Выделение и структурно-функциональная характеристика трипсина камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

зъ

На правах рукописи

КИСЛИЦЫН Юрий Алексеевич

ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРИПСИНА КАМЧАТСКОГО КРАБА {РАКАЫТНООЕБ САМТБСНАПСи5)

02 00 10-биоорганическая химия

□□3175Э85

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

003175985

Работа выполнена в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель доктор химических наук, вед науч сотр

Руденская Галина Николаевна

Официальные оппоненты доктор химических наук,

профессор Румш Лев Давидович доктор химических наук, ст н сотр Еремеев Николай Леонидович

Ведущая организация Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится 27 ноября 2007 года в 15 00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 501 001 41 по химическим наукам при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119992, г Москва, Ленинские горы, д 1, строение40, Институт физико-химической биологии им АН Белозерского, МГУ, ауд 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им MB Ломоносова

Автореферат разослан 26 октября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Трипсины являются наиболее типичными представителями сериновых протеиназ В настоящее время трипсины обнаружены в организмах, принадлежащих к различным таксономическим группам Функции, выполняемые этими ферментами, довольно разнообразны Основной функцией трипсина в организме человека, млекопитающих и беспозвоночных животных является участие данного фермента в пищеварении и активации других протеолитических ферментов, участвующих в этом процессе Кроме того, у человека и млекопитающих доказано участие трипсина в процессах клеточной пролиферации, расширении сосудов, развитии воспаления, а также в различных патологических состояниях от рака, панкреатита, астмы и до дерматитов и экземы У беспозвоночных животных физиологические и биохимические процессы, в которых принимают участие трипсины, изучены слабее На данный момент, у насекомых и ракообразных показано участие трипсина в пищеварении, клеточной дифференцировке и реакциях иммунного ответа

В настоящее время большой интерес вызывают трипсины, выделенные из психрофильных организмов Наиболее изучены психрофильные трипсины рыб Работы по изучению психрофильных трипсинов беспозвоночных малочисленны и содержат сведения либо о физико-химических и энзимологических свойствах, либо о первичной структуре Для полного понимания эффективности действия психрофильных трипсинов необходимо комплексное изучение структуры и свойств трипсинов беспозвоночных, обитающих при низких температурах Камчатский краб в этом смысле является подходящим объектом исследования Данные таких исследований позволяют более полно понять разнообразие биологических функций трипсинов, а также могут быть использованы для создания биокатализаторов с заданными свойствами

Трипсин, как и некоторые другие сериновые протеиназы, успешно экспрессируется в культуре клеток млекопитающих, Escherichia colt, дрожжах Pichia pastoris Несмотря на это, производство трипсина этими системами в силу ряда причин не получило широкого распространения, и в настоящее время большая часть фермента вырабатывается из панкреатической железы крупного рогатого скота и свиней Производство трипсина из гепатопанкреаса камчатского краба Parahthodes camtschaticus (трипсина PC) является более целесообразным в том смысле, что трипсин, полученный таким образом, не будет загрязнен вирусами, прионами и другими инфекционными агентами, свойственными млекопитающим, а также будут частично утилизированы отходы краболовства

Цель и задачи исследования

Настоящая работа посвящена изучению свойств и первичной структуры трипсина камчатского краба Для выполнения работы были поставлены следующие задачи

1 Разработка эффективного метода получения фермента в гомогенном состоянии в количествах, достаточных для проведения научных исследований

2 Подтверждение чистоты полученного препарата

3 Изучение физико-химических и энзиматических свойств трипсина

4 Установление первичной структуры трипсина

5 Сравнение первичной структуры трипсина PC с первичными структурами психрофильных и мезофильных трипсинов

6 Определение филогенетической связи между трипсинами, выделенными из организмов, принадлежащих к различным таксономическим группам

Научная новизна и практическая значимость работы

Трипсин PC выделен из камчатского краба, морского беспозвоночного, приспособленного к обитанию при температуре воды близкой к замерзанию Актуальность изучения трипсина из такого источника обусловлена тем, что молекулярная организация ферментов психрофильных организмов позволяет им проявлять ферментативную активность, несмотря на замедление метаболических реакций при низких температурах

По структурно-функциональным особенностям трипсин PC отличается от трипсинов млекопитающих и относится к группе психрофильных ферментов Результаты, полученные в настоящей работе, вносят вклад в структурно-функциональные исследования трипсинов, выделенных из организмов, принадлежащих к разньм таксономическим группам, и могут быть использованы для создания биокатализаторов с заданными свойствами

Трипсин камчатского краба является одним из важнейших компонентов мазей, применяемых для лечения ожогов, рубцов, пролежней Мазь "Морикрол," созданная на основе суммарного препарата протеиназ камчатского краба, включая трипсин PC, прошла успешные испытания в различных клиниках Москвы

Публикация и апробация работы По теме диссертации опубликованы 3 статьи Результаты диссертации были представлены на V международном симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва 2002), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург 2002), Международной конференции по природным соединениям (Алматы, Казахстан, 2003), VI международном симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва 2007)

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 156 страницах и содержит 23 рисунка и 22 таблицы

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

В настоящей работе получен гомогенный трипсин РС, определены его физико-химические параметры и изучены его энзиматические свойства Установлена первичная структура препрофермента путем секвенирования полноразмерной кДНК трипсина Выполнено сравнение первичной структуры трипсина РС с первичными структурами трипсинов, полученных из других организмов Выявленные структурно-функциональные особенности позволяют отнести трипсин РС к группе психрофильных ферментов Произведен филогенетический анализ, на основании которого определено эволюционное положение трипсина РС среди протеиназ клана БА

I Выделение трипсина РС

В качестве исходного материала для выделения трипсина РС нами был использован коммерческий препарат "Морикраза", полученный осаждением ферментов гепатопанкреаса камчатского краба сульфатом аммония

Для получения гомогенного препарата была разработана эффективная схема очистки (таблица 1) На первой стадии применялась анионообменная хроматография на ОЕАЕ-сефадексе (рис 1) Применение этого сорбента позволило в процессе нанесения препарата избавится от пигментов и белков, не сорбирующиеся при рН 6,4 Элюция градиентом рН и градиентом ЫаС1 привела к отделению белков не обладающих трипсиновой активностью Применение ОЕАЕ-сефадекса позволило получить фермент с выходом 84%

Стадия Белок, Активность* Выход, Степень

очистки ОЕ280 общая, ед акт. удельная, ед акт /ОЕ28о % очистки

Раствор "Морикразы" 341 0 40.1 012 100 1

DEAE**-сефадекс 163 8 34.4 0 21 84 1.8

ПТГ-агароза 46 0 27 6 0 60 69 5

Mono Q 14 2 25.5 1.80 64 15

определена по гидролизу Вг-Агд-рИА (ВАРИА) "ОЕАЕ-диэтиламинозтил

Агароза , содержащая в качестве лиганда пептиды трипсинового гидролизата белка сальмина

рН 1ШС11 м

1 о

05

мл

Рис 1 Профиль элюции трипсина РС с БЕАЕ-сефадекса 1 - градиент концентрации №С1 0,5-1,0 М 2- градиент рН 6,4-8,0 Стрелкой показаны фракции, обладающие трипсиновой активностью

0 100 200 300 400 500 и"

Рис 2 Профиль элюции трипсина РС с ПТГ-агарозы 1-градиент концентрации изопропанола 0-20 % 2-градиент концентрации №С1 0,2-1,5 М 3-градиент рН 6,4-8,0 Стрелкой показаны фракции, обладающие трипсиновой активностью

Фракции обладающие трипсиновой активностью хроматографировали на ПТГ-агарозе (рис 2 ) Данный сорбент в качестве лигандов содержит пептиды триптического гидролизата сальмина-протамина осетровых рыб, богатого аргинином и лизином Использование ПТГ-агарозы позволило нам произвести очистку трипсина камчатского краба от карбоксипептидазы РС и коллагенолитической сериновой протеиназы РС Заключительный этап очистки трипсина РС включал ионообменную хроматографию на колонке Мопо С> в

г I

I

, режиме РРЪС (ряс. 3). Применение этой процедуры позволило нам окончательно очистить трипсин РС. Таким образом, с 1 выходом 64%, нами был получен , гомогенный препарат тржютна камчатского краба.

I

I II. Критерии чистоты и 1 молекулярные свойства

I трипсина РС.

, Проведение 8-электрофореза (1

павдвкрип&мидном те гее в

восстанавливаю и (и л условиях показало нали»шс единственной белковой полосы, соответствующей молекулярной массе 23 кДа (рис. 4).

Данные мае с-спектрометрического

анализа (рис. 5), выявляют одиночный ник, соответствующий молекулярной массе 24,8 кДа, что поли остью согласуется о 1 расчетом молекулярной массы по | первичной структуре фермента. , М-концевая последовательность

трипсина РС характерна для типичных . трипсинов жгеоттщ-л. ("табл.6). Из десяти М-концевых аминокислот наибольшее отличие наблюдается с М-кон пев ой , последовательностьро аминокислот

I трипсина быка. Полная идентичность первых четырех аминокислотных остатков указывает на то, что трипсин РС, как и ' трипсины млекопнтагопшх, образуется в результате активации трип сил о гена.

I

I 1

Рис. 3. Профиль глгоции трипсина РС с колонки Modo Q. Стрелкой показаны фракции, обладающие три пси но вой активностью,

кДа 1 i

—•

зо —

-„ 23 кДа

— щ

Рис. 4. Электрофорез в ПЛАГ с SDS припенна РС (2). I-белки маркеры (Serva), сверку ühwí: феЦюрщдаа Ь, RCA, овальбумин, кярбо 1гатдегидрог ei ша.

