эуауккаискм 26 2879,5

Ыс За зикзмаккькеумекькока-ын2 20 2483,0

Ыс ЗЬ змазмаккхкеумекькола-ш2 20 2425,9

Г Ыс 4а СЬКОКРКЗМСЕКЬКОУЮТИКАКЕ-ЫНг 24 2902,5

Ыс 4Ь БЬКПКУКЗМОЕКЬКСШОТМКАКР-Ггаг 24 2884,5

Ыс 5 сррскмкеурккрсазрк1шра№кк11ь-ш2 28 3430,2

ГЫс 6а5 * ^аротекрптоктубамкмотзьсомкккрыь 33 4034,7

Ыс 6Ь5 * ^аектетрвшкшотакшошьеомкккеншь 35 4324,0

^ Ыс 6с <оаектетрпшк1еываккмооыьеомкккеыьыь 35 4296,0

Ыс 7* оетрпкькекьктруокьуекаеоьксоькакьз 34 3942,6

1 10 20 30

'Названия пептидов, обнаруженных в яде, отмечены жирным шрифтом. Названия пептидов с наибольшим содержанием подчеркнуты. Скобками отмечены группы близких гомологов. 2Остатки, различающиеся с первым представителем в группе, выделены затемнением. 'Аминокислотных остатков. 4Приведены значения расчетных средних молекулярных масс (Да). 'Л'-Концевые остатки глутамина циклизуются с образованием остатков пироглутамата. ^Обнаружены в яде после анализа кДНК.

Первичную структуру пептидов с массой 7-9 кДа, получивших название цито-инсектотоксины (С1Т) (табл. 2), исследовали с использованием комбинации методов Эдмана, селективной фрагментации полипептидной цепи и МС. Схема установления полной аминокислотной последовательности длинных пептидов показана на рисунке 2 и соответствует стандартному подходу к исследованию структуры белков. На первом этапе проводилось частичное Л'-концевое секвенирование, после чего молекулы пептидов подвергались селективному протеолизу (по остатком метионина, аргинина и глутаминовой кислоты с использованием бромциана и эндопротеиназ А^-С и 01и-С, соответственно). Полученные фрагменты разделяли с помощью ВЭЖХ, анализировали с помощью МС и секвенировали. В результате получали набор перекрывающихся последовательностей, полностью и однозначно соответствующих исходным полипептидным цепочкам. Всего с использованием указанной схемы было установлено семь полных последовательностей цито-инсектотоксинов: С1Т 1а, 1 ^ 1Ь, 2а, 2с и За.

Таблица 2. Аминокислотные последовательности цито-инсектотоксинов'

пептид аминокислотная последовательность2 длина масса

1 10 20 30 40 50 60 70 11111111

С1Т 1а GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKYYGKKALQKASEKL 69 7905,6

С1Т 1Ь СЕЕСМТЖК1КСКАБК1МЬККАУКЬМУККЕС13КЕЕА0А^ОАМЗКК01КЬУЪЪКУУСККАЬ0КАЗЕКЬ 69 7905,6

С1Т 1с СРРСЫТ№СК1КСКАОК1МЬККАУК1МУККЕС13КЕЕА0АКУБАМЗКК01КЬУУЬКУ¥СККАЬ0КАЗЕКЬ 69 7891,6

си 1а СРРСЫТМКК1КСКАБК1МЬККАУК1МУККЕС1ТКЕЕАдАКУОАМЗККдШЬУЬЬКУУСККАЬдКАЗЕКЬ 69 7919,7

С1Т 1е СРРСНТШЖ1КСКЗВК1МЬККАУК1МУККЕС13КЕЕАдАКУБАМЗККд1КЬУЬЬКУУСККАЬдКАЗЕКЬ 69 7921,6

СГТ 1-6 СЕЕСОТЖК1КСКАБК1МЬККА\/К1М\ЖКЕС1РКЕЕА0АКУОАМЗККд1КЬУЬЬКУУСККАЬ0КАЗЕКЬ 69 7965,7

С1Т и СРРСЫТМКК1КСКАВК1МЬККАУК1МУККЕС13КЕЕАдАКУПАМЗККд^ЬУЪЪКНУСККАЬдКАЗЕКЬ 69 7879,6

С1Т1й СРГСНТШК1КОЮШК1МЬККА\/К1МШСКЕС13КЕЕА0АКУВАМЗККд1КЬУУЫСНУСККАЬ0КАЗЕКЬ 69 7865,6

СГТ 1-9 GFFGNTWKKIKGKTDKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKHYGKKALQKASEKL 69 7909,6

С1Т 1-10 СЕЕСЫТ1ЖК1КСКАВК1МЬККАУК1МУККЕС13КЕЕАдАКУСАМЗКК01ЕЬУУЬКНУСККАЬ0РСУЗЕКЬ 69 7893,6

СГПЬ СЕЕСЫАШКК1КСКАЕКГР11ККААК11АККЕС1ТКЕЕАЕАКУОТМЗКК01КУУЬЬКНУСКЬСАЬ0КАЗЕКЬ 69 7885,5

С1Т 1-12 СЕРОНА№КК1КОКАЕКРРЕККААК11АККЕСТТКЕЕАЕАК^/ВРМЗКК01К\ГУЬЬКНУСККАЬ0КАЗЕКЬ 69 7881,5

С1Т 1-13 СРРСНтаКК1КСКАБК1МЬККАУК1МУККЕС13КЕЕАдАКУОАМЗКК01КЪУЬЪКНУСККЬРККЕРКМСБ0 71 8269,14

С1Т 1-14 СРРСНТККК1КСКАБК1МЬККАУК1МУККЕС13КЕЕА0АКУВАМЗКК01КЬУЬЬКУУСККЬРККЕРККСОд 71 8295,14

С1Т 1-15 СРРСЫТИКК1КСКАОК1МЬККА\ЖЬМ\7ККЕС13КЕЕА0АКУБАМЗКК01КЬУЬЬКУУСККЗЗЗКЗУНК1У13КЗР 75 8571,4

кС1Т 1-16 ОРРСЫТИКК1КСКАПК1МЬККАУК1М\ЖКЕС13КЕЕА0АКУВАМЗКК01КЬУУЬКНУСККЗЗЗКЗРКК1У13КЗР 75 8579,4

Г С1Т 2а3 SWDS-IWKSAKNKMDKIMRQKVAKWMAKKEGKSVEEVQAKVDAMSKKDIRLHVISHУGKKAFEQLSKSLE 69 8050,5

С1Т 2Ь3 ЗИОЗ-1;;КЗАКНКМВКХ1Ж0КУАКММАККЕСКЗУЕЕУдЗКУВАМЗККО1НЬНУ13НУСККАРЕ0ЬЗКЗЬЕ 69 8066,5

1 С1Т 2с3 гтог - IWKSAKNKMDKIMRgKVAKWMAKKEGKSVEEVgAKVDAMSKKDIRMHVI ЗНУСККАРЕдЬЗКЗЬЕЕ 70 8197,6

Г С1Т За КЗК»7СКЬИСКАКСУАККСАККУКРСАЬЬКАЬКККЬАКЕМАКЗКСУВУКЕМКАКУ11АМВКАЮ/ьдЕАМК1ЬСККАМВКУЬЗ 79 8796,0

1 С1ТЗЬ KSKWGKLWGKAKGIAKKGAKKMKKALLKELKKKLAKEMAKSKGVDYKE^IKAKVMAMDKAKVLQEAMKIFGKKAMDKYLS 79 8934,2

С1Т 4а* GYKDYMSKAKDLYKDIKKDKRVKAVИKSSYИKEAKKLYKDNPVRDAYgVYKGVKAGGKLLF-NH2 61 7128,5

1 10 20 30 40 50 60 70

'См. примечание к таблице 1. 2Остатки, использованные для установления полной последовательности, выделены жирным шрифтом. 3В последовательности С1Т 2 внесен разрыв после четвертого остатка для оптимизации сравнения с С1Т 1. ""Свободные тиольные группы.

Рисунок 2. Схема установления аминокислотной последовательности цито-инсектотоксинов. Аминокислотные последовательности С1Т 1а, С1Т 1Ь и С1ТЗа представлены жирными линиями, справа указана их длина. Сверху отмечены остатки, по которым проводился селективный гидролиз. Снизу стрелками показаны фрагменты, для которых полностью установлены аминокислотные последовательности. Схемы для С1Т 1Ь, 1с, Ы, 1е, 1 Г, 2а, 2с и 4а аналогичны представленной для С1Т 1а.

Си 1а н2ы-Ш-М-М-соон 69 а.к.

Эдман--

CNBr

1-18__ 19-26. 27-44__45-69

CITlh h2n-2-Ш-соон 69 а.к.

Эдман--

Arg-C --^

CNBr -Ы4-►--_

СИ За h,n-IM-ем мм-em-м—соон 79ак

Эдман-Ь43-^

Qju_c _Ш_у 38-48 > 49-64 > 65-79 ,

Сщг __> 3»49 > 57-^6 , 67-74э

Аминокислотные последовательности коротких пептидов и фрагментов длинных пептидов анализировали с помощью тандемной MC (MC/MC). Полученные результаты совпадали с данными химического секвенирования. МС/МС позволила установить структуру ряда менее представленных в яде компонентов - Ltc 2b (табл. 1), CIT lb, lc, ld и le (табл. 2) - с использованием гомологичных Ltc 2а и CIT 1а в качестве реперов.

Анализ транслированных нуклеотидных последовательностей подтвердил установленные с помощью методов химии белка и MC первичные структуры выделенных веществ. Кроме того, были обнаружены близкие гомологи новых пептидов: CIT 1-6, 1-9, 1-10, 1-12-1-16, 2Ь и ЗЬ (табл.2). Среди транслированных последовательностей были также выявлены пептиды, по ряду признаков сходные с латарцинами: Ltc 6а, 6Ь, 6с и 7 (табл. 1); т.н. повторяющиеся пептидные элементы (Rpe) (табл. 3); пептиды с расчетной массой ~6 кДа, названные мет-лизинами (Mlys) (табл. 4), а также пептид CIT 4а, отнесенный к группе цито-инсектотоксинов. Повторный анализ фракций, полученных при разделении яда, позволил идентифицировать Ltc 6а, 6Ь и 7, Rpe 1, 2 и 3, Mlys а и b, CIT 4а, первичная структура которых была подтверждена с помощью автоматического секвенирования и МС/МС. TV-Концевые остатки пироглутаминовой кислоты у Ltc 6а и 6Ь были предварительно удалены пироглутамат-аминопептидазой. Полная аминокислотная последовательность CIT 4а была исследована согласно описанной выше схеме (рис. 2).

