Роль тромбоцитов, эритроцитов и лейкоцитов в реализации связи между гемостазом и перекисным окислением липидов тема автореферата и диссертации по астрономии, 01.03.04 ВАК РФ

£ #

С^ Лу \

На правах рукописи

Ральченко Ирина Викторовна

Роль ТРОМБОЦИТОВ, ЭРИТРОЦИТОВ И ЛЕЙКОЦИТОВ В РЕАЛИЗАЦИИ СВЯЗИ МЕЖДУ ГЕМОСТАЗОМ И ПЕРЕКИСНЫМ ОКИСЛЕНИЕМ ЛИПИДОВ

00.03.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

УФА - 1998

Работа выполнена в Тюменской государственной медицинской академии

Научный консультант: Член-корреспондент АЕ и МАИ, заслуженный изобретатель

РФ, доктор медицинских наук, профессор А.Ш.Бышевский

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Ф.Н.Гнлымиярова, Доктор биологических наук С.А.Башкатов, Доктор биологических наук, профессор Е.А. Чирятьев

Ведущее учреждение:

Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится

1998 г на заседании диссертационного Совета

Д 084.35.01 при Башкирском государственном медицинском университете (425000, г. Уфа, у/ Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан

1998

Ученый секретарь диссертационного Совета член-корреспондент АН РБ, доктор медицинских наук, профессор

Э.Г.Давлетов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Об универсальной роли свободнорадикального окисления липидов в гомеостазе вообще [Л.К.Обухова, Н.М.Эмануэль, 1983], о роли этого процесса в развитии многих заболеваний имеется достаточно свидетельств [В.В.Малышев и др., 1995; Д.В.Морозов и соавт., 1996; Е.П. Шувалова и др., 1996; С.Л.Плавинский, А.С.Кузнецов, 1997; Р.М.Сафаров и др. 1997]. Особый интерес представляют патологические состояния, которые сопровождаются одновременно активацией ПОЛ и ростом гемостатического потенциала, что может приводить к развитию ДВС [А.Ш.Бышевский и соавт., 1995; С.С.Селицкая и соавт., 1996; 2Иеп е.а.,

1996].

Одновременная манифестация гиперкоагулемии и активации ПОЛ в клинике [Л.В.Шатилина и др., 1996: В.З.Ланкин, 1997] и эксперименте, способность антиоксидантов ограничивать в этих условиях гемокоагуляционные сдвиги [А.А.Гарганеева и др., 1997; И.Ш.Весельский, А.В.Сонник, 1997] обосновывают необходимость изучения механизмов взаимосвязи между свободнорадикальными процессами и гемостазом. Существование такой связи вполне допустимо, но механизмы ее реализации затронуты лишь в единичных работах [И.В.Селиванова, 1994; В.Г.Соловьев, 1997; ЫПапо е.а.,

1997]. В частности, об этом свидетельствуют изменения мембранных липидов под влиянием свободнорадикального окисления, данные о роли фосфо-липидов в формировании тромбопластической активности [В.Г.Соловьев, 1997; 1паа\ е.а., 1980].

Запуск коагуляционного каскада разными путями всегда ведет к образованию тромбина [Б.А.Кудряшов, 1975; Д.М.Зубаиров, 1978], поэтому корректно допустить, что зависимость между гиперкоагулемией и активацией ПОЛ реализуется через изменения интенсивности тромбиногенеза. Подтверждение этого предположения [Бышевский, 1996; В.Г.Соловьев, 1997] потребовало исследовать механизм влияния тромбинемии на свобод-норадикальные процессы крови, преимущественными субстратами которого являются жирные кислоты в составе мембранных липидов. Поэтому наше внимание привлекли клетки крови, как структуры, тесно связанные с гемостазом [Б.И.Кузник и соавт., 1989] и потенциально способные реагировать на тромбин активацией внутриклеточных реакций ПОЛ [Бышевский и др. 1996]. В большей степени это относится к тромбоцитам и лейкоцитам, имеющим рецепторы к тромбину ^апиеБоп е.а., 1980] и ферментные системы образования эндоперекисей простагландинов [Бкагс!, 1_адагс1е, 1985; 51е$5, 1989], в меньшей - к эритроцитам.

Ранее в нашей лаборатории выявлена связь, выражающаяся схемой «тромбинемия —» активация ПОЛ» и «активация ПОЛ —» тромбинемия» [С.Н.Ельдецова, 1990; И.В.Селиванова, 1994], свидетельствующая о взаимоусилении этих процессов. Показано также, что тромбоциты - одно из звеньев, опосредующих эту связь [И.В.Селиванова, 1994; В.Г.Соловьев,

1997]. Однако сведения о механизмах опосредования и роли в этом других

клеток крови немногочисленны, хотя и эритроциты, и лейкоциты участвуют

в гемостазе через влияние на активацию протромбиназы.

Цель работы - изучить роль и механизмы участия тромбоцитов, эритроцитов

и лейкоцитов во взаимосвязи процессов перекисного окисления липидов и

гемокоагуляции.

задачи: 1) изучить состояние гемостатического потенциала при активации и угнетении ПОЛ; 2) изучить состояние ПОЛ при модификации интенсивности тромбинообразования; 3) уточнить роль тромбоцитов как звена, опосредующего эффект активации ПОЛ на свертываемость; 4) изучить влияние эритроцитов и лейкоцитов на агрегацию тромбоцитов в зависимости от состояния процессов ПОЛ; 5) попытаться выявить материальный субстрат, обеспечивающий влияние эритроцитов и лейкоцитов на агрегацию тромбоцитов; 6) изучить эффекты модификаторов метаболизма субстрата (ара-хидоновой кислоты), превращения которого ведут к образованию диеновых конъюгатов в клетках (эффекты ингибиторов и активаторов метаболизма арахидоновой кислоты).

Научная новизна. Впервые показано, что введение про- и антиоксидантов дозозависимо изменяет концентрацию первичных и вторичных продуктов ПОЛ в плазме, эритроцитах, лейкоцитах и тромбоцитах, что этим изменениям следуют адекватные сдвиги активности гемостаза, что активация свертывания воздействиями, вызывающими тромбинемию, сопровождается повышением содержания продуктов ПОЛ в тех же объектах.

Впервые установлено что, изменения активности ПОЛ в тромбоцитах усиливает их агрегацию и высвобождение факторов Р3, Р4 и Р10.

Впервые установлена зависимость способности эритроцитов, нейтрофи-лов и моноцитов изменять гемокоагуляционную активность тромбоцитов (их агрегацию и реакцию высвобождения) при воздействиях, модифицирующих ПОЛ, показано, что эта способность зависит от уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ, накапливаемых в клетках и выделяемых в окружение.

Впервые показано, что посредником, обусловливающим эффект эритроцитов, нейтрофилов и моноцитов на тромбоциты являются высвобождаемые клетками первичные и вторичные продукты ПОЛ, что изменения интенсивности ПОЛ и, следовательно, концентрация пероксидов в эритроцитах, нейтрофилах и моноцитах, определяет их вклад в гемокоагуляцию за счет изменения скорости образования фактора Ха (активной протромбиназы).

Совокупность полученных данных позволила подтвердить представления о взаимодействии ПОЛ и гемостаза и раскрыть один из существенных механизмов его реализации.

Практическая ценность работы. В ходе исследований разработаны: 1. Способ определения тромбоцитарного ф. Р4 в плазме крови (авторское свидетельство № 1336713 и патент № 1336713 от 8.05.1987 г). 2. Способ очистки плазмы от гепарина (авторское свидетельство N2 1371208 и патент № 1371208 от 1.10.1987 г). 3. Способ определения суммарного содержания

фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови (Авторское свидетельство N2 1779693 и патент №1779693 от 12.01.1994 г).

Материалы исследований использованы при написании монографий («Витамины в профилактике тромбогеморрагических осложнений» (Тюмень, 1995, авторы - А.Ш.Бышевский, В.А.Полякова, С.Л.Галян, А.М.Мкртумян), «Тромбоциты» (Тюмень, 1996, авторы - А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, И.А.Дементьева, А.А.Нелаева) и легли в основу разработанных нами методических рекомендаций «Профилактика тромбогеморрагических осложнений в родах и послеродовом периоде» (Тюмень, 1997, соавторы А.Ш.Бышевский, В.А.Полякова, Ю.И.Цирук, Т.П.Шевлюкова, В.Г.Соловьев, И.А.Дементьева, А.А.Вакулин), «Антиоксидантная терапия при гестозе» (Тюмень, 1997, соавторы С.Л.Галян, В.А.Полякова, Ю.И.Цирук, Т.П.Шевлюкова, И.А.Дементьева, А.А.Вакулин, А.В.Соловьева).

Полученные данные использованы также при составлении инструкции по клиническому испытанию ВИТАКОМПЛЕКСА к заявке в Фармакологический Комитет МЗ и МП РФ.

Результаты работы внедрены в практическую деятельность ряда клинических учреждений г. Тюмени.

апробация и публикации. Основные положения диссертации доложены на Всесоюзных конференциях «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (М., 1987); «Физиология и патология перекисного окисления ли-пидов, гемостаза и иммуногенеза» (Полтава, 1991, 1992, 1993, 1994 1995); Региональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Тюмень, 1994); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы фармации» (Тюмень, 1994); Международном симпозиуме «Биологически-активные добавки к пище - нутрицевтики - и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях» (Тюмень, 1995); 9-ой Европейской конференции по гемореологии (Сиена, 1995); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии» (С.-Петербург, 1995); Всероссийской конференции «Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации» (Самара, 1996); Международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 1996, 1997).

По материалам диссертации опубликовано 46 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 238 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов исследования, главы с изложением собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 28 рисунками. Библиографический указатель включает 101 работы отечественных и 292 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Первичное угнетение или активация процессов ПОЛ, проявляющиеся изменением уровня продуктов пероксидации в клетках крови и плазме, сопровождается угнетением или активацией свертываемости крови соответственно.

2. Воздействия, активирующие или подавляющие тромбиногенез и не оказывающие непосредственного влияния на процессы ПОЛ, вызывают изменения интенсивности этих процессов.

3. Существует двусторонняя взаимосвязь между ПОЛ и гемостазом, опосредуемая по цепи ПОЛ-»эритроциты+нейтрофилы+моноциты->тром-6оциты-»гемокоагуляция (активация тромбиногенеза)—»активация ПОЛ. Факторы, активирующие ПОЛ в эритроцитах, нейтрофилах и моноцитах, усиливают высвобождение ими перекисных соединений, которые концен-трационнозависимо активируют тромбоциты, что повышает вклад последних в тромбинообразование. Активация ПОЛ в эритроцитах и моноцитах одновременно повышает их вклад в тромбинообразование за счет прироста тромбопластической активности.

4. Антиоксиданты, введение которых сопровождается снижением уровня продуктов пероксидации в изучаемых клетках, уменьшают их вклад в тромбинообразование, ограничивая интенсивность его аутокаталитического механизма и прирост коагуляционной активности крови.

Материалы и методы исследований.

Эксперименты выполнены на беспородных белых крысах (1010 особей) с массой тела 120±15 г. Кровь отбирали в шприц из обнаженной яремной вены наркотизированных диэтиловым эфиром крыс. Стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия (9:1) [В.П.Балуда и др., 1980].

В части опытов животным внутривенно вводили тромбин (0,1 мл/100 г, активность по свертыванию 0,2% раствора фибриногена /ФГ/ - 25 с) или тромбопластин /ТП/ (0,5 мл/100 г, активность - 22 с). Гипертромбинемию оценивали по изменению протромбинового индекса /ПТИ/, показателей состояния общей свертывающей активности крови, концентрации ФГ в плазме и содержанию тромбоцитов /ТЦ/. Для оценки коагуляционного гемостаза определяли ПТИ, активированное время рекальцификации /АВР/ и активированное частичное тромбопластиновое время /АЧТВ/, этаноловый тест /ЭТ/ по Г.Н.Детинкиной и др. [1984], количество ФГ - способом прямой спектрофотометрии [А.Ш.Бышевский, В.С.Мохнатов, 1969], продукты деградации фибрина /ПДФ/ в модификации А.Ш.Бышевского и др. [1989].

Для оценки процесса ПОЛ и их антиоксидантной активности /АОА/ определяли содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Содержание сопряженных диеновых соединений устанавливали по оптической плотности гептановой фазы (Л=232 нм), содержание продуктов окисления липи-дов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой /ТБК/, определяли в-мо-

4

дификации В.Н.Ушкаловой и др. (1987). В экстракте определяли кинетические величины прямого инициированного окисления липидов молекулярным кислородом - детальное описание приведено С.Н.Ельдецовой (1990).

Для выделения клеток кровь брали в шприц с гепарином (5 ООО ед./ мл), [В.П.Балуда и др., 1980].

Состояние агрегационной функции ТЦ оценивали, определяя: 1. Интенсивность спонтанной агрегации /СА/ ТЦ в модификации Н.И.Тарасовой (В.П.Балуда и др., 1980). 2.Агрегационную активность /АА/ ТЦ - с помощью агрегометра «Биомак». При оценке агрегатограмм устанавливали значения максимальной агрегации (МА), время ее достижения (Т), половину времени ее достижения (Т/2) и начальную скорость (tg а). Индуктор агрегации - АДФ с конечной концентрацией 0,01 мг/мл (В.П.Балуда и др., 1980). 3. Содержание и высвобождение ф. Р3 в плазме устанавливали по Rabiner, Groder [В.П.Балуда и др. 1980]. 4. Содержание ф. плазмы - по влиянию прогретой бедной ТЦ плазмы на тромбин-гепариновое время свертывания субстратной плазмы. Интенсивность высвобождения (реакция высвобождения /РВ/) фактора Р4 устанавливали по уровню ф. Р4 в плазме после проведения АДФ АГ. 5. Содержание ф. Р)0 определяли в модификации А.П.Соломонова, Э.Г.Ларского [В.П.Балуда и др., 1980]. 6. Содержание ТЦ определяли унифицированным методом - [В.В.Меньшиков, 1987]. Выделение и отмывку ТЦ проводили согласно описанию А.Б.Самаль и др. [1990]. 7. Выделение и отмывку эритроцитов /ЭЦ/для опытов проводили по описаниям И.Я.Ашкинази [1977]. 8. Нейтрофилы, моноциты и лимфоциты выделяли в градиенте фиколл/гипак (верографин) [Pandolfi, е.а., 1981]. 9. Разделение лимфоцитов и моноцитов проводили методом Ross [1979].

Как комплексный антиоксидант, использовали комбинацию витаминов А, Е, С и Р в дозах: 0,18, 0,15, 45 и 20 мг/100 г массы тела соответственно. Эти дозы адекватны средним лечебным дозам для человека [А.Ш.Бы-шевский, 1966; С.Л.Галян, 1993, С.А.Ральченко, 1992].

Дозы и пути введения димефосфона /ДМ/, ацетата свинца, эрахидо-ната /АХ/, аспирина /АСК/ и индометацина /ИМ/ приведены в соответствующих разделах.

В работе использованы следующие коммерческие препараты и реагенты: 1. Тромбин и фибриноген бычьей крови (Каунас). 2. Тромбопластин (г. Киров). 3. Эритрофосфатид (г. Минск). 4. АДФ (Reanal). 5. Витамины А, Е, С и Р (Алтайский витаминный завод). 6. Индометацин (Chinoin). 7. Арахидо-нат натрия (Sigma). 8. ДМ (Казань). 9. Аспирин (Bayer). 10. Сефадекс G-10 (Uppsala, Sweden). Каолин, соли, основания и кислоты - квалификации х.ч.

Полученные цифровые данные подвергнуты математической обработке методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений. Достоверность различий определена по таблицам Стьюдента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Гемостатический потенциал при изменении интенсивности процессов ПОЛ. Одну из задач работы - расширение представлений о зависимости между гемокоагуляцией и ПОЛ - решали, изменяя в условиях опыта интенсивность ПОЛ воздействием про- или антиоксидантов. Крысам вводили одновременно комбинацию витаминов (А, Е, С и Р) в дозах, адекватных лечебным, отбирая пробы крови на 13-й день. К этому сроку несколько снизились общая свертывающая активность (удлинилось АВР) и уровень ПДФ, что свидетельствует о замедлении непрерывно протекающего внутрисосу-дистого свертывания крови (табл. 1).

Таблица 1. Гемокоагуляция у крыс, получавших в течение 12 дней витамины _А, Е, С и Р в дозах, адекватных лечебным_

Исследуемые показатели Контрольная группа (п=12) Подопытная группа (п=9)

АВР, с 44,3± 1,2 51,6±0,9*

АЧТВ, с 28,5±0,9 29,4±0,8

ПТИ,% 92,9± 2,8 92,6± 1,1

ФГ, г/л 3,8±0,3 3,9±0,4

ПДФ, мг% 22,1 ±0,6 14,9±2,3*

ЭТ, % 0,0 0,0

ТЦ, тыс/мкл 965±19 1089±18*

Примечание: в этой таблице и последующих АВР - активированное время рекальцифика-ции, АЧТВ - активированное частичное ТП время, ПТИ - протромбиновый индекс, ФГ -фибриноген, ПДФ - продукты деградации фибрина (фибриногена), ЭТ - этаноловый тест; знак * - достоверные отличия.

Состояние свободнорадикальных процессов в плазме и ЭЦ тех же животных характеризуется значительным уменьшением количества диеновых коньюгатов /ДК/ в плазме и ЭЦ (в 1,6 и 2,8 раза соответственно), количества вторичных продуктов ПОЛ (в 1,9 и 2,2 раза), удлинился ПИ (в 2,6 и 2,1 раза) и снизилась скорость окисления/СО/ (в 1,4 и 1,7 раза). На основании полученных данных можно было использовать комбинацию витаминов как средство, угнетающее ПОЛ и повышающее антиоксидантный потенциал, что согласуется с известными данными [В.М.Шафер, 1989; С.Л.Галян, 1993].

Следующие эксперименты провели на таких группах животных: 1-я группа - интактные крысы (контроль) - дополнительно к рациону ничего не получали; 2 группа - крысы получали ацетат свинца (5 мг/100 г массы) [Свинец, 1980]; 3-я группа - свинец на фоне витаминной комбинации.

Из данных табл. 2 следует, что введение свинца вызвало рассогласование показателей общей свертывающей активности - удлинение АВР и укорочение АЧТВ, прирост ПДФ и появление положительных ЭТ. Эти изменения можно трактовать как наклонность к ДВС. На фоне «витаминизации» введе-

ние свинца не сопровождалось описанными гемокоагуляционными сдвигами [А.А.Мкртумян, 1994].

Таблица 2. Гемокоагуляция у крыс, получавших ацетат свинца на фоне «витаминизации» и без нее в течение 12 дней

Показатели Интактные Крысы получали Крысы получали свинец

крысы (п=8) свинец (п=6) и витамины (п =6)

АВР, с 45,7±1,3 48,7±1,6 46,2±2,2

АЧТВ, с 29,1±2,1 26,4±1,0 27,3+1,2

ПТИ, % 93,2±2,9 88,6±2,3 91,2±2,5

ФГ, г/л 3,7+0,2 3,6±0,5 3,9+0,4

ПДФ, мг% 21,2±0,7 27,9+0,8* 23,4+0,7

ЭТ, % 0,0 23,6±1,5 0,0

ТЦ, тыс/мкл 922±18 817+16* 912+17

Гемокоагуляционным сдвигам, вызываемым свинцом, сопутствует накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ, как в плазме, так и в ЭЦ наряду с укорочением ПИ и увеличением СО, а введение свинца на фоне витаминной комбинации не сопровождалось активацией ПОЛ.

Напротив, уровень вторичных продуктов пероксидации снизился против контрольного, несколько удлинился ПИ в плазме и упала СО в ЭЦ, т.е. имелись признаки роста антиоксидантного потенциала и ограничения интенсивности процессов ПОЛ.

Чтобы исключить эффекты, связанные с специфическими функциями витаминов, провели аналогичные наблюдения, заменив их синтетическим ан-тиоксидантом ДМ - 100 мг/100 г, доза, обеспечивающая высокий антиокси-дантный эффект без изменений свертываемости [С.Н.Ельдецова, 1990]. ДМ оказал на гемокоагуляцию такое же воздействие, как и комбинация витаминов: некоторое снижение интенсивности внутрисосудистого свертывания, выразившееся в небольшом удлинении АВР и снижении уровня ПДФ.

Состояние ПОЛ у этих же животных (табл. 3) изменилось почти идентично изменениям, вызванным комбинацией витаминов: снизилось содержание в плазме и эритроцитах продуктов ПОЛ, удлинился ПИ, и снизилась СО - появились признаки угнетения ПОЛ при росте антиоксидантного потенциала.

В очередном эксперименте сопоставили эффекты введения проокси-данта и ДМ одновременно и порознь. Из данных табл. 4 следует, что введение свинца вызвало рассогласование показателей общей свертывающей активности - удлинение АВР и укорочение АЧТВ (статистически не подтверждающиеся). Однако, как и в выше представленном эксперименте, эти изменения указывают на наклонность к ДВС, что подтвердило появление положительных ЭТ и прирост ПДФ, наряду со снижением тромбоцитемии. На фоне ДМ введение свинца не вызывало гемокоагуляционных сдвигов.

Таблица 3. Интенсивность ПОЛ и АО А липидов плазмы и ЭЦ на фоне 12-дневного приема ДМ (100 мг/100 г массы)

Исследуемые показатели Контроль (п=9) Опыт (п=7)

ДК, А/мг липидов 0,11±0,01 0,08 + 0,02*

0,11 ±0,01 0,04+0,01*

ТБК, ед/мг липидов 1,23±0,02 1,10+0,03*

14,8+0,7 1,89±0,02*

ПИ, мин/мл 14,8*0,7 29,9±7,1*

25,4±0,18 48,8+7, Г

СО, мм3/мл в мин 1,26±0,18 0,92±0,2Г

1,14±0,23 0,61 + 0,03*

Примечание: в первой строке - показатели в плазме, во второй - в эритроцитах.

Таблица 4. Гемокоагуляция у крыс, получавших ацетат свинца на фоне ДМ и без него в течение 12 дней

Показатели Интактные крысы (п=8) Крысы получали свинец (п=7) Крысы получали свинец и ДМ (п=6)

АВР, с 45,7+1,3 47,9±1,5 45,0±2,6

АЧТВ, с 29,1+2,1 25,9±1,1 27,3±1,2

ПТИ, % 93,2±2,9 87,8+2,0 9 6,2±2,7

ФГ, г/л 3,7±0,2 2,9±0,6 3,4±0,5

ПДФ, мг% 21,2±0,7 27,8±0,4* 21,9±0,6

ЭТ, % 0,0 22,5+1,4 0,0

ТЦ, тыс/мкл 922±18 807±16* 951±22

Гемокоагуляционные сдвиги, вызванные свинцом, сопровождались накоплением первичных и вторичных продуктов ПОЛ плазме и в ЭЦ при укорочении ПИ и увеличении СО. При введении свинца на фоне ДМ преобладает антиоксидантный эффект последнего - уменьшилась концентрация продуктов ПОЛ, увеличился ПИ и снизилась СО (табл. 5). Степень изменений очень близка к той, которую наблюдали при одновременном введении витаминов и свинца. Следовательно, ДМ влияет на гемокоагуляцию и ПОЛ в том же направлении и с той же интенсивностью, что и комбинация витаминов.

Итак, угнетение ПОЛ, проявляющееся снижением количества первичных и вторичных продуктов пероксидации и ростом антиоксидантного потенциала в плазме и ЭЦ, сопровождается снижением гемокоагуляционного потенциала. Активация процессов ПОЛ, ведущая к противоположным сдвигам в тех же объектах, сопровождается появлением признаков напряжения в гемостазе, характерным для ранних стадий ДВС крови. Одновременное введение прооксиданта и антиоксидантов (комбинации витаминов или ДМ) не приводит к существенным изменениям интенсивности ПОЛ и сдвигам в био-8 ________

химическом компоненте гемостаза. Это свидетельствует о наличии взаимосвязи между этими системами. Однако, какие из изменений первичны -процессы пероксидации или гемокоагуляционные сдвиги - неясно, хотя ранее и высказано предположение о двусторонней связи между ними [С.Н.Ельдецова, 1990]. Для приближения к ответу на поставленный вопрос мы изучали изменения ПОЛ при воздействии факторами, непосредственно активирующими образование тромбина.

Таблица 5. Состояние ПОЛ в плазме и ЭЦ при введении свинца на фоне ДМ и без него

Показатели Интактные Крысы получали Крысы получали

крысы (п=8) свинец (п=8) свинец и ДМ п—7)

ДК, А/мг ли- 0,12±0,02 0,41+0,03* 0,1410,01

пида 0,11±0,01 0,3010,02* 0,1110,01

ТБК, ед/мг 2,12±0,03 2,8910,04* 1,0110,01*

липида 1,27±0,01 5,110,11* 0,910,02*

ПИ, мин/мл 15,1±1,1 10,111,0* 24,211,3*

27,2±2,1 21,212,9* 31,2312,5

СО, мм3/мл в 1,29±0,2 3,510,11* 1,2310,2

мин 1,1110,2 2,910,09* 0,510,1*

Примечание: в первой строке - показатели в плазме, во второй - в эритроцитах.

Ускоренное тромбинообразования моделировали внутривенным введением взвеси ТП в дозе, не вызывающей гибель животных. Пробы отбирали через 60 мин, т.е. на высоте гемокоагуляционных изменений [В.Г.Соловьев, 1991, 1997].

Введение ТП привело к удлинению АВР в 1,8, а АЧТВ - в 3,5 раза, ПТИ снизился в 1,2 раза, уровень ФГ - в 3,8 раза, концентрация ПДФ увеличилась в 1,8 раза. Значительно уменьшилось количество ТЦ - в 2,5 раза. Таким образом, ТП вызвал явно выраженную гипокоагулемию потребления.

Результаты одновременно проводившегося определения интенсивности свободнорадикальных процессов приведены в табл. 6.

Как следует из приведенных в табл. 6 данных, введение ТП животным сопровождалось значительным укорочением ПИ и ростом СО липидов на фоне повышения количества вторичных продуктов ПОЛ в плазме и в ЭЦ.

Следовательно, тромбинемия сопровождается активацией ПОЛ и снижением АОА в тех же объектах, первичной активации ПОЛ в которых сопутствовал рост гемокоагуляционной активности.

В следующей серии опытов провоцировали эндогенную тромбинемию повторной кровопотерей: 1-й, 3-й и 7-й дни от момента комплектования группы вызывали кровопотерю в объеме 5, 7,5 и 7,5% от объема циркулирующей крови соответственно, на 8-й день брали пробы крови.

Таблица 6. Интенсивность ПОЛ и АОА липидов плазмы и ЭЦ через 1 ч после инъекции взвеси ТП

Исследуемые ТП не вводили Вводили ТП

показатели (п=10) (п=8)

ДК, А/мг липидов 0,04±0,01 0,07*0,01*

0,04±0,01 0,06±0,0Г

ТБК, ед/мг липидов 0,71 ± 0,06 1,40±0,08*

0,33±0,09 0,65±0,04*

ПИ, мин/мл 49,5±3,8 20,6± 2,3*

20,0± 1,6 26,6±8,0*

СО, мм3/мл в мин 0,76±0,07 2,02±0,25*

1,46±0,18 1,30±0,10

Примечание; 1-я строка - в плазме, 2-я - в эритроцитах.

Оказалось, что кровопотеря привела к удлинению АВР, снижению ПТИ, приросту содержания ПДФ и убыли числа ТЦ. Эти сдвиги характеризуют ДВС крови на грани II и III стадий (табл. 7).

Таблица 7. Гемокоагуляция у крыс после повторной кроволотери без витаминов

Исследуемые Интактный Кровопотеря

показатели контроль (п=6) (п=6)

АВР, с 32,8±0,6 38,0±0,6*

АЧТВ, с 24,1 ±0,9 26,0*0,6

ПТИ,% 101,6±2,5 81,0+2,2*

ФГ, г/п 3,6±0,5 3,2±0,8

ПДФ, мг% 21,2±2,0 28,1 ¿2,1*

ЭТ, % 0,0 0,0

ТЦ, тыс/мкл 967±21 775±19*

Изменения показателей состояния ПОЛ после повторной кропотери у животных были менее заметными, чем при экзогенной тромбинемии: повысилось количество вторичных продуктов пероксидации в плазме и сократился ПИ в ЭЦ. Тем не менее, активация тромбиногенеза и в этом случае сопровождалась активацией ПОЛ, причем, можно говорить об известном соответствии между степенью активации тромбиногенеза и степенью активации ПОЛ: после введения тромбина заметнее изменились показатели интенсивности ДВС (рост уровня ПДФ и снижение тромбоцитемии), те же показатели при повторном кровопускании изменились в меньшей мере.

Опыты с ограничением скорости тромбинообразования проведены на животных, которым внутримышечно вводили гепарин. Как видно из табл. 8, у них измененилась гемокоагуляция: снизились общая свертывающая активность, активность протромбинового комплекса и количество ПДФ.

Таблица 8. Гемокоагуляция у крыс через 1 ч после введения гепарина в дозе 0,6 мг/100 г

Показатели Введен растворитель (п=6) Введен гепарин (п=6)

АВР, с 33,9+0,8 71,0±0,7*

АЧТВ, с 25,2± 0,8 56,9±0,5*

ПТИ,% 91,9±2,2 61,0±2,Г

ФГ, г/л 3,9+0,5 3,7±0,7

ПДФ, мг% 18,7±2,1 14,5±2,0*

ЭТ, % 0,0 0,0

ТЦ, тыс/мкл 1007+22 975+18

Как следует из данных табл. 9, через 1 ч после внутримышечного введения гепарина выявились признаки ограничения скорости ПОЛ: уменьшилось в плазме содержание первичных, в плазме и ЭЦ - вторичных продуктов ПОЛ, удлинился ПИ в обоих объектах, уменьшилась СО в ЭЦ.

Таблица 9. Интенсивность ПОЛ и АОА плазмы и ЭЦ через 1 ч после введения гепарина (0,6 мг/100 г)

Исследуемые Введен растворитель Введен гепарин

показатели (п=6) (п=6)

ДК, А/мг липидов 0,07 + 0,01 0,04 + 0,01*

0,09±0,01 0,05+0,02

ТБК, ед/мг липидов 1,12±0,03 0,78±0,14*

1,42±0,05 1,02±0,06*

ПИ, мин/мл 13,9± 1,7 18,8± 1,2*

24,1 ± 2,1 32,1 + 0,9*

СО, мм3/мл в мин 1,24 + 0,16 1,01 + 0,03

2,05±0,21 1,66±0,04*

Примечание: 1-я строка - плазма, 2-я - ЭЦ

Если принять во внимание, что гепарин не обладает прямой антиокси-дантной активностью [С.Н.Ельдецова, 1990; В.Г.Соловьев, 1997], объяснить его эффект в организме можно в данном случае как косвенный - через ограничения процессов тромбиногенеза. Это наблюдение свидетельствует о том, что активация тромбиногенеза сопровождается активацией ПОЛ, угнетение тромбиногенеза - ограничением ПОЛ.

Выше показано, что антиоксидангы снижают эффекты прооксиданта прямого действия (свинца) на ПОЛ и гемокоагуляционные сдвиги. В связи с этим представлялось полезным оценить влияние антиоксидантов на сдвиги гемокоагуляции и ПОЛ при тромбинемии, провоцируемой введением ТП. Ускорение тромбинообразования моделировали внутривенным введением взвеси ТП в количествах, не вызывающих гибель животных (0,5 мл/100 г,

активность 22 с). Витамины вводили 12 дней в прежних дозах. На 13 день «невитаминизированным» и «витаминизированным» животным вводили ТП, интактному контролю - растворитель. Пробы брали через 0,5 и 1,0 ч.

Как следует из данных табл. 10, введение ТП животным вызвало значительное удлинение АВР и АЧТВ, снижение ПТИ, уровня ФГ и ТЦ, т.е. выраженную гипокоагулемию потребления, подтверждаемую высокой частотой положительной этаноловой пробы. Тромбинемия на фоне витаминов-антиоксидантов также сопровождалась гипокоагулемией потребления, но степень её заметно ниже. Сказанное относится к данным, полученным через 0,5 и 1,0 ч после инъекции ТП, хотя в последнем случае степень различий между интактным контролем и животными, которым ввели ТП на фоне витаминов, уже менее выражена.

У животных описываемой серии одновременно определяли и интенсивность свободнорадикальных процессов.

Таблица 10. Гемокоагуляция у крыс после инъекции взвеси ТП на фоне «витаминизации» и без нее

Показатели Контроль (ввели растворитель; п=12) Вводили ТП (п=12)

без витаминов на фоне витаминов

Через 0,5 ч

АВР, с 38,4± 0,6 68,6±0,4* 49,9± 0,4**

АЧТВ, с 29,9± 0,3 94,9± 1,3* 64,3±0,7**

ПТИ,% 95,1 + 0,8 77,0± 1,1* 92,2± 1,3**

ФГ, г/л 3,4±0,2 1,1±0,1* 1,5±0,2*

ПДФ, мг% 17,8± 1,8 22,7±0,6* 19,0±0,9

ЭТ, % 0,0 63,5* 22,5**

ТЦ, тыс/мкл 1002± 36 399 ±25* 628± 18°*

Через 1,0 ч

АВР, с 40,2±0,8 71,2±0,7* 64,1 ±2,4**

АЧТВ, с 29,1 ±0,3 57,8±0,7* 51,1±1,1**

ПТИ,% 98,7±0,9 55,5± 1,6* 48,9± 1,2*

ФГ, г/л 3,5±0,4 0,8±0,4* 1,1 ±0,6*

ПДФ, мг% 17,6±2,8 22,9±3,3 19,9±0,4**

ЭТ, % 0,0 75,5 55,5**

ТЦ, тыс/мкл 987±25 341±19* 772±23**

Примечание: знак «*» - отличие достоверно по отношению к контролю; «**» - к контро-

лю и к получавшим ТП без витаминов.

Введение ТП невитаминизированным животным сопровождалось значительным укорочением ПИ и ростом СО липидов на фоне повышения количества вторичных продуктов ПОЛ в плазме. В ЭЦ эти сдвиги менее значительны. На фоне «витаминизации» ПИ не изменился относительно контроля ни в плазме, ни в ЭЦ, а СО в плазме увеличилась в меньшей степени, что не сопровождалось изменением содержания вторичных продуктов ПОЛ. 12

Таким образом, вызываемые введением ТП сдвиги гемокоагуляции оказались ослабленными на фоне предварительного введения антиоксидантов, хотя последние, как показано выше, существенно на свертываемость не влияют. Это подтверждает связь гемокоагуляционных сдвигов с изменением скорости процессов ПОЛ: витамины ограничили интенсивность ПОЛ и это способствовало ограничению интенсивности гемокоагуляционных сдвигов, вызываемых ТП, который сам по себе, как показано ранее [С.Н.Ельдецова, 1990], на пероксидацию не влияет.

Совокупность рассмотренных данных - свидетельство двусторонней связи между ПОЛ и гемокоагуляцией: активация ПОЛ ведет к активации свертывания, активация свертывания сопровождается активацией ПОЛ. Следовательно, представление о существовании цикла «тромбинемия -> ПОЛ —» тромбинемия и т.д. оправдано.

Коагуляционная активность ТЦ при активации и угнетении свободнорадикаль-ных процессов. ТЦ являются одним из важных компонентов гемостаза, их участие в свертывании связано с одной из наиболее изученных функций ТЦ -агрегацией /АГ/. В ходе АГ развивается и реакция высвобождения /РВ/, обеспечивающая появление в кровотоке ряда факторов свертывания, из которых существенную роль в тромбинообразовании играют фф. Р3, Р4 и Рю-Для выяснения роли ТЦ в реализации эффектов тромбинемии на ПОЛ и процессов ПОЛ на гемокоагуляцию мы провели опыты, описанные ниже.

В первой серии экспериментов изучали АГ и РВ при угнетении процессов ПОЛ витаминами-антиоксидантами и ДМ. Оказалось, что АГ и высвобождение в плазму исследуемых факторов в равной мере ограничивалось предварительным введением витаминов или ДМ (табл. 11 и 12). Видимо, А А ТЦ падает при снижении интенсивности процессов ПОЛ в них. Следовательно, в дальнейшем мы можем воспользоваться для опытов с подавлением процессов ПОЛ витаминами или ДМ.

Таблица 11. Влияние витаминов-антиоксидантов и ДМ на процессы ПОЛ в ТЦ (введение в течение 12 дней, витамины в прежних дозах, ДМ - 0,1 г/100 г)

Показатели Контроль Витамины ДМ

ДК, А/мг 0,12±0,03 0,08+0,02* 0,07±0,03*

ТБК, ед/мг 0,54±0,06 0,32+0,03* 0,29±0,04*

ПИ, мин/мл 39,0±2,04 54,5+3,11* 57,4±3,13*

СО, м3/мл/мин 0,72+0,07 0,69±0,08 0,61±0,07*

Примечание: п=5, всего 15

В следующей серии опытов одновременно изучали АДФ АГ и РВ, наряду с оценкой эффективности ПОЛ в ТЦ при воздействии прооксидантом, прооксидантом на фоне антиоксидантов и ТП на фоне прооксиданта или на фоне антиоксидантов (см. табл. 13).

Таблица 12. АДФ-АГ ТЦ и уровень в плазме факторов Р3, Р4 и Р10 у крыс, получавших витамины или ДМ

Показатели Контроль Витамины ДМ

СА, % 5,8±0,42 4,9+0,33* 4,7+0,31*

МА, % 61 #9±3,1 52,3±2,Г 51,2+3,1*

Т, с 88,4+3,2 87,4+2,9 78,9±3,8

Т/2, с 21,0+1,2 19,3±1,1 18,9+1,6

а 4,9±0,08 4,1+0,03* 3,9±0,04*

Ф. Рз.% 89,9±4,1 79,9±3,9* 78,6±3,6*

Ф.Р4,с 2,9+0,03 2,3±0,02* 2,2±0,02*

Ф.Р10, нг/мл 8,9+0,11 7,1+0,15* 7,2±0,12*

Примечание: кровь тех же крыс, что и в табл. 11.

Таблица 13. Активность ПОЛ, АДФ АГ ТЦ, уровень фф. Р3, Р4 и Р10 в плазме после предварительных воздействий: прооксидантом, прооксидантом+анти-оксидантом, ТП на фоне прооксидант+антиоксидант и без антиоксиданта.

Показатели Контроль Свинец Свинец+ витамины Ввели ТП на фоне свинца

без витаминов на фоне витаминов

ДК, А/мг 0,12+0,03 0,19±0,02* 0,14+0,04 0,47+0,03* 0,34±0,03*

ТБК, ед/мг 0,54+0,06 0,69+0,03* 0,57+0,03 2,26+0,10* 1,85+0,02*

ПИ, мин/мл 50,0+3,04 41,2+2,1* 48,3±2,2 22,1+3,02* 34,1±3,09*

СО, мм3/мл в мин 0,72+0,0 7 1,03±0,02* 0,93±0,03 1,5+0,06* 0,99±0,05

СА, % 5,8±0,42 7,9+0,21* 5,7±0,32 14,9+1,1* 11,3±0,7*

МА, % 61,9+3,1 75,6+2,3* 63,4+2,2 87,2±4,2* 76,4±3,2

Т, с 88,4±3,2 76,1+2,9* 86,8±1,2 97,6+3,1* 91,2+3,1

Т/2, с 21,0+1,2 19,2±1,8 20,0+1,4 17,9±3,1 19,2+2,3

Тд а 4,9±0,08 6,3+1,0* 4,7+0,09 7,8+1,0* 6,5±0,6*

Ф. Рз,% 89,9+4,1 99,1±3,4* 88,1±4,0 112+4,7* 97,8+3,1*

Ф.Р4_с 2,9+0,03 3,4±0,01* 2,6±0,04 5,1+0,10* 4,3±0,07*

Ф.Р]0, нг/мл 8,9+0,11 11,2+0,13* 8,7+0,12 13,5+1,1* 11,9±0,9*

Примечание: п = 5, всего 25.

Введение прооксиданта сопровождалось активацией процессов ПОЛ в ТЦ, нарастанием их АА и усиленным высвобождением определявшихся факторов. Предварительное введение антиоксидантов устраняет эти эффекты свинца, следовательно, они связаны с пероксидацией. Введение ТП на фоне свинца в еще большей степени повышает интенсивность процессов ПОЛ, АГ ТЦ и РВ. Предварительное введение антиоксидантов смягчает эффект ТП, но не устраняет его полностью. Это подтверждает представление о том, что влияние ТП на ПОЛ не является прямым - он активирует этот процесс вторично через ускорение тромбиногенеза.

В итоге можно отметить, что эффект свинца как прооксиданта, суммируется с эффектом ТП, который также усиливает процессы ПОЛ в ТЦ. Если же животные предварительно получали витамины, то эффекты ТП, свинца или совокупного действия обоих на ПОЛ ограничиваются.

Далее мы выясняли связан ли эффект антиоксидантов с влиянием измененной под воздействием «витаминизации» плазмы. С этой целью плазму от «витаминизированных» крыс, разбавляли в 2 раза бестромбоцитной плазмой «невитаминизированных» крыс и, наоборот, - плазму «невитаминизирован-ных» крыс разбавляли в 2 раза освобожденной от ТЦ плазмой «витаминизированных» крыс. Затем определяли интенсивность АДФ АГ.

АГ у «витаминизированных» крыс была сниженной. Ее разбавление бестромбоцитной плазмой «невитаминизированных» крыс не изменило показателей. Не изменилась АГ и в плазме «невитаминизированных» крыс после разбавления ее бестромбоцитной плазмой «витаминизированных». Следовательно, изменения АГ ТЦ при «витаминизации» зависят от изменений в клетках, а не от изменения свойств плазмы.

По результатам экспериментов можно сделать заключение о связи между ростом АА ТЦ и интенсификацией РВ с одной стороны и активацией ПОЛ - с другой, а также предположить, что ограничение интенсивности ПОЛ - причина ослабления АА ТЦ.

В нашей лаборатории показано (А.Ш.Бышевский и др., 1996), что анти-агрегантный эффект АСК после предварительного введения антиоксидантов усиливается, что связано с угнетением в ТЦ ПОЛ. Поэтому можно ожидать ослабления эффекта АСК при активации ПОЛ, что мы проверили в эксперименте: 1-я группа крыс получала 12 дней ацетат свинца; 2-я - свинца не получала; 3-я - получала свинец и витамины. На 12 день всем крысам ввели АСК (15 мг/100 г) и через 24 ч взяли пробы крови, определяя АГ ТЦ и выход в плазму фф. Р3, Р4 и Р10, а также показатели ПОЛ.

Выяснилось, что введение АСК угнетало АГ, на фоне прооксиданта эффект АСК ослаблен по всем показателям, на фоне прооксиданта и антиоксидантов изменения такие же, как при введении только АСК (табл. 14).

Аналогично и в том же направлении изменились показатели высвобождения тромбоцитарных фф. 3, 4 и 10.

Следовательно, на фоне прооксиданта, который активирует ПОЛ, эффект АСК ослабляется (табл. 15).

При введении АСК на фоне прооксиданта и витаминов, когда эффект на ПОЛ сглаживается, АСК подавляет АГ в такой же степени, как у интакт-ных крыс (табл. 15).

На этом основании можно отметить, что рост АА ТЦ совпадает с ростом интенсивности ПОЛ: подавление процессов ПОЛ витаминами усиливает антиагрегантный эффект АСК, эффект АСК на фоне активации ПОЛ проок-сидантом ослабляется, эффект АСК на фоне прооксиданта, компенсируемого антиоксидантами, равен его эффекту при отсутствии про- и антиоксидантов.

Таблица 14. Влияние АСК на АГ и РВ ТЦ у крыс, получавших прооксидант на фоне витаминов и без них (п=5, всего 40)

Показатели Контроль Аспирин ввели Аспирин Аспирин на фо-

интактныи интактным на фоне не прооксидан-

крысам прооксиданта та и витаминов

С А, % 5,8±0,42 2,4+0,02* 2,8±0,05* 2,3±0,40

МА, % 61,9±3,4 29,3+2,4* 36,3±2,1 *+ 28,7±4,1

Тд а 4,9±0,08 2,9±0,06* 3,4±0,08*+ 2,6±0,09

Ф. Рз.% 85,2±3,2 71,1 ±4,1* 78,0+1,8* 83,4±2,3

Ф.Р4, с 3,1 ±0,02 2,2±0,08* 2,7±0,07*+ 2,9±0,03

Ф.РЮ, нг/мл 8,7+0,09 5,4±0,11 6,7±0,08*+ 7,9±0,05

Обозначения: * - достоверные отличия от контроля; знак 4- - при сравнении третьей

колонки со второй.

Таблица 15. Влияние АСК на ПОЛ в ТЦ «невитаминизированных» и «витаминизированных» крыс, получавших прооксидант

Показатели Контроль Аспирин ввели Аспирин Аспирин на фоне

интактныи интактным на фоне прооксиданта

крысам прооксиданта и витаминов

ДК, А/мг 0,15±0,02 0,08+0,03* 0,12+0,03 0,09±0,0Г

ТБК, ед/ мг 0,58±0,04 0,40±0,02* 0,52+0,03 0,42±0,03*

ПИ, мин/мл 51,3±2,10 59,9±2,4* 46,4±2,1 * 57,3+1,1 *

СО, мм3/мл 0,74±0,08 0,47±0,07* 0,81±0,07* 0,50±0,06*

в мин

Примечание: сравнение производится с контролем, кровь тех же крыс, что и в табл. 14.

Заканчивая эту часть работы, мы провели опыты с ДМ, противоокисли-тельное действие которого обусловлено синергическим влиянием на эффект природных антиоксидантов. Чтобы уточнить и количественно охарактеризовать зависимость агрегационной и высвобождающей активности ТЦ от их антиокислительного потенциала провели опыты с разными нагрузками ДМ.

Найдено, что с увеличением дозы антиоксиданта падает уровень продуктов ПОЛ в клетках и их АГ, в плазме снижается уровень определяемых факторов: чем ниже интенсивность ПОЛ и выше антиокислительный потенциал, тем заметнее снижены спонтанная и АДФ-АГ и ослаблена РВ (рис. 1).

Показатель степени снижения уровня ДК нарастает при увеличении дозы ДМ. Параллельно увеличивается степень изменения ПИ. В том же направлении изменяется степень отклонения от контроля показателей АА ТЦ (спонтанная и АФД-АГ).

Следовательно, взаимосвязь между процессами ПОЛ в ТЦ и степенью их АГ можно охарактеризовать как концентрационнозависимую - рост концентрации продуктов ПОЛ сопровождается ростом АА ТЦ. То же относится

и к изменениям РВ: чем выше доза ДМ, тем менее выражено высвобождение ТЦ в плазму факторов 3, 4 и 10.

100г

СА МА

Рисунок 1. Степень отклонения уровня диеновых конъюгатов (ДК), периода индукции (ПИ), спонтанной агрегации (СА) и максимальной агрегации (МА) от контрольных значений, принятых за 100%, в зависимости от дозы димефосфона; ДФ - ДМ в дозах 100, 150 и 200 - дозы в мг/100 г.

Видимо, рост антиоксидантного потенциала в ТЦ способствует снижению АГ и РВ. Эти же функции активируются при введении прооксиданта, усиливающего ПОЛ и снижающего антиоксидантный потенциал, а также при введении ТП, ускоряющего тромбиногенез, следовательно, и ПОЛ. Роль ЭЦ в реализации связи между ПОЛ и гемокоагуляцией. Чтобы установить, связан ли эффект витаминов на ТЦ с их влиянием на свойства ЭЦ, регистрировали АДФ АГ ТЦ крыс в присутствии ЭЦ по схеме: субстратную (богатую ТЦ) плазму интактных крыс делили на 2 порции; добавляли к одной порции разные количества ЭЦ в конечной концентрации - 6,0, 3,0 или 1,5 млн. клеток/мкл (примерно, 1/2 и 1/4 физиологической концентрации [И.М.Трахтенберг и др., 1978]); к другой порции плазмы добавляли 0,14 М раствора NaCI (контроль активности ТЦ).

После 30-минутной экспозиции обеих порций плазмы ЭЦ отделяли центрифугированием при скорости, не вызывающей осаждения ТЦ. Затем определяли АГ и содержание фф. Р3, Р4 и Р]0 в надосадке из контрольных и преинкубированных с ЭЦ проб. Экспозиция субстратной плазмы с «контрольными» ЭЦ усиливает АДФ АГ пропорционально концентрации ЭЦ в инкубируемой смеси. Экспозиция с ЭЦ крыс, получавших ДМ, приводит к меньшим сдвигам в том же направлении при всех конечных концентрациях ЭЦ. Усилению способности к АГ, вызываемому ЭЦ, сопутствует более интенсивная РВ, особенно факторов Р3 и Р4.

Экспозиция с субстратной плазмой ЭЦ крыс, получивших ДМ, усилила высвобождение факторов Р3 и Р4 в меньшей степени. На высвобождении ф. Р10 в равной мере отразились ЭЦ тех и других крыс. Следовательно, ЭЦ активируют АГ ТЦ при концентрациях: 1) близкой к физиологической (6,0-7,5 млн/мкл и 2) составляющей 1 /2 от физиологической.

Зависимость между концентрацией ЭЦ, преинкубируемых с ТЦ, и их влиянием на АГ представлена графически (рис. 2)

90 у ~~

80 --

Рисунок 2. Зависимость максимальной агрегации от экспозиции плазмы с эритроцитами: ЭН - ЭЦ крыс, не получавших ДМ, ЭП - получавших его, БЭ -без эритроцитов (контроль). Абсцисса - концентрация эритроцитов, млн. клеток/мкл.

Характерны и графики, характеризующие высвобождение фф. Р3 и Р4 в плазму при инкубации с ЭЦ (рис. 3). Здесь отмечается та же закономерность, которая выявлена при графическом анализе изменений МА: с увеличением концентрации эритроцитов нарастает интенсивность сдвигов.

140-]

120-

100-

г

80-

60-

40-

X-

20-

0-

----о*---■й'-.....О

, А—

. -д

-х-

.. - • -X

- -0- Р-3 (ЭН

- - о - РЗ (ЭП)

--Д-- Р-4 (ЭН

- -х - Р-4 (ЭП

о

1,5

3

Рисунок 3. Высвобождение факторов Р3 и Р4 при экспозиции с эритроцитами контрольных (не получавших ДМ - ЭН) и получавших его (ЭП) крыс в зависимости от концентрации эритроцитов в млн/мкл (абсцисса).

Таким образом, рост АА ТЦ при экспозиции плазмы с ЭЦ, сопровождается усилением реакции РВ. Этот эффект ЭЦ растет при увеличении их концентрации до известного предела, характеризуясь динамикой насыщения. Предварительное повышение антиоксидантного потенциала у животных снижает проагрегантную активность ЭЦ и их способность активировать реакцию РВ.

ЭЦ - носители неполного ТП [Б.И.Кузник, В.П.Скипетров, 1974]. Нас заинтересовала зависимость их тромбопластической активности /ТПА/ от ан-18

тиоксидантного потенциала, что мы пытались выяснить в нижеописанных экспериментах.

В одной серии опытов из четырех идентичных групп крыс, 1-я служила контрольной, 2-я, 3-я и 4-я группы получали ДМ по 100, 150 и 200 мг/100 г массы тела. На 13-й день у всех крыс получали кровь, выделяли ЭЦ, определяли их ТПА.

Данные показали, что ТПА ЭЦ контрольных крыс мала и близка к найденной ранее тем же приемом [В.Г.Соловьев, 1991]. Еще ниже ТПА ЭЦ после введения ДМ (рис. 4).

Рисунок 4. Степень снижения тромбопластической активности ЭЦ в зависимости от дозы ДМ: абсцисса - ДМ, ордината - степень снижения, %.

В другой серии опытов использован тот же контроль (1-я группа крыс), а животные 2-й группы получали ацетат свинца, а животные 3-й группы, кроме свинца еще и ДМ в течение 12 дней. На 13-й день исследовали ТПА ЭЦ.

Из данных табл. 16 следует, что прооксидант увеличил ТПА ЭЦ, а также то, что эффект прооксиданта обусловлен активацией ПОЛ, поскольку ДМ предупреждает изменение этого процесса в ЭЦ.

Таблица 16. ТПА ЭЦ крыс, получавших прооксидант (ацетат свинца) на фоне ДМ (100 мг/100 г) и без него (п=6, всего 12)

100 wr/100 г

150 мг/100 г

200МГ/100 г

Условия опыта ТПА эритроцитов, Е А/ мл Отклонение от контроля, %

Контроль 3787149 -

Вводили свинец 4799+51* 27

Вводили свинец и ДМ 4002±47 5,6

Таким образом, ЭЦ могут рассматриваться как клетки, участвующие в реализации связи между процессами ПОЛ и гемостатическим потенциалом. Реализуют ЭЦ эту связь за счет повышения способности активировать ТЦ, что ведет к росту АГ ТЦ и ускоренному высвобождению ими прокоагулян-

тов, а также за счет повышения роли ТЦ в тромбиногенезе по внутреннему механизму (в качестве неполного ТП).

Изучение роли ГШ в реализации связи между ПОЛ и гемокоагуляцией■ В опытах первой серии этой части работы нейтрофильные ЛЦ выделяли из плазмы контрольных животных и животных, получавших в течение 12 дней ДМ (100 мг/100 г). Отмытые клетки суспендировали в 0,1 М растворе NaCI (конечная концентрация нейтрофилов составляла 6,0, 3,0 и 1,5 тыс. кле-ток/мкл).

Обнаружено, что при экспозиции с нейтрофилами АГ ТЦ в субстратной плазме усиливается концентрационнозависимо: при росте концентрации нейтрофилов от минимально использованной до превышающей ее в 4 раза, их воздействие на АГ увеличивается.

Высвобождение в процессе АДФ АГ фф. Р3, Р4 и Рю изменялось при инкубации с нейтрофилами аналогично: нейтрофилы контрольных крыс увеличивали выход в плазму этих факторов, нейтрофилы крыс, получавших ДМ, повышали высвобождение в заметно меньшей мере (рис. 5).

180 х

—с> — Р-З(НДФ)

- о - Р-3(ДФ)

Р-4 (НДФ)

— -X — Р-4(ДФ)

—ж— Р-М(НДФ)

о Р-Ю(ДФ)

Рисунок 5. Высвобождение фф. Р3, Р4 и Р(о при экспозиции с нейтрофилами крыс, получавших ДМ (ДФ) и контрольных (НДФ) крыс. Абсцисса - концентрация нейтрофилов, тыс клеток/мкл.

Из данных, приведенных в табл. 17, следует, что при инкубации ТЦ в смеси с клетками фракции лимфоциты+моноциты контрольных крыс, активность АГ увеличилась на 72%, а в смеси с клетками крыс, получавших ДМ, - на 27%. При уменьшенной в 2 раза концентрации клеток, активация АГ составила 57% для клеток контрольных крыс и 14% для клеток крыс, получавших ДМ. При концентрации исследуемых клеток, составляющей 1 /4 от максимальной - соответственно 14 и 0,0%.

Таким образом, фракция лимфоциты+моноциты контрольных крыс в концентрации, близкой к физиологической, оказывает высокий проагрегант-ный эффект на ТЦ. Те же клетки крови крыс, получавших ДМ, менее активны как стимуляторы АДФ АГ ТЦ. Аналогичным образом меняется в присутствии исследуемой фракции клеток РВ: после контакта клеток исследуемой фракции с ТЦ уровень свободных фф. Р3 и Р4 заметно увеличивается в за-

висимости от концентрации клеток, что менее выражено в присутствии клеток крыс, получавших ДМ. Лишь высвобождение фактора Рю существенно не изменилось в присутствии наибольшей концентрации клеток от сравниваемых групп животных, и совсем не изменилось при меньших концентрациях.

Таблица 17. АДФ АГ ТЦ (максимальная), содержание в плазме фф. Р3, Р4 и Р,0 после ее экспозиции с клетками фракции лимфоциты+моноциты из плазмы контрольных и получавших ДМ крыс (п=5, всего 25 крыс)

Показатель Контроль Экспонировали с фракцией лимфоци-

(без клеток) ты+моноциты от крыс:

неполучавших ДМ получавших

ДМ

МА,% 56,9±3,1 98,1+3,3* 77,2±4,1"

87,3±2,4* 65,2±3,0"

61,0±2,3* 52,8±2,3

90,2±3,1 108+6,2* 97±2,9"

Ф. Рз% 99±2,3* 89,1±3,2

91,2±2,3 92,4±2,3

2,8± 0,04 6,7+0,01* 3,3+0,01"

Ф.Р4с 5,4+0,03* 2,9±0,04

4,0±0,03* 2,8+0,03

9,1± 0,20 13,8+0,11* 9,8+0,05"

Ф.Р10 10,8+0,13 8,7+0,09

нг/мл 8,9+0,14 8,9+0,19

Примечание: в 1-й, 2-й и 3-й строках данные, полученные в плазме, экспонированной с фракцией лимфоциты+моноциты в концентрации (по лимфоцитам) 2,5, 1,25 и 0,75 тыс. клеток/мкл (соответственно близкая к физиологической, 1/2 и 1 /4 от нее).

Ввиду невозможности получить фракцию лимфоцитов, свободную от моноцитов, для дифференциации эффекта моноцитов и лимфоцитов мы изучали влияние на АГ: 1) разных концентраций моноцитов, полученных в изолированном виде с чистотой 87,8%; 2) фракции лимфоциты+моноциты и фракции моноциты, к которой добавляли фракцию лимфоциты+моноциты в таком объеме, чтобы концентрация моноцитов стала равной одной из испытанных в индивидуальном виде.

Как и ранее, одновременно изучали клетки животных неполучавших и получавших ДМ в течение 12 дней с отбором проб крови на 13-й день. В этой серии экспериментов контролировали только МА (табл. 18).

Проагрегантная активность фракции лимфоциты+моноциты оказалась в этом эксперименте близкой к найденной прежде. Примерно в такой же степени повлияло на показатели введение ДМ.

Таблица 18. АДФ-АГ ТЦ (МА, %) после инкубации субстратной плазмы с моноцитами, фракцией лимфоциты+моноциты, смеси моноцитов с этой фракцией. Конечная концентрация клеток - 1/4, 1/6 и 1/8 от физиологической (в смесях - по лимфоцитам) (п=6, всего 42)

Контроль Экспозиция клеток крыс:

(без клеток) Неполучавших димефосфона Получавших ДМ

моноциты

53,9±1,7 86,7±3,3(61 )* 71,0±3,0(32)*"

77,1±2,0(43)* 60,9,0+2,3(13)*"

67,7+2,2(26)* 57,4±1,4(6,0)*"

лимфоциты+моноциты в соотношении 2:1

57,0±2,1 78,9±2,5(38)* 67,9+3,2(19)*"

72,0+2,3(26)* 64,5+1.4(16)*"

63,312,7(11) 56,2±1,3(0)

лимфоциты+моноциты 4:1

55,9+1,3 79,7+2,4(42)* 71,0+3,2(27)*"

72,8+2,0(30)* 64,9+1.3(16)*"

62,0±2,7(11)+ 61,9±2,3(0)

Примечание: знак * - сравнение с контролем, знак*" "сравнение 3-й колонки со 2-й.

Прирост доли лимфоцитов при прежних концентрациях моноцитов не изменил проагрегантной активности смеси лимфоциты+моноциты, как у контрольных, так и у получавших антиоксидант крыс.

Наиболее существенно то, что проагрегантный эффект инкубации субстратной плазмы со смесью лимфоциты+моноциты не нарастает при увеличении в смеси доли лимфоцитов и постоянной концентрации моноцитов. На основании этих данных мы можем полагать, что ответственны за проагрегантный эффект смеси моноциты, а не лимфоциты.

Применявшиеся приемы позволили выделить из фракции гранулоцитов эозинофилы с чистотой (91%). Фракцию использовали для изучения влияния эозинофилов на АА ТЦ. При наибольшей, и, естественно, при меньших концентрациях не было выявлено изменений АГ ТЦ. Далее, изучили эффект эозинофилов на АГ ТЦ, используя концентрацию, превышающую физиологическую в 2 раза. Однако и эта концентрация не сказалась на АА ТЦ.

Видимо, эозинофильные клетки крови не относятся к факторам, контролирующим АА ТЦ. В связи с этим эозинофилы, как и лимфоциты, нами в дальнейшем не изучались.

В очередной серии исследований, мы на большой партии животных одновременно изучали способность всех перечисленных клеток активировать ТЦ. Подход был таким: в субстратную плазму вносили клетки (ЭЦ, нейтро-филы или моноциты). В связи с этим ТЦ преинкубировали с убывающим количеством клеток данной популяции (в долях от физиологической), определяя ту наименьшую, при которой еще выявляются проагрегантные свойства.

На рис. 6 диаграмма иллюстрирует влияние клеток в физиологической и уменьшенной (в 2, 4, 6 и 8 раз) концентрации на МА 120 -i

100-

Рисунок 6. АГ тромбоцитов (МА, в % - ордината) после инкубации с эритроцитами (Э), нейтрофилами (Н), моноцитами (М) в физиологической (1), 1/2 (2), 1/4 (3), \/6 (4) и 1/8 (5) от нее концентрации. К - МА в контроле.

Наибольшей проагрегантной активностью обладают моноциты, затем нейтрофилы и ЭЦ. При снижении концентрации клеток в 2 раза от физиологической, проагрегантная активность моноцитов и ЭЦ не изменяется. При разведении в 4 раза активность сохраняют моноциты, они же обнаруживают активность и при снижении концентрации в 6 раз. По влиянию на высвобождение ф. Р3 первое место занимают нейтрофилы, второе - ЭЦ, третье -моноциты. Этот эффект клеток не выявляется уже при снижении концентрации в 4 раза (рис. 7).

э н и к

Рисунок 7. Высвобождение тромбоцитами ф. Р3 после инкубации с эритроцитами (Э), нейтрофилами (Н), моноцитами (М) в физиологической (1), 1/2 (2), 1 /4 (3), 1 /6 (4) и 1/8 (5) от нее концентрации. К - контроль.

На следующей диаграмме (рис.8) сопоставлено влияние клеток на способность ТЦ высвобождать ф. Р^.

Физиологические концентрации всех исследованных клеток в равной мере активируют высвобождение ф. Р4, а при уменьшенной в 2 раза концентрации наиболее высокую способность высвобождать этот фактор со-

храняют нейтрофилы, при снижении концентрации в 4 раза это свойственно только ЭЦ и в меньшей степени моноцитам. Следовательно, клетки крови, оказывающие влияние на активность ТЦ по разному относятся к разведению, однако все они в физиологических концентрациях активируют ТЦ.

Рисунок 8. Высвобождение тромбоцитами ф. Р4 после инкубации с эритроцитами (Э), нейтрофилами (Н), моноцитами (М) в физиологической (1), 1/2 (2), 1 /4 (3), 1 /6 (4) и 1 /8 (5) от нее концентрации. К - контроль.

Наибольший интерес представляет способность физиологических концентраций клеток модифицировать активность ТЦ. В связи с этим мы приводим диаграммы, характеризующие эффекты только этих концентраций -они более наглядны.

Как следует из диаграммы (рис. 9), проагрегационная способность в этом случае такова: моноциты>нейтрофилы>ЭЦ.

80 70 Б0 50 40 -30 20 -10 ■ О

л (

-1 Ч^

яша

1 (

Эритроциты

Нейтрофилы

Моноциты

Рисунок 9. Прирост (в %) проагрегантной активности тромбоцитов (МА) под влиянием разных клеток в физиологической концентрации.

Способность же усиливать реакцию высвобождения ф, Р3 наибольшая у нейтрофилов, наименьшая - у моноцитов (рис. 10).

Как следует из диаграммы на рис. 11, выход ф. Р4 с наибольшей интенсивностью стимулируют нейтрофилы, затем моноциты и существенно слабее - ЭЦ.

Стимулирующий эффект нейтрофилов оказался наиболее выражен и в отношении ф. Р10 (рис. 12).

Чтобы установить, является ли активация ТЦ другими клетками крови результатом суммации их эффектов или следствием взаимоусиления (или взаимоторможения), мы провели эксперименты, в которых ТЦ экспониро-

вали в субстратной плазме с ЭЦ, нейтрофилами или моноцитами (физиологическая, уменьшенная в 2 и 4 раза концентрации), определяя после отделения клеток агрегационную и «высвобождающую» активность ТЦ.

180-1 160140120 100806040 200

йшй

ЩШ §Ш >ЩШ Л

Эритроциты

Нейтрофилы

Моноциты

Рисунок Ю. Способность физиологических концентраций разных клеток активировать высвобождение ф. РЗ (прирост выхода в %).

165 160 ■ 155 -150 -145 140

ífi^S

i''*'-,,

Эритроциты

Нейтрофилы

Моноциты

Рисунок 11. Способность физиологических концентраций клеток активировать высвобождение ф. Р4 (прирост выхода в %).

80 70 -60 -50 40 3020100

§111

шкш

гщтг

Эритроциты

Нейтрофилы

Моноциты

Рисунок 12. Способность физиологических концентраций клеток активировать высвобождение ф. Р10 (прирост выхода в %).

Из данных табл. 19 видно, что МА при экспонировании ТЦ со смесью клеток в физиологической, уменьшенной в 2 и 4 раза концентрации достигала предельных значений. Видимо, 2-3% ТЦ рефрактерны, поэтому и МА не достигает 100%. Поэтому при использовании таких концентраций нельзя судить о характере суммации эффектов разных клеток на АГ. При концентрации смеси в 1/6 и 1/8 от физиологического значения МА ниже предельного. Это позволяет выявить имеет ли место простая суммация эффектов, или другие механизмы их одновременного действия. Так, при разведении клеток 1 /6 смесь повысила МА на 37%, в то время как ЭЦ, взятые от-

дельно, не изменили достоверно этого показателя, а моноциты изменили его на столько же процентов. Видимо, в этой зоне концентраций проявляется проагрегантный эффект только моноцитов, усиленный присутствием других клеток, которые в индивидуальном виде при таких концентрациях влияния на АГ ТЦ уже не оказывали. То же относится и к концентрации смеси, составляющей 1/8 от физиологической.

Таблица 19. Активность ТЦ после инкубации со смесью ЭЦ+нейтрофильН-моноциты (1, 2, 3, 4 и 5-я строки - соответственно физиологическая концентрация, 1 /2 и 1/4, 1/6 и 1 /8 от физиологической).

Показатели ТЦ преинку /бировали

с растворителем (контроль) Со смесью клеток

МА,% 56,3±2,1 97,2±3,Г 98,2±2,2* 97,9±3,1* 88,7+1,9* 83,1 ±2,4*

Ф.Р3, % 92,8±2,8 159±4,8* 134+7,1* 121±6,1* 93,8+4,3 92,1 ±6,2

Ф.Р4, с 2,7±0,03 18,0±0,11* 12,2+0,10* 9,3±0,08* 2,9+0,02 3,0±0,03

Ф. Р10, нг/мл 8,9±0,02 23,1±0,15* 17,9+0,12* 9,0+0,11 8,8+0,10

Примечание: контроль использован из данных табл.18, (п=10).

После контакта со смесью клеток высвобождение ф. Р3 увеличилось против контроля на 71, 44 и 30% при концентрации клеток физиологической, 1 /2 и 1 /4 от нее соответственно. Взятые порознь ЭЦ при соответствующих концентрациях усилили высвобождение ф. Р3 на 44, 31 и 17%, ней-трофилы - на 75, 19 и 0,0%, моноциты - на 18, 7 и 0,0%.

Сопоставляя эффекты клеток, исследованных порознь и совместно, обнаруживаем наличие их далеко неполной суммации при физиологической концентрации - проявляется эффект, свойственный наиболее сильным «вы-свободителям» - моноцитам или ЭЦ. То же относится и к уменьшенным

концентрациям. Примерно то же показал и анализ совместного действия клеток на высвобождение факторов Р4 и Р1().

Подводя этапный итог результатов наблюдений, отметим: 1. Введение животным комбинации витаминов-антиоксидантов или ДМ, снижает АА ТЦ и ослабляет высвобождение в плазму при АДФ АГ фф. Р3, Р4 и Р10. 2. Угнетение антиоксидантного потенциала введением прооксиданта, повышает АГ и РВ. 3. Одновременное введение про- и антиоксидантов, в дозах, взаимно нивелирующих сдвиги ПОЛ, предупреждает описанные изменения. В конечном счете, рост активности ТЦ сопутствует активации ПОЛ. 4. Экспозиция ЭЦ, нейтрофипов или моноцитов в субстратной плазме усиливает АДФ АГ ТЦ и РВ. 5. Лимфоциты, видимо, не обладают проагрегантными (по отношению к ТЦ) свойствами. Эозинофилы в виде индивидуальной фракции при экспозиции с субстратной плазмой не влияют на АДФ АГ ТЦ в ней.

Видимо, ТЦ - важное звено в связи ПОЛ-гемостаз (ПОЛ—»активация ТЦ—»гемостаз), другие клетки (ЭЦ, нейтрофилы, моноциты) - звено в цепи ПОЛ - активация ТЦ - гемостаз (ПОЛ-»ЭЩ-ЛЦ->ТЦ-> гемостаз). К механизму активации ТЦ ЭЦ и ЛЦ. В этих опытах использованы ЭЦ и ЛЦ контрольных и получавших ДМ крыс (12 дней, 100 мг/100 г в день). На '13-й день выделяли клетки, экспонировали их в малом объеме 0,14 М забуфе-ренного раствора ЫаС1, рН 7,3. Конечная концентрация клеток - 1/2 от физиологической. После экспозиции клетки отделяли (центрифугирование) и изучали влияние надосадочной жидкости на АДФ АГ и РВ ТЦ. В табл. 20 представлены результаты этих опытов.

Таблица 20. МА ТЦ в присутствии жидкости, в которой экспонировали клетки крови (п=5, всего 30).

Показатель Контроль - клетки преинкубированы Эффект супернатанта после экспозиции с эритроцитами от:

в растворителе контрольных крыс крыс, получавших ДМ

МА,% 59,3±2,6 76,0±2,1* 72,1 ±2,1 *

Эффект супернатанта после экспозиции с ней-трофилами от:

контрольных крыс крыс, получавших ДМ

МА,% 59,3±2,6 69,1+1,1* 64,9+0,8*

Эффект супернатанта после экспозиции с фракцией лимфоциты+моноциты от:

контрольных крыс крыс, получавших ДМ

МА,% 59,3±2,6 79,0+1,2* 65,9+1,3*

Сопоставляя данные табл. 20 с полученными при изучении влияния клеток на МА, не обнаруживаем заметных отличий между изменениями МА, вызванными экспозицией со средой, в которой экспонировали клетки. Некоторое статистически недостоверное уменьшение эффекта может быть связано с потерями вещества, опосредующего влияние клеток на ТЦ.

В табл. 21, представлены данные, характеризующие высвобождение фф. Р3 и Р4 в том же эксперименте.

Таблица 21. Высвобождение фф. Р3 и Рд ТЦ в присутствии жидкости, в которой экспонировали клетки крови (п=5, всего 30).

Показатель Контроль - клетки преинкубированы Эффект супернатанта после экспозиции с эритроцитами от:

в растворителе: контрольных крыс крыс, получавших ДМ

Ф.Р3, % 88,2+4,1 117+4,2* 97±3,2*

Ф.Р4. с 2,8+0,03 4,8±0,06* 3,8±0,05*

Эффект супернатанта после экспозиции с ней-трофилами от:

контрольных крыс крыс, получавших ДМ

Ф.Р3, % 88,2±4,1 108+3,1* 98,1±2,8*

Ф.Р4, с 2,8+0,03 5,4±0,04* 4,6±0,03*

Эффект супернатанта после экспозиции с фракцией лимфоциты+моноциты от:

контрольных крыс крыс, получавших ДМ

Ф.Р3, % 88,2±4,1 99,9±3,1* 89,1±3,3*

Ф.Р4, с 2,8±0,03 5,4±0,02* 4,3±0,02*

Здесь видно, что интенсивность высвобождения фф. 3 и 4 близка к той, которая наблюдалась ранее после преинкубации субстратной плазмы с ТЦ. Как и ранее, эффект клеток крови крыс, получивших ДМ, уменьшен.

Тот факт, что проагрегантная активность среды, в которой преинкуби-ровались клетки, ниже в случае, когда клетки брали у животных, получавших ДМ, мы рассматриваем как указание на возможную роль в реализации проагрегантной активности продуктов пероксидации. На выяснение такой возможности и направлен следующий эксперимент.

При выполнении этой части работы в первой серии исследований крыс разделили на 3 группы: 1-я группа дополнений к рациону не получала; 2-я группа, включавшая 3 подгруппы, - получала ДМ (по 100, 200 или 300 мг/100 г); 3-я группа, включавшая 2 подгруппы, получала ацетат свинца (по 5 или 10 мг/100 г).

На 13-й день брали пробы крови, центрифугировали (800 д 10 мин), плазму переносили в центрифужный патрон и повторно центрифугировали (1 400 д, 20 мин), бесклеточный надосадок использовали в опытах для определения продуктов ПОЛ и изучали его влияние на АДФ АГ.

Из полученных данных следует, что: 1) добавление растворителя дало обычные значения МА ТЦ; 2) бесклеточная плазма подопытных крыс содержит продукты ПОЛ в количестве, пропорциональном дозе полученного крысами антиоксиданта (ДМ) или прооксиданта (свинца), - в первом случае рост уровня, во втором - снижение; 3) влияние бесклеточной плазмы на АГ пропорционально концентрации продуктов ПОЛ в ней.

Во второй серии исследований мы уточняли зависимость проагрегантно-го эффекта и РВ от концентрации продуктов ПОЛ. Кровь трех крыс, которым 20 дней вводили прооксидант (10 мг ацетата свинца/100 г ежедневно), объединяли. В бесклеточной плазме пулированной крови обнаружена высокая концентрация ДК (2,21+0,001 А/мг липида) и ТБК-активных продуктов (1,32+0,0005 ед./мг липида).

Продукты ПОЛ сконцентрировали с помощью сефадекса G-10 без заметных потерь. Далее приготовили разведения в 2, 3, 4 и 6 раз, содержащие ДК и ТБК-активные продукты соответственно в концентрациях: 3,08 и 2,04; 1,54 и 1,02; 1,26 и 0,68; 0,77 и 0,51; 0,51 и 0,34 А/мг липида и ед./мг липида.

Каждое разведение в равных объемах экспонировали с субстратной плазмой, после чего определили АДФ АГ и выход в плазму факторов Р3, Р4 и Р,„. Контроль (концентрация продуктов ПОЛ=0,0) - экспозиция с субстратной плазмой равного объема забуференного 0,14 М раствора NaCI).

Результаты представлены графически (рисунки 13 и 14).

100

60 $ 40 -■ 20 -■ о

-О- - -2

0,5

0,33

0,25

0,16

Рисунок 13. Зависимость максимальной АДФ АГ от концентрации продуктов ПОЛ.

Абсцисса - концентрация продуктов ПОЛ: за единицу принята концентрация ДК - 3,08 А/мг липида + ТБК - 2,04 ед./мг липида (исходная), 0,5 и далее - доля исходной концентрации. Ордината - МА,%; 1 - кривая МА при разных концентрациях ПОЛ, 2 - кривая МА при физиологическом содержании ПОЛ.

140 и

0 0,16 0,25 0,33 0,5 1

Рисунок 14. Зависимость высвобождения фф. Р3 и Р4 после АДФ-агрегации от концентрации продуктов ПОЛ. Абсцисса - концентрация продуктов ПОЛ: 1 - (ДК - 3,08 А/мг липида -+ ТБК - 2,04 ед./мг липида), 0,5 и далее - доля исходной концентрации. Ордината - содержание факторов в плазме.

1

Здесь видно, что МА ТЦ пропорциональна концентрации продуктов "ПОЛ в исследованной плазме. В области малых концентраций зависимость менее выражена, при превышении физиологических концентраций продуктов ПОЛ кривая уплощается, следовательно, существует возможность насыщения продуктами ПОЛ по отношению к проагрегантной активности.

На рис. 14 приведены результаты определения в плазме фф. Р3 и Р4 после АДФ АГ ТЦ. Здесь, как и в случае с АГ, заметно, что по мере увеличения концентрации продуктов ПОЛ степень высвобождения факторов увеличивается, особенно фактора Р3.

В итоге выявлена пропорциональность между концентрацией продуктов ПОЛ в среде и активацией ТЦ, т.е. ростом АА и интенсификацией РВ. Отметим также, что изменениям АА во всех описанных ранее опытах, в том числе и в последнем, сопутствуют изменения интенсивности РВ.

ЛЦ могут выделять в окружение протеазы с проагрегантной активностью [Schärpe et al., 1991]. В нашем случае мы исключили их присутствие, пользуясь наблюдениями А.А.Вакулина [1998], однако следовало выявить, высвобождают ли ЭЦ и ЛЦ продукты ПОЛ, обусловливающие ту или иную интенсивность АГ и РВ ТЦ. В очередной серии экспериментов группа 1-я (контроль) добавок не получала, 2-я - получала в течение 12 дней ацетат свинца, 3-я - ДМ. На 13-й день брали кровь, выделяли клетки из 0,5 мл плазмы и инкубировали в забуференном физиологическом растворе хлорида натрия (0,5 мл) в течение 30 мин, затем в среде определяли первичные и вторичные продукты ПОЛ при физиологической концентрации клеток.

Таблица 22. Содержание продуктов ПОЛ в забуференном 0,14 М растворе №С1 после инкубации в нем клеток крови в (30 мин).

Продукты ПОЛ В забуференном 0,14 М растворе NaCI инкубировали:

ЭЦ нейтрофилы Моноциты

ДК, А/мг липида 0,13+0,02 0,0810,01 0,2510,04

0,29+0,04* 0,1410,02* 0,9110,07*

0,07±0,02* 0,04+0,006* 0,13+0,02*

ТБК, ед/мг липида 2,21±0,04 2,0110,03 2,8910,06

3,48+0,07* 2,9310,05* 4,0110,10*

1,7110,03* 1,5810,03* 1,9810,04*

Примечание: 1-я строка - крысы контрольные, 2-я - крысы получали ацетат свинца, 3-я -ДМ, п=5, всего 15.

Из данных табл. 22 видно, что все клетки высвободили продукты ПОЛ: моноциты>эритроциты>нейтрофилы. Количество этих продуктов выше при инкубации клеток крыс, получавших прооксидант, ниже - при инкубации клеток крыс, получавших антиоксидант.

Таким образом, эффект ЭЦ, нейтрофилов и моноцитов на АДФ АГ и РВ ТЦ согласуется с их способностью высвобождать продукты ПОЛ.

В связи с выявленной зависимостью между способностью клеток высвобождать продукты ПОЛ и их свойством активировать ТЦ, возникла необходимость оценить интенсивность выделения в среду продуктов ПОЛ эозинофилами, которые (по нашим данным) не активируют ТЦ.

С этой целью провели эксперимент с эозинофилами крыс, которые получали прооксидант (свинец, по 10 мг/100 г в течение 12 дней). Результаты показали, что концентрация продуктов ПОЛ невелика, составляет на 1-2 порядка меньше, чем концентрация тех же продуктов при экспозиции других клеток крови в равных условиях. Это, естественно, не указывает на малую скорость образования эозинофилами продуктов ПОЛ - видимо, в пересчете на клетку величины сблизились бы. Однако нас интересовала роль продуктов ПОЛ в реальных условиях, т.е. при реально существующих (физиологических) концентрациях клеток. Именно при физиологическом соотношении клеток на долю эозинофилов приходится уровень продукции перекисей, меньший на 1-2 порядка по сравнению с ЭЦ, нейтрофилами и моноцитами.

Далее, мы выясняли, меняется ли степень воздействия ЭЦ и ЛЦ на ТЦ при тромбинемии, сопровождающейся усилением ПОЛ. Тромбинемию вызывали введением в яремную вену раствора тромбина [С.Л.Галян, 1994]. Контрольным крысам вводили 0,14 М раствор ЫаС1, подопытным - тромбин (0,1 мл/100 г, активность - 25 с). Через 1 и 24 ч определяли показатели состояния гемостаза (табл. 23) и продукты ПОЛ в клетках (табл. 24).

Таблица 23. Гемокоагуляция после инъекции тромбина: 1-я строка -контроль, 2-я - после введения тромбина (п=5, всего 15).

Показатели Исходные Через 1 ч Через 24 ч

ПТИ,% 99,2±4,4 95,713,4 95,113,9

38,211,Г 71,512,3*

АВР, с 69,0±3,9 6511,4 63,212,3*

7912,9* 74,813,4

АЧТВ, с 58,9±2,0 57,912,1 62,213,3

85,312,2* 60,013,2

ПДФ, мг% 21,4±0,5 15,6± 2,2* 13,111,1*

Содержание ФГ, 2,12±0,02 2,1010,001* 2,3110,01

г/л 0,1410,002* 1,710,01*

К-во ТЦ, тыс/мкл 1096138 869122 899129

511121* 757124*

Примечания: * - достоверные отличия от исходных.

Согласно данным табл. 23, через 1 ч после инъекции тромбина развилась гипокоагулемия потребления (снижена общая свертывающая активность - удлинены АВР и АЧТВ, снижены ПТИ, концентрация ФГ и содержание ТЦ). К 24 ч показатели почти нормализовались. Следовательно, 1 ч после инъекции соответствует выраженному эффекту тромбинемии.

Содержание продуктов ПОЛ заметно возросло после введения тромбина (табл. 24), как это мы находили ранее при исследовании плазмы и ЭЦ крыс на фоне ТП.

Таблица 24. Содержание продуктов ПОЛ в ЭЦ и нефракционированных ЛЦ на высоте тромбинемии (через 1 ч после инъекции тромбина). 1-я строка - контроль, 2-я - после введения тромбина

Эритроциты

ДК, А/мг липида 0,042±0,0003 0,046±0,0004 0,068±0,005* 0,03910,0003 0,04410,0003

ТБК, ед./мг липида 0,73+0,04 0,62+0,04 08910,05* 0,06910,05 0,07410,04

Лейкоциты нефракционированные

ДК, А/мг липида 0,053+0,0004 0,05610,0003 0,07610,0004* 0,05410,003 0,05910,0005

ТБК, ед./мг липида 0,82±0,015 0,7810,011 1,1010,022* 0,08110,010 0,07910,021

Примечания: * - достоверные отличия от исходных.

В следующей серии исследований тромбинемию вызывали у контрольных крыс и крыс, получавших 12 дней ДМ (100 мг/100 г массы). Через 1 ч после введения тромбина выделяли ЭЦ и ЛЦ, последние фракционировали и изучали влияние фракций ЛЦ и ЭЦ на АГ ТЦ и РВ. Экспериментально определили, что ЭЦ контрольных крыс заметнее влияют на АГ и в большей степени усиливают РВ, чем ЭЦ крыс, получавших ДМ.

Оказалось, что на высоте тромбинемии обе изучавшиеся формы ЛЦ контрольных крыс вызывают рост АДФ-АГ до предельных значений. Достоверно этот показатель не изменяется в случае предварительного введения ДМ. Иное наблюдается при анализе влияния клеток на высвобождение ф. Р3: оба вида клеток контрольных крыс усиливают его высвобождение. Наиболее активны в этом отношении - моноциты, затем ЭЦ. То же относится и к высвобождению факторов Р4 и Р10. Наименьшей эффективностью отличаются нейтрофилы.

Чтобы сопоставить степень влияния всех изученных нами клеток на РВ, мы представили эффекты в виде интенсивной величины. Диаграмма, отражающая степень снижения способности клеток ускорять высвобождение на фоне предварительного введения ДМ, представлена на рис. 15.

На диаграмме видно, что особенно заметно при введении ДМ способность усиливать высвобождение ГЦ факторов Р3, Р4 и Р10 падает у моноцитов - клеток, которые в условиях тромбинемии отличались высокими проаг-регантными свойствами. Следовательно, антиоксидант, единственно значимая роль которого - снижение скорости процессов ПОЛ - ослабляет существенно способность ЭЦ и ЛЦ активировать РВ ТЦ.

120 100 80 60 40 20

МП mi

Эритроц. Нейтрофилы Мож

IP-3

РР-4

□ Р-10

Моноциты

Рисунок 15. Степень снижения способности высвобождать фактор Р3, Р4 и Р10 на фоне тромбинемии у клеток крыс, получавших ДМ относительно не-получавших его.

Влияние модификаторов метаболизма арахидоновой кислоты /АХ/ в клетках на их способность активировать ГЦ. Активацию ЛЦ можно вызвать АХ к суспензии ¡n vitro [Rodrigues, 1995], что ускоряет образование важных конечных продукта метаболизма АХ - тромбоксанов [Nordvi et al., 1995]. Выше мы нашли способность разных форм ЛЦ стимулировать АДФ-АГ "ГЦ и связь этой способности с активацией ПОЛ. Поэтому следовало изучить влияние экспозиции АХ с ЛЦ и ингибитора этих превращений (индометацина /ИМ/) на проагрегантную активность ТЦ.

АХ экспонировали 15 мин с взвесью индивидуальной фракции ЛЦ. Конечная концентрация АХ - 0,5 мкМ. ЛЦ отмывали, вносили в субстратную плазму на 15 мин, затем определяли МА ТЦ и выход фф. Р3 и Р4.

Таблица 25. Влияние ЛЦ, зкспони

эованных с АХ, на АГ (п=5, всего 15).

Клетки от: Максимальная АГ, %.

Нейтрофилы Моноциты

контрольных крыс - инкубация с арахидонатом - без инкубации с арахидонатом 88,1±1,3*+ 68,9±1,0* 92,0+1.6*+ 72,0±1,5*

Получавших ДМ крыс - инкубация с арахидонатом - без инкубации с арахидонатом 70,1±1,4*+" 65,0±1,2*+" 86,9±1,5*+" 84,9±1,3*+"

Без экспозиции с лейкоцитами 58,1 ±2,1 (контроль)

о

Обозначения: * - достоверное отличие от контроля, + - то же при сравнении инкубированных с арахидонатом и неинкубированных, " - при сравнении контрольных и получавших ДМ

Из данных табл. 25 следует, что: 1) неинкубированные с АХ ЛЦ активируют АГ в степени близкой к установленной нами ранее; 2) предварительное введение ДМ ограничивает проагрегантную активность; 3) инкубация с АХ увеличивает проагрегантную способность ЛЦ в большей степени в опытах с ЛЦ контрольных крыс; 4) интенсивнее при инкубации с АХ растут про-

агрегатные свойства моноцитов. Аналогичные эксперименты с ДМ показали, что антиоксидант ограничивает рост проагрегантной активности в наибольшей степени у нейтрофилов, преинкубированных с АХ.

Следовательно, моноциты при активации в них циклооксигеназного пути превращения АХ ее избытком, могут внести наибольший вклад в рост АА ТЦ, а защитное действие антиоксиданта на АГ реализуется преимущественно через торможение превращений АХ в нейтрофилах.

Интенсивность высвобождения тромбоцитарных факторов также увеличивается после инкубации с АХ, что это особенно заметно у контрольных крыс и менее выражено у крыс, получавших антиоксидант. Следовательно, получено еще одно подтверждение связи ПОЛ с гемостазом через взаимодействие ЛЦ-»ТЦ.

ИМ обратимо ингибирует циклооксигеназу [Honey et al., 1986]. При конечной концентрации ИМ 0,050 мг/мл, достигается достаточное торможение АГ [А.А.Вакулин, 1998]. Эту концентрацию мы создавали в экспериментах. Анализируя данные, отмечаем, что: 1) ИМ снижает способность ЛЦ контрольных крыс активировать АГ ТЦ; 2) эта способность ИМ более выражена на фоне антиоксиданта. Следовательно, достаточно специфичный ингибитор АГ (ИМ), заметнее влияет на ЛЦ крыс, получавших антиоксидан-ты, или на клетки крыс со сниженным уровнем продуктов ПОЛ. Следующие опыты выявили свойство ИМ уменьшать способность ЛЦ стимулировать высвобождение ТЦ фф. 3 и 4, особенно на фоне ДМ.

Далее, в эксперименте in vivo мы исследовали влияние факторов, инги-бирующих каскад АХ в клетках крови, изучая проагрегантную активность ЛЦ и ЭЦ путем тестирования их на ТЦ интактных животных. Вначале изучили влияние АСК на способность ЭЦ и ЛЦ активировать ТЦ, применив дозу 15 мг/100 г, которая снижает МА примерно на 50% - DI50% [А.А.Вакулин, 1998]. АСК вводили контрольным и получавшим ДМ крысам на 13-й день от начала опыта в составе рациона и через 1 ч брали пробы крови, выделяя ЭЦ и ЛЦ, ЛЦ фракционировали.

Исследуемые клетки инкубировали с субстратной плазмой и определяли в ней МА ТЦ, выход фф. Р3 и Р4, а также содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ в ЭЦ и ЛЦ. Контроль - клетки интактных животных.

Из данных табл. 26 видно, что ЭЦ крыс, получивших АСК, отличаются меньшей проагрегантной активностью и меньшей способностью активировать высвобождение, чем ЭЦ интактных крыс. Эти показатели уменьшаются при введении АСК на фоне ДМ. Содержание продуктов ПОЛ в ЭЦ падает параллельно снижению их способности активировать ТЦ.

В табл. 27 приведены результаты аналогичных исследований с нейтро-филами. Как и в эксперименте с ЭЦ, нейтрофилы, экспонированные с субстратной плазмой, повышают А А ТЦ и их способность к высвобождению. Проагрегантный эффект максимален у нейтрофилов контроля, ниже - у получивших АСК без ДМ и еще ниже - у получивших АСК на фоне ДМ.

Таблица 26. Влияние ЭЦ крыс, получавших АСК на фоне ДМ и без него, на АДФ АГ ТЦ. ПОЛ в ЭЦ (п=5, всего 20).

ЭЦ взяты от: МА,%, фф. Р3 и Р4 ДК, А/мг пипида ТБК, ед/мг пипида

Интактных крыс 76,1+2,Г 90,1±3,2 3,0±0,03 0,051+0,001 0,63+0,02

Получавших аспирин

без введения диме-фосфона 69,8+1,2* 78,1±2,3* 2,2±0,0Г 0,04010,002* 0,54±0,03*

на фоне димефосфона 64,1±1,0* 70,1+1,9* 1,6+0,003* 0,035±0,001** 0,45±0,01**

Контроль (до экспозиции с эритроцитами): МА -57,2+0,9; ф. Р3-98,7+3,1; ф. Р4 - 2,6+0,01

Обозначения: * - достоверное отличие от контроля без экспозиции с эритроцитами

Таблица 27. Влияние нейтрофилов крыс, получавших АСК на фоне ДМ и без него, на АДФ АГ ТЦ. ПОЛ в нейтрофилах (п=5, всего 20).

Нейтрофилы взяты из крови: МА,%, фф. Р3 и Р4 ДК, А/мг липида ТБК, ед/мг липида

Интактных крыс 68,1±1,1* 154±4,6* 6,9±0,11 * 0,034+0,001 0,43±0,03

Получавших аспирин

без введения димефосфона 51,2±1,2* 101+3,2* 4,2+0,03* 0,027±0,0009* 0,37+0,02*

на фоне димефосфона 59,5±0,4** 44,6±1,0* 3,4±0,02* 0,022±0,0007* 0,28±0,01*

Контроль (до экспозиции с нейтрофилами): МА -58,0+0,8; ф. Р,-99,0+3,2; ф. Р4-2,7±0,01

Обозначения: * - достоверное отличие от контроля без контакта с нейтрофилами

По данным табл. 28, сходным образом изменяется под влиянием АСК и проагрегантная активность моноцитов. Вместе с тем, различия между эффектами АСК на фоне ДМ и без него заметно усилены.

Влияние ИМ на способность ЭЦ и ЛЦ активировать ТЦ изучили по схеме, использованной для АСК. ИМ вводили в DI50 (по влиянию на МА) - 6

мг/100 г массы тела [И.А.Дементьева, 1998] . В опытах с ИМ наблюдали изменения такой же направленности, которые вызывало введение АСК -различия, носят лишь количественный характер.

Таблица 28. Влияние моноцитов крыс, получавших АСК на фоне ДМ и без него, на АДФ АГ ТЦ. ПОЛ в моноцитах (п=5, всего 20).

Моноциты взяты от: МА,%, фф. Р3 и ?л ДК, А/мг липида ТБК, ед/мг липида

Интактных крыс 99,1+1,9* 112±4,6* 7,1±0,04* 0,065±0,003 1,03±0,03

Получавших аспирин

без введения диме-фосфона 69,0+1,5* 74,3±2,0* 4,1±0,03* 0,051+0,003* 0,84±0,04*

на фоне димефосфона 59,2+1,4* 61,3±2,1* 3,2±0,01* 0,042+0,002** 0,69±0,02**

Контроль (до экспозиции с моноцитами): МА -58,0±0,8; ф. Рз-99,0±3,2; ф. Рг-2,7±0,01

Обозначения: * - достоверное отличие от контроля без контакта с моноцитами.

Результаты этих исследований таковы: утратили в заметной степени способность активировать ТЦ нейтрофилы, при введении ИМ содержание ПОЛ в них уменьшилось, причем после введения ИМ на фоне ДМ проагре-гантная активность достоверно не отличалась от таковой у контрольных животных. Связано это не столько с высокой интенсивностью влияния ИМ на нейтрофилы, сколько с тем, что антиагрегантная активность нейтрофилов сравнительно невелика. То же относится и к изменениям интенсивности РВ. Менее заметна в нейтрофилах и степень снижения активности ПОЛ.

Данные, полученные при исследовании моноцитов, выявляют, что при введении ИМ степень снижения проагрегантной активности моноцитов менее значительна у контрольных животных: небольшое отличие МА по сравнению с контролем имеется, но по сравнению с МА, найденной в ТЦ, экспонированных с моноцитами, отличие появляется лишь при введении ИМ на фоне ДМ. Соответственно изменялась и РВ.

Относительно малый эффект ИМ связан с тем, что моноциты не являются мишенями этого соединения. Тем не менее, высокий эффект АСК, коррелирующие при его введении изменения способности клеток активировать ТЦ и изменения ПОЛ, малый эффект ИМ на проагрегантную активность, и на процессы ПОЛ, дополнительно подтверждают связь между процессами пероксидации липидов и изучавшимися функциями ЛЦ.

ТПА Ли в зависимости от интенсивности процессов ПОЛ. Как и ЭЦ, другие клетки крови участвуют в гемостазе за счет ТПА, которая в значительной степени определяется состоянием плазматической мембраны [А.Ш.Бышевский и др., 1993].

Нефракционированные ЛЦ и индивидуальную фракцию моноцитов вносили в систему для определения ТПА в конечной концентрации, равной физиологической. В первой серии опытов из четырех идентичных групп крыс 1-я служила контролем, 2-я и 3-я получали ДМ по 100 и 200 мг/100 г массы тела в сутки в составе рациона. На 13-й день у всех крыс взяли кровь, выделили ЛЦ, из аликвоты нефракционированных ЛЦ выделили моноциты и определили их ТПА.

ТПА нефракционированных ЛЦ контрольных крыс (табл. 29) выше, чем ЭЦ, она уменьшена при введении ДМ. Практически не отличается ТПА моноцитов - она, как и активность нефракционированных ЛЦ в большей степени выражена у контрольных животных.

Таблица 29. ТПА нефракционированных ЛЦ и моноцитов при повышении антиоксидантного потенциала (п= 6 в группе)

Доза димефосфона ТПА, ЕА/мл

Лейкоциты Моноциты

Контроль (ДМ не вводили)

5221+67 5003±56

Вводили ДМ, мг/100 г

100, мг/100 г 4212±34(19%) 4201+40(16%)

200, мг/100 г 3954±312*(24%) 3828±29*(23%)

Примечание: в скобках - отклонение от контроля в %

В следующей серии использован тот же контроль, животные 2-й группы получали ацетат свинца, а животные 3-й группы, кроме того - ДМ (200 мг/100 г в сутки) в течение 12 дней, на 13-й день исследовали ТПА ЛЦ.

Было установлено, что прооксидант увеличивает ТПА суммы ЛЦ. Его эффект обусловлен, видимо, активацией ПОЛ, поскольку антиоксидант (ДМ) предупредил возникновение феномена в ЛЦ. Активность моноцитов, как и в предыдущем эксперименте, не отличается от активности нефракционированных ЛЦ, следовательно, моноциты - единственная или основная популяция ЛЦ, обладающая ТПА.

Таким образом, моноциты участвуют в реализации связи между процессами ПОЛ и гемостатическим потенциалом не только через активацию ТЦ, но и как фактор, располагающий тканевым ТП.

Итак, ЭЦ, нейтрофилы и моноциты реагируют на рост интенсивности процессов ПОЛ повышением способности к активации ТЦ. Активность ТЦ в этих условиях возрастает как непосредственно под влиянием ускоренного образования продуктов ПОЛ, так и за счет повышения способности ЭЦ, нейтрофилов и моноцитов активировать ТЦ. Кроме того, активация ПОЛ, вызывая изменения клеточных мембран, повышает ТПА ЭЦ и моноцитов, увеличивает их вклад в коагуляционный гемостаз.

выводы

1. Введение в организм антиоксидантов снижает, а прооксиданта повышает уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ в плазме и клетках крови, уменьшая или повышая одновременно интенсивность внутрисосуди-стого свертывания крови.

2. Воздействия, вызывающие у животных активацию тромбинообразо-вания, сопровождаются ростом содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ в плазме, эритроцитах, нейтрофипах, моноцитах и тромбоцитах.

3. Рост интенсивности процессов ПОЛ в плазме и клетках крови при тромбинемии ограничивается предварительным введением антиоксидантов и усиливается - введением прооксидантов.

4. При интенсификации или угнетении ПОЛ способность тромбоцитов к АДФ-индуцируемой агрегации и высвобождению факторов Р3, Р4 и Рщ повышается или снижается соответственно.

5. При экзогенной или эндогенной тромбинемии активность ПОЛ в плазме и клетках крови увеличивается, прирост активности ограничивается введением антиоксидантов.

6. В присутствии эритроцитов, нейтрофилов или моноцитов порознь или совместно АДФ-индуцируемая агрегация тромбоцитов и высвобождение факторов Р3, Р4 и Р10 усиливается пропорционально интенсивности ПОЛ в этих клетках, изменяемой про- или антиоксидантами, а также воздействиями, модифицирующими метаболизм арахидоновой кислоты.

7. По степени тромбоцитактивирующей способности клетки (в физиологической концентрации) располагаются следующим образом: моноци-ты>нейтрофилы>эритроциты. Последовательность изменяется при снижении концентрации.

8. Проагрегантный эффект эритроцитов, нейтрофилов и моноцитов не требует прямого контакта этих клеток с тромбоцитами и может быть вызван средой, в которой эти клетки экспонировали.

9. Среда экспонирования эритроцитов, нейтрофилов или моноцитов усиливает агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов пропорционально содержанию в ней первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов независимо от того, чем вызвано изменение уровня ПОЛ - введением про-, антиоксиданта или соединений, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты.

10. Прокоагулянтная активность эритроцитов, нейтрофилов и моноцитов при сдвигах ПОЛ меняется вследствие повышения их способности активировать тромбоциты, а эритроцитов и моноцитов - еще и за счет изменения их тромбопластической активности.

Полученные данные расшифровывают один из механизмов связи гемостаза и процесса перекисного окисления липидов, связи, обеспечивающей аутоактивацию свертывания при ускоренной пероксидации и активацию ПОЛ

при ускоренном тромбинообразовании, т.е. объясняют циклические превращения по схеме:

Воздействия, активирующие перекисное окисление —> накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ в эритроцитах, нейтрофилах и моноцитах, одновременно и в тромбоцитах —» активация тромбоцитов за счет ускоренного образования продуктов ПОЛ эритроцитами, нейтрофилами и моноцитами -> рост гемокоагуляционной активности тромбоцитов (проагрегантной и «высвобождающей») —> активация тромбиногенеза -» активация ПОЛ.

Вклад эритроцитов и моноцитов в активацию тромбиногенеза при усилении ПОЛ растет еще и за счет увеличения их способности ускорять образование ф. Ха (активная протромбиназы).

Такое представление о механизмах связи ПОЛ-гемостаз имеет в перспективе практическое значение, так как определяет целесообразность изучения эффекта совместного назначения антиоксидантов и антикоагулянтов для ограничения внутрисосудистого свертывания крови и объясняет эффективность антиоксидантов различной природы в профилактике тромбогемор-рагических осложнений.

Список публикаций по теме диссертации

1. Способ определения активности фактора Р4. Авторское свидетельство № 1336713, выдано 8.05.1987 (соавт.: А.Ш.Бышевский)

2. Способ освобождения плазмы от гепарина. Авторское свидетельство № 1371208, выдано 1.10.1987 (соавт.: И.А.Мухачева, О.А.Терсенов, А.Ш.Бышевский, О.В.Галенко).

3. Антигепариновая активность фактора III (тканевого тромбопластина) // Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике : сб. научн. тр. -М.: АМН СССР. - 1987. - С. 39-39 (соавт.: О.А.Терсенов, А.Ш.Бышевский, Е.Л.Рудзевич).

4. О роли циркулирующего в крови фактора III // Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике: сб. научн. тр. - М.: АМН СССР. - 1987. -С.141-141 (соавт.: А.Ш.Бышевский, О.А.Терсенов, И.А.Мухачева и др.).

5. О значении циркулирующих обломков клеточных мембран в регуляции агрегатного состояния крови // Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике: сб. научн. тр. - М.:АМН СССР. - 1987. - С. 142-143 (соавт.: А.Ш.Бышевский, О.А.Терсенов, И.А.Мухачева и др.).

6. Об антигепариновой активности фактора III // Научно-технический прогресс и здравоохранение Кузбасса. Тез. докладов XI съезду врачей Кузбасса, т.II, часть 1. - Кемерово. - 1986. - С. 249-251 (соавт.: О.А.Терсенов).

7. К механизму инактивации гепарина тромбопластином (фактором III)// Укр. биохим. журн. - 1987. - № 4. - С. 3-8 (соавт.: А.Ш.Бышевский, О.В.Галенко, О.А.Терсенов).

8. Циркуляция экзогенного тромбопластина в кровотоке, роль гепарина // Гематол. и трансфуз. - 1987. - № 9. - С. 32-35 (соавт.: О.А.Терсенов, О.В.Галенко, Е.В.Платонов, А.Ш.Бышевский).

9. Обоснование возможности использования йод -131-гепарина в исследовательских целях// Вопр. мед. химии. - 1989. - №2. Деп. в ВИНИТИ (соавт.: Е.Л.Рудзевич, О.А.Терсенов).

10. Роль циркулирующих в крови обломков клеточных мембран в гемостазе //Процессы биоэнергетики и структурно-функциональные свойства в норме и в условиях патологии: сб. научн. трудов. - Саратов. -1987. - С. 11-14 (соавт.: А.Ш.Бышевский, О.А.Терсенов, В.М.Шафер и др.).

11. О возможном значении антигепариновой активности тканевого тромбо-пластина в организме //Механизмы регуляции гемостаза на уровне молекулярных взаимодействий: сб. научн. трудов. - Свердловск. - СГМИ, 1988. - Ыз 3. - С. 20-20.

12. Гемокоагуляционная и антигепариновая активность лимфоцитов // Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины: сб. научн. трудов. -Тюмень. - 1988. - С. 71-71 (соавт.: И.В.Нелепченко, И.В.Хорчевникова).

13. О свертывающей активности околоплодных вод // Акуш. и гинек. -1989. - 1. - С. 43-46 (соавт.: О.А.Терсенов, В.А.Усольцева, А.Ш.Бышевский).

14. Тромбопластическая активность некоторых стабильных клеточных линий// Гематол. и трансф. - № 2. - С. 27-30 (соавт.: О.А.Терсенов, А.Ш. Бы-шевский, Е.В.Платонов, И.В.Нелепченко).

15. Количественное определение активности ингибитора при состояниях, модифицирующих ДВС-синдром //Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза: сб. научн. трудов. - Полтава. -1992. - С. 70-70 (соавт.: С.Л.Галян, В.Г.Соловьев, А.А.Вакулин).

16. Влияние гемоглобина на самосборку мономерного фибрина //Сборник научных трудов региональной научно-практической конференции. - Тюмень. 1994. - С. 167-168 (соавт.: А.Ш.Бышевский, П.Я.Шаповалов).

17. Влияние гемоглобина на плазмокоагупяцию //Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза: сб. научн. трудов. - Полтава. - 1994, - С.146-146 (соавт.: С.И.Тажудинова, П.Я.Шаповалов, С.Л.Галян).

18. Агрегационная активность тромбоцитов при сахарном диабете и влияние на нее Витакомплекса // В кн.: Материалы международного симпозиума «Биологически-активные добавки к пище-нутрицевтики и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях». - Тюмень. - 1995. - С. 29-31 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, А.А.Нелаева и др.).

19. Витамины А,Е,С, и Р в профилактике ДВС-синдрома //В кн.: Материалы международного симпозиума «Биологически-активные добавки к пище-нутрицевтики и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях». - Тюмень. - 1995. - С. 33-35 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, К.В.Горбатиков, И.А.Зарубина и др.).

20. Способ определения суммарного содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови. Авторское свидетельство № 1779693, выдано 12.01.1994 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, В.Г.Соловьев, И.В.Нелепченко, А.А.Вакулин).

21. Prevention of the syndrome of DIC with vitamins A, E, С and P //Clin Hemoreology. - 1995. - v 15. - N 33. - P. 586-586 (соавт.: С.Л.Галян, И.А.Зарубина, В.А.Полякова и др.).

22. Профилактика тромбогеморрагий витаминами-антиоксидантами // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии. Тез. докл. Российской конференции 6-8 июня 1995 г. - С. 176-177 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, К.В.Горбатиков и др.)

23. Об эффективности антиоксидантов в профилактике тромбогеморрагий // Медико-биологический вестник им. Я.Д.Витебского. - 1996. - №2. - С. -23-25 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, И.А.Дементьева и др.).

24. Гемокоагуляционные нарушения при инсулинзависимом сахарном диабете // Медико-биологический вестник им. Я.Д.Витебского. - 1996. - №2. - С. 25-25 (соавт.: А.А.Нелаева).

25. Состояние тромбоцитарных мембран у больных инсулин зависимым сахарным диабетом // Глава в кн.: Тромбоцит (А.Ш.Бышевский и др.). - Тюмень. - 1996. - С. 168-189.

26. Фармакологическая коррекция функционального состояния тромбоцитов // Глава в кн.: Тромбоцит (А.Ш.Бышевский и др.). - Тюмень. - 1996. - С. 189-191.

27. Влияние витаминов А,Е,С и Р на гемостаз // Глава в кн.: Витамины в профилактике тромбогеморрагических осложнений. - Тюмень. - 1995. - С. 8080 (соавт.: В.Г.Соловьев, С.Л.Галян, О.В.Галенко и др.).

28. О целесообразности применения витаминов-антиоксидантов при угрозе тромбообразования // Тезисы докладов научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины», посвященной 20-летию 2 ГКБ. - Тюмень. -1996. - С. 16-16 (соавт.: А.А.Нелаева, В.П.Полякова, В.М.Шафер и др.)

29. Механизм защитного эффекта витаминов-антиоксидантов на гемостаз // Тезисы докладов научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины», посвященной 20-летию 2 ГКБ. - Тюмень. - 1996. - С. 21-21 (соавт.: В.М.Шафер, А.А.Вакулин, К.В.Горбатиков и др.).

30. Влияние эритроцитов и лейкоцитов на активацию тромбоцитов in vitro // "Доктор Лэндинг", №6 (15)1996-1(16)1997, с 37-40 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, А.А.Вакулин и др.)

31. Профилактика тромбогеморрагических осложнений в родах и послеродовом периоде //Методические рекомендации, ТГМА, городская клиническая больница N23. - Тюмень. - 1997. - 26 с. (соавт.: Ю.И.Цирук, В.А.Полякова, Т.П.Шевлюкова и др.).

32.Антиоксидантная терапия при гестозе //Методические рекомендации, городская клиническая больница №3. - Тюмень. - 1997. - 19 с. (соавт.: Ю.И.Цирук, В.А.Полякова, Т.П.Шевлюкова и др.).

33. Влияние витаминов-антиоксидантов на антиагрегантную активность соединений, модифицирующих превращения арахидоновой кислоты в тромбоцитах // Международный симпозиум в рамках международной выставки "Медицина и охрана здоровья. Медтехника и Аптека". Сб."Биоантиоксидант". -ТГУ. - 1997. - С. 93-95 (соавт.: С.Л.Галян, А.А.Вакулин, И.А.Дементьева и др.)

34. Роль эритроцитов и лейкоцитов в поддержании активности тромбоцитов в зависимости от состояния перекисного окисления липидов // Международный симпозиум в рамках международной выставки "Медицина и охрана здоровья. Медтехника и Аптека". Сб., "Биоантиоксидант". - ТГУ. - 1997. - С. 9597. (соавт.: А.Ш.Бышевский, А.А.Вакулин, И.А.Дементьева и др.).

35. Влияние витаминов А,Е,С и Р на антиагрегантный эффект делагила // Мед.-биол. вестник им. Я.Д.Витебского. - 1 (7). - 1997. - С. 30-31 (соавт.: С.Л. Галян, И.А.Дементьева, А.А.Вакулин и др.).

36. Влияние на АДФ-агрегацию продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), содержащихся в плазме или среде инкубации клеток крови // Мед-биоп. вестник им. Я.Д.Витебского. - 1 (7). - 1997. - С. 32-34 (соавт.: А.Ш.Бышевский, А.А.Вакулин, И.А.Дементьева и др.).

37. Влияние антиоксидантов и прооксиданта на активность тромбоцитов // Материалы междун. симпоз., "Медицина и охрана здоровья, медтехника и аптека". - Тюмень. - 1997. - С. 338-341 (соавт.: А.Ш.Бышевский, А.А.Вакулин, И.А.Дементьева и др.).

38. Влияние индометацина на проагрегантную активность эритроцитов и лейкоцитов // Материалы междун. симпоз. "Медицина и охрана здоровья, медтехника и аптека". - Тюмень. - 1997. - С. 343-345 (соавт.: А.А.Вакулин, И.А.Дементьева).

39. Активация процессов перекисного окисления липидов и гемокоагуляци-онные нарушения у больных инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД) // Материалы междун. симпоз."Медицина и охрана здоровья, медтехника и аптека". - Тюмень. - 1997. - С. 345-347 (соавт.: А.А.Нелаева).

40. Изменения гемостаза до и после операции у больных с атеросклероти-ческим поражением сосудов нижних конечностей //Материалы междун. симпоз. "Медицина и охрана здоровья, медтехника и аптека. " - Тюмень. -1997. - С. 352-353 (соавт.: К.В.Горбатиков).

41. Сезонные колебания агрегационной активности тромбоцитов и их реакции на введение ингибитора агрегации аспирина // Ж. Мед-биол. вестник им. Я.Д.Витебского. - 1997. - 1(7). - С. 48-49 (соавт.: А.А.Вакулин, И.А.Дементьева).

42. Роль тромбоцитов в гемостазе //Ж. Научный вестник ТГУ. - 1998. - т. 3. - С. 3-15 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, А.А.Вакулин и др.).

43. Влияние ингибиторов трансформации арахидоната на проагрегантную активность эритроцитов и лейкоцитов и перекисное окисление липидов/ПОЛ/ в них // Ж. Научный вестник ТГУ. - 1998. - т. 3. - С. 21-24 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, А.А.Вакулин и др.).

44. К механизмам потенцирования антиагрегантного эффекта аспирина // Ж. Научный вестник ТГУ. - 1998. - т. 3. - С. 25-29 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, А.А.Вакулин и др.).

45. Гемокоагуляционные сдвиги при тромбинемии на фоне витаминов-анти-оксидантов // Материалы конф. биохимиков Урала и Западной Сибири «Актуальные вопросы биохимии и биотехнологии». - Уфа, 1998. — С. 21-22.

46. Витамины-антиоксиданты потенцируют антиагрегантную активность ингибиторов превращения в тромбоцитах арахидоновой кислоты // Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - Москва, 1998. - С. 354-354.

Используемые сокращения

АА- агрегационная активность

АВР - активированное время рекальцификации

АГ- агрегация

АОА - антиоксидантная активность

АСК - аспирин

АХ - арахидоновая кислота

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ДВС- диссеминированное внутрисосудистое свертывание

ДК- диеновые коньюгаты

ДМ - димефосфон

ПТИ - протромбиновый индекс

ПДФ - продукты деградации фибрина

ПИ - период индукции

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СА- спонтанная агрегация

СО - скорость окисления

ТП - тромбопластин

ТПА - тромбопластическая активность

ТБК - продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой

ФГ - фибриноген

МА - максимальная агрегация

РВ - реакция высвобождения

ИМ - индометацин

ЭТ - этаноловый тест

ЭЦ - эритроциты

ЛЦ- лейкоциты

ТЦ - тромбоциты

■¿«К-* — .г / /'

Тюменская государственная медицинская академия

На правах рукописи

Ральченко Ирина Викторовна

УДК 617-089. 166-059:615.356-07:616.151.5

РОЛЬ ТРОМБОЦИТОВ, ЭРИТРОЦИТОВ И ЛЕЙКОЦИТОВ в РЕАЛИЗАЦИИ СВЯЗИ МЕЖДУ ГЕМОСТАЗОМ И ПЕРЕКИСНЫМ ОКИСЛЕНИЕМ ЛИПИДОВ

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор А.Ш.Бышевский

Тюмень - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................5

2. РОЛЬ НЕКОТОРЫХ КЛЕТОК КРОВИ В ГЕМОСТАЗЕ (обзор литературы)................................................................................................................................11

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................62

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................................................................................72

4.1. Гемостатический потенциал при изменении интенсивности процессов ПОЛ................................................................ 72

4.1.1. Гемокоагуляция при торможении или активации процессов ПОЛ............................................................................ 72

4.1.2. Интенсивность процессов ПОЛ при активации тромби-ногенеза.................................................................................. 80

4.2. Коагуляционная активность тромбоцитов при активации

и угнетении свободнорадикальных процессов....................... 89

4.2.1. Агрегация и реакция высвобождения тромбоцитов у крыс после введения прокоагулянта или прокоагулянта на фоне антиоксиданта............................................................... 89

4.2.2. Влияние прооксиданта на способность аспирина снижать активность тромбоцитов................................................ 93

4.3. Роль эритроцитов в реализации связи между ПОЛ и ге-мокоагуляцией........................................................................ 100

4.3.1. Влияние эритроцитов на агрегацию тромбоцитов в зависимости от антиоксидантного потенциала......................... 100

4.3.2. Тромбопластическая активность эритроцитов в зависимости от антиоксидантного потенциала................................ 104

4.4. Изучение роли лейкоцитов в реализации связи между ПОЛ и гемокоагуляцией........................................................ 107

4.4.1. Влияние нейтрофилов на активность тромбоцитов......... 107

4.4.2. Влияние фракции лимфоциты+моноциты на активность тромбоцитов........................................................................... 109

4.4.3. Влияние фракции моноциты и фракции лимфоциты+моноциты на активность тромбоцитов....................................... 111

4.4.4. Влияние эозинофилов на активность тромбоцитов......... 113

4.4.5. Сравнение эффекта эритроцитов, нейтрофилов и моноцитов на активность тромбоцитов клеток крови................... 114

4.4.6. Активность тромбоцитов после инкубации одновременно с эритроцитами, нейтрофилами и моноцитами................. 120

4.5. К механизму активации тромбоцитов эритроцитами и лейкоцитами........................................................................... 124

4.5.1. Влияет ли среда инкубации эритроцитов или лейкоцитов на активность тромбоцитов............................................. 124

4.5.2. Влияние продуктов ПОЛ, накапливающихся при инкубации клеток крови, на активность тромбоцитов.................. 127

4.5.3. Способность эритроцитов и лейкоцитов активировать тромбоциты при гипертромбинемии....................................... 133

4.6. Влияние модификаторов метаболизма арахидоновой кислоты в клетках на их способность активировать тромбоциты........................................................................................ 137

4.6.1. Влияние арахидоновой кислоты на тромбоцитактиви-рующую способность лейкоцитов.......................................... 137

4.6.2. Влияние индометацина на тромбоцитактивирующую способность лейкоцитов......................................................... 141

4.6.3. Влияние in vivo ингибиторов трансформации арахидоновой кислоты на способность эритроцитов и лейкоцитов активировать тромбоциты...................................................... 143

4.7. Тромбопластическая активность лейкоцитов в зависимости от интенсивности процессов ПОЛ.................................. 150

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................... 153

6. ВЫВОДЫ............................................................................... 192

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................... 195

Список сокращений

АВР - активированное время рекальдификации

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

две - диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови

ДК - диеновые конъюгаты

ПДФ - продукты деградации фибрина

пти - протромбиновый индекс

ТБК - продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой

СО - скорость окисления

пи - период индукции

МА - максимальная агрегация

СА - спонтанная агрегация

ФГ - фибриноген

ЭТ - этаноловый тест

- 5 -1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Об универсальной роли свободно-радикального окисления липидов в гомеостазе вообще [Л.К.Обухова, Н.М.Эмануэль, 1983] и о роли этого процесса в развитии многих заболеваний имеется достаточно свидетельств [В.В.Малышев и др., 1995; О.А.Азизова и др., 1996; Д.В.Морозов и соавт., 1996; Е.П. Шувалова и др., 1996; С.Л.Плавинский, А.С.Кузнецов, 1997; Р.М.Сафаров и др. 1997]. Особый интерес представляют те патологические состояния, которые сопровождаются одновременно активацией ПОЛ и увеличением гемостатического потенциала, что может приводить к развитию ДВС [А.Ш.Бышевский и соавт., 1995; С.С.Селицкая и соавт., 1996; 2Ьеп е.а., 1996].

Одновременная манифестация гиперкоагулемии и активации ПОЛ при многих заболеваниях [В.П.Мищенко, 1981; Л.В.Шаталина и др., 1996: В.З.Ланкин, 1997] и в эксперименте, способность антиоксидантов ограничивать в этих условиях гемокоагуляционные сдвиги [А.А.Гарганеева и др., 1997; И.Ш.Весельский, А.В.Сонник, 1997] обосновывают необходимость изучения механизмов взаимосвязи между свободнорадикальными процессами и гемостазом. Существование такой связи вполне допустимо, однако механизмы ее реализации освещены лишь в единичных работах [И.В.Селиванова, 1994; В.Г.Соловьев, 1997; ЬиПапо е.а., 1997]. В частности, о такой связи свидетельствуют данные о модификации мембранных липидов под влиянием свободнорадикального окисления, о роли фосфолипидов в формировании тромбопластической активности [В.Г.Соловьев, 1997; е.а., 1980].

Запуск коагуляционного каскада разными путями всегда приводит к образованию тромбина [Б.А.Кудряшов, 1975; Д.М.Зу-баиров, 1978], поэтому корректно допустить, что зависимость между гиперкоагулемией и активацией ПОЛ может реализоваться

через изменения тромбиногенеза, ведущего к гипертромбинемии. В подтверждение этого предположения [Бышевский, 1996; В.Г.Соловьев, 1997] потребовалось исследовать механизм влияния тром-бинемии на свободнорадикальные процессы крови. Преимущественными субстратами свободнорадикального окисления являются жирные кислоты в составе мембранных липидов. Поэтому наше внимание привлекли клетки крови, как структуры, тесно связанные с гемостазом [Б.И.Кузник и соавт., 1989] и потенциально способные реагировать на тромбин активацией внутриклеточных реакций ПОЛ [Бышевский и др. 1996]. В большей степени это относится к тромбоцитам и лейкоцитам, имеющим рецепторы к тромбину УагшеБОп е.а.,1980] и ферментные системы образования эн-доперекисей простагландинов [Бюагс!, 1^агс1е, 1985; 81ез5, 1989], в меньшей - к эритроцитам.

Ранее в нашей лаборатории выявлена связь, выражающаяся схемой «тромбинемия—»активация ПОЛ» и «активация ПОЛ—>тро-мбинемия» [С.Н.Ельдецова, 1990; И.В.Селиванова, 1994], что позволяет думать о взаимоусилении этих процессов. Показано также, что тромбоциты - одно из звеньев, опосредующих эту связь [И.В.Селиванова, 1994; В.Г.Соловьев, 1997]. Однако сведения о механизмах опосредования и роли в этом других клеток крови немногочисленны, хотя и эритроциты, и лейкоциты участвуют в гемостазе через влияние на активацию протромбиназы.

Цель работы - изучить роль и механизмы участия тромбоцитов, эритроцитов и лейкоцитов во взаимосвязи процессов перекис-ного окисления липидов и гемокоагуляции.

ЗАДАЧИ: 1) изучить состояние гемостатического потенциала при активации и угнетении ПОЛ; 2) изучить состояние ПОЛ при модификации интенсивности тромбинообразования; 3) уточнить роль тромбоцитов как звена, опосредующего эффект активации

ПОЛ на свертываемость; 4) изучить влияние эритроцитов и лейкоцитов на агрегацию тромбоцитов в зависимости от состояния процессов ПОЛ; 5) попытаться выявить материальный субстрат, обеспечивающий влияние эритроцитов и лейкоцитов на агрегацию тромбоцитов; 6) изучить эффекты модификаторов метаболизма субстрата (арахидоновой кислоты), превращения которого ведут к образованию диеновых конъюгатов в клетках (эффекты ингибиторов и активаторов метаболизма арахидоновой кислоты).

Научная новизна. Впервые показано, что введение про- и ан-тиоксидантов дозозависимо изменяет концентрацию первичных и вторичных продуктов ПОЛ в плазме, эритроцитах, лейкоцитах и тромбоцитах, что этим изменениям следуют адекватные сдвиги активности гемостаза, что активация свертывания воздействиями, вызывающими тромбинемию, сопровождается повышением содержания продуктов ПОЛ в тех же объектах.

Впервые установлено, что, изменения активности ПОЛ в тромбоцитах усиливает их агрегацию и высвобождение факторов Р3, Р4 и Р10.

Впервые установлена зависимость способности эритроцитов, нейтрофилов и моноцитов изменять гемокоагуляционную активность тромбоцитов (их агрегацию и реакцию высвобождения) при воздействиях, модифицирующих ПОЛ, и что эта способность зависит от уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ, накапливающихся в клетках и выделяемых ими в окружение.

Впервые показано, что посредником, обусловливающим эффект эритроцитов, нейтрофилов и моноцитов на тромбоциты являются высвобождаемые клетками первичные и вторичные продукты ПОЛ, что изменения интенсивности ПОЛ и, следовательно, концентрация пероксидов в эритроцитах, нейтрофилах и моноцитах, опреде-

ляет их вклад в гемокоагуляцию за счет изменения скорости образования фактора Ха (активной протромбиназы).

Совокупность полученных данных позволила подтвердить представления о взаимодействии ПОЛ и гемостаза и раскрыть один из существенных механизмов его реализации.

Практическая ценность работы. В процессе выполнения исследований разработаны : 1. Способ определения тромбоцитарного фактора Р4 в плазме крови (авторское свидетельство № 1336713, на которое получен патент № 1336713 от 8.05.1987 г). 2. Способ очистки плазмы от гепарина (авторское свидетельство № 1371208, на которое получен патент № 1371208 от 1.10.1987 г). 3. Способ определения суммарного содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови (Авторское свидетельство № 1779693, на которое получен патент №1779693 от 12.01.1994 г).

Материалы исследований использованы для написания монографий «Витамины в профилактике тромбогеморрагических осложнений» (Тюмень, 1995, авторы - А.Ш.Бышевский, В.А.Полякова, С.Л.Галян, А.М.Мкртумян), «Тромбоциты» (Тюмень, 1996, авторы - А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, И.А.Дементьева, А.А.Нелаева). Материалы легли в основу разработанных нами методических рекомендаций «Профилактика тромбогеморрагических осложнений в родах и послеродовом периоде» (Тюмень, 1997, соавторы А.Ш.Бышевский, В.А.Полякова, Ю.И.Цирук, Т.П.Шевлюкова, В.Г.Соловьев, И.А.Дементьева, А.А.Вакулин), «Антиоксидантная терапия при гестозе» (Тюмень, 1997, соавторы С.Л.Галян, В.А.Полякова, Ю.И.Цирук, Т.П.Шевлюкова, И.А.Дементьева, А.А.Вакулин, А.В.Соловьева).

Полученные данные использованы при составлении инструкции по клиническому испытанию ВИТАКОМПЛЕКСА к заявке в Фармакологический Комитет МЗ и МП РФ.

Результаты работы внедрены в практическую деятельность ряда клинических учреждений г. Тюмени.

Апробация и публикации. Основные положения диссертации доложены на Всесоюзных конференциях «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (Москва, 1987); «Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза» (Полтава, 1991, 1992, 1993, 1994 1995); Региональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Тюмень, 1994); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы фармации» (Тюмень, 1994); Международном симпозиуме «Биологически-активные добавки к пище - нутрицевтики - и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях» (Тюмень, 1995); 9-ой Европейской конференции по гемореологии (Сиена, 1995); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы службы крови и трансфузиоло-гии» (Санкт-Петербург, 1995); Всероссийской конференции «Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации» (Самара, 1996); Международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 1996, 1997).

По материалам диссертации опубликовано 47 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 238 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов исследования, главы с изложением собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 28 рисунками. Библиографический указатель включает 101 работу отечественных и 292 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Первичное угнетение или активация процессов ПОЛ, проявляющиеся изменением уровня продуктов пероксидации в клетках крови и плазме, сопровождается угнетением или активацией свертываемости крови соответственно.

2. Воздействия, активирующие или подавляющие тромбиноге-нез и не оказывающие непосредственного влияния на процессы ПОЛ, вызывают изменения их интенсивности.

3. Существует двусторонняя взаимосвязь между ПОЛ и гемостазом, опосредуемая по цепи ПОЛ—»(эритроциты+нейтрофи-лы+моноциты)—»тромбоциты—»гемокоагуляция (активация тромби-ногенеза)—»активация ПОЛ. Факторы, активирующие ПОЛ в эритроцитах, нейтрофилах и моноцитах, усиливают высвобождение ими перекисных соединений, которые концентрационнозависимо активируют тромбоциты, что повышает вклад последних в тромби-нообразование. Одновременно активация ПОЛ в эритроцитах и моноцитах повышает их вклад в тромбинообразование за счет прироста тромбопластической активности.

4. Антиоксиданты, введение которых сопровождается снижением уровня продуктов пероксидации в изучаемых клетках, уменьшают их вклад в тромбинообразование, ограничивая интенсивность его аутокаталитического механизма и прирост коагуля-ционной активности крови.

2. РОЛЬ НЕКОТОРЫХ КЛЕТОК КРОВИ В ГЕМОСТАЗЕ

(обзор литературы) 2.1. Тромбоциты

Тромбоцитариый гемостаз - один из компонентов системы свертывания крови, участвующий в сохранении ее жидкого состояния, в восстановлении сосудистых стенок и образовании гемо-статического тромба [Д.М.Зубаиров, 1978; З.С.Баркаган, 1988, Haller, 1997, Jensen е.а., 1997]. Участвуют тромбоциты и в защитных реакциях организма [В.П.Балуда и др., 1995; Norman е.а., 1997, Gawaz е.а., 1997], в депонировании и переносе биогенных аминов, в патогенезе ряда патологических процессов [В.К.Ваш-кинель, М.Н.Петров, 1982; В.П.Балуда и др., 1995].

В соответствие с целью исследования нас интересуют функции тромбоцитов, сопряженные с гемостазом.

2.1.1. Рецепторный аппарат тромбоцитов

На мембранах тромбоцитов обнаружены рецепторы, обеспечивающие полифункциональность клеток, в том числе и их участие в гемостазе [В.А.Алмазов и др., 1990; А.В.Мазуров, С.А.Васильев, 1994; А.Ш.Бышевский и др., 1996]. Строгой классификации рецепторов не существует, но можно различать их по типу лиганд.

Рецепторы к лигандам белковой природы в тромбоцитах -главным образом гликопротеины /GP/ [Nurden, 1995]. У многих из них изучена секвенция аминокислот и функции [А.В.Мазуров, С.А.Васильев, 1994; Georg е.а., 1985]. В изучении функций использованы специфические антитела и клетки с дефицитом одного из GP [Brandt е.а., 1996, Lentsch е.а., 1996, Boukerche е.а., 1996, Shock е.а., 1997].

Сводка о GP тромбоцитарных мембран [А.В.Мазуров, С.А.Васильев, 1994]: Функции

Мембранные гликопротеины

Рецептор коллагена Рецептор фибронектина

Рецептор ф. Виллебранда, высокоаффинный рецептор тромбина, опосредует адгезию тромбоцитов к субэндотелию Индуцибельный рецептор фибриногена, фибронектина и ф. Виллебранда, опосредует агрегацию тромбоцитов Рецептор тромбоспондина, рецептор коллагена ?

Рецептор коллагена

Главный функциональный рецептор тромбина

Fc-рецептор (для мультивалентных лиган-

дов) ?

Функции

Стимуляция агрегации моноклональными антителами То же

То же

Экспрессируется на поверхности активированных тромбоцитов, рецептор для ли-ганда на лейкоцитах, опосредует взаимодействие тромбоцит-лейкоцит Экспрессируется на поверхности активированных тромбоцитов?

Большинство рецепторов - адгезивные белки («интегрины») [Fitzgerald, Phillips, 1987], распознающие последовательность Арг-Гли-Асп [Bachelot е.а., 1995] - содержат 2 нековалентно связанные а- и {3- субъединицы (90 - 170 кДа), отличаются высокой гомологией. Многие из них связываются со сходными участками адгезивных белков-лигандов [А.В.Мазуров, С.А.Васильев, 1994, А.Ш.Бы-шевский и др., 1996].

GP 1а-Иа GP 1с-Иа GP Ib-IX

GP Ilb-IIIa

GP IV

GP V GP VI

Рецептор тромбина

FcyIIR-рецептор

PECAM

GP

p24

PTAI

p32/35

GMP-140

p53

Комплексы GP Ia-IIa и Ic-IIa - компоненты одной из трех групп интегринов - VLA-группы (Very late activation antigen - поздние антигены активации), участвуют во взаимодейст