Механизмы действия природных и синтетических многоатомных фенолов и хинонов при иницировании свободнорадикальных процессов в биологических системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ В ЧЕРНОГОЛОВКЕ

На правах рукописи КОС IЮК Владимир Андреевич

I <

УДК 577.121.7+577.125+577.16+616-008

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ И СШПИИЧЕСКИХ МНОГОАТОМНЫХ ФЕНОЛОВ И

ХШЮНОВ ПРИ ИНИЦИИРОВАНИИ * СВОБОДНОРАДИКАЛЫ1ЫХ ПРОЦЕССОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

02.00.15 - химическая кинетика и катализ 03.00.04, - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени док тора химических наук

Чериоголомка 1994

Работа ныиолнена к Белорусским государственном униперси тете.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор И.1». Афанасьев

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук Сырцова Л.Л. Доктор биологических наук, профессор Ланнни В.'З. Доктор медицинских наук, профессор Коркнна ЛЛ". .

Ведущая организация: Институт фотобиоло! ии АМ Республики Беларусь

Защита состоится «Щ» иЩ^кЯ 1994 г. и "/¿^час. на заседании специализированного сонета Д 200.08.02 при Инсппу химической физики (Черноголовка) по адресу: 142432, Московск; обл., Черноголовка, Институтский проспект, 14, Корпус обще) назначения.

С диссертацией можно ознакомиться п библиотеке Инстнту химической физики (Черноголовка).

Автореферат разослан " /рфАСЫД-1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат физ.мат. наук (1Р- Фогс.1

■У Инсгитуг хммччсекоН фишки н 'к-рноголонкс )'АН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. У аэробных организмов, от простейших до млекопитающих, активные формы кислорода и пероксидм образуются в нормально функционирующих клетках. Для их инактивации и ходе эволюции сформировалась сложная защитная система, включающая ферменп,1: суиероксиддисмутазу, каталазу, глутатионпсроксидазу и низкомолекулирные антиокенданты. Однако при определенных услониях содержание,.активных форм кислорода и нсроксидов и отдельных клетках и тканях может многократно увеличиться и превысить дот оксидирующие возможности защитной системы. В этом случае развивается окислительный стресс, характерной особенностью косорото является активация снободнорадикальных процессов, в том числе и иерекисного окисления липидон (ПОЛ). Наиболее распространенными причинами, »изымающими развитие окислительного стресса, являются воздействия на организм неблагоприятных физико-химических факторов внешней среды и, и первую очередь, радиации- Существуют многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие об образовании продуктов ПОЛ при ишемии и особенно при рсперфузии печени, ночек, скелетных мышц, миокарда, головного мозга. О существенном вкладе снободнорадикальных процессов и повреждающее действие негативных факторов внешней среды свидетельствует хороший протекторный эффект, который оказывают и этих условиях различные по своей структуре антжженданты: ионол, «-токоферол, производные 1,4-ди1'Идро11ирид|(11а. Тем не менее, существующие в настоящее время представления о закономерностях инициирования и регуляции снободнорадикальных процессов, молекулярных механизмах их повреждающего действия и роли при развитии конкретных патологических процессов достаточно схематичны и спорны. В значительной степени это обусловлено недостатком эксперимен тальных данных о специфике протекания снободнорадикальных процессов, механизмах их регуляции, путях детоксикацин образующихся продуктов и патогенетических 1юследствиях их накопления в различных тинах клеток при воздействии радикалпиициирующих факторон. Данная проблема является своего рода "точкой роста" современной науки, в решсШш которой объединяются усилия химиков, биологов и медиков.

Важной практической задачей является разработка фармакологических способов воздействия на свободнорадикальные реакции с целью снижения негативного влиянии окружающей среды на

организм. Особенно актуальны эти проблемы для Беларуси с сё высоким уроннем индустрии, где постоянно действующим фактором стало внешнее и внутреннее радиационное облучение. В настоящее время получены -убедительные 'экспериментальные данные, свидетельствующие, что широко используемые витамины Е и С являются мощными биоантиокнелителями. Выполнены единичные исследования, указывающие, что флавоноиды, входящие в группу витамина Р, также являются антиоксидантами. Однако к началу выполнения нашей работы (1982-1983) конкретные механизмы антиоксидантного действия флавоноидов в значительной степени оставались невыяснеными, что определило актуальность проведения дальнейших исследований в этом направлении.

В Белгосунивсрсктетс, в НИЛ биоэнергетики при кафедре физиологии человека и животных синтезирована группа новых биологически активных соединений на осионс о-бензохинона. Выявлен хороший защитный аффект этих соединений при гиноксических и реперфузионных повреждениях. Мы предположили, что защитное Действие производных о-бензохинона в значительной степени обусловлено антиоксидантными свойствами, однако эта гипотеза Нуждалась в де тальном экспериментальном доказательстве.

Определение антиоксидантного действия биологически активных соединений и исследование соответствующих молекулярных Механизмов требует использования специфичных и достаточно простых Методов исследования. Ряд таких методов: ТБК-тест, снектрофотомстрическое определение диеновых конъюгатои, хроматографический анализ - использовались в исследовательской (¡рактикс на протяжении нескольких десятилетий. Вместе с тем, к началу выполнения наших исследований оставались нерешенными некоторые проблемы, связанные с особенностями использовании этих методов для исследований in vitro и особенно in vivo. Отсутствовали экспериментальные данные о стабильности различных продуктов ПОЛ н биологическом материале в процессе его подготовки к анализу и при хранении. Существовала потребность разработки новых методов разделения продуктов ПОЛ с- помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. *

Цель и задачи исследования. Основной мелью данного исследования явилось выяснение возможных 'механизмов антиокислнтслыюго действия природных и синтетических многоатомных фенолов i! хининов при инициировании снободнорадикальпых процессов

и различных биологических системах; оценка эффективности их защитного действия при развитии н клетке окислительного стресс;». В соответствии с ¿той целыо н диссертационной работе решались следующие задачи: - '

!. Определит!, оизимальнмс показатели, характеризующие процессы перскисного окисления линпдон в модельных системах и условиях iii vivo, разработан, новые и модифицировать существующие 'экспериментальные ме тоды их определении.

2. Установить наличие антиоксидангного действия у о-бен зохипонов и модельных системах перекменого окисления лииидон и ih vivo. Исследонать окислительно-восстановительные реакции, обуславливающие антиоксиданпкч; действие о-бензохинонов.

3. Сравнить эффективность антноксидаитного действии о-бензохшюнов, выявил- особенности и возможные их преимущества но сравнению с друз ими антиоксидактами.

4. Исследонать механизмы и особенности ангнокендантного денстиин фланоиоидон при инициировании перскисного окисления лппндов и различных биологических системах на примере кверцетина и рутина.

5. Изучить роль свободнорадикальных реакций и ноиреждении галогеналканами системы микросомального окисления эндонлазматического ретикулума- печени и особенности защитного действии о-бензохшшнон.

6. Оценить эффективность и исследонать механизмы защитного действия синтетических многоа томных фенолом и хинонов и|)п разни тип окислительного стресса н интактпых клетках

Научная новизна. Выявлена группа нр'инцинналмю новых ингибиторов свободнораднкальных реакций хиионной структуры - о-бензомнюнон. Показано, что эти соединения способны включаться но внутри клеточные окислите л ыю-восстановительные процессы, и результате которых постоянно регенерирую тся восстановленные формы о-бен'зохиноиов, обладающие мощным ашиоксидаитиьш действием. На основании полученных экспериментальных данных определены количественные параметры, характеризующие эффективность антноксидантиого действия о-бензохшюнон, и выявлены соединения, значительно более эффективные,- чем широко используемый ■антиоксидант - ионол. Установлено, что о-бензохинопы обладают хорошим протекторным эффек том при моделиронании окислительного ноиреждении н нитиктных клетках. Среди о-бензохинонои выявлены

Л-

соединения, избирательно иигибнрующне различные тины свободнорадпкальных реакций.

Впервые экспериментально подтверждено, что антшжендантное действие рутина и кверцетнна, нолифенолов, входящих в группу витамина Р, in vitro обусловлено их хелатирующнми и антираднкалынлмн свойствами. Найдено, что эти соединения способны оказывать антирадикальное действие как на стадии инициирования (процесс генерации активных форм кислорода), так и на стадии продолжения цени, взаимодействуя с алкилперекисвыми радикалами. Определены константы скорости реакции рутина и киерце тина с анион-раднкалом кислорода. Показано, что кверцетни является значительно более аффективным антирадикальным агентом, чем руги и. Впервые обнаружено, что киерцетин способен генерировать анион-радикал кислорода при окислении, и зга реакция может быть использовала для определения фермента супероксидднсмутазы.

Впервые получены прямые экспериментальные доказательтва того, что гидропероксиды полиненасыщонных жирных кислот, входящих в состав экзогенных фосфолинидов н фосфолннидов внутриклеточных мембран, способны ферментатнвно восстанавливаться и иечени в соответствующие оксисоединения без предварительного гидролиза с помощью фосфолипазы Аг.

Разработан оригинальный подход, позволивший получить экспериментальные данные, свидетельствующие, что in vivo инактивация системы микросомалыюго окисления печени крыс, происходящая н первые часы «осле отравления тетрахлорметаиом. вызвана не процессами нерекисного окисления лннпдо», а обусловлена, по-видимому, галоалкилированием соответствующих ферментон. Обнаружено также, что наблюдающееся и более поздние сроки (через 48 ч) снижение содержания н печени ключевых ферментов антиокислительной защиты - еунероксиддисмутазы и ка тализы - также не зависит от ПОЛ.