Рис 5 МА1ЛЭ1 масс-спектрометрический анализ трипсина Молекулярная масса фермента равна 24863 Да

В табл 2 представлены сравнительные характеристики полученного трипсина РС и трипсинов выделенных из организмов принадлежащих к разным таксономическим группам Значение молекулярной массы трипсина РС хорошо сопоставимо со значениями молекулярных масс трипсинов ракообразных и насекомых, но несколько выше, чем значения молекулярных масс трипсинов быка Воз 1аигт и трески Оас1и5 ogac Трипсин РС имеет самое низкое значение р1 (<2,5), среди всех представленных трипсинов и одно из самых больших значений температурного оптимума

Таблица 2 Физико-химические и энзиматические свойства трипсина РС

Источник трипсина Молекулярная масса (Мг,кДа) Изоэлектриче-ская точка (pi) рН-ста-бильность рН оптимум по (BAPNA) Т-опти-мум, °С

Бык (Bos taurus) 23 9,3 3-9,5 8,2 45

Треска (Gadus ogac) 23,5 - 7,5-10 7,5 35

Краб (Paralitliodes camtschaticus) 24,8 <2,5 5,8-9 7,5-8 55

Криль (Euphausia superba) 30 2,6 5,9-9,5 8,0 54

Краб (Uca pugilator) 24 <3 6-9 8,0 -

Саранча (Locusta migratoria) 24 3,5 7,5-10 9,0 56

Бабочка (Choristoneura fumiferaná) 25 10,3 - 9,5 -

Субстратная специфичность трипсина РС

Субстратную специфичность трипсина РС исследовали с помощью хромогенных пептидных субстратов разной длины и состава (табл 3 )

Трипсин РС, как и другие трипсины, гидролизует связи, образованные карбоксильньми группами лизина и аргинина, причем эффективность гидролиза возрастает с удлинением пептидной цепи субстрата В отношении субстратов эластазы, химотрипсина, сериновой протеиназы РС, содержащих аланин и лейцин в положении Р1, обнаруживалась лишь следовая активность, при инкубации в течении 1 суток Таким образом, трипсин РС по первичной специфичности не отличается от других трипсинов

Таблица 3. Субстратная специфичность трипсина РС

Субстрат Активность фермента, ед акт /мг

Н-£>-Уа1-Ьеи-Ьу5-рМА 40,6

2-£)-А1а-Ьеи-Агй-рМА 51,1

2-А1а-А1а-РЬе-Аг£-рКА 94,0

Вос-А1а-А1а-А1а-рЫА 0,03

г-Иу-Иу-Ьеи-р^А 0,07

г-А1а-01и-А1а-рКА 0,08

01р-РЬе-А1а-рКА 0,18

01р-А1а-А1а-1хи-рЫА 0,12

Защитные группы Вг — бензоин-, Ъ — бензилоксикарбонил-, Ир — пироглутамил-, Вое — трет-бутилоксикарбонил Хромофорная группа -pNA - л-нитроанилид

Гидролиз Bz-Arg-pNA трипсином РС при различных температурах

Для трипсина РС в отличие от трипсина быка наблюдаются значительно более низкие значения Кт при гидролизе Вг-А^-рКА в диапазоне температур 5-35 °С в то время как значения Утах/Ео различаются не так заметно (табл 4) Особенно интересно, что трипсин краба гидролизует ВАРКА в 19 раз эффективнее при 5 °С, чем трипсин быка Подобными свойствами обладают психрофильные трипсины рыб

Таблица 4. Кинетические параметры гидролиза Bz-Arg-pNA трипсином РС и

трипсином быка т т разных температурах

Источник трипсина Температура °С Кт (тМ) Утах/Е0 (Б') (Утах/Е0) /Кт(тМ-'з')

бык 5 0,21 0,3 1,42

21 0,35 0,75 2,14

35 0,62 1,75 2,82

Камчатский краб 5 0,029 0,80 27,50

21 0,041 2,3 56,1

35 0,053 3,1 58,5

Ингибирование трипсина PC

Ингибирование трипсина показало (табл 5), что трипсин PC полностью инактивируется ингибиторами сериновых протеиназ DFP (диизопропилфторфосфат) и PMSF (фенилметилсульфонилфторид) Специфический ингибитор трипсина TLCK (тозиллизинхлорметилкетон) полностью инактивирует фермент Из белковых ингибиторов наиболее эффективны ингибиторы трипсина из сои-Кунитца (SIT) и Баумана-Бирк (BBI), а также ингибитор из картофеля Таким образом, по функциональным характеристикам трипсин PC можно отнести к типичным трипсинам

Таблица 5. Ингибирование трипсина PC

Ингибитор [I] Б/1, моль/моль [1], шМ Остаточная активность, %

DFP 1 100 0,5 0

PMSF 1 100 0,5 2

TLCK 1 50 0,37 0

Бензамидин 1 50 0,4 55

Белковые ингибиторы

SIT 1 10 0,2 0

BBI 1 20 0,4 0

Из картофеля 1 50 0,8 0

Овомукоид 1 10 0,2 44

Из морской анемоны 1 20 0,2 64

III. Первичная структура трипсина РС

Определение первичной структуры трипсина

Определение первичной структуры трипсина РС было выполнено путем выделения суммарной РНК гепатопанкреаса, на основании которой была создана библиотека кДНК Используя вырожденные праймеры, соответствующие И-концевой последовательности трипсина РС, было проведено клонирование полноразмерной кДНК трипсина В результате была получена нуклеотидная последовательность препрофермента и на основании генетического кода была выведена его соответствующая аминокислотная последовательность Полученная последовательность зарегистрирована в базе данных ОепВапк под номером АР461036 Молекулярная масса зрелого трипсина, рассчитанная по аминокислотной последовательности, полностью совпала с молекулярной массой выделенного фермента, также был проведен масс-спектрометрический анализ пептидов полученных при гидролизе трипсина РС трипсином быка (рис 6), массы пептидов совпали с массами соответствующих пептидов, рассчитанными по первичной структуре

.-- 3882,9 Да--,

IVGGTEVTPGEIPYQLS FQDT S FGGEFHFCGASIYKDTW

AICAGHCVQGEDFDSPASLQIVAGDHTLYSAEGNEQKIA

VSKIIQHEDYNGFSISNDISLLQFASPLTFNSFVGPIAL

I r 1306,7 Да

PAQGOVASGDCTCTGWGTTTEGGYSSDALLKVTMPIVSD

-3488,5 Да--,

-> ,- 2200 Да--s

ADCRASYGESDIDDSMICAGVPQGGKDACQGDSGGPLAC

SDTGSPYLAGIVSWGYGCARPNYPGVYCEVAYYVDWVLA

NSS

Рис 6. MALDI масс-спектрометрический анализ пептидов, полученных при гидролизе трипсина PC трипсином быка Выделены пептиды, которые удалось идентифицировать Над последовательностью пептидов указаны экспериментально определенные массы

Сигнальные и активационные пептиды трипсина PC

Сигнальный пептид трипсина PC состоит из 15 аминокислотных остатков, что вполне сопоставимо с длинами сигнальных пептидов трипсинов других ракообразных (13-18 аминокислотных остатков) и позвоночных животных (табл 6), но заметно меньше сигнальных последовательностей трипсинов насекомых и S griseus По своей первичной структуре сигнальные последовательности препротрипсинов различных таксономических групп проявляют небольшую степень гомологии и, по-видимому, прохождение зимогена через плазматическую мембрану эндоплазматического ретикулума не требует какой-либо консервативной последовательности аминокислот

Длина активационных пептидов у представителей различных таксономических групп в большей степени варьирует, нежели длины сигнальных пептидов (табл 6) Длина активационного пептида трипсина PC больше, чем у соответствующих пептидов млекопитающих, рыб и асцидии, но меньше чем длина активационных пептидов насекомых Anopheles gambiae и Lygus hesperus В последовательности активационного пептида, трипсин PC не имеет отрицательно заряженных аминокислотных остатков, что отличает его от активационных пептидов трипсинов млекопитающих и рыб Активация зимогена у ракообразных, по-видимому, происходит иным способом, чем у млекопитающих Как известно, трипсин позвоночных превращается в зрелый белок под действием специфичной энтеропептидазы, имеющей сродство к Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-последовательности активируемого белка, а трипсин PC так же, как и трипсин креветки, имеет иной пропептид Arg-Gly-Leu-Asn-Lys-, не содержащий сайт расщепления энтеропептидазой Поэтому активация профермента у ракообразных, вероятно, происходит при участии других трипсиноподобных протеиназ, присутствующих в гепатопанкреасе, или путем самоактивации

Таблица 6. Сигнальные, акгивадионные пептиды и N-кондевые последовательности трипсинов

Источник трипсина Сигнальная последовательность Активационная последовательность

г последовательность

Бактерия Streptomyces griseus MKHFLRALKRCSVAVATVA1-AWGLQPVTASA APNP WGGTRAAQG

Асцидия Botrillns schlossert MKVFAILLLAFCGANA DK IV GG

Рак Paci/astacus leniusculus PAMKTLVFCLLLVGALA APSRRLRFPPfiNYK IVGGTDASLG

Креветка Penaeus vattnamet MKTLILCVLLAGA FAAPSRKPTTRRGNK IVGGTDATPG

Краб Paralithodes camtschaticus MKYLVFCLLLGAAFA APSRKPTFRRGLNK IVGGTEVTPG

Бабочка Hehcoverpa armigera MRILALVALCFAAVAA VPSNPQR rVGGSVTTID

Жук Rhyzopertha domimca MAVLTGLVLSPVTYVCA APHFVPHLPNGK IVGGHDVSIE

Manduxa sexta MRLFLALLALGFAAVAA VPANPQR IVGGSTTTIQ

Комар Anopheles gambiae MISNKIAILLAVLVVAVACAQA RVALKHRSVQALPRFLPRPQYDVGHR IVGGFEmVS

Листовертка Choristoneura flimiferana MRVTLALVALCLASVAA LPEKQQR IVGGSVTTIE

Муха Drosophila melanogaster MLKIVILLSAVVCALGGTVPEG LLPQLDGR rVGGSATTIS

Клоп Lygus hesperus MQLTTWLLLGAAVAVA QDSSEWGLGGGKVQTNCTCGYTNKNGGR rVGGRQTKVN

Треска Gadus ogac RKSLIFVLLLGAVFA EEDK IVGG

Лосось Salmo salar MISLVFVLLIGAAFA TEDDK IVGGYECKAY

Собака Canisfamiliaris MNPLLILAFLGAAVA TPTDDDDK IVGGYTCEEN

Бык Bos tavrtts MHPLLILAFVGAAVA FPSDDDDK IVGGYTCAEN

Аминокислотная последовательность зрелого трипсина РС

Консервативные аминокислотные остатки трипсина РС и других трипсинов В таблице 7 указано соотношение идентичных аминокислотных остатков в последовательностях трипсинов из различных источников Из таблицы видно, что трипсин РС по первичной структуре наиболее близок к трипсинам ракообразных (65-70% идентичных аминокислот), в меньшей степени к трипсинам позвоночных (37-39 %), еще в меньшей степени к трипсинам насекомых (36%) и наиболее отличается от трипсина микроорганизма (35%)

