Применение масс-спектрометрии для исследования водорастворимых полисахаридов бурых водорослей и продуктов их ферментативной трансформации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



00348Э937

На правах рукописи

АНАСТЮК Станислав Дмитриевич

¿Ж-

ПРИМЕНЕНИЕ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ И ПРОДУКТОВ ИХ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток 2009

1 4 ЯНВ

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биооргат леской химии Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, Звягинцева Т.Н.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

старший научный сотрудник Кича АЛ.

кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Суховерхое C.B.

Ведущая организация:

Институт органической химии имени Н.Д. Зелинского РАН, г. Москва.

Защита состоится «25» декабря 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, е-таП: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте совета http://piboc.dvo.ru

Автореферат разослан ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полисахариды — одни из наиболее распространенных на Земле биополимеров. Они разнообразны по составу и физико-химическим свойствам, что проявляется в многообразии их свойств и функций. Полисахариды могут выполнять структурные функции (целлюлоза, глюканы клеточных стенок), функции резервных веществ (амилоза, парамилон, ламинараны), водосохраняющие функции, присущие гелеобразующим полисахаридам (гликозаминогликаны и полисахариды водорослей), функции химического узнавания гликопротеинов, связанных с разными клетками.

Водорастворимые полисахариды бурых водорослей (фукоиданы, ламинараны) разнообразны по своей структуре и биологической активности. Фукоиданы -сульфатированные гетерополисахариды - проявляют иммуномодулирующее, антивирусное, противоопухолевое и антикоагулянтное действие, и в настоящее время на их основе разрабатывак>тся биологически активные добавки и лекарственные средства. Интерес к (1—>3);(1—>6)-Р-0-глюканам, к которым относятся ламинараны, связан с их влиянием на системы иммунитета растений и животных.

Несмотря на широкую известность всех этих полисахаридов, имеются трудности с установлением их структуры, которые связаны с тем, что состав и структурные характеристики полисахаридов зависят не только от вида водоросли, но и от сезона сбора, возраста и т.д. Кроме того, строение этих полисахаридов, особенно фукоиданов, отличается отсутствием регулярности и большим разнообразием.

Успешно применяемый в настоящее время подход к установлению структуры фукоиданов с помощью ЯМР-спекгроскопии предполагает использование химической модификации исходного полисахарида с целью упрощения его структуры. Из-за высокой лабильности молекул фукоидана выходы модифицированных препаратов часто невелики, откуда следует, что значительная часть информации о структуре полисахарида, включая информацию о минорных элементах, теряется.

Современные методы масс-спектрометрии позволяют получать надежные и точные результаты, благодаря аналитической гибкости, высокой чувствительности и селективности. Использование тандемной масс-спектрометрии и ферментов (О-гликозилгидролаз, лиаз, сульфатаз) с установленной специфичностью и механизмом действия позволяет устанавливать строение полисахаридов с уточнением положений минорных элементов. Ферментативная трансформация полисахаридов представляет большой интерес, так как позволяет с высоким выходом получать новые препараты с более разнообразной биологической активностью.

Цели и задачи исследования. Целью работы является использование современных методов масс-спектрометрии для установления структурных особенностей водорастворимых полисахаридов бурых водорослей (фукоиданов и ламинаранов) и продуктов их ферментативной трансформации, а также для изучения механизма действия и специфичности ферментов, участвующих в их трансформации. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) используя сочетание масс-спеюрометрических методов, исследовать структурные особенности фукоиданов из бурых водорослей Laminaria gurjanovae, Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Costaría costata и ламинаранов из L.

gurjanovae и L. cichorioides; 2) изучить продукты гидролиза ламинарана из L. cichorioides глюканазамц из Mizuhopeclen yessoyensis и Littorina kurila; 3) изучить трансгликозилирующую способность глюканаз из M. yessoyensis и L. kurila.

Положения, выносимые на защиту.

1. Фукоидан из L. gurjanovae представляет собой галактофукан блочного строения, остатки L-фукозы в котором соединены (1-»3)-гликозидными связями и сульфатированы, равно как и остатки галактозы, по С-2 и С-4.

2. Фукоидан из F. evanescens имеет протяженные участки, построенные из (1—>3)-, чередующихся (1-»3)- и (1-Несвязанных остатков a-L-Fuc, а также фрагменты, содержащие минорные моносахариды Xyl, Gal, GIcA, входящие в его состав. Остатки Fue, Xyl и Gal в основном 2-О-сульфатированы и частично сульфатированы при С-4.

3. Фукоидан изL. cichorioides является высокосульфатированным (1—>3)-а-Ь-фуканом.

4. Разветвления в фукоидане из С. costata, который имеет основную цепь в виде манноглгокуронофукана, представлены присоединенными к GlcA (1-»4)-гликозидными связями олигосахаридами, построенными из 2- или 4-0-сульфатированных остатков фукозы или галактозы.

5. Истинное молекулярно-массовое распределение ламинаранов из L. gurjanovae и L. cichorioides находится в интервалах Glc2i-Glc3« и GIC23-GIC33, соответственно.

6. Ферменты LV из M. yessoensis и G-I из L. kurila являются эндо-(1->3)-Р-0-глгаканазами. Они проявляют трансгликозилирующую активность в присутствии метилглюко- и ксилозидов, а также метанола. Метилгликозиды наиболее предпочтительны в качестве акцепторов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из 4 видов бурых водорослей в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН были выделены 4 образца фукоиданов и 2 образца ламинаранов. Впервые сочетанием масс-спектрометрических методов были исследованы особенности структур новых фукоиданов из бурых водорослей L. gurjanovae и С. costata, определен структурный статус минорных моносахаридов в фукоидане из F. evanescens; изучены ламинараны из L. gurjanovae и L. cichorioides и продукты их ферментативной трансформации новыми ламинарщдаами. Показано, что ферменты проявляют трансгликозилирующую активность в присутствии метанола, метилглюко- и ксилозидов.

В настоящей работе впервые с целью получения доступных для МС-анализа олигосахаридов для деградации фукоиданов были применены сольволитическое десульфатирование и автогидролиз. С помощью МАЛДИ и тандемной ИЭР МС показано, что в условиях сольволиза фукоиданы деполимеризуются до моносульфатированных олигомеров с сохранением минорных включений, МС-методы позволили установить типы гликозидных связей в олигомерах и положение сульфатных групп. Применение автогидролиза привело к получению мультисульфатированных фукоолигомеров, но при этом терялась информация о структуре минорных включений. Показано, что эти методы деградации не приемлемы для низкосульфатированных фукоиданов.

Впервые был применен метод МАЛДИ МС для анализа сульфатированных олигосахаридов с использованием фенилозазона D-эритро-аетазы в качестве матрицы. Установлено, что фукоидан из L. gurjanovae представляет собой галакгофукан блочного строения, поскольку в продуктах его деградации обнаружены фуко-, галакто- и смешанные фукогалактоолигосахариды.

Полученная информация о масс-спектрометрической фрагментации сульфатированных олигосахаридов носит фундаментальный характер и важна для дальнейших исследований связи структуры и биологической активности фукоиданов и других отрицательно заряженных полисахаридов.

Апробация работы Материалы работы были представлены на 4th European Conference on Marine Natural Products, Paris, France, 2005.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 1 тезисы доклада. Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 49 рисунков. Список литературы включает 152 цитируемые работы.

В работе обсуждаются результаты масс-спектрометрического исследования ламинаранов из бурых водорослей L. cichorioides, L. gurjanovae и фукоиданов из бурых водорослей L. cichorioides, L. gurjanovae, F. evanescens, С. costata, а также продуктов трансформации ламинаранов эвдо-глюканазами из морских беспозвоночных. Водоросли L. gurjanovaya и F. evanescens были собраны в экспедициях НИС «Академик Опарин» в Охотском море, соответственно, на побережье о. Большой Шантар и о. Парамушир. Водоросли L. cichorioides и С. costata собраны в бухте Троица (Японское море). Исследуемые полисахариды и ферменты были выделены в лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

В работе использовалось масс-спектрометрическое оборудование ТИБОХ ДВО РАН: времяпролетный МАЛДИ масс-спектрометр Biflex Ш (Bruker, Германия) и тандемный квадрупольно-времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения с двойным ИЭР источником Agilent 6010 (США).

1 МС анализ ламинаранов и продуктов их ферментативной трансформации 1.1 Исследование молекулярной массы ламинарана из Laminaria cichorioides

Ламшшран из L. cichorioides был проанализирован с помощью масс-спектрометрии с матрично-лазерной десорбцией/ионизацией. Масс-спектр ламинарана содержал ионы [Glc„+Na]', п=6-43 от [Glc6+Na]+ с m/z 1013.13 до [Glc43+Naj" с m/z 7006.44 с максимальным

масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением; МАЛДИ МС - иасс-спектромегрия с матрячно-активироваяной лазерной десорбцией/ионизацией; ДИС - диссоциация индуцироваынаж столкновением; MC/MC (МС2) - тандемыая масс-спектрометрия; ТФУ -трифторуксусная кислота; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; УФ - ультрафиолетовый дшшоы; ЦК - инфракрасный диапазон; AnCal -3,6-ангидрогалакгоза; п—степень полимеризации; НехА - гсксуроновая кислота; DHB - 2,5-дигидроксибензойяая кислота.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВЭЖХ - высокоэффективна! жидкостная хроматография; ГЖХ-газ о-жидкостная хроматография; ИЭР МС -

сигналом иона [Glc26+Na]+ с m/z 4253.70. Согласно данным гель-хромато1рафии (рис. 1, б), средневесовая молекулярная масса данного ламинарана составляла 5 кДа; среднечисленная по данным концевого анализа составила 3.2 кДа (Glcm). Максимум с молекулярной массой в 4.2 кДа (G1C26). значение которого получено с помощью МАЛДИ MC, попадает между этими двумя величинами и является наиболее точным значением. Основное количество молекул сосредоточено в интервале 3.7-5.3 кДа (Glc23- GIc33).

2.2 Исследование ламинарана из Laminaría gurjanovae Бурая водоросль L. gurjanovae характеризуется высоким содержанием ламинарана (около 22%), тогда как содержание фукоидана в ней не превышает 3.6%. Ламинаран состоит из двух фракций - растворимой (LgL2) и нерастворимой (LgLl) в холодной воде, в соотношении 1:2.5. Поданным 13С-ЯМР-спектроскопии, нерастворимая фракция ламинарана представляет собой практически линейный (1—►3)-Р-Б-глюкан, растворимая - разветвленный (1—>3);(1—>6)-Р-0-глюкан. В спектрах обеих фракций присутствует минорный сигнал, характерный для маннита (С6, 64.5 м.д.). Ограниченная растворимость «нерастворимого» ламинарана в холодной воде объясняется отсутствием р-(1—>6)-связанных остатков глюкозы. Молекулярные массы образцов растворимого ламинарана, по данным гель-хроматографии, распределились в интервале между 6 и 25 кДа с максимумом около 10 кДа (рис.1, а). Согласно этим данным, L. gurjanovae содержит фракцию ламинарана, молекулярная масса которого в несколько раз превышает молекулярную массу ламинарана из L. cichorioides,

величина которой характерна для известных ламинаианов буоых водорослей.

Л-wu 1.6

: 200-

300-

250-

LcL

LgL2

LgLl

ШтШт

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/г

Рис. 1. а) Гель-хроматография (Superdex 75 HR 1030 (1.5x30 см) ламинарана из L. cichorioides (LcL), «нерастворимого» (LgLl) и «растворимого» (LgLl) ламинарана из L. gurjanovae. Стандарты - декстраны (Sigma, США) с мол. массами 10, 20, 40, 80 кДа. б) МАЛДИ масс-спектр положительных ионов «растворимого» ламинарана из L. gurjanovae.

Однако эти значения находятся в противоречии с данными, полученными методом МАЛДИ МС (рис.1, б), из которых следует, что молекулярно-массовое распределение ламинарана из Ь. gurjanovae с максимумом при 4 кДа практически не отличается от такового

для Ь. ЫскогШ(1ез. Разница лишь в том, что в масс-спектре ламинарана из I. гуапоуае уверенно регистрируются молекулы с массой до 11 кДа, а в масс-спектре ламинарапа из Ь. ас/юпо1с!ез только до 7 кДа. Однако, доля молекул с высокой молекулярной массой невелика как в том, так и в другом случае. Можно предположить, что причиной, вызывающей завышение молекулярных масс ламинаранов, регистрируемых при гель-хроматографии, служит склонность молекул полисахарида к агрегации или отличная от глобулярной пространственная конформация их молекул.

1.2 Гидролиз ламинарана из L. cichorioides эидо-(1—>3)-р-0-глюканазон из М. yessoensis Из кристаллического стебелька двустворчатого моллюска Misuhapecten yessoensis бьиа выделена эндо-(1—»3)-Р-0-ппоканаза LV. С помощью МАЛДИ MC было установлено, что очищенный фермент катализировал гидролиз ламинарана с образованием глюкозы [Glc+Na]+ с m/z 203.1 (на спеюре не показано), ламинарибиозы [Glc2+Na]+ с m/z 365.1 и высших олигосахаридов [Glc„+Na]+, л=3-11 (рис.2).

