Анализ продуктов протеолиза бычьего фибриногена и коллагена типа I при помощи времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

---

Ли правах рукописи

СУНГУРОВ Юрий Владимирович

АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ПРОТЕОЛИЗА БЫЧЬЕГО ФИБРИНОГЕНА И КОЛЛАГЕНА ТИПА I ПРИ ПОМОЩИ ВРЕМЯПРОЛЕТНОЙ МАЛДИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

02.00.15-катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003467020

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук Еремеев Н. Л.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Ротанова Т. В. кандидат химических наук Самгина Т. Ю.

Ведущая организация:

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва

защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической этимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 009 гола

Защита состоится <

года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская Й.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Исследование реакций протеолиза, как правило, сопряжено с

решением двух основных вопросов - установленном механизма расщепления белкового субстрата и выяснением специфичности действия протеиназы. Традиционным биохимическим подходом для решения этих вопросов является разделение продуктов реакции (с помощью, например, электрофореза или жидкостной хроматографии) с их последующим анализом (определение молекулярной массы, распределение той или иной метки, иммуноблоттннг, секвенирование и т.д.).

Появление методов мягкой ионизации (электроспрей (ЭС) и матрично-активироваццая лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ)) дало толчок бурному развитию масс-спектрометрии биомакромолекул. Эти методы ионизации сделали возможным переводить большие и чрезвычайно лабильные биомолскулы в газовую фазу и ионизировать их без деструкции. Преимуществом МАЛДИ относительно ЭС является формирование, в основном, однозарядных ионов - таким образом, спектр МЛЛДИ белково-пептидных смесей дает возможность определить их качественный состав и массы входящих в них компонентов. Немаловажным фактором также является относительная толерантность метода МАЛДИ к присутствию в анализируемых образцах низкомолекулярпых добавок (соли, детергенты, компоненты буферных растворов и т.п.), а так же высокая чувствительность и экспрессность метода.

Изучение возможностей МАЛДИ МС для анализа продуктов протеолиза сложных белковых субстратов, расширяющее использование самого метода, является актуальной задачей. Так, трипсииолиз белка с последующим получением спектра МАЛДИ триптических пептидов («фингерпринта» или «отпечатков пальцев»), которое также называется МАЛДИ-картированием, с его идентификацией по существующим базам данных является в настоящее время рутинной процедурой. С нашей точки зрения аналогичный подход весьма перспективен для изучения механизма протеолиза белков.

Предполагаемый алгоритм эксперимента в этом случае должен включать в себя проведение протеолиза белкового субстрата конкретной протеиназой, отбор проб через определенные промежутки времени, гель-электрофорез проб в денатурирующих условиях (ДДС-гель-электрофорез), трипсинолиз полученных полос, соотнесение полученных в масс-спектре пиков с теоретическими триитическими пептидами исходного белка и определение их положения в полипептидной цепи. Наложение идентифицированных пептидов, а так же массы вычисленной из гсль-электрофореграммы полосы на аминокислотную последовательность белка дает представление о том, какому участку исходной молекулы субстрата принадлежит данный высокомолекулярный продукт протеолиза. Подобный анализ всех полос электрофореграммы в динамике процесса покажет, какие участки белковой молекулы и каким образом подвергаются протеолизу с течением времепи. Данный подход реализуем, если степень перекрывания масс триптических пептидов исходного субстрата в пределах определенной погрешности не очень

велика. В настоящей работе в качестве модельного белкового субстрата был выбран бычий фибриноген.

Для расщепления белков, помимо трипсина, используют и другие агенты. При этом в зависимости от специфичности действия той или иной протеиназы образующиеся из одного и того же белкового субстрата МАЛДИ «фингерпринты» сильно различаются между собой. В связи с этим возникает вопрос: возможно ли решение обратной задачи? Можно ли делать какие-либо выводы относительно специфичности действия протеиназ на основе «фингерпрянта» продуктов протеолиза, если в качестве субстрата взять один и тот же белок?

Особенно остро этот вопрос стоит при скрининге коллагеназ. Способность коллагеназ разрушать нативный коллагена при физиологических условиях обуславливает их широкое применение в различных отраслях биотехнологии, медицины, промышленности. В зависимости от типа каждого конкретного применения используются различные коллагеназы. Можно ожидать, что набор продуктов гидролиза коллагена будет зависеть от специфичности действия конкретной коллагеназы.

Безусловно, для полной характеристики действия фермента на коллаген необходим анализ первичной структуры продуктов протеолиза, что требует проведения тандемного масс-спектрометрического эксперимента. Однако в случае коллагена масс-спектрометрическое секвенировакие пептидов затруднено. Поэтому анализ действия коллагеназ различных классов на коллаген типа I в данной работе был проведен на основе сравнения МАЛДИ «фингерпринтов» продуктов реакций коллагенолиза без использования тандемной масс-спектрометрии.

Следует отметить, что условия проведения биохимических реакций в целом и протеолиза в частности накладывают серьезные ограничения на получение качественных и достоверных МАЛДИ масс-спектров белково-пептидных смесей. Наличие в образце низкомолекулярных добавок обычно приводит к уменьшению интенсивности пиков молекулярных ионов исследуемых веществ. Тем не менее, при правильном и тщательном подборе условий пробоподготовки удается получить масс-спектры даже таких сложных систем, как биологические жидкости.

Таким образом, отработка условий пробоподготовки образцов для получения воспроизводимых и качественных МАЛДИ масс-спектров и увеличения выходов сигналов является отдельной задачей в любом исследовании белково-пептидных смесей методом МАЛДИ масс-спектрометрии.

Цели и задачи исследовании. Целью настоящей работы явилось изучение новых возможностей метода МАЛДИ для определения механизма реакций протеолиза высокомолекулярных белковых субстратов на примере бычьего фибриногена, а также первичного скрининга коллагеназ (выяснение специфичности действия коллагенолитических ферментов разных классов на коллаген).

В работе решались следующие задачи:

1. Выбор модельного белка для изучения механизма его протеолиза методом МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов реакции. Изучение возможности применения МАЛДИ-картировация высокомолекулярных продуктов протеолиза для установления механизма расщепления бычьего фибриногена изоформой сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба.

2. Отработка процедуры пробоподготовки реакционных смесей в ходе протеолиза белковых субстратов с целью получения воспроизводимых и качественных спектров МАЛДИ и увеличения выхода сигналов.

3. Проведение сравнительного анализа спектров МАЛДИ гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ разных классов. Изучение возможности первичного скрининга коллагеназ по МАЛДИ «фингерпршггам» продуктов гидролиза коллагена.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые для выявления механизма протеолиза сложного белкового субстрата с надмолекулярной структурой (бычьего фибриногена) изоформой сериновой коллагенолитической протеиназы (СКП-2) камчатского краба Paralithodes camtschatica был применен метод МАЛДИ-картирования продуктов реакции, а также установлен сам механизм протеолиза. Отработана процедура пробоподготовки продуктов протеолиза белков с надмолекулярной структурой для получения информативных и воспроизводимых спектров МАЛДИ. Показана возможность первичного скрининга коллагеназ по спектрам МАЛДИ низкомолекулярных продуктов протеолиза коллагена («фингерпринтам»),

Airooбапия работы. Результаты работы были представлены на Международной конференции «Biocatalysis-2005: Fundamentals & Applications» (Санкт-Петербург, 2005), II Всероссийской конференции «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2005), IV Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), VI Международном симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4

статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы (4 раздела); экспериментальной части (8 разделов); двух разделов, в которых приведены результаты и их обсуждение; выводов и списка цитируемой литературы, включающего 199 источников. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, включает 46 рисунков н 15 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ I. Изучение механизма протеолиза МАЛДИ масс-спектрометрическнм картированием триптических пептидов высокомолекулярных продуктов реакции.