Теоретическая и практичсскан значимость работы. В результате вынолнепых исследований выявлена группа новых, высокоэффективных антиоксиданто», перспективных для последующих работ но разработке новых' фармакологических препаратов. Имеющиеся среди них соединения, избирательно ишибирующие различные тины свободнораднкальных реакции, могут бы п. использованы и качестве фармакологического инструмента нрн исследовании механизмов окислительного повреждении клеил.

Полученные н работе новые данные о механизмах про- и антноксидантного действии рутина и киерцетнна следует учитывать в экспериментальных и клинических исследованиях по использовании) природных полнфенолов, входящих в группу витамина Р, в качестве профилактических п чераиевтичееких с|х;дстн.

Полученные и процессе выполнении работы результаты, свидетельствующие о способности цитонлазматнческнх белков нечени восстанавливать гидронероксиды фосфолинидов без их предварительного гидролиза, послужили экспериментальным и теоречпческнм обоснованием для последующих работ по выделению, очистке н изучению иммунологических свойств нового фермента -мономерной глутатиоинероксидазы.

Полученные при исследовании окислительного повреждения в различных клетках данные позволили предложить оригинальную модель функционировании антиокислительных защитных систем клетки при развитии спободнораднкальных реакции.

Разработанные оригинальные методики определения в биологическом материале диеновых коныогатов (A.C. 1185242 СССР, МКИ 01 № 33/48); сунерокспддисмутазы (A.C. 1521773 СССР, МКИ 01 № 33/573); ТБК-нктинных продуктов в анаэробных условиях (Вонр.мед.химии", 1У87, №3, С.115-118) использовались во многих научных и клинических учреждениях, среди которых: Белгосупнверситсг, Минский государственный медицинский институт, НИИ.особо чистых биопрепаратов, НИИ высокомолекулярных соединений, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, НИИ скорой помощи им. Склифосовского, Свердловский медицинский институт.

Материалы диссертации были использованы и учебной работе кафедры физиологии человека и животных Бслгосуиннерснтста, ()уш>н>1ые положения, выносимые ни яиишту. I. Производи!,le о-бензохинона являются группой новых, эффективных синтетических ингибиторов свободнорадикальных процессов. Аитиокендаитное действие обусловлено способностью восстановленных форм этих соединений эффективно перехватывать свободные радикалы. В биологических системах существуют механизмы, обеспечивающие постоянную регенерацию носстамонлениых форм о-бс нзохинонон.

2. Антноксидантнос действие рутина и кверцетина in vitra обусловлено их хела тирующими и антнраднкальными свойствами. Антирадикалыюс действие этих флавопоидов возможно как на стадии ишщищхжанни, так и на стадии продолжения перекиспого окисления линидов.

3. В нечени осущестнля^етси эффективная дезактивация радикальных метаболитов ксенобиотиков посредством механизма, включающего реакцию радикалов с иолиненасьпцснными ациламп фосфолииидов и последующее ферментативное восстановление образующихся гидроиероксидов фосфолинпдон без их предварительного гидролиза.

4. Цитопротекторное действие о-бснзохшюнов при инициировании окислительного повреждения изолированных клеток обусловленно ингибированием свободнорадикальных реакций. Реализация этого механизма i/i vivo обеспечивает' защитный эффект о-бензохинонов при ишемии-реперфузин органов и тканей.

Апробации работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на заседании Минского отделения Белорусского физиологического общества ( 1986 г.); на VI (1983 г., Гродно) и на VII (1987 г., Витебск) съездах БФО им.И.П.Павлова; на V республиканском съезде фармацевтов, фармакологов и токсикологов (1989 г., Минск); на Всесоюзных семинарах "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине"(1984 г., 1986 г., 1990 г., 1992 г., Минск; 1987 г., 1988г., 1989 Рига; 1991 г., Ленинград); на V Всесоюзном съезде фармакологов (1982 г., Ереван); на VI Всесоюзной конференции по окислению органических соединений в жидкой фазе "Окисление - 86"(1986 г., Львов); на Всесоюзном совещании "Транспорт кислорода и антиоксидантные системы" (1989 г., Гродно); на Международном симпозиуме "Активные формы кислорода в биологических системах (1986 г., Варна, Болгария); на II и III Международных симпозиумах "Хелатирующие агенты в фармакологии, токсикологии и терапии" (1987 г., 1990 г. Пльзень, ЧССР); на XII Международном симпозиуме по структуре и функции эритроидиых клеток (1989 г. Берлин); на 58 и 64 ежегодных конференциях Японского биохимического общества (1985 и 1991 гг., Токио. Японии); на V Международном конгрессе "Активный кислород, лшшдиые псроксиды и антиоксидшпы" (1991 г., Киото, Я копия).

Публикации. Основные научные результаты, включенные н диссертацию, отражены и 56 вышедших из печати научных работах и четырёх ангорских свидетельствах на изобретения.

(>бы-м и структура диссертации. Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста, содержит 52 таблицы и 3N рисунков к состоит нз введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследования", нити глав собственных исследований, заключения, выводов н указатели литературы, включающего 427 источников. Диссертация написана на русс ком языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования При изучении молекулярных механизмов анчиокиелнтелыюго дейс твия природных и син те тических многоатомных фенолов и хинонов, оценке эффективности их защитног о действия при развитии в клетке окислительного с тресса в качестве объекта исследования использовали следующие типы сиободнорадикадьпых процессов:

- ценное, автокаталитичеекое окисление органических молекул;

- ферментативное и не ферментативное нерекисное окисление линидов в микросомалыюй фракции печени in vitro'

- нерекисное окисление липидов и галоалкилированне, инициируемые ССЦ в микросомалыюй фракции печени in vitro",

- окисли тельное повреждение изолированных клеток;

- нерекисное окисление лппндоп и галоалкилированне, инициируемые ССЦ в печени iu vivo".

Моделирование, свободнорадикальных процессов in vivo проводили на беспородных белых крысах и крысах линии Wistar. Свободнораднкальныс процессы инициировались в печени различными дозами тетрахлорметана (чстыреххлористого углерода), вводимого нероралык» в виде 25% раствора на вазелиновом масле. Печень для биохимического анализа извлекали иод эфирным наркозом и тщательно перфу .¡провали через воротную своему охлажденным 0,9-процентным NaCI. В зависимости от цели эксперимента определяли: содержание (неновых копыогатон, ТБК-активных соединений, гидропероксидон и количество связанною с микросомами '^С из ССЦ; п-гидроксилазную, п-демстнлазную и ССЦ-иероксидазную активность микросомалыюй фракции п содержание в ней пит »хрома Р-450; уровень цитоилазматической СОД и каталазы. Каждый эксперимент in vivo включал 4 группы животных: 1- интактные крысы, получавшие

вазелиновое масло; 2 - крысы, молучаншис антиоксидант; 3 - крысы, получавшие ССЦ; 4 - крысы, получавшие антиоксидант н CCU-

Для моделирования свободнораднкальных прюцсссон и интактных клетках использовали культивируемые эндотелиальные клечки и эритроциты. Эндотелиальные клетки получали из фрагментов аорты йыка и культивировали при 37°С в атмосфере У5% воздуха и 5% С'О2 в среде D-MEM (DULBECCOS MODIFIED EAGLE MEDIUM, C1IBCO, Grand Island, N.Y.), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки по общепринятым методам с использованием стандартного лабораторного оборудования. Степень повреждения эндотелиальных клеток оценивали по выходу в среду инкубации лактатдегидрогеназы. О повреждении эритроцитов судили но степени гемолиза. Ход гемолиза контролировали но изменению снетопронускания суспензии при 6(Х) нм.

Для исследования окислительно-восстановительных процессов в субклеточных фракциях использовали мнкросомы печени крыс, выделяемые методом дифференциального скоростного центрифугирования. Скорость восстановления производных о-бензохинона и присутствии микросом печени определяли но скорости потребления в среде инкубации кислорода, расходующегося на окисление восстановленных о-бензохннонов, используя закрытый платиновый электрод. НАДФН-зависимос нерекисное окисление линидов проводили в 0,05 M фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,02 M KCl, 10 мкМ FeS04, 0.3 мМ НАДФН, 1.2-1,3 мг/мл микросомального белка в конечном обч.еме 5 мл. СО4 -зависимое нерекисное окисление линидов проводили в 0,05 M фосфаччюм буфере, pH 7,4, содержащем 0,02 M KCl, 0,6 мМ ЭДТА и 3,4 мМ ССЦ, вносимого в виде спиртового раствора с конечной концентрацией этилового спирта 2%, 1,2-1,3 мг/мл микросомального белка в конечном обч.еме 5 мл. При исследовании процессов галоалкилирования использовали 14СС1д (В/О "Изотоп") с удельной активностью 28 МБк/ммоль. Аскорбат-завнсимос нерекисное окисление линидов проводили в 0,05 M фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0.02 M KCl, 0,1 мМ FeS04, 1,0 мМ аскорбиновой кислоты, 0,8-1,0 мг/мл микросомального белка в конечном обч.еме 5 мл. Пробы анализировались на содержание'продуктов ПОЛ и галоалкилирования стандартными методами. При исследовании влияния антиоксидапто» на процессы гидроксилирования в качестве субстратов использовали амидопирин и апилмп и определяли формальдегид и.п-амшюфенол.