Таблица 7. Сравнение первичных структур трипсинов из различных источников Цифры показывают процентное соотношение идентичных аминокислот в аминокислотных последовательностях трипсинов выделенных из различных источников __

ТРС TPV TAF ТАА TDM TSA ТВТ TSG

ТРС 100 70 65 36 36 37 39 35

TPV 100 75 38 39 39 43 38

TAF 100 38 36 39 41 36

ТАА 100 39 39 39 31

TDM 100 33 36 31

TSA 100 65 31

ТВТ 100 30

TSG 100

Сокращения ТРС-краба Parahthodes camlschaticus, TPV- креветки Penaeus vannamei, TAF-речного рака Astacus fluviatihs, ТАА-комара Aedes aegypli, TDM-мушки Drosophila melanogaster, TSA-рыбы Squahts acanthias, ТВТ-быка Bos laurtis, TSG- микроорганизма Streptomyces griseus

При сравнении аминокислотной последовательности трипсина PC с аминокислотными последовательностями трипсинов холодноводных рыб и быка (рис 7), видно, что наиболее протяженные участки идентичных аминокислотных остатков включают в себя N-концевую последовательность, остатки активного центра (His 57, Asp 102, Ser 195), петли 1, 2 и петельную структуру Е Наличие таких участков объясняет практически одинаковую третичную структуру трипсинов выделенных из различных организмов

Трипсины холодноводных рыб эффективно гидролизуют BAPNA при 5°С, что сближает их с трипсином РС и отличает от трипсина быка Тем не менее, трипсин РС и трипсины холодноводных рыб не имеют общих консервативных участков помимо консервативных последовательностей, общих с трипсином быка Таким образом, структурные элементы, обуславливающие психрофильные свойства трипсина краба, вероятно, отличаются от соответствующих элементов структуры трипсинов рыб

ТРС TSS ТРМ TGO

твт

30

40

50

60 I

IVGGTBBTPGEl|Y0llsffilDTSFGH5HHFCGBsqYKDTwEfl^pHCg0^F.DFD

XVGGY |CKAYSQgHQVSLN-----SGYHFCGGSLVNENWVVSAAHCYQS----

IVGGK |CSPYSQ0HQVSLN-----SGYHFCGGSLVNENWWSAAHCYKS----

IVGGY0CTKHSQAHQV£LN-----SGYHFCGG^LVSKDf^VVSHAHgYKS----

IVGGYTCGANTVPYQV^LN-----SGYjlFCGGSLINSQÍÍWS^AÍfdYKS----

I_I 'l_

TPC TSS TPM TGO TBT

80

90

100 I

110 I

SPASL0BSftGB^TllYBAEGME0KlBIVSKII0H|aDYN|gFSfflSNDlSl,IICgSas| ---RVEVRLGEI niqvtpgseqfiisssrvirhpnyssynIdndimIjIklskI

---RVEVRMGEj HIRVTf¡^KEdFJ3SS£iRVIRHPNEfiSSYNlDN0];M^IKLSK|

---VLRVRL^EHHIRVNEqT^2YaSS3SVIRHPN^SSYN@Nt(niMÜlKLTK|

---GIQVRLp'EDNINWBgNpl^FgSAgKS¿VHPSfflSNTLNH.l^jMpiKLKSA

TPC TSS TPM TGO TBT

120 130

I I

PNSFVGHlBLPAQ03vHs|§DCj |lntyvq¡¡v|lptscaphgtmc[

|l NQ Yt^QA VgEBS S CA Pff GTMCj |LbjQYj7,HAVHLI5TECAADATMp|

140

I

150

160

|C¡¡GWGTTT|^-GYSS|AIiL®TMPI0gDA VSGWGNTMSS-TADKNKIiQCLNIIÍ^LSYS VSGWGSTQSS-SADGNKJÍQCLNip^L^DR

Ivspwgntmss-VADGHK^QCLSL^ÍL'SHA

ASLfisRVASISLgTSCASAGTQSLISGWGNTKSSGTSYPDVjjKCLKA!Pl'L§DS

TPC TSS TPM TGO TBT

170

180

190

200

210

3CRAÍYgEgDl[jgSMÍjCAGH3QGGKD0CQGDSGGP¡EGS|3TGSPYLg]GIS/SWG CNN |YlP-GMTTNA{1E'PAGYLEfÍGKf)StqQGDSGGPVvpG----ELQGVySWG

TPC TSS TPM TGO TBT

220

230

240

ÍGCARlNYPGVYCgvgYYvHwVLANSS — GCñE|GNPGVYAKVClFNgWLTSTMATY GCAERDHPGVYAKVCLFNgWLETSMANY

|gc^erdhpgvyakvcvlsgwvrdtmany

SpOAQKNKP.GVXTyVCNYVSjilKQTIASN

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей трипсина PC с трипсинами холодноводных рыб и трипсином быка Приведены первичные структуры по базе данных SWISS-PROT (идентификационный номер указан после латинского названия животного) для трипсинов ТРС-краба Paralithodes camtschaticus (Q8WR10), трипсинов холодноводных рыб -TSS-Salmo salar (Р35032), ТРМ-Paranototherua magellamca (Q92099), TGO-Gadus ogac (PI6049), трипсина быка -TBT-Bos Taurus (Q29463) Цифры над последовательностью — нумерация по химотрипсиногену быка, звездочками отмечены каталитически важные остатки Обозначения УО—полностью консервативные остатки,

ЦЩ — консервативные остатки в последовательностях трипсина краба и холодноводных рыб,

Щ — остатки трипсина краба, отличные от консервативных остатков трипсина быка и трипсинов рыб

Структурные особенности трипсина РС

Сравнение первичной структуры трипсина РС с первичными структурами трипсинов беспозвоночных и трипсином быка показало различия в областях молекулы существенных для функционирования фермента (табл 8)

Таблица 8. Отличие трипсина РС от трипсинов ракообразных, трипсинов насекомых и трипсина быка по некоторым аминокислотным остаткам, существенным для связывания субстрата и поддержания третичной структуры фермента_

Остатки Замечание и ш | Камчатский краб Г Ракообразные Г Насекомые

Gly44 Образует участок + (Ala) (Ala) +

Рго92 Помогает поддержанию определенной конформации петли С + (Ala) (Glu) +

Leu99 Образует Б2 участок + (Не) lie/Leu -

Leul08 Вместе с Ьуз/А^107 образует участок автолиза + (Phe) + +

Tyrl 51 Образует Э2' участок + (Ser) (Pro) (Ser/He)

Pro152 Способствует поддержанию определенной конформации петли V + делеция + +/-

Ser 190 Входит в состав участка фермента, определяет вторичную специфичность трипсина + (Ala) + +/-

Замена остатка Serl90 на Ala в первичной структуре трипсина РС увеличивает размер субстратсвязывающего участка и может влиять на взаимодействие с субстратом или ингибитором Наличие остатка Alai 90 сближает трипсин РС с тромбином, фактором Ха, тканевым активатором плазминогена (tPA) также содержащими в этом положении остаток Ala Существенные отличия наблюдаются в петельных структурах трипсина РС и трипсинов позвоночных (рис 7) Трипсин краба имеет значительно более длинные петельные структуры А и Б, чем соответствующие петли трипсинов рыб и трипсина быка Наличие длинных петельных структур, как, правило, увеличивает подвижность молекулы в целом и может способствовать лучшему связыванию субстрата при низких температурах Петельные структуры трипсина РС отличаются от петельных структур трипсинов рыб наличием или отсутствием отрицательно заряженных аминокислотных остатков Так, например, петля Б и петля 3 трипсина РС имеют в своем составе по три отрицательно

15

заряженных аминокислотных остатка и ни одного положительно заряженного Трипсины рыб и трипсин быка отличаются от трипсина РС по содержанию отрицательно заряженных аминокислот в петле Б Например, трипсин лосося S salar содержит в петле Б один отрицательно заряженный остаток и один положительно, а трипсин быка вообще не имеет отрицательно заряженных остатков Другие петельные структуры трипсина РС тоже имеют некоторые отличия от соответствующих петельных структур трипсинов рыб и быка Следует отметить, что петельные структуры трипсинов участвуют во взаимодействии с пептидными и белковыми субстратами, белковыми ингибиторами и во многом определяют динамическое поведение молекулы в целом

IV Эволюционное положение трипсина РС

Эволюционная связь трипсина РС с ферментами клана SA, выделенными из животных различных таксономических групп, приведена в виде не укорененного филогенетического дерева, размещенного на рисунке В Филогенетический анализ показывает, что трипсины ракообразных формируют обособленный кластер, расположенный чуть ближе к трипсинам позвоночных, чем к трипсинам насекомых

Психрофильный трипсин лосося S salar имея схожие кинетические параметры гидролиза BAPNA при 5°С с трипсином РС, не входит в кластер трипсинов ракообразных, а находится в одной группе с мезофильным трипсином быка Таким образом, появление психрофильных форм трипсинов произошло задолго до появления рыб

Интересно отметить тот факт, что трипсины ракообразных и коллагеназы ракообразных образуют две обособленные друг от друга группы, несмотря на тот факт, что последние обладают двойственной субстратной специфичностью Например, элементы Джонс-Тейлор-Тронтон матрицы между различными трипсинами будут следующие 1,32 отделяет трипсин РС от трипсина мухи D melanogaster, 1,16 различие между трипсином РС и трипсином быка, в то время как, разница между трипсином РС и трипсином креветки Р vannamei, составляет 0,41 Удаленность трипсина РС от коллагеназы РС составит 1,45, а от трипсина из микроорганизма Sgriseus 1,57

Таким образом, можно привести определенный ряд филогенетического родства между трипсином РС и другими ферментами клана S А