Выбор модельного бежа.

Как уже говорилось выше, метод триптического МАЛДИ картирования белков широко используется в мире в протеомных исследованиях. С нашей точки зрения аналогичный подход весьма перспективен для изучения механизма протеолиза белков. Алгоритм эксперимента состоит из нескольких стадий (рис. 1).

Первая стадия включает в себя проведение протеолиза белкового субстрата конкретной протеиназой и отбор реакционных проб через определенные промежутки времени с дальнейшим гель-электрофорезом проб в денатурирующих условиях.

На второй стадии проводится трипсинолиз полученных полос высокомолекулярных продуктов протеолиза. Трипсинолизаты фрагментов исходного белкового субстрата подвергаются затем МАЛДИ масс-спектрометрическому анализу с получением листа масс триптических пептидов полосы продукта.

В результате теоретического расщепления исходного белкового субстрата трипсином получается полный спектр потенциальных триптических пептидов с массами, аминокислотной последовательностью и местоположением в белке.

Лист масс триптических пептидов полосы продукта сравнивается с результатами теоретического трипсинолиза исходного белка.

Каждой соотнесенной массе присваивается местоположение в аминокислотной последовательности исходного белкового субстрата. Наложение идентифицированных пептидов, а так же массы вычисленной из гель-электрофореграммы полосы на аминокислотную последовательность белка дает представление о том, какому участку исходной молекулы субстрата принадлежит данный высокомолекулярный продукт протеолиза.

Подобный анализ всех полос электрофореграммы в динамике процесса показывает, какие участки белковой молекулы и каким образом подвергаются протеолизу с течением времени. Следует отметить, что данный подход реализуем, если степень перекрывания масс триптических пептидов исходного субстрата в пределах определенной погрешности не очень велика. Только в этом случае становится возможным однозначное соотнесение конкретной экспериментально получаемой массы в масс-спектре с массой, месторасположением и аминокислотной последовательностью того или продукта теоретического трипсинолиза.

С использованием программы РерМеМаББ нами было проведено теоретическое расщепление трипсином пептидных цепей ряда белков с надмолекулярной структурой и определена степень перекрытия масс триптических пептидов из их различных цепей. С учетом

Протсаза Белковый субстрат

Отбор проб через определенные промежутки времени

Г«ль-электрофорсз в денатурирующих условиях

Исходный Высокомолекулярные белковый продукты

субстрат протеолим

_'г

Трипсннолш полосы продут а

МАЛДИ МС анализ триптических пептидов полосы

Теоретические продукты трипешгализа исходного белкового субстрата

гай Пептид «естополож«кие в белке

1214 СЦШНЛая 132-140

1104 ичташкт 172-181

1284 иикит-егк 91-100

1390 М\ТЛГ1ТОСЮОНА11 202-274

1495 СиОЕ\«!0[Т5И 75-87

1594 206-219

соотнесение масс

масс-спеюр триптических

пептидов I полосы

набор масс триптических пептидов полосы

положение пептидов на

аминокислотную последовательность белка

наложение массы продукта, рассчитанной из гель-электрофореза

I Н Ы Ы •

1-/

Рис. 1. Алгоритм изучения механизма протеолиза МАЛДИ картированием триптических пептидов высокомолекулярных продуктов реакции.

доступности и физиологической значимости для дальнейших исследований был выбран бычий фибриноген.

Степень перекрытия масс триптических пептидов из различных цепей бычьего фибриногена в пределах ±0,3 Да для интервалов масс 1000-3000 Да составляет менее 5% (14 перекрывающихся масс из 283), в то время как, например, в гемоглобине она достигает 24,5%, а в РНК-полимеразе - 29%. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в данном диапазоне масс местоположение подавляющего числа в той или иной цепи исходного фибриногена может быть однозначно идентифицировано с помощью МАЛДИ МС анализа по их молекулярной массе.

Молекула фибриногена представляет собой симметричный димер сложного пространственного строения (около 340 кДа, Рис. 2а). Каждый из мономеров состоит из 3 полипептидных цепей - Аа, Вр и у.

Аа ГЕ5Г

II

вр ШЕ

У С

Л

Пг

И

О

Л.

] [сигнальные пегтяды Е ' 1 фибринолептиды А и В

¡суперекрученный участок 1 I протуберанец С-домен

II межмолекулярные -в-Б- свиэн ! | | внутримолекулярные-Б-Б-связи

Связанный гликак

Рис. 2. Пространственная структура молекулы фибриногена, а) Схематичное представление четвертичной структуры дпмера фибриногена, б) Аа, Вр и у-цепи бычьего фибриногена с указанием элементов третичной структуры мономера и четвертичной структуры димера.

Димерная структура (центр молекулы, Е-домен) формируется междоменными дисульфидными связями между остатками Суэ50 Аа-цепей и остатками Суз 32 и Суз 33 у-цепей (Рис. 26, нумерация у-цепи но последовательности незрелого белка, с сигнальным пептидом). В мономерах присутствуют два «узла», разделяющие участки различной структурной организации, в которых все цепи фибриногена соединены между собой дисульфидными связями. Между этими узлами расположен так называемый суперскрученный (соПе<1-соП) участок, состоящий из всех трех цепей мономера. С-концевые последовательности Вр- и у-цепей образуют довольно плотный

D-домен, в то время как карбоксиконцевой участок Аа-цеии, содержащий 410 аминокислотных остатков, образует подвижный аС-домен («протуберанец»). Протяженность суперскручснных участков, соединяющих центральный домен с концевыми глобулярными доменами молекулы -около 110 аминокислотных остатков.

Особенности пробоподготовки для получения качественных масс-спектров трипсинолизатов фрагментов фибриногена.

Масс-спектры трипсниолизатов полос индивидуальных цепей после ПААГ-электрофореза удалось получить с использованием традициошюй пробоподготовки (матрица ц-циано-4-гидроксикоричная кислота (НССА), на несение на мишень методом «высушенной капли»), В случае фрагментов фибриногена данный метод успехов не принес. По-видимому, это связяано с низкой концентрацией продуктов гидролиза в геле (полосы фрагментов фибриногена на электрофореграмме окрашены менее иитенсивно, чем полосы индивидуальных цепей, см. рис. 3).

При замене матрицы НССА на 2,5-дигидроксибензойную кислоту (DHB) удалось получить масс-спектры трипецнолизатов фрагментов фибриногена. Однако они были малоинформативны (содержали. небольшое число пиков) и низкого качества (низкое отношение сигнал/шум и разрешение).

Для того чтобы улучшить качество полученных масс-спектров, мы решили воспользоваться методом комбинирования матриц НССА на DHB. Пробоподготовка со смесью матриц позволила значительно улучшить качество масс-спектров трипсинолизатов фрагментов фибриногена, получаемых из геля.

Выбрав подходящую матрицу, мы попытались варьировать методы нанесения смеси ее раствора с аналитом па мишень. Помимо метода «высушенной каплю» были опробованы методы «тонкого» и «двойного» слоя. Метод «высушенной капли» дал наилучшие результаты: спектры были хорошего качества (высокое отношение сигнал/шум и разрешение), наиболее информативны (наибольшее количество сигналов), обладали надежной воспроизводимостью, обеспечивали малое время на поиск так называемой «sweet spot» (точки на образце, обеспечивающей интенсивный спектр), что снижало время получения спектра МАЛДИ.