Таблица 3. Аминокислотные последовательности повторяющихся пептидных элементов1

пептид аминокислотная последовательность масса

1 10

Rpe 1 ggidrklmewnnlrkvq - -nh2 2068,5

Rne 2 gginrklmemvnnlrkvq- -nh2 2099,6

Rpe 3 gginrklmemvnklrkvq - -nh2 2113,6

Rpe 4 ag inrklmemvnklrkvq ■ -nh2 2127,7

См. примечание к таблице 1.

Применение МС позволило идентифицировать у пептидов Ыс За, ЗЬ, 4а, 4Ь и 5, Яре 1, 2 и 3, М1уэ а и Ь, С1Т4а наличие посттрансляционной модификации - С-концевого амидирования, вследствие которого измеренные молекулярные массы пептидов отличались от расчетных на 1 Да.

Таблица 4. Аминокислотные последовательности мет-лизинов1

пептид аминокислотная последовательность2 масса

1 10 20 30 40 50

Mlvs а mdkleemalklkdklktmaekgaqmgeklkemlpkaieklkeltekmknkm- -nh2 5951,4

Mlvs b mdkleemalklkdklktmaekgaqmgeklkemlpkameklkelmekmknkm- ■nh2 5999,5

Mlys с idkleemalklkdklktmaekgaqmgeklkemlpkaieklkeltekmknkm- ■nh2 5933,3

'См. примечание к таблице 1. 2Остатки метионина выделены жирным шрифтом.

Анализ первичной и вторичной структуры новых пептидов

Латарцины (табл. 1) представляют собой короткие (<50 остатков), линейные (не содержат остатков полуцистина), катионные (pl>10) и амфифильные (высокое содержание остатков заряженных и гидрофобных аминокислот) пептиды. Определенное чередование остатков в аминокислотной последовательности позволяет латарцинам формировать выражено амфипатические структуры в а-спиральной конформации с сегрегацией положительно заряженных и гидрофобных кластеров (рис. ЗА, Б). Результат применения распространенных алгоритмов предсказания вторичной структуры по аминокислотной последовательности для всех латарцинов - а-спираль, что связано с высоким содержанием т.н. спираль-формирующих остатков. Перечисленные структурные особенности являются признаком большой и гетерогенной группы МАП, т.н. линейных а-спиральных ЦП и АМП, а также основой их функции. Формирование спиральной конформации этих пептидов, как правило, происходит при контакте с мембранами - основными мишенями их действия. При этом положительно заряженные остатки взаимодействуют с фосфатными группировками на поверхности, а гидрофобные погружаются внутрь бислоя. Заряд латарцинов при нейтральных значениях pH колеблется от +5 у Ltc ЗЬ, 6а, 6Ь и 6с до +10 у Ltc 5. Несколько особняком стоит пептид Ltc 7 с зарядом молекулы +2 при pH 7 (pl~9,5), что, по-видимому, является причиной отсутствия активности на Е. coli.

Рисунок 3. Круговые диаграммы пептидов в а-спиральной конформации (проекции Шиффера-Эдмундсона). Показаны диаграммы для Ыс 2а (А), Ыс За (Б), Яре 2 (В), уУ-концевого фрагмента СИ 1а (1-34) (Г) и М1узЬ (Д). Остатки гидрофобных аминокислот отмечены серым, положительно заряженных - штриховкой.

За исключением трех пар: Ыс 2а и 2Ь, За и ЗЬ, 4а и 4Ь, а также группы Ыс 6, между латарцинами отсутствует значимое сходство последовательностей. Таким образом, в яде Ь. 1агаЬаехч одновременно присутствуют пять структурно различных групп коротких АМП и еще две группы предполагаемых коротких МАП. Существенной гомологии латарцинов с известными пептидами не обнаружено, выявлено только незначительное сходство с кателицидинами из млекопитающих и дермасептинами из амфибий (рис. 4). Это сходство указывает не на общность происхождения, а на одинаковый тип организации аминокислотной последовательности у а-спиральных АМП из различных источников. Интересным представляется тот факт, что сходство латарцинов с другими АМП членистоногих и, в частности, пауков значительно меньше, чем с АМП позвоночных. По-видимому, это пример конвергентной эволюции структур пептидов со сходной функцией.

Повторяющиеся пептидные элементы (табл. 3) образуют группу высоко гомологичных пептидов, сходных с латарцинами, однако характеризуются меньшей длиной (18 остатков) и малым зарядом (от +3 до +5 при рН 7). Общая

гидрофобность - еще один фактор, сказывающийся на активности МАП, - у Rpe сравнительно невысока, в условиях ОФ-ВЭЖХ они элюируются раньше других линейных пептидов (рис. 1Б). В результате, несмотря на способность к формированию амфипатических структур (рис. ЗВ), в предварительных тестах для Rpe не обнаружено цитолитической и антимикробной активности.

Рисунок 4. Сравнение аминокислотных последовательностей латарцинов и других АМП. САР 7 и CRAMP 18 - АМП семейства катслицидинов из кролика и мыши, соответственно. DS В2 - дермасептин В2 из листовой лягушки. Сходные аминокислотные остатки выделены затемнением, идентичные - дополнительно жирным шрифтом.

LtC 1 SMWSGMWBRKLKKLRNALKKKLK--GE---------------

САР 7 ----GL-RKRLRKFRNKIKEKLKKIGQKIQGFVPKLAPRTDY

LtC 2а GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH---------

DS В2 GLWSK- IKEVGKEAAK-AAAKAAGKAALGAVSEAV

LtC За ----SWKSMAKKLKEYMEJiLKQRA

CRAMP 18 --GEKLKKIGQKIKNFFQKL----

LtC 4Ь SLKDKVKSMGEKLKQYIQTWKAKF

На основании сходства первичной структуры цито-инсектотоксины объединяются в 4 семейства; пептиды из одного семейства различаются точечными заменами (табл. 2). Наиболее крупным как по числу представителей, так и по содержанию в яде является семейство С1Т 1. Семейства С1Т 1 и С1Т 2 являются близкородственными (55% идентичных остатков у С1Т 1а и 2а). Кроме описанных случаев, значимого сходства аминокислотных последовательностей цито-инсектотоксинов друг с другом, а также с другими пептидами обнаружено не было. В отличие от латарцинов, С1Т являются сравнительно длинными пептидами (от 61 остатков у С1Т4а до 79 у С1Т За и ЗЬ), вдвое превосходящими длину «средних» ЦП, их заряд также в среднем вдвое выше и при нейтральных рН варьирует от +7 у С1Т 2с до +21 (!) у С1Т За. Однако другие характеристики аминокислотной последовательности этих веществ совпадают со свойствами коротких линейных а-спиральных АМП, включая свойство формирования амфипатических структур в а-спиральной конформации (рис. ЗГ). Таким образом, цито-инсектотоксины можно называть гигантскими ЦП и АМП; на сегодняшний день это самые длинные линейные а-спиральные АМП.

Мет-лизины (табл. 4) состоят из 51 аминокислотных остатков и занимают промежуточное положение между короткими латарцинами и длинными цито-инсектотоксинами. Аминокислотный состав и организация первичной структуры М1уэ является типичной для а-спиральных АМП, за исключением относительно высокого содержания отрицательно заряженных остатков. В результате, несмотря на большую длину, молекулы мет-лизинов несут сравнительно небольшой положительный заряд +5 при рН 7. Видимо поэтому на сегодняшний день для них не выявлено цитолитической и антимикробной активности. В составе мет-лизинов преобладают остатки лизина (27,5%), метионина (11,8-17,6%), что отражено в их названии, и глутаминовой кислоты

(15,7%). Из всех выделенных пептидов Mlys характеризуются наибольшей склонностью к формированию а-спиралей, которые отличаются идеальной амфипатичностью (рис. ЗД). Более того, в а-спиральной конформации происходит выраженная сегрегация заряженных остатков: остатки лизина располагаются симметрично с обеих сторон гидрофобного сектора, отделяя его от кластера отрицательно заряженных остатков. Мет-лизины - пример идеального дизайна природных амфипатических структур. Сходные свойства характерны, например, для Ltc За (рис. ЗБ) и Ltc 7, т.е. тип организации первичной структуры может быть одинаков у МАП различной длины.

Вторичная структура исследовалась методом кругового дихроизма (КД) для пептидов, полученных химическим синтезом: Ltc 1, 2а, За, 4а, 5 и CIT 1а. Показано, что в водном растворе все перечисленные пептиды характеризуются неупорядоченностью структуры, в то время как в условиях, имитирующих мембранное окружение (раствор трифторэтанола, суспензии мицелл детергентов или липосом), пептиды принимают а-спиральную конформацию. Экспериментальные данные КД (табл. 5) согласуются с теоретическими предсказаниями вторичной структуры.

Таблица 5. Вторичная структура пептидов по данным спектроскопии кругового дихроизма

пептид условия1 содержание элементов вторичной структуры, % а-спираль (5-структура (3-изгиб клубок

вода 9 26 22 43

Ltc 1 50% ТФЭ2 78 2 2 18

ДОФХ3 48 24 0 28

вода 6 30 23 41

Ltc 2а 50% ТФЭ 69 4 7 20

ДОФХ 164 32 18 34

вода 31 16 21 32

Ltc За 50% ТФЭ 87 1 0 12

ДОФХ 56 3 15 26

вода 9 29 24 38

Ltc 4а 50% ТФЭ 88 1 0 11

ДОФХ 56 4 14 26

вода 5 24 27 44

Ltc 5 50% ТФЭ 86 1 2 11

ДОФХ 88 5 1 6

вода 13 14 24 49

CIT la 50% ТФЭ 69 3 7 21

ДОФХ 55 5 14 26

'Концентрация пептидов 0,1 мМ. 2ТФЭ - трифторэтанол. 3ДОФХ - липосомы из диолеоилфоефатидилхолина, диаметр 100 нм, молярное соотношение липид:пептид 50:1; данные лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул ИБХ РАН. 4Аномально низкое содержание а-спирали по данным КД. В суспензиях мицелл детергентов и липосом иного состава обнаружена высокая склонность пептида к спирализации.

Характеристика функциональных свойств выделенных веществ

Все выделенные в первой части исследования пептиды обладали антимикробной активностью в отношении Е. coli, что служило характеристическим признаком в ходе их очистки. Дополнительно идентифицированные в яде пептиды Ltc 6а, 6Ь и 7, Rpe 1, 2 и 3, Mlysa и Ь, CIT 4а по целому ряду свойств походили на типичные МАП. Антимикробные компоненты тестировались также на наличие инсектицидной активности. Выраженной токсичностью обладали фракции, соответствующие цистеин-содержащим АМП и цито-инсектотоксинам, что отражено в названии последних.

Латарцины Ltc 1, 2а, За, 4а, 4Ь и 5, а также цито-инсектотоксин CIT 1а были синтезированы и любезно предоставлены лабораторией химии пептидов ИБХ РАН в количествах, достаточных для проведения тестов их активности (табл. 6). Большинство тестировавшихся пептидов обладают высокой антибактериальной активностью и сопоставимы с наиболее эффективными ЦП и АМП подобного рода. Так, активность мелиттина - основного цитолитического компонента яда медоносной пчелы Apis mellifera, «классического» ЦП широкого спектра действия - в ряде случаев ниже, чем у пептидов из яда L. tarabaevi. Область активных концентраций пептидов лежит в пределах 0,5-16 мкМ, для большинства характерен широкий спектр действия, но также и некоторая специфичность. Характер действия пептидов бактерицидный, что было подтверждено соответствующими экспериментами. Для ряда пептидов характерна также высокая активность в отношении грибных патогенов растений (данные отдела «Учебно-научный центр» ИБХ РАН). Все перечисленные признаки часто встречаются у ЦП и АМП и согласуются с общим механизмом антимикробного действия за счет нарушения структуры плазматической мембраны клеток-мишеней. Выраженной гемолитической активностью, а также токсическим эффектом в отношении других клеток млекопитающих обладают пептиды Ltc 1, 2а, 5 и CIT 1а, при этом латарцин Ltc 2а является наиболее цитотоксическим (данные лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул ИБХ РАН).

Все синтетические пептиды были также протестированы на инсектицидную активность. Только некоторые латарцины обладают слабой токсичностью при инъекции личинкам мясной мухи S. carnario: наиболее активный пептид Ltc 2а характеризуется значением ЛД50 -150 мкг/г. При инъекции латарцинов наблюдалась парализация личинок, локальный некроз тканей и обильное выделение жидкости - симптомы, характерные для цитолитических веществ. ЛД50 CIT 1а составляет -20 мкг/г для личинок и ~5 мкг/г для имаго и приближается к значениям, свойственным для нейротоксинов. При этом вызываемые симптомы также соответствовали цитолитическим свойствам тестируемого вещества. Сравнение свойств самого активного латарцина Ltc 2а и цито-инсектотоксина CIT 1 а показало, что, несмотря на сходную токсичность в отношении клеток млекопитающих -эритроцитов, нормальных и трансформированных лейкоцитов (Ltc 2а несколько более активен), CIT 1а в 20 раз более активен по отношению к

культуре клеток насекомых Б©. Точно так же, токсичность пептидов на уровне целого организма была сопоставима в случае млекопитающих (1Лс 2а более активен) и сильно различалась в случае насекомых (С1Т 1а активнее на порядок).

Таблица 6. Антимикробная и гемолитическая активность пептидов1

пептид

Ltc 1 Ltc 2а Ltc За Ltc 4а Ltc 5 CIT la мелиттин'

Антимикробная активность; МИК, мкМ

Грамположительные бактерии

Bacillus subtilis 1 0,5 1 1 0,5 1 1

Staphylococcus aureus2 16 2 16 8 1 >16 2

Грамотрицательные бактерии

Escherichia coli 1 0,5 2 4 0,5 1 8

Pseudomonas aeruginosa 4 8 >16 >16 16 2 >16

Гемолитическая активность2; ЭК50*, мкМ

эритроциты человека 28 8 >50 >50 12 6 4

'Использовали штаммы микроорганизмов: В. subtilis В-501, S. aureus 209-Р, Е. coli DH5a, Р. aeruginosa PAOl. Антимикробную активность пептидов оценивали методом серийных разведений по ингибированию роста бактериальных культур в жидкой среде. 2Данные лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул ИБХ РАН. "■Концентрация, вызывающая 50% лизис эритроцитов.

Из личинок S. carnario проведена экстракция липидов, которые использовались для получения липосом. Анализ способности пептидов индуцировать выход флуоресцентного красителя из мицелл различного состава (рис. 5) выявил некоторую специфичность CIT 1а в отношении липидов S. carnario по сравнению с Ltc 2а. Оба пептида наиболее эффективны по отношению к мицеллам, содержащим отрицательно заряженные липиды. Такой состав имитирует плазматические мембраны клеток прокариот, и полученный результат согласуется с высокой антибактериальной активностью пептидов.

Таким образом, обнаружена определенная специфичность цито-инсектотоксинов в отношении насекомых. Токсический эффект, по-видимому, опосредован прямым цитолитическим действием пептидов. Выявленная специфичность, по крайней мере отчасти, объясняется липидным составом организма насекомых, однако может быть вызвана более тонкими различиями липидного состава мембран конкретных клеток, теряемыми в ходе грубой экстракции. Поскольку действие цито-инсектотоксинов паралитическое, основной мишенью предполагаются мембраны нейронов и/или мышечных клеток. В этом случае определенную роль в наблюдаемой специфичности играет также высокий мембранный потенциал.

Рисунок 5. Индуцированный выход красителя из липидных везикул.

Увеличение интенсивности флуоресценции красителя АНТС (динатриевая соль 8-аминонафталин-1,3,6-трисульфокислоты) при высвобождении из везикул, нагруженных также тушителем ДПК (я-ксллол-бис(Л'-ш1ридишш бромид)), под действием пептидов С1Т 1а (А) и 1Лс 2а (Б). Использовались липосомы различного состава: ДОФЭ:ДОФГ, смесь диолеоилфосфатидилэтаноламина и диолеоилфосфатндилглицерина (7:3); ДФФХ, дифитаноилфосфатидилхолин; насекомые, тотальный липидный экстракт из личинок серой мясной мухи 5. сатапа. Полный лизис везикул достигался при добавлении Тритона Х-100.

А

100

0s

. 60

40

20

CIT la

• дофэдофг -А-- насекомые -■-дффх

I»

...л--" —i—

100-

80-

„60-

о

к

§40-

R

-J 20-

0

Ltc 2а

О 0,5 1 1,5 2

концентрация пептида, мкМ

0,5 1 1,5 2

концентрация пептида, мкМ

Цито-инсектотоксины - новый класс компонентов яда пауков

Цито-инсектотоксины характеризуются уникальными структурно-функциональными особенностями. С «обычными» пептидными токсинами пауков их сближает биологическая активность, однако в их структуре отсутствуют дисульфидные связи. С другой стороны, CIT характеризуются рядом свойств а-спиральных ЦП и АМП (см. выше), однако их необычайная длина и высокая инсектицидная активность являются уникальными для этой группы соединений. Таким образом, цито-инсектотоксины представляют собой новый класс компонентов яда пауков, а также ЦП и АМП.

Структура предшественников и схема биосинтеза новых пептидов

Анализ транслированных нуклеотидных последовательностей позволил идентифицировать структуру предшественников всех латарцинов, повторяющихся пептидных элементов, мет-лизинов и цито-инсектотоксинов (табл. 7). Все новые МАП являются секретируемыми пептидными молекулами, синтезируемыми рибосомально в виде препропептидов, которые подвергаются нескольким стадиям созревания, при этом препро-участки, в отличие от зрелых цепей, характеризуются высоким уровнем консервативности (рис. 6).

Л'-Концевые последовательности, соответствующие сигнальному (пре-) пептиду, были выявлены у всех предшественников с помощью программы Signal Р 3.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). Сигнальный пептид обуславливает котрансляционное поступление растущей полипептидной цепи в эндоплазматический ретикулюм через транслокон и также котрансляционно отрезается от остальной части предшественника (пропептида) сигнальной пептидазой.

Таблица 7. Аминокислотные последовательности препро-участков предшественников МАП из яда Ь. ¡агаЬаегг

I длина длина

пептид аминокислотная последовательность препро-участка предшественника

_ ___пре-, а.к. про-, а.к.

1 10 20 30 40 50 60

Ыс 1 MKYFWALALAVALVCIAESTAYDVNEELENELDDLSDAAWLAKAAEDLQALDDFEESEESR 22 40

Ыс 2а, 2Ь MKYFVIALALAVALVCIAESTAYEVNEELENELDDLDDAAWLAVAEELQGLEDFEESR 22 36

Ыс За, ЗЬ MKTYAVLLALWAFVCIAESTGYPVEDLEDDELTELEAEALLEDLLEDLELEDLDYNEEAR 22 39

Ыс 4а2 MKFSIIALALAVAFVCVAESRSEEEGYDVSEEIQAEELEEAER 22 21

Ыс 5 MKYCWILALLVALVCITESRSTETGYAVAETLEDNDLDELQAYLEEIAEASEMEDFSNIEEAR 22 42

Ыс 6а, 6Ь2 МКУРУУАЬТЬАУАРУС1ЕЕСКТУЕ1СУАУЗЕБРБ0ЫЕ1ВМЕЕАН 22 22

Ыс 7 МКРУтеАЬАЬЬУАР¥С1АЕЗРЗУЕТЕЯАУБАВЬЕПОЬВВЬЕЕУЬЕС1АЕАЬЕЬЕПРРПТЕЕАР 22 41

С1Т I2 МКУРУУАЬАЬУААРАС1АЕЗКРАЕ8ЕНЕЬАЕУЕЕЕЫЕЪАВЬЕБАтеЪЕНЪАБЪЗВЪЕЕАН 20 40

С1Т 2а, 2с2 МКУРРУЗЬАЪ'\/ААРАС1АЕЗКРАЕАЕНЕЬАЕУЕЕЕМЕЬАГ)ЬЕВАЕ^Л?ЬЕВЬАВЪЕПЬЕВЬЗВЬЕЕАЕ 20 46

С1Т За, ЗЬ MKYFWAFALVAAFVTIAAREPVETGYDLEEAEDEFGLSDLEDAEWLLELAEASEDLENLEDSEEAR 19 48

С1Т 4а МКСР1ЬАААЬУЬАРАС1ААЗЕРАЕТЕКЕБЬНПЬЗПЬЕБЕЕ№ЬПЕ1,ЕЕААЕУЬЕ31^ 20 36

М1уБ а, Ь, с МКЗР¥РАЬАЫУАРАС13ЕЗКЗВНТСУЕЕЕЕЫЬЕБЗЕЬТБ^АААЬЬЕЕЬАЕАЗЕМВПЬЗУТЕЕАаСЕЕ 22 47

_1_10_20_30_40_50_60_

'Сигнальные пептиды подчеркнуты. Мотивы РОМ выделены жирным шрифтом. 2Для Ьй 4Ь и 6с, С1Т 1е, 1И, 1-12 и 2Ь -точечные замены.

Рисунок 6. Структура предшественников

МАП из яда /.. ШгаЬае\ч. Схематично показана организация аминокислотных последовательностей предшественников, отмечены их составные элементы: сигнальные пептиды, пропоследова-тельности, зрелые пептиды. Показаны аминокислотные последовательности мотивов РОМ и ¡РОМ, разделяющие зрелые цепи в «двойных» и «сложных» (для 1дс 4а) предшественниках. Остатки аргинина, по которым предположительно идет расщепление полипептидных цепей, выделены жирным шрифтом

Простые: Ыс 1, 2а, 2Ъ, За, ЗЪ, 5,7; М1ув; СГГ

Двойные: Ыс 6а, 6Ь, 6с

■ - сигнальныи пептид □ - ггропоследовательность В -зрелый пептид -Ире

Сложные: Цс 4а, 4Ь; 11ре

сиеозеедск сиеозеелся (зшкеелсе скеотеелк

Зрелые цепи МАП соответствуют С-концевым областям молекул предшественников. У предшественников латарцинов Ltc За, ЗЬ, 4а, 4Ь и 5, а также всех мет-лизинов и цито-инсектотоксина CIT 4а был идентифицирован дополнительный С-концевой остаток глицина, что служит дополнительным доводом в пользу посттрансляционной модификации зрелых молекул ш vivo под действием амидирующего фермента (пептидилглицин а-амидирующей монооксигеназы). Предшественник Ltc 1 содержит дополнительный С-концевой остаток лизина, по-видимому, удаляемый посттрансляционно карбоксипептидазой типа D или Е.

Промежуточное положение в аминокислотной последовательности предшественников между сигнальным и зрелым пептидами занимают пропоследовательности (про-фрагменты) пропептидов. Функция этих элементов, по общему мнению, состоит как в обеспечении корректности созревания и секреции активных молекул, так и в защите клеток-продуцентов от нежелательной цитолитической активности зрелых цепей. Пропоследовательности, как правило, несут большой отрицательный заряд (см. табл. 7; остатки дикарбоновых аминокислот составляют в среднем 40%), компенсирующий положительный заряд МАП, и тем самым препятствуют электростатическому связыванию последних с мембранами. Для обнаруженных нами пропоследовательностей, как и для зрелых МАП, характерна склонность к формированию a-спиралей ввиду высокого содержания спираль-формирующих остатков. Более того, эти a-спирали также характеризуются амфипатичностью и походят на a-спиральные АМП с измененным знаком зарядов (рис. 7А). Мы предполагаем, что в составе пропептидов происходит взаимная индукция спирализации пропоследовательностей и зрелых цепей с образованием устойчивой пространственной структуры типа a-спиральной шпильки (рис. 7Б), стабилизируемой электростатическими и гидрофобными взаимодействиями.

Отделение зрелых цепей от пропоследовательностей происходит в результате посттрансляционного ограниченного протеолиза предшественников под действием протеаз, специфичных в отношении специальных последовательностей аминокислот, т.н. сайтов процессинга или мотивов созревания. Мотивы, определяющие протеолиз предшественников токсинов и

Рисунок 7. Предполагаемая структура молекулы предшественника 1Лс 2а.

(А) Круговая диаграмма пропоследовательности предшественника в а-спиральной конфор-мации. Остатки гидрофобных аминокислот отмечены серым, отрицательно заряженных -штриховкой. (Б) Схема структурной организации молекулы предшественника в виде а-спиральной шпильки.

созревания. Мотивы, определяющие протеолиз предшественников токсинов и ЦП из яда пауков получили название Р()М и ¡Р()М. Мотив РС)М описывается формулой Х\ХгХ^, где любой Хп = Е. Иначе говоря, по общепринятой номенклатуре Шехтера-Бергера остатком Р1, формирующим гидролизуемую связь Р1-Р1', является остаток аргинина, а в положениях Р2-Р4 (иногда до Р6) расположен остаток глутаминовой кислоты. Мотив ¡РС>М является симметричной копией РОМ: положение Р1 также занято остатком аргинина, а остаток глутамата лежит в области РГ-Р5'. Р(}М и ¡РС)М отличаются от классических «двухосновных» мотивов, узнаваемых субтилизин-подобными ферментами процессинга кексинового/фуринового типа.

По числу мотивов ограниченного протеолиза и зрелых цепей предшественники МАП из яда Ь. 1агаЪае\ч были разделены на три группы:

«Простые» предшественники - для латарцинов Ыс 1, 2а, За, ЗЬ, 5 и 7, а также всех мет-лизинов и цито-инсектотоксинов - содержат один мотив РОМ и единственную зрелую цепь. Похожую структуру со сравнительно протяженной пропоследовательностью имеют предшественники дефензинов из различных животных, дермасептинов, мелиттина и др.

«Двойные» предшественники содержат по два мотива РС>М и две зрелые цепи: А'-концевую (Ыс 6Ь или 6с) и С-концевую (Ыс 6а). Зрелые цепи являются близкими гомологами (-75% идентичных остатков), и двойные предшественники возникли, по-видимому, в результате дупликации кодирующей области генов. Похожей структурой обладают предшественники других МАП: апидецинов из медоносной пчелы (до 9 повторов), наеглериапоров из амебофлагелляты Naegleria /о\\'1ег1 (4-5 повторов), магайнинов из лягушки Хепориз 1ае\ч.<; (6 повторов) и АМП из бальзамина садового (6 повторов). Несмотря на отсутствие мотива ¡РС>М, регуляторные остатки мотива РОМ оказались удалены из структуры зрелого Ыс 6Ь.

Отмечено удивительное сходство в организации последовательности зрелых С1Т 1 и 2 с «двойными» предшественниками коротких МАП. Цито-инсектотоксины рассматриваются как составленные из двух коротких пептидов (длина около 30 остатков), соединенных линкером 33ЕЕАС>38 или 35ЕЕАЕ38 у С1Т 1 и 34ЕЕУС>37 у С1Т 2, напоминающим мотив РОМ. Мы предполагаем, что данные семейства С1Т эволюционно возникли из «двойных» предшественников ЦП в результате мутации ключевого аргинина в сайте процессинга и, таким образом, представляют собой своеобразные «модульные» молекулы типа ЦП-ЦП. Мутация, приведшая к возникновению С1Т, была закреплена, поскольку имела позитивный эффект: цито-инсектотоксины, в отличие от коротких ЦП, обладали высокой инсектицидной активностью. На сегодня известен еще один пример «модульных» токсинов; это семейство скорпинов из яда скорпионов: в их структуре объединены модули линейного ЦП (АМП) и типичного дисульфид-содержащего нейротоксина скорпиона.

«Сложные» предшественники - для Ыс 4а и Ире 1 и 2, а также Ыс 4Ь и Яре 3 и 4, соответственно, - содержат пять мотивов РОМ и четыре мотива ¡РОМ. Зрелые латарцины соответствуют С-концевым областям предшественников, а последовательности, ограниченные мотивами созревания,

являются тандемными повторами высокогомологичных повторяющихся пептидных элементов (Rpe) (табл. 3), при этом последовательности латарцинов и Rpe значимого сходства не обнаруживают. С-Концевые остатки аргинина (из мотива iPQM) и глицина оказались удалены из структуры амидированных зрелых молекул, т.е. для Rpe характерны те же превращения, что и для биосинтеза других исследованных пептидов. Таким образом, сложные предшественники процессируются с образованием зрелых пептидов двух типов, а эволюция соответствующих генов, помимо умножения числа сегментов Rpe, включала более сложные стадии. Примеры предшественников АМП, процессирующихся с образованием двух типов зрелых молекул включают предшественники кателицидинов, хевеина из каучукового дерева Hevea brasiliensis, аттацина С из Drosophila и модульные белки-предшественники из австралийского ореха Macadamia integrifolia и тыквы крупной Cucurbita maxima.

Двойные и сложные предшественники - пример чрезвычайно экономичного использования аминокислотной последовательности по принципу «ничего лишнего», в их структуре отсутствуют «балластные» области, не имеющие определенной функции, а их созревание приводит к образованию большего числа зрелых молекул, чем в случае простых предшественников.

Получение латарцина 2а в Е. coli

Биотехнология служит альтернативой дорогостоящему химическому синтезу, и лекарства белковой и пептидной природы, как правило, производят с использованием бактериальных систем экспрессии, например, в Е. coli. В случае ЦП и АМП их химическая природа и биологическая активность являются очевидными препятствиями такому подходу. Линейные пептиды являются мишенями бактериальных протеаз, а биологическая активность ЦП и АМП может приводить к гибели клеток-продуцентов.

В качестве объекта для получения был выбран пептид Ltc 2а - короткий линейный АМП, проявляющий выраженную цитолитическую активность. Кроме того, был также получен природный пропептид Ltc 2а, содержащий кислую пропоследовательность. Для нейтрализации возможного токсического эффекта продуцируемых пептидов, для их стабилизации и увеличения уровня экспрессии их генов используют различные вспомогательные элементы. Один из распространенных подходов - получение искомых пептидов в виде химеры с собственным белком Е. coli тиоредоксином. Синтетические гены пептидов были клонированы в бактериальный вектор pET-32b (Novagen) для осуществления контролируемой экспрессии. Химерные белки содержали также последовательность, обеспечивающую возможность очистки с помощью аффинной хроматографии и сайт протеолиза для отделения искомого продукта. Поскольку целевые пептиды не содержат остатков метионина, проводился селективный гидролиз слитных белков с помощью бромциана. Конечной стадией получения пептидов служила ВЭЖХ (рис. 8). В результате достигнут выход рекомбинантных пептидов 2-3 мг с 1 л бактериальной культуры.

Рекомбинантный Ltc 2а по своим физико-химическим и биологическим свойствам был идентичен природному пептиду.

Рисунок 8. Получение рекомбинантных пептидов. (А) Электрофоретическое разделение фракций, полученных в ходе выделения гибридных белков тиоредоксина с Ltc 2а (дорожки 3, 4) и с пропептидом Ltc 2а (5, 6), в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. 1 - молекулярные стандарты; 2 - суммарный клеточный белок Е. coli BL21(DE3) до индукции; 3, 5 - после индукции 0,2 мМ изопропил-ß-Z)-тиогалактопиранозида; 4, 6 - очищенные гибридные белки. Слева указаны молекулярные массы использованных стандартов в кДа. Хроматографическое разделение продуктов гидролиза бромцианом гибридных белков с Ltc 2а (Б) и с пропептидом (В) (из 100 мл бактериальной культуры) на колонке Delta Pak Сщ (3,9 х 300 мм, Waters) в 0,1% трифторуксусной кислоте и линейном градиенте концентрации ацетонитрила (0-90% за 60 мин). Скорость элюции 1 мл/мин. Детекция по поглощению элюата при 210 нм. Стрелками отмечены фракции, содержащие целевые продукты.

А

1 2 3 4 5 6

lit

97- " 1 - S3

66- »

45- m

yt. »щ

30- m

20,1 - m

14,4 - ф

35 50

t, МИН

Функция пропоследовательности предшественников ЦП и АМП

Проведено сравнение свойств полноразмерного пропептида Ltc 2а, пропоследовательности и зрелого пептида (рис. 9, табл. 8). Предшественник представляет собой неактивный комплекс Ltc 2а с пропоследовательностью в а-спиральной конформации, что подтверждает выдвинутую нами гипотезу о нейтрализующей функции пропоследовательности.

Таблица 8. Свойства пропептида Ltc 2а и его фрагментов

Рисунок 9. Спектры кругового дихроизма1

30000

É

о 20000

Is 10000

X

У 0

&

Г—Ц -10000

(£)

-20000

— пропептид

— пропоследоватеяьность —зрелый Ltc 2а

пептид а-спираль, % (водная среда1) МИК, мкМ (Е. coli)

пропептид 42 >16

пропоследова-тельность 4 >16

зрелый Ltc 2а 8 0,5

190

200 210 220 230 240

д лина волны, нм

250

'Условия: 50 мМ Hepes, pH 7,3, 110 мМ NaCl; концентрация пептидов 0,5 мг/мл; длина оптического пути 0,01 см.

Уникальный молекулярный состав яда Ь. 1агаЬае\ч

Яды пауков представляют собой сложные многокомпонентные смеси чрезвычайно разнообразных по химическому строению и биологической функции веществ - солей, биогенных аминов, полиаминов, полипептидных нейротоксинов, цитолитических пептидов, ферментов, и т.д. Тем не менее, как правило, предпочтение отдается одному из типов компонентов, который составляет большую часть цельного яда. Большинство изученных на сегодняшний день пауков производят яд с преобладанием дисульфид-содержащих пептидных нейротоксинов. В одном яде могут присутствовать до несколько сотен родственных молекул со сходной пространственной структурой, стабилизированной инвариантными остатками полуцистина. Специфичность действия каждой молекулы определяется уникальной комбинацией вариабельных остатков, расположенных в петлевых участках между дисульфидными мостами. Такие ансамбли пептидных молекул яда принято называть природными комбинаторными библиотеками биологически активных веществ. Известно, по крайней мере, два исключения из описанной стратегии формирования компонентного состава яда: (а) пауки «вдовы» из рода Ьа1гос1ес1ш продуцируют высокоспециализированные белковые нейротоксины, латротоксины; (б) пауки кругопряды из семейства Агатске производят разнообразные ацилполиаминные токсины со средней специфичностью действия. Все три типа состава яда, тем не менее, сходны, поскольку основной компонент имеет нейротоксические свойства.

Среди изученных пауков Ь. ШгаЬаехч оказался уникальным по составу яда или «репертуару» вырабатываемых токсинов. Цитолитические пептиды латарцины, цито-инсектотоксины и цистеин-содержащие АМП вместе составляют более половины сухого вещества яда. Это свойство сближает паука Ь. 1агаЬае\1 с другими членистоногими, продуцирующими яд с выраженным цитолитическим действием - пчелами, шмелями, осами и муравьями. Другие пауки также производят яд с большим содержанием ЦП, однако на сегодняшний день это показано только для представителей надсемейства Ьусозо1(1еа: пауков «волков» рода из семейства Ьусоз1с1ае, пауков «рысей» из семейства Охуор1с1ае и «блуждающих» пауков из семейства 0:егис1ае. Во всех случаях большая и/или функционально более важная часть яда, тем не менее, представлена цистеин-содержащими нейротоксинами. Таким образом, состав яда этих пауков может быть описан как «промежуточный», в то время как Ь. 1агаЬае\п представляется уникальным «экспертом» по цитолитическим компонентам.

Биомолекулярное разнообразие цитолитических компонентов яда

По-видимому, в эволюции возникли две главных стратегии формирования компонентного состава яда с цитолитическими свойствами. Одна представлена медоносной пчелой, почти полностью полагающейся на ограниченное число активных молекул яда. Основные компоненты яда пчелы - пептид мелиттин и фермент фосфолипаза А2 - являются цитолитическими веществами широкого спектра действия. Другая стратегия предполагает большое «биомолекулярное»

разнообразие компонентов яда, сходное с комбинаторными библиотеками природных нейротоксинов: одновременно в яде присутствует большое число как сходных (гомологичных), так и весьма различающихся по структуре цитолитических пептидов. Примерами данной стратегии служат муравей РасЪусопдуЬ goeldii (в яде обнаружено 15 коротких линейных ЦП и АМП понерицинов, формирующих три семейства) и объект данной работы - паук Ь. ШгаЬаш.

Механизм формирования наблюдаемого биомолекулярного разнообразия, по-видимому, универсален для ядов с нейротоксическим и цитотоксическим действием. Для пептидных нейротоксинов и ЦП из яда пауков пути биосинтеза оказываются сходны. Для большинства ЦП из яда Ь. 1агаЬас\п, также как для нейротоксинов пауков, характерна «простая» организация предшественников: это препропептиды с кислой Л'-концевой пропоследовательностью, отделенной от зрелой цепи мотивом ограниченного протеолиза РОМ. Препро-участки предшественников консервативны, в то время как зрелые цепи отличаются большей вариабельностью. Такое явление «концентрирования» мутаций в тех областях генов, которые соответствуют зрелым полипептидам, получило название ускоренной эволюции и характерно для ядовитых животных с биомолекулярным разнообразием компонентов яда.

ВЫВОДЫ

1. Яд паука Ьаскезапа 1агаЬае\ч является уникальным по молекулярному составу с преобладанием цитолитических пептидов. Установлены полные аминокислотные последовательности 41 новых пептидов, образующих 13 семейств. Для восьми семейств пептидов показана цитолитическая, антимикробная и мембранотропная активность.

2. Идентифицированы полные аминокислотные последовательности предшественников зрелых пептидов из яда Ь. ¡агаЬаеу!. Предложена схема биосинтеза активных молекул в результате созревания предшественников различного типа. Показана роль кислой пропоследовательности в нейтрализации активности зрелой цепи.

3. Открыт новый класс цито-инсектотоксинов, представляющих собой длинные (свыше 60 остатков), линейные, катионные и амфифильные пептиды с выраженной цитолитической, антимикробной и инсектицидной активностью. Предположена эволюция некоторых цито-инсектотоксинов из предшественников модульной организации.

4. В бактериальной системе экспрессии получен рекомбинантный антимикробный пептид латарцин 2а, идентичный природному.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Kozlov S.A., Vassilevski А.А., Feofanov A.V., Surovoy A.Y., Karpunin D.V., Grishin E.V. Latarcins, antimicrobial and cytolytic peptides from the venom of the spider Lachesana tarabaevi (Zodariidae) that exemplify biomolecular diversity. J. Biol. Chem. 2006, 281(30), 20983-20992.

2. Василевский A.А., Козлов C.A., Жмак M.H., Куделина И.А., Дубовский П.В., Шатурский О.Я., Арсеньев А.С., Гришин Е.В. Синтетические аналоги антимикробных пептидов из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi. Биоорг. хштя 2007, 33(4), 405-412.

3. Vassilevski А.А.. Kozlov S.A., Samsonova O.V., Egorova N.S., Karpunin D.V., Pluzhnikov K.A., Feofanov A.V., Grishin E.V. Cyto-insectotoxins, a novel class of cytolytic and insecticidal peptides. Biochem. J. 2008,411(3), 687-696.

4. Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Grishin E.V. Antimicrobial peptide precursor structures suggest effective production strategies. Recent Pat. Inflammation Allergy Drug Discovery 2008, 2(1), 58-63.

5. Shlyapnikov Y.M., Andreev Y.A., Kozlov S.A., Vassilevski A.A.. Grishin E.V. Bacterial production of latarcin 2a, a potent antimicrobial peptide from spider venom. Protein Expression Parif. 2008, 60(1), 89-95.

Глава в монографии:

Kozlov S.A., Vassilevski A.A.. Grishin E.V. (2007) Peptidomics of short linear cytolytic peptides from spider venom. In: Peptidomics: Methods and Applications (Soloviev M., Shaw C., Andren P., eds.), pp. 55-70. John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey. Патенты РФ:

1. Козлов С.А., Василевский А.А., Феофанов А.В., Арсеньев А.С., Гришин Е.В. Пептиды, проявляющие антимикробную активность. №2302425 (2007).

2. Козлов С.А., Василевский А.А., Феофанов А.В., Суровой А.Ю., Арсеньев А.С., Гришин Е.В. Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность. №2302466 (2007).

3. Козлов С.А., Василевский А.А., Феофанов А.В., Суровой А.Ю., Арсеньев А.С., Гришин Е.В. Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность. №2302467 (2007).

4. Козлов С.А., Василевский А.А.. Воронцова О.В., Полянский А.А., Волынский П.Е., Феофанов А.В., Ефремов Р.Г., Арсеньев А.С., Гришин Е.В. Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность. №2306148

(2007).

5. Полянский А.А., Волынский П.Е., Василевский А.А.. Воронцова О.В., Козлов С.А., Феофанов А.В., Арсеньев А.С., Гришин Е.В., Ефремов Р.Г. Способ получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью. №2316336 (2008).

6. Козлов С.А., Василевский А.А.. Самсонова О.В., Полянский А.А., Волынский П.Е., Феофанов А.В., Ефремов Р.Г., Арсеньев А.С., Гришин Е.В. Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность. №2319745

(2008).

Тезисы докладов:

1. Vassilevski А.А.. Kozlov S.A., Feofanov A.V., Surovoy A.Y., Karpunin D.V., Grishin E.V. Latarcins - a group of spider venom cytolytic peptides with high structural diversity. 15th World Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins. July 23-28, 2006; Glasgow, UK.

2. Василевский A.A., Козлов С.А., Гришин E.B. Цитолитические пептиды из ядов членистоногих. VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. 25-27 октября 2006; Москва, Россия.

3. Vassilevski А.А., Kozlov S.A., Feofanov A.V., Surovoy A.Y., Karpunin D.V., Grishin E.V. Antimicrobial and cytolytic peptides from spider venom - an integrated approach. 2nd Workshop on Biophysics of Membrane-active Peptides. April 1-4, 2007; Lisbon, Portugal.

4. Vassilevski A.A.. Kozlov S.A., Grishin E.V. Membrane-active peptides from arthropod venom. Gordon Research Conference "Mechanisms of Membrane Transport". June 10-15, 2007; Tilton,USA.

5. Василевский А.А., Козлов C.A., Гришин E.B. Мембрано-активные пептиды из яда членистоногих. III Российский симпозиум «Белки и пептиды». 16-21 сентября 2007; Пущино, Россия.

6. Vassilevski A.A.. Kozlov S.A., Grishin E.V. Targeting the membrane: what can membrane-active peptides do for us? Symposium "Neuroreceptors: structure, mechanism of action and role in pathologies". October 4-5, 2007; Moscow, Russia.

7. Василевский А.А.. Козлов СЛ., Гришин E.B. Мембрано-активные пептиды: структура, функция, применение. XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 11-15 февраля 2008; Москва, Россия.

8. Василевский А.А., Козлов С.А., Гришин Е.В. Новые классы и группы цитолитических и антимикробных пептидов из яда пауков. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008; Новосибирск, Россия.

9. Vassilevski А.А.. Kozlov S.A., Samsonova O.V., Pluzhnikov K.A., Feofanov A.V., Grishin E.V. Cyto-insectotoxins, a novel class of spider venom constituents. 16th European Section Meeting of the International Society on Toxinology. September 7-10, 2008; Leuven, Belgium.

10.Kozlov S., Vassilevski A.. Grishin E. Antimicrobial peptide and spider toxin precursors: structural organization and maturation. 16th European Section Meeting of the International Society on Toxinology. September 7-10, 2008; Leuven, Belgium.

11 .Vassilevski A.A.. Shlyapnikov, Y.M., Andreev Y.A., Grishin E.V. Bacterial production of a potent antimicrobial peptide from spider venom. 16th European Section Meeting of the International Society on Toxinology. September 7-10, 2008; Leuven, Belgium.

Заказ № 161/10/08 Подписано в печать 17.10 2008 Тираж 110 экз Уел п.л 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ! www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Мембрано-активные пептиды

2.2. Цитолитические, антимикробные и защитные пептиды

2.3. Многообразие цитолитических и антимикробных пептидов

2.4. Биосинтез цитолитических и антимикробных пептидов

2.5. Механизм действия цитолитических и антимикробных пептидов

2.6. Состав ядов членистоногих

2.7. Цитолитические и антимикробные пептиды из ядов членистоногих: своеобразие и многообразие

2.7.1. Место цитолитических и антимикробных пептидов из ядов в общей системе

2.7.2. Классификация цитолитических и антимикробных пептидов из ядов членистоногих

2.8. Цитолитические и антимикробные пептиды из ядов пауков

2.9. Цитолитические и антимикробные пептиды из ядов членистоногих: биологическая функция

Полипептидные соединения, функция которых связана с взаимодействием с биологическими мембранами или структура которых обеспечивает эффективность этих взаимодействий, называют мембрано-активными полипептидами (МАП). МАП представляют обширный и гетерогенный класс соединений, используемых живыми организмами от бактерий до человека в различных целях. В основе такой универсальности МАП лежит способность взаимодействовать не со специфическим белковым рецептором, а с липидным бислоем, неотъемлемым компонентом клеточных форм жизни. Благодаря этому свойству МАП являются вездесущими компонентами внутри- и межвидовых отношений, эффекторными соединениями в конкурентной борьбе [1-14].

Характерная черта большого числа МАП - способность к дестабилизации мембраны-мишени, приводящей к клеточной гибели. МАП, функция которых состоит в разрушении мембраны и убийстве клетки, называют цитолитическими пептидами (ЦП). Природные ЦП представляют собой одно из наиболее простых по механизму действия и структурной организации, а также наиболее древних по происхождению и универсальных по сфере применения орудий в борьбе организмов друг с другом. Действительно, ЦП чрезвычайно распространены в природе, их находят практически у всех форм живых существ [7, 9, 10, 12, 15].

Организмы различного систематического положения (как эу-, так и прокариоты) продуцируют разнообразные пептиды с выраженным антимикробным действием, т.н. антимикробные пептиды (АМП), большая часть которых проявляют цитолитические свойства [9, 12, 15]. Многие из этих соединений являются неотъемлемой частью системы врожденного иммунитета высших организмов (животных и растений), характерного, в отличие от приобретенного, практически для всех многоклеточных, а не только для высших позвоночных [16-18]. Таким образом, для многих ЦП (АМП) характерна защитная функция, и эти пептиды называют защитными (ЗП). В литературе введен также термин «host defense peptides» в качестве синонима защитных АМП или как уточнение, указывающее на вовлеченность данных пептидов во врожденный иммунитет [10].

Не менее эффективно ЦП могут быть использованы и в целях нападения. ЦП -распространенные эффекторные молекулы-участники в конкурентной борьбе микроорганизмов [7]. Однако наиболее ярким примером служат ЦП, содержащиеся в природных ядах [4, 11]. Некоторые из этих молекул служат главным универсальным оружием ядовитых животных и являются наиболее значимым компонентом их яда, выполняющим центральную функцию убийства/парализации жертвы и/или отпугивания агрессора.

МАП являются удобной моделью для изучения белок-мембранных взаимодействий и, таким образом, представляют фундаментальный интерес. Практический интерес к ЦП основан на их антимикробной активности. Стремительный рост числа структурно новых антибиотиков, вводимых в клиническую практику, наблюдавшийся в 40-50-х годах прошлого столетия, сменился длительным инновационным кризисом, который продолжается и сегодня [19]. Широкое применение антибиотиков в качестве лечебных препаратов вызывает быстрое накопление устойчивых форм микроорганизмов, у которых клинически существенная резистентность возникает за период от нескольких месяцев до нескольких лет. Распространены случаи устойчивости целого ряда патогенов человека (Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae и многих других) практически к любому из применяемых препаратов [20-22].

По-видимому, принципиально новым классом природных антибиотиков, которые будут введены в клиническую практику, являются АМП [23]. Несмотря на существование более сильных антибиотиков, действующих при меньших концентрациях, АМП обладают рядом преимуществ. Способность быстро убивать клетки-мишени, широкий спектр действия, активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также относительная трудность в селекции устойчивых мутантов in vitro, позволяют рассматривать эти вещества в качестве основы для создания эффективных лекарств, особенно на фоне снижения потенциала обычных антибиотиков [24]. Учитывая широкое разнообразие ЦП из яда членистоногих, проявляющих различные спектры действия, предполагается возможным их использование как лекарственных прототипов.

Ущерб, наносимый мировому сельскому хозяйству со стороны патогенов культурных растений (грибов, бактерий, вирусов и вироидов) и насекомых-вредителей (две главные причины ущерба), оценивается трлн. рублей ежегодно. Потери нередко достигают 45% урожая. Современные методы, применяемые с целью снижения убытков, в основном сводятся к использованию синтетических пестицидов, многие из которых являются экологически агрессивными веществами. Использование химических средств защиты растений представляет значительную опасность для окружающей среды, биологические средства защиты растений являются более безопасными. Внедрение инсектицидов нового поколения позволило улучшить ситуацию лишь на 5-10% [25].

Применение методов генной инженерии для трансформации растений открывает новые возможности создания культур, обладающих широкой устойчивостью к патогенам, вредителям, а также абиотическому стрессу (засухе, засоленности почвы и др.). Пионерские работы по получению резистентных сортов сельскохозяйственных культур с использованием технологий рекомбинантных ДНК были выполнены около 20 лет назад [26, 27]. С использованием гена инсектицидного белка бактерии Bacillus thuringiensis были получены трансгенные растения табака, устойчивые по отношению к паразитическим личинкам бабочки Manducta sexta. С тех пор, по крайней мере, 10 генов энтомотоксинов из В. thuringiensis были перенесены и экспрессированы как минимум в 26 видах растений, приобретших устойчивость к некоторым вредителям [28]. Значительная часть мирового урожая приходится сегодня на долю ^/-трансформированных продуктов (информация взята с официального сайта Департамента сельского хозяйства США: www.aphis.usda.gov). Тем не менее, до сих пор не решен вопрос о безопасности ^/-содержащих продуктов для человека, не совсем ясны экологические последствия глобального распространения трансгенных растений, содержащих гены энтомотоксинов В. thuringiensis [29]. Кроме того, видимое нарушение межвидового барьера получает отрицательный отклик в современном обществе. На рынке практически не представлены другие ген-модифицированные сорта с повышенной устойчивостью. Более того, инженерия устойчивости к заболеваниям оказалась более сложной задачей, нежели повышение сопротивляемости насекомым. Согласно современным представлениям, ЦП и АМП представляют собой перспективный инструмент инженерии устойчивости растений к патогенам и могут быть использованы в «зеленой» биотехнологии.

Объект исследований

В качестве объекта исследования был выбран яд среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi Zonstein et Ovtchinnikov, 1999 из семейства Zodariidae («пауки-муравьеды»). Яд этого паука обладает наиболее выраженным цитолитическим действием в отношении различных клеток среди ядов около ста различных видов членистоногих из 25 семейств, имеющихся в коллекции лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН. Цельный яд обладает также высокой антимикробной активностью в отношении Escherichia coli со значением минимальной ингибирующей концентрации (МИК) 10 мкг/мл и высокой инсектицидной активностью против личинок серой мясной мухи Sarcophaga carnaria со значением средней летальной дозы (ЛД50) при инъекции 3 мкг/г; характер симптомов, вызываемых введением яда (некроз близлежащих тканей, обильное выделение жидкости), указывал на наличие в его составе цитолитических агентов [11]. Мы предположили, что яд L. tarabaevi является богатым источником новых ЦП и АМП.

Цель и задачи работы

Цель настоящей работы состояла в изучении цитолитических и антимикробных пептидов (ЦП и АМП) из яда среднеазиатского паука Ьаскезапа ШгаЪаелп. В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи: а) Провести идентификацию и выделение ЦП и АМП из цельного яда; б) Установить первичную структуру активных пептидов; в) Осуществить функциональную характеристику новых веществ; г) Изучить аминокислотную последовательность предшественников ЦП и АМП; д) Разработать систему гетерологичной экспрессии генов новых пептидов.

Стратегия исследований

Для изучения ЦП и АМП из яда Ь. tarabaevi мы использовали комплексный подход, объединивший в себе две независимых стратегии. Первая и более традиционная заключалась в выделении из яда индивидуальных активных соединений и установлении их аминокислотной последовательности. Вторая предусматривала анализ т зШсо транслированных нуклеотидных последовательностей из библиотеки кДНК ядовитых желез паука, имеющейся в лаборатории, и выявление потенциальных МАП. Сравнение двух групп данных позволило получить наиболее полную информацию о МАП яда.

Обзор литературы

Выводы

1. Яд паука Ьаскезапа (агаЬаеуг является уникальным по молекулярному составу с преобладанием цитолитических пептидов. Установлены полные аминокислотные последовательности 41 новых пептидов, образующих 13 семейств. Для восьми семейств пептидов показана цитолитическая, антимикробная и мембранотропная активность.

2. Идентифицированы полные аминокислотные последовательности предшественников зрелых пептидов из яда Ь. ¡агаЪае\п. Предложена схема биосинтеза активных молекул в результате созревания предшественников различного типа. Показана роль кислой пропоследовательности в нейтрализации активности зрелой цепи.

3. Открыт новый класс цито-инсектотоксинов, представляющих собой длинные (свыше 60 остатков), линейные, катионные и амфифильные пептиды с выраженной цитолитической, антимикробной и инсектицидной активностью. Предположена эволюция некоторых цито-инсектотоксинов из предшественников модульной организации.

4. В бактериальной системе экспрессии получен рекомбинантный антимикробный пептид латарцин 2а, идентичный природному.

2.10. Заключение

Подводя итог, следует отметить высокий научный и практический интерес к ЦП из яда членистоногих. С точки зрения синтеза эффекторных молекул, используемых в межорганизменных отношениях, ядовитые членистоногие по праву считаются «экспертами», а их яды - уникальными источниками таких молекул. ЦП представляют собой важный компонент яда, функции которого разнообразны. Эти соединения используются как модельные объекты для изучения белок- и пептид-мембранных взаимодействий, формирования биомолекулярного разнообразия яда, биосинтеза секретируемых молекул, структурно-функциональных отношений в полипептидах и т.д.

Материалы и методы исследования

3.1. Материалы

Реактивы: В работе использовались реактивы и материалы Clontech, ICN, Merck, Novabiochem, Novagen, Promega, Sigma-Aldrich (США), Fluka Chemie GmbH, (Германия), Криохром и Химмед.

Вода: Все растворы были приготовлены с использованием деионизованной воды (сопротивление 18,2 МОм), полученной на установке Millipore (США). Для биологических испытаний использовалась стерилизованная с помощью автоклавирования вода.

Биологический материал: Цельный яд паука Lachesana tarabaevi в виде лиофилизированного порошка приобретен у Fauna Laboratories (Казахстан). Бактериальные культуры для анализа антимикробной активности были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Бактериальные штаммы для молекулярного клонирования Escherichia coli XLl-Blue, а также для проведения экспрессии Е. coli BL21(DE3) приобретены у компании Novagen (США).

3.2. Разделение яда. Очистка пептидов

Для разделения яда с целью получения индивидуальных активных компонентов проводили последовательно 2-3 стадии хроматографии. На первом этапе яд подвергался эксклюзионной хроматографии (гель-фильтрации), а далее фракция, содержащая пептидные компоненты, разделялась по методу обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).

3.2.1. Гель-фильтрация

10 мкл цельного яда L. tarabaevi предварительно высушивали лиофильно и получали ~2 мг сухого веса. Сухой яд растворяли в 150 мкл элюирующего раствора для эксклюзионной хроматографии (10% CH3CN, 0,1% трифторуксусная кислота (ТФУ), v/v) и наносили на колонку с высокой разрешающей способностью TSK 2000SW (7,5 х 600 мм, размер пор 12,5 нм, диаметр частиц 10 мкм; Beckman, Япония), на которой, по заявлению производителя, эффективно разделяются вещества с молекулярными массами в диапазоне 5-100 кДа. С помощью хроматографа System Gold (Beckman, США) элюирующий раствор подавали на колонку со скоростью 0,5 мл/мин, предварительно пропуская через дегазер. Детекцию осуществляли по оптической плотности элюата при 210 нм с регистрацией на компьютере, снабженном программой МультиХром (Амперсенд). Фракции отбирали с помощью автоматического коллектора. Промывку колонки осуществляли этиловым спиртом.

3.2.2. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

Полученную фракцию, содержащую активные компоненты, разделяли на аналитической колонке Vydac 218ТР54 Qg (4,6 х 250 мм, размер пор 30 нм, диаметр частиц 5 мкм; Separations Group, США) с использованием градиентного хроматографа (Kontron Instruments, Великобритания), снабженного насосами System 525 и детектором 535, а также дегазером 3415а (ERC, Япония). Раствор А - 0,1%-ная (v/v) ТФУ в воде, раствор Б - 0,1%-ная ТФУ в ацетонитриле. Перед поступлением на колонку растворы дегазировали. Пробы наносились на колонку, переведенную в стартовый раствор А. Разделение проводили в линейном градиенте ацетонитрила: от 0 до 60% раствора Б, т.е. от 0 до 60% по ацетонитрилу, в течение 90 мин при комнатной температуре (23°С) и скорости потока 0,7 мл/мин. Детекцию осуществляли по оптической плотности элюата при 210 и 280 нм с регистрацией на компьютере, снабженном программой Kroma System 2000 (BioTek Instruments, США). Колонку промывали 80%-ным раствором Б.

С целью окончательной очистки выделенных соединений использовали дополнительное разделение с помощью ОФ-ВЭЖХ в измененных условиях: (а) на той же колонке Vydac Cis с иным режимом разделения или (б) с использованием иного элюирующего раствора; (в) на колонке Ascentis RP-Amide (2,1 х 100 мм, размер пор 10 нм, диаметр частиц 3 мкм; Supelco, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила со скоростью элюции 0,3 мл/мин.

Содержание примесей в очищенных фракциях оценивали с помощью аналитической ВЭЖХ на колонке Luna Cis (1 х 150 мм, размер пор 10 нм, диаметр частиц 3 мкм; Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 60% (v/v) в течение 100 минут со скоростью элюции 50 мкл/мин.

3.3. Масс-спектрометрия

Оценку молекулярных масс, а также индивидуальности очищенных веществ проводили с помощью масс-спектрометрического (МС) анализа. Использовали метод времяпролетной (time-of-flight, TOF) матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) масс-спектрометрии (MC) (MALDI-TOF MS), т.е. десорбционный метод «мягкой» ионизации МАЛДИ, тип масс-анализатора времяпролетный.

В ходе подготовки проб для анализа были учтены методические указания в руководствах по эксплуатации масс-спектрометров соответствующих фирм-производителей. Использовали наиболее распространенный метод «высушенной капли» ("dried-droplet"). От фракций, полученных методами ОФ-ВЭЖХ или гель-фильтрации, отбирали аликвоты по 250 мкл и при необходимости доводили до конечных концентраций содержащихся в них веществ порядка 2-10 мкМ на вакуумном концентраторе. На мишени смешивали равные объемы (по 0,5 мкл) образцов и раствора матрицы - 2,5-дигидроксибензойной кислоты (10 мг/мл в 70%-ном CH3CN, 0,1%-ной ТФУ, v/v) или а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (10 мг/мл в 50%-ном CH3CN, 0,1%-ной ТФУ, v/v), - высушивали на воздухе.

Масс-спектры получали на МАЛДИ-времяпролетных масс-спектрометрах M@LDI-LR (Micromass, Великобритания) и Ultraflex TOF-TOF (Bruker Daltonik GmbH, Германия), оснащенных УФ-лазером (337 нм), с идентификацией положительных ионов в линейном режиме (измерение средних значений молекулярных масс) или с использованием рефлектрона (измерение моноизотопных молекулярных масс). Калибровку приборов проводили с использованием наборов стандартов ProteoMass peptide and protein MALDI-MS calibration kit (диапазон молекулярных масс 700-66000 Да) или ProteoMass peptide MALDI-MS calibration kit (700-3500 Да) (Sigma-Aldrich, США). Заявленная производителями точность измерения масс составляла 50 и 5 миллионных долей для M@LDI-LR и Ultraflex, соответственно. Масс-спектры записывались в память компьютера и анализировались с помощью программ Bruker DataAnalysis for TOF.

Секвенирование пептидов с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) проводили на масс-спектрометре Ultraflex TOF-TOF согласно указаниям производителя с использованием ячейки, где происходит фрагментация «родительских» ионов и второго времяпролетного масс-анализатора для измерения масс полученных фрагментов.

3.4. Восстановление дисульфидных связей и алкилирование тиольных групп

Реакции восстановления дисульфидов 1,4-дитиотреитолом (ДТТ) и алкилирования тиолов 4-винилпиридином (ВП) с образованием остатков пиридилэтилцистеина вели согласно модифицированной методике [245, 246]. Учитывались практические советы и теоретические соображения, приведенные в работе [247].

Высушенные на вакуумном концентраторе аликвоты фракций, соответствующие порядка 1 нмоль веществ, растворяли в 40 мкл раствора, содержащего 6 М гуанидингидрохлорид, 3 мМ ЭДТА, 0,5 М Трис-HCl, рН 8,5. Затем к пробам добавляли 2 мкл

1,4 M ДТТ в воде, т.е. заведомо 100-кратный избыток, перемешивали и инкубировали их в течение 4 ч при 40°С в атмосфере азота.

К восстановленным образцам добавляли 4 мкл 50%-ного (v/v) ВП в изопропаноле, т.е. более чем 10-кратный избыток по отношению к ДТТ, перемешивали. Невосстановленные образцы высушивали на вакуумном концентраторе и растворяли в 40 мкл раствора, использовавшегося для реакции с ДТТ, после чего сразу добавляли ВП. Пробы инкубировали 15-20 мин в темноте при комнатной температуре в атмосфере азота, после чего проводили разделение продуктов методом ОФ-ВЭЖХ на аналитической колонке Jupiter С5 (2 х 150 мм, размер пор 30 нм, диаметр частиц 5 мкм; Phenomenex, США) со скоростью элюции 0,3 мл/мин. При этом сначала изократически элюировали побочные продукты реакции и остатки реагентов, поглощающие в УФ-области, 5%-ным CH3CN до установления ровной базовой линии, затем проводили элюцию целевых продуктов реакции в градиентном режиме.

3.5. Определение TV-концевой аминокислотной последовательности

3.5.1. Автоматическое секвенирование по Эдману

Определение Л'-когщевой последовательности очищенных пептидных компонентов проводили методом ступенчатой деградации по Эдману на автоматическом секвенаторе Procise 492 (Applied Biosystems, США) по методике фирмы-изготовителя. Остатки цистеина определялись в виде пиридилэтилированного производного (см. выше).

3.5.2. Отщепление А'-концевого остатка пироглутаминовой кислоты

В случае «блокированных» /V-концевым остатком пироглутамата пептидов проводили предварительно процедуру «деблокирования» - отщепления этого остатка пироглутамат-аминопептидазой (пироглутамил-пептидазой I) - цистеиновой пептидазой из археи Pyrococcus furiosus (ЕС: 3.4.19.3; Sigma-Aldrich, США). Реакцию вели согласно процедуре, описанной в методических указаниях, распространяемых фирмой-производителем.

Порядка 1 нмоль очищенного пептида с блокированным iV-концевым аминокислотным остатком высушивали на вакуумном концентраторе и растворяли в 40 мкл 50 мМ фосфатного буфера, рН 7, содержащего 10 мМ ДТТ и 1 мМ ЭДТА. В пробирку добавляли 10 мкл того же раствора, содержащие 1 миллиединицу фермента (1 единица гидролизует 1 мкмоль пироглутамат-я-нитроанилида за 1 мин при рН 7 и 37°С). Пробу инкубировали в течение 2 ч при 75°С, после чего деблокированный пептид выделяли методом ОФ-ВЭЖХ на аналитической колонке Jupiter С5 (2 х 150 мм).

3.6. Селективный гидролиз полипептидов

С целью установления полной аминокислотной последовательности, выделенные индивидуальные полипептидные соединения подвергали селективному расщеплению: химическому - по остаткам метионина с использованием бромциана; ферментативному - по остаткам глутаминовой кислоты с помощью эндопротеиназы Glu-C (протеазы V8; глутамиловой эндопептидазы) - сериновой протеазы, продуцируемой бактерией Staphylococcus aureus штамма V8 (ЕС: 3.4.21.19; Boehringer Mannheim GmbH, Германия), аргинина с помощью эндопротеиназы Arg-C (тканевого калликреина) - сериновой протеазы, выделенной из подчелюстной слюнной железы мыши (ЕС: 3.4.21.35; Sigma-Aldrich, США) и аспарагиновой кислоты с помощью эндопротеиназы Asp-N (пептидил-Asp металлоэндопептидазы) - металлопротеазы, продуцируемой бактерией Pseudomonas fragi (ЕС: 3.4.24.33; Boehringer Mannheim GmbH, Германия).

3.6.1. Расщепление полипептидов бромцианом

В работе использовали методику профессора Егорова Ц.А. [246] с модификациями.

В реакцию брали около 1-3 нмоль очищенных веществ - для последующего секвенирования фрагментов по Эдману - и меньшие количества - для МС/МС. Высушенные на вакуумном концентраторе аликвоты полипептидов растворяли в 80%-ной водной (v/v) ТФУ, доводили до концентрации 0,1-1 мкг/мкл. Раствор 5 М бромциана в ацетонитриле (Sigma-Aldrich, США) прибавляли с заведомо 100-кратным избытком по отношению к остаткам метионина, пробы перемешивали, продували азотом и оставляли на 18 ч при комнатной температуре в темноте. Реакцию останавливали разбавлением смеси 10-ю объемами воды, пробы высушивали на вакуумном концентраторе, растворяли в 0,1% ТФУ. Продукты реакции разделяли по методу ОФ-ВЭЖХ на аналитической колонке Luna Cis (1 х 150 мм) или же анализировали с помощью МС/МС (в этом случае, как правило, пробы высушивали не полностью, а до объема ~10 мкл).

3.6.2. Ферментативный гидролиз полипептидов

Использовали методические указания компаний-производителей ферментов (см. выше).

Во всех случаях ~1 нмоль очищенного компонента высушивали на вакуумном концентраторе и растворяли в соответствующем буферном растворе, доводили до концентрации 0,1-1 мкг/мкл. В образцы вносили нужное количество фермента и инкубировали в нужных условиях, после чего отбирали аликвоты (как правило, 1/10 часть) для МС анализа, продукты реакции разделяли с помощью ОФ-ВЭЖХ на аналитической колонке Luna Cis (1 x 150 мм). Отобранные аликвоты обессоливали с помощью ZipTip (Millipore, США) и наносили на мишень для МС.

Ниже приводится таблица с указанием конкретных условий гидролиза полипептидов с использованием того или иного фермента.

1. Bechinger, B. and Lohner, K. (2006) Detergent-like actions of linear amphipathic cationic antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta 1758, 1529-1539

2. Raghuraman, H. and Chattopadhyay, A. (2007) Melittin: a membrane-active peptide with diverse functions. Biosci Rep 27, 189-223

3. Efremov, R. G., Chugunov, A. O., Pyrkov, T. V., Priestie, J. P., Arseniev, A. S. and Jacoby, E. (2007) Molecular lipophilicity in protein modeling and drug design. Curr Med Chem 14, 393-415

4. Brown, K. L. and Hancock, R. E. (2006) Cationic host defense (antimicrobial) peptides. Curr Opin Immunol 18, 24-30

5. Kuhn-Nentwig, L. (2003) Antimicrobial and cytolytic peptides of venomous arthropods. Cell Mol Life Sei 60, 2651-2668

6. Tossi, A. and Sandri, L. (2002) Molecular diversity in gene-encoded, cationic antimicrobial polypeptides. Curr Pharm Des 8, 743-761

7. Walsh, C. (2003) Where will new antibiotics come from? Nat Rev Microbiol 1, 65-70 Walsh, C. (2000) Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406, 775-781

8. Finlay, B. B. and Hancock, R. E. (2004) Can innate immunity be enhanced to treat microbial infections? Nat Rev Microbiol 2, 497-504

9. Hancock, R. E. and Lehrer, R. (1998) Cationic peptides: a new source of antibiotics. Trends Biotechnol 16, 82-88

10. Oerke, E. C. (1994) Crop production and crop protection : estimated losses in major food and cash crops. Elsevier, Amsterdam ; Oxford

11. Andrews, R. E., Jr., Faust, R. M., Wabiko, H., Raymond, K. C. and Bulla, L. A., Jr. (1987) The biotechnology of Bacillus thuringiensis. Crit Rev Biotechnol 6, 163-23227