Разработка микрометодов анализа модифицированных и некодируемых аминокислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 ВВЕДЕНИЕ.

1.2 ПРИМЕРЫ ПРИРОДНЫХ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АМИНОКИСЛОТ И ИХ ФУНКЦИЙ.

1.2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ АМИНОКИСЛОТ В БЕЛКАХ И ПЕПТИДАХ.

1.2.1. ЗНА ЧЕНИЯИ ВИДЫ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ. 18 2.2. АНАЛИЗ ФОСФОРИЛГИДРОКСИАМИНОКИСЛОТ, ПРИСУТСТВУЮЩИХ В ГИДРОЛИЗОВАННЫХ КЛЕТО ЧНЫХ ЭКСТРАКТАХ.

1.2.3. РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ И НЕФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ КОЛОНОЧНОЙХРОМА ТОРГРА ФИЕЙ

1.2.4. ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛИФОСФОСЕРИЛ-СОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ СЕЛЕКТИВНЫМ ОСАЖДЕНИЕМ.

1.2.5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТОЧЕК ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ В БЕЛКАХ.

1.2.6. АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХN-ФОСФОРИЛИРОВАННЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ.

1.3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОМОЦИСТЕИНА.

1.3.1. ГОМОЦИСТЕИН, ПРИРОДА, ПУТИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНТЕЗА И КАТАБОЛИЗМА, ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ.

1.3.2. ВОССТАНОВЛЕНИЕДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГОМОЦИСТЕИНА.

1.3.3. МЕТОДЫ, НЕ ТРЕБУЮЩИЕДЕРИВАТИЗАЦИИ СВОБОДНЫХ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП ПРИ АНАЛИЗЕ ГОМОЦИСТЕИНА.

1.3.4. МЕТОДЫ МОДИФИКАЦИИ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП ПРИ АНАЛИЗЕ ГОМОЦИСТЕИНА.

1.3.4.1. ДЕРИВАТИЗАЦИЯПРИ ФЛУОРОМЕТРИЧЕСКОМДЕТЕКТИРОВАНИИ ГОМОЦИСТЕИНА.

1.3.4.2. МОДИФИКАЦИЯ ПРИ ФОТОМЕТРИЧЕСКОМ ДЕТЕКТИРОВАНИИ ГОМОЦИСТЕИНА.

1.3.5. МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ АНАЛИЗЕ АМИНОТИОЛОВ.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 .РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ.

2.2. ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.

2.3.СИНТЕЗ ФТГ 1 -АМИНОЦИКЛОГЕКСАН-1 -КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ (ФТГ АК1. РТН ААа ФТГ 4-АМИНОТЕТРАГИДРОПИРАН-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ ГФТГ АК2, РТН АА2). ФТГ 1-АМИНОЦИКЛОГЕКСАН-Ы-ДИКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ ГФТГ АКЗ, РТН ААЗУ.

2.4.ПРИГОТОВЛЕНИЕ МОДИФИЦИРУЮЩИХ СМЕСЕЙ.

2.5.СИНТЕЗ РТН S-ЭТАНОЛЦИСТЕИНА ИЗ О-ФОСФОСЕРИНА.

2.6.СИНТЕЗ ФТГ З-МЕТИЛ-8-ЭТАНОЛЦИСТЕИНА ИЗ О-ФОСФО-ТРЕОНИНА.

2.7.СИНТЕЗ ФТГ 8-ФЕНИЛТИОКАРБАМОИЛ-5-ГИДРОКСИЛИЗИНА ИЗ 5-ГИДРОКСИЛИЗИНА.

2.8.СИНТЕЗ ФТГ О-ФОСФОТИРОЗИНА.

2.9.МОДИФИКАЦИЯ ПЕПТИДА. СОДЕРЖАЩЕГО О-ФОСФОСЕРИН.

2.10.ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ.

2.11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ГОМОЦИСТЕИНА, ЦИСТЕИНА И ГЛУТАТИОНА В ПЛАЗМЕ.

2.12.ПРИГ0Т0ВЛЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНЫХ СТАНДАРТОВ.

2.13. ХРОМАТОГРАФИЯ.

2.13.1. ОФВЭЖХРЕАКЦИОННЫХ СМЕСЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ФТГАК, ФТГ АК2ИФТГАКЗ.

2.13.2. ОФВЭЖХ РЕАКЦИОННЫХ СМЕСЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ФТГ S-ЭТАНОЛЦИСТЕИНА, ФТГ З-МЕТИЛ-Б-ЭТАНОЛЦИСТЕИНА И ФТГ О-ФОСФОТИРОЗИНА.

2.13.3. ОФВЭЖХ РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ФТГ в-ФЕНИЛТИОКАРБАМОИЛ-5-ГИДРОКСИЛИЗИНА.

2.13.4. ОФВЭЖХ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ И НЕКОДИРУЕМЫЕАМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ.

2.13.4.1. ОФВЭЖХ ФОСФОРИЛИРОВАННОГО И НЕФОСФОРИЛИРОВАИНОГО ПЕПТИДОВ.

2.13.4.2. ОФВЭЖХ РЕАКЦИОННОЙ МАССЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ S-ЭТАНОЛЦИСТЕИНИЛПЕПТИДПОСЛЕ МОДИФИКАЦИИ ОСТАТКА 0-ФОСФОСЕРИИА.

2.13.4.3. ВЫДЕЛЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ

АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ МОРСКИХ ПОЛИХЕТ МЕТОДОМ ОФВЭЖХ.

2.13.6. ОФВЭЖХАМИНОТИОЛОВ.