Трипсин РС > трипсин креветки Р vannamei > трипсин быка > трипсин D melanogaster > коллагеназа РС > трипсин S griseus Можно отметить тот факт, что трипсин РС более близок к трипсину быка, чем к трипсинам из насекомых и микроорганизмов Кроме того, трипсин РС в эволюционном плане ближе к трипсину быка и трипсинам насекомых, чем к коллагеназе РС, в то же время трипсин РС более всех удален от трипсина S griseus Данный факт может говорить о дивергенции предшественника сериновых коллагеназ и трипсинов по крайней мере до происхождения членистоногих

TSG

Рис 8 Сравнение аминокислотных последовательностей сериновых протеиназ клана SA позвоночных и беспозвоночных животных с аминокислотной последовательностью трипсина PC Приведены первичные структуры по базе данных Swiss-Prot (идентификационный номер указан после латинского названия организма)

Сокращения ChCF, химотрипсин собаки Canus famtharis (Р04813), CliRN, химотрипсин крысы Rattus norvégiens (Р07338), ChBT, химотрипсин быка Bos taurus (P00766), ChPO химотрипсин рыбы Parahchthys ohvaceus (Q9W7Q3), TBT, трипсин быка В taurus (Q29463), TXL, трипсин лягушки Xenopus laevis (P19799), TSS, трипсин рыбы Sa/то salar (P35032), TPV, трипсин креветки Реп vannamei (Q27761), TPC, трипсин краба Р camtschaticus (Q8WR10), TAF, трипсин рака Astacus fluviatths (Р00765), PSS, активатор плазминогена из сколопендры Scolopendra supspmipes (096899), CUP, коллагеназа краба Ucapugilator (Р00771), ChPV, химотрипсин креветки Реп vannamei (Р36178), СРС коллагеназа краба Р camtschaticus (Q8WR.ll), ChPC, химотрипсин насекомого Phaedon cochleariae (097398), CHL, коллагеназа насекомого Hypoderma lineatunt (Р08897), ChHR, химотрипсин моллюска Hahotis rufescens (P35003), TCF, трипсин насекомого Choristoneura fumiferana (P35042), TAA, трипсин насекомого Aedes aegypti (P29786), TDM, трипсин насекомого Drosophda melanogaster (P04814), TFO, трипсин гриба Fusarium oxysporum (P35049), TMA, трипсин гриба Metarhmum amsophae (Q9Y7A9), TSG, трипсин микроорганизма S griseus (P00775), TBS, трипсин из асцидии Botryllus schlosseri (001309), TLH, трипсин насекомого Lygns hesperus (Q95PÎ5)

V. Модель третичной структуры трипсина PC

На основе первичной структуры нами была смоделирована третичная структура трипсина PC Для построения модели трипсина PC нами был использован сервис автоматического моделирования SWISS-MODEL Пространственная структура трипсина PC состоит из двух доменов, расположенных в пространстве не симметрично относительно друг друга, оси симметрии двух баррелей, составляющих основу каждого домена, располагаются почти перпендикулярно друг другу Каждый домен имеет в своем составе шесть антипараллельных р-складчатых слоев, которые соединяются между собой петельными стуктурами

Из наложений видно, что ход основной цепи молекулы трипсина PC совпадает с таковой трипсина быка (рис 9) Различия наблюдаются только в районах петельных структур

На рисунке 10 представлено распределение заряженных аминокислотных остатков на поверхности белковых глобул анионного трипсина быка и трипсина PC На белковой поверхности положительно и отрицательно заряженные аминокислотные остатки образуют определенные участки (кластеры), особая концентрация отрицательно заряженных аминокислотных остатков в трипсине PC сосредоточена в области субстратсвязывающего участка Возможно, этот факт облегчает связывание положительно заряженного субстрата и способствует более эффективному катализу трипсином PC при низких температурах, в отличие от трипсина быка В целом поверхность трипсина PC является, более отрицательно заряженной, чем поверхность анионного трипсина быка Такое свойство поверхностей белковых глобул этих ферментов хорошо согласуется с их аминокислотным составом В трипсине PC суммарное содержание отрицательно заряженных аминокислотных остатков (Asp+Glu=28), более чем в два раза превосходит сумму положительно заряженных аминокислотных остатков (Arg+Lys+His=l 1), а в анионном трипсине быка наблюдается обратное соотношение (Arg+Lys+His=I9) и (Asp+Glu=10)

Рис, Наложение третичных структур смоделированного тригтсиня PC с Привел лом быка Dos unûvs {] ÀQ7), Трипсин PC выделен красным цветом, трипсин пьны -— желтым. В скобках укйоаи номер кристаллической структуры в банке даннь№ белковых структур (PDB),

I

Рис.10. Распределение заряженных аминокислотных остатков по поверхности (кпкевой глобулы. Слепа на право-, анионный трипсин быка Box taunts, трипсин краба FarathhodeS camtschaticus. Синим цветом показамы положительно заряженные аминокислотные остатки, красным — отрицательно заряженное.

выводы

1 Разработан трехстадийный метод очистки трипсина РС, включающий комбинацию ионообменной и аффинной хроматографий

2 Показано, что трипсин РС отличается от трипсинов млекопитающих аномально низкой изоэлектрической точкой, более узким интервалом рН стабильности, более эффективным гидролизом Bz-Arg-pNA в диапазоне 5-35°С На основании полученных результатов трипсин камчатского краба можно отнести к ферментам психрофильного типа

3 Создана библиотека кДНК, проведено клонирование полноразмерной кДНК трипсина РС, по нуклеотидной последовательности которой была определена последовательность аминокислот препротрипсина РС

4 Филогенетический анализ, показал, что трипсины ракообразных группируются в обособленный кластер, который располагается чуть ближе к трипсинам позвоночных, чем к трипсинам насекомых и значительно удален от сериновых коллагеназ членистоногих Дивергенция между трипсинами и сериновыми коллагеназами произошла, вероятно, до происхождения членистоногих

5 На поверхности белковой глобулы трипсина РС в области субстратсвязывающего участка наблюдается концентрация отрицательно заряженных аминокислотных остатков, которые, вероятно, улучшают связывание субстрата и способствуют эффективному катализу при температуре близкой к 0°С

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Руденская ГН, Исаев В А, Каледина ТС, Степанов В М, Мальцев KB, Швец С В, Лукьянова НА, Кислицын ЮА, Мирошников А И Выделение трипсина PC камчатского краба Paralithodes camtschaticus и его свойства // Биоорганическая химия - 1998 - Т 24, N 2 - С 112-118

2 Кислицын ЮА, Ребриков Д В, Дунаевский Я Е, Руденская ГН Выделение и первичная структура трипсина камчатского краба Paralithodes camtschaticus П Биоорганическая химия - 2003 - Т 29, N 3 - С 269-276

3 Rudenskaya G N, Kislitsin Yu A, Rebrikov D V Collagenolytic serine protease PC and trypsin PC from king crab Paralithodes camtschaticus cDNA cloning and primary structure of the enzymes // BMC Structural Biology, - 2004 - V 4, issue 2 - P 1-9 www biomedcentral com

4 Кислицын ЮА, Ребриков ДВ, Руденская ГН Выделение и структура трипсина PC камчатского краба Paralithodes camtschaticus II V Международный симпозиум "Химия протеолитических ферментов" (23-25 апреля 2002 г, Москва), сборник тезисов -Москва ИБХ РАН, 2002 - С 49

5 Ребриков Д В, Кислицын ЮА, Руденская ГН Первичные структуры коллагенолитической протеиназы и трипсина камчатского краба Paralithodes camtschaticus II III Съезд биохимического общества (26 июня - 1 июля 2002 г, Санкт-Петербург), сборник тезисов -С-Петербург Мономакс, 2002 - С 515-516

6 Isaev V A, Shmoilov А М, Kislitsin Yu A, Rudenskaya G N The medical properties of the liniment "Moncrol" // International conference on natural products Chemistry, technology and medicinal perspectives ( October 8-10 2003, Almaty, Kasakhstan), - P 99

7 Паписова А И, Кислицын ЮА, Семенова С А, Руденская ГН Кинетические параметры гидролиза пептидных и белковых субстратов протеиназами камчатского краба при различных температурах // VI Международный симпозиум "Химия протеолитических ферментов" (23-25 апреля 2007 г, Москва), сборник тезисов -Москва ИБХ РАН, 2007 - С 102

Подписано к печати 18 10 07 Тираж 100 экз Заказ 187 Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ Москва, Садовая-Черногрязская, 35

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ТРИПСИНЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ.

1. Классификация трипсинов.

2. Современные подходы к выделению трипсиноподобных протеиназ

2.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография и скоростная жидкостная хроматография белков.

2.2. Аффинная хроматография.

2.3. Нестандартные подходы к очистке трипсинов.

3. Молекулярные свойства трипсинов беспозвоночных.

3.1. Физико-химические свойства.

3. 1. 1. Молекулярные массы, изоэлектрические точки.

3.1.2. Аминокислотный состав.

3.2. Энзиматические свойства.

3.2.1. рН-стабильность и рН оптимумы активности.

3.2.2. Субстратная специфичность.

3.2.2.1. Синтетические субстраты.

3.2.2.2. Полипептидные и белковые субстраты.

3.3. Ингибиторы трипсинов.

3.3.1. Синтетические ингибиторы.

3.3.2. Природные ингибиторы.

4. Структурные детерминанты, определяющие каталитические свойства и специфичность трипсинов.

4.1. Активный центр.

4.1.1. Каталитическая триада.

4.1.2. Оксианионная впадина.

4.2. Субстратсвязывающие участки.

4.2.1. Б1 - связывающий участок.

4.2.2. Полипептидсвязывающий участок.

5. Современные представления о механизме катализа сериновыми протеиназами.

6. Первичная структура трипсинов беспозвоночных.

6.1. Сигнальные и активационные пептиды.

6.2. Аминокислотные последовательности зрелых трипсинов.

7. Пространственная структура и эволюция трипсинов.

8. Биологические функции трипсинов беспозвоночных.

8.1. Процессы пищеварения.

8.2. Процессы свертывания гемолимфы.

8.3. Синтез пептидных антибиотиков.

8.4. Процесс полимеризации меланина.

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Выделение трипсина РС.

2. Критерии чистоты и молекулярные свойства трипсина РС.

3. Стабильность трипсина РС.

4. А^-концевая последовательность трипсина РС.

5. Аминокислотный состав.

