Выделение и структурно-функциональная характеристика металлопротеиназы и сериновой коллагенолитической протеиназы-2 камчатского краба (Paralithodes camtschatica) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СЕМЕНОВА Светлана Александровна

ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ И СЕРИНОВОЙ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕИНАЗЫ-2 КАМЧАТСКОГО КРАБА 0РАЙАиТНООЕв САМТБСНА Т/СА)

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени

кандидата химических наук . у

№

/

Москва - 2008

003457637

Работа выполнена в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук

Руденская Галина Николаевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Ротанова Татьяна Васильевна доктор биологических наук, профессор Соловьева Нина Ивановна

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие

«Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Защита состоится 23 декабря 2008 г. в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, строение 40, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ, ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 ноября 2008 г.

Учёный секретарь Совета кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протеолнтические ферменты ракообразных обладают рядом необычных свойств и находят широкое применение в медицине и биотехнологии. У многих видов крабов и креветок обнаружены сериновые коллагенолитическне протеиназы (СКП), которые способны гидролизовать коллаген в физиологических условиях и поэтому успешно используются для лечения рубцово-изменённой ткани. Ферментные препараты из ракообразных также являются эффективными средствами лечения ран, так как разрушают избыточные фибриновые отложения. При этом действие индивидуальных протеиназ из ракообразных на фибриноген, фибрин и другие белки плазмы крови мало изучено. Исследование взаимодействия протеиназ с компонентами плазмы крови имеет большое значение для создания более эффективных ферментных препаратов.

Для полной характеристики некоторых протеиназ камчатского краба, обладающих широкой первичной специфичностью, требуется исследование их взаимодействия с высокомолекулярными субстратами. Данные о влиянии пространственной структуры белковых субстратов на эффективность протеолиза представляют несомненный теоретический интерес и могут быть использованы для разработки методик изучения пространственной структуры белков с помощью ограниченного протеолиза. Расширение набора ферментов, используемых для ограниченного протеолиза, в том числе внедрение высокоактивных и доступных в больших количествах протеиназ ракообразных, безусловно, откроет новые возможности для исследователей.

Для пищеварительных сериновых протеиназ ракообразных характерно наличие изоформ. Сходство первичной структуры изоформ при заметных различиях в некоторых свойствах делает эти белки привлекательными объекташ для изучения структурно-функциональных взаимосвязей.

Температура среды обитания камчатского краба составляет +4 .. .+8°С, и поэтому ферменты этого беспозвоночного, вероятно, приспособлены к функционированию при низких температурах. Протеиназы психротрофных организмов представляют интерес для биотехнологии. Структурно-функциональные исследования таких ферментов имеют большое значение для белковой инженерии. Большинство исследованных протеиназ из психротрофных организмов принадлежит к семейству трипсина, а ферменты других семейств мало изучены, хотя известно, что механизмы холодовой адаптации протеиназ, принадлежащих к разным семействам, могут различаться. Определение характера зависимости кинетических констант от температуры - важный этап изучения любого фермента, приспособленного к низким температурам. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение двух эндо-пептидаз камчатского краба - металлопротеиназы, принадлежащей к семейству аста-

цина, и изоформы сериновой коллагенолитической протеиназы (сокращённое обозначение - СКП-2). Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Получение металлопротеиназы и СКП-2 в электрофоретически гомогенном состоянии.

2. Анализ первичной структуры металлопротеиназы и доказательство её соответствия структуре, определенной по кДНК. Исследование структуры СКП-2 с помощью масс-спектрометрии.

3. Определение энзиматических свойств выделенных протеиназ.

4. Изучение температурной зависимости кинетических констант гидролиза различных субстратов металлопротеиназой и СКП-2.

5. Исследование действия металлопротеиназы и СКП-2 на фибриноген, фибрин, плаз-миноген и плазму крови, а также на коллаген. Идентификация высокомолекулярных продуктов гидролиза фибриногена с помощью масс-спектрометрии.

Научная новизна и практическая значимость работы. Исследована первичная структура и определены свойства металлопротеиназы камчатского краба - нового представителя семейства астацина. Первичная структура СКП-2 - изоформы сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба - установлена частично. Определены свойства СКП-2, в том числе кинетические параметры гидролиза хромогенных субстратов. Охарактеризована зависимость кинетических параметров гидролиза азо-казеина метшшопротеиназой и хромогенных субстратов СКП-2 от температуры. Охарактеризованы высокомолекулярные продукты гидролиза фибриногена металлопротеиназой краба и СКП-2.

Фибринолитическая активность исследованных протеиназ и их способность активировать плазминоген, а также коллагенолитическая активность СКП-2 имеют большое значение для разработки новых средств лечения рай и рубцов. Получено положительное решение по заявке на патент РФ, оформленной по результатам работы.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 5 статей. Результаты работы были представлены на международных конференциях студентов и аспирантов «Ломоносов» (Москва, 2005 и 2006 гг.), конференции «Метцин-киновые протеиназы в здоровом организме и при патологиях» (Аскона, Швейцария, 2006), IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), VI международном симпозиуме "Химия протео-литических ферментов" (Москва, 2007), V съезде международного общества по изучению протеолиза (Патра, Греция, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (232 ссылки). Работа изложена на 148 страницах и содержит 33 рисунка и 10 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Выделение металлонротеиназы н сериновой коллагенолитнческон протеина-зы-2 камчатского краба

Суммарный препарат пищеварительных ферментов камчатского краба «Морн-краза» фракционировали с помощью ионообменной хроматографии на Г)ЕЛЕ'-Тоуореаг1 (рис. 1). Фракции, полученные при элюции буфером, содержащим 1М NaCl, обладали активностью как по субстрату трипсина, так и по субстрату СКП, и содержали один мажорный белковый компонент. Было сделано предположение, что этот белок является изоформой сериновой коллагеиолитической протеиназы краба.

camtschatica на DEAE-Toyopearl. Единицы активности трипсина и СКП - 0,1 мкмоль субстрата/мин. Единица активности металдопротеиназы (по азоказеину) 0,005 ед. А^о/мин (контроль - активность по азоказеину в присутствии ЭДТА). Скобкой отмечены фракции, из которых выделяли СКП-2.

Фракции элюата, содержащие металлопротеиназу, концентрировали ультрафильтрацией и хроматографировали на Сефадексе G-50 в буфере, содержащем 1М NaCl. Аномально прочное удерживание фермента на Сефадексе, характерное также

* DEAE - дпэтилампноэтнл

для других металлопротеипаз ракообразных, позволило отделить примесь мажорной изоформы СКП краба, близкой по молекулярной массе, и получить электрофоретиче-скл гомогенную металлопротеиназу. Электрофоретически гомогенная СКП-2 также была получена с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-50 сконцентрированных фракций элюата с DEAE-Toyopearl.

2. Определение частичной аминокислотной последовательности сериновой кол-лагенолитической протеннал>1-2

По данным тандемной масс-спектрометрии, пептид с М 1165,6 Да, полученный путём гидролиза СКП-2 трипсином, имеет состав VDTNDVAYIR. Последовательность этого фрагмента СКП-2 демонстрирует значительное сходство с последовательностью мажорной изоформы СКП краба P.camtschatica и других сериновых про-теиназ ракообразных, причем остаток Asp, следующий за остатком Asn, строго консервативен, так как входит в состав каталитической триады (рис. 2).

PCI IVGGQEATPHTWVHQVALFIDDMYFCGGSLISSEYVLTAAHCMDGAGFVEVVMGAH 56

PCI NIREDEASQVSMTSTNFAIHENYNAFTlTlJgVAylRLPSPVTFDANIGAVALPTSD 112

PCI PAVGTTVTPSGWGMDSDSAFGISDILRQVDVPIMSWDCDAVYGIVSNNQICIDSTG 168

PCI GRGTCNGDSGGPLNYGGTTVGITSFGASAGCEAGYPDAFTRVSAYLDWIQANTGVTP 224 Рис. 2. Сравнение аминокислотной последовательности одного из триптических пептидов СКП-2 с последовательностями сериновых протеиназ ракообразных. РС1 и РС2 - мажорная изоформа (структура приведена полностью) и СКП-2 P.camtschatica, соответственно. Источники протеиназ: ES1 и ES2 - креветка Euphausia superba, EP -креветка Euphausia pacifica, AS - рачок Artemia sanfrasciscana, UP - краб Uca pugiia-tor, PV1 и PV2 - креветка Penaeus vannamei. Номера последовательностей, внесённых в базу данных SwissPROT/TrEMBL, указаны в скобках. Обозначения: b - остаток Arg/Lys, после которого произошло расщепление СКП-2 при трипсинолизе, * - аминокислотные остатки каталитической триады.

Важное отличие СКП-2 от трипсинов млекопитающих и сериновых протениаз ракообразных - присутствие остатка Asp (второго с N-конца в исследованном пепти-

6

*

РС2

Е51 [ Kristjansdottir, 2000 ]

ES2 (A5HIQ7)

AS (A8D853)

UP (Р00771)

PV1 (Q00871)

PV2 (P36178)

EP (A5HIP8)

*

де) в положении, которое в других ферментах занимает остаток Не или Leu. Этот аминокислотный остаток участвует в формировании субстрат-связывающего участка (S3 по номенклатуре Шехтера и Бергера), и поэтому его замена может влиять на специфичность фермента.

3. Физико-химические и энзиматическне свойства сериновой коллагсно-литической протеиназы-2

По молекулярной массе, pH-оптимуму, интервалу pH-стабильности СКП-2 схожа с другими пищеварительными сериновыми протеиназами ракообразных (табл. 1), принадлежащими к подсемейству брахиуринов семейства химотрипсина. Брахиурины отличаются от трипсинов позвоночных нестабильностью в кислой среде.

Таблица 1. Свойства СКП-2 и других пищеварительных сериновых протеиназ рако-

обра 5ных

Фермент М, кДа Т-оптимум, °С pH-оптимум РН-стабильность

СКП-2 P.camtschatica 24,8 38-40 8,5 7,0-10,0

мажорная изоформа СКП P.camtschatica 29 47-55 7,5 4-9

трипсин P.camtschatica 24,8 55 7,5-8,0 5,8-9,0

трипсин креветки Euphausia superba 30 37 9 6-10

химотрипсин креветки £ superba 29 45 8 5,5-9

трипсины креветки Euphausia pacifica 33/32,3 40-50 9 6-11

трипсин креветки Neomysis japónica 32,6 43-48 8,5-9,5 7-11

химотрипсин креветки Penaeus orientaiis 24 70 7,5-9,0 6-9

химотрипсин креветки Penaeus vannamei 33,2 нет данных 8 6-10

СКП краба Carcmus maenas 23 30 7 нет данных

СКП краба Uca pugilator 25 нет данных 8 3,5-9

СКП-2 ингибируегся PMSF, но не чувствительна к о-фенантролину и иодацета-

миду, что подтверждает её принадлежность к классу сериновых протеиназ. Альдеги-допептиды - лейпептин и антипаин, а также белковые ингибиторы сериновых протеиназ подавляют активность фермента (табл. 2).