2.13.6.1. ОФВЭЖХ АНАЛИЗ РЕАКЦИОННОЙ МАССЫ НА ЭТАПЕ ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ И АЛКИЛИРОВАНИЯ ТИОЛОВ.

2.13.6.2. ОФВЭЖХ АНАЛИЗ АМИНОТИОЛОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ НА ЭТАПЕ ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ ПРОБОПОДГОТОВКИ.

2.13.6.3. ОФВЭЖХ АНАЛИЗ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ.

2.13.6.4. ОФВЭЖХ АНАЛИЗ ФТГАК, ОТЩЕПЛЁННЫХ ПРИ СЕКВЕНИРОВАНИИ ПЕПТИДОВ ИЛИ СИНТЕЗИРОВАННЫХ В КА ЧЕСТВЕ СТАНДАРТОВ.

2.14. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ.

2.15. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ (ВЭКЭ).

2.15.1. ВЭКЭ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ФТГАК.

2.15.2. ВЭКЭ АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ.

2.15.3. ВЭКЭ АНАЛИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ.

2.16. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПЕПТИДОВ.

2.17. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АМИНОТИОЛОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. АНАЛИЗ НЕКОДИРУЕМЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДАХ.

3.2. АНАЛИЗ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ.

3.3. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОРСКИХ ПОЛИХЕТ.

3.3. АНАЛИЗ ГОМОЦИСТЕИНА И ДРУГИХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ.

3.4. АНАЛИЗ ГОМОЦИСТЕИНА И ДРУГИХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ МЕТОДОМ ВЭКЭ.

4.ВЫВОД Ы.

Определение аминокислотного состава и аминокислотной последовательности пептидов и белков являются необходимыми стадиями структурно-функциональных исследований. Первичная структура в значительной мере определяет физиологическую активность и физико-химические свойства пептидов и белков. Свободные аминокислоты, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение, изменение их концентраций часто является маркером метаболических нарушений. Помимо двадцати «обычных» белковых аминокислот, существует множество соединений этого класса, отличающихся от «обычных» аминокислот структурой радикала боковой цепи, либо пространственной конфигурацией, либо способом включения в полипептидный остов. В основном, модифицированные аминокислоты являются продуктами либо посттрансляционных модификаций аминокислотных остатков в составе пептидов и белков, кодируемых геномами организмов, либо метаболических ферментативных превращений, в том числе, из свободных природных «обычных» аминокислот. Посттрансляционная модификация аминокислотных остатков пептидов и белков - важное явление, встречающееся в различных живых организмах - от вирусов до млекопитающих. Другой тип «необычных» аминокислот - некодируемые аминокислоты, - синтетические аналоги, не встречающиеся ни в природных пептидах и белках, ни в свободном виде. Синтетические пептиды, содержащие такие аминокислоты, представляют большой интерес как аналоги биологически активных природных пептидов с изменёнными свойствами, необходимые для исследования механизмов ферментативных реакций и межклеточных взаимодействий. До сих пор идентификация модифицированных и некодируемых аминокислот остаётся одним из наиболее сложных этапов структурных исследований. Условия реакций, используемые в классических методах аминокислотного анализа и пептидно-белкового секвениро-вания могут изменять или разрушать ковалентно модифицированные остатки, либо являются недостаточно чувствительными и селективными для идентификации упомянутых аминокислот, присутствующих в природных источниках в низких концентрациях. Кроме того, идентификация свободных аминокислот и аминокислотных остатков пептидов обычно основана на известных хроматографических подвижно-стях двадцати генетически кодируемых аминокислот, и «необычные» аминокислоты могут быть не узнаны или утеряны. Таким образом, в настоящее время существует проблема высокочувствительного надёжного определения некодируемых и модифицированных аминокислот в свободном виде и в составе пептидов и белков для решения как структурных задач, так и для клинико-диагностических целей.

Эта работа посвящена разработке комплекса инструментальных высокочувствительных методов идентификации и анализа различных некодируемых и модифицированных (фосфорилированных, гидроксилированных) аминокислот как в природных и синтетических пептидах, так и в свободном виде (гомоцистеина) в плазме крови.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 ВВЕДЕНИЕ.

Литературный обзор посвящен анализу природных модифицированных аминокислот и состоит из трёх частей. В первой главе обзора кратко перечислены примеры структурного и функционального разнообразия модифицированных аминокислот в природе. В следующих главах рассмотрены публикации, посвященные тематике и объектам данной диссертационной работы. Во второй главе описываются метаболическая важность процессов фосфорилирования и методы анализа фосфо-рилированных аминокислотных остатков в пептидах и белках. В третьей главе рассматриваются функциональное значение гомоцистеина в организме человека, маркера многих метаболических патологий, модифицированной аминокислоты и методы его определения в плазме крови и других физиологических жидкостях.

4.ВЫВОДЫ.

1. Синтезированы, выделены и охарактеризованы методами ВЭЖХ, ВЭКЭ, МС устойчивые фенилтиогидантоиновые производные 1-аминоциклогексан-1-карбоновой кислоты, 4-аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты, 1-аминоциклогексан-1,4-дикарбоновой кислоты, О-фосфосерина, О-фосфотреонина, О-фосфотирозина и 8-гидроксилизина.