6. Субстратная специфичность трипсина РС.

6.1. Гидролиз хромогенных пептидных субстратов.

6.2. Гидролиз Вг-А^-рИА трипсином РС при различных температурах.

7. Ингибирование трипсина РС.

8. Первичная структура трипсина РС.

8.1. Сигнальные и активационные пептиды трипсина РС.

8.2. Аминокислотная последовательность зрелого трипсина РС.

8.2.1. Консервативные аминокислотные остатки трипсина РС и других трипсинов.

8.2.2.1. Дисульфидные связи.

8.2.2.2. Кальций-связывающий участок.

8.2.2.3. Участки автолиза.

8.2.2.4. Другие каталитически или структурно важные остатки.

8.2.2.5. Петельные структуры трипсинов.

8.2.3. Сравнение первичной структуры трипсина PC с первичными структурами трипсинов психрофильных рыб и первичной структурой трипсина быка.

9. Эволюционное положение трипсина PC.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы.

1.1. Реактивы.

1.2. Субстраты.

1.3. Белковые ингибиторы.

1.4. Белки.

2. Методы.

2.1. Очистка трипсина PC (первая схема).

2.1.1. Ионообменная хроматография на аминосилохроме.

2.1.2 Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе.

2.1.3 Аффинная хроматография на аргинин-агарозе.

2.2. Очистка трипсина PC (вторая схема).

2.1.1 Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе.

2.1.2. Аффинная хроматография на ПТГ-агарозе.

2.1.3. Ионообменная хроматография на колонке Mono Q в режиме FPLC.

2.3. Концентрирование и обессоливание белковых растворов.

2.4. Определение активности фермента по и-нитроанилидному субстрату.

2.5. Определение концентрации белка.

2.6. Определение молекулярной массы фермента.

2.6.1. Гель-электрофорез.

2.6.2. Масс-спектрометрический анализ.

2.7. Определение TV-концевой последовательности белка.

2.8. Определение изоэлектрической точки трипсина.

2.9. Гидролиз синтетических субстратов.

2.10. Ингибиторный анализ.

2.11. Выделение РНК.

2.12. Получение библиотеки кДНК.

2.13. Клонирование кДНК трипсина РС.

2.14. Биоинформатика.

ВЫВОДЫ.

Трипсины являются типичными представителями сериновых протеиназ. В настоящее время трипсины обнаружены в организмах, принадлежащих к различным таксономическим группам. Функции, выполняемые этими ферментами, довольно разнообразны. Основной функцией трипсина в организме человека, млекопитающих и беспозвоночных животных является участие данного фермента в пищеварении и активации других протеолитических ферментов, участвующих в этом процессе. В настоящее время показано, что функции данного фермента в живых организмах значительно шире. Так, например, у человека и млекопитающих показано участие трипсина в процессах клеточной пролиферации, расширении сосудов, развитии воспалительного процесса, а также в различных патологических состояниях: от рака, панкреатита, астмы и артрита до дерматитов и экземы. Физиологические и биохимические процессы, в которых принимают участие трипсины у беспозвоночных животных, изучены слабее. На данный момент показано участие трипсинов в процессах клеточной дифференцировки и иммунного ответа у насекомых и ракообразных.

В настоящее время большой интерес вызывают трипсины, выделенные из психрофильных организмов. Наиболее изучены психрофильные трипсины рыб. Работы по изучению психрофильных трипсинов беспозвоночных малочисленны и содержат сведения либо о физико-химических и энзимологических свойствах, либо о первичной структуре. Для полного понимания эффективности действия психрофильных трипсинов необходимо комплексное изучение структуры и свойств трипсинов беспозвоночных, обитающих при низких температурах. Камчатский краб в этом смысле является подходящим объектом исследования. Данные таких исследований позволяют более полно понять разнообразие биологических функций трипсинов, а также могут быть использованы для создания биокатализаторов с заданными свойствами.

В настоящее время имеются сведения о физико-химических, энзиматических свойствах трипсинов, выделенных из млекопитающих [1-5], птиц [6-7], рыб [8-10], насекомых [11-14], ракообразных [15-19] и иглокожих [20-21]. Несмотря на кажущееся обилие информации, следует отметить, что во многих работах описываются свойства смесей, а не индивидуальных ферментов.

В последнее время отмечается повышенный интерес к структуре трипсинов беспозвоночных, имеются работы, посвященные определению первичной структуры трипсинов насекомых [22-25] и ракообразных [26-27]. К сожалению, данные работы не содержат сведений о физико-химических и энзиматических свойствах описываемых ферментов, так как авторы не выделяли исследуемые белки непосредственно, а лишь устанавливали структуру посредством сиквенса к ДНК.

В настоящее время в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений МГУ, ведется изучение трипсина и других протеолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба, совместно с фирмой "Тринита" был создан препарат "Морикраза". Этот препарат включает в себя трипсин, коллагеназу, металлопротеиназу, эластазу и карбоксипептидазу, полученные из гепатопанкреаса камчатского краба. На основе "Морикразы" был создан ряд мазей, успешно проходящих клинические испытания при лечении рубцов, ожогов, пролежней. Трипсин составляет около 1/3 части "Морикразы" и вносит существенный вклад в лечебное действие препарата. Поэтому изучение свойств и структуры трипсина камчатского краба является актуальным и практически важным, а применение данного фермента в медицинских целях более предпочтительно, чем трипсина быка, так как позволяет избежать внесения в препарат вирусов, прионов и других инфекционных агентов, свойственных млекопитающим. Следует отметить, что камчатский краб Рага1Шгос1ез сат18ска1кт как объект ценных протеолитических ферментов изучался в нашей стране ранее [28-29]. Однако литературные данные относительно протеиназ гепатопанкреаса неполны и часто противоречивы.

Настоящая работа посвящена исследованию трипсина камчатского краба. Цель настоящего исследования получение гомогенного препарата фермента, изучение его физико-химических и энзиматических свойств, сравнение первичной структуры трипсина РС с трипсинами, выделенными из других источников, определение эволюционного положения данного фермента.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ТРИПСИНЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Изучение трипсинов из организмов принадлежащих к различным таксономическим группам имеет большое значение для детального понимания механизмов молекулярной эволюции, специфичности, катализа, для создания биокатализаторов с заданными свойствами. В настоящее время показано, что трипсины выделенные из рыб и беспозвоночных имеют отличия в физико-химических и энзиматических свойствах.

Так, например, трипсины холодноводных рыб более эффективно гидролизуют синтетические и природные субстраты, отличаются некоторыми физико-химическими параметрами от трипсинов млекопитающих. Сериновые протеиназы ракообразных в ввиду своих особых физико-химических и энзиматических свойств, в настоящее время, выделяют в особое подсемейство - брахиурины.

В данном обзоре литературы сделана попытка, собрать воедино и проанализировать современные данные о выделении, физико-химических, энзиматических свойствах, структурах трипсинов беспозвоночных животных, их физиологических функциях.

Обзор состоит из 8 глав и посвящен современной классификации трипсинов (глава 1), физико-химическим, знзиматическим, структурным свойствам трипсинов беспозвоночных и их биологическим функциям (главы 3, 4, 6, 7 и 8). Освещены современные методы и подходы, применяемые в очистке трипсинов из различных природных источников (глава 2). Кроме того, для полного представления о месте и роли трипсинов беспозвоночных в системе протеолитических ферментов в обзор литературы включены современные сведения о механизме катализа, осуществляемого сериновыми протеиназами (глава 5).

выводы

1. Разработан трехстадийный метод очистки трипсина РС, включающий комбинацию ионообменной и аффинной хроматографий.

2. Показано, что трипсин РС отличается от трипсинов млекопитающих аномально низкой изоэлектрической точкой, более узким интервалом рН стабильности, более эффективным гидролизом Вг-А^-рКА в диапазоне 5-35°С. На основании полученных результатов трипсин камчатского краба можно отнести к ферментам психрофильного типа.

3. Создана библиотека кДНК, проведено клонирование полноразмерной кДНК трипсина РС, по нуклеотидной последовательности которой была определена последовательность аминокислот препротрипсина РС.

4. Филогенетический анализ, показал, что трипсины ракообразных группируются в обособленный кластер, который располагается чуть ближе к трипсинам позвоночных, чем к трипсинам насекомых и значительно удален от сериновых коллагеназ членистоногих. Дивергенция между трипсинами и сериновыми коллагеназами произошла, вероятно, до происхождения членистоногих. г

5. На поверхности белковой глобулы трипсина РС в области субстратсвязывающего участка наблюдается концентрация отрицательно заряженных , аминокислотных остатков, которые, вероятно, улучшают связывание субстрата и способствуют эффективному катализу при температуре близкой к 0°С.

1. Bricteux-Gregoire S, Schyns R, Florkin M, Purification, properties and N-terminal sequence of goat trypsinogen. Biochim. Biophys. Acta, 1971, v. 229, pp. 123-135.

2. Charles M, Rovery M, Guidoni A, Desnuelle P, On porcine trypsinogen and trypsin. Biochim. Biophys. Acta, 1963 v. 69, pp. 115-129.

3. Travis J, Studies on the active site of sheep trypsin. Biochem. Biophys. Res. Commun.,1968, v. 30, pp 730-734.

4. Louvard M.N, Puigserver A, On bovine and porcine anionic trypsinogens, Biochim. Biophys. Acta, 1974, v. 371, pp. 177-185.

5. Guy 0, Lombardo D, Bartelt D. C, Amie J, Figarella C, Two human trypsinogens. Purification, molecular properties, and N-terminal sequences. Biochemistry, 1978, v 17, pp 1669-1675.

6. Guyonnet V, Tluscik F, Long P. L, Polanowski A, Travis J, Purification and partial characterization of the pancreatic proteolytic enzymes trypsin, chymotrypsin, and elastase from the chicken. J. Chromatography A, 1999, v. 852, pp 217-225.

7. Szenthe B, Frost C, Szilagyi L, Patthy A, Naude R, Graf L, Cloning and expression of ostrich trypsinogen: an avian trypsin with a highly sensitive autolysis site. Biochem. Biophys. Acta, 2005, v. 1748, pp. 35-42.