В результате серий проведенных экспериментов были отработаны следующие условия пробоподготовки трипсинолизатов фрагментов фибриногена: 1) матрица: смесь растворов (20 мг/мл) НССА и DHB в соотношении 1:1; 2) растворитель: смесь ацетонитрила с 0,1%-ным водным раствором ТФУ (7:3 по объему); 3) метод нанесения образцов на стальную мишень: метод «высушенной капли»; 4) соотношение аналит:матрица —1:1.

ИсаеОовтте кехепчама п/мтешиза бычье™ фибриногена изоформай Ск'Ч-2 с нюккцью МЛ.1ДИ

масс-спектрпмстрии.

На рис.3 приведена ДДС-геяь-члектрофореграчма реакционной смсси протеолиза бычьего фибриногена изоформой СК11-2 В течение периых 15 минут протеолиза на гель-электрофореграмме пропадают полосы, соответствующие Аа- и Вр-шпям исходного фибриногена, и появляются три полосы продуктов с молекулярными массами около 47 и 27 и 15 кДа и (дорожка 3, полосы 2, 3 и 4, рис. 3). С увеличением времени реакции уменьшается (вплоть до полного исчезновения) Интенсивность окраски полосы, соответствующей у-цепи исходного субстрата. Одновременно с этим полосы относительно низкомолекулярных продуктов пропадают, а полоса высокомолекулярного продукта реакции «размывается» и сдвигается в область более

Рис. 3. ДДС-гель-

г ::' ф.;|'< * реакционной смеси, Дорожки: 1 - маркеры; 2 - Исходный субстрат; 3 -реакционная смесь через 15 пин. 4 — через 30 мин, 5 — через 4 часа протеолиза, (Условна протеолиза: 50 !нМ Трис-НС1 буфер (рН 8,0). температура 4 "С, концентрацня фибриногена 0,2 мг/мл. концентрация фермента (1,01 мг/мл).

На первый взгляд, результаты гель-электрофореза продуктов гидролиза СКП-2 говорят о том, что в ходе реакции происходит быстрое расщепление Аа и Вр-иепей бокового субстрата, в то время как у-цепь медленно гиАролизустся ферментом. Однако масс-сиектроыстричсский анализ тритически* шцролнзатов полос гель-электрофореграммы показал, что в действительности механизм протеолиза гораздо более сложен. Так, в масс-спектрах триптических гидролизатов полос 3 к 4 (рис 3, дорожка 3) обнаружены массы, идентифицированные исключительно как пептиды, относящиеся к Аа -цепи фибриногена При этом местонахождение этих нет идо в в цепи лежит в области М-конца аминокислотной последователь!госта (рис. 4).

низких масс (пилось! 6 и 7, дорожки 4 и 5 соответственно)

Мг, кДа 1 2 3

130 Я

95

■

-1-1 «ш&шзш

65

У 1 аЙйга^ч:-;

2 *

43 Щ

■ .г,^

3 у—

4

гГНАТ-ТА ч"1"

ли..

11. ы

Вр- цель

-г-......1-,_сезг

I _н 11Ж1

иг

.... 4*1 1

I исходном

нем*

tw.HKо 3. ¿орежки 3 (мчи гидро.ги ¡а)

по.'шт 4, дорожка 3 (И хин мне}

И Ч' , V ■н г—1. Ъ .. Г Я ф

г ^ . « Я ■ И ... . 1ф1 .1

аалта (<е АфШМда *

{30 мин гидролизе)

полоса 7, доромеко -Т (4 часа роянт}

ШЙ РГ'-Нр! * Ч 1 Щ 1

п 4}

1 М .............

м «■ * Е 1 ^ '' '"Ь г •Л

1 ■ И щ ^ ^Р™

к ь__ Л, «8« # 1 1 * ™ V 41

| . и ;

тр*гтгч«скке ПеГГЩВЫ 1 [

исходная

цепь

полоса I. АарамкоЗ (15 мии ,'идрализа) лолоса 6, дорожка 4 (30,чин мбролюи)

полета 7, дорожки 5 (4 часа ¿идролию)

средня*

I 1МЛ»купй|лая икс*

47кПа попоем ооявииым

рИС.З

Рис. 4. Расположение идентифицированных в масс-спектрах триптических пептидов полос элекгрофореграммы Рис, 2 в последовательно стих цепей фибриногена.

Наложение на исходную последовательность молекулярной массы фрагментов, рассчитанных из элеюрофореграмзш, позволяет говорить о том, что полоса 3 представляет собой осколок примерно т 240 аминокислот, а полоса 4 - из 130 аминокислот. Таким образом, ссрнновая коллагеназа в первую очередь разрушает на относительно мелкие осколки С-конец Ла-цепи 320 аминокислот), представляющий собой протуберанец к не входящий в состав надмолекулярных структур молекулы фибриногена (см. рис, 2а, б). Параллельно с этим происходит несколько более медленное расщепление су перекрученного участка Аа-цепи, находящегося между двумя регионами межмолекулярных днеульфидпых связей. Обработка масс-спектров триптических гкдролизатов всех остальных полос выявила наличие в них фрагментов, относящихся как к ВЩ так и к у-цепям фибриногена. При сравнении между собой

11

местонахождения идентифицированных пептидов в исходной аминокислотной последовательности Вр- и у-цепей и рассчитанных из электрофореграммы молекулярных масс фрагментов гидролиза фибриногена (рис. 4) можно говорить о том, что эти цепи начинают расщепляться с Ы-конца, то есть с участка, входящего в суперскрученную область молекулы фибриногена (см. рис. 26). Доменные структуры при этом демонстрируют высокую устойчивость к действию протеиназы СКП-2.

Эффективность протеолиза Вр-цепи фибриногена несколько выше, чем у-цепи. Ферментативное расщепление Вр- и у- цепей белкового субстрата приводит к образованию продуктов с близкими молекулярными массами, плохо разделяющимися при проведении гель-электрофореза. В этой связи «размывание» полосы высокомолекулярного продукта реакции на электрофореграмме с увеличением времени протеолиза (рис.3) обусловлено предпочтительным гидролизом Вр-цепи с образованием фрагментов несколько меньшей молекулярной массы. Более медленный протеолиз у-цепи фибриногена дает фрагменты более высокой молекулярной массы.

Косвенным подтверждением такого предположения может служить относительная интенсивность повторяющихся пиков, отнесенных к пептидам из Вр и у-цепей, на масс-спектрах триптических гидролизатов «верхнего» и «нижнего» участков полосы высокомолекулярного продукта полосы 7 на дорожке 5 рис. 3 (таблица 1). Если в «верхнем» участке полосы (содержащем продукты гидролиза с более высокой молекулярной массой) выше относительная интенсивность пиков, отнесенных к пептидам из у-цепи, то в «нижнем» выше относительная интенсивность пиков, отнесенных к пептидам из Вр-цепи фибриногена. Конечно, относительная интенсивность пиков в масс-спектрах не может служить количественной характеристикой концентрации тех или иных пептидов в смеси, однако, в первом приближении при одинаковых условиях пробоподготовки и нанесения образца, а также одинаковых условиях записи спектров можно считать, что наиболее интенсивные пики в спектрах МАЛДИ близких по составу соединений соответствуют молекулярным ионам компонентов с наибольшей концентрацией в пробе.