2. Разработана методика однозначной идентификации некодируемых и модифицированных аминокислотных остатков в синтетических и природных пептидах в виде фенилтиогидантоиновых производных с использованием комплекса инструментальных микрометодов анализа, включающего высокоэффективную жидкостную хроматографию, высокоэффективный капиллярный электрофорез, масс-спектрометрию, автоматическое газофазное секвениро-вание. С помощью синтезированных производных в пептидных образцах были определены аминокислотные остатки 1-аминоциклогексан-1-карбоновой кислоты, 4-аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты и фосфосерина. Показана возможность применения комплекса инструментальных микрометодов для идентификации необычных аминокислотных остатков с радикалами различной природы в пептидах и белках.

3. Разработан метод достоверного определения О-фосфосерина в аминокислотной последовательности на микроуровне с применением комплекса аналитических методов (микро-ВЭЖХ, капиллярного электрофореза, масс-спектрометрии), позволяющий исключить использование радиоактивного

32р

4. Впервые обнаружены, выделены и охарактеризованы хроматографически, масс-спектрометрически и методом автоматического секвенирования пептиды морских полихет, проявляющие активности по отношению к ДНК- и РНК- полимеразам. Исходя из полученных данных, выдвинуто предположение о наличии в одном из выделенных пептидов остатка модифицированной аминокислоты тетрадегидропролина (пиррол-2-карбоновой кислоты).

Разработаны простые методики скоростного, селективного и надёжного анализа общего содержания гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови обращённо-фазовой хроматографией и капиллярным электрофорезом для применения в клинической диагностике кардиососудистых, нейродегенеративных и других ненаследственных и наследственных нарушений метаболизма.

1. W.E.Cohn, Nomenclature of a-amino acids, Methods in Enzymology, 106 (Post-translational modifications), (1984) 3-17.

2. E.J.Miller, S.Gay, Collagen: an overview, Methods in Enzymology, v.82, (1982) 3-33.

3. A.M.Heacock, E.Adams, Hydroxy-L-proline as a substrate for hog kidney D-amino acid oxidase, Biochem Biophys Res Commun., 57(1) (1974) 279-285

4. T.Nakajima, B.E.Volcani, 3,4-dihydroxyproline: a new amino acid in diatom cell walls. Science, 164(886), 56 (1969). 1641400-1641401.

5. E.Katz, K.T.Mason, A.B.Mauger, 3-hydroxy-5-methylproline, a new amino acid identified as a component of actinomycin Zl, BBRC, 63(2) (1975) 502-508.

6. A.Gardemann, G.F.Domagk, The occurrence of gamma-carboxyglutamate in a protein isolated from ox liver mitochondria, Archives of Biochem. and Biophys. 220(2), 347353 (1983).

7. P.V.Hauschka, in Calcium Binding Proteins and Calcium Funktion, (H.R.Wasserman, et. al., eds.), (1977), North-Holland, New York, 338-347.

8. K.Weber, Measurement of molecular weights by electrophoresis on SDS-acrylamide gel, in Methods in Enzymology (C.H.W.Hirs, eds.), 26, 3-27, (1972) Academic Press, New York.

9. C.K.Kenneth, Clin. Chem. 24/8, (1978) 1373-1380.

10. M.Orlowski, S.Wilk, Metabolism of gamma-glutamyl amino acids and peptides in mouse liver and kidney in vivo, Eur J Biochem., 71(2), (1976) 549-555.

11. S.Wilk, H.Mizoguchi, M.Orlowski, Gamma-Glutamyl dopa: a kidney-specific dopamine precursor, J Pharmacol Exp Ther., 206(1), (1978) 227-232.

12. H.R.Crumpler, Nature (London) 167, 307,(1951).

13. R.Predel, W.Brandt, R.Kellner, J.Rapus, R.J.Nachman, G.Gade, Post-translational modifications of the insect sulfakinins: sulfation, pyroglutamate-formation and O-methylation of glutamic acid, Eur J Biochem., 263(2), (1999) 552-560.

14. J.H.Dreisbach, A.Veca, Rapid method for analysis of urinary pyrrole-2-carboxylic acid using reversed-phase high-performance liquid chromatography, J.Chromatogr., Biomed. Appl. 382, (1986) 280-283.

15. A.M.Heacock, E.Adams, Formation and excretion of pyrrole-2-carboxylic acid. Whole animal and enzyme studies in the rat, J. Biol. Chem. V.250(7), (1975) 25992608.

16. A.M.Heacock, E.Adams, Formation and excretion of pyrrole-2-carboxylate in man, J.Clin.Invest., 54(4), (1974) 810-818.

17. P.L.Gendler, H.Rapoport, Permethyl analogue of the pyrrolic antibiotic Distamycin A, J.Med.Chem, 24 (1981) 33-38.

18. Y.K.Tony Lam, et al. Cochinmicins, novel and potent cyclodepsipeptide endotelin antagonists from Microbispora sp. I. Production, isolation, and characterisation, J.Antibiotics, v.45, No.l 1(1992) 1709-1716.

19. D.Zink, et al., Cochinmicins, novel and potent cyclodepsipeptide endotelin antagonists from Microbispora sp. II. Structure determination. J.Antibiotics, v.45, No.l 1(1992) 1717-1722.

20. S.Wilk, M.Orlowski, The occurrence of free L-pyrrolidone carboxylic acid in body fluids and tissues, FEBS Lett., 33(3), (1973) 157-160.

21. E.Gross, H.H.Kiltz, The number and nature of, -unsaturated amino acids in subtilin, BBRC, 50 (2) (1973) 559-565.

22. R.Rudzats, E.Gellert, B.Halpern, Constituents of a New Guinea Boletus isolation and identification of a new unsaturated -amino acid, BBRC, 47(1) (1972) 290-292.