Рис. 2. МАЛДИ масс-спектр продуктов исчерпывающего гидролиза ламинарана из L. cichorioides эндо-(1—»3)-р-0-глюканазой LV из М. yessoensis. Время инкубации -60 мин.

jtw*

JA«

LI

JL

Содержание глюкозы было определено глюкозооксидазным методом и составляло 40 % от всех продуктов реакции. Интенсивность иона [Glc+Na]+ была очень мала и не соответствовала реальному содержанию глюкозы в смеси, установленному химическими методами. Стоит отметить, что наибольшую интенсивность в масс-спектре продуктов исчерпывающего гидролиза ламинарана имел сигнал иона [Glc3+Na]+ с m/z 527.1.

Рис. 3. МАЛДИ масс-спектр продуктов трансгликозилирования, полученных под действием эндо-(1—»3)-Р-Б-глюканазы LV из М. yessoensis на ламинаран из L. cichorioides в ! присутствии акцептора Me-ß-D-Glcp.

I, '

Таким образом, с помощью MC-анализа было подтверждено, что глюканаза LV из М. yessoensis гидролизовала ламинаран по эндо-типу действия. Кроме того, получена точная информация о составе олигосахаридных продуктов ферментативной реакции, причем время анализа по сравнению с известными методами сокращается более чем на порядок.

Свойство эндо-(1—»3)-р-0-глюканазы LV из М. yessoensis катализировать реакцию трансгликозилирования было исследовано с помощью МАЛДИ масс-спекгрометрии. На рис.3, приведен МАЛДИ масс-спектр реакционной смеси на начальной стадии реакции. Как видно из спектра, к сигналам ионов глюкоолигосахаридов (рис.2) добавились сигналы, отстоящие от них на 14 Да, которые были идентифицированы как метилглюкоолигозиды.

Стоит отметить, что наибольшую интенсивность имел сигнал иона метилглюкотриозида [Glc3Me+Na]+ с m/z 541.2, в то время как интенсивность остальных сигналов продуктов переноса была сопоставимой с сигналами ионов продуктов гидролиза.

1.3 Гидролиз ламинарана из L. cichorioides эндо-(1—>3)-р-В-глюканазой из L. kurila

Фермент G-I, эффективно катализирующий гидролиз ламинарана, был выделен из брюхоногого моллюска Littorina kurila. Тип действия и каталитические свойства данного фермента были изучены химическими методами с привлечением МАЛДИ MC.

С помощью МАЛДИ MC было установлено, что очищенный фермент катализировал гидролиз ламинарана с образованием глюкозы [Glc+Na]+ с m/z 203.1, ламинарибиозы [Glc2+Na]+ с m/z 365.1 и высших олигосахаридов [Glc„+Na]+, «=3-14 (рис.4).

соответствует действительности. По данным ВЭЖХ глюкоза составляла 29% от общего количества олигосахаридов. Необходимо отметить, что наибольшую интенсивность (исключая глюкозу, сигнал которой не соответствует реальному содержанию) в масс-спектре продуктов исчерпывающего гидролиза ламинарана имелся сигнал иона ламинаритетраозы [Glc4+Na]+ с m/z 689.1, сопоставимый по интенсивности с сигналом иона [Glc5+Na]+ с m/z 851.2. Таким образом, глюканаза G-I из L. kurila гидролизовала ламинаран по эндо-типу

действия с образованием глюкотетра- и пентаозы в качестве основных продуктов реакции среди олигомеров, в то время как для ламинариназы ЬУ из М. уазоею^ основной продукт среди олигосахаридов был глюкотриозой.

Известно, что различия в продуктах ферментативной реакции связаны со строением активного центра ферментов, в частности, с размерами гликозидной и агликоновой частей активного центра. Можно предположить, что активный цешр ламинариназы С-1 более протяженный, чем у ЬУ.

1.4 Трансглнкозилирование, катализируемое эндо-(1 —>3)-р-0-глгоканазой из £. киг'йа

Способность катализировать реакцию трансгликозилирования, как уже упоминалось, свойственна ферментам, сохраняющим в процессе гидролиза аномернущ конфигурацию. С помощью МАДЦИ МС было показано, что эндо-(1—►3)-р-С-глюк2наза С-1 обладала такой активностью. В качестве донора был использован ламинаран из £. а'сЛоп'иУе^, а в качестве акцепторов - метанол, метил-р-О-ксило- и глюкопиранозид (рис.5). Количество гидролитических единиц В было одинаковым в случае использования в реакции всех трех акцепторов. Масс-спектрометрический анализ образующихся в процессе реакции продуктов проводили на начальных стадиях реакции.

Продукты гидролиза (глюкоолигосахариды) и трансгликозилирования (метилглюкоолигозиды) были обнаружены с помощью МАДЦИ МС (таблица 1). Глюканаза С-1 катализировала реакцию трансгликозилирования наиболее эффективно с использованием метил-р-В-глюкопиранозида в качестве акцептора (рис.5).

Таблица 1. Продукты трансгликозилирования, образующиеся под действием эндо-(1—>3)-Р-О-глюканазы С-1 в присутствии различных акцепторов и ламинарана из Ь. Ыскопо1(1ех в качестве донора.

Акцептор Продукт [М+№|т, т/г

МеОН асОМе асзОМе ас3ОМе 01с„0Ме ИсзОМе ЙСбОМе ас7ОМе

217.1 379.1 541.2 703.2 865.3 1027.3 1189.4

Ме-Р-О- ИсгОМе асзОМе Ис^ОМе 01с50Ме 01с«;0Ме С1с7ОМе ИсОМе

Иср 379.1 541.2 703.2 865.3 1027.3 1189.4 1351.4

Ме-р-О- ИсХу! 01с2Ху1 С1с3Ху1 ОкДу! С1с5Ху1 вкбХу! С1с7Ху1

Ху1р ОМе ОМе ОМе ОМе ОМе ОМе ОМе

349.1 511.1 673.2 835.3 997.3 1159.4 1321.4

Интенсивность сигналов продуктов трансгликозилирования превышала таковую для продуктов гидролиза. Масс-спектрометрическое исследование продуктов, полученных под действием фермента в присутствии 20% метанола, выявило, что количество глюкоолигосахаридов превышало количество метилглюкоолигозидов. Вероятно, на начальном этапе реакции метанол оказывал ингибирующее действие на фермент и сдвигал равновесие реакции в сторону гидролиза.

На масс-спектре продуктов трансгликозилирования, полученных на начальных этапах реакции (рис.5), отчетливо виден сигнал, отстоящий от пика иона [01сз+Ыа]+ с т/г 521.2 на 2 Да. Очевидно, что этот сигнал принадлежит иону [01с2Нехо1+№]+, который представляет

собой ламинарибиозу, содержащую остаток Б-маннита, находящийся на восстанавливающем конце полисахаридной молекулы ламинарана. Присутствие этого сигнала означает, что фермент имеет склонность атаковать субстрат ближе к восстанавливающему концу, что было показано ранее для глгоканаз ЛГУ из моллюска 8рЬи1а йассЬаУтепхЫ и ЛЗ из СЫати сйЫйш.

Рис. 5. МАЛДИ масс-спектр продуктов трансгликозилирования, полученных под действием эндо-(1—»3)-(5-В-глгоканазы из I. кигНа в присутствии акцептора Ме-Р-Б-Иср и ламинарана из I. сг'сйологУа? в качестве донора; символом «я» отмечет! продукты реакции трансгликозилирования.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mfc

Таким образом, использование масс-спектрометрии позволяет быстро и эффективно регистрировать продукты гидролиза и трансгликозилирования одновременно. Чувствительность и селективность метода позволяет регистрировать олигомерные продукты, образующиеся в незначительных количествах, регистрация которых с помощью ВЭЖХ затруднена или невозможна.

2 Масс-спектрометрический анализ фукоидаяов из бурых водорослей 2.1 Исследование фукоидана из L. gurjattovae

Высокоочищенная фракция высокосульфатированного фукоидана LgF2 была выделена из бурой водоросли L. gurjattovae ионообменной хроматографией. Фракция имела гетерогенный моносахаридньш состав* с приблизительно равным соотношением L-Fuc:D-Gal. В ИК-спектре фракции LgF2 наблюдалось характерное для сульфатных групп поглощение при 1267 см'1 (S=0 колебания). Имелись также полосы поглощения при 851 см"1 и 828 см'1, из чего следовало, что сульфатные группы в фукоидане находятся в аксиальном положении (С-4), а также в экваториальной позиции (С-2 или С-3) остатков фукозы или галактозы. Значения молекулярных масс LgF2, определенных гель-проникающей хроматографией, находились в интервале от 15 до 60 кДа. Спектр 13С-ЯМР фукоидана LgF2, подобно спектрам большинства фукоиданов водорослей, содержал большое количество плохо разрешенных сигналов. Анализ спектра показал, что в молекулах фукоидана имеется заметное количество ацетатных групп, тогда как число свободных ОН-групп при С-6 галактозы невелико.

' Моносахаридньш состав фукоидана LgF2 из L.gurjanovae (ВЭЖХ, мольный%): Fue—48.2%, Xyl—3.1%, Man —1.5%, Gal—4-5.5%

Для масс-спектрометрического исследования фукоидан LgF2 бьш различными способами деполимеризован. Образец LgF2 предварительно дезацетилировали, а затем десульфатировали и получили препарат LgF2-DS. При десульфатировашш наряду с отщеплением сульфатных групп произошла деполимеризация исследуемого фукоадана. Состав образовавшихся при этом олигосахаридов (экстрагированных метанолом) анализировали методом МАЛДИ MC. В масс-спектрах положительных и отрицательных ионов, кроме сигналов ионов моносахаридов, были обнаружены сигналы ионов фукоолигосахаридов [Fuc„+Na]+ (н=2-11) и [Fuc„S03]" (л=2-П). Присутствие в спектрах сигналов, отстоящих от пиков фукоолигосахаридов на 16, 32, 48 Да, показывало наличие в смеси олигомеров, состоящих из остатков фукозы и гексозы, идентифицированной как галактоза ([Fuc„-„Hexm+Na]f; «=4-6, даг=1-3 и [Fuc, „IIex„SOjJ'; «=3-6, т=1-2.

Таким образом, анализ спектров показал наличие фукоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 11 и смешанных олигосахаридов, содержащих в своем составе фукозу и галактозу (например, Fuc3Gal3). Олигосахариды, содержащие НехА, отсутствовали.

В МАДДИ масс-спектрах продуктов частичного кислотного гидролиза (LgF2-Iil80) дезацетилированного образца фукоидана LgF2 были обнаружены моносульфаты фукозы и галактозы. Также в спектрах присутствовали ионы вида [GaLSOiNa+Na]* (п=2-3); [Gah+Na]* (п=2-5) и [Gal„S03]~ (я=2-3), полученных в соответствующих режимах регистрации и принадлежащих сульфатированным галактоолигосахаридам со степенью полимеризации от 2 до 5, фукоолигосахариды отсутствовали. Очевидно, что фрагменты молекул полисахарида, построенные из остатков фукозы, в условиях кислотного гидролиза разрушаются быстрее, чем в процессе сольволитического десульфатирования.

В продуктах частичного расщепления фукоидана LgF2 из L. guijanovae, образовавшихся в процессе сольволилиза и частичного кислотного гидролиза, методом МАЛДИ масс-спектрометрии обнаружены фуко- и галактоолигосахариды, а также смешанные олигосахариды, построенные из фукозы и галактозы. На этом основании предполагается, что фукоидан является сульфатированным галактофуканом (Fuc:Gal ~ 1.0:0.8). Образец, полученный экстракцией этанолом из препарата LgF2-DS, был проанализирован с помощью ИЭР МС/МС с целью получения структурных характеристик сульфатированцых моно- и олигосахаридов, обнаруженных в нем с помощью МАЛД И MC.

Масс-спектр ИЭР содержал только ионы моносульфатированных фукоолигосахаридов (я=2-3), а также ионы FucS03" и GalS03\ По всей видимости, в процессе хранения препарата в растворе протяженные фуко- и галактозосодержащие олигосахариды разрушились.

При отнесении сигналов фрагментных ионов была использована номенклатура, предложенная Домоном и Костелло, рис.6. При интерпретации МС/МС спектров были использованы следующие положения, базирующиеся на более ранних исследованиях сульфатированных дисахаридов, полученных из гепарина и хондроитина: при внутрикольцевом разрыве (1—+3)-связанных Сахаров не образуются 0ДХ- / "дА-ионы. Этот факт доказывает, что атом водорода при гидроксильной группе атома С-3 играет ключевую роль в формировании 0,2Х- и 0,2А-ионов в процессе фрагментации, что было подтверждено более ранними исследованиями сульфатированных гексоз. Напротив, при фрагментации фукоолигосахаридов из A. nodosum, содержащих помимо (1—>3)-связанных значительное

количество (1—»4)-связанных фрагментов, ионы "^Х и "■'А образовывались и были весьма интенсивными. Однако, установить какой тип связи преобладает в таком случае затруднительно, поскольку, как уже было отмечено выше, характерные ионы при замещении атома водорода при гидроксильной группе атома С-3 не образуются.

V, '-% У, /., V,- /„

ОИ

Восстанавливающий

в. С; в, Cj

Рис. 6. Номенклатура, используемая для описания продуктов масс-спектрометрической фрагментации, предложенная Домоном и Костелло.