Таким образом, сравнительный анализ продуктов реакции гидролиза фибриногена ферментом СКП-2 при помощи времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии триптических гидролизатов полос гель-электрофореза позволяет предложить следующий механизм процесса. В первую очередь происходит расщепление неструктурированного протуберанца на С-конце Аа— цепи (остатки =300-615 аминокислотной последовательности). Чуть более медленному, но достаточно эффективному протеолизу, подвергается и суперскрученный участок Аа-цепи. Разрушение суперскрученного участка Аа-цепи открывает ферменту возможность для атаки суперскрученных участков Вр- и у-цепей фибриногена. В этом случае протеолиз протекает с Ы-конца аминокислотной последовательности. Продуктами ферментативной деструкции белкового

Таблица. 1. Относительная интенсивность пиков трнптичсскпх пептидов т верхней п нижией част полосы 7 электрофореграм.мы (рис. 3)._

т/г пика пептида Относительная интенсивность пиков

Верхняя полоса геля Нижняя полоса геля

130- цепь

1176.8 2 8

1239.6 45 100

1612.1 5 15

1629.1 11 30

1784.5 5 16

2401.9 3 10

2567.3 2 9

у-цепь

1130.6 13 9

1323 24 20

1506.9 5 3

1741.5 100 60

1927.5 9 4

2220.8 26 15

субстрата являются близкие по молекулярным массам фрагменты доменных участков этих цепей. При этом Вр-цепь разрушается более эффективно по сравнению с у-цепью.

В литературе описаны различные механизмы протеолиза фибриногена. Существуют ферменты, предпочтительно гидролизуюгцие Аа- или Вр-цепи фибриногена (у-цепь обычно наиболее устойчива к протеолизу). Например, гементин пиявки сначала атакует суперскрученные участки Аа-цепи, не затрагивая протуберанец. Другие протеиназы, например, сериповые протеиназы из яда Сго1а1и$ Шгох, вначале расщепляют только В(5-цепи фибриногена, не затрагивая Аа- и у-цепи фибриногена.

Выявленный нами механизм протеолиза фибриногена СКП-2 во многом схож с механизмом действия другой сериновой протеиназы - плазмина. Протеолиз фибриногена плазмином характеризуется на начальном этапе большим количеством расщеплений в С-концевом участке Аа-цепи. После разрушения протуберанца Аа-цепи фибриногена, открывается доступ к суперскрученном участку между О и Е доменами, по которому происходит протеолиз сначала по Аа-, а затем по ВД- и у-цешм. При этом В(5-цепь расщепляется быстрее, чем у-цепь. Согласно литературным данным, подобный же механизм протеолиза установлен и для других сериновых протеиназ: трипсина, протеиназ лейкоцитов и тромбоцитов, триптазы тучных клеток и а-фибрииогеназ змеиного яда.

Следует отметить, что в начаче работы не было известно, к какому классу ферментов относится используемая нами протеиназа. Только осенью 2008 года были опубликованы данные о структурно-функциональных свойствах этой протеиназы, доказывающие, что СКП-2 является сериновой.

1!- Скрипят коллаляш анализом МАЛДИ <насс-спекгромегрических «фиш ерпринтов» продуктов щтотеелизя коллагеиа.

Подбор условий для получения качественных масс-спектра« гидрояизатов комаНпа.

Коллагены - это группа родственных оелков, обладающих очень высокой прочностью и составляющих основу кожи, хрящей, сухожилий, зубов и крове hoch ых сосудов Особенностью аминокислотной последовательности коллагена является чётко выраженный повторяющийся мотив Gly-Xaa-Yaa, где Ханн 75 % случаев- Pro или Hyp. Па долю глшшна приходится 35 % всех аминокислот, на долю мании а - 11%, пролил и оксипролян составляют 21%.

Главная макроструктурная единица фибриллы коллагена — тропоколлаген, состоящий из трёх суперскученных тяжей (каждый около 1000 а.м.к, рис 5а). Благодаря наличию большого количества внутримолекулярных водородных связей и дополнительных межмолекулярньсх ковалентных поперечных сшивок, коллаген проявляет высокую устойчивость к действию протеолитнчсскйх ферментов. Тем ис менее, известь! так называемые коллагеназы, способные разрушать натнвный коллаген при физиологических условиях

Существует два крайних типа itojuiareftai по действию на коллаген (рис. 56). Например, коллагеназа из Clostridium histolyticum расщепляет суперспираль коллагена в более, чем 200 участках (образуется большое количество низкомолекулярных продуктов, рис. 56-1). Другой тип -тканевые коллагеназы млекопитающих и земноводных - расщепляют коллаген, как бы делая разрез всех трёх цепей в одном месте, перед Gly-750 (образуются 2 продукта с массами й и 'Л ог начальной массы коллагена, рис. 56-2),

тип I

-X-1-Gly-Pio-Y-

а)

б)

>200 сайтов

тип 2

м4 [

3/4

Рис. 5. а) Структура тройной су перепирали коллагена. б) Дм крайних типа действия кол. ¡а ген аз на

коллаген.

Большинство коллагеназ имеют промежуточную специфичность, образуя в процессе гидролиза коллагена продукты различных молекулярных масс. На данный момент наиболее

изучены свойства сериновых, цпстсиновых и мсталлоколлагсназ. Коллагепазная способность протеипаз, имеющих в своем активном центре остаток асиарагиновой кислоты, открыта недавно.

Поскольку состав продуктов реакции коллагенолиза должен быть различен для коллагеназ разных классов, то с помощью МАЛДИ MC можно получить «фингерпринты» шдролизатов и попытаться по ним определить характер действия фермента. Для достижения этой цели необходимо получить набор характеристических масс-спектров продуктов ферментативной деструкции коллагена для каждого класса коллагеназ и выявить сходства и отличия в этих спектрах.

В настоящей работе для получения гидролизатов коллагена с целью их дальнейшего анализа с помощью масс-спектрометрии, были использованы ферментные препараты, содержащие коллагеназы разных классов. Клостридиопептидаза А из Clostridium histolyticum является металлоколлагеназой. Ферментные препараты из Serratia proteomaculans, Dermestes frischi и Dermestes maculatus представляют собой различные цистеиновые коллагеназы. Белковая фракция, полученная при хроматографическом разделении ферментного препарата «Морикраза» из Paralithodes camlschatica в качестве основного компонента содержит сериновую коллагеназу PC.

Для получения «фигерпринтов» реакций коллагенолиза необходимо было решить следующие задачи. С одной стороны, подобрать биохимические условия, в которых выбранные ферменты проявляли бы коллагеназную активность. С другой стороны, подобрать условия нробоподготовки образов для МАЛДИ масс-спектрометрического анализа, при которых получались бы качественные и достоверные масс-спектры гидролизатов коллагена.

На первом этапе работы были подобраны биохимические условия проведения реакций коллагенолиза.

Значение pH реакционной среды было решено зафиксировать на величине 7,5. Выбранное значение pH лежит в области pH-оптимума всех использованных препаратов коллагеназ.

Подбор температуры осуществляли при помощи отрицательного контроля (расщепление коллагена трипсином). Температуру проведения коллагенолиза зафиксировали на величине 22 С, при которой коллагенолитическая активность трипсина полностью отсутсвовала.

Время реакции - 24 часа, было выбрано ввиду того, что при таком времени происходит значительное или полное расщепление коллагена, что позволяет предположить наличие в реакционной смеси после проведения реакции полного набора продуктов гидролиза.

Согласно литературным данным ряд использованных нами ферментных препаратов требует наличия в реакционной среде ионов Са2+. Действительно, в отсутствии ионов кальция способность коллагеназы Dermestes frischi гидролизовать ß- и /-цепи коллагена падает, хотя некоторое накопление продуктов гидролиза а-цепей коллагена наблюдается. В то же время клостридиопептидаза А полностью теряла коллагеназную акгивиость в отсутствии ионов Са2+.

Таким образом, наличие ионов Са2+ в реакционной среде является необходимым условием для проявления всеми ферментными препаратами коллагеназной активности.