Потребление кислорода микросомами печени крыс при активации и ингибированин НАДФН-зависимого иерекисного окислении лннидон определяли в термос тегируемой ячейке объемом 1,6 мл при 37°Сс помощью платинового электрода закры того типа.

Аутоокнеление флавоноидов проводили при комнатной температуре и 0,175 М фосфатном буфере, рН 7,8, содержащем 0,07 мМ ЗДТА, 0,7 мМ ТМЭДА н конечном объеме 3,5 мл.

Фотоокисление фланонондов нроиоднли и рибофлавин-содержащей системе (6 мкМ), включающей 0,175 М фосфатный буфер, рН 7,8, 0,06 мМ ЭДТА и 0,6 мМ ТМЭДА в конечном объеме' 4,5 мл. В качестве источника спета использовали лампу ЛД-20.

При исследовании влияния антиоксидантов (о-бензохинонов, флавонондов) на спектральные параметры взаимодействия анилина н четыреххлористого углерода с цигохромом Р-450, регистрацию дифференциальных спектров проводили на спектрофотометре "Бресоп! М-40", ГДР. Спектральные константы диссоциации комплексов цптохром Р-450 - ССП, цитохром Р-450 - анилин (Кл) и величину амплитуд максимальных спектральных изменений (ОПмаКс.) определяли из зависимости величин спектральных изменений от величин концентраций субстрата н двойных обратных мхфдинатах.

Для получения гидроперокендон линидов холестерншннюлеат и трилпноленин окисляли на воздухе 'при 'комнатной температуре. Лпнолевую кислоту окисляли с помощью липоксигеназы и очищали ме тодом препаративной тонкослойной хроматографии. Хроматографию проводили на: стандартных пластинах 5Шеа;>е1 60 размер 20 х 20- см, толщина слоя 1 мм (МегсИ Ап 13895).

Жидкостную хроматографию высокого давления проводили на колонке гогЬах БЦ■ (4.6 х 250 мМ). В качестве подвижной фазы использовали систему ацетонитрнл-метанол-вода (400 : 100: 34), ско|чк"п. злюированин 2 мл/мин; метанол-вода (20 :1) и гексан-метанол (80 : 1),'скорость элюировании 1 мл/мин.

Содержание цмТохрома Р-450 определяли но дифференциальному спектру сто карбонильного комплекса. Активность' катализы определяли 'прямым епектрофотометрическим методом но убыли перокепда водорода в среде инку бации. Активность СОД определяли по степени торможения реакции окисления кверцетлпа. Активность лактатдеп1;(р>геназы определяли спектрофотометрическн, но скорости потребления НАДИ н катализируемой ферментом обратной реакции превращения нирувата в лактат. Для определения использовали

А).

лабораторный набор фирмы Sigma .Содержании первичных продуктов (диеноиых конъюгатон), образующихся в процессе, перекисного окисления лшшцок in vitro, определяли методом У<1>-спектрофотометрии. Гидропсроксиды линидов определяли с помощью цветной реакции с лейкометнленом голубым. 'ГБ К-актшшыс соединения определяли флкюрцмстрически. В качестве стандарта использовали тетраметоксинронан.

Экснеримс1пал1>н[.1е данные обрабатывали статистически с подсчетом среднего арифметического (X), среднего квадратичеекого отклонения (S). средней квадратичной ошибки среднего арифметического (±Sx) и нормированного отклонения (i). Значения I50 рассчитывали с помощью метода регрессионного анализа. Для математической обработки части результатов использовали коммерческую программу "Cricket Graph".

При выполнении исследований использовалась следующая основная аппаратура и оборудование: спектрофотометры СФ-26, СФ-46 [JIOMO, CCCP],"Specord" М-41) [Германия]. UV-300, UV-340 "Shimadzu" [Япония]; жидкостной хроматограф высокого давления "Shimadzu-4А"(Японии]; снсктрофлуориметр 650-10 "Hitachi" [Япония]; ультроцентрифуги L8-55 "Beckman" [США], VAC-601 [Германия], рефрижераторные центрифуги ЦЛР 1 и PC 6 [СССР], Kubota [Япония]; анализатор радиоактивности Бета 2 [СССР]. В работе использовались следующие реактивы: линолевая кислота, L-a-дилинолсоилфосфагидилхолин (P-L Chemicals Inc., США); трилиноленин, фосфатидилзтаноламин из печени свиньи (Serdary Res. Lab. Inc., Канада); холестеринлинолеат, холсстсринлиноленат (Nakarai Chem. Ltd., Яцоиия); липоксигсназа 130000 сд./мг, кверцетин, 2-гидроксизстраднол, дефероксамин (Sigma Chemical Co., США); каталаза 65(ХЮ ед./мг, азид натрия, адреналин (Serva, ФРГ); СОД 3000 сд./мг (Toyobo, Япония); кумасси бриллиантовый голубой (Lobo Feinchemie, Австрия); тиобарбитуроиая кислота, восстановленный глутатион, ионол, дитиотреитол (Wako, Япония); ПНТХ, ТМЭДА, НАДФН, НАДИ, ал!.бумин лиоф. сывороточный, трис (Reanal, Венгрия) и реактивы отечественного производства квалификации ЧДА, ХЧ и ОСЧ.

2. Разработка и модификация методов исслс.доттш свобод}шрадикалшых процессов а бшттшсских системах Проведение исследований в соответствии с поставленной целью требовали решения ряда методических вопросов, касающихся особенностей исследования снободнорадикальпых процессов г

^логических системах, особенно ш vivo. В частности, отсутствовали снериментальные данные о стабильности различных продуктов ПОЛ биологическом материале и процессе его подготовки к анализу и при анаши, возможностях экстракции окисленных липидов из ологического материала различными системами растворителей, чцестнонала потребность разработки новых методов разделения дронероксидов линидон и продуктом их восстановления с помощью 1сокоэффективной жидкостной хроматографии.. Имелись основанные сомнения в отношении правомерности использования так зываемого ТБК-теста для определения продуктов нерскисного исления ¡ii vivo.

В результате исследований, вынолненых с целью решения азанных выше методических вопрос«!?, установлено, что наименее Ti';!':;;',;;.müi продуктами ПОЛ являются гидронероксиды различных шидов и, в первую очередь, свободных ненасыщенных жирных кислот фосфолшшдов. Показано, что восстановление гидропероксидов НЖК фосфолипидов может произойти за Время приготовления гомогената :чени при стандартных лабораторных условиях. Более того, процесс ерментативного восстановления гидронерс>кеидон линидов, юисходящий in vivo, препятствует накоплению гидропероксидов в санях. Значительно более информативным при исследован н.ч числительного стресса является определение тканевого уровня шновых коньюгатов и ТБК-активпых соединений.

Необходимым этапом при снектрофотометрическом определении шновых коныогатов является экстракция линидон из биологического НтерИала. Обычно окисленные липиды экстрагируют но Фолчу, 1есыо метанола и хлороформа, но и этом случае неоходимым этаном 1ляется длительная и дос таточно сложная при большом количестве Зрабатынаемых проб процедура упаривания хлороформенной фазы в же инертного газа. Планером было предложено экстрагировать кисленные липиды смесью гснтан:изоиропанол с последующим шктрофотометрироианием гептановой фазы. Однако результаты шной -работы свидетельствуют, что основные продукты ПОЛ -кисленные фосфолипиды, экстрагируются, главным образом, шртовой фазой ( табл. 1). Степень экстракции окисленных липидов из иолотического материала системой геита^:изонропанол сравнима с езультами экстракции по Фолчу. Поэтому был разработан метод пределения диеновых кош.югатов в биологическом материале, ключающий экстракцию системой гснтан:изоиронанол (1:1) и

последующее снектрофотомстрированис спиртной ф предварительно очищенной от нодораспюримых соединений

Распределение продуктов окисления различных линидов в ни о ... гентан-изонронанол (1 :1)*

Анализируемый материал Отношение

.. ROOH/ДК

Распределение дисновы>. конъюгатов, в процента*

Изонронанол Гептан

ГИДРОПЕРОКСИДЫ:

Холсстеринлинолеата

Холсстеринлинолсната

Трилинолснина

Линолсвой кислоты

Фскфатидилхолина

Фосфатидилэтаноламина

ВОССТАНОВЛЕННЫЕ

ГИДРОПЕРОКСИДЫ:

Линолсвой кислоты

Фосфатидилхолииа

Фосфатидилэтаноламина

1,2 3,0

3.0 1,0 1,5

2.1

0 0

о

14,5 25/> 28,0 78,5 98,5 89,4

92,6 91.5

85,5

.85,5

74.4 72.0

21.5 ]Л 10.6

7,4 К,5 14,5

* - в таблице приведены средние значения трех экспериментов. Разброс значений не превышал 5%.