8. Cohen T, Gertler A, Birk Y, Pancreatic proteolytic enzymes from carp (iCyprinus carpio), Kinetic properties and inhibition studies of trypsin, chymotrypsin and elastase. Сотр. Biochem. Physiol., 1981, v. 69 B, pp. 647653.

9. Martinez A, Olsen R. L, Serra J. L, Purification and characterization of two trypsin-like enzymes from the digestive tract of anchovy Engraulis encrasicholus. Сотр. Biochem. Physiol., 1988, v. 91 B, pp. 677-684.

10. Simpson B.K, Haard N.F, Trypsin from Greenland cod, gadus ogac. Isolation and comparative properties. Comp. Biochem. Physiol., 1984, v. 79 B, №4, pp 613-622.

11. Levinsky H, Birk Y, Applebaum S. W, Isolation and characterization of a new trypsin-like enzyme from Tenebrio molitor L. Larvae, Int. J. Peptide Protein Res, 1977,v. 10, pp 252-258.

12. Lopes A. R, Terra W. R, Purification, properties and substrate specificity of a digestive trypsin from Periplaneta Americana. Insect Biochem. Biol., 2003, v. 33, pp. 407-415.

13. Sakal E, Applebaum S. W, Birk Y, Purification and characterization of trypsins from the digestive tract of Locusta migratoria. Int. J. Pept. Prot. Res, 1989, v. 34, pp. 498-505

14. Elert E, Agrawal M. K, Gebauer C, Jaensch H, Bauer U, Zitt A, Protease activity in gut of Daphnia magna: evidence for trypsin and chymotrypsin enzymes, Comp. Biochem. Physiol., 2004, v.137 B, pp 287-296.

15. Titani K, Sasagawa T, Woodbury RG, Ericsson LH, Dorsam H, Kraemer M, Neurath H, Zwilling R: Amino acid sequence of crayfish (Astacus fluviatilis) trypsin If. Biochemistry, 1983, v.22, pp. 1459-1465.

16. Johnston D., Hermans M., Yellowlees D., Isolation and characterization of a trypsin from the slipper lobster, Thenus orientalis, Arch. Biochem. Biophysics, 1995, v. 324, pp. 35-40.

17. Dendinger J. E, O'Connor K. L, Purification and characterization of a trytpsin-like enzyme from the midgut gland of the atlantic blue crab Callinectes sapidus. Comp. Biochem. Physiol., 1990, v. 95 B, pp. 525-530.

18. Hernandez-Cortes P, Cerenius L, Garcia-Carreno F, Soderhall K: Trypsin from Pacifastacus leniusculus hepatopancreas: purification and cDNA cloning of the synthesized zymogen. Biol. Chem., 1999, v.380 pp. 499-501

19. Kozlovskaya E. P, Elyakova L.A, Purification and propertier of trypsin-like enzymes from the starfish Lysastrosoma anthsticta. Biochem. Biophys. Acta, 1974, v. 371, pp 63-70.

20. Kishimura H, Hayashi K, Isolation and characteristics of trypsin from pyloric ceca of the starfish Asterina pectinifera. Comp. Bochem. Physiol., 2002, v. 132 B, pp. 485-490.

21. Peterson A. M, Barillas-Mury C. V, Wells M. A, Sequence of three cDNAs encoding an alkaline midgut trypsin from Manduca sext, Insect. Biochem. Molec. Biol, 1994, v. 24, pp. 463-471.

22. Wang S, Young F, Hickey D. A, Genomic organization and expression of a trypsin gene from the spruce bud worm, Choristoneura fumiferana. Insect. Biochem. Molec. Biol. 1995, V 25, pp. 899-908.

23. Davis C. A, Riddell D. C, Higgins M. J, Holden J. J. A, White B. N, A gene family in Drosophila melanogaster coding for trypsin-like enzymes, Nucleic acids research, 1985, v. 13, pp.6605-6619.

24. Klein B, Sellos D, Wormhoudt A V, Genomic organization and polymorphism of a crustacean trypsin multi-gene family, Gene, 1998, v. 216, pp. 123-129.

25. Klimova О. A, Borukhov S. I, Solovyeva N.I, Balaevskaya T. 0, Strongin A. Y, The isolation and properties of collagenolytic proteases from crab hepatopancreas. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, v. 166, pp. 1411-1420.

26. Климова О.А, Чеботарев В. Ю, Коллагенолитический комплекс протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба: разделение на индивидуальные компоненты, Бюллетень Эксп. Биол. Мед., 1999, т. 128, сс. 308-313.

27. Rawlings, N.D., Morton, F.R. & Barrett, A.J, MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res, 2005, v. 34, pp 270-272.

28. Krem M. M, Di Cera E, Molecular markers of serine protease evolution, EMBO J, 2001, v 20, pp 3036-3045.

29. Lu P, Liu H, Tsai I, The midgut trypsin of shrimp {Panaeus monodon ). High efficiency toward native protein substrates including collagens. J.Biol. Chem., 1990, v. 371, pp. 851-859.

30. Graf R, Boehlen P, Briegel H, Structural diversity of trypsin from different mosquito species feeding on vertebrate blood, Experientia, 1991, v. 47, pp. 603609.

31. Rypniewski W. R, Hastrup S, Betzel Ch, Dauter M, Dauter Z, Papendorf G, Branner S, Wilson K. S, The sequence and X-ray structure of the trypsin from Fusarium oxysporum, Protein Eng., 1993, v. 6, pp. 341-348.

32. Burton N.P, Lowe C. R, Design of novel affinity absorbents for the purification of trypsin-like proteases. J. Mol. Recognit., 1992, v. 5, pp. 55-68.

33. Burton N. P, Lowe C. R, Design of novel cationic ligands for the purification of trypsin-like proteases by affinity chromatography, J Mol. Recogn, 1993,v. 6, pp. 31-40.

34. Ibrahim-Grant O, Bertrand O, Separation of proteases: old and new approaches. J. Chromatography, Pt. B, 1996, v. 684, pp. 239-263.

35. Lemos F. J. A, Terra W. R, Soluble and membrane-bound forms trypsin-like in Musca domestica larval midgut. Insect Biochem. Mol. Biol., 1992, v. 22, pp. 613619.

36. Morris S. R, Sakanari J. A, Characterization of the serine protease and serine protease inhibitor from the tissue-penetrating nematode Anisakis simplex, J. Biol. Chemistry, 1994, v. 269, № 44, pp. 27650-27656.

37. Flanagan S.D, Barondes S.H, Affinity partitioning. A method for purification of proteins using specific polymer-ligands in aqueous polymer two-phase systems. J. Biol. Chem., 1975, v.250, pp. 1484-1489.

38. Senstad C, Mattiasson B, Precipitation of soluble affinity complexes by a second affinity interaction: a model study. Biotechnol. Appl. Biochem., 1989, v. 11, pp. 41-48.

39. Ling T.G.I, Mattiasson B, Membrane filtration affinity purification (MFAP) of dehydrogenases using cibacron blue. Biotechnol. Bioeng., 1989, v. 34, pp. 13211325.

40. Linne E, Garg N, KAUL R; MATTIASSON.B, Evaluation of alginate as a ligand carrier in affinity precipitation. Biotechnol. Appl. Biochem., 1992, vol. 16, n 1, pp. 48-56.

41. Galaev I. Yu, Mattiasson B, Galaev, I. Yu., Mattiasson, B. Smart polymers and what they could do in biotechnology and medicine. Trends Biotechnol., 1999, v. 17, pp. 335-340.

42. Wunderwald P, Schrenk W.J, J, Port H, Krezse G. B, Removal of endoproteinases from biological fluids by "sandwich affinity chromatography" with alpha 2-macroglobulin bound to zinc chelate-Sepharose. Appl. Biochem., 1983, v.1-2, pp. 31-42.

43. Walker J. E, Keil B, Perification and characterization of different active forms of pork trypsin. Eur. J. Biochem, 1973, v. 32, pp. 486-491.

44. Brun G. L, Wojtowicz M. B, A comparative study of the digestive enzymes in the hepatopancreas of Jonah crab ( Cancer borealis ) and rock crab ( Cancer irroratus ). Comp. Biochem. Physiol., 1976, v. 53B, pp. 387-391.

45. Grant G. A, Sacchettini J. C, Welgus H. C, A collagenolytic serine protease with trypsin-like specificity from the fiddler crab Uca pugilator .Biochemistry, 1983, v 22, p 354-358.

46. Kimoto K, Kusama S, Murakami K, Purification and characterization of serine proteinases from Euphausia superba. 1983, Agric. Biol. Chem., v. 47, pp. 529534.

47. Graf R, Briegel H, Isolation of trypsin isozymes from the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect. Biochem., 1985, v. 15, pp. 611-618.

48. Jany K. D, Haug H, Ishay J, Trypsin-like endopeptidases from the midgets of the larvae from the hornets of Vespa orientalis and Vespa crabo Insect. Biochem., 1978, v. 8, pp. 221-230.

49. Walsh K. A, Trypsinogens and trypsins of various species. In Methods in enzymology, Academic Press, New York, 1970, v 19, pp. 41-63.

50. Amarant T, Burkhart W, Le Vine H, Arocha-Pinango C. L, Parikh, Isolation and complete amino acid sequence of two fibrinolytic proteinases from the toxic Saturnid caterpillar Lonomia achelous. Biochem. Biophys. Acta, 1991, v. 1079, pp. 214-221.

51. Sasaki T, Hishida T, Ichikawa K, Asari S, Amino acid sequence of alkaliphic serine protease from silkworm, Bombyx mori, larval digestive juice. FEBS Lett.,1993, v. 320, pp. 35-37.

52. Bigelow C.C, On the average hydrophobicity of proteins and the relation between it and protein structure. J. Theoret. Biol., 1967, v. 16, pp. 187-211.

53. Read R. J, James M. N. G, Refined crystal structure of Streptomyces griseus trypsin at 1,7 A resolution. J. Mol. Biol., 1988, v. 200 pp. 523-551.

54. Smalas A. 0, Heimstad E.S, Hordvik A, Willassen N.P, Male R, Cold adaption of enzymes: structural comparison between salmon and bovine trypsins, Proteins, 1994, v. 20, pp. 149-166.

55. Winter W. P, Neurath H, Purification and properties of a trypsin-like enzyme from the starfish Evasterias trochelii, Biochemistry, 1970, v. 9, pp. 4673-4679.