Необходимость наличия ионов Са2+ в реакционной среде не позволяет использовать для поддержания рН аммиачно-гидрокарбонатный буфер, рекомендуемый при подготовке образцов белково-пептидных смесей для получения МАЛДИ масс-спектров. Как известно, компоненты буферпых растворов сильно снижают интенсивность пиков молекулярных ионов. В этой связи в качестве буфера был выбран Трис-НС1 (50 мМ), который, согласно литературным данным, оказывает наименьшее влияние на интенсивность пиков белков и пептидов в масс-спектрах.

Для проверки влияния компонентов буферной среды на качество получаемых масс-спектров были проведены эксперименты по гидролизу коллагена препаратом «Морикраза» в аммиачно-гидрокарбоиатном буфере.

Масс-спектр гидролизата в такой буферной системе был идентичен масс-спектру гидролизата, полученному с использованием Трис-НС1 буфера, содержащего ионы кальция (рис. 6, таблица 2). Однако, как и следовало ожидать, при использовании Трис-НС1 буфера интенсивность пиков упала в 4-7,5 раза, что повлекло за собой уменьшение отношения сигнал/шум. Таким образом, использование 50 мМ Трис-НС! буфера, содержащего ионы кальция, позволяет получать удовлетворительные масс-спектры низкомолекулярных продуктов коллагенолиза. Также можно сделать вывод об отсутствии в полученных масс-спектрах пиков аддуктов компонентов реакционной смеси с ионами пептидов. Следовательно, фиксируемые в масс-спектрах пики достоверно относятся именно к ионам низкомолекулярных продуктов гидролиза коллагена. Однако наличие ионов ТРИСа и кальция приводит к тому, что масс-спектры гидролизатов сильно загрязнены матричными пиками в области т/г < 1000. Этим обусловлен выбор нижней границы рассматриваемого нами диапазона масс гидролизатов коллагена.

В пробоподготовке гидролизатов коллагена для масс-спектромстрического варьировались матрицы (ОНВ, НССА и синалиновая кислота (БА)), соотношение раствора матрицы и аналита (об/об: 2/1;1/1;1/2;1/10), методы нанесения образцов на мишень (метод «высушенной капли», «тонного» и «двойного» слоя). В качестве мишеней были использованы стальная плашка и преструктурированньш анкор-чип (Апс1югСЫр™1а^е1). В ряде случаев были применены дополнительные процедуры отмывки и рекристаллизации нанесенных образцов непосредственно на мишени.

Информативные и воспроизводимые спектры МАЛДИ удалось получить лишь для низкомолекулярных фракций гидролизатов коллагена (до 3200 Да) с использованием смеси образца и матрицы НССА (растворенной до насыщения в смеси ацетонитрила с 0,1%-м водным раствором трифторуксусной кислоты (об/об 1/2)) в соотношении 1:1, нанесение на стальную мишень методом «высушенной капли». Для относительно более

с

и

5

Рис. 6. Масс-спектры гидролизатов коллагена препаратом Мормкраза в различных буферных системах: а) - 20 мМ М14НСОз, б) - 50мМ ТРИС-НС1 + 2,5 мМ Са2+.

Таблица 2. Отношение сигнал/шум пиков в масс-спектрах из рис. 6. _

Пик, т/г Отношение сигнал/шум пиков

20 мМ МЬНСОз 50мМ ТРИС-НС1 + 2,5 мМ Са2+

1048 18,7 5.3

1064 44,7 14.5

1071 19,5 12,1

1080 39.4 13,9

1087 7,4 9,3

1126 17,1 5,3

1142 16,4 5,5

1365 11,4 6,0

1422 10,2 5,1

1438 11,9 5,2

1472 13,1 6,5

1493 43,7 8,3

1509 15,7 5,0

1555 8.6 нет

1*Гм

а) МН4НС03 буфер

МЧмямЬвисД«*«*

6) ТРИС-НС1 буфер

т/г

высокомолекулярных фракций гидролизатов коллагена воспроизводимых и информативных масс-спектров ни при каких условиях пробоподготовки получить не удалось.

Среди возможных причин можно предположить несколько. Чем тяжелее молекула, тем сложнее происходит ее десорбция с мишени. Перевод высокомолекулярных соединений в газовую фазу является самостоятельной задачей, требующей в каждом конкретном случае индивидуального подбора матриц и отработки условий эксперимента. Кроме того, известно, что при совместном присутствии нескольких компонентов в ионном источнике происходит подавление сигналов одних компонентов сигналами других. Это обусловлено различным сродством к протону оснбвных аминокислот, присутствующих в структурах различных пептидов (в режиме регистрации положительных ионов), что может проявляться в резком доминировании одних компонентов и дискриминации других. И, наконец, это может быть обусловлено структурными особенностями самого коллагена. Как известпо, фибриллы коллагена состоят из трёх суперскрученных цепей и стабилизированы большим количеством внутримолекулярных водородных связей. Это может приводить к тому, что при кристаллизации совместно с молекулами матрицы коллаген образует плотную полимерную сетку, что и мешает десорбции относительно высокомолекулярных фракций с Мишени.

В результате проведенных экспериментов по получению качественных масс-спектров гидролизатов коллагена были выбраны следующие условия. Состав реакционной среды при проведении коллагенолиза: ТРИС-НС1 + 2,5 мМ Са2+, температура: 22°С, время реакции: 24 ч. Пробоподготовка образца для получения масс-спектров: матрица: насыщенный раствор НССА в смеси ацетонитрила с 0,1%-м водным раствором трифторуксусгюй кислоты (об/об 1/2)), соотношение растворов аналита и матрицы: 1:1, нанесение образца на стальную мишень методом «высушенной капли».

Сравнительный анализ масс-спектров гидролизатов, полученных в результате обработки коллагена типа I ферментами разных классов.

В таблице 3 приведены массы пиков гидролизатов коллагена, полученных под действием всех 5 препаратов, использованных в работе. Из таблицы видно, что для разных препаратов количество пиков гидролизатов коллагена разное. Например, для гидролизатов коллагена, полученных под действием препарата из Clostridium histolyticum, количество пиков в диапазоне масс от 1000 до 3200 Да равно четырем. На наш взгляд это связано с тем, что согласно литературным данным, коллагеназа из Clostridium histolyticum расщепляет коллаген по связям, образованным глицином, более чем в 200 участках. Поскольку глицин занимает каждую третью позицию в аминокислотной последовательности цепей коллагена, то продукты реакции представляют собой пизкомолекулярные олигопептиды с массами менее 1000 Да. Поэтому в использованном нами диапазоне масс эти пептиды не видны.

Таблица 3. Величины т/г пикон для масс-спекгров гидролизатов коллагена, полученных под действием различных коллагена]. Жирным шрифтом выделены одинаковые массы в разных масс-спектрах.

Источник ферментного препарата

С. 1и5Ю1\Псит Р. сатйс1юИса 51. рМеотаси/аю й./гксЫ О. тасиккия

1042 1048 1007 1112 1016 1628

1071 1064 1015 1173 1053 1644

1158 1071 1066 1194 1097 1649

1548 1087 1123 1210 1112 1656

1080 1138 1265 1116 1665

1126 1155 1452 1132 1671

1142 1164 1473 1139 1677

1365 1178 1548 1146 1681

1422 1214 1586 1155 1695

1438 1295 1628 1160 1698

1472 1379 1644 1174 1752

1493 1390 1649 1183 1759

1509 1399 1656 1265 1765

1555 1439 1665 1272 1823

1481 1704 1280 1826

1489 1707 1286 1839

1656 1759 1296 1914

1678 2888 1344 1935

1682 1383 1954

1773 1400 1586

1913 1410 1972

1938 1415 2041

1955 1421 2080

2164 1428 2096

2242 1436 2160

2348 1444 2180

1452 2216

1473 2318

1485 2461

1489 2526

1515 2539

1548 2580

1567 2884

1577 2888

1584 3062

1586 3169

Наибольшее число пиков молекулярных ионов продуктов коллагенолиза (71) присутствует в масс-спектре гидролизата, полученного под действием препарата из О. тасиЫш. Количество пиков в масс-спектрах других гидролизатов колеблется от 14 до 26.