23. D.P.Thornhill, Desmosines: a rapid single-column isolation procedure Anal. Biochem. 46,(1972)119-122.

24. S.Hunt, S.W.Breuer, Isolation of a new naturally occurring halogenated amino acid: monochloromonobromotyrosine, Biochim Biophys Acta. 252 (1971) 401-404.

25. J.Hoffman, A rapid liquid chromatographic determination of S-adenosylhomocysteine in subgram amounts of tissue, Anal. Biochem. 68, (1975) 522-530.

26. J.G.Donnelly, Homocysteine: biochemistry, measurement, and role in vascular disease, Biotech. Lab. Int. 3(1),1-2 (1998), 6-8.

27. G.Wilhelm, K.D.Kupka, Identification of amino citric acid in biological peptides, FEBS Lett., 123(1), (1981) 141-144.

28. S.A.Lewisch, R.L.Levine, Determination of 2-oxohistidine by amino acid analysis, Anal. Biochem. 231, (1995) 440-446.

29. Ю. А. Овчинников. Биоорганическая химия, Издательство «Просвещение», (1987)285-288.

30. J.A.Alhadeff, G.D.Daves, 2-Aminoethylphosphonic acid: distribution in human tissues, Biochim Biophys Acta., 244 (1971), 211-213.

31. T.M.Martensen, Chemical properties, isolation, and analysis of O-phosphates in proteins, Methods in Enzymology, 107, (1984) 3-36.

32. J.W.Perich, D.L.Nguyen, E.C.Reynolds, Phosphorylation of src-phosphopeptides by casein kinases-1 and -2: favourable effect of phosphotyrosineTetrahydron Lett. 32, (1991)4033-4034.

33. P.A.De Witte, J.F.Cuvelee, W.J.Merlevede, J.R.Vandenheede, Analysis of phospho-rylhydroxyamino acids present in hydrolyzed cell extracts using dabsyl derivatization. Anal. Biochem. 226, (1996) 1-9.

34. M.Johnstone, R.G.Goold, D.Bei, I.Fischer, P.R.Gordon-Weeks, Localisation of mi-crotubule-associated protein IB phosphorylation sites recognised by antibody SMI-31, J Neurochem., 69(4) (1997) 1417-24.

35. R.S.Turner, B.E.Kepm, H.Su, J.F.Kuo, Substrate specificity of phospholipid/Ca2+-dependent protein kinase as probed with synthetic peptide fragments of the bovine myelin basic protein, J. Biol. Chem. 260, (1985) 11503-11507.

36. S.A.Carr, K.Bieman, Identification of Posttranslationally modified Amino Acids in Proteins by Mass Spectrometry in Methods in Enzimology, 106 (1984) 29-58.

37. A.P.Hunter, D.E.Games, Chromatographic and mass spectrometric methods for the identification of phosphorylation sites in phosphoproteins, Rapid Commun. Mass Spectrom. 8(7), (1994) 559-570.

38. L.Andersson, J.Porath, Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe3+) affinity chromatography, Anal Biochem., 154, (1996) 250-254.

39. D.B.Glass, R.A.Masaracchia, J.R.Feramisco, B.E.Kemp, Isolation of phosphorylated peptides and proteins on ion exchange papers, Anal. Biochem 87, (1978) 566-575.

40. T.M.Martensen, Chemical properties, Isolation, and Analysis of O-Posphates in Proteins, Methods in Enzimology 107, (1984) 3-23.

41. H.Ohguro, K.Palczewski, Separation of phospho- and non-phosphopeptides using reverse phase column chromatography, FEBS Lett. 368, (1995) 452-454.

42. H.Matsumoto, E.S.Kahn, N.Kamori, Separation of phosphopeptides from their non-phosphorylated forms by reversed-phase POROS perfusion chromatography at alkaline pH, Anal. Biochem., 251, (1997)116-119.

43. E.C.Reynolds, P.F.Riley, N.Adamson, A selective precipitation purification procedure for multiple phosphoseryl-containing peptides methods for their identification. Anal Biochem. (1994), 217(2):277-84.

44. Y.Wang, C.J.Fiol, A.A.DePaoli-Roach, A.W.Bell, M.A.Hermodson, P.J.Roach, Identification of phosphorylation sites in peptides using a gas-phase sequencer, Anal. Biochem.,174, (1998) 537-547.

45. S.A.Carr, M.J.Huddleston, R.S.Annan, Selective detection and sequencing of phosphopeptides at the femtomole level by mass spectrometry, Anal. Biochem 239, (1996) 180-192.

46. R.S.Annan, S.A.Carr, Phosphopeptide analysis by matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry, Anal. Chem 68, (1996) 3413-3421.

47. R.S.Annan, S.A.Carr, The essential role of mass spectrometry in characterizing protein structure: mapping posttranslational modifications. J Protein Chem., 16(5) (1997) 391-402.

48. D.B.Bylund, T.S.Huang, Decomposition of phosphoserine and phosphothreonine during acid hydrolysis, Anal Biochem., 73(2), (1976) 477-485.

49. J.C.Yang, J.M.Fujitaki, R.A.Smith, Separation of phosphohydroxyamino acids by high-performance liquid chromatography, Anal Biochem., 122(2), (1982) 360-363.

50. L.Carlomagno, V.D.Huebner, H.R.Matthews, Rapid separation of phosphoamino acids including the phosphohistidines by isocratic high-performance liquid chromatography of the orthophthalaldehyde derivatives, Anal Biochem., 149(2), (1985) 344-348.