Анализ тандемного ИЭР масс-спектра (рис.7, а) интенсивного иона [FucS03Na-Na]" с m/z 243.017 дал следующие результаты: в смеси одновременно присутствовали ионы 0,2Х с т/ z 138.969 (от остатков 2-О-сульфатировагоюй фукозы) и менее интенсивные ионы 0,2А с m/z 182.996, свидетельствующие о сульфатировании остатков фукозы при С-4.

йо.б <

!х он

■OjSt

3.75 ■ с 3.5-^3.25;

| гт;

» 2.5Н

1 2'25': „

g 2; Ж

| 1:75 : s о 1.5 i

S 1:25 | 1 i

0:75 : 0.5 I 0,25 !

CHjOH "А

X

он

OSOj-

140 150 1G0 170

190 200 210 220 230 240

140 150 160 170 130 190 200 210 220 230 240 250 260

Рис. 7. Тандемный ИЭР масс-спектр ионов а) [FucS03Na-Na]" и б) [GalS03Na-Na]' с m/z 243.017 и 259.020, соответственно.

Самый интенсивный ион с m/z 96.963 соответствовал отрыву HSO4" (на всех МС/МС спектрах этот ион присутствует). Полученные результаты согласуются с данными ИК-спектроскопии. Спектр также содержал минорный сигнал иона с m/z 168.982, связанный с двойным разрывом кольца по типу °,3Х. Еще один минорный сигнал с m/z 164.984 образуется, вероятно, при потере молекулы воды фрагментом 0iA с m/z 182.996. MC/MC спектр иона сульфатированной галактозы [GalS03Na-Na]" с m/z 259.020 (рис.7, б) также содержал ион с m/z 138.969, несущий информацию о 2-О-сульфатаровашш остатка галактозы и ион "^А с m/z 182.996, несущий информацию о 4-0- или 6-О-сульфатировании остатка галактозы. Последний сигнал имел более высокую интенсивность. Спемр также содержал достаточно интенсивный ион с m/z 168.982, связанный, вероятно, как и в случае с фукозой, с двойным разрывом кольца по типу WX. Он не наблюдался в ИЭР МС/МС спектрах ионов Gal40S03" или GaI60S03", а также Glc30S03", исследованных в предыдущих работах. Причиной появления этого сигнала могут быть более жесткие условия ионизации.

MC/MC спектр иона сульфатировашюй фукобиозы [Fuc2SOjNa-Na]" с m/z 389.075 (рис.8) имел ряд отличий от картины ДИС МС/МС аналогичного фрагмента из фукоидана А. nodosum который имеет большую долю (1-*4)-связанных остатков фукозы в структуре. В отличие от МС/МС спектра фукобиозы из A. nodosum, анализируемый спектр не содержал ионов 0,2Аг, образующихся при наличии (1—>4)-связи между остатками фукозы в молекуле, при сульфагированин невосстанавливающего остатка фукозы.

»10 3 5,5 5

4.5-

и 4 О

ю 3.5

S

ü 3 X ä

о

5 2

О

< 1,5 1

[MNa-Naf ß

140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 230 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 m/2

Рис. 8. Тандемный ИЭР масс-спектр иона [Fuc2S03Na-Na]" с m/z 389.075.

В спектре присутствовал ион 0,2Xi с m/z 285.028, который указывал на 2-0-сульфатирование невосстанавливающего остатка фукозы, и, возможно, сульфатирование восстанавливающего остатка фукозы. Сигнал иона 0,2Хо с m/z 138.969 невысокой интенсивности также свидетельствовал о 2-О-сульфатировашш восстанавливающего остатка фукозы. Как уже было отмечено (стр.11-12), указанный сигнал образуется в случае доступности протона при гидроксиле атома С-3 остатка фукозы на восстанавливающем конце, что означает наличие некоторого (небольшого) процента ионов Fuc-(l->4)-Fuc2SOj" в исследуемой смеси. Ион 0,3Х| дополнительно указывал па 2-О-судьфатирование невосстанавливающего остатка фукозы, что также было показано ранее с помощью MC3 эксперимента. Наличие минорного фрагмента wAj с m/z 182.995 также свидетельствовало о 4-О-сульфатировании остатка фукозы на невосстанавливающем конце.

Таким образом, МС/МС анализ иона [FiK^SOsNa-Na]" показал наличие в смеси фрагментов Fuc2S03'-(l->3)-Fuc, Fuc-(l-»3)-Fuc2S03"co следами Fuc4S03"-(l-»3)-Fuc.

Анализ тандемного ИЭР масс-спектра [FucjSChNa-Na]", базирующийся на тех же принципах, что и анализ сульфатировашюй фукобиозы, показал отсутствие фрагменткых ионов, несущих информацию о 4-О-сульфатировании остатков фукозы, остутствие ионов 0ДА и низкую интенсивность сигналов ионов 0,2Х. Это позволяют предположить, что фрагменты сульфатировашюй фукотриозы имеют структуру Fuc2SOy(l-»3)-Fuc-(l-»3)-Fuc, Fuc-(l->3)-Fuc2S03"-(l-»3)-Fuc, с незначительным содержанием (1->4)-связанных остатков Fue. Таким образом, суммирование масс-спекгрометрических данных позволяет утверждать, что остатки a-L-фукозы в цепи фукоидана из L. gurjanovae соединены (1->3)-связью и сульфатированы при С-2 и реже при С-4.

2.2 Исследование фукоидапа из Fucus evanescens

В литературе имеются сведения об установлении структуры двух различных фракций фукоидана, выделенных из бурой водоросли F. evanescens. M. Билан и соавторы показали, что основная цепь фукоидана из F. evanescens представляет собой линейный полимер,

построенный из остатков фукозы___с__чередующимися (1->3)- и (1—>4)-евязями,

сульфатнровашшми в основном при С-2 и частично ацетилироваяными (по данным ЯМР-епсктроскопии и метилирования). М. Кусайкин с соавторами выделили из F. evanescens фракцию фукоидана, содержащую приблизительно в 3.5 раза больше (1->3)-, чем (1-й)-связанных остатков фукозы. В обеих работах представлены данные моносахаридного состава фукоидана, содержащего помимо фукозы ксилозу, глюкозу и галактозу. При этом положение этих минорных компонентов в структуре фукоидана не было установлено.

Исследуемый нами образец FeF2 был выделен по методике, описанной в работе М. Кусайкина с соавторами. В условиях сольволитического десульфатирования этого фукоидана помимо полимерной фракции был получен набор олигосахаридов, как и в случае с фукоиданом из L. gurjanovae. Экстракцией метанолом из реакционной смеси была получена пригодная для масс-спектрометрического анализа олигосахаридная фракция Fe-dSlraf. По данным МАЛДИ MC положительных ионов, фракция Fe-dSlmf содержала набор интенсивных пиков, соответствующих ионам [Fuc„+Na]+ (л=1-6), и менее интенсивные сигналы, соответствующие смешанным олигосахаридам, в которых один или несколько остатков фукозы замещены остатком другого моносахарида, например, [FuciPenti+Na]+ с m/z 319 Да и [FuciHexi+Na]+ с m/z 349 Да, отстоящих от иона [Fuc2+Na]+ с m/z 333 Да на -14 и +16 Да соответственно. Таким образом, несульфатированные олигосахариды, содержащие остатки пентозы и гексозы были найдены в МАЛДИ масс-спектре фракции Fe-dSImf: [Fuc„Pent+Naf, «=2-6 и [Fuejíex+Naf, п=2-6.

МАЛДИ масс-спектр отрицательных ионов содержал набор интенсивных пиков, соответствующих ионам моносульфатированных моно - и фукоолигомеров со степенью полимеризации 2-4. Фракция Fe-dSlmf была разделена с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Фракция 1 (Fe-AFl) , не задержавшаяся на колонке, была проанализирована с помощью ИЭР MC отрицательных ионов. Высокая чувствительность тандемного ИЭР масс-спектрометра с времяпролетным анализатором позволила обнаружить не только сульфатированные компоненты, но и олигомеры, содержащие уроновую кислоту, для большей части из которых также были получены МС/МС спектры. По результатам изучения моносахаридного состава* фракции Fe-AFl пентозе соответствует D-ксилоза (Xyl), гексозе -D-галактоза (Gal), уроновая кислота была идентифицирована как D-ппокуроновая (GlcA). Полная информация по составу данной фракции отображена в таблице 2. Из анализа литературных данных следует, что наличие в фукоидане из F. evanescens сульфатированной ксилозы (т/г 229.006) и галактозы (m/z 259.018), а также олигомеров, содержащих уроновую кислоту ([Fuc„G!cA-Na]", л=1-3) было показано нами впервые.

' Моносахаридный состав фукоидана FeF2 из F.evanescens: (ВЭЖХ, молышй%): Fue—93%, Xyl—2.8%, Man— 0.2%, Gal—4%.

' Моносахаридный состав фракции Fe-AFl (ГЖХ ацетатов полиолов, мольный %): Fue—72.8%, Xyl—5.2%, Gal —4.6%, GlcA—17.4%.

Таблица 2. Получештые с помощью ИЭР MC значения m/z основных и минорных (*) низкомолекулярных продуктов сольволитического десульфатирования (фракция Fe-AFl) фукоидана из F. evanescens.

m/z Состав m/z Состав m/z Состав

»229.000 [XyliSOjNa-Na]' 389.076 [FuCiSOjNa-Na]' 535.133 [FucjSOjNa-Na]'

243.018 [FuCiSOjNá-Na]" »405.071 [FuciGabSOjNa-Na]' »551.128 [Fuc;Gal,SOjNa-Na]'

♦259.013 [Gai|SOjNa-Na]" »421.060 [GabSOjNa-Na]' »567.125 [FucjGabSOiNa-Na]"

»339.093 [FucjGlcA,]" 485.151 [FuczGlcAi]" »631.209 [FucjGIcAi]'

»375.060 [FuciXyliSOjNa-Na]' »521.118 [Fuc2Xyl i SOjNa-Na]' »681.191 [Fuc.SOjNa-Na]"

На следующем этапе ионы, наблюдаемые в ИЭР масс-спектре, были подверпгуты фрагментации с целью извлечения структурной информации. Стоит отметить, что каждый пик в этом спектре может содержать несколько изомеров, отличающихся положением сульфатных групп, типом связи, положением остатков различных моносахаридов и др. Однако, благодаря характеристичным фрагментам, нередко становится возможным установление структурных особенностей каждого из таких компонентов.

Картина распада минорного иона с m/z 229.003, соответствующего [XylS03Na-Na]', практически совпадала с таковой для сульфатированной фукозы (рис.7, а). Фрагменты с m/z 138.970 и 168.979 соответствовали двойным разрывам связей внутри кольца. Первый иоп0,2Х свидетельствовал о 2-0-, а второй - 0iА - о 4-О-сульфатировашш остатка ксилозы. Таким образом, смесь одновременно содержала ионы Xyl2S03"- и Xyl4S03".

Тандемный масс-спеетр минорного иона [FuciXyliS03Na-Na]' с m/z 375, содержащего ксилозу, представлял более сложную фрагментационную картину. Наличие ионов 0,2Xi с m/z 271.008 и 285.032, а также °'3Xi с m/z 301.012 указывало на 2-О-сульфатирование остатков фукозы и ксилозы. Ионы одХо и0,2А2 с относительно высокой интенсивностью (последний ион также указывает на сульфатирование невосстанавливающего конца дисахарвда) свидетельствовали о (1-»4)-связи между остатками фукозы и ксилозы. Попытка получить однозначные данные из МС/МС спектра иона [Fuc2XyliS03Na-Na]" с m/z 521.126 успехом не увенчалась. Таким образом, в смеси были обнаружены 2-О-сульфатированные фрагменты Fuc-(l->4)-Xyl, Xyl-(1—>4)-Fuc со следами 4-О-сульфатирования.

На рис.9 представлен МС/МС спектр иона невысокой интенсивности [FuciGlcA-Na]" с m/z 339.093. Самый интенсивный фрагментный ион 0,2Xi с m/z 235.046 несет информацию о разрыве двух связей внутри кольца невосстанавливающего остатка фукозы. Вероятно, что аномально высокая интенсивность этого фрагмента обусловлена присутствием в смеси структурного варианта GlcA-(l—>2)-Fuc, при этом фрагмент 0,2А'2 имеет указанное m/z, Фрагмент 2,5А2 с m/z 261.061 (рис.9), как уже отмечалось, характерен для уроновых кислот, находящихся на восстанавливающем конце. Фрагментный ион 0,2А2 с m/z 279.067, имеющий низкую интенсивность и, как упоминалось ранее, несущий информацию о типе связи, свидетельствовал о наличии в смеси преимущественно структур Fuc-(1—>3)-GlcA и GlcA-(l->2)-Fuc с небольшим количеством Fuc-(l->4)-GlcA.

iJX, "--A',

o и

Ю ; <

|MNa-Na]"

1711 160 130 200 210 220 2S0 240 250 260 270 280 2SÛ 500 310 320 330 340 m/Z

Рис. 9. Тандемный ИЭР масс-спектр иона [FuciGlcA-Na]" с m/z 339.093.

Фрагментационные картины ионов невысокой интенсивности [Fuc2GlcA-Na]" с m/z 485.158 и [Fuc3GlcA-Na]" с m/z 631.204 были сходными, поэтому остановимся на описании МС/МС спектра иона более сложного строения, представленного на рис.10. Спектр содержал

интенсивные ионы, соответствующие разрывам гликозидных связей.