Несмотря на очевидные различия полученных масс-спектров низкомолекудярных продуктов гидролиза коллагена, в каждой сравниваемой паре можно найти общие пики. Степень схожести спектров, т.е. нахождения одинаковых пиков в 2-х масс-спектрах, различна для каждой пары сравниваемых масс-спектров. Так, для масс-спсктров гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ разных классов, максимальная идентичность достигает 35% (сериновая коллагеназа из Р. СатгзсИаИса относительно цистеиновой из 5 РшсотааЛат), а для гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ из близких источников она достигает 77%

(цистенновая коллагеназа из D.frischi относительно цистеиновой коллагеназы из D. mciadalus). Данный факт может быть обусловлен наличием в субстрате (коллагене) часто повторяющихся мотивов Gly-Xaa-Yaa, что увеличивает число возможных пептидов данной массы (то есть при гидролизе могут образоваться пептиды с различной аминокислотной последовательностью, но с одинаковым значением m/z, не различимые с помощью МАЛДИ).

Тем не менее, если убрать из рассмотрения все пики, являющиеся общими хотя бы для одной пары сравниваемых масс-спектров, то в каждом из них обнаруживаются пики, характеристические только для данного образца (таблица 4). Наличие подобных характеристических пиков в масс-спектрах (то есть продуктов гидролиза с определёнными массами) может быть отнесено только к действию конкретного коллагеназного препарата.

Таблица 4. Величины m/z характеристических пиков для масс-спектров гидролизатов

коллагена, полученных под действием различных коллагеназ.

Источник ферментного препарата m/z

С. histolyticum 1042,1158

Р. camlschatica 1048, 1064, 1080, 1126,1142, 1365,1493, 1509,1555

S. proleomaculans 1007, 1066,1123, 1164,1178,1214,1379,1390,1481, 1773, 1938,2164, 2242,2348

D.frischi 1194,1210,1704,1707

D. maculatus 1053, 1097, 1116,1132, 1146,1160,1183,1272, 1280, 1286,1344,1383,1415, 1428, 1436,1444,1485, 1515,1567,1577,1584,1671, 1695, 1698, 1752, 1765,1823,1826, 1839,1935,1972,2041,2080,2096,2160,2180,2216,2318,2461,2526,2539,2580, 2884, 3062,3169

В большинстве исследований метод МАЛДИ не применяется количественно, поскольку для таких экспериментов необходимы многочисленные стандартизации. Тем не менее, как было сказано выше, в первом приближении можно считать, что наиболее интенсивные пика в спектрах МАЛДИ соответствуют молекулярным ионам мажорных компонентов в пробе. Исходя из этих положений, мы решили сравнить масс- спектры гидролизатов коллагена с относительной интенсивностью пиков ионов более 50% (рис. 7).

Результаты сравнения оказались очень интересными: в масс-спектрах коллагена, полученных под действием металлоколлагеназы, сериновой и цистеиновых коллагеназ не оказалось ни одного общего пика. То есть для ферментов определенного класса набор мажорных продуктов является уникальным. Такие различия позволяют сделать вывод о том, что высокоинтенсивные пики являются «фингерпринтом» коллагеназ и могут быть использованы для характеристики действия ферментов на коллаген.

1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1000 1650 1700

Рис. 7. Масс-спектры гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагена! различных классов, содержащие пики с относительной интенсивностью более 50%. а) -металлоколлагеиаза (клострнднопептидаза A Clostridium histolyticum), б) - сериновая коллагеназа (из гспатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschatica), в)-д) -цистеиновые коллагеназы S. proteoniaculans (е); из личинок жуков D. frischi (г); из личинок жуков D. maculatus (д).

Однако, не менее интересен тот факт, что внутри одного класса коллагеназ имеются общие пики в масс-спектрах, что может служить характерным признаком действия ферментов данного класса на коллаген. Так, во всех масс-спектрах продуктов гидролиза коллагена различными цистеиновыми протеиназами есть общий для них пик (m/z = 1656) отсутсвующий в аналогичных масс-спектрах для ферментов других классов (рис. 7, в-д). Ещё один общий пик (m/z = 1452) появляется в масс-спектрах гидролизатов для ферментов, полученных из близких источников: для цистеиновых коллагеназ, выделенных из жуков рода Dermestes (рис. 7, г-д). Такие сходства, по-

видимому, обусловлены накоплением одинаковых продуктов гидролиза коллагена во время реакции под действием ферментов близкой специфичности.

Полученные результаты показывают потенциальную возможность применения МАЛДИ-ВП МС для первичного скрининга коллагеназ по «фингерпринтам» продуктов гидролиза коллагена. Преимуществом данного подхода, является его относительная простота и экспрессность. Дальнейшим развитием работы должно стать расширение круга коллагеназ, получение качественных МАЛДИ масс-спектров гидролизатов коллагена для этих ферментов и выявление характеристических пиков («фингерпринтов»). Наличие необходимого набора спектров даст возможность создать базу данных, содержащую характеристические пики, соответствующие различным образцам коллагеназ. Поиск в такой базе данных как отдельных пиков, так и их совокупности позволит быстро дать ответ о схожести масс-спектра того или иного исследуемого образца с масс-спектрами, имеющимися в базе. Анализ сходств и различий может дать ответ о характере действия того или иного фермента на коллаген.

ВЫВОДЫ

1. Подобран модельный белковый субстрат (бычий фибриноген) для изучения механизма его протеолиза методом триптического МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов реакции. Проведен трипсщголнз и МАДДИ-ВП МС анализ триптичсскнх пептидов высокомолекулярных продуктов протеолиза бычьего фибриногена изоформой сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба в динамике процесса. Впервые показано, что подобный подход позволяет выявлять механизм протеолиза сложно организованных белков.

2. Отработана процедура пробоподготовки реакционных смесей в ходе протеолиза белковых субстратов с целью получения воспроизводимых и качественных спектров МАЛДИ и увеличения выхода сигналов.

3. На основании сравнительного анализа масс-спектров гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ разных классов, выявлено наличие характеристических пиков, относящихся только к действию конкретного ферментного препарата. Обнаружены общие пики в масс-спектрах гидролизатов, полученных под действием коллагеназ одного класса (цистеиновых коллагеназ). Показана потенциальная возможность применения МАЛДИ МС для первичного скрининга коллагеназ по «фингерпринтам» продуктов гидролиза коллагена.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Суцгупов Ю.В., Еремеев H.JI., Лебедев А.Т., Малошнцкая О.А., Рудснская Г.Н., Семенова .А. (2008) Масс-спектрометрический подход к первичному скринингу коллагенолитических ерментов. Биоорганическая химия, том 34, № 3, с. 392-398.

. Сунгуров Ю.В., Еремеев Н.Л., Лебедев А.Т., Малошнцкая О.А., Руденская Г.Н., Семенова .А. (2008) Изучение механизма протеолиза фибриногена масс-спектрометрическим артироеанием продуктов реакции. Масс-спектромстрия, T.S, №4, с. 259-266.