51. L.R.Murthy, K.Iqbal, Measurement of picomoles of phosphoamino acids by high-performance liquid chromatography, Anal Biochem.,193(2), (1991) 299-305.

52. D.L.Simpson, J.Hranisavljevic, E.A.Davidson, Elimination and sulfite addition as a means of localization and identification of substituted seryl threonyl residues in proteins and proteoglycans, Biochemistry 11, (1972) 1849-1856.

53. В.Ю.Колесникова, В.А.Склянкина, Л.А.Баратова, Т.И.Назарова, С.М.Аваева, Биохимия, 39 (1974) 235-240.

54. R.C.Clark, J.Dijkstra, Chemical modification of phosvitin: preparation of dimethyla-minovitin and methylmercaptovitin their utility for elucidation of phosvitin primary structure, Int. J. Biochem., 11, (1980) 577-585.

55. H.E.Meyer, E.Hoffman-Posorske, H.Korte, L.M.G.Heilmeier, FEBS Lett. 204(1) (1986) 61.

56. C.F.B.Holmes, A new method for the selective isolation of phosphoserine-containing peptides, FEBS Lett. 204, (1987) 61-66.

57. C.Wong, W.Wu, S.A.Obenshain, S.K.Diah, B.Faiola, P.J.Kennels, High-molecular-weight polypeptide substrates for phospholysine phosphatases Anal. Biochem., 222, (1994) 14-18.

58. J.M.Fujitaki, A.W.Steiner, S.E.Nichols, E.R.Helander, Y.C.Lin, R.A.Smith, A simple preparation of N-phosphorylated lysine and arginine, Prep Biochem. 10(2), (1980) 205-213.

59. H.Ohmory, M.Kuba, A.Kumon, Two phosphatases for 6-phospholysine and 3-phosphohistidine from rat brain, J. Biol. Chem., 268(11), 7625-7627.

60. P.G.Besant, L.Byrne, G.Thomas, P.V.Attwood, A chromatographic method for the preparative separation of phosphohistidines, Anal. Biochem., 258, (1998) 372-375.

61. Y.-F.Wei, H.R.Matthews, A filter-based protein kinase assay selective for alkali-stable protein phosphorylation and suitable for acid-labile protein phosphorylation, Anal. Biochem., 190, (1990) 188-192.

62. J.Huang, Y.Wei, Kim, L.Osterberg, H.R.Matthews, Purification of a protein histidine kinase from the yeast Saccharomyces cerevisiae. The first of this class of protein kinases, J.Biol.Chem. 266, (1991) 9023-9031.

63. V. Du Vigneaud, C.Ressler, J.R.Rachele, Science 112 (1950) 267-271.

64. G.Minniti, A.Piana, U.Armani, R.Cerone, Determination of plasma and serum homocysteine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection, J.Chromatogr. A, 828 (1998) 401-405.

65. M.L.Dalton, P.J.Gadson, J.Wrenn, et al., Homocysteine signal cascade: Production of phospholipids, activation of protein-kinase C, and the induction of c-tos and c-myb in smooth muscle cells, Faseb J., 11(8) (1997) 703-711.

66. J.C.Tsai, H.Wang, M.A.Perella, et al., Induction of cyclin A gene expression my homocysteine in smooth muscle cells, J.Clin.Invest., 97(1) (1996) 146-153.

67. M.A.Mansoor, A.M.Svardal, P.Ueland, Determination of the in vivo redox status of cysteine, cysteinylglycine, homocysteine, and glutathione in human plasma Anal. Biochem. 200 (1992) 218-229.

68. A.M.Svardal, M.A.Mansoor, P.M.Ueland, Determination of reduced, oxidized, and protein-bound glutathione in human plasma with derivatization with monobromobi-mane and liquid chromatography, Anal.Biochem. 184(2) (1990) 338-346.

69. C.Gomes TRolin, B.Regland, L.Oreland, Decreased methionine adenosyltransferase activity in erythrocytes of patient with dementia disorders, Eur. Neuropsychopharmacol., 5(2) (1995) 107-114.

70. D.E.Wilcken, S.G.Reddy, V.J.Gupta, Homocysteinemia, ischemic heart diseas, and the carrier state for homocystinuria, Metabolism, 32(4) (1983) 363-370.

71. L.Brattstrom, B.Israelsson, et al., Impared homocysteine metabolism in early-onset cerebral and peripheral occlusive arterial diseas. Efects of pyridoxine and folic acid treatment, Atherosclerosis, 81(1) (1990) 51-60.

72. L.J.Fortin, J.Jr.Genest, Measurement of homocysteine in prediction of arterosclerosis, Clin.Biochem., 28(2), (1995) 155-162.

73. H.Refsum, F.Wesenberg, P.M.Ueland, Plasma homocysteine in children with acute lymphoblastic leukemia: changes during a chemotherapeutic regimen including methotrexate, Cancer Res. 51(3) (1991) 828-835.

74. V.W.Dennis, K.Robinson, Homocisteinemia and vascular diseas in end-stage renal diseas, Kidney Int. Suppl., 57 (1996) 1-17.

75. A.D.Horan, C.Y.Chan, et al., Analysis of tumor thiol concentrations: comparison of flow cytometric with chemical and biochemical techniques, Cytometry, 29(1) (1997) 76-82.

76. M.Pirmohamed, D.Williams, et al., Intracellular glutathione in the peripheral blood cells of HIV-infected patients: failure to show a dificiency, AIDS, 10(5) (1996) 501507.

77. N.P.Dudman, P A.Tyrrell, D.E.Wilcken, Homocysteinemia: depressed plasma serine levels, Metabolism, 36(2) (1987) 198-201.