«10"

37535

G

I 3 § 2.75-g 2.5? 2.25-

I 2-

У .

13 1.75 < 1.5

0.75 0.5 0.25

lao 200 220 243 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 4S0 500 520 540 560 580 600 620 640 т/2

Рис. 10. Тандемный ИЭР масс-спектр иона [Fuc3GlcA-Na]" с m/z of 631.204.

Ионы Z3 и Y3 с m/z 467.140 и 485.147 соответствовали отрыву фукозы и ее дегидратированной формы; ионы Z¡a Y¡ с m/z 321.083 и 339.097 соответствовали отрыву фукобиозы и ее дегидратированной формы с невосстанавливающего конца и т.д. Спектр также .содержал фрагментные ионы 2,5A4 и 0,2А4 с m/z 553.174 и 571.189, позволившие локализовать положение GlcA в молекуле (рис.10). Масс-спектр не содержал ионов 0,3А или МХ, которые свидетельствуют о наличии разветвлений. Отсутствие сульфатных групп, влияющих, по-видимому, на интенсивность сигналов СДХ, а также установленное положение уроновой кислоты позволило полуколичественно сравнить интенсивности 0|2Х-фрагментов. Фрагментами ион 0,2Х3 с m/z 527.159 имел наибольшую интенсивность из-за наличия незамещенного протона при гидроксиле С-3. Фрагментный ион ИХ2 с m/z 381.102, имел

значительно меньшую интенсивность. Интенсивность фрагмента 0ДХ1 с m/z 235.045 (рис.10) была примерно в 3 раза выше.

Фрагментный ион0,2А) с m/z 571.204 имел низкую интенсивность. Отсюда следует, что наиболее вероятная структура иона [FucjGlcA-Na] имеет вид Fuc-(1—>3)-Fuc-(l—>4)-Fuc-(1—>3)-GIcA. Как уже упоминалось, анализ МС/МС-спектра иона [FuCíGlcA-Na]" с miz 485.151 свидетельствовал о преобладании структуры Fuc-(1—»4)-Fuc-(l—»3)-GlcA. В работе М. Билан (2002г.) было установлено, что выделенная авторами фракция фукоидана из F. evartescens имеет линейную цепь, построенную из сульфатированных остатков фукозы с чередующимися (1—>3)- и (1—»4)-связями. Подобные фрагменты, связанные с глюкуроновой кислотой, обнаружены нами в исследуемой фракции фукоидана.

Использование тандемной масс-спекгрометрии позволило установить структурное значение еще одного минорного компонента - галактозы. МС/МС спектр иона [GalSOjNa-Na]" с m/z 259.018 значительных отличий от подобного спектра сульфатированной галактозы из L. gurjanovae (рис.7, б) не имел. Анализ МС/МС спектра иона [GaUSOjNa-Na]' с m/z 421.060, имеющего очень низкую интенсивность, позволил установить следующее. Ион 0,2Хо с m/z 138.970 указывал на 2-О-сульфатирование восстанавливающего остатка галактозы. Фрагментные ионы °'2Xi с т/г 301.022 и 0,3Xi с m/z 331.032 свидетельствовали о 2-0-сульфатировании невосстанавливающего остатка галактозы. Фрагменты, характерные для 4-О-сульфатирования, отсутствовали. Таким образом, в исследуемой смеси были обнаружены следующие минорные фрагменты галактобиозы: Gal2S03~-(l->4)-Gal и GaI-(l-»4)-Gal2S03".

МС/МС анализ, базирующийся на принципах, изложенных выше (стр.11-12), позволил установить, что малоинтенсивный ион [FuciGaliS03Na-Na]~ с m/z 405.070 содержит несколько изомеров: Gal-(1—>4)-Fuc2SOj", Gal2S03"-(l—»4)-Fuc и незначительное количество Fuc-( 1 —>4)-Gal2SO/. Остаток невосстанавливающей Gal может быть 4-О-сульфатирован. Картина фрагментации минорного иона [FuciGaUSOjNa-Na]" с m/z 567.124 бьша наиболее сложной для интерпретации. Тем не менее, в спектре имелись сигналы, позволяющие установить наличие в смеси следующих структурных вариантов : Gal-(1—»4)-Gal-(l—>3)-Fuc и Fuc-(1—»3)-Gal-(l-+4)-Gal. Сульфатные группы занимали положение при С-2, включая возможное 4-О-сульфатирование остатка галактозы на восстанавливающем конце,что установлено по наличию сигнала иона 3,SA3 с m/z 152.990.

Анализ фрагментационной картины интенсивного иона [FucS03Na-Na]" с m/z 243.016 дал результаты, сходные с полученными для L. gurjanovae. Спектр отличался интенсивностью иона 0,2А с m/z 182.996 (фрагмент 4-О-сульфатированной фукозы), которая была примерно в 2 раза ниже, чем интенсивность иона 0,2Х с m/z 138.971 (фрагмент 2-0-сульфатированной фукозы). Таким образом, смесь содержала 2-0- и 4-О-сульфатированные остатки фукозы. Фрагментационные картины наиболее интенсивного иона [Fuc2S03Na-Na]" с m/z 389.082 и иона [Fuc3S03Na-Na]" с m/z 535.131 были похожи. Анализ МС/МС спектра последнего иона дал следующую информацию: были найдены сигналы ионов ojxohmxi с т/ z 138.971 и с m/z 285.029, которые несли информацию о 2-О-сульфатировании остатков фукозы восстанавливающего конца и соседнего остатка фукозы. Фрагментный ион °,2Х2с m/z 431.085 нес информацию о 2-О-сульфатировании остатка невосстанавливающей фукозы. Минорный сигнал с m/z 182.996 свидетельствовал о 4-О-сульфатировании

невосстанавливающего остатка фукозы. Ион WA2 низкой интенсивности с m/z 329.054 давал информацию о вероятности (1—>3)-связи между остатками фукозы на невосстанавливающем конце. Однако, МС/МС спектр содержал ионы °'3Xi с m/z 315.037 и °-2Xi с m/z 285.029, указывая на наличие (1-»4)-связи между вышеуказанными остатками. Ион очень низкой интенсивности 0,:!Аз с jn/z _475,112 и вышеупомянутый wXo также свидетельствовали о вероятности (1-»3)-связи между остатками фукозы, находящимися на восстанавливающем конце. Анализ более протяженных сульфатированных фукоолигосахаридов не дал столь четких результатов из-за большого количества шума в спектре и сложности в интерпретации. Таким образом, МС/МС анализ показал наличие в исследуемой смеси фрагментов фукоидана Fuc-(1—»3)-Fuc, Fuc-(l->4)-Fuc, Fuc-(l->3)-Fuc-(l-*3)-Fuc, Fuc-(l->4)-Fuc-(l->3)-Fuc, сульфатированных в основном при С-2 и реже при С-4. Полученные данные соответствуют результатам предыдущих работ.

2.3 Исследование фукоидана из L. cichorioides

Литературная информация о строении фукоидана L. cichorioides противоречива. Первой группой исследователей (Zvyagintseva et. al., 2003г.) было показано, что исследуемый фукоидан представляет собой линейный (1->3)-а-Ь-фукан, остатки фукозы в котором сульфатированы в положениях С-2 и С-4. Согласно данным другой группы (Yoon et. al., 2007г.) фукоидан из L. cichorioides является галактофуканом (Fuc:Gal~2:l), остатки a-L-фукозы в котором связаны (1->4)-связью и 2-0- или З-О-сульфатированы. При исследовании фукоидана обеими группами исследователей применялись десульфатирование и метилирование с последующим анализом производных с помощью ЯМР-спектроскошш. Образец высокосульфатированного фукоидана' LcF2, выделенный в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, был подвергнут автогидролизу с целью получения низкомолекулярных фрагментов, доступных для MC-анализа. Этанольный экстракт продуктов автогидролиза Lc-AHL (выход 27% от исходного образца) был проанализирован с помощью ИЭР MC отрицательных и положительных ионов. При анализе масс-спектра положительных ионов, было установлено, что один из наиболее интенсивных сигналов принадлежит иону [Fuci+Na]+ с m/z 187.087. Помимо сигнала мономера, были найдены сигналы ионов фукоолигосахаридов [Fuc„+Na]+, «=2-7. Среди этих сигналов также были обнаружены ионы, соответствующие смешанным олигосахаридам: [Fuc„Hexi+Na]+, п=2-5, сигналы которых, как и в случае с F. evanescens, имели невысокую интенсивность. Из анализа масс-спектра отрицательных ионов следовало, что самые интенсивные сигналы принадлежали ионам сульфатированных фукозы [FuciSOjNa-Napc m/z 243.018 и фукобиозы [Fuc2S03Na-Na]" с m/z 389.075. Спектр также содержал сигналы с m/z 234.011, и 307.042, являющиеся, соответственно, ионами [Fuc2(S03Na)2-2Na]2" и [Fuc3(S03Na)2-2Na]J\ Сигнал иона невысокой интенсивности [FuCiHexA-Na]" с m/z 339.091 также присутствовал.

Каждый из ионов, наблюдаемых в ИЭР масс-спектре отрицательных ионов, был подвергнут анализу в режиме ДИС МС/МС. Тандемный масс-спектр иона [FucS03Na-Na]" с m/z 243.018 совпал с таковым для F. evanescens. Интенсивность иона WA с m/z 182.996, была

* Моносахаридный состав фукоидана LcF2 из Lxicharioides (ВЭЖХ, молышй%): Fuc—81%, Xyl—2%, Rha— 8%, GIc—3%, Man—2%, Gal-4%,

примерно в 2 раза ниже, чем интенсивность иона 0ДХ с m/z 138.971. Таким образом, смесь

Рис. 11. Тандемный ИЭР масс-спектр иона [Fuc2(S03Na)2-2Na]2" с m/z 234.011

Тандемный масс-спектр иона [Fuc2(S03Na)2-2Na]2" с m/z 234.011 (рис.11) содержал следующие ключевые фрагменты: малоинтенсивные сигналы двухзарядных ионов C'i и В'), связанных с разрывами гликозидных связей и отщеплением дисульфатированных остатков Fue и Fuc-H20 с m/z 160.985 (z=2) и 150.792 (r=2), соответственно. Интенсивный сигнал °'2Ai с m/z 182.995, свидетельствовал о 4-О-сульфатировашш невосстанавливающего остатка фукозы. На 2-О-сульфатирование того же остатка указывали сигналы двухзарядного фрагмента 0,3X'i с m/z 196.996, однозарядного фрагмента "'Xi с m/z 285.033 и °-3Xi с m/z 315.026. Таким образом, было установлено, что в исследуемой смеси присутствовали ноны [Fuc-2,4-(S03Na)2-(l-^3)-Fuc-2Na]2-H[Fuc-2S03Na-(l->3)-Fuc-2S03Na-2Na]2-.

MC/MC спектр иона [FuC3(S03Na)2-2Na]2" с m/z 307.043 содержал самые интенсивные фрагментные ионы, образующиеся при разрыве гликозидных связей. Наименьшую интенсивность имел сигнал иона с m/z 234.015 (z=2), связанный с отщеплением фрагмента (FucSO"3)2. Фрагмент WA3 с m/z 277.030 (z=2), указывающий на (1->4)-связь между восстанавливающим остатком фукозы и соседним, а также другие фрагменты, указывающие на (1-»4)-связь, имели очень низкую интенсивность. Отсюда следует, что в исследуемом фрагменте остатки фукозы соединены в основном (1—>3)-связыо и преимущественно 2-0-сульфатированы (сигналы 0,3Xi с m/z 315.044 и минорный сигнал 0,2X¡ с m/z 285.036): Fuc2S03"-(l ->3)-Fuc-( l->3)-Fuc2S03", Fuc-( I->3)-Fuc2S03'-( 1 ->3)-Fuc2S03'. со следами 4-0-сульфатирования невосстанавливающего остатка фукозы (ион 0>2Ai с m/z 182.998).

MC/MC спектр иона [FuciHexA-Na]" с m/z 339.091, подобный найденному во фракции Fe-AF1 из фукоидана F. evanescens, имел некоторые отличия. Сигнал 2,5А2 с m/z 261.070 (рис.9) и сигнал °-2Xi с m/z 235.049, имеющий в данном случае в 2 раза более низкую интенсивность, чем в случае с F. evanescens, указывали на положение остатка уроновой кислоты в молекуле на ее восстанавливающем конце. Малоинтенсивный сигнал иона 63Ai с m/z 133.014 свидетельствовал об обратном. Сигнал DJA2 с m/z 279.068 имел низкую

интенсивность и указывал на незначительное содержание Fuc-( 1 —»4)-HexA, и, вероятно, на преобладание Fuc-(l->3)-HexA. Фрагмент HexA-(l-»3)-Fuc также был обнаружен.