. Eremeev N.L., Lobodin V.V., Rudenskaya O.N., Shmoylov A.M., Sungurov Yu.V.. Lebedev A.T. pplicability of MALDIfor the analysis of collagenase specificity. Abstracts of International Conference 'Biocatalysis-2005: Fendamentals & Applications", June 19-23, 2005, St. Petersburg, Russia, p. 76. . Сунгуров Ю.В.. Лободин B.B., Шмойлов A.M. Определение специфичности коллагеназ с омощъю MALDI-TOF MS. Материалы Всероссийской конференции с международным участием <Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы», 12-16 сентября, 2005, Москва, Россия, МБС-'1.

Еремеев H.JL, Лебедев А.Т., Лободин В.В., Руденская Г.Н., Шмойлов A.M., Сунгуров Ю.В. 2006) Использование масс-спектрометрии для определения специфичности коллагеназ. Вопросы ¡шзико-химической биологии в ветеринарии: Сб. науч. Тр. -М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. крябина, стр. 34-44

). Sungurov Yu.V., Eremeev N.L., Lebedev A.T., Maloshitskaya О.A., Rudenskaya G.N., Semenova \A., Shmoylov A.M. Mass spectrometry approach for the determination of collagenase specificity. \bstracts of The Fourth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects )f Development", March 12-16, 2007, Moscow, Russia, p. 309.

. Семенова СЛ., Сунгуров Ю.В.. Руденская Г.Н., Еремеев Н.Л., Исаев В.А. Динамика гидролиза фибриногена металлопротеиназой камчатского краба. Материалы IV Московского 1еждународного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта, 007, Москва, Россия, Т.1. с. 131.

.. Сунгуров Ю.В.. Еремеев Н.Л., Лебедев А.Т., Малошицкая О.А., Руденская Г.Н., Семенова С.А., Цмойлов A.M. Масс-спектрометрический подход к первичному анализу специфичности юллагенолитических ферментов. Материалы VI Международного симпозиума «Химия ротеолитических ферментов», 23-25 апреля, 2007, Москва, Россия, с. 92.

. Sungurov Yu.V.. Eremeev N.L., Lebedev A.T., Maloshitskaya O.A., Rudenskaya G.N., Semenova .A., Shmoylov A.M. Mass Spectrometric Approach for Determination of Collagenase Specificity. esearch Progress in Biotechnology, Ed.: G. E. Zaikov, 2008, pp. 159-168.

Подписано в печать: 12.03.2009

Заказ №1697 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Матрично-активированная лазерная десорбционно/ 11 /ионизационная (МАЛДИ) масс-спектрометрия биомакромолекул

1.1.1. Общие принципы масс-спектрометрии. Способы 11 десорбции/ионизации

1.1.2. Принцип метода МАЛДИ

1.1.3. Масс-анализаторы в МАЛДИ масс-спектрометрии. 14 Времяпролетный (ВП)-анализатор

1.1.4. Матрицы для МАЛДИ масс-спектрометрии

1.1.5. Качество МАЛДИ масс-спектра и его характеристики

1.2. Пробоподготовка белково-пептидных смесей для МАЛДИ МС 27 анализа

1.2.1. Общие моменты в пробоподготовке аналитов для МАЛДИ МС 27 анализа

1.2.2. Матрицы для МАЛДИ МС анализа белково-пептидных смесей

1.2.3. Подготовка белково-пептидных образцов для получения 32 качественных МАЛДИ масс-спектров

1.3. Использование МАЛДИ масс-спектрометрии для анализа белков 41 и пептидов

1.3.1. Идентификация белков с помощью картирования пептидных 42 масс

1.3.2. Обоснование постгрансляционных модификаций белка с 46 известной аминокислотной последовательностью

1.3.3. Применение МАЛДИ МС в диагностике

1.3.4. Вычислительные инструменты для МАЛДИ МС анализа 49 белков

1.3.5. Проблемы МАЛДИ МС анализа продуктов реакций протеолиза

I.4. Структура бычьего фибриногена и коллагена типа I.

Биохимические подходы к исследованию их протеолиза

1.4.1. Бычий фибриноген

1.4.2. Коллаген типа I

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

II. 1 .Материалы

11.2. Ферментативный гидролиз коллагена типа I и бычьего ^ фибриногена

11.2.1. Гидролиз коллагена типа I

11.2.2. Гидролиз бычьего фибриногена

11.3. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях

11.4. Трипсинолиз белков из геля

11.5. Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа

11.6. Получение МАЛДИ масс-спектров

11.7. Очистка полученных масс-спектров

11.8. Обработка очищенных масс-спектров

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. Изучение механизма протеолиза бычьего фибриногена 85 МАЛДИ масс-спектрометрическим картированием триптических пептидов высокомолекулярных продуктов реакции

III. 1.1. Выбор модельного белка

III. 1.2. Условия получения гидролизатов бычьего фибриногена

III. 1.3. Подбор условий для получения качественных масс-спектров 95 триптических пептидов фрагментов бычьего фибриногена III. 1.4. Исследование механизма протеолиза бычьего фибриногена 100 изоформой СКП-2 с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии III.2. Скрининг коллагеназ при помощи МАЛДИ массспектрометрических «фингерпринтов» продуктов протеолиза коллагена типа I

111.2.1. Условия получения гидролизатов коллагена типа I

111.2.2. Подбор условий для получения качественных масс-спектров 116 гидролизатов коллагена типа I

III. 2.3. Сравнительный анализ масс-спектров гидролизатов, 129 полученных в результате обработки коллагена типа I ферментами разных классов

ВЫВОДЫ

Исследование реакций протеолиза, как правило, сопряжено с решением двух основных вопросов — установлением механизма расщепления белкового субстрата и выяснением специфичности действия протеиназы. Традиционным биохимическим подходом для решения этих вопросов является разделение продуктов реакции (с помощью, например, электрофореза или жидкостной хроматографии) с их последующим анализом (определение молекулярной массы, распределение той или иной метки, иммуноблоттинг, секвенирование и т.д.).

Появление методов мягкой ионизации (электроспрей (ЭС) и матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ)) дало толчок бурному развитию масс-спектрометрии биомакромолекул. Эти методы ионизации сделали возможным переводить большие и чрезвычайно лабильные биомолекулы в газовую фазу и ионизировать их без деструкции. Преимуществом МАЛДИ относительно ЭС является формирование, в основном, однозарядных ионов - таким образом, спектр МАЛДИ белково-пептидных смесей дает возможность определить их качественный состав и массы входящих в них компонентов. Немаловажным фактором также является относительная толерантность метода МАЛДИ к присутствию в анализируемых образцах низкомолекулярных добавок (соли, детергенты, компоненты буферных растворов и т.п.), а так же высокая чувствительность и экспрессность метода.

Изучение возможностей МАЛДИ МС для анализа продуктов протеолиза сложных белковых субстратов, расширяющее использование самого метода, является актуальной задачей. Так, трипсинолиз белка с последующим получением спектра МАЛДИ триптических пептидов («фингерпринта» или «отпечатков пальцев»), которое также называется МАЛДИ-картированием, с его идентификацией по существующим базам данных является в настоящее время рутинной процедурой. С нашей точки зрения аналогичный подход весьма перспективен для изучения механизма протеолиза белков.