ТБК-тест используется для определения продуктов перекисною окисления линидов более тридцати лет. Первоначально считали, что он характеризует содержание в анализируемых образцах одного из конечных продуктов ПОЛ - малонового диалг.дегида. Позднее было показано, что большая часть малонового альдегида, реагирующем» с тиобарбитуроной кислотой, образуется н процессе анализа биологического материала в результате разрушения гидро- и эндонероксидон. Поэтому л настоящее время ТБК-тест рассматривается как интегральный метод определения общего содержания промежуточных и конечных продуктов окисления линидов. Однако исследования, подтверждающие возможность применения ТБК-тсста с такой целью, проводились, главным образом, с ненасыщенными жирными кислотами и нк гидроперекисями. : о;

;он>рых характерно тождество результатов, полученных при анализе н оробных и анаэробных условиях. В то же нремя, как показали наши исследовании, при анализе тканевых гомогенатон до 90% всего МДА может образовываться в результате снободнорадиКальных реакций, активирующихся ири кипячении исследуемых образцов н присутствии кислорода, и этот процесс подавляется при удалении кислорода. При лом, анаэробные условия но нремя тепловой обработки инициируемого материала не влияют на выход малрнивого диальдегида из промежуточных продуктов окисления различных липидон. Другими словами, полученные в этом случае результаты определяются только содержанием промежуточных продуктов ПОЛ, разлагающихся при нагрснании с образованием МДА. Следовательно, определение промежуточных продуктов ПОЛ с помощью ТБК и гомогенатах тканей следует проводить только н отсутствие кислорода.

Л. Биохимические механизмы интиоксидантного действии о- , бензихинонов

В отличие от а-гокоферола н других фешш.ных и полнфенольных антиоксидантов молекулы о-бензохинонов и его нронзиодных не содержат активных атомов водорода, способных легко отрываться.при реакции со свободными радикалами. Поэтому антиоксидантпые свойства этих соединений могут быть обусловлены, во-первых, их способностью восстанавливаться в присутствии доноров электронов, конкурируя с окисли-тельно-восстановителышми системами, активирующими свободнорадикальные процессы в клетке (шунтирующее действие). Во-нторых, образующиеся при восстановлении о-бензохинонов дифенольные соединения могут являться ловушками активных форм кислорода и других радикалов, инициирующих свободнорадикальные реакции ».модельных системах и условиях целостного организма (антирадикалыюе действие). -

Эффективность шунтирующего и антирадикалыюго действия о-бензохинонов исследовали в микросомалыюй фракции печени крыс. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что о-бепЗохиноны способны ингибировать реакции окисления ксенобиотиков и ингцбирующий эффект о-бензохинонов растет с увеличением их концен трации. Используя преобразование по методу Лайнуивера-Берка, мы показали, что характер воздействия АМОВХ на процесс гидроксилирования анилина соответствует действию неконкурентного ингибитора, то есть снижается максимальная скорость реакции при неизменной величине константы Михаэлиса. Аналогичная картина

наблюдалась и при действии других о-бензохинонов. Чтобы оценить эффективность ингибиропания, графическим методом Диксона определяли значения констант ингибйрования (КО, приведенные в таблице 2.

Таблица 2

Некоторые параметры, характеризующие способность о-бензохинонов восстанавливаться НАДФН (Км), ингибировать гидрюксилированис анилина (Ю) и ССЛ4-зависимое ПОЛ(15о)

о-бензохиноны Км, ИГ5 М К!, Ю-5 М 150, 10"6М

АМОБХ 1,7 ± 0,2 1,7 ±0,2 0,3 ± 0,1

ОБХ1 4,2 ± 0,5 . 4,2 ±0,5 1,0 ±0,2

ОБХ2 6,7 ± 0,5 7,2 ± 0,5 5,0 ± 0,5 *

Шунтирующее действие о-бензохинонов может 6i.h i> оценено по их способности окислять НАДФН п присутствии мнкросомалыюй фракции. Поскольку значения максимальной скорости реакции (V = 0,26 • 1()"9М с"1 мг~') оказались одинаковыми для всех исследованных о-бензохинонов, их акцепторные свойства могут быть охарактеризованы величиной Км. Тот факт, что значения Км совпадают с соответствующими значениями К! (см. табл. 2), достаточно убедительно подтверждает способность данных соединений ингибировать гидроксилированис анилина и результате шунтирования НАДФН-спсцнфичной цени переноса элект ронов в микросомах печени на уровне ФП1, при этом восстановительные эквиваленты, благодаря высокой скорости окисления диоксибензолов, будут переноситься на кислород, минуя цитохром Р-450:

ФП1

НАДФН + Н+ + ОБХ — НАДФ+ + ОБХНз (1)

ОБХН2 + О2 — ОБХ + Н2О2 (2)

Следствием этого буде т снижение количества восстановительных эквивалентов, переносимых от НАДФН к цитохрому Р-450, то ость фактическое снижение концентрации реакционноспособиой формы последнего, что приведет к уменьшению максимальной скорости реакции гидроксилщхжания без измеиеии величины Км.

Процессы метаболизма четыреххдористот углерода и печени сопровождаются инициирова/шем свободнораднкальных рсакшш. И

юследние годы показана, что в результате гомолитического распада лолскулы ССЦ на цитохроме Р-450 образуется радикал СС1з- и радикал DCI3O2', инициирующий реакции иерекисного окисления лниидов. <\нтиокислительную активность о-бензохиионов в условиях ССЦ-ншц^ирусмого ПОЛ характеризовали величиной I50, соответствующей концентрации антиоксиданта, ипгибирующей образование ТБК-активных продуктов на 50%. Приведенные значении I50 (см. табл. 2) свидетельствуют, что исследованные о-бензохиноны, в концентрациях практически не способных шунтирован» НАДФН-сиецифичную цень переноса электронов, эффективно ингибируюг процессы иерекисного окислении, инициируемые в микросомах печени (JCI4. Наряду с активацией ПОЛ, добавление четыреххлористого углерода к микросомам печени имеет следствием ковалентное связывание продуктов его гомолиза с белками и линидами. В данном исследовании ковалентное связывание оценивали по количеству '^С из CCI4, остающегося в микросомах после многократного промывания метанолом. Сравнивая способность о-бензохинонон ннгибировать перекисное окисление липидов и ковалентное связывание в микросомах печени, инкубируемых с ССЦ, можно сделать вывод, что исследованные соединения оказывают различное действие на эти процессы. Так, ОБХ1, оказывавший при концентрации 4 мкМ эффективное антиокислительное действие, практически не влиял на процесс ковалентного связывания. Менее селективным было влияние на ПОЛ у АМОБХ. ОБХ2 избирательным действием не обладал и ингибировал оба процесса в равной степени (табл. 3).

Ингибирование ковалентного связывания и иерекисного окисления может быть обусловлено рядом причин: шунтированием транспорта электронов но НАДФН-сиецифичной цени, как это имеет место при иигибировашш о-бензохннонами гидроксилироиания анилина; вытеснением субстрата из фермент-субстратного комплекса цитохром Р-450 и ССЦ и, наконец, дезактивацией радикальных Метаболитов СС14.

Чтобы оценить, в какой степени шунтирующее действие о-бензохинонов может обусловливать их влияние на ПОЛ и ковалентное связывание, были сравнены данные, характеризующие действие о-бензохинонов на ССЦ-занисимые процессы и окисление амидопирина, являющегося, как и ССЦ, субстратом первого тина, но окисляющегося без образования радикальных метаболитов (см. табл. 3). На основании этих результатов можно сделать вывод, что шунтирующее действие

АМОБХ и ОБХ2 только на 20-30% обусловливает ингибирование ими ковалентного связывании, тогда как для ОБХ1 вклад шунтирующего действия является более существенным. В то же время, способность о-бензохинонон ингибировать процессы ССЫ-ишщиируемого ПОЛ не связана с их шунтирующим действием.

Таблица 3

Влияние о-бейзохшюнов на нск(УГор!,1е цитохром Р-450-зависимыс реакции в микросомах печени крыс

СС14-инициирусмые Гидроксилированпе

реакции ..амидопирина

Условия ПОЛ, ТБК- Ковалснтнос .Количество

экспери- активнме связ1,тание формаль-

мента соединения*, 14С из СС14*, дегида**.

в процентах в процентах в процентах

Исходная среда 100 ± 5,0 100 ± 4,0 100 ±6.2

инкубации (6,52 ± 0,59) (1,96 ±0,2) (64,9 ±4,0)***

+ АМОБХ, 2 мкМ 14 ±0,8 48 ± 0,4 82 ± 3,7

+ ОБХ1,4,мкМ -27 ± 0,4 98 ± 0,4 • 96 ± 4,6

+ ОБХ1,Ю мкМ 9 ± 0,4 74 ± 2,3 89 ± 3,7

+ ОБХ2,10 мкМ 50 ± 2,0 50 ±0,6 80 ± 2,3

+ ОБХ2, 30 мкМ 10 ± 0,4 20 ±3,5 61 ±4,2

* - значения рассчитывали но отношению к холостой пробе, не содержащей в среде инкубации НАДФН;

** - значения рассчитывали по отношению к холостой пробе, не содержащей в среде инкубации субстрата окисления - амидопирина;

*** - цифры в скобках - нмоль/мг белка.

При исследовании влияния о-бензохинонов на образовавне комплекса цитохром Р-450-СС14 установлено, что АМОБХ в концентрации, эффективно ингибирующей ковалснтнос связывание и ПОЛ, не оказывает существенного влияния на количественные параметр),1 спектральных изменений, сопровождающих образование комплекса цитохром Р-450-СС14; аналогичные результаты получены для ОБХ1, что свидетельствуют об отсутствии прямого влияния о-бензохиионов в исследованном диапазоне концентраций на образование фермент-субстратного комплекса цитохром Р-450-СС1.}.

Таким образом, основным механизмом, обуславливающим ингибирование ковалентного связывания о-бензохинонами, является способность этих соединений эффективно перехватывать радикал).ные

метаболиты СО4. В настоящее нремя имеются убедительные данные, свидетельствующие, что ковалентное связывание обусловлено, в основном, радикалом СОз, а иерекисное окисление лннидов инициируется ССЛ3О2' - радикалом. Поэтому можно допустить, что ОБХ2 способен взаимодействовать как с СС1з\так и с СО3О2' -радикалами. ОВХ1 в исследованном диапазоне концентраций практически не взаимодействует с СС1з' - радикалом, хотя, по-видимому, эффективно дезактивирует СО3О2' - радикал, ингибируя в результате это то перекисное окисление липидон.

Дальнейшие исследования показали, что нее изученные соединения являются эффективными ингибиторами ферментативного перекисного окисления липидон. Менее выраженный эффект наблюдался при аскорбат-зависймом процессе. Значения 150, характеризующие эффектинность ацтиоксидантного действия и численно равные концентрациям, при которых наблюдалось ингибирование перекисного окисления линидов на 50%, рассчитывались графическим методом на основании экспериментально полученных данных. Прн ннгнбировании ферментативного ПОЛ шест/, соединений оказались более эффективными, чем сильный синтетический антиоксидант - нонол (табл. 4).

Установлено, что в случае фементативного и аскорбаг-зависимого ПОЛ перенос электронов от различных носстатщитслей непосредственно на о-бензохиноны в обход путей, обеспечивающих протекание свободнорадикальных реакций, не определяет антиоксидантные свойства исследованных соединений. Так, при концентрациях о-бензохинонон в диапазоне [О] « Км АМОБХ только в 2,7 раза быстрее окисляет НАДФН, чем АМОБХС, в то же время АМОБХ приблизительно в 100 раз эффективнее при ингибировании фермента тинного ПОЛ. Аналогичные результаты получены и для аскорбаг-зависимого ПОЛ, при ингибировании которого АМОБХС, обладающий более выраженной способностью окислять аскорбиновую кислоту (к|[АМОБХС]/к1[АМОБХ] =4), менее эффективен, чем АМОБХ.

В последующих экспериментах была изучена связь между эффективностью антноксидантного действия о-бензохинонон и скоростью их восстановления в соответствующие диоксибензолы. С этой целью были проведены эксперименты, в которых варьировали скорость восс тановления АМОБХ и АМОБХС.

о

Таблица 4

Эффективность антиоксидантного действия (150) при ферментативном и аскорбат-зависимом перекисном окислении липидов и микросомах печени для ионола и производных о-бензохинона общей формулы:

1ЧН

о

И (ОБХ) или °

II

оа! з

И* (ОБХ*)

№/№ Антиоксидант И (И*)

150, НИ> М

Ферментативное Аскорбат-ПОЛ зависимое ПОЛ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8. 9.

АМОБХ

ОБХЗ

ОБХ4

ОБХ1 ОБХ5

ОБХ*6 Ионол

ОБХ*7 ОБХ*8

Н

п-СНз 'п-БОгИНг

802т

К). ОБХ*9

И. ОБХПО

12. ОБХ2

13. АМОБХС,

о-СПз

-О

N о

снгсн2-он

СН2-СН;-ОН — он

соон

-«»-О

БОг^аСОСНз

0,35 ± 0,1 32,0 ± 5 ,0

0,70 ±0,2 34,0 ±5,0

0,90 ± 0,2 -

1,10 ±0,2 2,8 ±0,5

1,50 ±0,2 -

1,70 ±0,2 -

3,70 ±0,5 1,45 ±0,2

4,10 ±0,5 -

4,50 ±0,8 -

5,50 ±0,5 150,0 ±10.0

6,50 ± 0.7 -

НШ ±1,0 -

30.0 ± 5,0 50.0 ± 6,0

Это достигалось добавлением и среду инкубации различного количества аскорбиновой кислоты в диапазоне от 1 до 4 мМ. При этом интенсивность аскорбат-зависимого ПОЛ не изменяется, а скорость восстановлении о-бензохипонов увеличивается пропорционально концентрации аскорбиновой кислоты. Показано, что степень ингибирования иерскисного окисления линидов о-бензохинопами также линейно зависит от концентрации аскорбиновой кислоты. Роль восстановленных дифенольных форм о-бензохиноноп п реализации их антиокендантного дейс твия показана также в экспериментах, в которых исследовали ингибирование аскорбат-зависимого ПОЛ без и в присутствии НАДН. Использование НАДН было обусловлено тем, что он, как и НАДФН, способен восстанавливать о-бензохиноны в присутствии микросом печени. При этом НАДН не способен заменит!. НАДФН в реакции инициирования ферментативного ПОЛ и не оказывает влияния на аскорбат-зависимое исрекиснос окисление линидов. Установлено, что внесение НАДН почти в 70 раз увеличивает эффективность аитиокислителыюго действия АМОБХ. Таким образом, необходимым условием ингибирования свободнорадикальных реакций производными о-бензохинона является их предварительное восстановление в дифенольные соединения.

Дифснольпыс формы'о-бензохипонов (ОБХН2) могут окисляться кислородом в результате многостадийной реакции, описываемой суммарным уравнением (2), приведенном на стр. 14, или реагировать с различными радикалами:

к3

С№ + 2К- — (} + 21Ш , (3)

где Я' может быть Ог"", 'ОН или пероксидные радикалы линидов.

В результате реакции 3 восстановленные о-бензохиноны будут ингибировать евободнорадикальные реакции, окисляясь до исходных бензохиионов, включающихся в новый цикл окислительно-восстановительных превращений. Поэтому, в отличие от фенольных антиоксидантов, каждая молекула производных о-бензохинона способна многократно участвовать в процессе 'ингибирования ПОЛ. Этот вывод согласуется с экспериментальными данными, полученными при исследовании кинетики ферментативного иерскисного окисления линидов п присутствии ионола и АМОБХ. Установлено, что ингибирующий эффект ионола быстро снижается в ходе реакции по мере расходования антиоксиданта. В то же время АМОБХ эффективен

в течение всего периода инкубации (рис. 1), поскольку в системе поддерживается постоянная концентрация ОБХНг.

При изучении механизма антиоксидантного действия производных о-бензохинона необходимым этаном является. выяснение природы радикалов, реагирующих с ОБХН2. По-видимому, определенный вклад в решение этого вопроса может дать сравнение дииамнкн образования диеновых коньюгатов в процессе развития ПОЛ без и и присутствии аитиоксиданта. Это обусловлено тем, что соединения, взаимодействующие с вероятными инициаторами процессов нерекисного окисления липидов (Ог" или ОН), способны полностью блокировать образование сопряженных двойных связей. Антиоксидангы, взаимодействующие с иерекисными радикалами линидон, не могут предотвратить образование сопряженных двойных связей в стадии инициирования свободнорадикальных реакций, а напротив, стабилизируют лииидные молекулы с такими связями, предотвращая их разрушение в реакциях нерекисного окисления.

Установлено, что нри добавлении АМОБХ в инкубационную среду в концентрации, полностью ингибирующей ферментативное ПОЛ (2,5 мкМ), количество соединений с сопряженными двойными связями не изменяется в течение всего времени икубации. На основании этих результатов можно сделать вывод, что ингпбиррванпе процессов иерекненого окисления липидов 4-аншшио-5-мс'1хжеи-1,2-бензохиноном обусловлено способностью его восстановленной формы реагировать с инициаторами ПОЛ.

Таким образом, приведенные в данной главе данны* свидетельствуют, что производные о-бензохинона снособнь вовлекаться в окислительно-восстановительные реакции, прсугекакицш н эндонлазматическом ретикулуме печени, совершая нри это» циклический переход между окисленной и восстановленной формами Восстановленные о-бензохиноны являются ингибиторами нерекисног окисления липидов и других свободнорадикальных реакций.

4. Исследование антиоксидаптньго действия флшюноидои

С целью экспериментального подтверждения способное! флавоноидов ингибировать процессы нерекисного окисления липидов результате ка*к хелатирующего, так и антирадикальго действи: сравнивалась эффективность действия ругана и кверцетина при ССЦ-НАДФН-инициируемом нерекисном окислении липидов в микросом; нечени крыс (табл. 5).

Рис. ■(. Кинетика ингибиропания ферментативного нерекисного окисления липидои ДМОБХ и ионолом.

1-н отсутстние антноксидантон;

2 - 0,9 икМ нонол;

3 - 0,2 мкМ АМОВХ; 1 - 0,4 мкМ ДМОБХ;

Каждая точка представляет собой среднее значение из 3 зкенериментоп; среда инкубации: 0,02 М N«01. 0.05 мМ НАДФН, 5 мкМ ГеЗОд. 0 05 М фосфатный буфер. рН 7.4. белок -0.6 зг/мл.

Таблица 5

Антиоксидантное действие фланоноидоп и условиях ферментативного перскисного окисления линидон в микросомах исчени крыс

Концентрация Количество образующегося МДА, нмоль/мл суспензии флавоноидов, _]_

КГ5 м НАДФН-'зависимое ПОЛ* ССЦ-зависимое ПОЛ**

Кверцетин, 0,0 « 10,3 ±0,4 4,0 ± 0,1

0,25 7,1 ± 0,1 -

0,5 6,6 ± 0,1 2,1 ± 0,2

1,0 2,1 ± 0,4 1,2 ±0,6

2,0 - 0,5 ±0,1

Рутин, 0,0 13,0 ± 0,2 7,2 ±0,2

2,0 9,1 ± 1,0 -

4,0 2,1 ± 0,6 -

8,0 0,2 ± 0,2 • 4,0 ± 0,1

16,0 • 3,3 ± 0,1

32,0 - 1,8 ± 0,1

* - время инкубации 5 мин;

** - время инкубации 7,5 мин. Прочерк означает отсутствие данных.

В обоих случаях наблюдалось ингибирование образования малонового диальдегида, однако, эфективность кнерцетина и, особенно, рутина в первой системе, где выявлялся только антирадикальный эффект, была значи тельно ниже, чем во второй, где дополнительно реализовывался хелатирующий механизм.

При исследовании способности флавоноидов взаимодействовать с различными радикалами установлено, что кверцетин является хорошей ловушкой линидных радикалов и анион-радикала кислорода, константа скорости второго порядка для реакции с С>2" равна 1,85• К)5 М-'с-1. Рутин практически не взаимодействовал с радикалами линидон и оказался значихельно менее эффективной ловушкой анион-радикала кислорода, константа скорости второго порядка равна 0,55-11Р М-'с1. Поэтому в модельной системе рутин ингибирует ПОЛзначителыю лучше как хслагор, чем антирадикал!.ный агент. Различная эффективность антирадикалыюго действия кнерцетина и его гликозида рутина, по-видимому, обусловлена отсутствием в молекуле последнего

книжного атома водорода п положении 3 хромонового фрагмента-, мещенпого на гликозидную группу.

Автоокисленне фланоноидои и, в частности, окисление шрцетина, представляет собой, при определенных условиях (рН 10. ГМЕДА), ценной спободнорадикальный процесс, при котором в oiecnie промежуточного продукта образуется анион-радикал (елорода. По-видимому, высокое значение 'рН необходимо для гсдотнращения спонтанной дисмутации Ог~. Можно предположить, что гидрофобных зонах клетки также возможно окисление кверцетина, шронождающееся генерацией анион-радикал кислорода. Не :ключено, что выянленннй рядом исследователей мутагенный эффект !ерцетина связан с данным феноменом.

Реакция аугоокисления кнерцетина п присутствии ТМЭДА имеет рактический интерес, поскольку может быть использована для [феделепия суиероксиддисмутазной активности в биологическом атериалс. Проведенные исследования свидетельствуют о высокой увствитсльности, специфичности и простоте метода определения стивности СОД по торможению реакции аутоокисления кверцетина. В ястности установлено, что средняя величина чувствительности метода вставляет 5,22-10-И г/мл. Чувствительность, характеризуемая ¿личиной ID50 (концентрация нятидесятинроцентного ингибиромания ¿акции), составляет не менее 1,5-1 О*" г/мл. Эти показатели на 1-2 [>рядка выше, чем у широко распространенных "ксантин-сантиноксидазного" и "адреналинового" методов. Тесты на "открытие" "линейность", проведенные по общепринятым схемам, позволили [слать следующие заключения:

содержащиеся п биологических жидкостях и тканях эндогенные «тиоксиданты. гемоглобин и другие интерферирующие агенты не пияют на протекание биохимической реакции, лежащей в основе редлагаемого метода, и не искажают результаты определения СОД ри рекомендуемых рабочих разведениях;

ме тод не требует предварительной обработки анализируем!,ix проб.

5. Саобо(Ь1(>радикальный механизм повреждения печени четыре ххм>ристы.и углеродом. Особенности защитного действия о

бен.юхшюшю.

Имеющиеся н настоящее время данные свидетельствуют, что жсическое действие чстыреххлористого углерода обусловливают, мпимм образом, дна процесса, протекающих в печени: перекипи ?ислепне линидов |;1ло.)лм|.шрон.ише н pc:i\льт.пе коналентных

сшивок радикальных продуктом гомолиза CCI4 с белковыми и другими макромолекулами. Детальное исследование влиянии производных о бензохинона на эти процессы in vitro и in vivo выявило, что ОБXI в концентрациях, Практически полностью ингибирующих псрскиснос окисление линидов, не оказывал существенного влияния на галоалкилирование. Такая избирательность антирадикального действия данного соединения позволила использовать его в экспериментах но исследованию механизмов токсического действия тстрахлорметана in vivo. Полученные данные свидетельствуют, что ингибиронание иерекисного окисления линидов не устраняет инактивирующего действия ССЦиа процессы микросомального окисления и белкового синтеза в клетках печени. В частности, показано, что инактивация системы микросомального окисления печени крыс, происходящая в верные часы после отравления тетрахлормстаном, сохраняется после практически полного ингибирования иерекисного окисления линидов (табл. 6). .

Таблица 6

Содержание диеновых кон1>к)гатоц'.и состояние системы микросомального окисления печени крыс через 2 часа после отравления CCI4 (100 мкл/1(Х) г массы тела) без и на фоне предварительного введения ОБХ1

Условия Дисно- Параметры системы микросомального окисления

экснери- вые ■ ________

мента копью- Цитохром Р-450 N-гидроксилаз- Способность

гаты, нмоль/мг белка ная активность иницищювать нмоль/г (анилин) . CCI4-зависимое

ткани нмоль/ MOJI, МДА,

(мг . мин) нмоль/(мг . мин)

Контроль 0 0,82 ± 0,10 0,52 ±0,10 1,04 ±0,20

и=6

CCI4 194,9 0,37 ±0,03 0,10 ±0,02 0,07 ± 0,03

н = 6

ОБХ1+СС14 30,5 0,45 ± 0,03 0,185± 0,04 0,12 ±0,04

и=6 -

Отмеченное в более поздние сроки (через 48 ч) снижение содержания в печени ключевых ферментов антиокислитслмюй защиты супероксиддисмутазы и каталазы - также не зависит от ПОЛ. В то же

время цитотоксичсское действие продуктоп ПОЛ экспериментально нодгнерждсио во многих исследованиях и не вызывает сомнений. Возникшее противоречие легко разрешимо, если допустить, что in vivo только незначительная часть нероксидон липидов, образующихся в печени в результате первичной атаки радикала CCI3O2", вовлекается в процессы радикального разрушения до альдегидов и других токсичных низкомолскулярпых продуктов. Основное же количество нероксидон быстро восстанавливается в соответствующие оксисоедннсния, обладающие характерным максимумом поглощения нри 232 им, но неспособные участвовать в дальнейших свободнорадикальных процессах. Поэтому радикал CCI3O2' является менее цитотоксичным агентом, чем радикал СС1з . Полученные экспериментальные результаты о соотношении основных продуктов нерекисного окисления липидов, образующихся в модельных системах и in vivo, подтвердили сформулированную выше рабочую гипотезу. Так, нри инициировании нерекисного окисления липидов в микросомах печени крыс количество конечных продуктов значительно превышает содержание диеновых ко1п,1огатов и гидронсроксидов, причем соотношение последних близко к I, то есть диеновые конг.югаты преимущественно являются гидроисроксидами липидов. В условиях in vivó содержание вторичных щюдуктон ПОЛ и гидропероксидов значительно меньше, чем уровень диеновых кон-ыогатов, которые в этом случае являются преимущественно оксипроизводными липидов (рис. 2). Основным повреждающим фактором нри интоксикации тсрахлормстаном является, по-видимому, ковалентное связывание радикальных метаболитов CCI4, главным образом СС1з-, с соответствующими белковыми молекулами.

ГТри исследовании механизмов, обеспечивающих эффективное восстановление линидных гидронероксидо» и особенностей их внутриклеточной локализации, установлено, что гидронерокенды полиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав экзогенных фосфолинидов н фосфолинидов внутриклеточных мембран, способны восстанавливаться в соответствующие оксисоединения без предвари/ель/тго гидролиза с помощью фосфолиназы Л^. Этот процесс катализируется несколькими цнтонлазматичсскими белками. Один из них, использующий в качестве доноров водорода восстановленный глутатион. описан в настоящее время как новый фермент - моиомериая глутатионпероксидаза. Приведенные в данном ра!Де Ь' ре ьльппы явились ,кенернменгальным и теоретический

обоснованием для проведения работ по выделению и идентификации указанного фермента.

П ТБК-активные соединения И Диеновые кокъющты ® Гидропероксиды Рис. 2 Соотношение между основными продуктами нерекисного окисления лииидов in vitro (А) и in vivo (Б).

В настоящее время установлено," что процессы детоксикации различных ксенобиотиков, протекающие в печени, часто' сопровождаются образованием активных радикальных метаболитов. Образующиеся радикалы способны инактивировать ферменты и индуцировать изменения в информационных молекулах. Поэтому значительно менее онасные для клетки реакции радикалов ксенобиотиков с полиненасыщенными ацилами фосфолинидов, ферментативное восстановление образующихся гидронероксидов и последующее удаление окисленных фосфолинидов с помощью фосфолипазы Аг можно рассматривать как механизм эффективной дезактивации радикальных метаболитов ксенобиотиков. 6. Исследование защитного действия антиоксидантов в интактных клетках при экспериментальном окислительном стрессе В последние годы нри изучении механизмов ишемических и ренерфузионных повреждений, большое внимание уделяется исследованию процессов, протекающих в эндотелиальных клетках. Установлено, что нри ишемии различных органов и тканей ксантиндегидрогеназа, присутствующая в эндотелиальных клоках.

прекращается it ксаптппоксидазу (О-форма). В условиях рснерфузии О-форма фермента катализирует окисление различных нурннон, перенося электроны на молекулярный кислород и продуцируя анион-радикал (О2" ). Образующийся 02" запускает каскад реакций, приводящих к многократному увеличению внутри- и внеклеточного уровня активных форм кислорода-. Другим потенциальным источником активных форм кислорода в условиях рснерфузии тканей являются нсйтрофилы. Они накапливаются в зоне первичного повреждения, благодаря хемоатрактантным свойствам 02" и поврежденных эндотелиальных клеток. Реагируя с различными стимулами, нсйтрофилы активируются, в них развивается дыхательный взрыв, сопровождающийся высвобождением протеолитических ферментов и образованием 02", НОг\ сннглстного кислорода, иероксинитрита (0N00"), гидроксилыюто радикала ( ОН). В случаях, когда антпокнслительная защитная система кле тки не в состоянии полностью детоксициронать активные формы кислорода и продукты их реакций с макро- и низкомолскулярнымн соединениями, развивается окислительный стресс. Его характерной особенностью является активация свободнорадикальных реакций, непосредственно повреждающих клетки и являющихся пусковым механизмом других патогенетических процессов, прнподящих к повреждению органа и организма в целом. Биоантиокислители и другие фармакологические агенты способны предотвратить последствия окислительного стресса и уменьшить реперфузионные повреждения органон и тканей, ингибируя превращение ксантиндсгидрогсназы в ксантиноксидазу, убирая активные формы кислорода и свободные радикалы, связывая ионы железа. Исследование механизмов защитного действия этих соединений н поиск наиболее эффективных препаратов требует адекватных биологических моделей. В данной работе в качестве вероятных индукторов окислительного повреждения использовали адреналин и гидропсроксид линоленой кислоты.

Показано, что адреналин не оказывал повреждающего действия на культивируем!,ie эндотелиальные клетки и, следовательно, не может быть использован дли моделирования окслителыюго повреждения эндотелия. Добавление гидронсроксида линоленой кислоты в среду для культивирования эндотелиальных клеток вызывает их повреждение, связанное с утратой барьерной фукции и целостности цитоплазма ппсских мембран и выходом из клетки компонентов цитоплазм!.!, включая и макромолекулы. Степень и кинетика повреждения эндотелиальных клеток гидропероксидом лннолевой

кислоты зависит от концентрации повреждающего агента, продолжительности воздействия и содержания эмбриональной телячьей сыворотки в среде инкубации. Для подтверждения роли свободнорадикальных реакций в процессе повреждении эндотслиальных клеток гндронероксидом лшюлевой кислоты была исследована:

- кинетика накоилелия продуктов иерекисного окислении липидов (ТБК-активных соединений) и потребления восстановленного глутатнона в процессе развития повреждения;

- влияние дефероксамина (хелатор ионов железа) на кинетику повреждения эндотелиаЛьных клеток гндронероксидом лшюлевой кислоты;

' - илляние антиоксидаитов на кинетику повреждения эндотелиальных клеток гндронероксидом лшюлевой кислоты;

- влияние антиоксидантов на образование ТБК-активных Продуктов и потребление восстановленного глутатнона в эндотслиальных клетках, инкубируемых с гндронероксидом лшюлевой кислоты;- .

В результате проведенных исследований установлено, что повреждение эндотслиальных клеток обусловлено активацией свободнорадикальных реакций и ингибируется синтетическими фенолами и о-бензохинонами (табл. 7). Было также показано, что защита клеток от действия экзогенных нерокендов обеспечивается внутриклеточными системами и компонентами сыворотки крови. Дли дальнейшего исследования выявленных эффектов в качестве экспериментального объекта были использованы эритроциты. Такой выбор обусловлен рядом методических преимуществ, характерных для работы с -эритроцитами, и тем обстоятельством, что они, как и эндотелнальные клетки, находятся в постоянном контакте с плазмой крови. Вместе с тем, исследование действия гндропероксидов на различные типы клеток даёт возможность выявить специфику и закономернос ти их окислительного повреждении.:

Полученные результаты и имеющееся данные литературы позволили предложить механизм повреждения клеток при действии гидронерокендов липидов, схематично представленный 11а рисунке 3. В этом процессе можно выделить ряд этапов. Первый из них характеризуется переходом добавленного гидроиероксида из среды инкубации в клетку. Длительность процесса зависит от типа клеток и составляет дли эритроцитов несколько минут, а для эндотслиальных кле ток десятки минут. Проникающие в клетки. молекулы

гндронсроксида восстанавливаются глутатионпероксидазой за счет внутриклеточного фонда восстановленного глутатиона.

Таблица 7

Влияние ОБХ1 и 2-гндроксиэстрадиола на содержание ТБК-нктпиных соединений и лизис эндотелиальных клеток после их инкубации с гидронсроксидом линоленой кислоты (150 мкмол!,/л) и среде,не содержащей эмбриональной телячьей сыворотки

Степень ингибиронания, процент

Концентрация __

антиоксида1гпя1, •• Образование ТБК-активных выход ЛДГ из мкмоль/л соединений, клеток

ОБХ1.10 31,5 ±2,0 27,2 ±5,0

ОБХ1, 20 38,9 ±5,0 47,3 ± 7,0

ОБХКбО 47,0 ± 5,0 84,2 ± 3,0

ОБХ1.120 50,5 ± 3,0 87,5 ± 0.5

2-ОН-эстрадиол, 1 24,7 ± 5,0 34,6 ± 5,0

2-ОН-эстрадиол, 2 40,4 ±12,0 56,6 ± 1,0

2-011-эс градиол, 5 57,9 ± 3,0 ■ 86,4 ± 5,0

2-ОН-эстрадиол, 10 56,9 ± 5,0 78,2 ± 2,0

* - время инкубации 120 мин

При добавлении достаточно большого количества гндронсроксида (в случае эритроцитов > 1 молекулы на четыре молекул!.! восстановленного глутатиона) резервы глутатионнероксидазной защитной системы исчерпываются и начинается второй этан, характеризующийся разрушением накапливающихся нероксидов свободными и связанными ионами металлов и образованием алкоксильных и алкилиерекисных радикалов. Образующиеся радикалы дезак тивируются внутрикле точным фондом анпюксидантов. Па треп.ем этапе, наступающем после расходования внутриклеточного фонда антноксидантов. образующиеся радикалы инициируют процессы перекисного окисления мембранных липндов. модифицируют макромоле кул 1.1, обеспечивающие структурно-функциональную целостность клеток. Эти процессы приводят к лизису клеточной мембраны и разрушению клетки на четвёртом эт апе.

В соответствии с предлагаемой схемой, исследованные., экзогенные аитноксидашы оказывают защитное действие на 2 и Л

этапах, дезактивируя алкоксильные и алкилнерекисныс радикалы, ингпбируя процессы нсрскисного окисления липндон.

Рис.3. Возможный механизм цитотоксического действии гндропероксида липолсвой кислоты

ВЫВОДЫ .

1. Впервые показано, что производные о-бензохшюна являются эффективными инщбиторами окислительных процессов in vivo и и модельных биологических системах. Механизм антиоксидантного действия о-бензохинонон включает стадию их ферментативного или неферменгатинпого восстановлении до активных форм, эффективно перехватывающих свободные радикалы и окисляющихся при этом в исходные xinioHbi. Механизм ингибиронании нерадикальных резки'

микросомалыюго окисления основан на способности производных о-бензохииона шунтнронать электронтрапспортные цени на уровне фла нон роге и дон.

2. Иш ибировапис производными о-бснзохинона СОд-инициируемых свободнораднкал1»1н.1Х процессов и микросомалыюй фракции клеток печени является, следствием дезактивации радикальных метаболитов тетрахлормстаиа и не затрагивает процесс их образования. Среди исследованных соединений выявлен 4-[1Ч-натрий-М-(5-этил-1-,3,4-тиадназол-2-ил)]-сульфаниламндо-5-метоксн-1,2-бензохинон (ОБХ1), который избирательно взаимодействуете радикалами, инициирующими нерскисное окисление линидои, но не перехватывает радикалы, вовлекающиеся в процессы галоалкнлироиания. Выявленные свойства позволяют использовать ОБХ1 в качестве фармакологического инструмента при исследовании механизма гепатотокснческого действия галогензамещенимх углеводородов.

3. На основании результатов исследования ингибнрутощей активности рутина и его агликона кверцетина (группа витамина Р) при инициировании свободнорадикальных процессов в модельных бесклеточных системах сделан.вывод, что эти соединения являются эффективными хелаторами и ловушками анион-радикала кислорода, других свободных радикалов и могут рассматриваться н качестве перспективных нетоксичных препаратов ан пюксидантного действии.

4. Показано, ч то реакция окисления кнерцетина и щелочной среде является примером цепного свободнорадикалыюго процесса, при котором в качестве промежуточного продукта образуется аиион-радикал кислорода. Предложено использовать данную реакцию для высокоснецифичного и чувствительного метода определения фермента сунсроксиддисмутазы в биологическом материале.

5. Установлено, что повреждение системы микросомального окисления и нарушение детокенцирующей функции клеток печени крыс in vivo, происходящее п первые часы после отравления тетрахлорметаном, обусловлено галоалкилированием соответствующих ферментов. Протекающие в этих условиях процессы нерекпепого окисления лшшдов значительно менее опасны дли клетки, так как экспериментально показано, что образующиеся гидропсроксидм иолинснасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолииндов внутриклеточных мембран, ферментативво восстанавливаются в соответствующие оксисоедннения, не накапливаясь в клетках и не вовлекаясь в процессы вторичного инициирования.