Таким образом, в результате применения автогидролиза был получен набор дисульфатированных олигомеров (п=2-3), не образующихся при использовании сольволитического десульфатирования. Особенностью тандемных масс-спектров фрагментов фукондана из L. cichorioides (то же явление наблюдалось и для L. gurjanovae) бьшо отсутствие или сверхнизкая интенсивность фрагментов ионов 0,2 Аг и "¿Ai, возникающих в случае наличия в смеси структур, содержащих (1-Несвязанные фукоолигомеры, как в случае с фукоиданом из A. nodosum. Из вышесказанного следует, что исследуемые фрагменты содержали 2-0- и реже 4-0-сульфатированные (1->3)-связанные остатки фукозы в качестве превалирующей структурной единицы. Следов З-О-сульфатирования обнаружено не было. Полученные данные согласуются с результатами предыдущих исследований, выполненных в ТИБОХ ДВО РАН. Впервые в фукоидане из L. cichorioides были обнаружены дисахариды, построенные из остатков фукозы и уроновой кислоты: Fuc-(l-»3)-HexA и НехА-(l->3)-Fuc со следами Fuc-(1—И)-НехА. Значение минорных включений гексозы в структуре олигосахаридов остается невыясненной, поскольку в режиме отрицательных ионов гексозсодержащих олигосахаридов обнаружено не было.

2.4 Структурные характеристики фукондана из Costaria costaía

Анализ моносахаридного состава фракции фукоидана' из С. costata CcF2 показал, что пентозе соответствовала D-ксилоза (Xyl), гексозе - D-галакгоза (Gal), дезоксигексозе - L-фукоза (Fue), гексуроновой кислоте - D-глюкуроновая кислота (GlcA). Фракция фукоидана содержала значительное количество ацетатных групп.

Дезацетшшрованный фукоидан CcF2 из Costaría costata был подвергнут кислотному гидролизу с целью получения олигосахаридов, пригодных для масс-спектрометрического анализа, поскольку ни сольволитическим десульфатированием, ни автогидролизом подходящего для MC-анализа образца получить не удалось. С помощью тандемного ИЭР масс-спектрометра была проанализирована фракция CcF2-B60\ полученная экстракцией метанолом продуктов гидролиза фукоидана CcF2 в течение 60-ти минут, содержащая наибольшее количество олигосахаридов. При анализе масс-спектра положительных ионов бьшо установлено, что основные компоненты смеси - галактоза и фукоза: [Gali+Na]* с m/z 203.054 и [Fuci+Na]+ с m/z 187.059. Кроме этого, в смеси были найдены ионы фуко- и галактобиозы [Fuc2+Na]+ с m/z 333.116 и [Gal2+Na]+ с m/z 365.104. Менее интенсивными были сигналы ионов смешанных дисахаридов: [Xyl,Fuci+Na]+ с m/z 319.101, [GalJFuc1+Na]+ с m/z 349.109, [FuciGlcAi+Na]+ с m/z 363.090, [Gal,GlcA,+Na]+ с m/z 379.084. Также в спектре был найден'сигнал [Fuc,SO,Na+Na]+ с m/z 289.000.

Из анализа масс-спектра отрицательных ионов следовало, что самый интенсивный сигнал принадлежал иону [FuciSOjNa-Na]" с m/z 243.016. В смеси также были обнаружены

' Моносахарндный состав фукоидана CcF2 из С. costata (ГЖХ ацетатов полиолов, мольный %): Fue—39.7%, Xyl—11.6%, Gal—21.4%, Man—12.0%, GlcA—7.5%.

' Моносахарндный состав фракции CcF2-H60 (ГЖХ ацетатов полиолов, мольный %): Fue—76.5%, Xyl—1.3%, Rba—1.4%, Gal—20.2, Man—0.6%.

сигналы ионов [GahSOjNa-Na]" с m/z 259.012, [Fuc,GlcA-Na]' с miz 339.094, [Gal.GlcA-Na]" с m/z 355.089, [FucjSOjNa-Na]" с m/z 389.075, [(Fuc,Gal,)S03Na-Na]- с m/z 405.069, [Gal2S03Na-Na]' с m/z 421.065. В спектре был обнаружен минорный ион глюкуроновой кислоты [GlcA-Na]" с m/z 193.035. Сульфатированная ксилоза обнаружена не была. Для извлечения информации о структурных особенностях фрагментов фукоидана CcF2, найденных в отрицательном режиме регистрации, каждый ион был подвергнут ДИС МС/МС анализу.

Таыдемный масс-спектр наиболее интенсивного иона [FuciS03Na-Na]" с m/z 243.016 от полученных для L. gurjanovae, F. evanescens, L. cichorioides практически не отличался. Интенсивности фрагментных ионов, соответствующих 2-0- и 4-О-сульфатированной фукозе были примерно равны. ДИС МС/МС спектр иона малой интенсивности [FuczS03Na-Na]" с т/ z 389.074, который отличался от описанных для L. gurjanovae (рис.8) и F. evanescens (стр.18) наличием интенсивных сигналов ионов серии oiA. Интенсивные сигналы 0ЛХо и А2 с m/z 329.059 указывали на наличие (1—>4)-связи между остатками фукозы. Сигналы ионов 0,2Xi с m/z 285.027 и wXi с m/z 315.039 указывали на 2-О-сульфатирование невосстанавливающего остатка фукозы. Таким образом, масс-спектрометрическое исследование показало наличие в смеси следующих изомеров моносульфатированной фукобиозы: Fuc4S03"-(l—>4)-Fuc, Fuc2S03~-(l—>4)-Fuc, Fue (l-+4)-Fuc2S03\

ДИС MC/MC спектр иона невысокой интенсивности [FuciGlcA-Na]" с m/z 339.094, имел следующие отличия от масс-спектра аналогичного дисахарида из фукоидана F. evanescens (рис.9): здесь интенсивные сигналы ионов 0,2А2 с m/z 279.069 и °?Кг с m/z 249.066 указывали на (1—>4)-связь между моносахаридами. Сигнал 0,2Xi с m/z 235.049, имеющий в данном случае невысокую интенсивность, и интенсивный фрагмент 15А3 с m/z 261.062, указывали на положение остатка глюкуроновой кислоты на восстатавливающем конце молекулы. Таким образом, смесь содержала фрагмент Fuc-(l-+4)-GlcA.

МС/МС спектр иона невысокой интенсивности [GaliGlcA-Na]" с m/z 355.089 от уже описанных масс-спектров ионов [FuciGlcA-Na]" отличался следующим: ион 2,5А2 277.054, указывающий на положение GlcA (см. описание спектров [FuciGlcA-Na]"), по интенсивности был сопоставим с фрагментом из из F. evanescens (рис.9). Сигнал 0,2Xi с m/z 235.047 имел ту же интенсивность, что и на предыдущем МС/МС спектре. Сигналы ионов Аг с m/z 295.063 и 0,3 А2 с m/z 265.055, указывающие на (1-*4)-связь между остатками галактозы и уроновой кислоты, были в 2 раза менее интенсивными, чем в предыдущем МС/МС спектре. Это может косвенно свидетельствовать о наличии в смеси Gal-(1—>3)-GlcA. Таким образом, МС-анализ показал наличие в исследуемой смеси дисахаридов Ga!-(1—>4)-GlcA и Gal-(1—>3)-GlcA.

Анализ ДИС МС/МС спектра иона [(FuciGalt)S03Na-Na]" с m/z 405.069 позволил установить следующие структурные особенности дисахарида: сигналы фрагментов разрыва кольца остатков фукозы 0,2X'j с m/z 285.034 и галактозы 0,2Xi m/z 301.014, находящихся на ^восстанавливающем конце, свидетельствовали как о наличии двух различных структур в смеси, так и о сульфатировании остатков Сахаров на восстанавливающем конце, так как в спектре отстутствовапи сигналы 0ЛАг и wXi. Интенсивный сигнал 0,2Хо с т/г 138.973 свидетельствовал, что моносахарид на восстанавливающем конце сульфатирован при С-2 и связан с первым (1—>4)-связью. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в смеси

присутствовали дисахариды, связанные (1—»4)-связью: Gal-(1—>4)-Fuc2S03" и Fuc-(l-»4)-Gal2S03". Сигналы, свидетельствующие о 4-О-сульфатировании, обнаружены не были.

МС/МС спектр иона [GaliSCbNa-Na]" с m/z 259.013 был очень похож на спектры сульфатированной галактозы, полученной из фукоиданов L. gurjanovae (рис.7, б) и L. cichorioides. Однако, данный МС/МС спектр от вышеуказанных отличался отсутствием сигнала иона ВДХ с m/z 168.98 и наличием сигнала с m/z 180.981. Сигнал с m/z 198.993 был отнесен к иону 0,2А, свидетельствующем о 4-0- или 6-О-сульфатировании остатка галактозы. Сигнал с m/z 180.981 не наблюдался в ИЭР МС/МС спектрах GIc3SO"3, присутствовал в MC3 спектре Gal4SO"3 вместе с сигналом 3,4А с m/z 138.9, и являлся фрагментом 0'2А-Н2О. Сигнал 2'4 А в MC3 спектре Gal6S0'3 был малоинтенсивным (более ранние исследования). Возможно, в примененных условиях фрагменты, полученные другими исследователями в MC3 режиме, образуются и в MC2 режиме, и, вероятно, принадлежат 4-О-сульфатированной галактозе. В пользу данного предположения также указывает совпадение данного спектра с ИЭР МС/МС спектром 4-О-сульфатированной галактозы, полученной кислотным гидролизом дисахарида Gal4S03Na-(l—>4)-AnGal из каррагинана. Несмотря на все вышесказанное, сульфатирование остатка галактозы при С-2 нельзя исключить.

МС/МС спектр иона [GabSOjNa-Na]' с m/z 421.065 (рис.12) имел ряд отличий от спектра соответствующего иона в случае F. evanescens. В нем ионы, образовавшиеся при

расщеплении гликозидных связей, имели невысокую интенсивность.

2.8 ад

2 Л

¡5 г,г- ^Бн'У^ " 9ЮШЫ1

Я~Л2

О

..... - *

! и : 1.2 | 1 ' 0.S 0.6 <1:4 0.2

I

i

[MNa-H.O-Naf

140 150 VöC 170 1315 'lOO 200 210 0 230 240 250 2G0 270 280 200 300 310 320 330 340 350 360 370 3S0 390 400 410 420 ГП/Z

Рис. 12. Тандемный ИЭР масс-спектр иона [Gal2S03Na-Na]" с m/z 421.074.

Наличие сигнала иона 3,5А2 с m/z 152.987 указывало на 4-О-сульфатирование восстанавливающего остатка Gal. Этот же сигнал наблюдался в МС/МС спектре иона [FuCiGal2S03Na-Na]" из F. evanescens. Интенсивный сигнал 0ДА2 с m/z 361.047 свидетельствовал о наличии в смеси дисахарида Gal-(1—>4)-Gal, в котором невосстанавливающий остаток Gal сульфатирован. Интенсивный сигнал иона °ЛХ, с m/z 301.018, указывал как на отсутствие 2-О-сульфатирования невосстанавливающего остатка галактозы, так и на присутствие в смеси (1-*2)-связанных остатков Gal (рис.12, слева), как было показано для бурой водоросли Hizikia fuziforme, имеющей сходный моносахаридный

состав. При этом разрыв 0ЛА'г (рис.12, слева) дает то же значение m/z 301.018. На 4-0-сульфатирование невосстанавливающего остатка галактозы указывали сигналы ионов 0,2Ai с m/z 198.995 и 2,4Ai с m/z 138.967 (рис.12, справа). Однако, в пользу 2-0-сульфатирования невосстанавливающего остатка галактозы свидетельствовал ион wXi с m/z 331.035.

В итоге были сделаны следующие выводы: в фукоидане из С. costata йайдены структурные элементы Fuc4S03"-(l—>4)-Fuc, Fuc2S03'-(l—>4)-Fuc, Fue (l-+4)-Fuc2S03\ Fuc-(1—>4)-GlcA, Gal-(1—>4)-GlcA, Gal-(l-»3)-GlcA, Gal-(l-»4)-Fuc2S03", Fuc-(l->4)-Gal2S03", Gal2S03"-(l—»2)-Gal, GaI4S03"-(l—>4)-Gal. Вероятно, эти фрагменты находятся в разветвлениях от основной цепи, поскольку из литературы известно, что фукоидап с таким моносахаридным составом может иметь основную цепь, состоящую из блоков уроновая кислота-гексоза, с разветвлениями в виде коротких цепей, состоящих из остатков сульфатированной фукозьг и галактозы. Фракция CcF2-H60 действительно содержала устойчивый к кислотному гидролизу полисахаридный кор с высоким содержанием GlcA и гексоз. Фрагменты, содержащие фукозу, соединены в основном (1—>4)-связыо, в отличие от фрагментов фукоиданов из L. gurjanovae, F. evanescens, L. cichorioides, где преобладает (1—»3)-связь. Исследование фукоидана из С. costata в настоящий момент продолжается.

3 ВЫВОДЫ

1. Впервые сочетанием МС-методов были исследованы особенности структур новых фукоиданов из бурых водорослей £. ^щ'апоуае и С. с05Ш1а, определен структурный статус минорных моносахаридов в фукоидане из Р. еуапейсегя.

2. Методом МАЛДИ масс-спекгрометрии было подтверждено, что ферменты ЬУ из М. ув55оепз15 и С-1 из £. кигНа являются эндо-(1—>3)-р-0-глюканазами: в продуктах реакции помимо глюкозы обнаружены глюкоолигосахариды с п=2-13. Исследуемые ферменты проявляли трансгликозшшрующую активность: в присутствии метилглюко- и ксилозидов, а также метанола были получены метилолигозиды с п-2-1. В качестве акцепторов наиболее предпочтительными оказались метилгликозиды глюкозы и ксилозы.