78. S.-S.Kang, P.W.K.Wong, K.Curley, The effect of D-penicillamine on protein-bound homocysteine in homocystinurics, Pediatr.Res., 16 (1982) 370-372.

79. R.Saetre, D.L.Rabenstein, Determination of cysteine in plasma and urine and homocysteine in plasma by high-pressure liquid chromatography, Anal.Biochem., 90 (1978)684-692.

80. D.L.Rabenstein, G.T.Yamashita, Determination of homocysteine, penicilamine, and their symmetrical and mixed disulfides by liquid chromatography with electrochemical detection, Anal.Biochem., 180 (1989) 259-263.

81. S.B.Thompson, D.J.Tucker, Analysis of homocysteine in human urine using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection, J.Chromatogr. 382 (1986) 247.

82. J.L.D'Eramo, A.E.Finkelstein, et al., Total homocysteine levels in plasma: high-performance liquid chromatographic determination with electrochemical detection and glassy-carbon electrode, J.Chromatogr. B, 720 (1998) 205-210.

83. E.G.Demaster, F.N.Shirota, B.Redfern,D.J.W.Goon, H.T.Nagasawa, Analysis of hepatic reduced glutathione, cysteine and homocysteine by cation-exchange highperformance liquid chromatography with electrochemical detection, J.Chromatogr. 308 (1984) 83.

84. R.Singh, G.V.Lamoureux, et al., Regents for rapid reduction of disulfide bonds, in Methods Enzymol. 251,(1995), 167-173, Academic Press Inc., San Diego.

85. A.Fontana, C.Toniolo, Detection and determination of thiols, in Methods Епгуток 251, (1995), 271-324, Academic Press Inc., San Diego.

86. S.-W.Myung, M.Kim, H.-K.Min, et al., Determination of homocysteine and its related compounds by solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, J.Chromatogr.B, 727 (1999) 1-8.

87. J.B.Ubbink, R.Delport., et al., Comparison of three different plasma homocysteine assays with gas chromatography-mass spectrometry, Clin.Chem., 45(5) (1999) 670675.

88. S.P.Stabler, P.D.Marcell, R.Podell, R.H.Allen, Quantitation of total homocysteine, total cysteine, and methionine in normal serum and urine capillary gas chromatography-mass spectrometry, Anal. Biochem., 162 (1987) 185.

89. M.J.Magera, J.M.Lacey, et al., Method for the determination of total homocysteine in plasma and urine by stable isotope dilution and electrospray tandem mass spectrometry, Clin.Chem., 45(9) (1999) 1517-1522.

90. V.J.Gupta, D.E.Wilcken, The detection of cysteine-homocysteine mixed disulphide in plasma of normal fasting man, Eur.J.Clin.Invest, 8(4) (1978) 205-207.

91. M.T.W.B. de Poele-Pothoff, M.van der Berg, et al., Three different methods for the determination of total homocysteine in plasma, Ann.Clin.Biohem. 32 (1995) 218-220.

92. H.Kataoka, K.Takagi, M.Makita, Determination of total plasma homocysteine and related aminothiols by gas chromatography with flame photometric detection, J.Chromatogr. B, 664 (2) (1995) 421-425.

93. C.M.Pfeyffer, D.L.Huff, E.W.Gunter, Rapid and accurate HPLC assay for plasma total homocysteine and cysteine in a clinical laboratory setting, Clin.Chem.,45(2) (1999)290-292.

94. K.Nakashima, C.Umekawa, et al., High-performance liquid chromatography/chemiluminiscence determination of biological thiols with N-4-(6-dimethylamino-2-benzofuranyl)phenyl.maleimide.

95. D.Beales, R.Finch, et al., Determination of penicillamine and other thiols by combined high-performance liquid chromatography and post-column reaction with Ellman's reagent: aplication to human urine, J.Chromatogr., 226 (1981) 498-503.

96. A.Andersson, A.Isaksson,L.Brattstron, B.Hulberg, Homocysteine and other thiols determined in plasma by HPLC and thiol-specific postcolumn derivatization. Clin. Chem. 39(8) (1993) 1590.

97. H.Refsum, S.Helland, P.M.Ueland, Radioenzymic determination of homocysteine in plasma and urine, Clin.Chem., 31 (1985) 624.

98. C.Parmentier, P.Leroy, M.Wellman, A.Nicolas, Determination of cellular thiols and glutathione-related enzyme activities: versatility of high-performance chromatography-spectrofluorimetric detection, J.Chromatogr. B, 719 (1998) 37-46.

99. I.Fermo, C.Arcelloni, E.De Vecchi, et al., High-performance liquid chromatographic method with fluorescence detection for the determination of total homocist(e)ine in plasma, J.Chromatogr., 593(1-2) (1992) 171-176.

100. K.Hyland, T.Bottiglieri, Measurement of total plasma and cerebrospinal fluid homocysteine by fluorescence following high-performance liquid chromatography and precolumn derivatization with O-phthaldialdehyde, J.Chromatogr., 579(1) (1992) 5562.

101. R.Gatti, V.Carvini, et al., High-performance liquid chromatographic determination of aliphatic thiols with aroylacrylic acids as fluorogenic precolumn determination reagents, J.Chromatogr., 507 (1990) 451-458.

102. E.M.Kosower, N.S.Kosower, Bromobimane probes for thiols, in Methods Enzymol. 251,(1995), 133-148, Academic Press Inc., San Diego.

103. D.J.Jacobsen, V.J.Gatautis, R.Green, Determination of plasma homocysteine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection, Anal.Biochem. 178 (1989) 208.

104. A.Araki,Y.Sako, Determination of free and total homocysteine in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. J. Chromatogr. 422 (1987) 43-52.

105. P.E.Cornwell, S.L.Morgan, W.N.Waughn, Modification of a high-performance liquid chromatographic method for assay of homocysteine in human plasma, J.Chromatogr, 617 (1993) 136-139.

106. A.Feussner, B.Rolinski, N.Weiss, et al. Determination of total homocysteine in human plasma by isocratic high-performance liquid chromatography, Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem, 35(9) (1997) 687-691.

107. J.B.Ubbink, W.J.Hayward Vermaak, S.Bissbort, Rapid high-performance liquid chromatographic asay for total homocysteine levels in human serum, J.Chromatogr, 565 (1991)441-446.

108. T.Toyo'oka, K.Imai, High-performance liquid chromatography and fluorometric detection of biologically important thiols, derivatized with ammonium 7-fluorobenzo-2-oxo-1,3-diazole-4-sulphonate (SBD-F), J.Chromatogr. 282 (1983) 495-500.

109. K.Kuo, R.Still, S.Cale, I.McDowell, Standartization (external, internal) of HPLC assay for plasma homocysteine, Clin.Chem, 43 (1997) 1653-1655.

110. V.Rizzo, L.Montalbetti, M.Valli, et al., Study of factors affecting the determination of total plasma 7-fluorobenzo-2-oxa-l,3-diazole-4-sulfonate (SBD)-thiol derivatives by liquid chromatography, J.Chromatogr. B, 706 (1998) 209-215.

111. P.Durand, L.J.Fortin, S.Lussier-Cacan, J.Davignon, D.Blache, Hyperhomocys-teinemia induced by folic acid deficiency and methionine load-aplications of a modified HPLC method, Clin.Chim.Acta, 252(1) (1996) 83-93.

112. T.Oe, T.Ohyagi, A.Naganuma, Determination of y-glutamylglutatione and other low-molecular-mass biological thiol compounds by isocratic high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection. J.Chromatogr. B, 708 (1998) 285-289.

113. S.J.Moat, J.R.Bonham, M.S.Tanner, et al., Recommended approaches for the laboratory measurement of homocysteine in the diagnosis and monitoring of patients with hyperhomocysteinaemia, Ann.Clin.Biochem, 36 (1999) 372-379.

114. S.Velury, S.B.Howell, Measurement of plasma thiols after derivatization with monobromobimane, J.Chromatogr., 424 (1988) 141-146.

115. R.C.Chu, C.A.Hall, The total serum homocysteine as an indicator of vitamin В12 and folate status, Am.J.Clin.Path. 90 (1988) 446.

116. E.Jelum, A.K.Thorsud, E.Time, Capillary electrophoresis for diagnosis and studies of human disease, particularly metabolic disorders, Chromatogr. 489 (1991) 455-465.

117. M.W.Lada, R.T.Kennedy, In vivo monitoring of glutathione and cysteine in rat caudate nucleus using microdialysis on-line with capillary zone electrophoresis-laser induced fluorescence detection, J.Neirosci.Methods, 72 (1997) 153-159.

118. E.Causse, R.Terrier, S.Champagne, M.Nertz, P.Valdiguie, R.Salvayre, F.Couderc, Quantitation of homocysteine in human plasma by capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence detection, J.Chromatogr. A, 817 (1-2) (1998) 181-185.

119. J.Zhou, T.J.O'Shea, S.M.Lunte, Simultaneous detection of thiols and disulfides by capillary electrophoresis-electrocemical detection using mixed-valence ruthenium cyanide-modified microelectrode, J.Chromatogr. A, 680 (1994) 271.

120. T.Fiskerstrand, H.Refsum, G.Kvalheim, P.M.Ueland, Homocysteine and other thiols in plasma and urine: automated determination and sample stability, Clin.Chem. 39(2) (1993) 263-267.

121. W.H.Fischer, C.A.Hoeger, J.Meisenhelder, T.Hunter, A.G.Craig, Determination of phosphorylation sites in peptides and proteins employing a volatile Edman reagent, J. Prot. Chem.l6(5) (1997) 329-334.

122. A.M.Edelman, D.K.Blumenthal, E.G.Krebs, Protein serine/threonine kinases Annu.Rev.Biochem. 56 (1987) 567.

123. P.Edman, A.Henschen, Sequence determination, in Needleman, S.B. (Ed), in Protein Sequence Determination, Springer, Verlag, Berlin, Hedelberg, N.Y., 1975, p. 232-279.

124. E.Neufeld, H.J.Goren, D.Boland, Thin-layer chromatography can resolve phos-photyrosine, phosphoserine, and phosphothreonine in a protein hydrolyzate Anal.Biochem. 177 (1989) 138-143.

125. M.Manai, A.J.Cozzone, Two-dimensional separation of phosphoamino acids from nucleoside monophosphates, Anal. Biochem. 124 (1982) 12-18.

126. H.E.Meyer, E.Hoffman-Posorske, A.Donella-Diana, H.Korte, Sequence analysis of phosphotyrosine-containing peptides, Meth. Enzymol.124 (199) 206-224.

127. F.Downs, C.Peterson, V.L.N. Murty, W.Pigman, Quantitation of the beta-elimination reaction as used on glycoproteins, Int. J. Peptide Protein Researh. 10 (1977)315-322.

128. C.W.Turck, J.Herrmann, J.A.Escobedo, L.T.Williams, Identification of phosphoty-rosine residues during protein sequence analysis, Pept. Research. 4(1) (1991) 36-39.