Предполагаемый алгоритм эксперимента в этом случае должен включать в себя проведение протеолиза белкового субстрата конкретной протеиназой, отбор проб через определенные промежутки времени, гель-электрофорез проб в денатурирующих условиях (ДДС-гель-электрофорез), трипсинолиз полученных полос, соотнесение полученных в масс-спектре пиков с теоретическими триптическими пептидами исходного белка и определение их положения в полипептидной цепи. Наложение идентифицированных пептидов, а так же массы вычисленной из гёль-электрофореграммы полосы на аминокислотную последовательность белка дает представление о том, какому участку исходной молекулы субстрата принадлежит данный высокомолекулярный продукт протеолиза. Подобный анализ всех полос электрофореграммы в динамике процесса покажет, какие участки белковой молекулы и каким образом подвергаются протеолизу с течением времени. Данный подход реализуем, если степень перекрывания масс триптических пептидов исходного субстрата в пределах определенной погрешности не очень велика. В настоящей работе в качестве модельного белкового субстрата был выбран бычий фибриноген.

Для расщепления белков, помимо трипсина, используют и другие агенты. При этом в зависимости от специфичности действия той или иной протеиназы образующиеся из одного и того же белкового субстрата МАЛДИ «фипгерпринты» сильно различаются между собой. В связи с этим возникает вопрос: возможно ли решение обратной задачи? Можно ли делать какие-либо выводы относительно специфичности действия протеиназ на основе «фингерпринта» продуктов протеолиза, если в качестве субстрата взять один и тот же белок?

Особенно остро этот вопрос стоит при скрининге коллагеназ. Коллагеназы имеют широкое применение в различных отраслях биотехнологии, медицины, промышленности. В зависимости от типа каждого конкретного применения используются различные коллагеназы.

Благодаря особенностям строения и наличию большого количества внутримолекулярных водородных связей и дополнительных межмолекулярных ковалентных поперечных сшивок, коллаген проявляет высокую устойчивость к действию протеолитических ферментов. Тем не менее коллагеназы способны разрушать нативный коллаген при физиологических условиях. Коллагеназы различаются строением активного центра и типом действием на коллаген. Можно ожидать, что набор продуктов гидролиза коллагена будет зависеть от специфичности действия конкретной коллагеназы.

Безусловно, для полной характеристики действия фермента на коллаген необходим анализ первичной структуры продуктов протеолиза, что требует проведения тандемного масс-спектрометрического эксперимента. Однако в случае коллагена масс-спектрометрическое секвенирование пептидов затруднено. Поэтому анализ действия коллагеназ различных классов на коллаген типа I в данной работе был проведен на основе сравнения МАЛДИ «фингерпринтов» продуктов реакций коллагенолиза без использования тандемной масс-спектрометрии.

Следует отметить, что условия проведения биохимических реакций в целом и протеолиза в частности накладывают серьезные ограничения на получение качественных и достоверных МАЛДИ масс-спектров белково-пептидных смесей. Наличие в образце низкомолекулярных добавок (соли, компоненты буферных растворов, детергенты и т.д.) обычно приводит к уменьшению интенсивности пиков молекулярных ионов исследуемых веществ. Тем не менее, при правильном и тщательном подборе условий пробоподготовки удается получить масс-спектры даже таких сложных систем, как биологические жидкости.

Таким образом, отработка условий пробоподготовки образцов для получения воспроизводимых и качественных МАЛДИ масс-спектров и увеличения выходов сигналов (выбор оптимальной матрицы, способа нанесения образца на мишень, процедур отмывки и рекристаллизации, варьирования мощности лазерного выстрела, а также самой подложки-мишени) является отдельной задачей в любом исследовании белково-пептидных смесей методом МАЛДИ масс-спектрометрии.

Целью настоящей работы явилось изучение новых возможностей метода МАЛДИ для определения механизма реакций протеолиза высокомолекулярных белковых субстратов на примере бычьего фибриногена, а также первичного скрининга коллагеназ (выяснение специфичности действия коллагенолитических ферментов разных классов на коллаген).

В работе решались следующие задачи:

1. Выбор модельного белка для изучения механизма его протеолиза методом МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов реакции. Изучение возможности применения МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов протеолиза для установления механизма расщепления бычьего фибриногена изоформой сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба.

2. Отработка процедуры пробоподготовки реакционных смесей в ходе протеолиза белковых субстратов с целью получения воспроизводимых и качественных спектров МАЛДИ и увеличения выхода сигналов.

3. Проведение сравнительного анализа спектров МАЛДИ гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ разных классов. Изучение возможности первичного скрининга коллагеназ по МАЛДИ «фингерпринтам» продуктов гидролиза коллагена.

выводы

1. Подобран модельный белковый субстрат (бычий фибриноген) для изучения механизма его протеолиза методом триптического МАЛДИ-картирования высокомолекулярных продуктов реакции. Проведен трипсинолиз и МАЛДИ-ВП МС анализ триптических пептидов высокомолекулярных продуктов протеолиза бычьего фибриногена изоформой сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба в динамике процесса. Впервые показано, что подобный подход позволяет выявлять механизм протеолиза сложно организованных белков.

2. Отработана процедура пробоподготовки реакционных смесей в ходе протеолиза белковых субстратов с целью получения воспроизводимых и качественных спектров МАЛДИ и увеличения выхода сигналов.

3. На основании сравнительного анализа масс-спектров гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ разных классов, выявлено наличие характеристических пиков, относящихся только к действию конкретного ферментного препарата. Обнаружены общие пики в масс-спектрах гидролизатов, полученных под действием коллагеназ одного класса (цистеиновых коллагеназ). Показана потенциальная возможность применения МАЛДИ МС для первичного скрининга коллагеназ по «фингерпринтам» продуктов гидролиза коллагена.

1. Dempster A. J. A new method of positive ray analysis. // Phys. Rev. 1918. - V. 11. -P. 316-324.

2. Munson M. S. В., Field F. H. I. Chemical ionization mass spectrometry. General introduction. // J. Am. Chem. Soc. 1966. - V. 88. - P. 2621-2630.

3. Beckey H. D., Principles of field ionization and field desorption mass spectrometry. International series in analytical chemistry. Oxford, New York: Pergamon Press. -1977.-335.

4. Benninghoven A., Sichtermann W. Detection, identification and structural investigation of biologically important compounds by secondary ion mass spectrometry.//Anal. Chem. 1978. -V. 50.-P. 1180-1184.

5. Barber M., Bordoli R. S. , Sedgwick R. D., Tyler A. N. Fast atom bombardment of solids (F.A.B.): a new ion source for mass spectrometry. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1981. - P. 325 - 327.

6. Torgerson D. F., Skrowonski R. P., Macfarlane R. D. New approach to the mass spectroscopy of non volatile compounds. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. -V. 60.-P. 616-619.

7. Honig R.E., Woolston R.J. Laser induced emission of electrons, ions, and neutral atoms from solid surfaces. // Appl. Phys. Lett. 1963. - V. 2. - P. 138-141.

8. Fenner N.C., Daly N.R. Laser used for mass analysis. // Rev. Sci. Instrum. 1966. -V. 37.-P. 1068-1072.

9. Vastola F. J., Mumma R. O., Pirone A. J. Analysis of organic salts by laser ionization. // Org. Mass Spectrom. 1970. -V. 3. - P. 101-104.

10. Posthumus N. A., Kistemaker P. G., Meuzelaar H. L. C., Ten Noever de Brauw M. C. Laser desorption-mass spectrometry of polar nonvolatile bioorganic molecules. // Anal. Chem. 1978. - V. 50. - P. 985-991.

11. Hillenkamp F., Kaufmann R., Nitschc R., Unsold E. Laser microprobe mass analysis of organic materials. //Nature. 1975. - V. 256. - P. 119-120.

12. Karas M., Bachmann D., Hillenkamp F. Influence of the wavelength in highirradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. // Anal. Chem. -1985.-V. 57.-P. 2935-2939.