3. Методом МАЛДИ МС было установлено истинное молекулярно-массовое распределение ламинаранов из Ь. ^гуапоуае (01с21-01сзб) и Ь. cichorioides (01с23-01с33).

4. Впервые с целью получения доступных для МС-анализа олигосахаридов, для деградации фукоиданов были применены сольволитическое десульфатирование и автогидролиз. С помощью МАЛДИ и тандемной ГОР МС показано, что в условиях сольволиза фукоиданы деполимеризуются до моносульфатированных олигомеров с сохраиишем минорньк включений, МС-методы позволили установить типы глихозидных связей в олигомерах и положение сульфатных групп. Применение автогидролиза привело к получению мулмисульфатированных фухоолигомеров, но при этом терялась информация о структуре минорных включений. Эти методы деградации неприемлемы для низкосульфатированных фукоиданов.

5. Впервые, применение метода МАЛДИ МС позволило установить, что фукоидан из L. gurjanovae представляет собой галактофукан блочного строения, поскольку в продуктах его деградации обнаружены фуко-, галакто- и смешанные фукогалактоолигосахариды. С помощью тандемной ИЭР МС установлено, что остатки фукозы соединены (1->3)-гликозидными связями и сульфатированы, равно как и остатки галактозы, при С-2 и С-4.

6. Анализ с помощью тандемной ИЭР МС продуктов кислотного гидролиза нового фукоидана из С. costata, основная цепь молекулы которого представлена манноглюкуронофуканом, позволил получить информацию о структуре фрагментов разветвлений: Fuc4S03'-(1^4)-Fuc, Fuc2SO-3-(l-»4)-Fuc, Fue (l-*4)-Fuc2S03", Fuc-(l->4)-GlcA, Gal-(1—>4)-GlcA, Gal-(l->3)-GlcA, Gal-(l->4)-Fuc2S03", Fuc-(l-»4)-Gal2S03\ Gal2S03--(l—2)-Gal, Gal4S03-(l->4)-Gal.

7. Анализ тандемной ИЭР МС продуктов деградации фукоидана из L. cichorioides подтвердил, что он является высокосульфатированным (1-»3)-а-Ь-фуканом.

8. С помощью тандемной ИЭР МС в продуктах деградации фукоидана из F. evanescens были впервые обнаружены фрагменты, содержащие минорные моносахариды Xyl, Gal, GlcA, и установлена их структура: Xyl-(l->4)-Fuc, Gal-(l-»4)-Fuc, Gal-(1 ->4)-Gal-(l->4)-Fuc, Gal-(1^4)-Gal, GlcA-(l->2)-Fuc, Fuc-(l->3)-GlcA, Fuc-( 1 ->4)-Fuc-( 1 ->3)-GlcA, Fuc-(1—>3)-Fuc(¡—>4)-Fuc-(l—>3)-GlcA. Показано, что остатки Fue, Xyl и Gal сульфатированы в основном при С-2 и реже при С-4.

9. Показано, что в МС/МС-спектрах сульфатированных олигомеров со свободной ОН-группой при С-4 соотношение иптенсивностей фрагментных ионов 0,2Х и 0,3Х зависит от позиции сульфатной группы (С-2 или С-3). 2-О-сульфатирование приводит к снижению интенсивности ,,2Х-фрагмента. При отсутствии сульфата в указанных положениях ионы 0,3Х не образуются. Это позволило точно локализовать положение сульфатных групп.

Основные публикации по теме диссертации

1. Kusaykin M.I., Pesentseva M.S., Anastyuk S.D., Sova V.V., Zvyagintseva T.N. Laminarinases from the gastropodean marine mollusk Littorina kurila II 4th European Conference on Marine Natural Products: book of abstr. - Paris, France. 2005. P. 64,

2. Kovalchuk S. N., Sundukova E. V., Kusaykin M. I., Guzev К. V., Anastiuk S. D., Likhatskaya G. N., Trifonov E. V., Nurminski E. A., Kozherayako V. В., Zvyagintseva T. N., Rasskazov V. A. Purification, cDNA cloning and homology modeling of endo-l,3-beta-D-glucanase'ftom scallopMizuhopectenyessoensis. //Сотр. Biochem. Physiol. 2006. V. 143. N. 4. P. 473-485.

3. Шевченко H. M., Анастюк С. Д., Герасименко Н. И., Дмитренок П. С., Исаков В. В., Звягинцева Т. Н. Полисахаридный и липидный состав бурой водоросли Laminaria gurjanovae. //Биоорган, химия. 2007. т. 33. № 1. С. 96-107.

4. Pesentseva М. S., Kusaykin М. I., Anastyuk S. D., Sova V. V., Zvyagintseva Т. N. Catalytic properties and mode of action of endo-(l—>3)-beta-D-glucanase and beta-D-glucosidase from the marine mollusk Littorina kurila. II Carbohydr. Res. 2008. V. 343. N. 14. P. 2393-2400.

5. Anastyuk S. D., Shevchenko N. M., Nazarenko E. L., Dmitrenok P. S., Zvyagintseva T. N. Structural analysis of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass spectrometry. // Carbohydr. Res. 2009. V. 344. N. 6. P. 779-787.

Соискатель

Анаспок С.Д.

Анастюк Станислав Дмитриевич

ПРИМЕНЕНИЕ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Д ЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ И ПРОДУКТОВ ИХ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

Автореферат

Подписано в печать 23.11.2009 г. Формат 60x90/16. 1 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1263. Отпечатано в типографии ООО «Типография «Дальрыбтехцентр»» г. Владивосток, Запорожская 87А

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1 Современные методы масс-спектрометрии, применяемые для изучения олиго- и полисахаридов.

2.1.1 Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ИЭР МС).

2.1.1.1 Электрораспыление как метод перевода. ионов в газовую фазу из раствора.

2.1.1.2 История применения метода ионизации. электрораспылением в масс-спектрометрии.

2.1.1.4 Электрофоретический механизм формирования заряженных капель

2.1.1.5 Модели формирования ионов газовой фазы. из малых заряженных капель.

2.1.2 Масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ МС).

2.1.2.1 Процесс образования газофазных ионов с помощью МАЛДИ.

2.1.2.2 Матрицы, используемые в МАЛДИ МС.

2.1.2.3 Подготовка пробы.

2.1.2.4 Способы улучшения качества МАЛДИ МС анализа.

2.1.3 Применение МАЛДИ и ИЭР МС для анализа углеводов.

2.1.4 Тандемная масс-спектрометрия (МС/МС).

2.1.5 Масс-спектрометрическая фрагментация молекулярных ионов олигосахаридов.

2.1.5.1' Номенклатура, используемая для описания продуктов. масс-спектрометрической,фрагментации1.

2.1.5.2 Фрагментация протонированных молекул.

2.1.5.3 Фрагментация комплексов олигосахаридов катионами щелочных металлов.

2.1.5.4 Фрагментация депротонированных молекул.,.

2.2 Масс-спектрометрический анализ продуктов трансформации гликанов 29 2.2.1 МС-анализ продуктов ферментативной трансормации полисахаридов

2.2.2 МС-анализ продуктов химической деградации полисахаридов.

2.3 Водорастворимые полисахариды бурых водорослей.

2.3.1 Ламинараны.

2.3.2 Фукоиданы.

2.3.2.1 Фукоиданы, построенные в основном. из сульфатированной фукозы.

2.3.2.2 Фукоиданы с гетерогенным моносахаридным составом.

2.3.2.3 Гетерогенность структуры фукоиданов.

2.3.2.4 Методы исследования фукоиданов.

2.3.2.5 Фукоиданы и гепарин.

Полисахариды — одни из наиболее распространенных на Земле биополимеров. Они разнообразны по составу и физико-химическим свойствам, что проявляется в многообразии их свойств и функций. Полисахариды могут выполнять структурные функции (целлюлоза, глюканы клеточных стенок), функции резервных веществ (амилоза, парам ил он, ламинараны), водосохраняющие функции, присущие гелеобразующим полисахаридам (гликозаминогликаны и полисахариды водорослей), функции химического узнавания гликопротеинов, связанных с разными клетками.

Водорастворимые полисахариды бурых водорослей (фукоиданы, ламинараны) разнообразны по своей структуре и биологической активности. Фукоиданы -сульфатированные гетерополисахариды - проявляют иммуномодулирующее, антивирусное, противоопухолевое и антикоагулянтное действие, и в настоящее время на их основе разрабатываются биологически активные добавки и лекарственные средства. Интерес к (1—>3);(1—>6)-Р-Б-глюканам, к которым относятся ламинараны, связан с их влиянием на системы иммунитета растений и животных.

Несмотря иа широкую известность всех этих полисахаридов, имеются трудности с установлением их структуры, которые связаны, с тем, что состав и структурные характеристики полисахаридов зависят не только от вида водоросли, но и от сезона сбора, возраста и т.д. Кроме того, строение этих полисахаридов, особенно фукоиданов, отличается отсутствием регулярности и большим разнообразием.

Успешно применяемый в настоящее время подход к установлению структуры фукоиданов с помощью ЯМР-спектроскопии предполагает использование химической* модификации исходного полисахарида с целью упрощения его структуры. Из-за высокой лабильности молекул фукоидана выходы модифицированных препаратов часто невелики, откуда следует, что значительная> часть информации- о структуре полисахарида, включая информацию о. минорных элементах, .теряется:

Современные методы, масс-спектрометрии позволяют получать надежные и точные результаты, благодаря аналитической гибкости, высокой, чувствительности и селективности. Использование тандемной масс-спектрометрии и ферментов (О-гликозилгидролаз, лиаз, сульфатаз) с установленной специфичностью и механизмом действия позволяет устанавливать строение полисахаридов с уточнением положений минорных элементов. Ферментативная трансформация полисахаридов представляет большой интерес, так как позволяет с высоким выходом получать новые препараты с более разнообразной биологической активностью.

Целью работы является использование методов масс-спектрометрии для установления структурных особенностей водорастворимых полисахаридов бурых водорослей (фукоидана и ламинарана) и продуктов их ферментативной трансформации, а также изучение механизма действия и специфичности ферментов, участвующих в трансформации.

В диссертационной работе представлены данные о структурных характеристиках ламинаранов и продуктов их ферментативной трансформаци. Изучены каталитические свойства ферментов. Основное внимание уделено изучению структурных особенностей фукоиданов как наиболее перспективных веществ для создания БАД к пище и новых лекарственных препаратов на их основе. Разработан подход к исследованию структурных особенностей фукоиданов с помощью методов ИЭР и МАЛДИ масс-спектрометрии. В литературном обзоре освещены особенности современных методов масс-спектрометрии, применяемых для анализа гетерогенных смесей углеводов, приведена информация о механизмах масс-спектрометрической фрагментации, структурах и степени изученности полисахаридов бурых водорослей.

Список используемыхсокращений

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ББА МС - масс-спектрометрия с бомбардировкой быстрыми атомами;

ИЭР МС — масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением;

МАЛДИ МС - масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией;

ДИС - диссоциация, индуцированная столкновением;

МС/МС (МС2) - тандемная масс-спектрометрия;

DHB - 2,5-дигидроксибензойная кислота;

НССА - 4-гидрокси-а-цианокоричная кислота;

ТФУ - трифторуксусная кислота;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс;

УФ — ультрафиолетовый дипазон

ИК - инфракрасный диапазон

AnGal - 3,6-Ь-ангидрогалактоза

ХС - хондроитинсульфат

ГХ - газовая хроматография

ГХ/МС - газовая хроматография/масс-спектрометрия

Благодарности

Автор искренне благодарит научного руководителя д.х.н., проф. Звягинцеву Татьяну Николаевну, сотрудников лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН за помощь в работе и особенно Шевченко Н.М. за предоставленные образцы фукоиданов. Автор выражает признательность зав. лаборатории инструментальных и радиоизотопных методов к.х.н. Дмитренку П.С. за напутствия в работе и поддержку.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Масс-спектрометрия представляет собой современную фундаментальную и прикладную физико-химическую область науки. В её задачу входит получение и накопление знаний о составе веществ, их структуре, физико-химических свойствах, а также происходящих с ними процессах. Именно эти знания позволили обеспечить и осуществить многие открытия и достижения 20-го века, наиболее яркими из которых являются обеспечение освоения ядерной энергии, развитие микроэлектроники; к ним можно добавить достижения в химии, биологии, фармакологии, открытие стабильных изотопов, фуллеренов и многое другое.

Метод масс-спектрометрии с помощью образования ионов из нейтрального вещества, разделения их по массам и детектирования дает богатейшую информацию об окружающем мире. Масс-спектрометрия — естественный, многосторонний и эффективный комплекс методов определения состава вещества, исследования различных ядерных, атомных, плазменных, физико-химических, биологических, геологических и технологических процессов. Она успешно дополняет, конкурирует и часто превосходит другие методы физико-химического анализа по широте и комплексности подхода, чувствительности, скорости и точности измерений.

5 ВЫВОДЫ

1) Впервые сочетанием масс-спектрометрических методов были исследованы особенности структур новых фукоиданов из бурых водорослей L. gurjanovae и С. costata, определен структурный статус минорных моносахаридов в фукоидане из F. evanescens.