129. J.A.Cooper, B.M.Sefton, T.Hunter, Detection and quantification of phosphotyro-sine in proteins, Meth. Enzymol. 99 (1983) 387-402.

130. M.K.Leung, K.S.-Rozsa, A.Hall, S.Kuruvilla, G.B.Stefano, D.O.Carpenter, Enkephalin-like substance in Aplisia nervous tissue and actions of Leu-enkephalin on single neurons, Life Sciences, 38, (1986) 1529-1534.

131. N.Ohta, I.Kubota, T.Takao, Y.Shimonishi, Y.Yasuda-Kamatani, et al., Fulicin, a novel neuropeptide containing a D-amino acid residue isolated from the ganglia of Achatina Fulica, Biochem.Biophys.Res.Comm., 178(2), (1991) 486-493.

132. Y.Kamatani, H.Minakata, P.T.M.Kenny, T.Iwashita, et al., Achatin-1, an endogenous neuroexcitatory tetrapeptide from Achatina Fulica ferussac containing a D-amino acid residue, Biochem.Biophys.Res.Comm., 160(3) (1989) 1015-1020.

133. B.D.Evans, J.Pohl, N.A.Kartsonis, R.L.Calabrese, Identification of RF-amid neuropeptides in the Medicinal Leech, Peptides, 12 (1991) 897-908.

134. F.E.G.Cox, The worm and the virus, Nature, 347 (1990) 618.

135. M.Salzet, C.Wattez, P.Bulet, J.Malecha, Isolation and structural characterization of a novel peptide related to y-melanocyte stimulating hormone from the brain of the leech Theromyzon tessulatum, FEBS Lett., 348 (1994) 102-106.

136. M.Salzet, P.Bulet, M.Verger-Bocquet, J.Malecha, Isolation and structural characterization of enkephalins in the brain of the Rhynchobdellid leech Theromyzon tessulatum, FEBS Lett., 357 (1995) 187-191.

137. Л.А.Елякова, О.М.Мястовская, В.А.Мамонтова, В.А.Рассказов, Потенциальные противоопухолевая и антивирусная активности морских полихет, Биология моря, 24(1) (1998) 38-43.

138. L.A. Elyakova, A.R. Ivanov, I.V. Nazimov, V.A. Mamontova and V.L. Tunitskaya,Primary Analysis of Physiologically Active Peptides Isolated from Marine

139. Polychaetes. Peptides 1998, Sandor Bajusz and Ferenc Hudecz (Eds), Akademiai Kiado, Budapest, (1999) 424-425.

140. S.Partanaen, S.Kaakkola, I.Kaariainen, Tryptophylglycine dipeptide in ACTH/MSH cells of the human hypophysis: its identification studies on its antinociceptive effects in mice, Acta Physiol. Scand., 107 (1979) 213-218.

141. K.Tatemoto, Synthesis of receptor antagonists of neuropeptide Y, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 157 (1988) 713.

142. Y.Kuroda, et al, FR-900148, a new antibiotic. II. Structure determination of FR-900148, J. Antibiotics, v.XXXIII No.3, (1980) 267-271.

143. H.Fukunaga, M.Takahashi, H.Kaneto, M.Yoshikawa, Effects of Tyr-MIF-1 on stress-induced analgesia and the blockade of development of morphine tolerance by stress in mice, Jpn J Pharmacol., 79(2) (1999) 231-235.

144. H.Refsum, P.M.Ueland, A.M.Svardal, Fully automated fluorescence assay for determining total homocysteine in plasma, Clin.Chem. 35/9 (1989) 1921-1927.

145. R.Munday, Toxicity of thiols and disulphides: involvement of free-radical species, Free Rad. Biol. Med. 7(6) (1989) 659-673.

146. L.Bratstrom, B.Israelsson, J.O.Jeppsson, B.L.Hulberg, Higher total plasma homocysteine in vitamin В12 deficiency than in heterozygosity for homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency, Metabolism 37 (1988) 175-178.

147. L.E.Overman, J.Smoot, J.D.Overman, The reduction of aryl disulfides with tri-phenylphosphine and water, Synthesis. 1 (1974) 59.

148. V.C.Wiley, N.P.B.Dudman, D.E.L.Wilcken, Interrelations between plasma free and protein-bound homocysteine and cysteine in homocystinuria, Metabolizm. 37(2) (1998)191-195.

149. А.П.Садименко, В.А.Коган, Статистическая обработка данных и планирование химического эксперимента, Издательство Ростовсого университета, 1985.

150. А.П.Крешков, А.АЛрославцев, Курс аналитической химии, Издательство «Химия», 1975.

151. Ю.Ю.Лурье, Справочник по аналитической химии, Издательство «Химия», 1979.

152. К.Дёрфель, Статистика в аналитической химии, «Мир» (1994).

153. D.L.Rabenstein, G.T.Yamashita, Determination of homocysteine, penicillamine, and thir symmetrical and mixed disulfides by liquid chromatography with electrochemical detection, Anal. Biochem. 180 (1989) 259.

154. K.Havel, K.Pritts, T.Wielgos, Quantitation of oxidized and reduced glutathione in plasma by micellar electrokinetic capillary electrophoresis, J.Chromatogr. A, 853 (1999)215-223.

155. J.S.Stamler, J.Loscalzo, Capillary zone electrophoretic detection of biological thiols and their S-nitrosated derivatives, Anal.Chem., 64(7) (1992) 779-785.1. POCC'-V-'r'J1 t F.