56. Grant G. A, Henderson К. O, Eisen A Z, Bradshaw R. A, Amino acid sequence of a collagenolytic protease from the hepatopancreas of the fiddler crab Uca pugilato, Biochemistry, 1980, v. 19, pp. 4653-4659.

57. Eisen A, Henderson K, Jeffrey J, Bradshaw R, A collagenolytic protease from the hepatopancreas of the fiddler crab Uca pugilator. Purification and properties. Biochemistry, 1973, v. 12, pp. 1814-1822.

58. Tsai Н, Lu Р, Chuang J, The midgut chymotrypsin of shrimp (Penaeus monodon, Penaeus japonicus and Penaeus penicillatus). Biochem. Biophys. Acta, 1991, v. 1080, pp. 59-67.

59. Zwilling R, Tomasek V, Amino acid composition of crayfish trypsin. Nature, 1970, v. 228, pp. 57-58.

60. Turkiewicz M, Galas E, Kalinowska H, Collagenolytic serine protease from Euphausia superba Dana (Antarctic krill). Comp. Biochem. Physiol, 1991, v. 99B, pp. 359-371.

61. Tsu C. A, Perona J. J, Fletterick R. J, Craik C. S, Structural basis for the broad substrate specificity of fiddler crab collagenolytic serine protease 1. Biochemystry, 1997, v. 36, pp. 5393-5401.

62. Lecroisey A, Keil B, Specificity of the collagenase from the insect Hypoderma lineatum, Eur. J. Biochem., 1985, v. 125, pp. 123-130.

63. Tanizawa K, Kasaba Y, Kanaoka Y, Inverse substrates for trypsin. Efficient" enzymatic hydrolysis of certain esters with a cationic center in the leaving group. J. Am. Chem. Soc., 1977, v. 99, pp. 4485-4488.

64. Sekizaki H, Itoh K, Murakami M, Toyota E, Tanizawa K, Anionic trypsin from chum salmon: activity with p-amidinophenyl ester and comparison with bovine and Streptomyces griseus trypsin. Comp. Bioch. Physiol., 2000, v. 127 B, pp 337346.

65. Sainz J. C, Garcia-Carreno F. L, Hernandez-Cortes P, Penaeus vannamei isotrypsins: purification and characterization. Comp. Biochem. Physiol., 2004, v. 138 B, pp. 155-162.

66. Jiang S. T, Moody M, Chen H. C, Purification and characterization of proteases from digestive tract of grass shrimp {Penaeus monodori), J. Food Sci, 1991, v. 56, pp. 322-326.

67. Gates R.J, Travis J, Isolation and comparative properties of shrimp trypsin (Penaeus setiferus). Biochemistry, 1969, v. 8, pp. 4483-4489.

68. Galgani F. G, Benyamin Y, Ceccaldi H. J, Identofication of digestive proteinases of Penaeus kerathurus: a comparison with Penaeus japonicus bate. Comp. Biochem. Physiol., 1984, v. 78 B, pp. 355-361.

69. Matthews B. E, The source, release and specificity of proteolytic enzyme activity produced by Anisakis simplex larvae (Nematoda: Ascaridida) in vitro, J. Helminthol., 1984, v. 58, pp. 175-185.

70. Glass H. J, Stark J. R, Protein digestion in the European lobster Homarus gammarus. Сотр. Biochem. Physiol., 1994, v. 108 B, pp. 225-235.

71. Purcell J. P, Greenplate J. T, Sammons R. D, Examination of midgat luminal proteinase activities in six economically important insects. Insect. Biochem. Mol. Biol, 1992, v. 22, N 1, pp. 41-47.

72. Мосолов В. В, Протеолитические ферменты, 1971, Изд-во "Наука" Москва.

73. Sanger, F., and Thompson, Е. О. P., Amino acids in the glycyl chain of insulin. II Peptides from enzymic hydrolyzates: Biochemical Journal, 1953, v. 53, p. 366374.

74. Ней M. S, Kim H. R, Pyeun J. H, Comparison of trypsin and chymotrypsin from the viscera of anchovy, Engraulis japónica, Сотр. Biochem. Physiol. 1995, V 112B,n3,pp 557-567.

75. Zwilling R, Neurath H, Methods in enzymology, 1981, v 80, Invertebrate proteases, pp633-643

76. Lecroisey A, Tong N. T, Keil B, Hypodermin B, a trypsin-related enzyme from the insect Hypoderma lineatum. Eur. J. Biochem, 1983,134, pp261-267.

77. Sanger F, Tuppy H, The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates. 1951, Biochem J, v. 49, pp 481-490.

78. Hofman H, Fietzek P. P, Kuhn K, The role of polar and hydrophobic interactions for the molecular packing of type I collagen: a Three-dimensional evaluation of the amino acid sequence. J. Mol. Biol., 1978, v. 125, pp. 137-165.

79. Genicot S, Feller G, Gerday C, Trypsin from antarctic fish {Paranotothenia magellanica foster) as compared with trout (salmo salar) trypsin. Comp. Biochem. Physiol., 1988, v 90B, pp 601-609.

80. Laskowski J. M, Qasim M. A, What can the structure of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes?, Biochem. Biophys. Acta, 2000, v. 1477, pp 324-337.

81. Read R. J, James M. N. G, In: proteinase inhibitors, Eds A.J. Barret, G. Salvesen-Amsterdam: Elsevier, 1986, pp. 301-336.

82. Sweet R. M, Wright H. T, Janin J, Chothia C. H, Blow D. M, Crystal structure of the complex of porcine trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz) at 2.6-A resolution. Biochemistry, 1974, v. 13, pp. 4212-4228.

83. Christeller J. T, Shaw B. D, The interaction of a range of serine proteinase inhibitirs with bovine trypsin and Costelytra zealandica trypsin. Insect.Biochem, 1989, v. 19, pp 233-241.

84. Patthy A, Amir S, Malik Z, Bodi A, Kardos J, Asboth B, Graf L, Remarkable phylum selectivity of a Schistocerca gregaria trypsin inhibitor: the possible role of enzyme-inhibitor flexibility. Arch. Biochem. Biophis., 2002, v. 398, pp. 179-187.

85. Huntington J. A, Read R. J, Carrell R.W, Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation. Nature (London), 2000, v. 407, pp. 923-926.

86. Hedstrom L, Serine protease mechanism and specificity, Chem. Rev., 2002, v.102, pp. 4501-4523.

87. Hartley B. S, Kauffman D. L, Corrections to the amino acid sequence of bivine chymotrypsinogen A, Biochem J, 1966, v 101, pp 229-231.

88. Branden C, Tooze J, Introduction to protein structure, 1991, pp238.

89. Jansen E.F, Nutting M.D.F, Balls A.K, Mode of inhibition of chymotrypsin by diisopropyl fluorophosphate. I. Introduction of phosphorus. J.Biol.Chem., 1949, v. 179, pp 201-204.

90. Schoellman G, Shaw E, Direct evidence for the presence of histidine in the active center of chymotrypsin. Biochemistry, 1963, v. 2, pp. 252-255.

91. Blow D.M, Birktoft JJ, Hartley B.S, Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin. Nature, 1969, v. 221, pp. 337-340.

92. Corey D.R, Craik C.S, An investigation into the minimum requirements for peptide hydrolysis by mutation of the catalytic triad of trypsin. J. Am. Chem. Coc., 1992, v. 114, pp. 1784-1790.

93. Carter P, Wells J.A, Engineering enzyme specificity by "substrate-assisted catalysis". Science, 1987, v. 237, pp. 394-399.

94. Corey D.R, Willett W.S, Coombs G.S, Craik C.S, Trypsin specificity increased through substrate assisted catalysis. Biochemistry, 1995, v. 34, pp. 11521-11527.

95. Menard R, Storer A. C, Oxyanion hole interactions in serine and cysteine proteases. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1992, v. 373, pp. 393-401.

96. Menard R, Plouffe C, Laflammme P, Vernet T, Tessier D. C, Thomas D. Y, Storer A. C, Modification of the electrostatic enviroment is tolerated in the oxyanion hole of the cysteine proteinase papain. Biochemistry, 1995, v. 34, pp. 464-471.

97. Perona J.J, Hedstrom L, Rutter W. J, Fletterick R. J, Structural origins of substrate discrimination in trypsin and chymotrypsin. Biochemistry, 1995, v. 34, pp. 1489-1499.

98. Graf L. A, Jancso A, Szilagyi G, Hegyi K, Pinter G, Naray-Szabo J, Hepp K, Medzihradszky K, Rutter W. J, Electrostatic complementary within the substrate-binding poket of trypsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, pp. 4961-4965.

99. Hedstrom L, Szilagyi L, Rutter W. J, Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops. Science, 1992, v. 255, pp. 1249-1253.

100. Hedstrom L, Perona J. J, Rutter W. J, Converting trypsin to chymotrypsin: residue 172 is a substrate specificity determinant. Biochemistry, 1992, v. 33, pp. 8757-8763.

101. Kossiakoff A. A, Spencer S. A, Direct determination of the protonation states of aspartic acid-102 and histidine-57 in the tetrahedral intermediate of the serine proteases: neutron structure of trypsin, Biochemistry, 1981, v. 20, pp. 6462-6474.

102. Bryan P, Pantoliano W, Quill S. G, Hsioa H-Y, Poulos T, Sci. U.S.A, Site-Directed Mutagenesis and the Role of the Oxyanion Hole in Subtilisin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1986, v.83, pp. 3742-3745.

103. Warshel A, Naray-Szabo G, Sussman F, Hwang J. K, Biochemistry, How do serine proteases really work?, 1989, 28,3629-3637.

104. Warshel A Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem, 1998, v. 273, pp. 27035-27038.

105. Gerlt J. A, Gassman P.G, Understanding the rates of certain enzyme-catalyzed reactions: proton abstraction from carbon acids, acyl-transfer reactions, and displacement reactions of phosphodiesters. Biochemistry, 1993, v. 32, pp. 1155211568.

106. Kuhn P, Knapp M, Soltis S. M, Ganshaw G, Thoene M, Bott R, The 0.78 A structure of a serine protease: Bacillus lentus subtilisin. Biochemistry, 1998, v. 37, pp. 13446-13452.