2) Методом МАЛДИ масс-спектрометрии было подтверждено, что ферменты LV из М. yessoensis и G-I из L. kurila являются эндо-( 1 —>3)-Р-0-глюканазами: в продуктах реакции помимо глюкозы обнаружены олигосахариды G1c2-G1c13. Показано, что исследуемые ферменты проявляли трансгликозилирующую активность: в присутствии метилглюко- и ксилозидов, а также метанола были получены метилолигозиды с п=2-7. Установлено, что метил гликоз иды наиболее предпочтительны в качестве акцепторов.

3) Методом МАЛДИ МС было установлено истинное молекулярно-массовое распределение ламинаранов из L. gurjanovae (G1c2i-G1c36) и L. cichorioides (Glc23-Glc33), метод гель-проникающей хроматографии давал завышение молекулярной массы в случае ламинарана из L. gurjanovae примерно в 5 раз.

4) Впервые с целью получения доступных для МС-анализа олигосахаридов, для деградации фукоиданов были применены сольволитическое десульфатирование и автогидролиз. С помощью МАЛДИ и тандемной ИЭР МС показано, что в условиях сольволиза фукоиданы деполимеризуются до моносульфатированных олигомеров с сохранением минорных включений, МС-методы позволили установить типы гликозидных связей в олигомерах и положение сульфатных групп. Применение автогидролиза привело к получению мультисульфатированных фукоолигомеров, но при этом терялась информация о структуре минорных включений. Эти методы деградации не приемлемы для низкосульфатированных фукоиданов.

5) Впервые применив метода МАЛДИ МС позволило установить, что фукоидан из L. gurjanovae представляет собой галактофукан блочного строения, поскольку в продуктах его деградации обнаружены фуко-, галакто- и смешанные фукогалактоолигосахариды. С помощью тандемной ИЭР МС установлено, что остатки фукозы соединены (1—»3)-гликозидпыми связями и сульфатировапы, равно как и остатки галактозы, при С-2 и С-4.

6) Анализ с помощью тандемной ИЭР МС продуктов кислотного гидролиза нового фукоидана из С. costata, основная цепь молекулы которого представлена манноглюкуронофуканом, позволил получить информацию о структуре фрагментов разветвлений: Fuc4S03"-(l—»4)-Fuc, Fuc2S03"-(l—>4)-Fuc, Fuc-( 1 ->4)-Fuc2S03\ Fuc-(l->4)-GlcA, Gal-(l->4)-GlcA, Gal-(l->3)-GlcA, Gal-(l-»4)-Fuc2S03\ Fuc-(l-»4)-Gal2S03", Gal2S03"-(l->2)-Gal, Gal4S03'-(l->4)-Gal.

7) Анализ с помощью тандемной ИЭР МС продуктов деградации фукоидана из L. cichorioides подтвердил, что этот фукоидан является высокосульфатированным (1 —»3)-а-Ь-фуканом.

8) С помощью тандемной ИЭР МС в продуктах деградации фукоидана из F. evanescens были впервые обнаружены фрагменты, содержащие минорные моносахариды Xyl, Gal, GlcA, входящие в его состав, и установлена структура содержащих их олигомеров: Xyl-(l-»4)-Fuc, Gal-(l-»4)-Fuc, Gal-(l-»4)-GaI-(l-»4)-Fuc, Gal-(l->4)-Gal, GIcA-(l^-2)-Fuc, Fuc-(l->3)-GIcA, Fuc-(l->4)-Fuc-(1—>3)-GlcA, Fuc-(l-»3)-Fuc(l-»4)-Fuc-(l-»3)-GlcA. Показано, что остатки Fuc, Xyl и Gal 2-О-сульфатированы со следами 4-О-сульфатирования. Олигосахариды, содержащие GlcA, несульфатированы.

9) Показано, что в МС/МС-спектрах сульфатированных олигомеров со свободной гидроксильной группой при С-4 соотношение интенсивностей фрагментных ионов °'2Х и 0,3Х зависит от позиции сульфатной группы (С-2 или С-3). При 2

П 9

О-сульфатировании интенсивность иона фрагмента ' X снижается. При отсутствии сульфата в указанных положениях ионы ^Х не образуются. Это позволило точно локализовать положение сульфатных групп.

3.2.5 Заключение

В процессе выполнения работы с помощью масс-спектрометрического анализа нами были исследованы структурные особенности фукоиданов из четырех видов бурых водорослей: L. gurjanovae, F. evanescens, L. cichorioides и С. costata.

Для получения олигосахаридов, пригодных к масс-спектрометрическому анализу, исходные фукоиданы были деполимеризованы различными методами: сольволитическим десульфатированием, частичным кислотным гидролизом и автогидролизом.

Впервые, с помощью химических и физико-химических методов было показано, что фукоидан из L. gurjanovae представляет собой сульфатированный и частично ацетилированный галактофукан блочного строения [142]. Фукоидан из L. gurjanovae был деполимеризован в условиях сольволитического десульфатирования и частичного кислотного гидролиза. С помощью МАЛДИ масс-спектрометрии среди, низкомолекулярных продуктов деполимеризации кроме моносахаридов a-L-фукозы [Fuc+Na]+ и [FucS03]" были обнаружены нейтральные фукоолигосахариды: [Fucn+Na]+, n=2-l 1, сульфатированные фукоолигосахариды [FucnS03]~,n=2-l 1, а также смешанные олигосахариды: [Fucn.mGalra+Na]+, п=4-6, m=l-3; [FucnmGalmS03]",n=3-6, т=1-2. Обнаружение смешанных олигосахаридов свидетельствует о блочном строении фукоидана. В среднем на 5 остатков фукозы приходится 2-3 остатка D-галактозы. Протяженность блоков, построенных из a-L-фукозы, составляет не менее 11 остатков. Анализ продуктов частичного кислотного гидролиза фукоидана с помощью МАЛДИ МС показал, что среди полученных олигосахаридов преобладали галактозосодержащие [Galn+Na]+, n=2-5, [GalnS03]", п=2-3, причем a-L-фукоза в смеси была найдена только в виде ионов мономеров [Fuc+Na]+ и [FuC[S03]" а также в составе иона [FuciGaliS03]. Отсюда следует, что, как уже известно, в условиях кислотного гидролиза более лабильными являются гликозидные связи между моносахаридными остатками дезоксигексозы (a-L-фукозы). При этом размер максимального блока, построенного из D-галактозы равен пяти, что близко к результатам исследования продуктов сольволитического десульфатирования где п=3.

Дальнейшее исследование с применением тандемной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией позволило установить структурные особенности фрагментов [FucnSC>3]", п=1-3. Было показано, что остатки a-L-фукозы связаны в основном (1—>-3)-связыо и 2-О-сульфатированы со следами 4-О-сульфатирования. Остатки D-галактозы также могут быть как 2-0-, так и 4-О-сульфатированы. К сожалению, информацию о типе связи между a-L-фукозой и D-галактозой извлечь не удалось из-за деградации исследуемой смеси олигосахаридов в процессе хранения. Можно предположить, что блоки, построенные из галактозы, связаны (1—»4)-связью с фукозной цепью, поскольку известно, что (1—»4)-связь менее устойчива, чем (1—>3)-связь, которая по данным ИЭР МС/МС преобладает в фукозной цепи. Исследуемый фукоидан отличается от аналогичных полисахаридов, выделенных из других видов семейства ламинарневых, которые представляют собой сульфатированные (1—>3)-а-L-фуканы [123, 147], хотя повышенное содержание D-галактозы отмечалось для фукоиданов из L. japonica [145] и L. cichorioides [146].

Фукоидан из F. evanescens, бурой водоросли рода Fucales, по одним данным представлял линейную цепь с чередующимися 3- и 4-связанными остатками a-L-Fucp, сульфатированными в> пололоженни 2. Дополнительная сульфатная группа могла находиться в положении С-4 некоторых (1 —>-3)-связанных остатков фукозы [108], сульфатированных в пололожении 2. По другим данным из F. evanescens была выделена фракция фукоидана с преобладанием (1—>-3)-связанных остатков фукозы над (1—>-4)-связанными примерно в 3.5 раза [107].

Для деполимеризации выделенного из F. evanescens по методу [107] фукоидана были применены условия сольволитического десульфатирования. В результате был получен набор олигосахаридов со степенью полимеризации? до 6. Согласно данным масс-спектрометрического анализа [144], этот фукоидан, содержал протяженные участки, построенные из (1—»3)-связанных остатков. a-L-Fucp (до трех, и, возможно, более), сульфатированных в основном в положении С-2. Впервые в фукоидане нами были найдены олигосахариды, содержащие D-глюкуроновую кислоту. Для этих фрагментов было отмечено чередование 3- и 4-связанных остатков a-L-Fucp. Таким образом, полученные данные [144] находятся в соответствии с результатами предыдущих исследований [107]. Кроме того, нами впервые было показано, что остатки D-ксилозы и D-галактозы, обнаруженных ранее в моносахаридном составе фукоидана из F. evanescens в минорных количествах, включены в цепь. Остаток D-ксилозы в основном 2-0-сульфатирован и может быть связан (1-»4)-связью с остатками a-L-Fucp. Остатки 2-0-сульфатированной D-галактозы (до двух) между собой могут быть связаны (1-»4)- или (1-»3)-связями, а с остатками a-L-Fucp - (1-»4)-связью. Наличие (3-(1-»4)-связанных остатков D-ксилозы (до шести), входящих в основную цепь фукоидана, было показано ранее только для бурой водоросли Fucus serratus [110].

Фукоидан из L. cichorioides ранее был исследован авторами работ [145, 146]. Полученные нами данные согласуются с результатами, опубликованными в работе [145], согласно которым исследуемый фукоидан представляет собой высокосульфатированный (1->3)-а-Ь-фукан, но находятся в противоречии с данными, полученными в работе [146], согласно которым фукоидан из L. cichorioides представляет собой галактофукан (L-Fuc:Gal~2:l), остатки a-L-фукозы в котором (1->4)-связаны и 2,3-О-дисульфатированы. В условиях автогидролиза, впервые примененного нами для деградации фукоиданов, были получены сульфатированные и нейтральные фукоолигосахариды с максимальной степенью» полимеризации п до 7. Результаты анализа сульфатированной a-L-фукозы и фукоолигосахаридов с п=2-3 с помощью ИЭР МС/МС показали следующее: остатки 2-0- и 4-О-сульфатированной a-L-фукозы были соединены в основном (1—>3)-связями. Содержание (1—Несвязанных остатков a-L-фукозы было незначительным. Остатки гексозы были найдены среди смешанных олигосахаридов [FucnHexi+Na]+, п=2-5 при ИЭР МС анализе состава нейтральных олигосахаридов. Данные о сульфатировании остатков гексозы и типе связи их с фукозной цепью не были получены, так как в продуктах отсутствовали необходимые сульфатированные фрагменты. Предположительно, по аналогии с фукоиданом из L. gurjanovae, остатки гексозы связаны (1—>4)-связью, которая'наиболее легко расщепляется в условиях автогидролиза, как было показано для каррагинанов [81].

Фукоидан из бурой, водоросли С. costata, исследованный нами впервые, содержал, помимо фукозы, большое количество глюкуроновой кислоты, гексоз, и был слабосульфатирован. Как известно из литературы [118], фукоидан с таким моносахаридным составом может иметь основную цепь, состоящую из блоков, построенных из D-глюкуроновая кислоты и D-маннозы, с разветвлениями в виде коротких цепей, состоящих из остатков сульфатированной a-L-фукозы и D-галактозы. Все три метода деполимеризации - автогидролиз, сольволитическое десульфатирование и частичный гидролиз - были использованы для получения олигосахаридов, пригодных к масс-спектрометрическому анализу. Только один из примененных методов деградации (кислотный гидродиз 1 Н ТФУ, 60 минут) оказался достаточно эффективным. Стоит отметить, что условия кислотного гидролиза, примененные для фукоидана из С. costata были более жесткие, чем для фукоидана из L. gurjanovae. При кислотном гидролизе фукоидана из С. costata кроме олигосахаридной была получена полисахаридная фракция, анализ моносахаридного состава которой (см. раздел 4.3.1) показал, что ее основными компонентами являются d-глюкуроновая кислота, D-мапноза и a-L-фукоза. Низкую эффективность деградации фукоидана автогидролизом и сольволитическим десульфатированием можно объяснить относительно небольшим количеством сульфатных групп, а также высокой стабильностью гликозидной связи в блоке уроновая кислота-гексоза [118]. Масс-спектрометрическин анализ низкомолекулярных продуктов кислотного гидролиза показал, что степень полимеризации наблюдаемых олигосахаридов непревышала двух, что связано с жесткими условиями кислотного гидролиза. Остатки a-L-фукозы в найденных фукоолигосахаридах были 2-0- или 4-О-сульфатированы и связаны (1—»4)-связью. Остатки D-галактозы в основном 4-О-сульфатированы и связаны с фукозой (1—»4)-связью и (1—>2)- или (1—»4)-связью между собой. Необходимо уточнить, что 4-О-сульфатирование отмечено в основном для остатков Сахаров на невосстанавливающем конце. Остатки D-ксилозы, содержащиеся в фукоидане в минорном количестве, не сульфатированы и найдены во фрагментах, содержащих a-L-фукозу. Фрагменты, содержащие a-L-фукозу и D-глюкуроновую кислоту на восстанавливающем конце, связаны (1—»4)-связью и не сульфатированы. Фрагменты Gal-(l-»4)-GlcA, Gal-(l-»3)-GlcA были также найдены в. исследуемом фукоидане. Возможно, бурая водоросль С. costata синтезирует два разных типа фукоиданов, как описано для Sargassum stenofilum [121] в разделе 2.3.2.3.

При интерпретации тандемных масс-спектров сульфатированных олигосахаридов в основном были использованы результаты работ [66] и [80]. Тем не менее, в процессе выполнения диссертационной работы были сделаны следующие

О 3 уточнения: механизм формирования фрагментов ' X, наблюдаемых во всех сульфатированных фукоолигосахаридах, по-видимому, требует наличия сульфатной группы в положениях С-3 [66] или С-2 [80], поскольку подобные сигналы не наблюдались в МС/МС спектрах олигосахаридов, содержащих уроновую кислоту на ft О восстанавливающем конце [144]. На интенсивность сигналов ' X в случае замещения гликозидного гидроксила влияет также наличие сульфатной группы в положении С-2, 02 так как сигналы ' X в случае с вышеуказанными фукоуронидными фрагментами имели более высокую интенсивность, чем в случае с сульфатированными фукоолигосахаридами. Таким образом, при наличии замещенного атома водорода гликозидного гидроксила, механизм образования вышеуказанного иона °'2Х для олигосахаридов отличается от предложенного ранее [65, 66] для сульфатированных моносахаридов. Это наблюдение позволяет точнее локализовать положение сульфатной группы по соотношению пнтенсивностей фрагментов °'2Х и °'3Х.

Фукоиданы различного строения представляют несомненный интерес для сравнительного исследования проявляемой ими разнообразной биологической активности. Установление строения полисахарида с уточнением положений минорных компонентов является важной задачей, так как имеется ряд примеров, где показано, что за биологическую активность отвечает определенный структурный элемент его молекулы. Так, антикоагулянтную активность гепарина связывают с уникальным пентасахаридным фрагментом, который составляет менее 30% от всей молекулы [129]. Изучение структуры гетерополисахаридов будет продолжено с использованием более эффективных методов хроматографии и с привлечением химических, физико-химических и энзиматических методов структурного анализа.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 4.1 Материалы и оборудование

Реагенты и материалы. Этанол, метанол, неорганические соли и кислоты — коммерческие препараты производства «Реахим» (Россия). ДЕАЕ-целлюлоза, декстраны (Молекулярные массы 10, 20, 40, 80 кДа), метил-Р-О-глюко- и ксилопиранозиды - препараты фирмы «Sigma» (США).

Ламинаран LeL из бурой водоросли Laminaria cichorioides был получен по методике, описанной ранее [148].

Фракция ламинарапа LgLl из бурой водоросли L. gurjanovae, нерастворимая в холодной воде была получена в процессе концентрирования водного раствора ламинарана (LgL) и охлаждения концентрата до 4°С [142]. Растворимая при комнатной температуре фракция ламинарана LgL2 была также получена по методике, описанной в работе [142].

Фракции фукоиданов LeF2 и FeF2'из бурых водорослей L. cichorioides и F. evanescens были получены по методикам, описанным ранее. Моносахаридный состав-фракции LeF2 (мольнып%): Fuc—81%, Xyl—2%, Rha— 8%, Glc—3%, Man—2%, Gal—4% по данным ВЭЖХ [145]. Моносахаридный состав фракции FeF2 (мольный%): Fuc—93%, Xyl—2.8%, Man—0.2%, Gal—4% по данным ВЭЖХ [107].

Фракция фукоидана LgF2 была получена из бурой водоросли L. gurjanovae по методу, описанному в работе [142]. Моносахаридный состав (мольный%): Fuc— 48.2%, Xyl—3.1%, Man—1.5%, Gal—45.5% по данным ВЭЖХ.

Фракция фукоидана CcF2 из бурой водоросли Costaria costata была получена с помощью анионнообенной хроматографии' (см. методы). Моносахаридный состав (мольный %): Fuc—39.7%, Xyl—11.6%, Gal—21.4%, Man—12.0%, GlcA—7.5% поданным ГЖХ ацетатов полиолов.

МАЛДИ масс-спектры регистрировали на времяпролетном масс-спектрометре «BIFLEX III» (Brukcr, Германия), оснащенном азотным, лазером (337 нм) с частотой импульса в 4 Гц и шириной импульса 3 не. Масс-спектрометр использовали в режиме рефлектора и с экстракцией ионов с задержкой.

ИЭР масс-спектры регистрировали на тандемном квадрупольно-времяпролетном масс-спектрометре «6510 LC-QTOF» (Agilent, США) с двойным ИЭР источником.

Моносахаридный состав определяли на углеводном анализаторе IC-5000 Biotronik (Германия) па колонке Shim-pack ISA-07/S2504 (0.4x25см), калий-боратный буфер, скорость элюции 0.6 мл/мин, обнаружение проводили бицинхонинатным методом; интегрирующая система Shimadzu С - R2 АХ. Моносахариды (Rha, Rib, Man, Fuc, Gal, Xyl, Glc) использовали как стандарты.

ГЖХ анализ ацетатов полиолов. Газо-жидкостная хроматография была выполнена с помощью хроматографа Hewlett-Packard 6850 (США) на HP-5MS капиллярной колонке (30 м х 0.4 мм) с использованием температурного градиента от 150 до 230 °С со скоростью 3 °С/мин. Образцы моносахаридов использовали в качестве стандартов.

ИК-спектры полисахаридов регистрировали в таблетках КВг на спектрометре Carl Zeiss IR-75 (Германия).

Молекулярную, массу полисахаридов, определяли методом гель-фильтрации на колонке (1.5x30 см) с Superdex 75 HR 10/30 или Superose 6 HR 10/30 (American Pharmacia Biotech AB). Элюцию проводили 0.05 M фосфатным буфером рН 7.2, содержащим 0.15 М NaCl. Скорость элюции 0.2 мл/мин. Фракции (0.5 мл) анализировали на присутствие углеводов по реакции с фенолом и серной кислотой [149]. В качестве стандартов использовали декстраны (М 10, 20, 40 и 80 кДа для Superdex 75 HR 10/30 и М40, 80 и 200-300 кДа для Superose 6 HR 10/30).

ВЭЖХ выполняли с помощью жидкостного хроматографа Agilent 1100 (США) с рефрактометрическим детектором на колонке Silasorb CJ8 (24x250 мм);

Сверхчистую воду получали с помощью оборудования Direct-Q (Millipore,

США)

4.2 Мётоды

Получение водорастворимых полисахаридов из бурой водоросли Costaria costata. Обезжиренную водоросль (50 г) измельчали до размера частиц не более 1мм, дважды в течение 3 ч экстрагировали 0.05 М раствором соляной кислоты при рН 2.0

2.3 и температуре 20°С (гидромодуль 1:20). Экстракты объединяли, концентрировали до 1/5 объема, нейтрализовали 3 % водным раствором NaHC03 (до рН 5.7), диализовали против 10 объемов дистиллированной воды 48 ч, лиофильно сушили. Сухой препарат растворяли в дистиллированной воде, не растворившийся осадок отделяли центрифугированием (Eppendorf Centrifuge (США) 5804 R, Т=15°С, t=10MHH, У=6500об/мин). Супернатант лиофильно сушили. Получали фракцию полисахаридов СсЭ-1 - 270мг (выход 0.4% от веса сухой водоросли).

Анионообменная хроматография. Раствор полисахарида СсЭ-1 в 0.1 М NaCl (1.9 г в 50 мл) наносили на колонку (3 х 21 см) с DEAE-целлюлозой в СГ-форме, уравновешенную с 0.1 М NaCl. Колонку промывали 0.01Н НС1, сорбированные полисахариды элюировали ступенчатым градиентом NaCl (0.5 М, 1.5 М, 2.0 М). Скорость элюции 1 мл/мин. Собирали фракции по 9 мл, присутствие полисахаридов анализировали фенол-сернокислотным методом [149]. Фракции упаривали, диализовали ультрафильтрацией на мембране NMWL 1000 (Millipore, США) путем последовательного разбавления, затем лиофилизовали. Получали 350 мг препарата CcF0.5, 320 мг препарата CcFl и 250мг препарата CcF2.

Кислотный гидролиз полисахаридов из L. gurjanovae (для определения моносахаридного состава с помощью ВЭЖХ). Раствор 5 мг вещества в 500 мкл 2 N трифторуксусной кислоты нагревали 8 ч при 100°С. После гидролиза смесь нейтрализовали, кислоту отгоняли на роторном испарителе три раза с метанолом.

Автогидролиз полисахаридов. Водный раствор фукоидана (10 мг/мл, в Н-форме, рН 2.0) оставляли при комнатной температуре на 3 сут. После гидролиза смесь нейтрализовали раствором NH.|OH до рН 6.0.

Для. удаления сульфатных групп использовалось сольволитическое десульфатирование (нагревание пиридиниевой соли полисахарида. в диметилсульфоксиде с добавкой метанола) [126]. По окончании реакции* смесь разбавляли водой, дважды лиофилизовали для удаления диметилсульфоксида.

Определение содержания* углеводов в выделенных образцах и фракциях проводили колориметрически по реакции с фенолом и серной кислотой [149]. Молекулярно-массовое распределение ламинарана из L. cichorioides (1-7 кДа), I растворимого» ламинарана из L. gurjanovae (1.3 - 11 кДа), низкомолекулярных продуктов десульфатирования фукоидана из L .gurjanovae (187 Да - 1.7 кДа) и F. evanescens (187 - 917 Да) определяли e помощью МАЛДИ масс-спектрометрии. Молекулярно массовое распределение продуктов автогидролиза фукоидана из L. cichorioides (187 - 1063Да), фракции FE-AF1 F. evanescens (229 - 681 Да), продуктов кислотного гидролиза фукоидана из С. costata (187 - 1063 Да) определяли с помощью масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией.

Моносахаридный состав фракции FE-AF1 был определен после гидролиза 2М ТФУ 4ч при 105 °С с последующим восстановлением в воде с NaBD4 (ночь) при комнатной температуре и ацетилированием [150]. Для определения уроновых кислот гидролизаты упарены с IN НС1 5 раз для конверсии уроиовой кислоты в уроно-1,4-лактон, который был восстановлен NaBD4 с последующим ацетилированием [151].

Содержание сульфатных групп в полисахаридах определяли титриметрическим методом [152].

Дезацетилированне проводили обработкой полисахаридов водным раствором аммиака [112].

4:3.1 Получение олигосахаридов для масс-спектрометрического анализа

Получение олигосахаридов из фукоидана L. cichorioides автогидпдролизом.

Исходный фукоидан (LcF2, 9г) был деполимеризован в условиях автогидролиза. После нейтрализации и ультрафильтрации па мембране Millipore (1 кДа) были получены низкомолекулярная и высокомолекулярная фракции. Выход последней составил 0.33 г. Низкомолекулярная фракция была экстрагирована 95% ЕЮН (15 мин, 60°С). Осадок составил 3.8 г (Lc-AHH), супернатант лиофильно высушили и получили фракцию Lc-AHL с выходом 2;39 г. Подфракцию Lc-AHL использовали для анализа МАЛДИ и ИЭР МС/МС.

Получение олигосахаридов из фукоидана L. gurjanovae в процессе сольволитического i десульфатирования. Дезацетилированный фукоидан (LgF2) был деполимеризован, в условиях сольволитического десульфатирования-(см. выше). Этанольный экстракт продуктов десульфатирования (LgF2-DS) использовали для анализа методом МАЛДИ МС и ИЭР МС/МС.

Получение олигосахаридов из фукоидана L. gurjanovae частичным кислотным гидролизом. Дезацетилированный препарат LgF2 подвергали частичному кислотному гидролизу (0.2 Н ТФУ, Зч, 60°С). После нейтрализации полученный гидролизат (LgF2-H180) анализировали методом МАЛДИ МС.

Получение олигосахаридов из фукоидана F. evanescens в процессе сольволнтического десульфатирования. Дезацетилированный фукоидан FeF2 (100 мг) был деполимеризован условиях сольволнтического десульфатирования (см выше). Выход эганольного экстракта (Fe-DSlmf) составил 60 мг. Этот экстракт был проанализирован методом МАЛДИ МС. Далее, с помощью ВЭЖХ (хроматограф Agilent 1100, скорость потока - 4.8 мл/мин, 60°С, изократический режим, в воде) из него была выделена сульфатированная фракция Fe-AF1 с выходом 4 мг, которую анализировали методом ИЭР МС/МС. Моносахаридный состав данной фракции (мольный %): Fuc—72.8%, Xyl—5.2%, Gal—4.6%, GlcA—17.4% по данным ГЖХ ацетатов полиолов.

Получение олигосахаридов из фукоидана С. costata частичным кислотным гидролизом. Дезацетилированный фукоидан CcF2 подвергали гидролизу в течение 10, 20, 40 и 60 мин 1FI ТФУ при 100°С. После нейтрализации* продукты гидролиза экстрагировали метанолом и супернатант анализировали методом МАЛДИ МС (данные не приведены). Гидролизат CcF2-H60, содержащий, наибольшее количество олигосахаридов (60 минут гидролиза), анализировали методом ИЭР МС/МС. Моносахаридный состав фракции CcF2-H60 (мольный %): