Новые подходы к изучению структурно-функционального разнообразия полипептидных токсинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

Козлов Сергей Александрович

Тема: НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ТОКСИНОВ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

1 7 МАР 2011

Москва-2011

4840832

Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Научный консультант: доктор химических наук, профессор, чл.-корр. РАН Гришин Евгений Васильевич

Предполагаемые официальные оппоненты:

- чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Рысков Алексей Петрович Лаборатория организации генома Института биологии гена

- доктор химических наук, профессор Уткин Юрий Николаевич Лаборатория молекулярной токсинологии Института биоорганической химии

- доктор биологических наук Лисица Андрей Валерьевич Лаборатория биоинформационных технологий Института биомедицинской химии

Предполагаемая Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится » уД^Г^ 2011 г. на заседании Диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института биоорганической химии по адресу: 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Автореферат разослан «*Ц » А. д 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

В.А. Олейников

I. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность проблемы

Современная биологическая наука характеризуется мощными технологическими прорывами, благодаря чему возросли темпы сбора и обработки биоинформации, ускорились процессы расшифровки структур новых биомолекул, активно разрабатываются и внедряются постгеномные технологии. Практическую ценность приобретает не просто накопление массивов данных о новых структурных единицах, но и их дальнейший анализ с использованием различных алгоритмов поиска функционально-значимых структур. Очевидно, что время «ручных» анализов безвозвратно ушло, поэтому, активно разрабатываются и внедряются многочисленные автоматизированные методы по работе с биоинформацией, в частности по анализу баз данных случайных нуклеотидных последовательностей (EST).

Настоящая работа посвящена изучению биологически активных молекул полипептидной природы, которые могут быть использованы в медицине, ветеринарии или агропромышленном комплексе. Интенсивный поиск новых активных белковых молекул проводится во всем мире с применением различного арсенала исследовательских средств. Для анализа собранных результатов существуют общие схемы обработки данных, отдельные приложения и автоматизированные программные комплексы. Однако, эффективность неспециализированных приложений очень низкая. Основываясь на общедоступных ресурсах белковых последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein.) и баз данных EST, полученных самостоятельно или загруженных с сетевого ресурса NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest), был предложен новый эффективный алгоритм анализа, специально созданный для поиска полипептидных токсинов.

Для поиска новых лекарственных средств идеально подходит яд животных - сложная многокомпонентная смесь различных биоактивных молекул. Созданный по принципу комбинаторной библиотеки яд одного вида животного может содержать от 10 до 500 различных компонентов. Таким образом, актуальными задачами исследования природных ядов являются, во-первых, характеристика структурного разнообразия различных компонентов, во-вторых, поиск соединений, обладающих специфическим действием на представляющую интерес биологическую мишень.

1.2. Цели работы

Основной задачей работы является разработка и практическая апробация новых подходов для направленного поиска полипептидных структур.

Данные о новых структурах могут быть получены разными способами. Прежде всего это проведение прямых исследований собранных образцов природных ядов. В этом случае используется техника постадийного

фракционирования компонентов или протеомика цельного яда. Эффективным также является применение комбинации обеих технологий. Более перспективный метод, дающий одновременно выверенные полипептидные последовательности компонентов яда, основан на анализе баз данных EST. Этот метод изучает транскриптом изучаемого образца и при наличии специально разработанных алгоритмов анализа позволяет идентифицировать большинство полипептидов в яде. Одна из целей работы связана с разработкой специализированного алгоритма анализа EST банков и метода предсказания зрелых полипептидных структур из ядов пауков.

В рамках работы проводился направленный поиск активных компонентов, имеющих выраженную токсичность к насекомым, способных эффективно подавлять рост микроорганизмов и модулировать проводимость ионотропного ванилоидного рецептора 1 (TRPV1).

1.3. Научная новизна и практическая значимость

Разработанные алгоритмы поиска полипептидных токсинов в базах данных показали большую эффективность по сравнению с традиционными методами анализа. Они могут быть успешно применены, как для систематизации уже собранных данных, так и для аннотирования вновь создаваемых банков последовательностей.

Полученные в ходе выполнения данной работы инсектотоксины и антимикробные пептиды представляют значительный практический интерес для сельского хозяйства, поскольку могут быть использованы для повышения устойчивости культурных растений.

Охарактеризованные в ходе выполнения этой работы антимикробные пептиды имеют определенный потенциал использования в медицинских целях в качестве антибиотиков нового типа.

Впервые обнаруженные природные полипептидные молекулы, обладающие ингибирующей активностью в отношении TRPV1 рецептора, могут быть использованы для создания лекарственных анальгетических средств нового поколения.

1.4. Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на российских и международных конференциях:

• VI Чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2002);

• III Съезд биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002);

• 14 Мировой конгресс по животным, растительным и микробным токсинам (Аделаида, 2003);

• Российский симпозиум по химии и биологии пептидов (Москва, 2003);

• Научная конференция «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005);

• 15 Мировой конгресс по животным, растительным и микробным токсинам (Глазго, 2006);

• VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006);

• 2 Симпозиум по биофизике мембрано-активных пептидов (Лиссабон,

2007);

• Симпозиум «Нейрорецепторы: структура, механизм действия и роль в патологиях» (Москва, 2007);

• III Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Пущино, 2007);

• XX Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва,

2008);

• IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008);

• 16 Собрание Европейской секции международного общества токсинологии (Лёвен, 2008);

• международная конференция "Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008);

• 12 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008);

• Международный форум по нанотехнологиям Rusnanotech08 (Москва, 2008);

• 34 Конгресс федерации Европейский биохимических обществ (Прага, 2009);

• IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009);

• Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009);

• Конгресс по TRP рецепторам (Стокгольм, 2009);

• Германо-Российский симпозиум «Молекулярная нейробиология сегодня и завтра» (Берлин, 2010).

1.5. Публикации

Материалы диссертационной работы отражены в 15 научных статьях, 3 обзорных статьях и 3 главах научных сборников.

1.6. Патенты

В рамках выполнения диссертационной работы получено 8 патентов Российской Федерации и 1 международный патент.

1.7. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц, 36 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, 3 приложений с аминокислотными последовательностями обсуждаемых в работе полипептидов, и списка литературы, включающего 258 источников.

II. Объекты и методы исследования

11.1. Объекты исследования

Природные яды животного происхождения по своему качественному составу можно условно разделить: на структурно ограниченные, структурно разнообразные и функционально ориентированные. Одними из самых интересных представителей ядовитой фауны являются пауки. Количество описанных биологических видов пауков огромно - более 41000. Число компонентов в их ядах в среднем более 100, что предполагает наличие нескольких миллионов структур активных молекул с чрезвычайно широким спектром действия.

Практически на уровне каждого вида паука реализовано широкое разнообразие синтезируемых структур за счет комбинаторики в распределении аминокислотных остатков на базе нескольких общих структурных матриц. Такая организация позволяет эффективно подбирать "ключи" к самым различным "замкам" клеточных рецепторов, поэтому поиск потенциальных лекарств среди полипептидных токсинов считается наиболее перспективным подходом. Под термином токсины в данной работе (и не только) подразумеваются все полипептидные молекулы, обнаруживаемые в природных ядах или выводимые из баз данных кДНК ядовитых желез. При этом полипептиды яда могут обладать или не обладать токсичностью, а также влиять или не влиять на состояние живых организмов.

Помимо пауков комбинаторные принципы построения полипептидных библиотек широко распространены в ядах морских животных, наиболее известные из них - улитки конусы и морские анемоны. Полипептидные токсины морских анемон также стали объектами исследования данной работы. Экстракт из тел одного вида тропической анемоны фракционировали

для выделения специфических полипептидных токсинов, для другого вида средиземноморской анемоны изучали многообразие токсинов, анализируя опубликованные данные библиотеки EST.

11.2. Основные реализованные в работе подходы

Развитие новых технологий и совершенствование инструментальной базы привело к появлению новых течений и тенденций в биохимии. Основной упор в работе сделан на внедрение новаторских технологий в процессы поиска новых полипептидных структур в природных ядах животных. Разработанные уникальные программы математического анализа массивов полипептидных последовательностей позволили сформулировать новые структурные мотивы и проследить последовательность формирования активных полипептидов из неактивного препробелка. В свою очередь, для подтверждения правильности расчетов и предсказаний проводились протеомные исследования различных образцов ядов животных, а также, использовались традиционные хроматографические методы выделения активных полипептидов.

В данной работе продемонстрирована неотъемлемая связь в исследовании белков и кодирующих их генов. Доказано, что для получения полной информации о структуре всевозможных вариантов имеющихся в ядах полипептидов следует подтверждать протеомные исследования геномными, а геномные исследования протеомными.

11.3. Использованные информационные ресурсы

Аминокислотные последовательности белков для проведения анализов были получены из депозитария национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein). Для выбора нужных последовательностей использовали различные специализированные запросы, сужающие поиск. Были получены с сервера, преобразованы в нужный формат и проанализированы следующие выборки аминокислотных последовательностей:

• 39903 аннотированные белковые последовательности с детализированной информацией о координатах активного полипептида для анализа созревания всевозможных белков предшественников многоклеточных организмов (январь 2008 года);

• 231 аминокислотная последовательность токсинов морских анемон (февраль 2010);

• 10903 последовательности полипептидных токсинов для проверки эффективности работы разработанных алгоритмов и запросов поиска (апрель 2010).

Для поиска токсинов морских анемон использовали готовый банк EST, созданный для средиземноморской анемоны Anemonia viridis. Весь объем

исходных данных в количестве 39939 EST был загружен с сервера NCBI (http://www.ncbi.nlin.nih.gov/nucest).

Структуру сигнального пептида устанавливали с помощью сетевого ресурса SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) по двум предлагаемым методикам расчета, на основе нейрональной сети и Hidden Markov модели. Для определения новизны найденных структур проводили поиск гомологии их первичной структуры против не вырожденной базы белковых последовательностей методами blastp и PSI-BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

III.Результаты и обсуждение

111.1. Разработка алгоритмов для анализа банков нуклеотидных последовательностей

Эффективный поиск полипептидных последовательностей в геномах неразрывно связан с определением всех возможных посттрансляционных модификаций и вычленением зрелой структуры. Структурное сходство у отдельных классов белков существует не только между зрелыми последовательностями, но, частично, и между удаляемыми при созревании препрофрагментами, которые тоже можно использовать при анализе. Разработку методов поиска полипептидных токсинов начинали с создания способа предсказания зрелой цепи для токсинов пауков.

При созревании разнообразные белки помимо удаления сигнального пептида на входе в эндоплазматический ретикулум претерпевают дальнейшие превращения в аппарате Гольджи. Эти превращения могут заключаться в одиночной или последовательной фрагментации исходной полипептидной цепи, гликозилировании, фосфорилировании и ацилировании аминокислотных остатков. Помимо этого, также могут осуществляться и другие менее распространенные посттрансляционных модификаций. Однако, наиболее важной и ответственной процедурой в формировании зрелой активной молекулы белка является, так называемый, ограниченный протеолиз белка под действием специфических эндопептидаз, часто именуемых конвертазами.

Изначально наличие пары положительно-заряженных аминокислотных остатков перед местом протеолитического расщепления полипептидной цепи считалось необходимым условием для ограниченного протеолиза. Первый фермент, способный разрушать такой тип связи, был открыт в 1984 году в дрожжах, и был назван кексином. Затем у млекопитающих удалось найти фермент из семейства субтилизин-подобных сериновых эндопротеиназ со сходной субстратной специфичностью, который был назван фурином. Позднее обнаружено было еще много сходных по биологической активности ферментов млекопитающих, получивших общее название субтилизин-подобные пропротеин конвертазы (СППК).

В общепринятых координатах ферментативного процессинга Шехтера и Бергера Р4-РЗ-Р2-РЦР1'-Р2'-РЗ' положение PI является наиболее консервативным и всегда соответствует остатку Arg, очень редко остатку Lys. Специфичность гидролиза пептидной связи определяется наличием еще одного положительно заряженного аминокислотного остатка преимущественно в положение Р2, реже в положениях Р6 или Р4. Для формализации поиска места фрагментирования полипептида по двум положительно-заряженным аминокислотным остаткам ввели обозначение этого структурного мотива как "Arginine cleavage by basic control" или сокращенно R(K)toR. По этому мотиву происходит процессинг множества важных сигнальных молекул, например, нейропептидов и гормонов, таких как энкефалины, кортикотропины, эндорфины, инсулин, гастрин и т.п.

Полипептидные токсины пауков в основном Arg/Lys богатые молекулы, поэтому наложение субстратной специфичности известных СППК приводила к тому, что при моделировании процесса созревания белков предшественников нарушалась структура их зрелой цепи. То есть, эти ферменты не могли участвовать в процессе созревания полипептидных токсинов пауков. Для определения специфического места ограниченного протеолиза, была проведена статистическая обработка всех данных о структуре белков предшественников токсинов пауков. На основе проведенного анализа удалось идентифицировать новый мотив ограниченного протеолиза, который получил название "Processing Quadruplet Motif' (ПКМ). Изначально мотив ПКМ описывал только особенности аминокислотного состава фрагмента из 4 аминокислотных остатков (координаты Р4-Р1). Последующий анализ первичных структур различных белков предшественников выявил, что мотив узнавания более обширен и охватывает интервал Р6-Р1. Мотив описывает взаимное расположение одного или нескольких регуляторных аминокислотных остатков Glu (интервал Р6-Р2) перед расщепляемой пептидной связью Arg-Xaa. По аналогии с мотивом СППК новый структурный мотив получил название "Arginine cleavage by Glutamic acid control" или сокращенно EtoR.

Белки предшественники с наличием двух или более зрелых последовательностей, следует рассматривать как сложные или «комплексные» белки. В результате их созревания из одной исходной полипептидной цепи получается не менее двух активных компонентов. Это часто проявляется при синтезе небольших пептидов, особенно нейропептидов и мембрано-активных пептидов (МАП). Если в каждой из последовательностей есть аминокислотные остатки Cys, то после замыкания дисульфидных связей (например, синтез инсулина) может получаться многоцепочечный белок.

Анализ «комплексных» белков предшественников пауков привел к открытию еще одного нового структурного мотива ограниченного протеолиза. Мотив по своей сути симметричен мотиву ПКМ. Расщепление пептидной связи происходит по С-концу аминокислотного остатка Arg.

Специфичность разрываемой связи также задается аминокислотным остатком GIu, располагающимся после расщепляемой связи в положениях РГ-Р5'. Этот структурный мотив получил название inversed Processing Quadruplet Мотив (иПКМ), или EafterR. Мотивы EtoR и EafterR имеют характерное симметричное расположение в последовательности пробелка. Мотив EtoR всегда располагается с Л'-концевой части активного пептида, а мотив EafterR всегда с С-концевой.

Для выяснения роли новых мотивов EtoR и EafterR в процессах созревания каких-либо других активных полипептидов потребовалось дополнительное исследование. Была сделана выборка 39903 аминокислотных последовательностей белков предшественников полипептидов, относящихся к многоклеточным организмам. Из них была отобрана 6571 последовательность белка предшественника, в состав которой входил хотя бы один выщепляемый профрагмент. Для каждой последовательности реконструировали этапы ферментативных превращений от белка предшественника до зрелой молекулы и определяли мотив ограниченного протеолиза. Результаты сведены в таблице 1.

Таблица 1 Белки предшественники из группы аннотированных последовательностей, для которых были определены мотивы ограниченного протеолиза конвертазами.

Тип предшественника Количество последовательностей R(K)toR Оба мотива EtoR/EafterR

Простой 5168 872 (16.9%) 240 (4.6%) 174(3.4%)

Комплексный (2 активных фрагмента) 908 446(49.1%) 69(7.6%) 19(2.1%)

Комплексный (более 2 активных фрагментов) 495 203 (41.0%) 39 (7.9%) 9(1.8%)

ВСЕГО 6571 1521 (23.1%) 348 (5.3%) 202(3.1%)

Из результатов проведенного анализа следует, что ограниченный протеолиз для большинства известных активных полипептидов происходит под действием СППК. Как видно из таблицы почти четверть проанализированных последовательностей созревает с участием ферментов этого типа. В случае комплексных предшественников участие СППК возрастает почти до 50%. Для части белков предшественников подходит расщепление как по Е1оЛ/ЕайеЛ, так и по R(K)toR мотиву.

Рисунок 1 Зависимость типа ограниченного протеолиза белков предшественников от биологической активности. Белые столбики - мотив ЯСК^оЯ, черные - ЕЬЖ/ЕайегК, серые столбики - оба мотива равновероятны. По оси ординат приведено количественное значение в рассматриваемой выборке.

Рисунок 2 Распространенность мотивов созревания пробелков в зависимости от класса животных: А - для предшественников нейротоксинов и Б - для предшественников антимикробных пептидов и цитотоксинов. Белые столбики соответствуют мотиву черные - ЕЬэК/ЕаПегР!., серые

столбики - оба мотива равновероятны. По оси ординат приведено количественное значение в рассматриваемой выборке.

При рассмотрении групп белков с различной функцией выясняется, что преимущественная роль СППК осуществляется не всегда. Так, открытые мотивы Е1о11/ЕаА:ег11, хотя и уступают по частоте встречаемости мотиву ЩК^оЯ, но составляют заметную конкуренцию ему в случае цитотоксинов и нейротоксинов (см. рисунок 1).

Интересно отметить, что среди предшественников токсинов из разных ядовитых животных (данные на рисунке 2А) мотив Е1о11/ЕаАегК заметно доминирует у паукообразных, где он встречается почти у всех проанализированных последовательностей. При созревании антимикробных пептидов и порообразующих токсинов у ряда животных (данные на рисунке 2Б) распространенность мотива Е1оК/ЕайегЯ была также выше встречаемости традиционного мотива Я(К)1оЯ.

Практическим итогом этого этапа работы стала разработка алгоритма анализа основных этапов деградации белков предшественников, приведенного на рисунке 3, с помощью которого можно предсказывать зрелые полипептидные последовательности секретируемых белков за 4 стадии.

ЭТАП 1 (сигнальная пелтидаза)

[л1':

штый кигнашый

шжж:

ЭТАП 2 (регулярный мотив) 1

:

ЕИ С

^ЭТАП2 (симметричный мотив)

за

га:

ЭТАП 3 (эндопептидазы) ^

I 1 с

1 В

ЭТАП 4 (амидирование) ^

► вой Щ ЕаЯегЯ

у КДОЫ!

активные цени [ балласгные цени

сайтМЮюХ

Рисунок 3 Алгоритм анализа аминокислотных последовательностей белков предшественников, для поиска закодированных зрелых цепей активных молекул.

На первой стадии важно выделить последовательность сигнального пептида. Далее полученный пробелок необходимо анализировать на наличие мотивов R(K)toR (большинство активных полипептидов) и EtoR/EafterR (токсины и МАП). Если пробелок содержит оба мотива следует выбрать наиболее подходящий или рассмотреть оба возможных варианта. При выборе наиболее подходящего мотива следует учитывать также статистические данные по типу белка и видовой принадлежности белков предшественников исходя из данных на рисунках 1 и 2. На 3 этапе анализируется возможный гидролиз полипептидных цепей с обоих концов эндопептидазами. Наконец, на последней стадии для всех полученных продуктов, содержащих С-концевой аминокислотный остаток Gly, отбрасывают этот остаток и приписывают амидирование предшествующему аминокислотному остатку. Итогом анализа, проводимого по предложенной схеме, является изначально задуманная природой зрелая полипептидная последовательность.

Для поиска и идентификации в базе данных структур токсинов был разработан метод Single Residue Distribution Analysis (SRDA), который позволяет анализировать большие банки аминокислотных последовательностей, и может быть легко автоматизирован. Принципиальное отличие предлагаемого метода в том, что анализируются особенности первичной структуры кодированного белка, а не исходные нуклеотидные последовательности. При этом объем анализируемого материала увеличилось в 6 раз за счет транслирования по всем возможным рамкам считывания.

SRDA служит для формализации белковых последовательностей и основан на анализе взаиморасположения ключевых аминокислотных остатков. Ключевые остатки остаются в "упрощенной" последовательности без изменения, а все остальные остатки между ключевыми заменяются на цифру, равную их количеству, пример преобразования приведен на рисунке 4.

Для удачного анализа необходимо определиться с выбором ключевого аминокислотного остатка. Для большинства полипептидных токсинов закономерно распределяются аминокислотные остатки Cys, в случае других типов белков, возможно, более характерным будет взаиморасположение других аминокислотных остатков, например Lys (см. третий вариант на рисунке 4). С практической точки зрения важно иметь представление о разрывах в анализируемых аминокислотных последовательностях, соответствующих стоп кодонам по гену (обозначаемые знаком точка). Так на рисунке 4 приведено распределение в анализируемой последовательности только по ключевому остатку Cys - SRDA("C") (б равномерно распределенных аминокислотных остатков), которое сильно отличается от данных по ключевым остаткам Cys и терминации - SRDA("C .") (два фрагмента по 2 остатка Cys в каждом).

<■3* J. -<-12-«Ы 41-11-

YRQCMTLY.DTTTFT.C.CTNFLPSGFL

-21-► ! SRDA("C)

ILCJ

LSQILC.MVFLYVLLIFIYGAYNILSR

-21-

3C12C1C11C21C21C35 SRDA ("С") }СЦ 6 c сш 20C21C28. 6 PFSOLPNAKHYGDYKVLALGSÎPFPAKQ^ SRDA^.-? 6.1.16.29К5К1ШК2К5К11. «

VKAIKAVPASKRNRGTRLQVAV.ILLS LY

Рисунок 4 Пример преобразования некой аминокислотной последовательности в упрощенную форму по различным ключевым остаткам. SRDA("C") - преобразование по ключевому остатку Cys, выделенному стрелками над исходной аминокислотной последовательностью, там же для Cys приведено значение цифрового интервала между ключевыми остатками; SRDA("C .") - преобразование по Cys и символу терминации трансляции, обозначенному точками в исходной аминокислотной последовательности; SRDA ("К .") - преобразование по ключевому остатку Lys, выделенному звездочкой над исходной аминокислотной последовательностью, и символу терминации.

Swiss-Prot аннотированные последовательности

Предположит, функция

^Индивидуальны!

I..........ЛГ Д

поисковым запрос

Рисунок 5 Алгоритм поиска полипептидных токсинов в банках данных EST.

Область, доступную для анализа присутствия того или иного мотива, ограничивали фрагментами, начинающимися с начала последовательности или после одного из терминальных кодонов и заканчивающимися терминальными кодонами. Если фрагмент не оканчивался терминальным кодоном, последовательность отбрасывали, как частично определенную. Это ограничение значительно сократило объем ложноположительных данных, так как исключило совпадение с последовательностями, оттранслированными по неправильной рамке считывания.

Поиск полипептидных токсинов в банках данных можно разделить на несколько последовательных операций. Последовательность операций входящих в общий алгоритм поиска полипептидных токсинов в банках нуклеотидных последовательностей приведена на рисунке 5.

Необходимо иметь две отдельные базы последовательностей. Первая из них - анализируемая база, которая после трансляции по 6 возможным рамкам считывания, будет переводиться в упрощенную форму БИЛА по ключевому(ым) аминокислотным остаткам и символу терминации полипептидной цепи.

Какие ключевые остатки следует выбрать, и как правильно сформулировать поисковые запросы определяется при анализе второй базы данных, которая формируется из аминокислотных последовательностей известных полипептидов, обнаруженных в яде животных этого же класса. Запросы (в виде упрощенной формы записи) могут быть созданы в любом количестве для перекрытия всех возможных моделей распределения ключевых остатков по структурам. Для более гибкого формирования запросов допускается вместо указания точной цифры использовать символы подстановки:

? - любой одиночный символ,

# - любая одиночная цифра (0-9),

* - разрыв поисковой строки от 0 до любого количества символов..

С помощью разработанных запросов вначале находятся упрощенные структуры, а далее осуществляется переход к конкретным клонам в исходной базе нуклеотидных последовательностей. Повторяющиеся аминокислотные последовательности удаляются с учетом идентичности зрелых цепей выводимых полипептидов без учета возможных вариаций в области сигнальных пептидов и профрагментов.

Достоверность выведенных структур проверяется по наличию сигнального пептида сервисом Б1§па1Р. Для определения новизны найденных структур и возможной оценке предполагаемых биологических свойств, проводится поиск гомологии против неповторяющейся базы белковых последовательностей по алгоритмам Ь^р или РБЬВЬАЗТ.

Практическая значимость разработанных алгоритмов поиска была проверена на базах данных нуклеотидных последовательностей, полученных для ядовитых животных.

111.2. Разработка запросов для проведения анализа баз данных пауков

Характерные мотивы первичной структуры для токсинов пауков разрабатывали на основе предварительного анализа описанных в литературе токсинов пауков. Большинство токсинов имеет характерное распределение остатков Су б по полипептидной цепи и схему пространственной укладки,

известную как цистеиновый узел. Упрощение их структур по ключевым аминокислотным остаткам цистеина позволяет сформулировать два наиболее распространенных мотива.

Л'-концевой Принципиальный Структурный Мотив (ПСМ): ПСМСХХХХХХС—5-10 а.о.—СС или С6С(#/##)СС и С-концевой Дополнительный Структурный Мотив (ДСМ): ДСМСХС-----СХС или С1С*С1С

На основании этих формализованных мотивов были сформулированы: универсальный поисковый запрос, охватывающий только мотив ПСМ, который выглядит как "С#С*СС*С*С#." , запрос для нахождения токсинов с обоими мотивами "С#С*СС*С1С*С1С#." и запрос для поиска токсинов с укладкой, отличной от цистеинового узла - "С1С*С1С#."

Для проверки эффективности разработанных запросов был проведен анализ проверочной базы животных токсинов. Среди токсинов членистоногих по трем мотивам было идентифицировано более половины структур из 3053 представленных в банке. Если рассматривать только структуры, относящиеся к паукам, то все запросы в сумме обнаруживают 1634 последовательности и еще 354 остаются неопределенными. Среди этих «пропущенных» последовательностей большинство относится к ферментам и высокомолекулярным компонентам яда. Только 60 полипептидных токсинов, половина из которых является предсказанными по общей гомологии, не узнаются разработанными поисковыми запросами. Это соответствует 5% токсинов пауков в проверочной базе.

111.3. Разработка запросов для проведения анализа баз данных морских анемон

Структуры токсинов морских анемон намного разнообразнее. Для поиска общих мотивов из 231 известной аминокислотной последовательности токсинов отобрали 104 неповторяющиеся. После анализа упрощенных последовательностей по ключевому остатку цистеина можно выделить 15 поисковых запросов, полностью перекрывающих всю проанализированную выборку. Эти поисковые запросы были обозначены как мотивы упрощенных структур 0 - 14, а их структуры приведены в таблице 2. Первые четыре мотива перекрывали максимальное количество известных токсинов морских анемон из выборки данных и были наиболее селективными.

Особенностью компонентного состава яда морских анемон является наличие крупных молекул без остатков цистеина с сильным цитолитическим действием. Общепринятое название таких цитолитических компонентов анемон - цитолизины. Для цитолизинов мотивы структур оказались слишком простыми (мотив 0 и 14 в таблице 2), и как оказалось в дальнейшем, слишком вырожденными для поиска. Вместо этих двух мотивов был создан новый

мотив К, который совмещал два условия: наличие не более 2 остатков цистеина при SRDA ("С .") и не менее 6 остатков лизина при SRDA ("К .").

Таблица 2 Мотивы распределения аминокислотных остатков Cys в полипептидных токсинах морских анемон. Поисковый запрос отражает синтаксис, применяемый для поиска в банках EST методом SRDA. Точка обозначает символ терминации, # - любой цифровой символ, * -допустимый разрыв в поисковой строке. Количество соответствует числу аминокислотных последовательностей известных токсинов морских анемон, использованных для формулирования мотива, примеры некоторых из них приведены в последнем столбце.

Поисковый запрос кол-во пример (код в базе данных)

мотив 1 С1С##С6С#СС 44 гангитоксин (Р82803), АЕТХ-1 (Р69943)

мотив 2 с\стс9сисс#. 8 BDS-II (Р59084), АРЕТх2 (Рб 1542)

мотив 3 С8С#С*СЗС#С. 8 калисептин (Q9TWG1), ShK (Р29187)

мотив 4 С8С*С#С*СЗС 9 AsKCl (Q9TWG0), АРНС1 (B2G331)

мотив 5 С8С#С*С1С#С#. 2 SHTX-5 (B1B5J0), гигантоксин-l (BAD01579)

мотив 6 СС#С#СС*С1С*С. 2 AETX-2 (P69944)

мотив 7 СС1С»С*С*С*С1С#. 1 PA-TX (P09949)

мотив 8 СС1С#С5С*С#. 1 нейротоксин 3 (1ANS)

мотив 9 С6С*С*С'С6С№. 2 акрорхагин 1I(BAE46983)

мотив 10 С8СЗС #с. 1 метридин(PI 1495)

мотив 11 с#с#с#с#сгас#с#. 2 акрорхагин-1 (BAE46981)

мотив 12 С6С#С#С1С*С1С 3 AvTX-60A (BAD04943), PsTX-60B (P58912)

мотив 13 с#с#с#с#. 1 SHTX-l/SHTX-2 (P0C7W7)

мотив 0 18 Эквинатоксин И (P61915), цитолиэин-3 (Q9U6XI)

мотив 14 ##С • 2 Up-1 (P0C1G1), бандапорин (BAH80315)

мотив К К>=6 AND С<=2

ВСЕГО 104

Анализ эффективности разработанных поисковых запросов для токсинов морских анемон на проверочной базе животных токсинов показал, что среди всех запросов специфичными к токсинам морских анемон оказались только два - мотив 1 и 2. Мотивы 3 и 4, хотя и разрабатывались, как высокоспецифичные, оказались характерными для токсинов других видов животных, в основном нематод и змей. Эффективность общей выборки по первым 13 мотивам оказалась приличной. Все вместе они не обнаружили в проанализированной проверочной базе 154 из 374 представленных последовательностей токсинов морских анемон, 108 из них относились к предсказанным структурам или фрагментам последовательностей, а оставшиеся 46 к цитотоксинам (мотив К). Среди цистеин-содержащих полипептидных токсинов найдены были все последовательности.

111.4. Анализ баз данных нуклеотидных последовательностей

Разработанные запросы применяли для поиска полипептидных токсинов. Использовали, как вновь созданные базы нуклеотидных последовательностей из ядовитых желез различных видов пауков, так и

опубликованную, но не до конца аннотированную базу EST морской анемоны. Из полученных 12 баз EST ядовитых желез пауков в работу вошли результаты анализа только двух видов.

Ш.4.1. Результаты анализа базы данных EST последовательностей

паука Agelena orientalis

База данных EST последовательностей паука A. orientalis была проанализирована на наличие полипептидных последовательностей, обладающих тремя структурными мотивами токсинов пауков (ПСМ, ДСМ, ПКМ). Для всех обнаруженных по выше разработанным поисковым запросам последовательностей проверяли наличие сигнального пептида. Выделяли пять основных групп токсинов в зависимости от найденных мотивов: (1) -структуры с ПКМ, ПСМ; (2) - структуры с ПКМ, ПСМ и ДСМ; (3) -структуры с ПКМ, ДСМ; (4) - структуры без ПСМ и ДСМ, но с ПКМ; (5) структуры, не содержащие остатков Cys, но имеющие ПКМ. Зрелые последовательности определяли по алгоритму, представленному на рисунке 3. Распределение всех выведенных структур из банка EST по структурным группам наглядно представлено на рисунке 6.

□ группа 1 Н группа 2 И группа П Н группа Ф S3 ошибки

62,4%

Рисунок 6 Разбивка на группы выведенных последовательностей из банка данных EST паука A. orientalis. Группа 1 - компоненты, в первичной структуре которых имеются ПКМ, ПСМ; группа 2 - компоненты, где имеются ПКМ, ПСМ и ДСМ; группа П содержит последовательности без структурных мотивов; группа Ф состоит из фрагментов больших белков. Группа "ошибки" содержит бессмысленные и неправильно определенные последовательности EST.

Из всех возможных 5 групп полипептидных токсинов присутствуют только две - сильно преобладающая группа 1 и группа 2. Вместе обе группы токсинов представлены в банке более чем на 70%, что является показателем хорошего качества сборки банка. Наблюдаемый 21% ошибочных последовательностей включал, как ошибки определения нуклеотидных последовательностей (сбой рамки или нечитаемый нуклеотид), так и неудачные результаты клонирования. Не столь многочисленными были две группы выведенных последовательностей: полноразмерных полипептидных

компонентов, не относящихся к токсинам (группа П, 2.7%); и фрагментов больших клеточных белков (группа Ф, 3.1%).

В группе 1 лидировала подгруппа из 26 последовательностей, содержащая нейротоксин агеленин, ранее выделенный из близкородственного вида паука Agelena opulenta. В этой подгруппе наиболее представлен токсин Agel_01 (38% от всех структур токсинов в банке), уже известный агеленин (21%) и токсин Agel_02 (14%). По-видимому, транскрипция этих трех генов идет наиболее интенсивно и, следовательно, в природном яде они должны быть одними из основных компонентов. Во второй группе присутствовали две основные подгруппы, гомологичные ранее известным белкам ц-агатоксину 2 и со-агатоксину-IIIA из яда паука Agelenopsis aperta. Их распределение в банке последовательностей было более равномерным.

Всего было определено 45 различных последовательностей белков предшественников токсинов, из которых только одна относилась к ранее известным.

III.4.2. Результаты анализа базы данных EST последовательностей

паука Lachesana tarabaevi

Отличия различных видов пауков проявляются не только на уровне морфологии, но и на компонентном составе их яда. Выведенные полипептидные последовательности из банка EST второго исследованного паука вида L. tarabaevi показали абсолютно другое распределение кодированных структур по группам (см. рисунок 7). На 5 групп, соответствующих полипептидным токсинам, в общей сложности пришлось менее половины всех выведенных последовательностей.

В яде L. tarabaevi с большим перевесом преобладают линейные токсины 5 группы. Токсины в группе 1 представлены совсем незначительно, как количеством клонов, так и количеством различных полипептидов (4 полипептида и 19 клонов). Представители второй группы более разнообразны по количеству кодированных структур и представленности в транскриптоме (22 полипептидных токсина). Распределение структур более равномерное, по сравнению с банком EST последовательностей из яда паука A. orientalis. Нет одного весьма распространенного семейства, все семейства с приблизительно равной представленностью (порядка 40 клонов). Следовательно, библиотека более нормализована, что проявляется не только по группам токсинов, но и по представленности белков в группах П и Ф. Всего было выведено 98 последовательностей белков предшественников полипептидных токсинов. Гомология первичных структур зрелых последовательностей с известными токсинами пауков была незначительная, поэтому все полученные токсины относятся к абсолютно новым.

19,7%

35,6%

2%7,4% 0,9%

32,4%

□ группа 1 йгруппа 2 КЗ группа 3 IS группа 4 Игруппа 5 ИИ группа П Ш группа Ф

□ ошибки

Рисунок 7 Разбивка на группы выведенных последовательностей из банка данных L. tarabaevi. Группа 1 компоненты, в первичной структуре которых имеются ПКМ, ПСМ; группа 2, где имеются ПКМ, ПСМ; группа 3, где имеются ПКМ и ДСМ; группа 4, где имеется только ПКМ; группа 5 линейные белки без цисгеинов, где имеется ПКМ; группа П содержит последовательности без структурных мотивов; группа Ф состоит из фрагментов больших белков. Группа ошибки содержит бессмысленные EST и неправильно определенные последовательности.

III.4.3. Результаты анализа базы данных последовательностей морской анемоны А. viridis

Морская анемона А. viridis, ранее известная как Ammonia sulcata - один из средиземноморских видов, наиболее часто подвергавшаяся вниманию исследователей. Более 20 различных по структуре и функции полипептидных токсинов выделено и охарактеризовано за время ее исследования. На каждый разработанный поисковый запрос был проведен поиск совпадений в анализируемом банке EST, статистические результаты представлены в таблице 3.

Количество обнаруженных клонов на каждый мотив сильно отличалось. Так, для наиболее вырожденного мотива 13, описывающего расположение 4 остатков Cys с интервалами менее 10 остатков, было обнаружено совпадение с 5466 EST. Почти все эти совпадения происходили с последовательностями, оттранслированными в неправильной рамке считывания, но все они эффективно отсекались на стадии поиска сигнального пептида. Перед стадией проверки сигнального пептида все EST группировали по гомологии. Успешно этот этап преодолели только 89 выведенных структур предполагаемых белков предшественников полипептидных токсинов. А последний этап поиска гомологии с известными белками преодолели 47 последовательностей.

Все найденные полипептидные токсины и подобные им структуры процессировались по мотиву R(K)toR, который и был признан как основной , мотив ограниченного протеолиза для токсинов морских анемоны, хотя мотив

EtoR иногда сопутствовал R(K)toR мотиву. По алгоритму поиска зрелых последовательностей были найдены зрелые формы токсинов.

По мотиву 1 было найдено четыре полноразмерные структуры белков предшественников, три из которых полностью совпадали с ранее известными токсинами блокаторами натриевых каналов, выделенными ранее из этого вида морской анемоны. Это нейротоксин 2, токсин 2-1 и нейротоксин 8. Четвертый полипептид, получивший имя нейротоксин 1-1, имел всего две аминокислотные замены по сравнению с еще одним известным полипептидом - нейротоксином 1.

Таблица 3 Посгадийные результаты поиска полипептидных токсинов в банке EST А. viridis. Общее количество последовательностей, отобранных из банка по каждому разработанному запросу, указано, как EST найдено. В колонке SignalP указано количество индивидуальных последовательностей после удаления повторов и подтверждения наличия сигнального пептида. Количество токсинов имеющих структурных гомологов по алгоритму blastp и количество найденных известных токсинов приведены в соответствующих столбцах.

\ EST найдено SignalP подтверждено blastp совпадения Известные последовательности из А. viridis

мотив 1 7 4 4 3

мотив 2 51 13 13 1

мотив 3 162 11 5 0

мотив 4 211 16 16 3

мотив 5 26 2 2

мотив 6 2 0 -

мотив 7 10 0 -

мотив 8 8 0 -

мотив 9 59 2 2

мотив 10 19 0 -

мотив 11 81 5 2

мотив 12 20 0 •

мотив 13 5466 И 3

мотив К 133 25 -

итого 6222 89 47

Для полипептидных токсинов BDS-1/BDS-2 - специфических блокаторов быстро инактивирующихся К+ каналов Kv34 в банке (на мотив 2) была обнаружена структура белка предшественника BDS-1 неизвестная ранее и еще 12 близких структурных гомологов, которые получили порядковые номера с BDS -3 по BDS -14.

Следующий известный блокатор калиевых каналов калисептин (по мотиву 3) не был найден в библиотеке, но были обнаружены 11 подобных по структуре полипептидов (avtx-1 - avtx-11). По гомологичности с известными структурами только 5 токсинов немного походили на изученные белки.

Полипептиды, имеющие характерный мотив укладки Кунитца, были обнаружены по мотиву 4. В отличие от других полипептидов морских анемон они не имели профрагмента между сигнальным пептидом и зрелой частью, но содержали короткие выщепляемые С-концевые последовательности. В этой группе самыми представленными являются ранее известный каликлюдин-3 и новый гомолог каликлюдин-4 (AsKC4). Также были идентифицированы структуры гомологичные каликлюдину-1 (AsKCla) и пептидному ингибитору протеиназ 5 II.

Несколько полипептидов было найдено по мотиву 5. Две новые структуры были названы Gigt 4 и Gigt 5 за высокое родство к гигантоксину I из другого вида морской анемоны Síichodactyla gigantean, который является слабым паралитическим токсином, способным связываться с EGF рецептором.

Две интересные последовательности белков предшественников пептидных токсинов AV-1, AV-2 были найдены по мотиву 9. Четыре зрелых полипептида из каждого белка предшественника были умеренно гомологичны пептидным токсинам Аш-1 из морской анемоны Aníheopsis macúlala. Особенность белка предшественника Аш-1 состоит в том, что в процессе своего созревания он расщепляется на 6 активных компонентов по специфическим сайтам ограниченного протеолиза, ранее описанным как R(K)toR. В структуре новых найденных последовательностей гомологичны не только зрелые цепи, но и удаляемые фрагменты.

Последовательности, найденные по мотивам 11 и 13, были названы как токсин подобные из-за отсутствия гомологии к известным белкам. Среди них были 8 коротких цистеин-содержащих последовательностей. Две последовательности (Tox-like av-1 и 5) по результатам поиска гомологии совпадали с предсказанными ранее структурами. Помимо этого были обнаружены длинные цистеин-содержащие последовательности, названные Tox-like av-9 - av-16. Они имели интересную особенность первичной структуры - наличие протяженного профрагмента сразу за сигнальным пептидом, в котором преобладают отрицательно заряженные аминокислотные остатки, тогда как в зрелой цепи расположено много аминокислотных остатков аргининов и лизинов, подобно тому, как это было найдено для некоторых предшественников антимикробных пептидов.

На мотив К было обнаружено несколько явных цитотоксинов, не содержащих аминокислотных остатков цистеинов и сильно обогащенных лизинами, названных цитолизин-подобными структурами Cyt-like av-1 -Cyt-like av-11. Кроме того, были идентифицированы еще 12 коротких последовательностей, не имеющих большого положительного заряда. Все они, кроме одной последовательности, хорошо группировались в 4 гомологичных семейства с пока неизвестной функцией. Для них было предложено название гипотетические полипептиды hpp av-1 -hpp av-12.

Весьма интересны два белка предшественника, найденные по мотиву К, каждый из которых при ограниченном протеолизе генерирует по пять небольших пептидов с предположительно нейрональной активностью (см. рисунок 8).

Для морских анемон, полипов и медуз известны примеры белков предшественников нейропептидов. Характерная особенность получаемых пептидов - одинаковая С-концевая последовательность, заканчивающаяся амидированным аминокислотным остатком. Для Ь\Уамид семейства белков это С1у-Ьеи-Тгр-ЫН2, для ЯР амид семейства белков - 01у-А^-РИе-КН2. Гомология строения новых белков предшественников отсутствует, сходны только мотивы, расположенные между получаемыми нейропептидами -мотивы Я(К)1оЯ и мотив амидирования С-концевого остатка. Точное местоположение Л-концевого аминокислотного остатка у пептидов было невозможно установить, поэтому предположили, что активный нейропептид должен иметь длину в 4-6 аминокислотных остатков. Четыре из пяти получаемых при созревании пептидов оканчиваются на последовательность Аг£-Рго-МН2, поэтому новые белки предшественники получили название ЯРамид нейропептиды.

Antho-RFaiom MLVAMTTASYVTILVTLIFHILTINAKTVTKRAKETSLE DDE PQYWRGRFAKDVVPQF«KGRFSDPQFWKGRFS D

Маыид нейропептид --------ESACAQQHGLWGntQNPGLWGRSADAQQHGLWSKRQHPGLWGRSAEPGQPGLBGKRQHPGLWGRSAE

RPaiow нейропептид (1) ---------MASLHWLFSALLALLWTCTCFULQKDbESETEGSSKElfEDSQK—AIPyRPGKRERiRKLEDSPK

ЯРаыид нейропептид(2) ---------HASLHWlESAmLLWICtGFRL0Kl)LESEtEGNSKEifEDSQK--ArPVRP(3iREFNRMtEDSPi!

Antho-RTaMHÄ PQFTOjRESSHGNKRRWPGRyGREFQGRFGR--------EFQGRFGREOGRFG-REEDQGRFSREED----QGRFS-R

Маиид нейропептид PLQPGMGntQHPGLWGRSADAQQPGL»-SKR-------------QDLDIGMlfSitROKAGLW-SmADPGO-LGtm

ЕРамид нейропептид (1) AIPyRLS-KRGjfPLIiRMSEDSQMPVRPGKR—EFS№.EOPQYISIPVRPgaGSGSSDASPQWPl)VYSPIRPGRK

RPaie« нейропептид(2) AIPmS-^YPLH№EPSQKAIPVRPGlI!i---EFlimE[)POHSIPVRPSXRGSGSmASPeWPDVySPFRPGl«

Antho-RFaiow EE-gGRFGREEDgGRFGREEDQGRFGSEEDQGRFGREEEQGRFGREEDQGR. Шщ нейропептид miGLas&smiQmimmshmpsEQ

Рисунок 8 Сравнение аминокислотных последовательностей белков предшественников LWaмид нейропептидов ((516998), Л/-концевого фрагмента АпШо-11Рамида ((201133) и двух белков предшественников ИРамид нейропептидов, полученных на мотив К. Активные нейропептиды подчеркнуты, жирным цветом выделены совпадающие места процессинга полипептидной цепи.

В результате анализа к ранее известным 23 полипептидным токсинам из морской анемоны А. viridis нам удалось добавить еще 42 новые последовательности токсинов, для 5 ранее известных токсинов были

определены структуры белков предшественников, а всего в результате анализа базы данных по 14 мотивам упрощенных структур было обнаружено 89 белков предшественников.

III. 5. Протеомный анализ ядов пауков

Применяемые методы анализа банков нуклеотидных последовательностей позволяют получить сразу большое количество структурной информации, но это не соотносится с реальным составом природных ядов. Выведенные последовательности из баз данных EST ядовитых животных нуждаются в экспериментальной проверке. Такая проверка, с одной стороны, необходима для сопоставления качественного и количественного содержания токсинов с уровнем содержания их мРНК в железах пауков, и, с другой стороны, подтверждает правильность установления структуры зрелой цепи для токсинов.

Исследования компонентного состава природных ядов проводили на образцах, полученных из нескольких пауков. Использовали протеомный подход, включавший комбинацию ВЭЖХ и МАЛДИ масс-спектрометрии.

III.5.1. Компонентный анализ яда паука A. orientalis

Масс-спектрометрический анализ образца природного яда, приведенный на рисунок 9А, позволил достоверно детектировать 9 основных компонентов в диапазоне масс от 1 до 10 кДа. Для детального определения молекулярных масс всех возможных компонентов проводили повторный анализ фракций после разделения яда ВЭЖХ на обращено-фазной колонке (профиль разделения представлен на рисунке 9Б). В этом случае был идентифицирован 21 полипептидный компонент, что в два раза меньше, чем было найдено при анализе базы данных EST последовательностей.

Для наиболее представленных 12 компонентов были определены аминокислотные последовательности частичным /V-концевым секвенированием по Эдману и масс-спектрометрическим анализом пептидов, полученных после ферментативного расщепления полипептидной цепи. Отличие экспериментально определенных масс от расчетных во всех случаях составило менее 1 Да.

Было найдено соответствие между 12 предсказанными структурами полипептидов по базе EST и компонентами природных ядов. Девять компонентов, содержали С-концевой амидированный аминокислотный остаток, 3 компонента яда содержали свободную карбоксильную группу. Все предсказанные модификации при созревании токсинов были подтверждены протеомным анализом.

ioo

%

/

3000 3400 3800 4200 4600

M/z

0.05' 0.04 0.030.020.01- 0

210

CHfN,%

/f

0

20 25 30 время (мин)

35

40

Рисунок 9 Исследование компонентного состава природного яда паука A. orientalis. (А) Масс-спектр цельного яда в линейном режиме измерения. (Б) Результаты хроматографического разделения 20 мкг смесевого яда на обращено-фазной колонке Jupiter С5 2x150 мм (Phenomenex). Линейный градиент концентрации ацетонитрила 1% в минуту создавали в присутствии 20 мМ триэтиламина, титрованного уксусной кислотой до рН 10.0, скорость потока 300 мкл/мин.

4(1 ■ % в транскриптоме \

35

30-

2 5

15

10 ' 1 1

5 II

fi i . 1 J_ II

I 2 з 4 5 в 7 9 10111213 14 15 16 17 18 19 20 2l\

Рисунок 10 Сравнение процентного содержания компонентов яда по данным протеомных исследований сданными исследования транскриптома. Порядковый номер компонента соответствует последовательности элюирования с обращено-фазной колонки: Р3242, Р4237, Р4160, Р3125, Р6530, Р3180, Р3737, Р3772, Р3795, Р4145, Р1442, Р3491, Р3509, Р4115, Р5192, Р4273, Р4214, Р4146, Р3762, Р3820, Р3848.

Расчетное количественное содержание различных полипептидов яда не совпадало с предполагаемым количеством, выведенным из анализа уровня мРНК в базе EST (см. рисунок 10). Только восемь компонентов в природном

яде присутствовало в сравнительно большом количестве (более 3%) - Р4237, Р4145, Р4273, Р4214, Р4146, Р3762, Р3820 и Р3848. Одно из вероятных объяснений этого несоответствия заключается в том, что при клонировании EST существуют некоторые структурные предпочтения. Второе вероятное объяснение заключается в том, что образцы яда и желез пауков были получены от различных особей, которые, в свою очередь, могут иметь некоторые фенотипические различия.

Для проверки последнего предположения были получены 20 образцов яда от отдельных особей паука A. orientalis, обитающих на одной территории. Качественный и количественный анализ этих образцов был проведен комбинацией методов ВЭЖХ и масс-спектрометрии в тех же условиях, что и анализ смесевого яда (см. сводный результат на рисунке 11).

Рисунок 11 Качественный и количественный состав ядов двадцати индивидуальных особей паука А. опе^аИв. По вертикальной оси в логарифмической шкале отмечено процентное содержание компонентов яда относительно "стандартного" компонента Р4273, отмеченного черным цветом. Серым цветом показаны постоянные компоненты, присутствующие в каждом яде, белым - «мобильные» компоненты, присутствие которых в яде непостоянно.

Значительных различий в профилях элюции пиков между образцами индивидуальных ядов не наблюдали, однако, по содержанию компонентов образцы существенно отличались как от смесевого яда, так и между собой. В то время как в смесевом яде был обнаружен 21 компонент, отдельные особи продуцировали от 8 до 15 полипептидных компонентов яда, причем, наибольшее количество ядов (двенадцать образцов) содержало 12 - 14

компонентов. Таким образом, число детектированных компонентов в индивидуальных ядах оказалось существенно меньше числа компонентов в смесевом яде.

Анализируя состав индивидуальных ядов, выделили группу постоянных компонентов, присутствующих во всех проанализированных образцах и характеризующихся сравнительно высоким относительным содержанием. Остальные компоненты, получили название «мобильных», их присутствие детектируется от особи к особи, и в целом, распределение «мобильных» компонентов по ядам носило случайный характер.

Сопоставление результатов анализа смесевого яда с индивидуальными показало, что все соединения, найденные в 20 проанализированных образцах ядов индивидуальных особей, обнаруживаются также и в смесевом яде. Таким образом, предполагается, что существует закрепленный набор полипептидных структур, ограничивающий возможное разнообразие полипептидов внутри одного вида. Каждая особь подходит к процессу создания многокомпонентного яда по принципу синтеза разрешенных полипептидов вероятностным выбором или под действием направляющих факторов внешней среды. Найденная вариабельность состава яда пауков внутри одного вида представляет огромный интерес с точки зрения понимания механизмов, лежащих в основе формирования структурного разнообразия токсинов.

III.5.2. Компонентный анализ яда паука L. tarabaevi

В отличие от подробного протеомного анализа яда паука A. orientalis, в случае яда L. tarabaevi детальных исследований с определением первичных структур компонентов не проводили. Яд паука L. tarabaevi обладает более сложным, компонентный составом, что видно по обзорному масс-спектру на рисунке 12А, в котором можно выделить 4 группы полипептидов.

Это хорошо представленные короткие полипептиды 2-3 кДа, далее идут компоненты 3.5-5 кДа, и еще две выраженные группы 6-7, 7-8.5 кДа. Как и в случае паука A. orientalis количество индивидуальных компонентов яда в действительности много больше, чем представлено на обзорном спектре. При разделении аликвоты природного яда методом ВЭЖХ на носителе с обращенной фазой (рисунок 12Б) было получено 34 фракции. Последующий масс-спектрометрический анализ отдельных фракций выявил присутствие чуть менее 100 компонентов. Практически столько же структур токсинов было выведено из банка последовательностей EST.

Сравнение молекулярных масс природных соединений и зрелых молекул выведенных токсинов позволило установить соответствие 76 компонентов. Так как все фракции были многокомпонентными, произвести расчет представленности каждого компонента природного яда оказалось невозможным. Все наиболее представленные компоненты по транскриптому (уровень представленности 20 и более клонов в банке) соответствовали

самым значительным сигналам в масс-спектрах, кроме одного выведенного токсина ЬаТх_31 с расчетной молекулярной массой 9526.8 Да.

Суммируя все выше представленные результаты, следует отметить, что разработанный алгоритм хорошо предсказывает токсины. Выводимые с его помощью структуры соответствуют последовательностям природных токсинов, что было продемонстрировано на образцах природных ядов пауков. Разработанный инструментарий позволяет расшифровывать большое количество структур токсинов в сжатые сроки, в результате чего, в ближайшее время можно получить исчерпывающие знания о принципах комбинаторики и попытаться перейти к предсказанию функции.

Рисунок 12 Масс-спектр - панель (А) и профиль хроматографического разделения - панель (Б) природного яда паука L. tarabaevi. ВЭЖХ проводили на обращено-фазной колонке Jupiter С5 2x150 мм (Phenomenex). Линейный градиент концентрации ацетонитрила 2% в минуту создавали в присутствии 0.1% ТФУ, скорость потока 300 мкл/мин.

Разнообразие полипептидов в ядах пауков по совместным данным геномики и протеомики велико. Всего существует несколько структурных семейств внутри которых насчитывается ряд отдельных представителей, несущих единичные аминокислотные замены. Из этого множества пока не удается достоверно выбрать специфичного активного токсина на определенный тип клеточного рецептора. Поэтому до разработки стройных алгоритмов предсказаний, следует использовать традиционный подход, основанный на измерении функциональной активности в специализированных тестах. В этом случае токсин с искомой активностью постадийно выделяется из цельного яда, после чего определяется его строение. В данной работе было использовано несколько типов функциональных тестов и модельных систем для поиска специфичных полипептидов.

111.6. Выделение инсектоспецифических токсинов

В первом функциональном тесте проводилось изучение токсического действия полипептидов на насекомых. Для удобства работы использовали не взрослых насекомых, а их личинки. С точки зрения представленности различных типов рецепторов, личинки могут иметь несколько другой профиль рецепторов, однако с практической точки зрения наибольший урон сельскому хозяйству наносят личинки, а не взрослые насекомые. В плане устойчивости к действию инсектотоксинов личинки превосходят взрослых особей, что было показано для некоторых исследуемых полипептидов. Использовали личинки обыкновенной комнатной мухи Musca domestica и личинки табачной листовертки Heliothis virescens, являющейся распространенным сельскохозяйственным вредителем. Специфичность действия проверяли в экспериментах на млекопитающих, вводя мышам в хвостовую вену или внутрибрюшинно физиологический раствор с тестируемыми соединениями.

Ш.6.1. Инсектотоксины из яда паука Segestria florentina

Первым объектом стал небольшой плетущий паутину паук S. florentina, распространенный в средиземноморском регионе. Начальное фракционирование яда проводили на гель-фильтрационном сорбенте для отделения активной фракции полипептидов от высокомолекулярных белков. После чего единственная активная фракция, полученная на первом этапе, подвергалась обращено-фазной ВЭЖХ. В результате были получены три фракции, обладавшие инсектицидной активностью против личинок Н. virescens, представленные на рисунке 13.

Для выделения гомогенных компонентов проводили дополнительную очистку на том же сорбенте с измененными условиями разделения, после чего подтверждали чистоту фракций масс-спектрометрическим анализом. Измеренные средние молекулярные массы активных компонентов составили 5159,4973 и 4993 Да. После предварительного восстановления полипептидов и алкилирования по остаткам Cys были определены первые 18 А-концевых аминокислотных остатков всех активных компонентов: £5.5 AECMVDETVCYIHNXNNC...; £5.6 KECMTDGTVCYIHNXNDC...; £5.7 КЕСМADETVCYIHNXNNC....

2.451 A2¡0 j 3TJn

3 „дА

5

К

80

60

40

20

0

О 10 20 30 40 ,50 , 60 70

время (иин)

Рисунок 13 Выделение полипептидных токсинов с инсектицидным действием из природного яда паука S. florentina. 1этап гель-фильтрация на колонке TSK 4000SW (10 цм, 7.5x600 мм), мобильная фаза 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.0), 150 мМ NaCI, скорость элюции 0.5 мл/мин. 2 этап ВЭЖХ на колонке Delta Рак С4 (3.9x150 мм, 100 А) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила, мобильная фаза 0.1% ТФУ, скорость элюции 0.7 мл/мин. Фракции, проявлявшие активность в тестах, выделены.

Для установления полных структур активных компонентов были синтезированы два вырожденных олигонуклеотидных праймера Psfi-1 и Psfi-2 на основе информации о jV-концевой аминокислотной последовательности выделенных инсектотоксинов. С помощью этих праймеров была получена информация о 35 независимых клонах: 5 клонов, содержащих продукты ПЦР на праймер Psfi-1, и 30 клонов на Psfi-2. После множественного выравнивания всех полученных нуклеотидных последовательностей была установлена структура 8 генов, кодирующих единственное семейство гомологичных белков, первичная структура всех выведенных полипептидных токсинов (SFI-1 - SFI-8) приведена на рисунке 14. Молекулярная масса и А'-концевая аминокислотная последовательность полипептида SFI-1 соответствовала основному инсектотоксичному компоненту яда f5.6.

КЕСМТО6ТУСУ1НШШС0БС1С5Н6Р1АЯР1ШШ6НСЖ6Р!СА БЯ-1

КЕСМАОЕТУСУ! НММНМССбЗСЮЬМбРУАйРНЕМкУбМСКССРКЕ 5Я-2

КЕСМУВ6ТУСУ1НННМ1)СС65С1..СкМ6Р1ЛеРКЕЙМУ6^СКС5РКА БЯ-З

КЕСГ1УЮСТУС¥1НМНЫВСС65СЬС1ЫСР1 АйР5^КНМУеМСКССРКА 5Я-4

КЕСНУВ6ТУСУ1ИШШССС5С1СРНеР1АНРНЕМ1У5МСКС5РКА 5Я-5

КЕСМТВЕТУСУХНЫНЫВССбЗСЬС АНРИЕММУбМСКСб РКА БЯ-б

КЕСМА»6ТУСУ1ННННБССаЗСЬСРГ46РиАЯРМЕУиУ5МСКС6РКА 8Я-7

КЕСМАВ6ТУСУ11ШОСС65С1.СРН6Р1ЛР!РИЕН1.УаМСКС6РКА БЯ-в

Рисунок 14 Высокогомологичное семейство инсекготоксинов из яда паука Я ПогепИпа. Точечные замены в полипептидной цепи выделены жирным шрифтом.

Инсектоспецифичность токсинов, выделенных из яда, была проверена на мышах. В дозах 1.1 -1.5 мг/кг веса все токсины не вызывали изменений в поведении или в самочувствии контрольных животных. В этих концентрациях токсический эффект на личинках обнаруживался уже через 1-5 минут после введение токсинов, значение расчетной половинной летальной дозы (ЛД50) было выше, оно составило 4,10 и 7 мг/кг веса личинки для токсинов f5.5, £5.6, £5.7 соответственно.

Таким образом, в результате исследования яда паука 5. /¡огепИпа удалось обнаружить семейство гомологичных инсектоспецифичных токсинов, определить полную структуру 8 отдельных представителей этого семейства и функционально охарактеризовать три полипептидных токсина.

Ш.6.2. Инсектотоксины из яда паука Ь. 1агаЬаеУ1

Для получения индивидуальных полипептидов из природного яда паука Ь. ¡агаЬае\ч использовали на первой стадии также гель-фильтрационную хроматографию. При этом обнаружили единственную инсектотоксичную фракцию в диапазоне элюирования стандартных белков массой от 30 до 5 кДа. После второй стадии фракционирования на обращено-фазном сорбенте на хроматографическом профиле обнаружили две области, в которых элюировались полипептидные компоненты с интересующей активностью. Они были разделены на пять частей, каждая из которых была подвергнута дальнейшему разделению на компоненты. Схема разделения приведена на рисунке 15.

В итоге из первой группы с меньшим временем удерживания на втором этапе выделили два токсина:

токсин 54В1 с измеренной средней молекулярной массой 7670 Да и частичной //-концевой аминокислотной последовательностью ЕСУРЬЕШСТКЬ...;

токсин 659 с измеренной средней молекулярной массой 6570 Да и частичной Лг-концевой аминокислотной последовательностью ЕС1РТШОС"ПЧО....

Из второй группы выделили четыре токсина:

токсин 93 с измеренной средней молекулярной массой 7887 Да и частичной jV-концевой аминокислотной последовательностью GFFGNAWKK1KGKAE..;

токсин 916 с измеренной средней молекулярной массой 7904 Да и частичной //-концевой аминокислотной последовательностью GFFGNTWK...;

токсин 933 с измеренной средней молекулярной массой 7893 Да и частичной JV-концевой аминокислотной последовательностью GFFGNTWKKIKG...;

токсин 934 с измеренной средней молекулярной массой 7866 Да и частичной Л'-концевой аминокислотной последовательностью GFFGNTWKKIKG....

Рисунок 15 Выделение полипептидных токсинов с инсектицидным действием из природного яда паука L. tarabaevi. 1этап гель-фильтрация на колонке TSK 2000SW (10 дм, 7.5x600 мм), мобильная фаза 50 мМ Трис-НС1 (рН 7.0), 150 мМ NaCI, скорость элюции 0.5 мл/мин. 2 этап ВЭЖХ на колонке Jupiter Cs (4.6x150 мм, 300 Â) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 0% до 40% за 60 мин, далее от 40% до 65% за 10 мин, мобильная фаза 0.1% ТФУ, скорость элюции 1 мл/мин. 3 этап разделение пяти фракций (за 5 отдельных инжекций 2+3) из предыдущей хроматографической стадии на обращено-фазной колонке Jupiter Cs (2x150 мм, 300 Â), линейный градиент концентрации ацетонитрила 15-45% за 60 мин, мобильная фаза 0.1% ТФУ, скорость элюции 0.3 мл/мин. Фракции, проявлявшие активность в тестах, выделены.

На основании частичной аминокислотной последовательности и измеренной молекулярной массы природных белков в банке EST были

найдены полные аминокислотные последовательности соответствующих белков предшественников этих инсектотоксинов. Соответствие выделенных и кодированных структур приведено в таблице 4. Для подтверждения этого соответствия дополнительно проводили фрагментирование полипептидной цепи токсинов трипсином и сравнивали массы получаемых и расчетных пептидов, что подтвердило правильность найденных структур токсинов.

Токсичность на насекомых была проверена для всех индивидуально полученных полипептидов. Для двух наименее представленных в яде не удалось рассчитать значение ЛД50, для остальных полипептидов измеренная активность составила 11-14 мг/кг веса (см. данные в таблице 4).

Таблица 4 Свойства инсектотоксинов из яда паука L. tarabaevi и их соответствие выведенным последовательностям из базы данных EST.

В природном яде В банке EST Разница иол. масс №

Подапетидяда ДДи (мг/кг веса) %вяде структура кол-во клонов

токсин 54В1 11.1 3.4 LaTX 21 36 0.8

токсин 659 11.5 8.4 LaTX 17 33 03

токсин 93 142 9.4 LaTX 01 (СГГ lh) 70 \5

токсин 916 1357 35 LaTX 05 (СГГ la) 142 -1.7

токсин 933 н/д 0.75 LaTX Q3(CITlc) 10 1.4

токсин 934 Hin 0.7 LaTX 07 (CIT lg) 57 0.4

Токсины из первой группы принадлежат к семейству цистеин-содержащих полипептидов, состоящему из семи полипептидных молекул. Активность на насекомых была измерена только для двух наиболее представленных компонентов, остальные, предположительно, также обладают искомой активностью.

Инсектотоксины второй группы оказались представителями линейных полипептидов, относящихся к 5 структурной группе (16 индивидуальных последовательностей по транскриптому). Из пяти наиболее представленных в банке данных EST последовательностей в яде было идентифицировано четыре. Еще 4 токсина удалось найти в близлежащих фракциях при анализе масс пептидов, полученных после селективного протеолиза по остаткам метионина, аргинина и глутаминовой кислоты с использованием бромциана и эндопротеиназ Arg-C и Glu-C, и по de novo последовательностям пептидов, определенным с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Выделенные из яда токсины помимо токсичности на насекомых обладали цитолитическим действием на клетки грам(+) и грам(-) бактерий, поэтому за ними было закреплено окончательное название цито-инсектотоксины (CIT).

Поскольку цито-инсектотоксины обладали паралитическим действием, можно предположить, что основной их мишенью являются мембраны нейронов и/или мышечных клеток насекомых.

Для тестирования на млекопитающих использовали только один синтезированный твердофазным методом полипептид CIT 1а, который вводили мышам внутрибрюшинно. При дозе в 5 мг/кг веса исследуемый полипептид не проявлял признаков парализации или других проявлений острой токсичности. Наблюдали только мелкие конвульсии и признаки недержания мочи и кала, эти же симптомы без летального эффекта вызывало введение других веществ с мембранолитическими свойствами. Из экспериментов следует, что, возможно, все новые токсины этого семейства обладают большей специфичностью к насекомым, чем к млекопитающим.

Всего три непохожих семейства было обнаружено при проведении целенаправленного поиска инсектотоксинов в ядах двух видов пауков S. florentina и L. tarabaevi, которые в общей сложности содержат 31 уникальную последовательность новых токсинов.

III. 7. Поиск полипептидов с антимикробными свойствами

Во второй тест-системе, с помощью которой проводили целенаправленный поиск антимикробных компонентов в ядах, изучался бактериостатический эффект. Для более широкого охвата изучали эффекты природных ядов, фракций и отдельных компонентов на нескольких различных культурах грам(+) и грам(-) микроорганизмов, но первоначальное тестирование проводили на одном лабораторном штамме Е. coli DH5a. Среди протестированных ядов лидером снова оказался яд паука L. tarabaevi. При анализе хроматографического профиля (рисунок 16) образца природного яда, разделенного на обращено-фазной колонке, искомая антимикробная активность присутствовала в половине собранных фракций.

Среди компонентов активных мембранолитических фракций, были найдены представители группы цито-инсектотоксинов - 8 из 16, представленных в банке EST. Помимо них была обнаружена группа различных по аминокислотному составу гидрофобных пептидов, с большим временем удерживания на колонке и небольшой молекулярной массой 2-4 кДа. Полная аминокислотная последовательность 9 пептидов была установлена с помощью автоматического yV-концевого секвенирования по методу Эдмана в комбинации с de novo определением структуры МС/МС. Вся группа этих новых полипептидов была названа латарцинами, а отдельные представители получили названия: Ltc 1, Ltc 2а, Ltc За, Ltc 3b, Ltc 4a, Ltc 4b, Ltc 5, Ltc 6a и Ltc 7. Все выделенные из природного яда латарцины были найдены в банке данных EST в виде белков предшественников.

Рисунок 16 Разделение природного яда паука L. tarabaevi ВЭЖХ на обращено-фазной колонке Vydac Cis (4.6x250 мм, 218ТР54) в 0.1% ТФУ, в градиенте концентрации ацетонитрила 0-60% за 90 мин, скорость элюции 0.7 мл/мин. Активные фракции с антимикробной активностью в отношении Е. со// выделены.

Таблица 5 Результаты биологических испытаний линейных полипептидов из яда паука /.. (агайае// и мелитина из яда пчелы.

пептид Антимикробная активность; МИК, мкМ Гемолитическая активность на эритроциты человека; ЭК50, мкМ

Грамположительные бактерии Грамотрицательные бактерии

Bacillus subtilis B-5Q1 Staphylococcus aureus 2Q9-P Escherichia coli DH5a Pseudomonas aeruginosa PAOl

Ltd 1 16 1 4.1 28

Ltc2a 0.4 2 0.5 6.7 8

Ltc3a 1.2 16 2.5 >40 >50

Ltc3b 2.9 16 23 >45 >50

Ltc4a 1.1 8 4.5 >35 >50

Ltc4b 1.1 16 4.4 >35 >50

Ltc5 0.6 I.I 0.6 18 12

Ltc6a >70 >40 >70 >70 >50

Ltc7 >70 >40 >70 >70 >50

CITla 1 >16 1 2 6

мелитин 1 2 „ 8 >16 4

Для проведения развернутого биологического тестирования использовали химически синтезированные токсины, для которых были определены минимальные ингибирующие концентрации (МИК) пептидов, вызывающие полное ингибирование роста разных микроорганизмов in vitro,

а также концентрации, вызывающих 50% лизис эритроцитов (ЭК50) (см. результаты измерений в таблице 5).

Большинство протестированных пептидов обладали высокой антибактериальной активностью, сопоставимой с наиболее эффективными мембранолитическими соединениями, например, мелитином - основным компонентом яда медоносной пчелы Apis mellifera.

Итогом изучения компонентов яда паука L. tarabaevi с использованием традиционного подхода, основанного на измерении антимикробной активности, стало обнаружение 17 активных индивидуальных компонентов.

III.8. Поиск селективных модуляторов TRPV1 рецептора

III.8.1. Актуальность проблемы поиска модуляторов TRPV1 и

первичное тестирование ядов

Третьей тест-системой, использованной для поиска функционально активных компонентов природных ядов, было электрофизиологическое исследование модуляторов ионотропного рецептора TRPV1, активируемого капсаицином и теплом. TRPV1 выполняет чувствительно-эффекторные функции в периферической нервной системе, где он осуществляет функцию восприятия термических, химических и механических стимулов. Известно, что в ряде патологических состояний TRPV1 играет важную роль. Например, при болях воспалительного характера, раке, нейропатических и висцеральных болях, а также при воспалительных заболеваниях кишечника, интерстициальном цистите, недержании мочи, заболеваниях дыхательных путей, панкреатитах и мигренях.

Низкомолекулярные соединения, такие как арванил или капсаицин, могут активировать TRPV1. Сходным действием обладают также и три полипептидных агониста из яда тарантула Psalmopoeus cambridgei. Так как для эффективного подавления боли желательно не активировать, а ингибировать проводимость этого рецептора, наибольший интерес представляют соединения, снижающие его функциональную активность. Было показано, что аргинин-богатые пептиды и низкомолекулярные соединения на основе триалкил глицина или Ruthenium red, ингибирующие проводимость TRPV1, в экспериментах in vivo проявляют анальгетический эффект. Данные о полипептидных ингибиторах TRPV1 до момента начала исследования отсутствовали.

Биологические испытания образцов ядов пауков проводили в условиях гетерологичной (овер-) экспрессии TRPV1 каналов в ооцитах лягушки Xenopus laevis. Токи через мембрану ооцитов в ответ на аппликацию селективного агониста - капсаицина измеряли методом двухэлектродной фиксации потенциала. Среди 34 образцов ядов пауков не удалось обнаружить достойного кандидата для выделения ингибитора TRPV1 каналов. В связи с этим было проведено исследование ядов других животных. Среди

3 препаратов экстрактов морских анемон был найден один, приготовленный из морской тропической анемоны Heteractis crispa, снижавший регистрируемый ток в электрофизиологических экспериментах.

III.8.2. Выделение полипептидных компонентов из яда морской

анемоны Я. crispa

Морские анемоны относятся к типу кишечнополостных и не имеют специализированных желез для наработки ядовитого секрета. Токсины продуцируются стрекательными клетками, расположенными по всей поверхности организма, поэтому чистого яда из анемоны не получают. Полипептидные компоненты с искомой активностью выделяли из спиртового экстракта целых организмов.

Разделение компонентов экстракта хроматографическими методами потребовало большего количества стадий, чем при работе с ядами пауков. Вероятно, это связано с тем, что комбинаторных вариантов в морских организмах, как эволюционно более древних накоплено больше. Часть операций была выполнена непосредственно после отлова животных сотрудниками лаборатории химии пептидов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН под руководством д.х.н. Э.П. Козловской.

На первой стадии применяли гидрофобную хроматографию. Применение сорбента Полихром-1 позволило избавиться от таких представленных в экстракте балластных соединений, как липиды, пигменты, соли и низкомолекулярные соединения, а также гемолизинов, эффективно удаляемых промывкой водным буфером. Последующий ступенчатый градиент концентрации спирта позволил получить несколько фракций, среди которых одна обладала искомой активностью.

Рисунок 17 отражает все основные стадии разделения экстракта анемоны Я. crispa: вышеупомянутая гидрофобная хроматография, два этапа ионообменной хроматографии на колонках Bio-Rex 70 и SP-Sephadex С-25 в буферных растворах с нейтральным значением pH и, наконец, ВЭЖХ активной фракции на обращено-фазной колонке Jupiter С5. После каждого этапа разделения проводили измерение влияния получаемых фракций на проводимость TRPV1.

Рисунок 17 Основные стадии хроматографического выделения аналитических полипептидов АРНС1 и АРНС2 из спиртового экстракта нематоцитов морской анемоны Н. crispa. На первом этапе использовали гидрофобную колонку Полихром-1 (7x30 см), скорость элюции 1.2 л/час, ступенчатый градиент этанола к воде; на 2 этапе использовали ионообменную колонку Bio-Rex 70 (2.5x60 см), 5 мМ аммоний-ацетатный буфер (pH 4.5), скорость элюции 22 мл/час, линейный градиент концентрации (\laCI; на 3 этапе использовали ионообменную колонку SP-Sephadex С-25 (2.5x40 см), 5 мМ аммоний-ацетатный буфер (pH 4.5), скорость элюции 70 мл/час, сложный градиент создавали увеличением концентрацией NaCI и далее повышением значения pH раствора с 4.5 до 6.0; на последнем 4 этапе использовали обращено-фазную колонку Jupiter С5 (4.6x150 мм), буфер, содержащий 0.1% ТФУ, скорость элюции 1 мл/мин, градиент концентрации ацетонитрила. Активные фракции на каждом этапе выделены.

Итогом многостадийного разделения стало выделение двух индивидуальных компонентов с очень близкими молекулярными массами. Наиболее представленный компонент с массой 6187 Да (первый элюируемый на обращено-фазном сорбенте) получил название АРНС1, а второй слабо представленный токсин с массой 6185 Да - АРНС2.

объем(л) вреня(мин)

Рисунок 18 Основные стадии хроматографического выделения анальгетического полипептида АРНСЗ из спиртового экстракта нематоцитов морской анемоны Н. crispa. На первом этапе использовали гидрофобную колонку Полихром-1 (7x30 см), скорость элюции 1.2 л/час, ступенчатый градиент спирта в воде; на 2 этапе использовали гель-фильтрационную колонку Biogel Р-4 (1.4x96 см), уравновешенную водой, скорость элюции 0.25 мл/мин; на 3 этапе использовали ионообменную колонку SP-Sephadex С-25 (2.5x50 см), 100 мМ аммоний-ацетатный буфер (pH 4.5), скорость элюции 0.6 мл/мин, градиент pH рабочего буфера от 4.5 до 6.5; на 4 этапе использовали обращено-фазную колонку Delta-Pak Ci8-300 (4.6x250 мм), скорость элюции 2 мл/мин, 10 мМ аммоний-ацетатный буфер (pH 7.2), линейный градиент концентрации ацетонитрила 0-50% за 15 мин; на 5 этапе использовали обращено-фазную модифицированную колонку RP-amide (2x100 мм), скорость элюции 0.3 мл/мин, 10 мМ аммоний-ацетатный буфер (pH 7.2), линейный градиент концентрации ацетонитрила 17.5-54% за 70 мин; на 6 этапе использовали обращено-фазную колонку Luna Cíe (2x150 мм), скорость элюции 0.15 мл/мин в буфере, содержащем 0.1% ТФУ, линейный градиент концентрации ацетонитрила 0-70% за 70 мин. Активные фракции выделены на каждом этапе.

Определение частичной iV-концевой аминокислотной последовательности обоих компонентов не выявило отличий. Были идентифицированы следующие последовательности:

GSICLEPKVVGPCTA... для АРНС1;

GSICLEPKVVGPCTAYFRRF YFD... для АРНС2.

Была использована также альтернативная методика разделения экстракта (рисунок 18), которая включала еще большее количество основных стадий фракционирования. После 1 этапа на Полихроме, применяли гель-фильтрационную и ионообменную хроматографию. Дальнейшие этапы разделения состояли из ВЭЖХ, где последовательно использовали обращено-фазные колонки с тремя различными фазами.

В результате был выделен еще один активный компонент, названный АРНСЗ, с молекулярной массой 6111 Да. Определение частичной Л-концевой аминокислотной последовательности его первых 32 аминокислотных остатков:

GSICLEPKVVGPCTA YFPRFYFNSETGKCTPF...

подтвердило высокий уровень гомологии к ранее полученным АРНС1 и АРНС2.

Для определения полных аминокислотных последовательностей токсинов были получены кДНК из образцов тканей и проанализированы нуклеотидные последовательности, получаемые ПЦР на специфические праймеры к Л'-концевым фрагментам токсинов. В результате секвенирования выборочных клонов было обнаружено множество гомологичных структур с точечными мутациями. Для оценки количества возможных вариантов токсинов были определены суммарные нуклеотидные последовательности ПЦР фрагментов, полученных при амплификации, как кДНК, так и геномной ДНК. Было обнаружено 20 положений, представленных на рисунке 19, в которых наблюдались точечные замены аминокислотных остатков, дающие более миллиона возможных вариантов структур.

Так как наборы данных, полученных при анализе, как кДНК, так и геномной ДНК совпадали, можно сделать вывод о том, что в геноме Н. crispa содержится множество гомологичных генов, появившихся, скорее всего, в результате дупликации.

XXICXEPKVVGPCXAXXXRXYXXSETGKCTXXIXGGCXGXGNXXEXLXACRXICRA RG L К YFP Y YD РF Y К N KF S Н G

GS S Т RIR F FN LV S ES NR Т R А

GV I G L L

Q

Рисунок 19 Вариабельность полипептидов структурного семейства BPTI/Кунитц типа из морской анемоны Н. crispa.

Полноразмерные структуры всех найденных токсинов были отобраны из последовательностей реальных клонов по молекулярным массам кодируемых продуктов. После чего правильность выведенных структур подтверждали пептидным картированием полипептидов экстракта и МС/МС анализом полученных триптических пептидов.

АРНС1-3 имеют характерный мотив первичный структуры BPTI/Кунитц, впервые описанный для ингибитора сериновых протеиназ из поджелудочной железы быка BPTI. Белок предшественник состоит только из сигнального пептида, содержащего 22 аминокислотных остатка, и зрелой цепи. Наиболее представленный в экстракте морской анемоны полипептид АРНС1 отличается только одной аминокислотной заменой в 31 положении (V—>Р) от второго активного полипептида АРНС2. АРНСЗ отличается от первого полипептида четырьмя заменами.

GSICLEPKVVGPCTAYFRRFYFDS GSICLEPKVVGPCTAYFRRFYFDS GSICLEPKVVGPCTAYFPRFYFHS SICSEPKKVGRCKGYFPRFYFDS 1NKDCLLPHDVGRCRASHPRYYYNS PRRKLCI LHRNPGRCYDKIPAFYYNQ AAKVCKLPLR IGPCKRKI PS FYYKW RPDFCLEPPY1GPCKARIIRYFYNA W0PPWYC КЕ PV RIG S С Ш FSS FY FKW

ETGKCTVFIYGGCEGN ETGKCTPFIYGGCEGN Ё Т G К С Г Р FIY G 6 С £ 6 N ETGKCTPFIYGGCGGN SSKRCEKFIYGGCRGN MKÖCERFDWSGCGGN К А К Q С L Р F D Y S G С G G N KAGLC0T FVYGGCRAK TAKKCLPFLFSGCGGM

GNNFETLRACRAICRA АРНС1

GNNFETLRACRAICRA АРНС2

6NNFETLRACRGICRA АРНСЗ

GNNFETLHOCRAICRA SHPI1

ANNFHTLEECEKVCGVR KALI

SNRFKTIEECRRTCLG DTX-a

А N R F К ТIЕ Е С R R Г С V G DTXK

RNNFKSAEDCHRTCGGA BPTI

ANRFOTIGECRKKCLG САС

Рисунок 20 Выравнивание аминокислотных последовательностей анальгетических пептидов, выделенных из морской анемоны Н. crispa, построенное по результатам поиска гомологии BLAST с ингибиторами протеиназ: SHPI-1 (Р31713) из морской анемоны Stichodactyla helianthus, BPTI (Р00974) из поджелудочной железы быка; блокаторами К+ каналов -каликлюдином 1 (Q9TWG0) из морской анемоны А. viridis, дендротоксином альфа (Р00980) и дендротоксином-К {Р00981) из яда змей; блокатором Са2+ каналов кальциклюдином (Р81658) из яда змей.

Результаты анализа гомологии приведены на рисунке 20. Наиболее значительное сходство выделенных токсинов было обнаружено с тремя известными ингибиторами протеиназ морских анемон: ингибитор IV (87% гомологии) из Н. crispa, SHPI-1 (83% гомологии) и SHPI-2 (81% гомологии) из S. helianthus. Гомология наблюдалась также с некоторыми полипептидными токсинами.

III.8.3. Биологическая активность новых токсинов из морской анемоны

Рекомбинантные аналоги всех трех токсинов были получены в достаточном количестве для проведения биологических испытаний. Несмотря на высокий уровень гомологии первичных структур, все они отличались по проявляемой активности. Самым слабым ингибитором TRPV1 оказался АРНС2, он обладал слабо детектируемой (10-15%) ингибирующей

активностью на токи, вызываемые капсаицином, в концентрациях от 100 нМ до 3 мкМ. АРНСЗ обладал ингибирующей активностью ~30% и наиболее активный АРНС1 ингибировал токи не более чем на 50%.

Построенная концентрационная зависимость действия АРНС1 показала, что действие пептида даже в насыщающих концентрациях не вызывает полной блокады ТЯРУ1 каналов. Скорость восстановления ответа после отмывки пептида была высокой, а его воздействие на рецептор было полностью обратимым (см. рисунок 21). Расчетная величина половинного ингибирования индуцированных токов - ЕС50, составила 54±4 нМ, при расчетном значении коэффициента Хилла 2.12±0.19.

/о

А ^ IJHA Cops

-100 -200 -300 -400 -500 -600 -700

Caps + 300 нМАРНС)

100 200 300 400

Время, сек

Б У1о 1.05

0.95 0.85 0.75 0.65 0.55

50

10

100 1000

[АРНС1], нМ

Рисунок 21 Действие АРНС1 на капсаицин-индуцируемые каналы TRPV1. (А) - записи проводимости каналов после добавления 2 мкМ капсаицина (Caps) и 2 мкМ капсаицина совместно с рекомбинантным АРНС1 (конечная концентрация 300 нМ). (Б) - кривая зависимости доза - ответ, построенная как отношение тока после совместной аппликации АРНС1 с капсаицином к уровню тока возбуждения контрольного эксперимента.

Исследуемые полипептиды не оказывали никакого влияния на мембранный потенциал ооцитов. Совместная аппликация капсаицина и BPTI в концентрациях от 100 нМ до 3 мкМ не выявила никакого влияния ингибиторов протеиназ на токи, индуцированные капсаицином через TRPV1. Таким образом, можно сделать вывод, что АРНС полипептиды напрямую взаимодействуют с TRPV1 и является модуляторами его активности.

Функция ингибирования протеолитических ферментов у выделенных токсинов сохранилась. В экспериментах по ингибированию трипсина и химотрипсина их активность была сравнена с двумя классическими ингибиторами протеиназ (см. данные в таблице 6). Как видно из значений констант ингибирования, эта активность была незначительной.

Таблица 6 Константы ингибирования сериновых протеиназ.

полипептид Ki трипсин Ki химотрипсин

АРНС1 1.0*10"6 5.0* Ю-6

АРНС2 0.9*10"6 4.5*10-*

АРНСЗ 5.0*10'7 7.0*10"6

BPTI 6.0*10"14 1.8* Ю-13

SHP1-1 1.0*10-'° 2.3* 10'9

Анальгетическая активность токсинов морской анемоны была изучена в экспериментах in vivo. Пептидные модуляторы, несмотря на неполное блокирование проводимости рецептора TRPV1, достоверно снижали болевую чувствительность у мышей. Введение рекомбинантных АРНС1-3 внутривенно не приводило к каким-либо токсическим эффектам в дозах до 1 мг/кг и не влияло на нормальное поведение животных.

Рисунок 22 Влияние АРНС1, АРНС2, АРНСЗ и ВРТ1 на время задержки облизывания задних лап при внутривенном введении в тесте горячей пластины (Т=55°С). Достоверность отличий от контроля определяли анализом вариабельности А1ЧО\/А и тестом Тьюки. Статистически достоверные различия (Р<0.05) отмечены *, для каждого соединения приведены значения среднеквадратичных отклонений.

В моделях тепловой стимуляции боли использовали тест горячей пластины, основанный на активации ТЯРУ1 и, возможно, некоторых других рецепторов. На рисунке 22 приведены данные сравнения активности трех анальгетических пептидов морской анемоны и ингибитора трипсина быка ВРТ1, полученные при введении полипептидов в дозе 0.1 мг/кг веса. Наибольшим анальгетическим потенциалом обладал АРНСЗ, его активность в этом тесте незначительно превосходила активность АРНС1. АРНС2 был наименее активен, однако действие его как анальгетика было статистически

достоверно. Ингибитор сериновых протеиназ BPTI, использованный как контроль, не проявлял анальгетической активности.

Анализ минимальной действующей дозы полипептида АРНС1 подтвердил большой анальгетический потенциал нового полипептида, который вызывал достоверно значимое увеличение латентного времени облизывания задних лап даже в дозе 0.01 мг/кг. Следует отметить, что доза морфина необходимая для достижения аналогичного эффекта в тестах отдергивания хвоста и нагретой пластины составляет около 3 мг/кг при терапевтической дозе морфина для человека 0.3 мг/кг.

В результате выполнения этого этапа работы из яда морской анемоны Н. crispa были получены и охарактеризованы три новых токсина - первые ингибиторы TRPV1 рецептора полипептидной природы. Два из них обладают большим терапевтическим потенциалом для практического внедрения в медицину в качестве анальгетиков нового поколения, обладающих специфичным действием на молекулярном уровне.

IV. Выводы

1) Предложена новая стратегия анализа структурного разнообразия полипептидных компонентов яда животного происхождения на основе обработки баз данных EST фрагментов и идентификации зрелых форм компонентов природных ядов. При использовании данной стратегии в 3 изученных банках EST обнаружено 232 полипептидные последовательности, из которых только 8 были известны ранее; достоверность предсказанных посттрансляционных модификаций подтверждена при протеомном анализе нескольких ядов.

2) С помощью метода формализации белковых последовательностей для цистеин-содержащих полипептидов обнаружено два характерных мотива первичной структуры токсинов пауков и 13 мотивов токсинов морских анемон.

3) Проведен протеомный анализ ядов индивидуальных пауков и найдены их различия на уровне отдельной особи. Продемонстрировано присутствие постоянных и "мобильных" компонентов яда пауков и доказана необходимость комбинации геномных и протеомных технологий для полной характеристики компонентного состава яда.

4) На основе функциональной протеомики обнаружен и структурно охарактеризован 31 новый инсектотоксин из ядов двух видов пауков S. florentina иЬ. tarabaevi.

5) При изучении антимикробных полипептидных компонентов яда паука L. tarabaevi найдено 17 новых пептидов и открыт новый функциональный класс - цито-инсектотоксины.

6) Впервые обнаружены полипептиды, способные ингибировать функциональную активность ванилоидных рецепторов ТЯРУ1. Показано, что эти пептиды обладают выраженным анальгетическим действием и могут служить основой для создания новых анальгетиков.

V. Список работ, опубликованных по теме диссертации

V.1. Научные статьи:

1) Lipkin A., Kozlov S., Nosyreva Е., Blake A., Windass J.D., Grishin E. Novel insecticidal toxins from the venom of the spider Segestría florentina // Toxicon. 2002. V. 40. P. 125-130.

2) Kozlov S., Malyavka A., McCutchen В., Lu A., Schepers E., Herrmann R., Grishin E. A novel strategy for the identification of toxin like structures in spider venom // Proteins. 2005. V. 59. P. 131-140.

3) Kozlov S., Grishin E. Classification of spider neurotoxins using structural motifs by primary structure features. Single residue distribution analysis and pattern analysis techniques // Toxicon. 2005. V. 46. P. 672-686.

4) Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Feofanov A.V., Surovoy A.Y., Karpunin D.V., Grishin E.V. Latarcins, antimicrobial and cytolytic peptides from the venom of the spider Lachesana tarabaevi (Zodariidae) that exemplify biomolecular diversity // J Biol Chem. 2006. V. 281. P. 20983-20992.

5) A.A. Василевский, C.A. Козлов, M.H. Жмак, И.А. Куделина, П.В. Дубовский, О .Я. Шатурский, А.С. Арсеньев, Е.В. Гришин Исследование синтетических аналогов антимикробных пептидов из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi // Биоорганическая химия.

2007. Т. 33. С. 405-412.

6) S.A. Kozlov, E.V, Grishin The universal algorithm of maturation for secretory and excretory protein precursors // Toxicon. 2007. V. 49. P. 721-726.

7) Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Samsonova O.V., Egorova N.S., Karpunin D.V., Pluzhnikov K.A., Feofanov A.V., Grishin E.V. Cyto-insectotoxins, a novel class of cytolytic and insecticidal peptides // Biochem J.

2008. V. 411. P. 687-696.

8) Andreev Ya.A., Kozlov S.A., Koshelev S.G., Ivanova E.A., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P., Grishin E.V. Analgesic compound from sea anemone Heteractis crispa is the first polypeptide inhibitor of trpvl receptor // J Biol Chem. 2008. V. 283. P. 23914-23921.

9) Yu.M. Shlyapnikov, Ya.A. Andreev, S.A. Kozlov, A.A. Vassilevski, E.V. Grishin Bacterial production of latarcin 2a, a potent antimicrobial peptide from spider venom // Protein Expr Purif. 2008. V. 60. P. 89-95.

10) Я.А. Андреев, C.A. Козлов, Э.П. Козловская, Е.В. Гришин Анальгетическое действие пептидного ингибитора TRPV1 рецептора в моделях тепловой стимуляции боли // Доклады Академии наук. Биохимия, биофизика, молекулярная биология. 2009. Т. 424. С. 688-691.

11) С.А. Козлов, Я.А. Андреев, А.Н. Мурашев, Д.И. Скобцов, И.А. Дьяченко, Е.В. Гришин Новые полипептидные компоненты с анальгетической активностью из морской анемоны Heteractis crispa // Биоорганическая химия. 2009. Т. 35. С. 789-798.

12) Ю.М. Шляпников, С.А. Козлов, A.A. Федоров, Е.В. Гришин Сравнение полипептидного состава яда индивидуальных пауков Agelena orientalis // Биоорганическая химия. 2010. Т. 36. С. 88-95.

13) Andreev Y.A., Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Grishin E.V. Cyanogen bromide cleavage of proteins in salt and buffer solutions // Anal Biochem. 2010. V. 407. P. 144-146.

14) Осмаков Д.И., Андреев Я.А., Козлов С.А. Получение рекомбинантных биологически активных полипептидов морских анемон // Вестник Московского государственного областного университета. Серия: Естественные науки. 2010. № 3. С. 7-11.

15) Kozlov S., Grishin Е. The mining of toxin-like polypeptides from EST database by single residue distribution analysis // BMC Genomics. 2011. V. 12. P. 88.

V.2. Обзорные статьи:

16) S.A. Kozlov Polypeptide toxins from animal venoms // Recent Pat DNA Gene Seq. 2007. V. 1. P. 200-206.

17) A.A. Vassilevski, S.A. Kozlov, E.V. Grishin Antimicrobial peptide precursor structures suggest effective production strategies // Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov. 2008. V. 2. P. 58-63.

18) A.A. Василевский, С.А. Козлов, Е.В. Гришин Молекулярное разнообразие яда пауков // Успехи биологической химии. 2009. Т. 49. С. 211-274.

V.3. Публикации в научных сборниках:

19) Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Grishin E.V. Peptidomics of short linear cytolytic peptides from spider venom // Peptidomics Methods and Applications / Eds. M. Soloviev, C. Shaw, P. Andren. New Jersey: Wiley-Interscience, 2007. P. 55-70.

20) Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Grishin E.V. Secreted protein and peptide biosynthesis: precursor structures and processing mechanisms // Protein biosynthesis / Eds T. E. Esterhouse, L. B. Petrinos. New York: Nova Science Publishers, Inc., 2009. P. 225-248.

21) Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Egorov T.A., Grishin E.V. Purification and characterization of biologically active peptides from spider venoms // Peptidomics: Methods and Protocols, серия: Methods in Molecular Biology / Eds. M. Soloviev. New York: Humana Press, 2010. V. 615. P. 87-100.

V.4. Патенты:

1) Патент WO 9949035 Insecticidal compounds / Blake, A.N., Windass, J.D., Lipkin, A.V., Nosyreva, E.D., Grishin, E.V., Koslov, S.A.; Опубл. 1999.

2) Патент РФ 2302425 Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность / Козлов С.А., Василевский A.A., Феофанов A.B., Арсеньев A.C., Гришин Е.В.; Опубл. 2007.

3) Патент РФ 2302466 Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность / Козлов С.А., Василевский A.A., Феофанов A.B., Суровой А.Ю., Арсеньев A.C., Гришин Е.В.; Опубл. 2007.

4) Патент РФ 2302467 Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность / Козлов С.А., Василевский A.A., Феофанов A.B., Суровой А.Ю., Арсеньев A.C., Гришин Е.В.; Опубл. 2007.

5) Патент РФ 2306148 Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность / Козлов С.А., Василевский A.A., Воронцова О.В., Полянский A.A., Волынский П.Е., Феофанов A.B., Ефремов Р.Г., Арсеньев A.C., Гришин Е.В.; Опубл. 2007.

6) Патент РФ 2316336 Способ получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью / Полянский A.A., Волынский П.Е., Василевский A.A., Воронцова О.В., Козлов С.А., Феофанов A.B., Арсеньев A.C., Гришин Е.В., Ефремов Р.Г.; Опубл. 2008.

7) Патент РФ 2319745 Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность / Козлов С.А., Василевский A.A., Самсонова О.В., Полянский A.A., Волынский П.Е., Феофанов А. В., Ефремов Р.Г., Арсеньев А. С., Гришин Е. В.; Опубл. 2008.

8) Патент РФ 2368621 Полипептид актинии, обладающий анальгетическим действием / Козлов С.А., Андреев Я.А., Кошелев С.Г., Иванова Е.А., Лейченко Е.В., Козловская Э.П., Гришин Е.В.; Опубл. 2009.

9) Патент РФ 2404245 Полипептид актинии, обладающий анальгетическим действием / Козлов С.А., Андреев Я.А., Мурашев А.Н., Гришин Е.В.; Опубл. 2010.

Подписано в печать: 01.02.11

Объем: 2,0 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ X» 781 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

I. ВВЕДЕНИЕ :

1.1. Объекты исследования

1.2. Цели и задачи работыб

1.3. Основные реализованные в работе подходы

II. Обзор литературы

2.1. Введение

2.2. Классификация токсинов

2.3. Структурные особенности токсинов

2.4. Биосинтез полипептидных токсинов

2.5. Биологические свойства полипептидных токсинов

2.5.1. Токсины, действующие на К+ каналы

2.5.2. Токсины, действующие на Са2+ каналы

2.5.3. Токсины, воздействующие на Na+ каналы

2.5.4. Токсины, действующие на другие типы рецепторов

2.5.5. Токсины с неспецифичным действием

2.6. Современные подходы к исследованию токсинов пауков

4.6.1. Актуальность проблемы поиска модуляторов TRPV1 и первичное тестирование ядов114

4.6.2. Выделение полипептидных компонентов из яда морской анемоны Н. crispa 115

4.6.3. Биологическая активность новых токсинов из морских анемон 120

V. Выводы124

VI. Список сокращений125

VII. Благодарности127

VIII. Список цитируемой литературы128

IX. Приложение I149

X. Приложение И153

XI. Приложение III161

I. ВВЕДЕНИЕ

Начало 21 века ознаменовано технологическими прорывами в области биохимических исследований. Возросли темпы сбора и обработки биоинформации, ускорились процессы расшифровки новых структур, активно разрабатываются и внедряются постгеномные технологии. Труд ученых становится все более и более продуктивным, и практическая составляющая научных исследований приобретает все более значимый интерес. Настоящая работа посвящена изучению биологически активных молекул, которые могут быть использованы в медицине, ветеринарии или агропромышленном комплексе.

Природные биологически активные молекулы давно используются как основа для производства различных лекарственных препаратов. Многие биологически активные вещества прошли долгий эволюционный отбор и заслужили право стать стандартом в медицине. Однако, всегда остается возможность улучшить определенные свойства имеющихся соединений или найти более эффективные. В последнее время наметилась тенденция активного изучения полипептидных молекул, которые в скором времени смогут конкурировать на рынке с небелковыми соединениями. Самыми разнообразными по структуре и функции биологически активными соединениями являются природные токсины.

Животные, способные продуцировать яд, известны давно. По своему составу яд животных - сложная многокомпонентная смесь активных молекул, которая идеально подходит для поиска новых лекарственных средств. В настоящей работе внимание уделяется полипептидным компонентам природных ядов, в основном это нейротоксины, способные при низких концентрациях вызывать смерть или паралич потенциальных жертв. Быстрый эффект обусловлен запуском различных механизмов блокирования прохождения нервных импульсов от периферии к центральной нервной системе (ЦНС). Преимущественными мишенями при этом являются ионотропные рецепторы Са2+, К+, СГ каналов, а также глутаматные и ацетилхолиновые рецепторы, возбуждение и/или ингибирование которых происходит одновременно под действием разно ориентированных нейротоксинов. После чего происходит сбой работы основных контролируемых систем дыхания, кровоснабжения и движения.

Вторыми по распространенности компонентами природных ядов являются мембрано-активные пептиды (МАП). Они представляют собой обширный и гетерогенный класс соединений, способных взаимодействовать не со специфическим белковым рецептором, а с липидным бислоем - неотъемлемым компонентом любой клетки. Характерная черта большого числа МАП - способность к дестабилизации мембраны-мишени, приводящая к клеточной гибели. Поэтому

МАП, функция которых состоит в разрушении мембраны и убийстве клетки, называют таюке цитолитическими пептидами или цитотоксинами. Из-за способности образовывать в мембране поры часть из них может именоваться пороформерами. Из-за специфичности сродства отдельных МАП к мембранам прокариот некоторые носят название антимикробные пептиды (АМП). Наконец кМАП можно отнести отдельные полипептиды с ферментативной активностью, например, фосфолипазы.

В природных ядах встречается еще несколько функциональных классов белков, в том числе и полипептидные молекулы, нетоксичные для животных, однако такие компоненты принято также именовать токсинами, как и вышеперечисленные МАП.

V. выводы

1) Предложена новая стратегия анализа структурного разнообразия полипептидных компонентов яда животного происхождения на основе обработки баз данных EST фрагментов и идентификации зрелых форм компонентов природных ядов. При использовании данной стратегии в 3 изученных банках EST обнаружено 232 полипептидные последовательности, из которых только 8 были известны ранее; достоверность предсказанных посттрансляционных модификаций подтверждена при протеомном анализе нескольких ядов.

2) С помощью метода формализации белковых последовательностей для цистеинсодержащих полипептидов обнаружено два характерных мотива первичной структуры токсинов пауков и 13 мотивов токсинов морских анемон.

3) Проведен протеомный анализ ядов индивидуальных пауков и найдены их различия на уровне отдельной особи. Продемонстрировано присутствие постоянных и "мобильных" компонентов яда пауков и доказана необходимость комбинации геномных и протеомных технологий для полной характеристики компонентного состава яда.

4) На основе функциональной протеомики обнаружен и структурно охарактеризован 31 новый инсектотоксин из ядов двух видов пауков S. florentina и L. tarabaevi.

5) При изучении антимикробных полипептидных компонентов яда паука L. tarabaevi найдено 17 новых пептидов и открыт новый функциональный класс — цито-инсектотоксины.

6) Впервые обнаружены полипептиды, способные ингибировать функциональную активность ванилоидных рецепторов TRPV1. Показано, что эти пептиды обладают выраженным анальгетическим действием и могут служить основой для создания новых анальгетиков.

VI. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ANOVA - дисперсионный анализ,

ASIC - кислотно-чувствительный ионный канал,

BAPNA - и-нитроанилид Аг-бснзоил-.0£-аргинина,

BDS - blood depressing substance,

ВК - кальций-активируемые К+ каналы большой проводимости,

ВТЕЕ - этиловый эфир-ТУ-бензошь/хгирозина,

CIT - цито-инсектотоксин,

CPD - карбоксипептидаза D,

СРЕ - карбоксипептидаза Е, dbEST - база данных последовательностей EST,

DDH - disulfide directed р-hairpin,

DPP - дипептидил пептидаза,

EafterR - inversed processing quadruplet мотив,

EC50 - значение концентрации вещества вызывающее 50% эффект,

EST - случайные нуклеотидные последовательности,

EtoR - Arginine cleavage by Glutamic acid control мотив.

Fmoc - флуоренилметоксикарбонил,

HEPES - 4-(2-оксиэтил) 1 -пиперазинэтансульфоновая кислота,

IC5o - значение 50% ингибирования тока,

ICK - мотив цистеинового узла,

IK - кальций-активируемые К+ каналы средней проводимости,

NARC - K-type neural apoptosis regulated convertase,

R(K)toR - Arginine cleavage by basic control мотив,

SK - кальций-активируемые K+ каналы малой проводимости,

SRDA - анализ распределения одиночного остатка,

TRPV - ионотропный ванилоидный рецептор,

TTX-R - тетродотоксин устойчивые Na+ каналы,

TTX-S - тетродотоксин чувствительные Na+ каналы,

VPE - vacuolar processing enzyme,

АМП - антимикробный пептид,

ВП - винилпиридин,

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,

ДСМ - дополнительный структурный мотив,

ДТТ - 1,4-дитиотреитол, иПКМ - inversed processing quadruplet мотив,

ЛД50 - средняя летальная доза,

МАЛДИ - ионизация лазерной десорбцией, ассистируемая матрицей,

МАП - мембрано-активный пептид,

МИК - минимальная ингибирующая концентрация,

МС/МС - тандемная масс-спектрометрия,

ПАМ - пептидилглицин а-амидирующая монооксигеназа,

ПГЛ - пептидил-а-гидроксиглицин а-амидирующая лиаза,

ПГМ - пептидил-а-гидроксилирующая монооксигеназа,

ПКМ - processing quadruplet мотив,

ПСМ - принципиальный структурный мотив,

ПСМ(С) - принципиальный структурный мотив с одним дополнительным цистеином,

ПСМ(СС) - принципиальный структурный мотив с двумя дополнительными цистеинами,

ПЦР - полимеразная цепная реакция, ски - субтилизин кексин изоцим,

СППК - субтилизин-подобные пропротеин конвертазы

Трис - трис-(оксиметил)аминометан,

ТФУ - трифторуксусная кислота, цнс - центральная нервная система,

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота,

ЭК5о - концентрация вызывающая 50% эффект.

VII. БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность за помощь в работе:

- Коллективу лаборатории нехфорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН и лично Молявке А.А., Шляпникову Ю.М., Андрееву Я.А., Василевскому А.А., Липкину А.В., Кошелеву С.Г., Корольковой Ю.В. и Гришину Е.В. за непосредственное участие в работе, Егорову Ц. А. и Мусолямову А.Х. за помощь при секвенировании пептидов;

- Коллективу лаборатории химии пептидов ИБХ РАН и лично Егоровой Н.С., Суровому А.Ю. а также сотруднику лаборатории рецепции нейропептидов Жмаку М.Н. за химический синтез пептидов;

- Сотрудникам структурных подразделений ИБХ РАН: лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул, лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии, лаборатории моделирования биомолекулярных систем за анализ и расчет структур антимикробных пептидов;

- Руководителю патентного отдела ИБХ РАН Мартине кой Т.Д.;

- Сотрудникам лаборатории биологических испытаний филиала ИБХ РАН в городе Пущино и лично Мурашеву А.Н. за измерение биологической активности на животных моделях;

- Сотрудникам лаборатории химии пептидов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН за поставку полипептидных фракций морских анемон;

- Федорову А.А. (ТОО «Научно-производственное объединение Фауна»; Алматы, Республика Казахстан) за предоставление качественного материала для работы;

- Сотрудникам структурных подразделений Pioneer Hi-Bred International, Inc., и DuPont Agriculture and Nutrition и лично Bill McCutchen, Albert Lu, Eric Schepers, Rafi Herrmann за помощь в конструировании и секвенировании банков данных нуклеотидных последовательностей из желез пауков.

2.7. Заключение

В состав яда пауков входят самые разнообразные полипептидные компоненты, имеющие различные мишени, которые направленно модулируют множество физиологических процессов. Яды можно рассматривать как природные фармакопеи, и практический интерес к ним в настоящее время вызван возможностью получения новых фармакологических препаратов. Поскольку основной добычей пауков служат насекомые, разнообразные инсектотоксины, содержащиеся в их ядах, могут быть использованы как биоинсектициды для снижения потерь в сельском хозяйстве, связанных с насекомыми-вредителями. Присутствует и фундаментальный интерес к компонентам ядов пауков, который заключается в получении высокоселективных инструментов для исследования различных клеточных рецепторов.

Большему внедрению полипептидов из ядов пауков в практику пока мешает их недоступность. Токсины пауков могут быть в ряде случаев успешно экспрессированны в клеточных системах, но при использовании прокариотических

36 систем экспрессии не всегда обеспечивается правильное замыкание многочисленных дисульфидных связей. Возможно осуществить химический синтез полипептидов, так как они имеют не слишком протяженную полипептидную цепь, но проблема правильного замыкания дисульфидных связей стоит здесь так же остро. Есть надежда, что дальнейшее совершенствование технологий позволит снять существующие ограничения, и полипептиды из ядов пауков займут достойное место в научной и практической сфере.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы

3.1.1. Реактивы

В работе использовались реактивы и материалы производства Clontech, ICN, Merck, Novabiochem, Novagen, Promega, Sigma-Aldrich, Fluka Chemie GmbH, Fermentas (Литва), Криохром и Химмед. Все реактивы отечественного производства, использовавшиеся в работе, имели квалификацию осч или чда, импортные реактивы имели маркировку для молекулярной биологии или аналитической работы. Все растворы были приготовлены с использованием деионизованной воды (сопротивление 18.2 МОм), полученной на установке Millipore. Для клеточных работ использовалась вода, стерилизованная с помощью автоклавирования.

3.1.2. Биологический материал и животные

Пауки среднеазиатского региона были собраны на территории Казахстана и Киргизии сотрудниками ТОО «Научно-производственное объединение Фауна» (Казахстан). Цельный яд пауков (лиофилизованные препараты) и железы, секретирующие яд (глубокая заморозка на сухом льде), были приобретены у объединения «Фауна» в готовом виде. Там же были приобретены образцы ядов индивидуальной дойки пауков A. orientalis. Живые морские анемоны Н. crispa в работе не использовали, вместо них использовали фракции после разделения спиртовых и водных экстрактов морской анемоны, любезно предоставленные ТИБОХ РАН для совместной работы. Методика приготовления экстрактов анемон изложена [161]. В исследованиях эффектов in vivo использовались мыши лини CD-I (НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН») весом 19-21 г. Животные содержались при температуре 23±2°С, вода и еда ad libitum. Каждое животное использовалось для эксперимента один раз.

3.1.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы

Штамм Е. coli XL 1-Blue использовали для молекулярного клонирования, Е. coli BL21(DE3) - для проведения экспрессии. Использовали на различных этапах работы плазмидные вектора pBlueScriptll SK+ (Stratagene), pET32b (Novagen), pAL-TA (Евроген). Бактериальные культуры для анализа антимикробной активности были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов (http://www.vkm.ru/).

3.2. Математические вычисления и данные для анализа

3.2.1. Исходные данные для анализа

Аминокислотные последовательности белков для проведения анализов были получены из депозитария национального центра биотехнологической информации [162]. Для поиска необходимых последовательностей использовали специализированные запросы, сужающие поиск. Следующие выборки аминокислотных последовательностей были получены с сервера, преобразованы в нужный формат и проанализированы.

1) 39903 аннотированные белковые последовательности с детализированной информацией о координатах активного полипептида для анализа созревания всевозможных белков предшественников многоклеточных организмов (январь 2008 года). Для формирования выборки первоначально использовали поисковый запрос "metazoa", "precursor" после чего фильтровали выбранные последовательности локально автоматическими скриптами по дополнительным критериям. Выбирали только последовательности для которых был описан хотя бы один пропептид и указаны точные координаты процессируемой активной цепи.

2) 231 аминокислотная последовательность токсинов, выделенных из морских анемон (февраль 2010).

3) 10903 последовательности полипептидных токсинов для проверки эффективности работы разработанных алгоритмов и запросов поиска (апрель 2010). Для выборки использовали поисковый запрос "toxin" и ограничение по видовой принадлежности к царству животных.

Для поиска токсинов морских анемон использовали банк EST, созданный для средиземноморской морской анемоны А. viridis [163]. Весь объем исходных данных в количестве 39939 EST был загружен с сервера [164].

3.2.2. Вычисления

Анализ последовательностей проводили на персональном компьютере средней производительности под управлением операционной системы Windows ХР. Анализируемые последовательности экспортировали в табличный редактор Excel (из пакета программ MS Office 2003) с параметрами безопасности, разрешающими применение внешних макрокоманд. Использовали набор специальных функций, написанных на языке VBA для использования внутри MS Excel, MS Word, которые осуществляли трансляцию нуклеотидных последовательностей, поиск гомологии по образцу, конвертирование в упрощенные последовательности, расчет молекулярных масс и прочие операции с массивами данных.

Для проведения множественного выравнивания полипептидных последовательностей с визуализацией результатов, формирования контигов и выведения консенсусной последовательности, разработки олигонуклеотидных зондов, анализа свойств полипептидов использовали набор утилит программного комплекса Winstar (DNASTAR Inc.). Расчет молекулярных масс белковых последовательностей природных и модифицированных, а также молекулярных масс пептидов, получаемых после специфической фрагментации полипептидной цепи, проводили с использованием программы GPMAW 4.04 (Lighthouse data, Дания). Для

39 статистической обработки экспериментальных данных использовали пакет программ ORIGIN (OriginLab).

Структуру сигнального пептида устанавливали с помощью сетевого ресурса SignaP [165] по двум предлагаемым методикам расчета, на основе нейрональной сети и Hidden Markov модели. Для определения новизны найденных структур проводили поиск гомологии их первичной структуры против не вырожденной базы белковых последовательностей методами blastp and PSI-BLAST [166].

3.3. Оборудование

В работе использовали основное лабораторное оборудование ведущих фирм производителей: Eppendorf, LKB-Pharmacia, Bio-Rad, Hitachi, Flow Laboratories, B.Braun Melsunger AG, Leybold-Heraeus, Sanyo, SAVANT Instruments Inc. Несколько хроматографических систем высокого давления было задействовано в работе: фирмы Beckman, состоящих из модуля поршневых насосов модели 126 System Gold и двулучевого УФ детектора 167 модели с изменяемой длиной волны, дополнительно укомплектованного детектором с фотодиодной сканирующей матрицей Waters 991; фирмы Kontron Instruments состоящей из блока насосов модели 522 и УФ-детектора с переменной длиной волны модели 535; а также моноблочная хроматографическая система 130А (Applied Biosystems). Для хроматографии низкого давления использовали отдельные компоненты фирмы Gilson и LKB-Pharmacia, которые комбинировали между собой в зависимости от стоящих задач. Масс-спектры получали на МАЛДИ-время пролетных масс-спектрометрах M@LDI-LR (Micromass) и Ultraflex TOF-TOF (Bruker Daltonik GmbH), оснащенных УФ-лазером (337 нм), с идентификацией положительных ионов в линейном или рефлекторном режиме. При необходимости использовали тандемную масс спектрометрию (МС/МС) для определения вторичных ионов на приборе Ultraflex TOF-TOF. -/V-концевую аминокислотную последовательность полипептидов определяли на автоматическом секвенаторе белков Procise 492 (Applied Biosystems). Для чтения нуклеотидных последовательностей применяли ABI Model 373 Automated DNA Sequencer (Applied Biosystems). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на градиентном амплификаторе РТС-200 (MJ Research). Спектры КД измеряли с помощью спектрополяриметра J-810 (Jasco) в области поглощения амидного хромофора (диапазон длин волн 190-250 нм) с шагом 0.2 нм при 20°С. Для электрофизиологических измерений использовали установку собственного производства, основанную на усилителе слабых токов Gene Clamp 500 (Axon Instrument).

3.4. Методы

3.4.1. Создание библиотек EST из ядовитых желез

Библиотеки иуклеотидных последовательностей были созданы сотрудниками DuPont Agriculture & Nutrition для пауков среднеазиатского региона в ходе выполнения совместной научно исследовательской работы. Общая РНК из ядовитых желез была получена набором TRIzol (Life Technologies) из замороженных в жидком азоте образцов. Далее мРНК выделяли аффинной хроматографией с помощью набора mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech) и синтезировали первую цепь кДНК набором Superscript II (Life Technologies). Продукты по добавленным адаптерным последовательностям клонировали по сайтам EcoRI и Xhol в плазмиду pBlueScript SK+ и далее считывали информацию с универсального праймера М13 (см. структуру в Таблице 2) автоматическими методами определения иуклеотидных последовательностей.

3.4.2. Получение кДНК из пауков и морских анемон

Для получения кДНК использовали замороженные в жидком азоте железы пауков или нематоцисты морских анемон. Исходный материал 50-100 мкг гомогенизировали при помощи специального пестика (Eppendorf) в 300 мкл буфера содержащего 4 М гуанидинтиоционат, 25 мМ цитрат натрия, 0.5% TV-лауроилсаркозин, затем добавляли 300 мкл фенола, насыщенного Трис-НС1 (pH 8.0), интенсивно перемешивали, инкубировали 10 мин при 40°С. Затем для разделения фаз добавляли 125 мкл хлороформа, интенсивно смешивали и центрифугировали при 14000 об/мин 2 мин. Водную фазу отбирали и повторяли обработку фенолом и хлороформом. К водной фазе добавляли 2 объема 96% этилового спирта, перемешивали, центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 мин. Осадок растворяли в 150 мкл 40 мМ Трис-ацетат (pH 8.3), 1 мМ ЭДТА буфера. К раствору добавляли 300 мкл 9 М LiCl, инкубировали 2 часа при -20°С, затем центрифугировали 5 мин при 14000 об/мин. Осадок подсушивали и растворяли в 50 мкл воды. В качестве альтернативы использовали набор реактивов RNAwiz (Ambion) по протоколу фирмы производителя.

Количество РНК и наличие примесей на различных стадиях выделения определяли спектрофотометрически по поглощению при 260 и 280 нм. мРНК выделяли аффинной хроматографией с помощью набора mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech) и синтезировали первую цепь кДНК набором Superscript II (Life Technologies).

Образцы геномной ДНК получали сходной методикой из щупалец морских анемон.

3.4.3. Определение нуклеотидной последовательности генов, кодирующих токсины

ПЦР с использованием специфических зондов (см. структуру в Таблице 2) применяли для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих выделенные из ядов природные токсины. Для встраивания продуктов реакции в pBlueScript SK+ vector (Stratagene) и дальнейшего клонирования в клетках Е. coli XL-1 Blue использовали несколько универсальных зондов.

Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе (Model 373А Applied Biosystems, США) при помощи набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems, США).

1. The World Spider Catalog, by Norman I. Platnick, American Museum of Natural History: Электронный ресурс. Режим доступа: http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html. Дата обращения: ноябрь 2010.

2. Sheumack D. D., Claassens R., Whiteley N. M., Howden M. E. Complete amino acid sequence of a new type of lethal neurotoxin from the venom of the funnel-web spider Atrax robustus // FEBS Lett. 1985. V. 181. P. 154-156.

3. Brown M. R., Sheumack D. D., Tyler M. I., Howden M. E. Amino acid sequence of versutoxin, a lethal neurotoxin from the venom of the funnel-web spider Atrax versutus // Biochem J. 1988. V. 250. P. 401-405.

4. Rezende Junior L., Cordeiro M. N., Oliveira E. В., Diniz C. R. Isolation of neurotoxic peptides from the venom of the 'armed' spider Phoneutria nigriventer // Toxicon. 1991. V. 29. P. 1225-1233.

5. Mcintosh J. M., Santos A. D., Olivera В. M. Conus peptides targeted to specific nicotinic acetylcholine receptor subtypes // Annu Rev Biochem. 1999. V. 68. P. 59-88.

6. Olivera В. M., Cruz L. J. Conotoxins, in retrospect // Toxicon. 2001. V. 39. P. 7-14.

7. Miller C. The charybdotoxin family of K+ channel-blocking peptides // Neuron. 1995. V. 15. P. 5-10.

8. King G. F., Gentz M. C., Escoubas P., Nicholson G. M. A rational nomenclature for naming peptide toxins from spiders and other venomous animals // Toxicon. 2008. V. 52. P. 264-276.

9. Norton R. S., Pallaghy P. K. The cystine knot structure of ion channel toxins and related polypeptides//Toxicon. 1998. V. 36. P. 1573-1583.

10. Craik D. J., Daly N. L., Waine C. The cystine knot motif in toxins and implications for drug design // Toxicon. 2001. V. 39. P. 43-60.

11. Gracy J., Le-Nguyen D., Gelly J. C., Kaas Q., Heitz A., Chiche L. KNOTTIN: the knottin or inhibitor cystine knot scaffold in 2007 // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. D314-319.

12. Bulet P., Stocklin R. Insect antimicrobial peptides: structures, properties and gene regulation // Protein Pept Lett. 2005. V. 12. P. 3-11.

13. Craik D. J., Daly N. L., Mulvenna J., Plan M. R., Trabi M. Discovery, structure and biological activities of the cyclotides // Curr Protein Pept Sci. 2004. V. 5. P. 297-315.

14. Liu Z., Dai J., Dai L., Deng M., Hu Z., Hu W., Liang S. Function and solution structure of Huwentoxin-X, a specific blocker of N-type calcium channels, from the Chinese bird spider Ornithoctonus huwena // J Biol Chem. 2006. V. 281. P. 8628-8635.

15. Bernard C., Legros C., Ferrat G., Bischoff U., Marquardt A., Pongs O., Darbon H. Solution structure of hpTX2, a toxin from Heteropoda venatoria spider that blocks Kv4.2 potassium channel //Protein Sci. 2000. V. 9. P. 2059-2067.

16. Oswald R. E., Suchyna T. M., Mcfeeters R., Gottlieb P., Sachs F. Solution structure of peptide toxins that block mechanosensitive ion channels // J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 34443-34450.

17. Shu Q., Lu S. Y., Gu X. C., Liang S. P. The structure of spider toxin huwentoxin-II with unique disulfide linkage: evidence for structural evolution // Protein Sci. 2002. V. 11. P. 245-252.

18. Pallaghy P. K., Alewood D., Alewood P. F., Norton R. S. Solution structure of robustoxin, the lethal neurotoxin from the funnel-web spider Atrax robustus // FEBS Lett. 1997. V. 419. P. 191-196.

19. Antuch W., Bemdt K. D., Chavez M. A., Delfin J., Wuthrich K. The NMR solution structure of a Kunitz-type proteinase inhibitor from the sea anemone Stichodactyla helianthus // Eur J Biochem. 1993. V. 212. P. 675-684.

20. Harvey A. L. Twenty years of dendrotoxins // Toxicon. 2001. V. 39. P. 15-26.

21. Schweitz H., Bruhn T., Guillemare E., Moinier D., Lancelin J. M., Beress L., Lazdunski M. Kalicludines and kaliseptine. Two different classes of sea anemone toxins for voltage sensitive K+ channels // J Biol Chem. 1995. V. 270. P. 25121-25126.

22. Buczek O., Bulaj G., Olivera B. M. Conotoxins and the posttranslational modification of secreted gene products // Cell Mol Life Sci. 2005. V. 62. P. 3067-3079.

23. Branton W. D., Rudnick M. S., Zhou Y., Eccleston E. D., Fields G. B., Bowers L. D. Fatty acylated toxin structure //Nature. 1993. V. 365. P. 496-497.

24. Sollod B. L., Wilson D., Zhaxybayeva O., Gogarten J. P., Drinkwater R, King G. F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries? // Peptides. 2005. V. 26. P. 131-139.

25. Jiang L., Peng L., Chen J., Zhang Y., Xiong X., Liang S. Molecular diversification based on analysis of expressed sequence tags from the venom glands of the Chinese bird spider Omithoctonus huwena//Toxicon. 2008. V. 51. P. 1479-1489.

26. Yuan D. D., Han Y. H., Wang C. G., Chi C. W. From the identification of gene organization of alpha conotoxins to the cloning of novel toxins // Toxicon. 2007. V. 49. P. 1135-1149.

27. Froy O., Sagiv Т., Poreh M., Urbach D., Zilberberg N., Gurevitz M. Dynamic diversification from a putative common ancestor of scorpion toxins affecting sodium, potassium, and chloride channels // J Mol Evol. 1999. V. 48. P. 187-196.

28. Chen J., Deng M., He Q., Meng E., Jiang L., Liao Z., Rong M., Liang S. Molecular diversity and evolution of cystine knot toxins of the tarantula Chilobrachys jingzhao // Cell Mol Life Sci. 2008. V. 65. P. 2431-2444.

29. Jiang L., Chen J., Peng L., Zhang Y., Xiong X., Liang S. Genomic organization and cloning of novel genes encoding toxin-like peptides of three superfamilies from the spider Orinithoctonus huvvena// Peptides. 2008. V. 29. P. 1679-1684.

30. Qiao P., Zuo X. P., Chai Z. F., Ji Y. H. The cDNA and genomic DNA organization of a novel toxin SHT-I from spider Ornithoctonus huwena // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2004. V. 36. P. 656-660.

31. Данилевич В. H., Лукьянов С. А., Гришин Е. В. Клонирование и структура гена, кодирующего а-латрокрустотоксин в составе ядовитых желез паука каракурта // Биоорган химия. 1999. Т. 25. С. 537-547.

32. Данилевич В. Н., Гришин Е. В. Хромосомные гены нейротоксинов паука каракурта не содержат инронов // Биоорган химия. 2000. Т. 26. С. 933-939.

33. Krapcho К. J., Krai R. М., Jr., Vanwagenen В. С., Eppler К. G., Morgan Т. К. Characterization and cloning of insecticidal peptides from the primitive weaving spider Diguetia canities // Insect Biochem Mol Biol. 1995. V. 25. P. 991-1000.

34. Binford G. J., Cordes M. H., Wells M. A. Sphingomyelinase D from venoms of Loxosceles spiders: evolutionary insights from cDNA sequences and gene structure // Toxicon. 2005. V. 45. P. 547-560.

35. Coetzee W. A., Amarillo Y., Chiu J., Chow A., Lau D., Mccormack Т., Moreno H., Nadal M. S., Ozaita A., Pountney D., Saganich M., Vega-Saenz De Miera E., Rudy B. Molecular diversity of K+ channels // Ann NY Acad Sci. 1999. V. 868. P. 233-285.

36. Latorre R., Oberhauser A., Labarca P., Alvarez O. Varieties of calcium-activated potassium channels // Annu Rev Physiol. 1989. V. 51. P. 385-399.

37. Rudy B. Molecular diversity of ion channels and cell function // Ann NY Acad Sci. 1999. V. 868. P. 1-12.

38. Vergara C., Latorre R., Marrion N. V., Adelman J. P. Calcium-activated potassium channels // Curr Opin Neurobiol. 1998. V. 8. P. 321-329.

39. Swartz K. J., Mackinnon R. An inhibitor of the Kv2.1 potassium channel isolated from the venom of a Chilean tarantula // Neuron. 1995. V. 15. P. 941-949.

40. Takahashi H., Kim J. I., Min H. J., Sato K., Swartz K. J., Shimada I. Solution structure of hanatoxinl, a gating modifier of voltage-dependent K(+) channels: common surface features of gating modifier toxins // J Mol Biol. 2000. V. 297. P. 771-780.

41. Swartz K. J., Mackinnon R. Hanatoxin modifies the gating of a voltage-dependent K+ channel through multiple binding sites //Neuron. 1997. V. 18. P. 665-673.

42. Swartz K. J., Mackinnon R. Mapping the receptor site for hanatoxin, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels // Neuron. 1997. V. 18. P. 675-682.

43. Li-Smerin Y., Swartz K. J. Localization and molecular determinants of the Hanatoxin receptors on the voltage-sensing domains of a K(+) channel // J Gen Physiol. 2000. V. 115. P. 673-684.

44. Li-Smerin Y., Swartz K. J. Gating modifier toxins reveal a conserved structural motif in voltage-gated Ca2+ and K+ channels // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V. 95. P. 8585-8589.

45. Sanguinetti M. C., Johnson J. H., Hammerland L. G., Kelbaugh P. R., Volkmann R. A., Saccomano N. A., Mueller A. L. Heteropodatoxins: peptides isolated from spider venom that block Kv4.2 potassium channels // Mol Pharmacol. 1997. V. 51. P. 491-498.

46. Diochot S., Drici M. D., Moinier D., Fink M., Lazdunski M. Effects of phrixotoxins on the Kv4 family of potassium channels and implications for the role of Itol in cardiac electrogenesis // Br J Pharmacol. 1999. V. 126. P. 251-263.

47. Corzo G., Escoubas P. Pharmacologically active spider peptide toxins // Cell Mol Life Sci. 2003. V. 60. P. 2409-2426.

48. Marvin L., De E., Cosette P., Gagnon J., Molle G., Lange C. Isolation, amino acid sequence and functional assays of SGTxl. The first toxin purified from the venom of the spider scodra griseipes // Eur J Biochem. 1999. V. 265. P. 572-579.

49. Ebbinghaus J., Legros C., Nolting A., Guette C., Celerier M. L., Pongs O., Bahring R. Modulation of Kv4.2 channels by a peptide isolated from the venom of the giant bird-eating tarantula Theraphosa leblondi // Toxicon. 2004. V. 43. P. 923-932.

50. Ruta V., Jiang Y., Lee A., Chen J., Mackinnon R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel //Nature. 2003. V. 422. P. 180-185.

51. Ruta V., Mackinnon R. Localization of the voltage-sensor toxin receptor on KvAP // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 10071-10079.

52. Liao Z., Yuan C., Deng M., Li J., Chen J., Yang Y., Hu W., Liang S. Solution structure and functional characterization of jingzhaotoxin-XI: a novel gating modifier of both potassium and sodium channels // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 15591-15600.

53. Yuan C., Liao Z., Zeng X., Dai L., Kuang F., Liang S. Jingzhaotoxin-XII, a gating modifier specific for Kv4.1 channels // Toxicon. 2007. V. 50. P. 646-652.

54. Ertel E. A., Campbell K. P., Harpold M. M., Hofmann F., Mori Y., Perez-Reyes E., Schwartz A., Snutch T. P., Tanabe T., Birnbaumer L., Tsien R. W., Catterall W. A. Nomenclature of voltage-gated calcium channels //Neuron. 2000. V. 25. P. 533-535.

55. Adams M. E., Bindokas V. P., Hasegawa L., Venema V. J. Omega-agatoxins: novel calcium channel antagonists of two subtypes from funnel web spider (Agelenopsis aperta) venom // J Biol Chem. 1990. V. 265. P. 861-867.

56. Scott R. H., Dolphin A. C., Bindokas V. P., Adams M. E. Inhibition of neuronal Ca2+ channel currents by the funnel web spider toxin omega-Aga-IA // Mol Pharmacol. 1990. V. 38. P. 711-718.

57. Venema V. J., Swiderek K. M., Lee T. D., Hathaway G. M., Adams M. E. Antagonism of synaptosomal calcium channels by subtypes of omega-agatoxins // J Biol Chem. 1992. V. 267. P. 2610-2615.

58. Pocock J. M., Venema V. J., Adams M. E. Omega-agatoxins differentially block calcium channels in locust, chick and rat synaptosomes // Neurochem Int. 1992. V. 20. P. 263-270.

59. Adams M. E. Agatoxins: ion channel specific toxins from the American funnel web spider, Agelenopsis aperta // Toxicon. 2004. V. 43. P. 509-525.

60. Mintz I. M. Block of Ca channels in rat central neurons by the spider toxin omega-Aga-IIIA // J Neurosci. 1994. V. 14. P. 2844-2853.

61. Yan L., Adams M. E. The spider toxin omega-Aga IIIA defines a high affinity site on neuronal high voltage-activated calcium channels // J Biol Chem. 2000. V. 275. P. 21309-21316.

62. Olivera B. M., Miljanich G. P., Ramachandran J., Adams M. E. Calcium channel diversity and neurotransmitter release: the omega-conotoxins and omega-agatoxins // Annu Rev Biochem. 1994. V. 63. P. 823-867.

63. Mintz I. M., Venema V. J., Swiderek K. M., Lee T. D., Bean B. P., Adams M. E. P-type calcium channels blocked by the spider toxin omega-Aga-IVA // Nature. 1992. V. 355. P. 827-829.

64. Sidach S. S., Mintz I. M. Low-affinity blockade of neuronal N-type Ca channels by the spider toxin omega-agatoxin-IVA // J Neurosci. 2000. V. 20. P. 7174-7182.

65. Sather W. A., Tanabe T., Zhang J. F., Tsien R. W. Biophysical and pharmacological characterization of a class A calcium channel // Ann NY Acad Sci. 1994. V. 747. P. 294-301.

66. Leao R. M., Cruz J. S., Diniz C. R., Cordeiro M. N., Beirao P. S. Inhibition of neuronal high-voltage activated calcium channels by the omega-phoneutria nigriventer Tx3-3 peptide toxin//Neuropharmacology. 2000. V. 39. P. 1756-1767.

67. Bourinet E., Stotz S. C., Spaetgens R. L., Dayanithi G., Lemos J., Nargeot J., Zamponi G. W. Interaction of SNX482 with domains III and IV inhibits activation gating of alpha(lE) (Ca(V)2.3) calcium channels // Biophys J. 2001. V. 81. P. 79-88.

68. Arroyo G., Aldea M., Fuentealba J., Albillos A., Garcia A. G. SNX482 selectively blocks P/Q Ca2+ channels and delays the inactivation of Na+ channels of chromaffin cells // Eur J Pharmacol. 2003. V. 475. P. 11-18.

69. Newcomb R., Palma A., Fox J., Gaur S., Lau K., Chung D., Cong R., Bell J. R., Home B., Nadasdi L., Et Al. SNX-325, a novel calcium antagonist from the spider Segestria florentina//Biochemistry. 1995. V. 34. P. 8341-8347.

70. Peng K., Chen X. D., Liang S. P. The effect of Huwentoxin-I on Ca(2+) channels in differentiated NG108-15 cells, a patch-clamp study // Toxicon. 2001. V. 39. P. 491-498.

71. Wang M., Guan X., Liang S. The cross channel activities of spider neurotoxin huwentoxin-I on rat dorsal root ganglion neurons // Biochem Biophys Res Commun. 2007. V. 357. P. 579-583.

72. Pluzhnikov K., Vassilevski A., Korolkova Y., Fisyunov A., Iegorova O., Krishtal O., Grishin E. omega-Lsp-IA, a novel modulator of P-type Ca2+ channels // Toxicon. 2007. V. 50. P. 993-1004.

73. Sutton K. G., Siok C., Stea A., Zamponi G. W., Heck S. D., Volkmann R. A., Ahlijanian M. K., Snutch T. P. Inhibition of neuronal calcium channels by a novel peptide spider toxin, DW13.3 // Mol Pharmacol. 1998. V. 54. P. 407-418.

74. Bloomquist J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects // Invert Neurosci. 2003. V. 5. P. 45-50.

75. Villegas E., Adachi-Akahane S., Bosnians F., Tytgat J., Nakajima T., Corzo G. Biochemical characterization of cysteine-rich peptides from Oxyopes sp. venom that block calcium ion channels // Toxicon. 2008. V. 52. P. 228-236.

76. Catterall W. A., Goldin A. L., Waxman S. G. International Union of Pharmacology. XLVII. Nomenclature and structure-function relationships of voltage-gated sodium channels // Pharmacol Rev. 2005. V. 57. P. 397-409.

77. Catterall W. A., Cestele S., Yarov-Yarovoy V., Yu F. H., Konoki K., Scheuer T. Voltage-gated ion channels and gating modifier toxins // Toxicon. 2007. V. 49. P. 124-141.

78. Nicholson G. M., Willow M., Howden M. E., Narahashi T. Modification of sodium channel gating and kinetics by versutoxin from the Australian funnel-web spider Hadronyche versuta// Pflugers Arch. 1994. V. 428. P. 400-409.

79. Nicholson G. M., Little M. J., Birinyi-Strachan L. C. Structure and function of delta-atracotoxins: lethal neurotoxins targeting the voltage-gated sodium channel // Toxicon. 2004. V. 43. P. 587-599.

80. Bloomquist J. R., Kinne L. P., Deutsch V., Simpson S. F. Mode of action of an insecticidal peptide toxin from the venom of a weaving spider (Diguetia canities) // Toxicon. 1996. V. 34. P. 1072-1075.

81. Peng K., Shu Q., Liu Z., Liang S. Function and solution structure of huwentoxin-IY, a potent neuronal tetrodotoxin (TTX)-sensitive sodium channel antagonist from Chinese bird spider Selenocosmia huwena// J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 47564-47571.

82. Xiao Y. C., Liang S. P. Purification and characterization of Hainantoxin-V, a tetrodotoxin-sensitive sodium channel inhibitor from the venom of the spider Selenocosmia hainana // Toxicon. 2003. V. 41. P. 643-650.

83. Xiao Y., Liang S. Inhibition of neuronal tetrodotoxin-sensitive Na+ channels by two spider toxins: hainantoxin-III and hainantoxin-IV // Eur J Pharmacol. 2003. V. 477. P. 1-7.

84. Li D., Xiao Y., Hu W., Xie J., Bosnians F., Tytgat J., Liang S. Function and solution structure of hainantoxin-I, a novel insect sodium channel inhibitor from the Chinese bird spider Selenocosmia hainana//FEBS Lett. 2003. V. 555. P. 616-622.

85. Bosmans F., Rash L., Zhu S., Diochot S., Lazdunski M., Escoubas P., Tytgat J. Four novel tarantula toxins as selective modulators of voltage-gated sodium channel subtypes // Mol Pharmacol. 2006. V. 69. P. 419-429.

86. Clement H., Odell G., Zamudio F. Z., Redaelli E., Wanke E., Alagon A., Possani L. D. Isolation and characterization of a novel toxin from the venom of the spider Grammostola rosea that blocks sodium channels // Toxicon. 2007. V. 50. P. 65-74.

87. Xiao Y., Tang J., Hu W., Xie J., Maertens C., Tytgat J., Liang S. Jingzhaotoxin-I, a novel spider neurotoxin preferentially inhibiting cardiac sodium channel inactivation // J Biol Chem. 2005. V. 280. P. 12069-12076.

88. Xiao Y., Li J., Deng M., Dai C., Liang S. Characterization of the excitatory mechanism induced by Jingzhaotoxin-I inhibiting sodium channel inactivation // Toxicon. 2007. V. 50. P. 507-517.

89. Xiao Y., Tang J., Yang Y., Wang M., Hu W., Xie J., Zeng X., Liang S. Jingzhaotoxin-III, a novel spider toxin inhibiting activation of voltage-gated sodium channel in rat cardiac myocytes // J Biol Chem. 2004. V. 279. P. 26220-26226.

90. Liao Z., Yuan C., Peng K., Xiao Y., Liang S. Solution structure of Jingzhaotoxin-III, a peptide toxin inhibiting both Navl.5 and Kv2.1 channels // Toxicon. 2007. V. 50. P. 135-143.

91. Wang M., Diao J., Li J., Tang J., Lin Y., Hu W., Zhang Y., Xiao Y., Liang S. JZTX-IV, a unique acidic sodium channel toxin isolated from the spider Chilobrachys jingzhao // Toxicon. 2008. V. 52. P. 871-880.

92. Zeng X., Deng M., Lin Y., Yuan C., Pi J., Liang S. Isolation and characterization of Jingzhaotoxin-V, a novel neurotoxin from the venom of the spider Chilobrachys jingzhao // Toxicon. 2007. Y. 49. P. 388-399.

93. Deng M., Kuang F., Sun Z., Tao H., Cai Т., Zhong L., Chen Z., Xiao Y., Liang S. Jingzhaotoxin-IX, a novel gating modifier of both sodium and potassium channels from Chinese tarantula Chilobrachys jingzhao // Neuropharmacology. 2009. V. 57. P. 77-87.

94. Smith J. J., Cummins T. R., Alphy S., Blumenthal К. M. Molecular interactions of the gating modifier toxin ProTx-II with NaV 1.5: implied existence of a novel toxin binding site coupled to activation // J Biol Chem. 2007. V. 282. P. 12687-12697.

95. Reis H. J., Gomez M. V., Kalapothakis E., Diniz C. R., Cordeiro M. N., Prado M. A., Romano-Silva M. A. Inhibition of glutamate uptake by Tx3-4 is dependent on the redox state of cysteine residues // Neuroreport. 2000. V. 11. P. 2191-2194.

96. Escoubas P., De Weille J. R., Lecoq A., Diochot S., Waldmann R., Champigny G., Moinier D., Menez A., Lazdunski M. Isolation of a tarantula toxin specific for a class of proton-gated Na+ channels // J Biol Chem. 2000. Y. 275. P. 25116-25121.

97. Патент US5877026 Analgesic peptides from venom of Grammostola spatulata and use thereof / Lampe R. А.; Опубл. 1999.

98. Siemens J., Zhou S., Piskorowski R., Nikai T., Lumpkin E. A., Basbaum A. I., King D., Julius D. Spider toxins activate the capsaicin receptor to produce inflammatory pain // Nature. 2006. V. 444. P. 208-212.

99. Bohlen C. J., Priel A., Zhou S., King D., Siemens J., Julius D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain // Cell. 2010. V. 141. P. 834-845.

100. Yuan C. H., He Q. Y., Peng K., Diao J. B., Jiang L. P., Tang X., Liang S. P. Discovery of a distinct superfamily of Kunitz-type toxin (KTT) from tarantulas // PLoS One. 2008. V. 3. P. e3414.

101. Liang S. P., Pan X. A lectin-like peptide isolated from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena // Toxicon. 1995. V. 33. P. 875-882.

102. Lu S., Liang S., Gu X. Three-dimensional structure of Selenocosmia huwena lectin-I (SHL-I) from the venom of the spider Selenocosmia huwena by 2D-NMR // J Protein Chem. 1999. V. 18. P. 609-617.

103. Pimentel C., Choi S. J., Chagot B., Guette C., Camadro J. M., Darbon H. Solution structure of PcFKl, a spider peptide active against Plasmodium falciparum // Protein Sci. 2006. V. 15. P. 628-634.

104. Yan L., Adams M. E. Lycotoxins, antimicrobial peptides from venom of the wolf spider Lycosa carolinensis // J Biol Chem. 1998. V. 273. P. 2059-2066.

105. Kuhn-Nentwig L., Muller J., Schaller J., Walz A., Dathe M., Nentwig W. Cupiennin 1, a new family of highly basic antimicrobial peptides in the venom of the spider Cupiennius salei (Ctenidae) // J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 11208-11216.

106. Liang S. Proteome and peptidome profiling of spider venoms // Expert Rev Proteomics. 2008. V.5.P. 731-746.

107. Escoubas P., Quinton L., Nicholson G. M. Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry // J Mass Spectrom. 2008. V. 43. P. 279-295.

108. Escoubas P., Sollod B., King G. F. Venom landscapes: mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach // Toxicon. 2006. V. 47. P. 650-663.

109. Yuan C., Jin Q., Tang X., Hu W., Cao R., Yang S., Xiong J., Xie C., Xie J., Liang S. Proteomic and peptidomic characterization of the venom from the Chinese bird spider, Ornithoctonus huwena Wang // J Proteome Res. 2007. V. 6. P. 2792-2801.

110. Liao Z., Cao J., Li S., Yan X., Hu W., He Q., Chen J., Tang J., Xie J., Liang S. Proteomic and peptidomic analysis of the venom from Chinese tarantula Chilobrachys jingzhao //Proteomics. 2007. V. 7. P. 1892-1907.

111. Legros C., Celerier M. L., Henry M., Guette C. Nanospray analysis of the venom of the tarantula Theraphosa leblondi: a powerful method for direct venom mass fingerprinting and toxin sequencing // Rapid Commun Mass Spectrom. 2004. V. 18. P. 1024-1032.

112. Zhang Y., Chen J., Tang X., Wang F., Jiang L., Xiong X., Wang M., Rong M., Liu Z., Liang S. Transcriptome analysis of the venom glands of the Chinese wolf spider Lycosa singoriensis //Zoology (Jena). 2010. V. 113. P. 10-18.

113. The National Center for Biotechnology Information, Protein database Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein.

114. Sabourault С., Ganot P., Deleury E., Allemand D., Furla P. Comprehensive EST analysis of the symbiotic sea anemone, Anemonia viridis // BMC Genomics. 2009. V. 10. P. 333.

115. The National Center for Biotechnology Information, EST database Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest.

116. SignalP 3.0 server Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP.

117. Basic Local Alignment Search Tool Электронный ресурс. Режим доступа: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.

118. Thomsen J., Bayne S. J. Microsomal alkylation with 4-vinylpyridine // J Protein Chem. 1988. V. 7. P. 295-296.

119. Dixon M. The determination of enzyme inhibitor constants // Biochem J. 1953. V. 55. P. 170-171.

120. Otvos L., Cudic M. Broth microdilution antibacterial assay of peptides // Methods Mol Biol. 2007. Y. 386. P. 309-320.

121. Wiegand I., Hilpert K., Hancock R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances // Nat Protoc. 2008. , V. 3.P. 163-175.

122. Julius D., Brake A., Blair L., Kunisawa R., Thorner J. Isolation of the putative structural gene for the lysine-arginine-cleaving endopeptidase required for processing of yeast prepro-alpha-factor // Cell. 1984. V. 37. P. 1075-1089.

123. Van De Ven W. J., Roebroek A. J., Van Duijnhoven H. L. Structure and function of eukaryotic proprotein processing enzymes of the subtilisin family of serine proteases // CritRev Oncog. 1993. V. 4. P. 115-136.

124. Rehfeld J. F., Goetze J. P. The posttranslational phase of gene expression: new possibilities in molecular diagnosis // Curr Mol Med. 2003. V. 3. P. 25-38.

125. Gomord V., Faye L. Posttranslational modification of therapeutic proteins in plants // Curr Opin Plant Biol. 2004. V. 7. P. 171-181.

126. Routtenberg A., Rekart J. L. Post-translational protein modification as the substrate for long-lasting memory // Trends Neurosci. 2005. V. 28. P. 12-19.

127. Xin X., Varlamov O., Day R., Dong W., Bridgett M. M., Leiter E. H., Fricker L. D. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding rat carboxypeptidase D // DNA Cell Biol. 1997. V. 16. P. 897-909.

128. Fricker L. D. Carboxypeptidase E // Annu Rev Physiol. 1988. V. 50. P. 309-321.

129. Mentlein R. Dipeptidyl-peptidase IV (CD26)-role in the inactivation of regulatory peptides // Regul Pept. 1999. V. 85. P. 9-24.

130. Eipper B. A., Stoffers D. A., Mains R. E. The biosynthesis of neuropeptides: peptide alpha-amidation//Annu Rev Neurosci. 1992. V. 15. P. 57-85.

131. Prigge S. T., Mains R. E., Eipper B. A., Amzel L. M. New insights into copper monooxygenases and peptide amidation: structure, mechanism and function // Cell Mol Life Sci. 2000. V. 57. P. 1236-1259.

132. Satani M., Takahashi K., Sakamoto H., Harada S., Kaida Y., Noguchi M. Expression and characterization of human bifunctional peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase // Protein Expr Purif. 2003. V. 28. P. 293-302.

133. Fuller R. S., Brake A. J., Thorner J. Intracellular targeting and structural conservation of a prohormone-processing endoprotease // Science. 1989. V. 246. P. 482-486.

134. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain // Biochem Biophys Res Commun. 1967. V. 27. P. 157-162.

135. Matthews D. J., Goodman L. J., Gorman C. M., Wells J. A. A survey of furin substrate specificity using substrate phage display // Protein Sci. 1994. V. 3. P. 1197-1205.

136. Lindberg I., Hutton J. C. Peptide processing proteinases with selectivity for paired basic residues. // Peptide Biosynthesis and Processing / Eds. Fricker L. D. Boca Raton, FL: CRC Press, 1991. P. 141-174.

137. Lipkind G., Gong Q., Steiner D. F. Molecular modeling of the substrate specificity of prohormone convertases SPC2 and SPC3 // J Biol Chem. 1995. V. 270. P. 13277-13284.

138. Nakayama K. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins // Biochem J. 1997. V. 327. P. 625-635.

139. Molloy S. S., Anderson E. D., Jean F., Thomas G. Bi-cycling the furin pathway: from TGN localization to pathogen activation and embryogenesis // Trends Cell Biol. 1999. V. 9. P. 28-35.

140. Klimpel K. R., Molloy S. S., Thomas G., Leppla S. H. Anthrax toxin protective antigen is activated by a cell surface protease with the sequence specificity and catalytic properties of furin // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89. P. 10277-10281.

141. Cheng D., Espenshade P. J., Slaughter C. A., Jaen J. C., Brown M. S., Goldstein J. L. Secreted site-1 protease cleaves peptides corresponding to luminal loop of sterol regulatory element-binding proteins // J Biol Chem. 1999. V. 274. P. 22805-22812.

142. Hara-Nishimura I., Takeuchi Y. , Nishimura M. Molecular characterization of a vacuolar processing enzyme related to a putative cysteine proteinase of Schistosoma mansoni // Plant Cell. 1993. V. 5. P. 1651-1659.

143. Janzik I., Macheroux P., Amrhein N., Schaller A. LeSBTl, a subtilase from tomato plants. Overexpression in insect cells, purification, and characterization // J Biol Chem. 2000. V. 275. P. 5193-5199.

144. Boyd P. M., Barnaby N., Tan-Wilson A., Wilson K. A. Cleavage specificity of the subtilisin-like protease CI from soybean // Biochim Biophys Acta. 2002. V. 1596. P. 269-282.

145. Coffeen W. C., Wolpert T. J. Purification and characterization of serine proteases that exhibit caspase-like activity and are associated with programmed cell death in Avena sativa//Plant Cell. 2004. V. 16. P. 857-873.

146. Christie A. E. In silico analyses of peptide paracrines/hormones in Aphidoidea // Gen Comp Endocrinol. 2008. V. 159. P. 67-79.

147. Sunagawa S., Desalvo M. K., Yoolstra C. R., Reyes-Bermudez A., Medina M. Identification and gene expression analysis of a taxonomically restricted cysteine-rich protein family in reef-building corals // PLoS One. 2009. V. 4. P. e4865.

148. Wigger E., Kuhn-Nentwig L., Nentwig W. The venom optimisation hypothesis: a spider injects large venom quantities only into difficult prey types // Toxicon. 2002. V. 40. P. 749-752.

149. Malli H., Kuhn-Nentwig L., Imboden H., Nentwig W. Effects of size, motility and paralysation time of prey on the quantity of venom injected by the hunting spider Cupiennius salei // J Exp Biol. 1999. V. 202. P. 2083-2089.

150. Boeve J. L., Kuhn-Nentwig L., Keller S., Nentwig W. Quantity and quality of venom released by a spider (Cupiennius salei, Ctenidae) // Toxicon. 1995. V. 33. P. 1347-1357.

151. Qu Y., Liang S., Ding J., Liu X., Zhang R., Gu X. Proton nuclear magnetic resonance studies on huwentoxin-I from the venom of the spider Selenocosmia huwena: 2. Three-dimensional structure in solution// J Protein Chem. 1997. V. 16. P. 565-574.

152. Omecinsky D. O., Holub K. E., Adams M. E., Reily M. D. Three-dimensional structure analysis of mu-agatoxins: further evidence for common motifs among neurotoxins with diverse ion channel specificities // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 2836-2844.

153. Inui T., Hagiwara K., Nakajima K., Kimura T., Nakajima T., Sakakibara S. Synthesis and disulfide structure determination of agelenin: identification of the carboxy-terminus as an amide form // Pept Res. 1992. V. 5. P. 140-144.

154. Parkinson J., Blaxter M. Expressed sequence tags: an overview // Methods Mol Biol. 2009. V. 533. P. 1-12.

155. Quevillon E., Silventoinen V., Pillai S., Harte N., Mulder N., Apweiler R., Lopez R. InterProScan: protein domains identifier // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 116-120.

156. Manoleras N., Norton R. S. Three-dimensional structure in solution of neurotoxin III from the sea anemone Anemonia sulcata// Biochemistry. 1994. V. 33. P. 11051-11061.

157. Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. V. 40. P. 111-124.

158. Elliott R. С., Konya R. S., Vickneshwara К. The isolation of a toxin from the dahlia sea anemone, Tealia felina L // Toxicon. 1986. V. 24. P. 117-122.

159. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj В., Macek P., Gubensek F. Cloning, sequencing, and expression of equinatoxin II // Biochem Biophys Res Commun. 1996. V. 220. P. 437-442.

160. Ильина А. П., Монастырная M. M., Исаева М. П., Гузев К. В., Рассказов В. А., Козловская Э. П. Первичная структура актинопоринов актинии Oulactis orientalis // Биоорг химия. 2005. Т. 31. С. 357-362.

161. Cline Е. I., Wiebe L. I., Young J. D., Samuel J. Toxic effects of the novel protein Upl from the sea anemone Urticina piscivora // Pharmacol Res. 1995. V. 32. P. 309-314.

162. Grotendorst G. R., Hessinger D. A. Purification and partial characterization of the phospholipase A2 and co-lytic factor from sea anemone (Aiptasia pallida) nematocyst venom//Toxicon. 1999. V. 37. P. 1779-1796.

163. Монастырная M. M., Козловская Э. П., Иванов А. С., Мольнар А. А., Халилов Э. М., Еляков Г. Б. Действие метридиолизина из морской анемоны Metridium senile на биологические и модельные мембраны // Биол мембраны. 1988. Т. 5. С. 830-835.

164. Diochot S., Schweitz Н., Beress L., Lazdunski M. Sea anemone peptides with a specific blocking activity against the fast inactivating potassium channel Kv3.4 // J Biol Chem.1998. V. 273. P. 6744-6749.

165. Alsen C. Biological significance of peptides from Anemonia sulcata // Fed Proc. 1983. V. 42. P. 101-108.

166. Wunderer G., Machleidt W., Fritz H. The broad-specificity proteinase inhibitor 5 II from the sea anemone Anemonia sulcata // Methods Enzymol. 1981. V. 80. P. 816-820.

167. Wang H. X., Ng Т. B. Concurrent isolation of a Kunitz-type trypsin inhibitor with antifungal activity and a novel lectin from Pseudostellaria heterophylla roots // Biochem Biophys Res Commun. 2006. V. 342. P. 349-353.

168. Beress L., Wunderer G., Wachter E. Amino acid sequence of toxin III from Anemonia sulcata//Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1977. V. 358. P. 985-988.

169. Moran Y., Weinberger H., Lazarus N., Gur M., Kahn R., Gordon D., Gurevitz M. Fusion and retrotransposition events in the evolution of the sea anemone Anemonia viridis neurotoxin genes // J Mol Evol. 2009. V. 69. P. 115-124.

170. Shiomi K., Honma Т., Ide M., Nagashima Y., Ishida M., Chino M. An epidermal growth factor-like toxin and two sodium channel toxins from the sea anemone Stichodactyla gigantea // Toxicon. 2003. V. 41. P. 229-236.

171. Honma Т., Hasegawa Y., Ishida M., Nagai H., Nagashima Y., Shiomi K. Isolation and molecular cloning of novel peptide toxins from the sea anemone Antheopsis maculata // Toxicon. 2005. V. 45. P. 33-41.

172. Darmer D., Hauser F., Nothacker H. P., Bosch Т. C., Williamson M., Grimmelikhuijzen C. J. Three different prohormones yield a variety of Hydra-RFamide (Arg-Phe-NH2) neuropeptides in Hydra magnipapillata// Biochem J. 1998. V. 332. P. 403-412.

173. Gajewski M., Leitz Т., SchloBherr J., Plickert G., Ehnasri H. LWamides from Cnidaria constitute a novel family of neuropeptides with morphogenetic activity // Dev Genes Evol. 1996. V. 205. P. 232-242.

174. Mcfarlane I. D., Anderson P. A., Grimmelikhuijzen C. J. Effects of three anthozoan neuropeptides, Antho-RWamide I, Antho-RWamide II and Antho-RFamide, on slow muscles from sea anemones // J Exp Biol. 1991. V. 156. P. 419-431.

175. Katsukura Y., Ando H., David C. N., Grimmelikhuijzen C. J., Sugiyama T. Control of planula migration by LWamide and RFamide neuropeptides in Hydractinia echinata // J Exp Biol. 2004. V. 207. P. 1803-1810.

176. Сагдиев, H. Ж., Валиева, JI. А., Корнеев, А. С., Садыков, А. А., Салихов, Ш. И. Изучение токсических компонентов яда погребного паука Segestria florentina // Биоорг химия. 1987. Т. 13. С. 1013-1018.

177. Shin S. Y., Kang S. W., Lee D. G., Eom S-. H., Song W. K., Kim J. I. CRAMP analogues having potent antibiotic activity against bacterial, fungal, and tumor cells without hemolytic activity // Biochem Biophys Res Commun. 2000. V. 275. P. 904-909.

178. Tossi A., Scocchi M., Skerlavaj В., Gennaro R. Identification and characterization of a primary antibacterial domain in CAP 18, a lipopolysaccharide binding protein from rabbit leukocytes // FEBS Lett. 1994. V. 339. P. 108-112.

179. Raghuraman H., Chattopadhyay A. Melittin: a membrane-active peptide with diverse functions // Biosci Rep. 2007. V. 27. P. 189-223.

180. Rajan R., Balaram P. A model for the interaction of trifluoroethanol with peptides and proteins // Int J Pept Protein Res. 1996. V. 48. P. 328-336.

181. Caterina M. J., Leffler A., Malmberg А. В., Martin W. J., Trafton J., Petersen-Zeitz K. R., Koltzenburg M., Basbaum A. I., Julius D. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor // Science. 2000. V. 288. P. 306-313.

182. Szallasi A., Cortright D. N., Blum C. A., Eid S. R. The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept // Nat Rev Drug Discov. 2007. V. 6. P. 357-372.

183. Immke D. C., Gavva N. R. The TRPY1 receptor and nociception // Semin Cell Dev Biol. 2006. V. 17. P. 582-591.

184. Garcia-Martinez C., Morenilla-Palao C., Planells-Cases R., Merino J. M., Ferrer-Montiel A. Identification of an aspartic residue in the P-loop of the vanilloid receptor that modulates pore properties // J Biol Chem. 2000. V. 275. P. 32552-32558.

185. Planells-Cases R., Aracil A., Merino J. M., Gallar J., Perez-Paya E., Belmonte C., Gonzalez-Ros J. M., Ferrer-Montiel A. V. Arginine-rich peptides are blockers of VR-1 channels with analgesic activity // FEBS Lett. 2000. V. 481. P. 131-136.

186. Kitaguchi Т., Swartz K. J. An inhibitor of TRPV1 channels isolated from funnel Web spider venom // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 15544-15549.

187. Зыкова Т. А., Винокуров JT. M., Маркова Л. Ф., Козловская Э. П., Еляков Г. Б. Аминокислотная последовательность трипсинового ингибитора IV из Radianthus macrodactylus. //Биоорг химия. 1985. Т. 11. С. 293-301.

188. Le Bars D., Gozariu M., Cadden S. W. Animal models of nociception // Pharmacol Rev. 2001. V. 53. P. 597-652.