6. Разработаны новые экспериментальные методики исследования свободнорадикальных процессов, включающие определение диеновых конъюгатоп и ТБК-актинных продуктов в условиях, обеспечивающих высокую специфичность анализа. Эксперимен тально подтверждено, что выбранные параметры адекватно характеризуют состояние процессов псрскисного окисления линидов in vivo.

7. Разработана удобная, воспроизводимая модель окислительного повреждения интактных клеток с помощью гидропероксида линолевой кислоты. Данную модель предложено использовать для исследования внутри- и внеклеточных защитных систем, поиска природных к син тетических средств фармакологической защи ты.

8. 4-^нштрий^-(5-;л™-1,3,4-тиадиазол-2-ил)]-сульфашш»мидо-5-метокси-1,2-бензохиион 1г2'-гидрокспэстрадпол обладают выраженным защитным действием при повреждении эритроцитов и культивируемых эндотелиальных клеток гидронсроксидом линолевой кислоты. Цитонротекторный эффект .исследованных соединений обусловлен ингибированием свободнорадикальных реакций. Целесообразны дальнейшие фармакологические исследования 4-[N-натрии-М-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)]-сульфаниламндо-5-метокси-1,2-бснзохинона и 2-гидроксиэстрадиола с целью создания на их основе лекарственных препаратов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1 Костюк В.А., Лунсц Е.Ф. Ингибированис производными о-бензохинонаперекисното окисления лииидов в микросомах печени // Биохимня.-1983.-Т.9, № 9.- С. 1491 -1495

2. Костюк В. А., Потапонич А.И., Лу.нсц Е.Ф. Снектрофотометрическое определение диеновых копыогатов // В()пр.мед.хнмии. -1 У84.-Т.30, № 4,- С.125-127

3. Костюк В.А., Потапонич А.И. Анализ некоторых методов Определения продуктов иерекненого окисления • линидов // Кислородные радикалы в химии и биологни.-Минск,-1984.- С.49--53

4. Kosiyuk V.А:, Komura S.,and Yagi К. Reduction of Various Lipid Hydroperoxides by Rat Liver Homogenate // Biochem. Int. -1985-Vol.11, -P.K03-808.

5. Лунец Е.Ф., Кучуро СВ., Костюк В.А. Влияние перекисного (окисления лииидов па активность М»-АТФазы мозга и печени // Вопр.мед.хнмии.-1986.-Т.32, № 4,- С.32-34

6. Костюк В.А. Возможные пути восстановления пероксидои дипидов н печени и их внутриклеточная локализация И Биохимия.-1986.-Т.51, № 7.- С. 1059-1065

7. Костюк В. А. Устойчивость продуктом окисления липидов в печени крыс и нуги их утилизации // Биохимия.-1986.-Т.51, № 8.- С.1392-1397

8. Костюк В. А., Потапокич А.И. Определение продуктов нерекисного . окисления липидов с помощью тиобарбитуровой кислоты в

анаэробных условиях // Воир.мед.химии.-1987.-Т.ЗЗ, № 3.- С.115-118

9. Костюк В.А. Ингнбиронание микросомального окисления производными о-бензохиноиа // Биохимия.-l 987.-Т.52, № 3.- С.335-358

10. Потапович А.И., Костюк В.А. Алтпокислительное действие производи!,ix о-беизохинона в условиях СС14-иидуцнруемого нерекисного окисления линндов в печени крыс// Биохимия.-1988,-Т.53, № 2.- С.233-237

11. Костюк В. А., Потапович А.И., Терещенко С.М., Афанасьев И.Б. Антнокнслнтел/.наи активность флавоноидон н различных системах нерекисного окисления липидов // Биохимия.-l988.-Т.53, № 8.-С.1365-1370

12. Кочубеев Г.А., Фролов A.A., Костюк В.А., Пропекая И.В., Гуринович Г.П. Фотодинамнческое действие хлорина сб на мембраны эритроцитов // Биофизика.-1988.-Т.ЗЗ,№3.- С.471-474

13 Косткж В.А., Погапонич А.И. Биохимические механизмы антиоксидантного действия производных о-бензохинона // Кислородные радикалы в химии, биологии и мсдицине.-Рига, 1988.-С.43-45

14. Костюк В.А., Потапович А.И. Роль ашюн-радикала кислорода в процессах ауто- и фогосенсибилизнрованного окисления фланоноидов // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине.-Рига, 1988.- С.45-54

15. Потапович А.И., Костюк В.А., Терещенко С.М., Афанасьев И.Б. Антнокнслительная активность флавоноидон в системе мнк|х>сомалыюго нерекисного окислении // Кислородные радикал/,! в химии, биологии и мсдицине.-Рига, 1988,- С.187-1У0

.16. Костюк В.А.. Погапонич А.И., Терещенко С.М. Витамины группы Р: некоторые молекулярные механизмы биологического действия // Биохимия,Сборник еттией.-Минск. 1989,- С.45-50

-3.1-

17. Al'anas'ev I.В., Dorozhko А.1., Brodskii A.V., Kostyuk V.A., Potapovitch A.I. Chelating and Free Radical Scavenging Mechanisms of Inhibitory Action of Rutin imd Quercelin in Lipid Peroxidation // Biochem Pharmacol.-1989,- Vol.38, -P.1763-1769

18. Kostyuk V.A., Potapovitch A.I. Superoxide-driven Oxidation of Quercetin and a Simple Sensitive Assay for Determination of Superoxid' Di.smutase// Biocheur Int. -1989.-Vol.19, -P.l 117-1124.

19. Костюк В.А., Потапович A.M., Ковалева Ж.В. Простой чувствительный метод определения актин ноет супероксидаисмутазы.'Ьснованнын па реакции окисления кверцетш IIВопр.мсд.химии.-1990.-Т.3б, № 2.- С.88-91

20. Kostyuk V.A. Influence of Chelating Agents on Activity of Antioxidai Enzymes // PIzen.Lek. Shorn. -1990.-Vol.62, -P. 173-174

21. Potapovich А.1., Kostyuk V.A., and N.F.Soroka, Chelating am Antioxidant Action D-penicillamine on Free Radical Oxidation /, PIzen.Lek.Sbom. -1990.-Vol.62, -P. 175-176

22. Костюк В.А., Потапович А.И., Сорока Н.Ф. Аптнокислитсльная активность противоаргритных препаратов // Вопр.мсд.химпи.-l 990.-Т.36, № 3,- С.37-39

23. Сорока Н.Ф., Костюк В.А., Потапович А.И. Обладают ли антиоксидантноп активностью нестероидные противовоспалительные средства? // Ревматология.-1990.-№ 2,- С.34-36

24. Костюк В.А. Влияние производных о-бенэохинона на свободнорадикальные процессы, инициируемые в микросомах печени крыс четыреххлористым углеродом // Биохимия.-1991.-Т.56, № 1.-С.109-114

25. Костюк В.А. Роль коиалентного связывания и перскисного окисления липидов в повреждении печени четыреххлористым углеродом // Биохимия,-1991.-Т.56, № 10,- С. 1878-1885

26. Костюк В.А. Использование системы гентан-нзопропанол для экстракции первичных продуктов перскисного окисления лшшдоп II Укр.б1юхим.журн.-1991.-Т.63, М> Ь-С/Ж-КИ

27. Kostyuk V.A., Potapovich А.1., Tereshchenko S.M. 4-(4-R-phenylamino)-5-methoxy-l,2-benzoquinones are New Selective Inhibitors of Carbon Tetrachloride-initiated Free Radical Reactions in Liver.// Biochem. Int. -199l-Vol.25, -P.167-172.

28. Kostyuk V.A.. Potapovich A.I. Damage of the Liver Microsomal Mixed Function Oxidase System by Carbon Tetrachloride. In vivo Study with

Selective Inhibitor of Lipid Peroxidation // Biochem. Int. -1991-Vol.25, -P.167-172.

29. Сорока Н.Ф., Костюк В.А., Погапович А.И. Механизм антиокислитслыюго действия Д-пеницилламина И Эксиерим. и клин. фармакол.-1992.-Т.55, № 3.- С.42-43

30. Костюк В.А. , Погапович А.И., Маслова Г.Т. Состояние антиокислительной защитой системы печени крыс при отравлении четыреххлористым углеродом П Укр.биохим.журн.-1992.-Т.64, № 6.-С.114-116

31. Kostyuk V.A., Ishida N., Komura S., Ohishi N.Yagi K. Inhibitory Effect of Antioxidants on Bovine Aortic Endothelial Cell Injury Induced by Lipid Hydroperoxides // Proceedings of the 5th international Congress on Oxygen Radicals. Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam. -1992,-P. 126-139

32. Костюк В.А., Погапович А.И., Маслова Г.Т. Реакция системы антиокислительной защиты печени при отравлении четырс'ххлорнстым углеродом //"Актуальные нрблсмы современной биохимии." Сборник статей.-Минск, 1991.- С.20-21

33. А.с. 1185242 СССР. Способ определения диеновых коньюгатов 7/Открытия.-1985.-№38 (соавт.: А.И.Потанович, Е.Ф.Лунец)

34. А.с. 1521773 СССР. Способ определения диеновых коньюгатов //Открытия.-1989.49 (соавт.: А.И.Потанович, И.Б.Афанасьев)

Подписано к печати 31.01.94 г. Формат 60 х 84 /16. ООьём 2 п. л. Тираж 1(Х) экз. Закат № 44. Пес платно.

Отпечатано на ро пшринте Нслгосунинсрснтета. 22Ш80г. Минск, ул. БоОруйская, 7.

А