Таблица 2. Ингибирование сериновой коллагенолитической протеиназы-2

Ингибитор /см

овомуконд (7,8±1,1)*10~8

а-антитрипсин (4,2±0,7)*10"s

ингибитор трипсина из сои (2,3±0,4)*Ю~Я

лейпептин (Ac-Leu-Leu-Arg-H) (5,9±1,1)*10JJ

антипаин (N-(Na-CO-Arg-Val-Arg-H)-Phe) (4,0±0,7)* 10"у

£-аминокапроновая кислота (2,0±0,5)*10~4

СКП-2 обладает смешанной субстратной специфичностью, но, в отличие от мажорной изоформы, предпочитает положительно заряженные аминокислотные остатки в Ргположении (рис. 3). Как и другие исследованные брахиурины, СКП-2 практически не расщепляет субстраты с остатками Pro, Asp и Glu в Pi-положении. Увеличение длины субстрата способствует повышению эффективности протеолиза (рис. 3, табл. 3).

Рис. 3. Сравнительная характеристика субстратной специфичности мажорной изоформы СКП камчатского краба (литературные данные), и СКП-2. Активность мажорной изоформы приведена в % от активности по glp-AAL-pNA, активность СКП-2 - в % от активности по Ъ-(£7)-ЛТЛ-рКЛ. [Б]0 « 0,05 мг/мл.

Таблица 3. Субстратная специфичность СКП-2 (Т = 22°С). Сравнение с другими се-

риновыми протеиназами (литературные данные)

Субстрат Фермент Am, мкМ АсаЬ С

(D)-V LK-pNA СКП-2 Лиз-плазмин 1,1 ±0,1 210 ±20 0,84 ±0,02 26 ±1

(£7)-VLR-pNA СКП-2 калликреин свиньи, 37°С калликреин-1 человека, 37°С тромбин, 20°С 1,25 ±0,09 18,3 12,0 ±0,8 189 0,8 ± 0,2 6,6 0,81 ±0,02 38

Z'-(Q/-ALR-pNA СКП-2 1,1 ±0,2 0,46 ±0,07

Z"-APR-pNA СКП-2 2,39 ±0,09 0,59 ± 0,09

Z*-AFR-pNA СКП-2 трипсин быка, 25°С калликреин свиньи, 25°С 1,9 ±0,2 67 61 0,53 ± 0,02 11 16

(D)-PFR-pNA СКП-2 протеиназа змеи Trimeresurusjerdonii тканевый калликреин человека, 30°С 0,96 ± 0,07 6,3 11 ±2 0,7 ±0,1 20,3 1,3 ±0,3

glp'-AAFL-pNA СКП-2 23 ±4 0,26 ± 0,05

glp'-AAL-pNA СКП-2 мажорная изоформа СКП P.camtschatica, 37°С термитаза Thermoactinomyces vulgaris, 37°С субтилизин BPN маклюрализин растения Madura pomífera, 37°С 220 ± 20 350 80 800 29 0,61 ±0,04 190 5381

Bz-Arg- glp-AAL- Z-(D)- Z-AAF- glp-FA-pNA pNA ALR-pNA pNA pMA

" glp- - ппроглутамил, Z- ~ бензилокспклрбошп

Эффективность (A-cat /Кю) гидролиза хроыогенных субстратов СКП-2 выше, чем у протеиназ млекопитающих, за счет более низких значений Кт (табл. 3). Более низкие значения Кт, чем у мезофильных аналогов, являются отличительной особенностью психрофильных трипсинов. В отличие от трипсинов и большинства брахиурииов, предпочитающих субстраты с остатком аргинина в Pj-положешш, СКП-2 расщепляет (D)-VLR-pNA и (£>)-VLK-pNA практически с одинаковой эффективностью.

4. Исследование первичной структуры металлопротеиназы

Первичная структура металлопротеиназы была определена исходя из структуры кДНК. С помощью праймеров, соответствующих N-концевой последовательности зрелого фермента, кДНК металлопротеиназы была обнаружена в библиотеке кДНК из гепатопанкреаса краба. Последовательности 3' и 5'-концов кДНК определили с помощью метода RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), а затем на основе этих последовательностей синтезировали праймеры для амплификации полноразмерной кДНК, которую впоследствии клонировали и секвенировали. Аминокислотная последовательность препрометаллопротеиназы зарегистрирована в базах данных NCBI (№AAL99079) и TrEMBL (Q8T5U6).

Для доказательства соответствия первичной структуры выделенного белка структуре, определённой по кДНК, был проведен ферментативный гидролиз металлопротеиназы, включённой в полиакриламидный гель (после электрофореза), а затем были зарегистрированы масс-спектры гидролизатов. Пептиды, обнаруженные среди продуктов гадролиза белка трипсином, не обработанным ингибиторами химотрипси-на, глутамилэндопептидазой B.intermedius и трипсином, обработанным р-CH3C6H4S02-Plie-CH2C1, в сумме составляют 87% последовательности (рис. 4).

1 AAILGDQYLW SGGWPYVFG SSVSSSEQSV ILDGMADFHA

41 KTCVRFQHRS GEADYIEIVT NDSGCWSYVG TIGGQQRVSL

81 DTYGCIYIGT VIHELMHAIG FYHEHTRNDR DDYWIDFSH

121 VISGMESNFN KDTYWRYVGE DYNYASIMHY GTYAFSDNWG

161 IDATIVPTDP NVILTEAYDK YEMAQSDANE INTLYSC

Рис. 4. Аминокислотная последовательность металлопротеиназы камчатского краба Серым цветом выделены фрагменты последовательности, присутствие которых в белке подтверждено с помощью MALDI* масс-спектрометрии. Подчёркнуты структурные мотивы, характерные для ферментов семейства астацина: цинк-связывающий мотив (одной чертой) и «мешониновый поворот» (двумя чертами).

* MALDI - матричная л;иерная десорбцнонная понизацня (matnx-assibted 1аьег desorption ionization)

9

МА1ЛЭ1 масс-спектрометрический анализ подтвердил присутствие в молекуле белка структурных мотивов, позволяющих отнести металлопротеиназу краба к семейству астацина: цинк-связывающего мотива и «метионинового поворота».

5. Физико-химические и энзиматнческие свойства металлопротеиназы

Молекулярная масса металлопротеиназы краба, определенная с помощью электрофореза - 22,4 кДа - близка к значению, рассчитанному исходя из структуры кДНК (22181 Да) и сопоставима с молекулярными массами других однодоменных астацино-вых протеиназ. Среди этих ферментов встречаются как катионные, так и анионные, причём протеиназа краба, как и другие астацины ракообразных, является анионным белком: рассчитанное значение р1 - 4,43. По данным атомно-абсорбционной спектроскопии, металлопротеиназа краба содержит цинк (один ион на молекулу белка), что характерно также для других протеиназ семейства астацина.

Оптимум рН действия протеина зы, как и у большинства других астацинов, находится в щелочной области (8,5). Температурный оптимум действия фермента 45°С.

Для металлопротеиназы камчатского краба характерны широкая субстратная специфичность и предпочтение высокомолекулярных субстратов. Фермент расщепляет азоказеин, азоальбумин, гемоглобин, сывороточный альбумин человека и быка.

Металлопротеиназа камчатского краба ингибируется тиолами и хелатирующими агентами (табл. 4), что характерно также и для других астацинов.

Таблица 4. Ингибирование металлопротеиназы камчатского краба.

Ингибитор [11, мМ Остаточная активность, %

БТТ 4,5 0 (после 1 ч инкубации)

ЕВТА 4,5 0 (после 24 ч инкубации)

аргинин 5 100 (после 24 ч инкубации)

бацитрацин 21 92 (после 1 ч инкубации)

грамицидин $ 16 58 (после 1 ч инкубации)

полимиксии 18 58 (после 1ч инкубации)

глутатион 45 66 (после 1 ч инкубации)

оксихинолин 45 31 (после 1 ч инкубации)

о-фенантролин 4,5 0 (после 24 ч инкубации)

Аргинин не влияет на активность металлопротеиназы, хотя и является ингибитором белка морфогенеза костной ткани-1 (ВМР-1), принадлежащего к семейству астацина. Пептидные антибиотики (в табл. 4 выделены жирным шрифтом) применяются в качестве лигандов для аффинной хроматографии протеиназ, и поэтому опре-

деление их ингибирующего действия на металлопротеиназу краба представляло интерес для разработки методик очистки фермента. Как видно из таблицы 4, антибиотики лишь умеренно ингибируют металлопротеиназу и, вероятно, не являются подходящими аффинными лигандами для неё.

6. Сравнение первичных структур металлопротсиназы краба и других астацинов

Металлопротеиназа краба, как и большинство других астациновых протеиназ, синтезируется в виде препробелка. Сигнальный пептид, структура которого была предсказана с помощью программы SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP), состоит из 15 аминокислотных остатков. Активация профермента происходит в результате гидролиза связи Arg-Ala.

Аминокислотные остатки, образующие дисульфидные связи и гидрофобное ядро молекулы, и участвующие в электростатических взаимодействиях, стабилизирующих белковую глобулу астациновых протеиназ, являются консервативными (рис. 5). Последовательности астациновых протеиназ в области субстрат-связывающих участков различаются, с чем, вероятно, и связаны различия в субстратной специфичности.

Астациновые протеиназы краба ParaHthodes camtschatica, рака Astacus astacus и креветки Penaeus vannamei весьма схожи по первичной структуре, в то время как средняя температура среды обитания ракообразных, у которых обнаружены ферменты, заметно различается и составляет 6°С для краба, 10°С для рака и более 15°С для креветки. Поэтому было проведено сравнение состава и аминокислотных последовательностей этих ферментов с целью выявления структурных особенностей металло-протеиназы краба, связанных с адаптацией к низким температурам.

Различия в аминокислотном составе астациновых протеиназ ракообразных незначительны. Такие особенности психрофильных ферментов, как повышенное содержание остатков метионина и аспарагина, пониженное соотношение (Ile+Leu)/(Ile+Leu+Val) и (Arg)/(Arg+Lys), не были обнаружены при сравнении аминокислотного состава протеиназ P. camtschatica и P. vannamei.

mb mdarhwpwfllfatfllvsglaapekf—vkdidggi-ol mnlapstcll jlflldiaqalf

ñf м-----qcavJJlallgvvaas|

pv mpc m

-llvt jlavvavagato -klll

-dqdifdinedlgl -15 wdeegheegheegdgddfvdittriltsnnntdq -14

11peaaraly----------------------ynd -20

л/praatam-----------------------ynp -20

alvasvagtgtipqaakam-----------------------ynp -20

o o

o o

edslfcmnakgvfll sseysggevatp a-gvsgadqs. gnsvnsyers gssvssseqs

§ si' ¡gtn-hdria 87 rggmmysg 95 iqanghvyhg 88 dsngsmykg 89 ptyghiyig 89

iyndsvsds "nvp yljy yíy 144

khd---tnn íntp 149

i—dtysry Iged geg £ged YiY 143

к—dtywqy y"y 144

к—dtywry 144

MB T samhy skt

ol s s mhy grd

af y s mhy gky

pv E s Imhy gty

pc A s ¡mhy gty

íqngtesti itkisfj---fedvig

¡siaygrdsitpipm---pnvpig

SsiqwgvletivplHngidltdpy SsvqwgvaktivptHpnvilteay ¡sdnwgidativptqpnvilteay

Рис. 5. Сравнение аминокислотных последовательностей металлопротеиназы камчатского краба (PC, Q8T5U6) и других астациновых протеиназ: пищеварительных ферментов креветки Penaeus vannamei (PV, Q20AS7) и рака Astacus astacus (AF, P07584), хориолизина H рыбы Oryzias iatipes (OL, P31580) и протеолитического домена р-субъединицы меприна крысы (MB, Р28826). В скобках после обозначений приведены идентификаторы последовательностей в базе данных SwissProt-TrEMBL. Аминокислотные остатки, обозначенные Т, являются N-концевыми в зрелых ферментах; § - образуют дисульфидные связи; о - входят в состав гидрофобного ядра; - и + - участвуют в электростатических взаимодействиях, важных для стабилизации структуры белка; S|.3, S]' - участвуют в связывании субстратов. Нумерация по последовательности зрелых форм протеиназ. Пропептиды подчёркнуты.

Для более подробного анализа различий в первичной структуре протеиназ были построены модели их пространственных структур (на основе известной пространственной структуры астацина рака).

Для металлопротеиназы камчатского краба не характерны такие признаки фер-

ментов, адаптированных к низким температурам, как уменьшение количества амино-

12

кислотных остатков с объёмистыми боковыми радикалами в составе гидрофобного ядра и увеличение доли гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности. Количество отрицательно заряженных аминокислотных остатков на поверхности молекулы протеиназы краба выше, чем у протеиназы креветки, что приводит к заметным различиям поверхностного электростатического потенциала (рис. 6).

протеиназа креветки протеиназа рака протеиназа краба

P.vannamei A.astacus P.camtschatica

Рис. 6. Распределение электростатического потенциала по поверхности молекул аста-циновых протеиназ ракообразных. Модели структур ферментов P.camtschatica и P. vannamei построены с помощью сервера Swiss-Model на основе структуры астацина A.astacus (HAD в базе данных PDB - www.rcsb.org/pdb). Распределение электростатического потенциала вычислено программой PyMol. Белыми окружностями показано положение катионов цинка. Красным цветом показаны отрицательно заряженные аминокислотные остатки, синим - положительно заряженные.

Повышенный отрицательный заряд на поверхности характерен для многих ферментов из организмов, приспособленных к низким температурам. Считается, что большое количество заряженных аминокислотных остатков, особенно небольших по стерическому объёму остатков аспарагиновой кислоты, на поверхности белковой глобулы способствует усилению взаимодействий белка с растворителем и повышению подвижности полипептидной цепи, что играет важную роль в сохранении каталитической активности при низких температурах.

7. Зависимость кинетических констант гидролиза различных субстратов про-теиназами камчатского краба от температуры

Сохранение высокой каталитической эффективности (kcat/Km) при понижении температуры у трипсинов и некоторых субтилизинов психрофильных организмов

13

происходит благодаря уменьшению Кт. При исследовании гидролиза различных субстратов химотрипсинами и эластазами психрофильных организмов было обнаружено, что Кт протеолиза для некоторых субстратов уменьшается при понижении температуры, а для некоторых - увеличивается, но обычно эти изменения незначительны.

Характер зависимости Кт СКП-2 от температуры связан с природой аминокислотного остатка в Ргположении субстратов (табл. 5).

Таблица 5. Температурная зависимость кинетических констант гидролиза хромоген-

ных субстратов СКП-2

Субстрат Т, °С Кт, мкМ ^саь С*

glp-AAL-pNA + 5 200 ± 20 (мажорная изоформа - 960) 0,09 ±0,01

+ 22 220 ± 20 0,61 ±0,04

+ 37 120 ± 10 (мажорная изоформа - 350) 0,56 ± 0,04

г-АРЛ-рКА + 4 1,24 ±0,13 0,078 ± 0,002

+ 22 1,9 ±0,2 0,53 ± 0,02

+ 37 3,5 ± 0,5 0,73 ± 0,09

Эффективное значение Кга реакции гидролиза азоказеина металлопро-теиназой камчатского краба слабо зависит от температуры, так же как и в случае термолизина - металлопротеи-назы из термофильного микроорганизма (табл. 6).

8. Действие протеиназ камчатского краба на коллаген

Исследования гидролиза коллагена «Морикразой» - препаратом протеиназ краба - с помощью электрофореза, вискозиметрии и МДЬ01-масс-спектрометрии показали, что компоненты препарата не только переводят димеры и тримеры а-цепей коллагена (так называемые р- и у-компоненты) в мономеры путем расщепления телопептидов (неспирализованных концевых участков молекул, в которых находятся сайты межмолекулярного ковалентного связывания), но и расщепляют а-цепи субстрата. Изучение действия индивидуальных компонентов «Морикразы» на коллаген интересно как с теоретической точки зрения, так и с практической - для разработки более эффективных коллагенолитических ферментных препаратов.

Таблица 6. Эффективные значения Кт (мг/мл) для металлопротеиназы краба и термолизина при различных температурах (субстрат - азоказеин)

Т, °С Металлопротеиназа Р.сатпсЬаНса Термолизин

+ 4 0,22 0,13

+ 24 0,16 0,11

+ 37 0,21 0,19

СКП-2 расщепляет коллаген I - III типов при температуре 25°С (рис. 7), что характерно также для многих других брахиуринов.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 7. Электрофореграммы продуктов гидролиза коллагена под действием СКП-2. Коллаген типа I крысы: 1 - контрольный образец, 2 - гидролизат. Коллаген типа II из трахеи быка: 3 - гидролизат, 4 - контрольный образец. Коллаген типа III из плаценты человека: 5 - гидролизат, б - контрольный образец. Коллаген типа I из кожи телёнка: 7 - гидролизат, 8 - контрольный образец. Стрелкой отмечена полоса, соответствующая высокомолекулярным продуктам гидролиза, буквой ß - полоса ß-димеров цепей коллагена. Молекулярные массы белков-маркеров в кДа указаны между дорожками 2 и 3. Соотношение фермент: субстрат 1:20, время гидролиза 19 часов.

Распад ß-димеров цепей коллагена под действием СКП-2 свидетельствует о гидролизе пептидных связей, расположенных в телопептидных областях.

При исследовании действия металлопротеиназы на нативный коллаген с помощью SDS-электрофореза не было выявлено высокомолекулярных продуктов гидролиза, но результаты реакции с нингидрином показали, что расщепление пептидных связей всё же происходит. Вероятно, фермент расщепляет телопептидные участки молекул коллагена и частично денатурированные молекулы субстрата. Металлопротеиназа краба также обладает активностью по отношению к коллагену, импрегнированному азокрасителями.

9. Действие протеиназ камчатского краба на белки системы свёртывания крови

Оба изученных фермента расщепляют фибриноген - предшественник нерастворимого белка фибрина, составляющего основу тромбов. Молекула фибриногена состоит из шести полипептидных цепей: двух Аа, двух BP и двух у (рис. 8).

Рис. 8. Схема строения молекулы фибриногена. Ол. - олигосахариды. «У» -«дисульфидные узлы», соединяющие все три цепи в начале и конце супер-скрученных а-спиральных участков.

По данным электрофореза, обе протеиназы P.camtschatica разрушают Аа-цепь фибриногена с наибольшей скоростью, а у-цепь - с наименьшей скоростью.

Многие ферменты, гидролизугощие фибриноген in vitro, малоактивны по отношению к этому белку, находящемуся в плазме крови, так как плазма содержит ингибиторы протеиназ. Однако, по данным тромбозластографии, при коагуляции плазмы крови, обработанной СКП-2 или металлопротеиназой краба, образуется менее плотный сгусток, чем при коагуляции необработанной плазмы. Плотность сгустка плазмы зависит от концентрации фибриногена. Следовательно, ферменты P.camtschatica способны расщеплять фибриноген в присутствии ингибиторов из плазмы крови.

Продукты гидролиза фибриногена протеиназами краба разделяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях, а затем идентифицировали с помощью MALDI масс-спектрометрии триптических гидролизатов. В отличие от большинства других металлопротеиназ, в первую очередь атакующих компактные полярные С-концевые домены Aot-цепи фибриногена (Аа392-б15), металлопротеиназа краба расщепляет эту цепь в участке, имеющем вторичную структуру, близкую к «полипро-линовой спирали» (рис. 9).

100 ... _3|Ю_ |—| , 6Q0

3 - триптические пептиды g

• дисульфидные связи между цепями |—| . дисульфидные связи внутри Аа-цепи

- триптические пептиды, идентифицированные неодно значно

Рис. 9. Продукты гидролиза фибриногена металлопротеиназой камчатского краба (время инкубации 15 минут, соотношение ферментхубстрат 1:20).

Продукты гидролиза фибриногена СКП-2 схематически представлены на рис. 10.

ЮО

300

1 »ж1 и М № D н и н и Ш <3

II. 1 100 300 ,1—1 , 600

raw и И KJ РЧ,

II. I ИИ 300 ,1—1 , 600

-й- ы' м 'и ' )

600 Исходим J Act-цепь

"ШЙГ

ЮО

13 1ЖИ

ЖЕ

-,300

wmt

Г

(15 мин)

15,3 кДа (15 мин)

Исходная Вр-цепь

ЮО

Ж

1П~зГ

лЗОС

ж;

46,8 кДа (15 мин)

100

.300

Ж

юо

Ж

ч300

й кш ш

iia:

и 100 л Г77 300 ,п

1 SSK8I И ятж1 1 м

It 100 ,t Г31 300 л

ixkl ю №УЯ м

11 100 ,1 П7 , 300 ,п

. и И R&fl '

и 100 ,1 300 л

kw KKXXI м

39 кДа 3 (30 мин)

31 кДа 3 (4 ч)

Исходная у-цепь

46,8 кДа (15 мин) 39 кДа (30 мин) 31 кДа (4 ч)

У* - N-связанный гликан

g -триптические пептиды

Дисульфидные связи: i:

между цепями

внутри цепей

Рис. 10. Продукты гидролиза фибриногена СКП-2. Время инкубации указано в скобках после молекулярной массы. Соотношение фермент:субстрат 1:20.

Как и большинство известных сериновых протеиназ, СКП-2 начинает расщеплять Аа-цепь фибриногена с С-конца, а затем разрушает N-концевые участки В|3 и у-цепей.

Металлопротеиназа и СКП-2 расщепляют фибрин и сгустки плазмы в экспериментах in vitro. Лизис фибрина, прогретого при 85°С, под действием ферментов краба происходит медленнее, чем лизис непрогретого фибрина. Нагревание приводит не только к изменению структуры субстрата, но и к инактивации присутствующих в препаратах фибрина следов плазминогена - предшественника фермента плазмина, разрушающего фибрин (и фибриноген) в физиологических условиях. Таким образом, более высокая активность протеиназ по отношению к непрогретому фибрину может свидетельствовать об их активаторном действии на плазминоген. Способность СКП-2

17

и металяопротеиназы активировать плазминоген была подтверждена с помощью электрофореза (рис. 11, 12).

аио

Рис.11. Активация плазминогена СКП-2: гидролиз синтетического хромогенного субстрата (£7)-УЬК-рМА в присутствии плазминогена (1), в присутствии СКП-2 (2), в присутствии плазминогена и СКП-2 (3). Электрофореграмма: 1 - препарат плазминогена кролика, 2 - продукты обработки плазминогена СКП-2 (слева указаны молекулярные массы белков-маркеров в кДа).

94,6 | 4 { -1*-'

66,2 | ш . 1 'Шй;-'^""

45 ? щщ ( |Гг ; 1

31

21.5 !

14,4 ' _ гГ-

1 2

плазмин, тяжёлая цепь

\

плазмин, лёгкая цепь

металло-протеиназа

Рис.12. Активация плазминогена ме-таллопротеиназой камчатского краба:

1 - препарат плазминогена быка,

2 - препарат плазминогена быка после обработки металлопротеиназой. Слева указаны молекулярные массы белков-маркеров в кДа.

выводы

1. Выделены электрофоретически гомогенные металлопротеиназа и нзоформа СКП-2 сериновой коллагеиолитической протеиназы камчатского краба РагаУпЬобе5 сагШзсЬаИса.

2. Подтверждено соответствие 87% первичной структуры металлопротеиназы структуре, определённой по кДНК. Обнаружено сходство между металлопро-теиназой краба и другими астациновыми протеиназами по таким признакам, как характер ингибирования, рН-оптимум активности, содержание цинка в активном центре.

3. Частично определена аминокислотная последовательность СКП-2 (с помощью тандемной масс-спектрометрии). Обнаружено сходство между СКП-2 и другими протеиназами ракообразных по молекулярной массе, температурному и рН-оптимуму активности, интервалу рН-стабильности, характеру ингибирования. Обнаружены различия в субстратной специфичности изоформ СКП краба.

4. Установлено, что природа используемого субстрата влияет на характер зависимости кинетических параметров реакций, катализируемых СКП-2, от температуры, а значение А'^эфф реакции гидролиза азоказеина металлопротеиназой незначительно зависит от температуры.

5. Показано, что обе протеиназы краба расщепляют неспирализованные участки молекул коллагена, а СКП-2 также способна расщеплять трёхспиральные участки этого белка. Установлено, что обе изученные протеиназы способны расщеплять фибриноген (в том числе в плазме крови) и фибрин, а также активировать плазминоген. Охарактеризованы высокомолекулярные продукты гидролиза фибриногена быка металлопротеиназой и СКП-2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Semenova S.A., Rudenskaya G.N., Rebrikov D.V., Isaev V.A. (2006) cDNA cloning, purification and properties of Paralithodes camtschatica metalloprotease. Protein and Peptide Letters, 13 (6), pp. 571-575.

2. Сунгуров Ю. В., Еремеев H. Л, Лебедев А. Т., Малошицкая О. А., Руденская Г. Н., Семенова С. А. (2008) Масс-спектрометрический подход к первичному скринингу коллагенолитических ферментов. Биоорг. химия, 34 (3), с.392-398.

3. Паписова А. И., Семенова С. А., Кислицын Ю. А., Руденская Г. Н. (2008) Особенности гидролиза субстратов эндопептидазами из гепатопанкреаса камчатского краба. Биоорг. химия. 34 (4), с. 479-486.

4. Danilov N.A., Ignatieva N.Y., lomdina E.N., Semenova S.A., Rudenskaya G.N., Grokhovskaya Т.Е., Lunin V.V. (2008) Stabilization of scleral collagen by glycerol aldehyde cross-linking. Biochim. Biophys. Acta. 1780 (5), pp. 764-772.

5. Семенова С.А., Руденская Т.Н., Лютова Л.В., Никитина О.А. (2008) Выделение и свойства изоформы сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба Paralithodes camtschatica. Биохимия, т.73, вып.Ю, с.1403-1413.

6. Руденская Г.Н., Шмойлов A.M., Байдаков А.В., Семенова С.А., Харлампиева Д.Д., Исаев В.А. (2005) Аффинные сорбенты для получения коллагеназ. Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы III Московского международного конгресса (Москва, 14-18 марта 2005 г.). Доп. том, с. 18.

7. Семенова С.А. (2005) Металлопротеиназа камчатского краба Paralithodes camtschatica. Материалы международной конференции молодых учёных по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» - Химия. Т.2. С. 107.

8. Семенова С.А. (2006) Гидролиз коллагена металлопротеиназой камчатского краба Paralithodes camtschatica. Материалы международной конференции молодых учёных по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006» - Химия. Т.2. С.46.

9. Semenova S. (2006) Metalloprotease from king crab Paralithodes camtschatica - a novel protease from the astacin family. Metzincin Metalloproteases in Health and Disease, Centro Stefano Franscini, Monte Verita, Aseona, Switzerland. P.31.

10. Rudenskaya G„ Semenova S., Isaev V. (2006) Substrate specificity of metalloproteinase from the crab Paralithodes camtschatica. Metzincin Metalloproteases in Health and Disease, Centro Stefano Franscini, Monte Verita, Ascona, Switzerland. P.56.

11. Сунгуров Ю.В., Еремеев Н.Л., Лебедев A.T., Малошицкая О.А., Руденская Т.Н., Семенова С.А., Шмойлов A.M. (2007) Определение специфичности коллагеназ с

помощью MALDI-TOF MS. Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Т.2. С.309.

12. Семенова С.А., Сунгуров Ю.В., Руденская Г.Н., Еремеев Н.Л., Исаев В.А. (2007) Динамика гидролиза фибриногена металлопротеиназой камчатского краба. Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Т.1. С.131.

13. Семенова С.А., Руденская Г.Н., Ребриков Д.В., Исаев В.А. (2007) Металлопротеи-наза камчатского краба - представитель семейства астацина. VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Тезисы докладов и стендовых сообщений. С.79.

14. Паписова А. И., Кислицын Ю. А., Семенова С. А., Руденская Г. Н. (2007) Кинетические параметры гидролиза пептидных и белковых субстратов протеиназами камчатского краба при различных температурах. VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 102.

15. Семенова С.А., Лютова Л.В., Паписова А.И., Руденская Г.Н., Исаев В.А. (2007) Взаимодействие протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба с белками плазмы крови. VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 156.

16. Иомдииа 1111., Игнатьева ШО., Данилов ПЛ., Семенова С.А., Руденская Г.П., Гроховская Т.Е., Лунин В.В (2007) Стабилизация коллагена склеры при поперечном сшивании глицериновым альдегидом. Биомеханика глаза-2007. Сборник трудов конференции. С.98-106.

17. Papisova A.I., Semenova S.A., Kislitsin Yu.A, Rudenskaya G.N. (2007) Temperature dependence of proteolytic activity of cold-adapted enzymes from king crab. 5th General Meeting of the International Proteolysis Society. Patras, Greece. P.202.

18. Semenova S.A., Rudenskaya G.N., Lyutova L.V., Papisova A.I., Isaev V.A. (2007) Action of king crab digestive proteinases on blood plasma proteins. 5th general Meeting of the International Proteolysis Society. Patras, Greece. P.392.

19. Руденская Г. H., Семенова С. А., Лютова Л. В., Никитина О. А. (2008) Выделение и свойства изоформы сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба Paralithodes camtschatica. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск. С.30.

Заказ № 176/11/08 Подписано в печать 18.11.2008 Тираж 110 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок". тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 ; ! www.cfr.ru; e-maihinfo@cfr.ru

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Металлопротеиназы семейства астацина.

1.2. Структура, биосинтез и локализация астациновых протеиназ.

1.2.1. Структура генов.

1.2.2. Особенности биосинтеза.

1.2.3. Активация проферментов.

1.2.4. Гликозилирование.

1.2.5. Пространственная структура и доменный состав.

1.2.6. Значение доменной структуры для транспорта и процессинга.

1.2.7. Локализация.

1.3. Физико-химические и энзиматические свойства астациновых протеиназ.

1.3.1. Физико-химические свойства.

1.3.2. Особенности гидролиза пептидной связи.

1.3.3. Роль ионов металлов.

1.3.4. Определение активности.

1.3.5. Субстратная специфичность.

1.3.6. Белковые субстраты.

1.3.7. Амидазная активность.

1.3.8. Значение доменной структуры для энзиматических свойств

1.3.9. Ингибирование.

1.4. Получение астациновых протеиназ.

1.4.1. Общая характеристика методик выделения.

1.4.2. Получение рекомбинантных астациновых металлопротеиназ

1.5. Физиологическая роль астациновых металлопротеиназ.

1.5.1. Участие в пищеварении.

1.5.2. Участие в формировании и распаде межклеточного матрикса.

1.5.3. Функции в процессах морфогенеза и развития организма.

1.6. Брахиурины — сериновые протеиназы ракообразных.

1.6.1. Общая характеристика.

1.6.2. Структура.

1.6.3. Субстратная специфичность.

1.6.4. Гидролиз коллагена брахиуринами.

1.6.5. Ингибирование брахиуринов.

1.6.6. Физико-химические и энзиматические свойства брахиуринов.

1.6.7. Получение брахиуринов.

1.6.8. Биологические особенности брахиуринов.

1.7. Использование протеиназ ракообразных в медицине.

1.8. Исследования протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1. Очистка протеиназ.

2.2. Определение частичной аминокислотной последовательности сери-новой коллагенолитической протеиназы-2.

2.3. Физико-химические и энзиматические свойства сериновой коллагенолитической протеиназы-2.

2.4. Ингибирование сериновой коллагенолитической протеиназы-2.

2.5. Субстратная специфичность сериновой коллагенолитической протеиназы-2.

2.6. Исследование первичной структуры металлопротеиназы.

2.7. Физико-химические и энзиматические свойства металлопротеиназы.

2.8. Ингибирование металлопротеиназы.

2.9. Субстратная специфичность металлопротеиназы.

2.10. Сравнение аминокислотной последовательности металлопротеиназы краба и других астациновых протеиназ.

2.11. Моделирование пространственной структуры металлопротеиназы.

2.12. Построение филогенетического древа астациновых протеиназ.

2.13. Влияние температуры на кинетические параметры гидролиза субстратов протеиназами краба.

2.14. Действие протеиназ краба на коллаген.

2.15. Действие протеиназ краба на фибриноген.:.

2.16. Действие протеиназ краба на фибрин, плазминоген и плазму крови. 99 3. ЭКСГШРИМЕНТАЛЪНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Синтетические хромогениые субстраты.

3.1.2. Ферменты, белки, пептиды.

3.1.3. Прочие реактивы и сорбенты.

3.2. Методы.

3.2.1. Аффинная хроматография на полимиксин-силохроме.

3.2.2. Аффинная хроматография HaNHOH-Bz-ONH-Ala-Ala-силохроме.

3.2.3. Гидрофобная хроматография.

3.2.4. Аффинная хроматография на лейцин-силохроме.

3.2.5. Аффинная хроматография на аргинин-силохроме.

3.2.6. Гель-хроматография на Сефадексе G-50.

3.2.7. Ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl.

3.2.8. Концентрирование и обессоливание растворов белков.

3.2.9. Определение концентрации белка по методу Бредфорд.

3.2.10. Определение активности по динитрофенилпептидам.

3.2.11. Определение активности по и-нитроанилидам пептидов.

3.2.12. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях.

3.2.13. Масс-спектрометрический анализ.

3.2.14,Определение субстратной специфичности металлопротеиназы.

3.2.15. Определение рН-оптимума активности ферментов.

3.2.16. Определение активности протеиназ по азоказеину и азоальбумину.

3.2.17. Определение зависимости активности протеиназ от температуры.

3.2.18. Определение кинетических параметров протеолиза.

3.2.19. Ингибиторный анализ.

3.2.20. Исследование действия протеиназ на коллаген.

3.2.21. Действие протеиназ краба на фибриноген и другие белки.

3.2.22. Действие протеиназ краба на фибриновые пластины.

3.2.23. Действие протеиназ краба на фибриновые сгустки.

3.2.24. Действие протеиназ краба на плазму крови.

3.2.25. Определение содержания цинка в молекуле металло-протеиназы.

3.2.26. Клонирование и секвенирование кДНК металлопротеиназы.

3.2.27. Компьютерный анализ данных и моделирование структуры белков.

ВЫВОДЫ.

Протеолитические ферменты ракообразных обладают рядом необычных свойств и находят широкое применение в медицине и биотехнологии.

Ферменты ракообразных, обитающих в холодных морях, приспособлены к функционированию при низких температурах и поэтому являются перспективными биокатализаторами. Изучение влияния температуры на каталитические свойства таких протеиназ позволяет получить информацию о механизмах холодовой адаптации ферментов. Большинство исследований кинетических характеристик и структурных особенностей психрофильных протеиназ посвящены трипсинам, а протеиназы других семейств изучены менее подробно.

Коллагенолитическая активность, обнаруженная у некоторых сериновых протеиназ ракообразных, открывает широкие возможности использования этих ферментов в медицине, биотехнологии и пищевой промышленности. На основе пищеварительных ферментов крабов и креветок созданы медицинские препараты для лечения ран, ожогов и других повреждений кожи. Ферментные препараты из ракообразных способны гидролизовать фибриноген и фибрин, но действие индивидуальных протеиназ на эти белки практически не изучено, несмотря на важную роль фибрина в заживлении ран. Изучение фибринолитического действия протеиназ краба имеет большое значение для разработки новых тромболитических средств.

Для пищеварительных сериновых протеиназ ракообразных характерно наличие изоформ. Сходство первичной структуры изоформ при заметных различиях в некоторых свойствах делает эти белки привлекательными объектами для изучения структурно-функциональных взаимосвязей.

Для полной характеристики протеиназ камчатского краба, обладающих широкой первичной специфичностью, требуется исследование их взаимодействия с высокомолекулярными субстратами. Данные о влиянии пространственной структуры белковых субстратов на эффективность протеолиза представляют несомненный теоретический интерес и могут быть использованы для разработки методик изучения пространственной структуры белков с помощью ограниченного протеолиза. Расширение набора ферментов, используемых для ограниченного протеолиза, в том числе внедрение высокоактивных и доступных в больших количествах протеиназ ракообразных, безусловно, откроет новые возможности для исследователей.

Настоящая работа посвящена исследованию металлопротеиназы камчатского краба Paralithodes camtschatica, принадлежащей к семейству астацина, и минорной изоформы сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба (далее СКП-2), принадлежащей к подсемейству брахиурина семейства химотрипсина. Целью работы являлось получение гомогенных препаратов протеиназ, изучение их физико-химических и энзиматических свойств, в том числе действия на фибриноген и фибрин. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Получение металлопротеиназы и СКП-2 в электрофоретически гомогенном состоянии.

2. Анализ первичной структуры металлопротеиназы и доказательство её соответствия структуре, определённой по кДНК. Исследование структуры СКП-2 с помощью масс-спектрометрии.

3. Определение энзиматических свойств выделенных протеиназ.

4. Изучение температурной зависимости кинетических констант гидролиза различных субстратов металлопротеиназой и СКП-2.

5. Исследование действия металлопротеиназы и СКП-2 на фибриноген, фибрин, плазминоген и плазму крови, а также на коллаген. Идентификация высокомолекулярных продуктов гидролиза фибриногеиа с помощью масс-спектрометрии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Металлопротеиназы семейства астацина

Большинство известных металлопротеаз содержит в активном центре один ион цинка, координированный остатками глутаминовой кислоты и (или) гистидина (рис. 1). Функция этого иона в катализе - поляризация молекулы воды, атакующей расщепляемую пептидную связь [1].

Термолиз iih Астащшы

Аминопептадазы Серрагашгны

Адаматшшы/ ADAM Матрикашы (ММР)

Рис. 1. Структура цинк-связывающих мотивов металлопротеаз (по [2]).

Объединение протеиназ в семейства, основанное на сравнении первичной структуры белков, является принципом построения современной классификации MEROPS [3]. Несколько семейств протеаз, характеризующихся сходной вторичной и третичной структурой, образуют клан.

Клан метцинкинов включает астациновые металлопротеиназы, серрали-зииы (ферменты бактерий из родов Serratia, Erwinia и Pseudomonas), тканевые металлопротеиназы (matrix metalloproteinases, ММР), и семейство адама-лизинов/ADAM. В ферментах этого клана цинк координирован тремя остатками гистидина, два из которых входят в состав мотива НЕХХН, и остатком глутаминовой кислоты (через молекулу воды). Общий структурный элемент всех метцинкинов — метиониновый поворот (1,4-р-поворот, включающий консервативный остаток метионина). Семейства астацинов, ММР и серрали-зинов достаточно близки друг к другу по первичной структуре, а семейство адамализинов занимает обособленное положение [4].

Астацин - пищеварительный фермент речного рака Astacus astacus — был впервые описан в 1967 году. Термин «астацины» также обозначает пигменты (производные (З-каротина), обнаруженные у речного рака [5, р. 1219].

Астациновые металлопротеиназы были выделены в самостоятельное семейство в 90-х гг. XX в. С тех пор были получены и исследованы более двадцати представителей этого семейства - ферменты бактерий, беспозвоночных и позвоночных животных. При анализе базы данных NCBI с помощью программы BLAST в 2006 году было обнаружено более 900 последовательностей белков, сходных с онхоастацином - протеиназой паразитического червя Onchocerca volvulus [6, S.50]. Следует отметить, что у растений и вирусов не обнаружено ни ферментов, относящихся к семейству астацина, ни генов, кодирующих такие белки [3].

ВЫВОДЫ:

1. Выделены электрофоретически гомогенные металлопротеиназа и изо-форма СКП-2 сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба P.camtschatica.

2. Подтверждено соответствие 87% первичной структуры металлопротеиназы структуре, определённой по кДНК. Обнаружено сходство между металлопротеиназой краба и другими астациновыми протеиназами по таким признакам, как характер ингибирования, рН-оптимум активности, содержание цинка в активном центре.

3. Частично определена аминокислотная последовательность СКП-2 (с помощью тандемной масс-спектрометрии). Обнаружено сходство между СКП-2 и другими протеиназами ракообразных по молекулярной массе, температурному и рН-оптимуму активности, интервалу рН-стабильности, характеру ингибирования. Обнаружены различия в субстратной специфичности и характере ингибирования изоформ СКП краба.

4. Установлено, что природа используемого субстрата влияет на характер зависимости кинетических параметров реакций, катализируемых СКП-2, от температуры, а значение КШ;Эфф реакции гидролиза азоказеина металлопротеиназой практически не зависит от температуры.

5. Показано, что обе протеиназы краба расщепляют неспирализованные участки молекул коллагена, а СКП-2 также способна расщеплять трёх-спиральные участки этого белка. Установлено, что обе изученные протеиназы способны расщеплять фибриноген (в том числе в плазме крови) и фибрин, а также активировать плазмииоген. Охарактеризованы высокомолекулярные продукты гидролиза фибриногена быка металлопротеиназой и СКП-2.

1. Rawlings N.D., Barrett A.J. // Evolutionary families of metallopeptidases. Meth. Enzymol. 1995. V. 248. P. 183-228.

2. Hooper N.M. // Families of zinc metalloproteases. FEBS Lett. 1994. V.354(l). pp. 1-17.

3. Rawlings N.D., Tolle D.P., Barrett A.J. // MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res. 32 Database issue. 2004. D160-D164.

4. Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. / Handbook of Proteolytic Enzymes. L., Academic Press, 1998.

5. Mohrlen F., Hutter H., Zwilling R. // The astacin protein family in Caenorhabdi-tis elegans. Eur. J. Biochem. 2003. V. 270(24). P. 4909-4920.

6. Angerer L., Hussain S., Wei Z., Livingston B.T. // Sea urchin metalloproteases: a genomic survey of the BMP-l/tolloid-like, MMP and ADAM families. Dev. Biol. 2006. V.300. P. 267-281.

7. Kawaguchi M., Yasumasu S., Hiroi J., Naruse K., Masayuki I., Iuchi I. // Evolution of teleostean hatching enzyme genes and their paralogous genes. Dev. Genes Evol. 2006. V. 216. P. 769-784.

8. Geier G., Jacob E., Stocker W., Zwilling R. // Genomic organization of the zinc-endopeptidase astacin. Arch. Biochem. Biophys. 1997. V.337(2). P. 300-307.

9. Jiang W., Flannery A.V. // Correlation of the exon/intron organization to the secondary structures of the protease domain of mouse meprin alpha subunit. Gene. 1997. V. 189(1). P. 65-71.

10. Lhomond G., Ghiglione C., Lepage Т., Gache C. // Structure of the gene encoding the sea urchin blastula protease 10 (BP 10), a member of the astacin family of Zn2+-metalloproteases. Eur. J. Biochem. 1996. V.238(3). P. 744-751.

11. Janitz M., Heiser V., Bottcher U., Landt O., Lauster R. // Three alternatively spliced variants of the gene coding for the human bone morphogenetic protein-1. J. Mol. Med. 1998. V.76 (2). P. 141-146.

12. Bond J.S., Beynon R.J. // The astacin family of metalloendopeptidases. Protein Sci. 1995. No. 4(7), P. 1247-1261.

13. Hung C.H., Huang H.R., Huang C.J., Huang F.L., Chang G.D. // Purification and cloning of carp nephrosin, a secreted zinc endopeptidase of the astacin family. J. Biol. Chem. 1997. V.272(21). P. 13772-13778.

14. Yan L., Leontovich A., Fei K., Sarras M.P., Jr. // Hydra metalloproteinase 1 (HMP-1): a secreted astacin metalloproteinase whose apical axis expression is differentially regulated during head regeneration. Dev Biol. 2000. V.219(l). P.l 15-128.

15. Pan Т., Groger H., Schmid V., Spring J. // A toxin homology domain in an astacin-like metalloproteinase of the jellyfish Podocoryne carnea with a dual role in digestion and development. Dev. Genes Evol. 1998. V.208 (5). P.259-266.

16. Geier G., Zwilling R. // Cloning and characterization of a cDNA coding for Astacus embryonic astacin, a member of the astacin family of metalloproteases from the crayfish Astacus astacus. Eur. J. Biochem. 1998. V. 253 (3). P.796-803.

17. Ravi Ram K., Sirot L.K., Wolfner M.F. // Predicted seminal astacin-like protease is required for processing of reproductive proteins in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103(49). P. 18674-18679.

18. Leighton M., Kadler K.E.// Paired basic/Furin-like proprotein convertase cleavage of Pro-BMP-1 in the trans-Golgi network. J. Biol. Chem. 2003. V.278(20). P.l8478-18484.

19. Becker C., Kruse M.N., Slotty K.A., Kohler D., Harris J.R., Rosmann S., Ster-chi E.E., Stocker W. // Differences in the activation mechanism between the alpha and beta subunits of human meprin. Biol. Chem. 2003. V.384. P.825-831.

20. Lippincott-Schwarz J., Yuan L.C., Bonifacino J.S., Klausner R.D. // Rapid redistribution of Golgi proteins into the ER in cells treated with brefeldin A: evidence for membrane cycling from Golgi to ER. Cell. 1989. V. 56(5). P.801-813.

21. Yan J., Cheng Q., Li C.-B., Aksoy S. // Molecular characterization of three gut genes from Glossina morsitans morsitans: cathepsin B, zinc-metalloprotease and zinc-carboxypeptidase. Insect Mol. Biol. 2002. No.ll(l). P.57-65.

22. De Maere V., Vercauteren I., Geldhof P., Gevaert K., Vercruysse J., Claerebout E. // Molecular analysis of astacin-like metalloproteases of Ostertagia ostertagi. Parasitology. 2005. V.130. Pt.l. P. 89-98.

23. Yan L., Fei K., Zhang J., Dexter S., Sarras M.P. // Identification and characterization of hydra metalloproteinase2 (HMP 2): a meprin-like astacin metallo-proteinase that functions in foot morphogenesis. Development. 2000. V.127 (1). P. 129-141.

24. Tarentino A.L., Quinones G., Grimwood B.G., Hauer C.R., Plummer T.H.Jr. // Molecular cloning and sequence analysis of flavastacin: An O-glycosylated pro-caiyotic zinc metalloendopeptidase. Arch. Biochem. Biophys. 1995. V.319 (1). P. 281-285.

25. Yasumasu S., Katow S., Hamazaki T.S., Iuchi I., Yamagami K. // Two constituent proteases of a teleostean hatching enzyme: concurrent syntheses and packaging in the same secretory granules in discrete arrangement. Dev. Biol. 1992. V.149. P. 349-356.

26. Stroupe S.T., Craig S.S., Gorbea C.M., Bond J.S. // Sex-related differences in meprin-A, a membrane-bound mouse kidney proteinase. Am J. Physiol. 1991. V.261(l). P. E354-E361.

27. Kadowaki Т., Tsukuba Т., Bertenshaw G.P., Bond J.S. // N-Linked oligosaccharides on the meprin A metalloprotease are important for secretion and enzymatic activity, but not for apical targeting. J. Biol. Chem. 2000. V.275 (33). P. 25577-25584.

28. Garrigue-Antar L., Hartigan N., Kadler K.E. // Post-translational modification of bone morphogenetic protein-1 is required for secretion and stability of the protein. J. Biol. Chem. 2002. V.277 (45). P. 43327-^3334.

29. Bode W., Gomis-Ruth F.X., Huber R., Zwilling R., Stocker W. // Structure of astacin and implications for activation of astacins and zinc-ligation of colla-genases. Nature. 1992. V.358. P. 164-167.

30. Stocker W., Gomis-Ruth F.X., Bode W., Zwilling R. // Implications of the three-dimensional structure of astacin for the structure and function of the astacin family of zinc-endopeptidases. Eur. J. Biochem. 1993. V.214 (1). P. 215-231.

31. Gerhartz В., Mac Sweeney A., Bodendorf U., Hommel U. // Crystal structure of the catalytic domain of tolloid-like protease 1 and uses thereof. European Patent №1932907. 2008.

32. Hege Т., Baumann U. // Structure-function relationships in serralysins, probed by site-directed mutagenesis and X-ray crystallography. Acta Cryst. 2000. A56 (supplement s.253).

33. Yokozawa Y., Tamai H., Tatewaki S., Tajima Т., Tsuchiya Т., Kanzawa N. // Cloning and biochemical characterization of astacin-like squid metalloprotease. J. Biochem. 2002. V.132(5). P.751-758.

34. Johnson G.D., Bond J.S. // Activation mechanism of meprins, members of the astacin metalloendopeptidase family. J. Biol. Chem. 1997. V.272(44). P. 28126-28132.

35. Hengst J.A., Bond J.S. // Transport of meprin subunits through the secretory pathway: role of the transmembrane and cytoplasmic domains and oligomeriza-tion. J. Biol. Chem. 2004. V. 279 (33). P. 34856-34864.

36. Porter S., Clark I.M., Kevorkian L., Edwards D.R. // The ADAMTS metallo-proteinases. Biochem. J. 2005. V. 386(Pt 1). P. 15-27.

37. Mohrlen F., Maniura M., Plickert G., Frohme M., Frank U. // Evolution of astacin-like metalloproteases in animals and their function in development. Evol. Dev. 2006. V. 8(2). P. 223-231.

38. Xiong X., Chen L., Li Y., Xie L., Zhang R. // Pf-ALMP, a novel astacin-like metalloproteinase with cysteine arrays, is abundant in hemocytes of pearl oyster Pinctadafucata. Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1759(11-12). P. 526-534.

39. Tsukuba Т., Bond J.S. // Role of the COOH-terminal domains of meprin A in folding, secretion, and activity of the metalloendopeptidase. J. Biol. Chem. 1998. V. 273(52). P. 35260-35267.

40. Ge G., Greenspan D.S. // Developmental roles of the BMP1/TLD metallopro-teinases. Birth Defects Res. С Embryo Today. 2006. V. 78(1). P.47-68.

41. Litovchik L., Chestukhin A., Shaltiel S. // The C-terminal tail of KSMP/meprin P is involved in its intracellular trafficking. J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.29043-29051.

42. Tang J., Bond J.S. // Maturation of secreted meprin alpha during biosynthesis: role of the furin site and identification of the COOH-terminal amino acids of themouse kidney metalloprotease subunit. Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 349(1). P. 192-200.

43. Villa J.P., Bertenshaw G.P., Bylander J.E., Bond J.S. // Meprin proteolytic complexes at the cell surface and in extracellular spaces. Biochem. Soc. Symp. 2003. V. 70. P.53-63.

44. Ishmael F.T., Norcum M.T., Benkovic S.J., Bond J.S. // Multimeric structure of the secreted meprin A metalloproteinase and characterization of the functional protomer. J. Biol. Chem. 2001. V.276(25). P. 23207-23211.

45. Bertenshaw G.P., Norcum M.T., Bond J.S. // Structure of homo-and hetero-oligomeric meprin metalloproteases. J. Biol. Chem. 2003. V. 278(4). P. 25222532.

46. Stocker W., Zwilling R. // Astacin. Meth. Enzymol. 1995. V.248. P.305-325.

47. Butler P.E., Mc Kay M.J., Bond J.S. // Characterization of meprin, a membrane-bound metalloendopeptidase from mouse kidney. Biochem. J. 1987. V. 241(1). P. 229-235.

48. Yiallouros I., Grosse Berkhoff E., Stocker W. // The roles of Glu 93 and Tyr 149 in astacin-like zinc peptidases. FEBS Lett. 2000. V. 484(3). P. 224-228.

49. Garrigue-Antar L., Barker C., Kadler K.E. // Identification of amino acid residues in bone moiphogenetic protein-1 important for procollagen C-proteinase activity. J. Biol. Chem. 2001. V. 276(28). P. 26237-26242.

50. Doll B.A., Villa J.P., Ishmael F.T., Bond J.S. // Zinc ligands in an astacin family metalloprotease meprin A. Biol. Chem. 2002. V. 383 (7-8). P. 1167-1173.

51. Park H.I., Ming L.J. // The mechanistic role of the coordinated tyrosine in astacin. J. Inorg. Biochem. 1998. V. 72. P.57-62.

52. Yiallouros I., Vassiliou S., Yiotakis A., Zwilling R., Stocker W., Dive V. // Phosphinic peptides, the first potent inhibitors of astacin, behave as extremely slowly-binding inhibitors. Biochem. J. 1998. V. 331(Pt2). P. 375-379.

53. Williams R.J.P., Frausto da Silva J.J.R. // The distribution of elements in cells. Coord. Chem. Rev. 2000. V. 200-202. P. 237-348.

54. Vallee B.L., Auld D.S. // Zinc coordination, function and structure of zinc enzymes and other proteins. Biochemistiy. 1990. V. 29(24). P. 5647-5659.

55. Soler D., Nomizu Т., Brown W.E., Shibata I., Auld D.S.// Matrilysin: expression, purification, and characterization. J. Protein Chem. 1995. V.14 (7). P. 511-520.

56. Garrigue-Antar L., Francis V., Kadler K.E. // Deletion of epidermal growth factor-like domains converts mammalian tolloid into a chordinase and effective procollagen C-proteinase. J. Biol. Chem. 2004. V. 279(48). P.49835-49841.

57. Hojima Y., Behta В., Romanic A.M., Prockop D.J. // Cadmium ions inhibit procollagen C-proteinase and cupric ions inhibit procollagen N-proteinase. Matrix Biol. 1994. V. 14(2). P. 113-120.

58. Shibata I., Iwamatsu Т., Oba Y., Kobayashi D., Tanaka M., Nagahama Y., Suzuki N., Yoshikuni M. // Identification and cDNA cloning of alveolin, an extracellular metalloproteinase, which induces chorion hardening of medaka

59. Oryzias latipes) eggs upon fertilization. J. Biol. Chem. 2000. V.275(12). P. 8349-8354.

60. Fan T.J., Katagiri C. // Properties of the hatching enzyme from Xenopus laevis. Eur. J. Biochem. 2001. V.268(18). P. 4892-4898.

61. Bertenshaw G.P., Villa J.P., Hengst J.A., Bond J.S. // Probing the active sites and mechanisms of rat metalloproteases meprin A and B. Biol. Chem. 2002. V. 383 (7-8). P. 1175-1183.

62. Wolz R.L., Bond J.S. // Phe5(4-nitro) bradykinin: a chromogenic substrate for assay and kinetics of the metalloendopeptidase meprin. Anal. Biochem. 1990. V. 191(2). P. 8488-8493.

63. Grams F., Zimmerman G. // Pyrimidin-2,4,6-trion derivatives, method for producing the same and medicinal products containing these compounds. USA Patent № 6242455. 2001.

64. Wagner W., Mohrlen F., Schnetter W. // Characterization of the proteolytic enzymes in the midgut of the European Cockchafer, Melolontha melolontha (Col-eoptera: Scarabaeidae). Insect Biochem. Mol. Biol. 2002. V. 32(7). P. 803-814.

65. Harlin-Cognato A., Hoffman E.A., Jones A.G. // Gene cooption without duplication during the evolution of a male-pregnancy gene in pipefish. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103(51). P. 19407-19412.

66. Chestukhin A., Litovchik L., Muradov K., Batkin M., Shaltiel S. // Unveiling the substrate specificity of meprin on the basis of the site in PKA cleaved by the kinase-splitting membranal proteinase. J. Biol. Chem. 1997. V.272(6). P. 3153-3160.

67. Medeck R.J., Sosa S., Morris N., Oxford J.T. // BMP-1-mediated proteolytic processing of alternatively spliced isoforms of collagen type XI. Biochem. J. 2003. V. 376(Pt2). P. 361-368.

68. Zhang Y., Ge G., Greenspan D.S. // Inhibition of bone morphogenetic protein 1 by native and altered forms of alpha2-macroglobulin J. Biol. Chem. 2006. V. 281(51). P. 39096-39104.

69. Villa J.P., Bertenshaw G.P., Bond J.S. // Critical amino acids in the active site of meprin metalloproteinases for substrate and peptide bond specificity. J. Biol. Chem. 2003. V. 278(43). P. 42545-42550.

70. Walker P.D., Kaushal G.P., Shah S.V. // Meprin A, the major matrix degrading enzyme in renal tubules, produces a novel nidogen fragment in vitro and in vivo. Kidney Int. 1998. V. 53(6). P.1673-1680.

71. Yasumasu S., Iuchi I., Yamagami K. // Isolation and some properties of low choriolytic enzyme (LCE), a component of the hatching enzyme of the teleost, Oryzias latipes. J. Biochem (Tokyo). V.105, P. 212-218.

72. Kanzawa N., Yabuta H., Fujimi T.J., Tsuchiya T. // Solubility properties of a 65-kDa peptide prepared by restricted digestion of myosin with astacin-like squid metalloprotease. Zoolog. Sci. 2004. V.21(2). P. 159-162.

73. Reynolds S.D., Zhang D., Puzas J.E., O'Keefe R.J., Rosier R.N., Reynolds P.R. // Cloning of the chick BMPl/Tolloid cDNA and expression in skeletal tissues. Gene. 2000. V. 248 (1-2). P. 233-243.

74. Serpe M., Ralston A., Blair S.S., O'Connor M.B. // Matching catalytic activity to developmental function: tolloid-related processes Sog in order to help specify the posterior crossvein in the Drosophila wing. Development. 2005. V.132. P. 2645-2656.

75. Stocker W., Sauer В., Zwilling R. // Kinetics of nitroanilide cleavage by astacin. Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1991. V. 372 (6). P. 385-392.

76. Hartigan N., Garrigue-Antar L., Kadler K.E. // Bone morphogenetic protein-1 (BMP-1). Identification of the minimal domain structure for procollagen C-proteinase activity. J. Biol. Chem. 2003. V. 278(20). P. 18045-18049.

77. Zwilling R., Dorsam H., Torff H.J., Rodl J. // Low molecular mass protease: evidence for a new family of proteolytic enzymes. FEBS Lett. 1981. V. 127(1). P. 75-78.

78. Wolz R.L. // A kinetic comparison of the homologous proteases astacin and meprin A. Arch. Biochem. Biophys. 1994. V. 310(1). P. 144-151. v

79. Wolz R.L., Harris R.B., Bond J.S. // Mapping the active site of meprin-A with peptide substrates and inhibitors. Biochemistry. 1991. V. 30(34). P. 8488-8493.

80. Hojima Y., van der Rest M., Prockop D.J. // Type I procollagen carboxyl-terminal proteinase from chick embryo tendons. Purification and characterization. J. Biol. Chem. 1985. V.260(29). P.15996-16003.

81. Lee H. X., Ambrosio A. L., Reversade В., De Robertis E. M. // Embryonic dorsal-ventral signaling: secreted frizzled-related proteins as inhibitors of tolloid proteinases. Cell. 2006. V. 124(1). P. 147-159

82. Tsai P.L., Chen C.H., Huang C.J., Chou C.M., Chang G.D. // Purification and cloning of an endogenous protein inhibitor of carp nephrosin, an astacin metalloproteinase. J. Biol. Chem. 2004. V. 279(12). P. 11146-11155.

83. Hirano M., Ma B. Y., Kawasaki N., Okimura K., Baba M., Nakagawa Т., Miwa K., Kawasaki N., Oka S., Kawasaki T. //Mannan-binding protein blocksthe activation of metalloproteases meprin alpha and beta. J. Immunol. 2005. V.175. P. 3177-3185.

84. Tripp C.A., Frank G.R., Grieve R.B. // Anti-parasite astacin metalloendopep-tidase antibodies. USA Patent №6673345. 2004.

85. Yasumasu S., Iuchi I., Yamagami K. // Purification and partial characterization of high choriolytic enzyme (HCE), a component of the hatching enzyme of the teleost, Oryzias latipes. J Biochem. (Tokyo). 1989. V. 105(2). P. 204-211.

86. Kohler D., Kruse M.N., Sterchi E.E., Stocker W. // Heterologously overex-pressed, affinity-purified human meprin alpha is functionally active and cleaves components of the basement membrane in vitro. FEBS Lett. 2000. V. 465(1). P. 2-7.

87. Reyda S., Jacob E., Zwilling R., Stocker W. // cDNA cloning, bacterial expression, in vitro renaturation and affinity purification of the zinc endopepti-dase astacin. Biochem. J. 1999. V.344 (Pt.3). P.851-857.

88. Titani K., Torff H.J., Hormel S., Kumar S., Walsh K.A., Rodl J., Neurath H., Zwilling R. // Amino acid sequence of a unique protease from the crayfish Astacus fluviatilis. Biochemistry. 1987. V.26. P. 222-226.

89. Prockop D.J., Hojima Y., Li S.-W., Sieron A. // Recombinant C-proteinase and processes, methods and uses thereof. USA Patent №6258584. 2001.

90. Foradori M.J., Tillinghast E.K., Smith J.S., Townley M.A., Mooney R.E. // Astacin family metallopeptidases and serine peptidase inhibitors in spider digestive fluid. Сотр. Biochem. Physiol. В Biochem. Mol. Biol. 2006. V. 143(3). P. 257-268.

91. Wayne Davis M., Birnie A.J., Chan A.C., Page A.P., Jorgensen E.M. // A conserved metalloprotease mediates ecdysis in Caenorhabditis elegans. Development. 2004. V. 131. P. 6001-6008.

92. Lopez В., Gonzalez A., Beaumont J. // Identification of a potential cardiac an-tifibrotic mechanism of torasemide in patients with chronic heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 2007. V. 50. P. 859-867.

93. Huguenin M., Miiller E.J., Trachsel-Rosmann S., Oneda В., Ambort D., Sterchi E.E., Lottaz D. // The metalloprotease meprin beta processes E-cadherin and weakens intercellular adhesion. PLoS ONE. 2008. V.3(5). P. e2153.

94. Bond J.S., Matters G.L., Banerjee S., Dusheck R.E. // Meprin metalloprotease expression and regulation in kidney, intestine, urinary tract infections and cancer. FEBS Lett. 2005. V. 579 (15). P. 3317-3322.

95. Padanilam B.J. // Cell death induced by acute renal injury: a perspective on the contributions of apoptosis and necrosis. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2003. V.284. P.F608-F627.

96. Sarras M.P. Jr, Yan L., Leontovich A., Zhang J.S. // Structure, expression, and developmental function of early divergent forms of metalloproteinases in hydra. Cell Res. 2002. V. 12(3-4). P. 163-176.

97. Davis S.W., Smith W.C. // Expression cloning in ascidians: isolation of a novel member of the astacin protease family. Dev Genes Evol. 2002. V. 212(2). P. 81-86.

98. Schmitz C., Kinge P., Hutter H. // Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegansstrain nre-l(hd20) lin-15b(hdl26). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104(3). P.834-839.

99. Ge G., Fernandez C.A., Moses M.A., Greenspan D.S. // Bone morphogenetic protein 1 processes prolactin to a 17-kDa antiangiogenic factor Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104(24). P.l0010-10015.

100. Hasilik A. Biosynthese, Modification und Abbau von Proteinen. / Biochemie und Pathobiochemie. Eds. G. Loffler, P. E. Petrides, P. C. Heinrich. Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg-New York. 2003. Teil 8. P.318.

101. Chau P., Fielding P.E., Fielding C.J. // Bone morphogenetic protein-1 (BMP-1) cleaves human proapolipoprotein A1 and regulates its activation for lipid binding. Biochemistry. 2007. V. 46(28). P. 8445-8450.

102. Chestukhin A., Muradov K., Litovchik L., Shaltiel S. // The cleavage of protein kinase A by the kinase-splitting membranal proteinase is reproduced by meprin. J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 30272-30280.

103. Beynon R.J., Oliver S., Robertson D.H. // Characterization of the soluble, secreted form of urinary meprin. Biochem. J. 1996. V. 315 (Pt 2). P. 461-465.

104. Tamura G., Olson D., Miron J., Clark T.G. // Tolloid-like 1 is negatively regulated by stress and glucocorticoids. Brain Res. Mol. Brain Res. 2005. V. 142(2). P.81-90.

105. Takahara K., Brevard R., Hoffman G.G., Suzuki N., Greenspan D.S.// Characterization of a novel gene product (mammalian Tolloid-like) with high sequence similarity to mammalian Tolloid/bone morphogenetic protein-1. Genomics. 1996. V. 34(2). P. 157-165.

106. Kristjansdottir S., Gudmundsdottir A. // Propeptide dependent activation of the Antarctic krill euphauserase precursor produced in yeast. Eur. J. Biochem. 2000. V. 267(9). P. 2632-2639.

107. Titani К., Sasagawa Т., Woodbury R.G., Ericsson L.H., Dorsam H., Kraemer M., Neurath H., Zwilling R. // Amino acid sequence of crayfish (Astacus Jluvi-atilis) trypsin If. Biochemistry. 1983. V.22(6). P. 1459-1465.

108. Gudmundsdottir A. // Cold-adapted and mesophilic brachyurins. Biol Chem. 2002. V. 383(7-8). P. 1125-1131.

109. Oh E.-S., Kim D.-S., Kim J.-H., Kim H.-R. // Enzymatic properties of a protease from the hepatopancreas of shrimp, Penaeus orientalis. J. Food Biochem. 2000. V.24.P. 251-264.

110. Bornstein P., Traub W. The chemistry and biology of collagen. / The proteins. (Neurath H. and Hill R L, eds.) New York. Academic Press. 1979. Pt. 4. P. 411-632.

111. Grant G.A., Sacchettini J.C., Welgus H.G. // A collagenolytic serine protease with trypsin-like specificity from the fiddler crab Uca pugilator. Biochemistry. 1983. V. 22(2). P. 354-358.

112. Sainz J.C., Garcia-Carreno F.L., Hemandez-Cortes P. // Penaeus vannamei isotrypsins: purification and characterization. Сотр. Biochem. Physiol. B. 2004. V. 138. P. 155-162.

113. Johnston D., Hermans J.M., Yellowlees D. // Isolation and characterization of a trypsin from the slipper lobster, Thenus orientalis (Lund). Arch. Biochem. Biophys. 1995. V. 324(1). P.35-40.

114. Климова О.А., Чеботарев В.Ю. // Коллагенолитический комплекс проте-аз из гепатопанкреаса камчатского краба: разделение на индивидуальные компоненты. Бюлл. эксп. биол. мед. 1999. Т. 128. № 9. С. 308-313.

115. Лебедев A.T. / Масс-спектрометрия в органической химии. М.:2003.

116. Qin J., Chait В.Т. // Collision-induced dissociation of singly charged peptide ions in a matrix-assisted laser desorption ionization ion trap mass spectrometer. Int. J. Mass Spectrom. 1999. V.191. P.313-320.

117. Perona J. J., Craik C.S. // Structural basis of substrate specificity in the serine proteinases. Protein Sci. 19. V.4(3). P.337-360.

118. Rezaie A.R. // Role of residue 99 at the S2 subsite of factor Xa and activated Protein С in enzyme specificity. J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 23807-23814.

119. Leiros H.-K. S., McSweeney S. M., Smalas A. O. // Atomic resolution structures of trypsin provide insight into structural radiation damage. Acta Cryst. (2001). V.D57. P.488-497.

120. Климова O.A., Чеботарев В.Ю. // Коллагенолитический комплекс проте-аз из гепатопанкреаса камчатского краба: энзимологические свойства индивидуальных компонентов. Бюлл. эксп. биол. мед. 1999. Т.128(10). С.391-396.

121. Wu Z., Jiang G., Xiang P., Yang D., Wang N. // Purification and characterization of trypsin-like enzymes from North Pacific krill (.Euphausia pacifica). Biotechnol. Lett. 2008. V. 30, P.67-72.

122. Yamada К., Murakami Н., Tachibana Н., Watanabe Y., Miyake Y., Omura H. // Stimulation by 2-mercaptoethanol and alcohols of protease in antarctic krill, Euphausia superba, at low temperature. Agric. Biol. Chem. 1987. V.51. P. 3363-3368.

123. Kimoto K., Yokoi Т., Murakami K. // Purification and characterization of chymotrypsin-like proteinase from Euphausia superba. Agric. Biol. Chem. 1985. V.49. P. 1599-1603.

124. Wu Z., Jiang G. // Purification and characterization of trypsin-like enzymes from Neomysis japonica using BApNA as substrate. Int. J. Pept. Res. Ther. 2008. V.2. P.75-80.

125. Jeong Y., Wei C.I., Preston J.F., Marshall M.R. // Purification and characterization of proteases from hepatopancreas of crayfish (Procambarus clarkii). J. Food Biochem. 2000. V. 24. P.311-332.

126. Hernandez-Cortes P., Whitaker J., Garcia-Carreno F.L. // Purification and characterization of chymotrypsin from Penaeus vannamei (Crustacea: Deca-poda). J. FoodBiochem. 1997. V. 21. P.497-514.

127. Roy P., Colas В., Durand P. // Purification, kinetical and molecular characterizations of a serine collagenolytic protease from greenshore crab (Carcinus maenas) digestive gland. Сотр. Biochem. Physiol. В Biochem. Mol. Biol. 1996. V. 115. P. 87-95.

128. Eisen A.Z., Henderson K.O., Jeffrey J.J., Bradshaw R.A. // A collagenolytic protease from the hepatopancreas of the fiddler crab, Uca pugilator. Purification and properties. Biochemistry. 1973. V. 12. P. 1814-1822.

129. Tsu C.A., Perona J.J., Schellenberger V., Turck C.W., Craik C.S. H The substrate specificity of Uca pugilator collagenolytic serine protease I correlates with the bovine type I collagen cleavage site. J. Biol. Chem. 1994. V. 269(52). P. 19565-19572.

130. Wohl R.C., Summaria L., Robbins K.C. // Kinetics of activation of human plasminogen by different activator species at pH 7.4 and 37 degrees C. J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 2005-2013.

131. Pozsgay M., Szabo G., Bajusz S., Simonsson R., Gaspar R., Elodi P. // Investigation of the substrate-binding site of trypsin by the aid of tripeptidyl-p-nitroanilide substrates. Eur. J. Biochem. 1981. V.l 15(3). P.497-502.

132. Blaber M., Isackson P.J., Marsters J.C., Burnier J.P., Bradshaw R.A. // Substrate specificities of growth factor associated kallikreins of the mouse submandibular gland. Biochemistry. 1989. V. 28. P. 7813-7819.

133. Le Bonniec B.F., Esmon C.T. // Glu-192—Gin substitution in thrombin mimics the catalytic switch induced by thrombomodulin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P. 7371-7375.

134. Powers J.C., McRae В. J., Tanaka Т., Cho K., Cook R.R. I I Peptide thioesters and 4-nitroanilides as substrates for porcine pancreatic kallikrein. Biochem. J. 1984. V. 220. P. 569-573.

135. Гаспарян M. Э., Остапченко В. Г., Долгих Д. А., Кирпичников М. П. // Биохимическая характеристика рекомбинантной лёгкой цепи энтеропеп-тидазы человека. Биохимия. 2006. Т. 71 (2). С. 149-156.

136. Jia Y.H., Jin Y., Lu Q.M., Li D.S., Wang W.Y., Xiong Y.L. // Jerdonase, a novel serine protease with kinin-releasing and fibrinogenolytic activity from Trimeresurus jerdonii venom. Acta Biochim. Biophys. Sin. 2003. V. 35. P. 689-694.

137. Chagas J. R., Portaro F. С. V, Hirata I. Y., Almeida P. C., Juliano M. A., Juli-ano L., Prado E. S. // Determinants of the unusual cleavage specificity of lysyl-bradykinin-releasing kallikreins. Biochem. J. 1995. V. 306. P. 63-69.

138. Паписова А.И., Семенова С.А., Кислицын Ю.А., Руденская Г.Н. // Особенности гидролиза субстратов эндопептидазами из гепатопанкреаса камчатского краба. Биоорг. химия. 2008. Т. 34 (3). С.479-486.

139. Rudenskaya G.N., Bogdanova E.A., Revina L.P., Golovkin B.N., Stepanov V.M. // Macluralisin a serine proteinase from fruits of Maclura pomifera (Raf.) Schneid. Planta. 1995. V.196(l). P. 174-179.

140. Богачева A.M., Руденская Г.Н., Пройссер А., Чикилева И.О., Дунаевский Я.Е., Головкин Б.Н., Степанов В.М. // Протеиназа из корней одуванчика Taraxacum officinale. Биохимия. 1999. Т.64(9). С. 1224-1232.

141. Spungin-Bialik A., Ben-Meira D., Fudima E., Carmeli S., Blumberg S. // Sensitive substrates for neprilysin (neutral endopeptidase) and thermolysin that are highly resistant to serine proteases. FEBS Lett. 1996. V.380(l-2). P. 79-82.

142. Asgeirsson В., Bjarnason J.B. // Structural and kinetic properties of chy-motrypsin from atlantic cod (Gadus morhua). Comparison with bovine chy-motrypsin. Сотр. Biochem. Physiol. B. 1991. V. 99B. P.327-335.

143. Keil B. / Specificity of proteolysis. Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg-NewYork. 1992.

144. Monigatti F., Berndt P. // Algorithm for accurate similarity measurements of peptide mass fingerprints and its application. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005. V.16. P. 13-21.

145. Степанов В.М./ Молекулярная биология: структура и функции белков. М.: 1997.

146. Keil-Dlouha V., Zylber N., Imhoff J.-M., Tong N.-T., Keil B. // Proteolytic activity of pseudotrypsin. FEBS Lett. 1971. V. 16(4). P.291-295.

147. Stocker W., Ng M., Auld D.S. // Fluorescent oligopeptide substrates for kinetic characterization of the specificity of Astacus protease. Biochemistry. 1990. V.29(45). P. 10418-10425.

148. Wu Z., Jiang G., Wang N., Wang J., Chen S., Xu Z. // Relating trypsin enzymatic properties with amino acid composition. Int. J. Pept. Res. Ther. 2007. V.14. P.81-87.

149. Schroder Leiros H.K., Willassen N. P., Smalas A. O. // Structural comparison of psychrophilic and mesophilic trypsins. Elucidating the molecular basis of cold-adaptation. Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 1039-1049.

150. Adekoya O.A., Helland R., Willassen N.P., Sylte I. // Comparative sequence and structure analysis reveal features of cold adaptation of an enzyme in the thermolysin family. Proteins. 2006. V. 62(2). P. 435-449.

151. Feller G., Gerday C. // Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation. Nat. Rev. Microbiol. 2003. V. 1(3). P. 200-208.

152. Schr0der H.K., Willassen N.P., Smalas A.O. // Structure of a non-psychrophilic trypsin from a cold-adapted fish species. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1998. V. 54 (Pt 5). P.780-798.

153. Eyre D.R., Matsui Y., Wu J.-J. // Collagen polymorphisms of the intervertebral disc. Biochem. Soc. Trans. 2002. V. 30. P. 844-848.

154. Нурминская M.B. Исследование белков и геномных последовательностей Candida utilis, содержащих элементы гомологии с альфа-цепью коллагена высших эукариот. Дисс. канд. биол. наук. Москва. 1991.

155. Dabbous М.К., Roberts A.N., Brinkley S.B. // Collagenase and neutral protease activities in cultures of rabbit VX-2 carcinoma. Cancer Res. 1977. V.37. P. 3537-3544.

156. Welgus H.G., Grant G.A., Jeffrey J.J., Eisen A.Z. // Substrate specificity of the collagenolytic serine protease from Uca pugilator. studies with collagenous substrates. Biochemistry. 1982. V.21 (21). P.5183-5189.

157. Mainardi C.L., Dixit S.N., Kang A.H. // Degradation of type IV (basement membrane) collagen by a proteinase isolated from human polymorphonuclear leukocyte granules. J Biol. Chem. 1980. V.255(l 1). P.5435-5441.

158. Fortney D.Z., Durham D.R. // Composition containing protease produced by Vibrio and method of use in debridement and wound healing. 1997. European patent 0472 011.

159. Lim В., Lee E. H., Sotomayor M., Schulten K. // Molecular basis of fibrin clot elasticity. Structure. 2008. V. 16. P. 449-459.

160. Wright H, T. // Secondary and conformational specificities of trypsin and chy-motrypsin. Eur. J. Biochem. 1977. V. 73. P. 567-578.

161. Tsurupa G., Tsonev L., Medved L. // Structural organization of the fibrinogen) alpha C-domain. Biochemistry. 2002. V. 41(20). P. 6449-6459.

162. Markland F. S. // Snake venoms and the hemostatic system. Toxicon. 1998. V. 36(12). P. 1749-1800.

163. Kirschbaum N.E., Budzynski A.Z. // A unique proteolytic fragment of human fibrinogen containing the A alpha COOH-terminal domain of the native molecule. J. Biol. Chem. 1990. V. 265(23). P. 13669-13676.

164. Astrup Т., Mullertz S. // The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys. 1952. V. 40(2). P. 346-351.

165. Hellgren L., Mohr V., Vincent J., Vincent J., Karlstam B. // Intravasal thrombolysis. European Patent No. W01994SE00550 19940607. 1995.

166. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovitch E.L., Balaban N.P., Mardanova

167. A.M., Sharipova M.R., Viryasov M.B., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. // Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedins, strain 3-19. FEBS Lett. 1997. V.404(2-3). P.241—244.

168. Bradford M.M. // A rapid and sensitive method of the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal. Biochem. 1976. V.72. P.248-251.

169. Filippova I. Yu., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. // L-pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine-p-nitroanilide a chromogenic substrate for thiol proteinase assay. Anal. Biochem. 1984. V. 143(2). P.293-297.

170. Березин И.В., Клёсов A.A. // Практический курс химической и ферментативной кинетики. М. 1976.

171. Frugoni J.A.C. // Tampone universale di Britton e Robinson a forza ionica constante. Gazz. Chem. Ital. 1957. V.87. P. 403-407.

172. Шагинян K.A., Изотова Л.С., Иомантас Ю.В., Стронгин А.Я., Степанов

173. B.М. // Металлопротеиназа Bacillus snbtilns: «внутриклеточные» и «внеклеточные» ферменты. Биохимия. 1980. Т.45. С. 2083-2095.

174. Андреенко Г.В. (ред.) Методы исследования фибринолитической системы крови. Изд-во МГУ, Москва. 1981.

175. Matz М., Shagin D., Bogdanova Е., Britanova О., Lukyanov S., Diatchenko L. Chenchik A. // Amplification of cDNA ends based on template-switching-effect and step-out PCR. Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1558-1560.

176. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. // Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 2004. V.340. P.783-795.

177. Schwede Т., Kopp J., Guex N., Peitsch M.C. // SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Research. 2003. No.31.P. 3381-3385.

178. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. // Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990. V.215. P.403-410.

179. Johnson R.S., Taylor J.A. // Searching sequence databases via De novo peptide sequencing by tandem mass spectrometry. Mol. Biotechnol. 2002. V. 22(3). P.301-315.

180. Ma В., Zhang K., Hendrie C., Liang C., Li M., Doherty-Kirby A., Lajoie G. // PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003. V.17. P.2337-2342.