107. Cleland W. W, Frey P. A, Gerlt J.A, The Low Barrier hydrogen bond in enzymatic catalysis. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, pp. 25529-25532.

108. Blow D. M, Birktoft J. J, Hartley B. S, 1969, Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin, Nature, 221, 337-340.

109. Fujinaga M, Delbaere L. T. J, Brayer G. D, James M. N. G, Refined structure of alpha-lytic protease at 1.7 A resolution. Analysis of hydrogen bonding and solvent structure. J. Mol. Biol., 1985, v. 183, pp. 479-502.

110. Bachovchin W. W, Confirmation of the assignment of the low-field proton resonance of serine proteases by using specifically nitrogen-15 labeled enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, v. 82, pp. 7948-7951.

111. Wang J. H, Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A, Directional character of proton transfer in enzyme catalysis. Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1970, v. 66, pp. 874881.

112. Satterthwait A. C, Jencks W. P, J. Am. Chem. Soc., The mechanism of the aminolysis of acetate esters. J. Am. Chem. Soc., 1974, v. 96, pp. 7018-7031.

113. Carne T, Scheele G, Amino acid sequences of transport peptides associated with canine exocrine pancreatic proteins. J.Biol. Chem., 1982, v. 257, pp. 4133-4140.

114. Maroux S, Baratti J, Desnuelle P, Purification and Specificity of Porcine Enterokinase. J.Biol.Chem., 1971, v. 246, pp. 5031-5039.

115. MacDonald R.J, Stary S.J, Swift G.H, Rat pancreatic ribonuclease messenger RNA. The nucleotide sequence of the entire mRNA and the derived amino acid sequence of the pre-enzyme. J.Biol.Chem., 1982, v. 257, pp. 14582-14585.

116. Abita J.P, Delaage M, Lazdunski M, Savrda J, The mechanism of activation of trypsinogen. The role of the four N-terminal aspartyl residues. Eur.J.Biochem, 1969, v. 8, pp. 314-324.

117. Chothia C, Conformation of twisted beta-pleated sheets in proteins. J. Mol. Biol., 1973, v. 75, pp. 295-302.

118. McLachlan A. D, Gene duplication in the structural evolution of chymotrypsin. J. Mol. Biol., 1979, v. 128, pp. 49-79.

119. Murzin A. G, Lesk A. M, Chothia C, Principles determining the structure of 13-sheet barrels in proteins: I. A theoretical analysis. J. Mol. Biol., 1994, v.236, pp. 1369-1381.

120. Lesk A. M, Fordham W. D, Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family. J. Mol. Biol., 1996, v. 258, pp. 501537.

121. Birktoft J.J, Blow D. M, Structure of crystalline chymotrypsin. V. The atomic structure of tosyl-chymotrypsin at 2A resolution. J. Mol. Biol., 1972, v. 68, pp. 187-240.

122. Baptista A. M, Jonson P. H, Hough E, Petersen S. B, The origin of trypsin: evidence for multiple gene duplication in trypsins. J. Mol. Biol., 1998, v. 47, pp.353-362.

123. Rogers J, Exon shuffling and intron insertion in serine proteinase genes. Nature,1985, v. 315, pp. 458-459.

124. Kornblihtt A. R, Vibe-Pedersen K, Baralle F. E, Human fibronectin: cell specific alternative mRNA splicing generates polypeptide chains differing in the number of internal repeats. Nucleic. Acids. Res., 1984, v. 12, pp. 5853-5868.

125. G. H. Swift, C. S. Craik, S. J. Stary, C. Quinto, R. G. Lahaie, W. J. Rutter, and R. J. MacDonald, Structure of the two related elastase genes expressed in the rat pancreas. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, pp. 14271-14278.

126. Rypniewski W.R, Perrakis A, Vorgias C, Wilson K. S, Evolutionary divergence and conservation of trypsin. Protein Engineering, 1994, v.7, №1, pp 57-64.

127. Iwanaga S, Kawabata S. I, Muta T, New types of clotting factors and defense molecules found in horseshoe crab hemolymph: their structures and functions. J. Biochem., 1998, v. 123, pp. 1-15.

128. Jiang H, Kanost, M. R, The clip-domain family of proteinases in arthropods. Insect. Biochem. Molec. Biol., 2000, v. 30, pp. 95-105.

129. Iwanada S, Kawabata S, Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Front. Biosci., 1998, v. 3 D, pp. 973-984.

130. Levashina E. A, Langley E, Green C, Gubb D, Ashburner M, Hoffmann J. A, Reichhart J. M, Constitutive activation of Toll-mediated antifungal defense in serpin-deficient Drosophila, Science, 1999, v. 285, pp. 1917-1919.

131. LeMosy E. K, Hong С. C, Hashimoto C, Signal transduction by a protease cascade. Trends in Cell Boil., 1999, v. 9, pp. 102-107.

132. Gotz T, Mechanisms of encapsulation in dipteran hosts. Symp. Zool. Soc. Lond., 1986, v. 56, pp. 1-19.

133. Ashida M, Brey P, Recent advances in research on the insect prophenoloxidase cascade. In: Brey P. T, Hultmark D, Molecular mechanisms of immune responses in insects, Chapman and hall, London, 1997, pp. 133-172.

134. Ochiai M, Ashida M, Purification of a (3-1,3-glucan recognition protein in the prophenoloxidase activating system from hemolymph of the silkworm, Bombyx mori. J. Biol. Chem., 1988, v. 263, pp. 12056-12062.

135. Soderhall K, Cerenius L, Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology, 1998, v. 10, pp. 23-28.

136. Jiang H, Wang Y, Kanost M. R, Pro-phenol oxidase activating proteinase from an insect, Manduxa Sexta: a bacteria-inducible protein similar to Drosophila easter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v. 95, pp. 12220-12225.

137. Satoh D, Horii A, Ochiai M, Ashida M, Prophenoloxidaseactivating enzyme of the silkworm, Bombyx mori: purification, characterization, and cDNA cloning. J.Biol. Chem., 1999, v. 274, pp. 7441-7453.

138. Исаев В. А, Руденская Г. H, Купенко О. Г, Степанов В. М, Попова И. М, Диденко Ю.Г, " Способ получения препарата коллагеназы", патент №2008353 от 5 авг 1991 г,. Бюлл. Изобр., №4, 1994, 18.

139. Grant G. A, Eisen A. Z, Bradshaw R. A, Collagenolytic protease from fiddler crab (Uca pugilator). Metods Enzymol., 1981, v. 80, pp. 722-734.

140. Camacho Z, Brown J. R, Kitto G. B, Purification and properties of trypsin-like protease from the starfish Dermasterias imbricata. J. Biol. Chem., 1970, v. 254, pp. 3964-3972.

141. Sakarov I. Yu, Mar. Biotechnol, 2, pp 259-266, Purification and some properties of two carboxypeptidases from the hepatopancreas of the crab Paralitodes camtschaticus. Mar. Biotechnol. 2000, v. 2, pp. 259-266.

142. Сахаров И. Ю, Джунковская А. В, Эластаза из гепатопанкреаса камчатского краба. Биохимия, 1993, т 58, стр. 1445-1453.

143. Руденская Г. Н, Шмойлов А. М, Исаев В. А, Ксенофонтов А. В, Швец С.

144. В, Аминопептидаза PC гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtshaticus. Биохимия, 2000, т. 65, стр. 1345-1353.

145. Osnes К. К, Mohr V, On the purification and characterization of three anionic, serine-type pepide hydrolases from Antarctic krill, Euphausia superba. Сотр. Biochem. Physiol., 1985, v 82 B, pp. 607-619.

146. Руденская Г.Н, Купенко О. Г, Исаев В. А, Степанов В. М, Дунаевский Я. Е, Выделение и характеристика карбоксипептидазы из камчатского краба Paralithodes camtshaticus., Биоорг. Химия, 1995, т. 21, с 249-255.

147. Liu J-H, Wang Z. X, Kinetic analysis of ligand-induced autocatalytic reactions. Biochem J, 2004, v. 379 pp.697-702.

148. Groppe JC, Morse DE: Molluscan chymotrypsin-like protease: structure, localization, and substrate specificity. Arch Biochem Biophys., 1986, v. 305 pp. 159-169.

149. Papaleo E, Fantucci P, De Gioia L, Effects of calcium binding on structure and autolysis regulation in trypsins. A molecular dynamics investigation, J. Chem. Theoty Comput., 2005, v. 1, pp. 1286-1297.

150. Castro H.C, Silva D. M, Craik C, Zingali R. B, Structural features of a snake venom thrombin-like enzyme: thrombin and trypsin on a single catalytic platform? , Biochem. Biophys. Acta, 2001, v. 1547, pp. 183-195.

151. Leiros H. K, Willassen N. P, Smalas A. O, Residue determinants and sequence analysis of cold-adapted trypsins. Extermophiles, 1999, v. 3 pp. 205-219.

152. Gabriel B, Stubbs M. T, Bergner A, Hauptmann J, Bode W, Sturzebecher J, Moroder L, Design of benzamidine-type inhibitors of factor Xa. J. Med. Chem., 1998, v. 41, pp. 4240-4250.

153. Matsuzaki T, Sasaki C, Okumura C, Umeyama H, X-ray analysis of thrombin inhibitor-trypsin complex. J. Biochem., 1989, v. 105, pp. 949-952.

154. Oliveira M, Rogana E, Rosa J. C, Reinhold B. B, Andrade M. H, Greene L. J, Guia M. M, Tyrosine 151 is part of the substrate activation binding site of bovine trypsin. The J. Biol. Chem., 1993, v. 268, pp. 26893-26903.

155. Miller D. W, Agard D.A, Enzyme specificity under dynamic control: a normal mode analysis of alpha-lytic protease. J. Mol. Biol., 1999, v. 286 pp. 267-278.

156. Leiros H-K. S, Willassen N. P, Smalas A. O, Structural comparison of psychrophilic and mesophilic trypsins, Eur. J. Biochem, 2000, v 267, pp 10391049.

157. Erlanger B. F, Kokowsky N, Cohen W, The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin, Arch. Biochem. Biophys, 1961, v 95, pp 271-278.

158. Bradford M, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem, 1976, v 72, pp 248-254.

159. Laemmli U.K, Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriofage T4, Nature, 1970, v. 227, pp. 680-685.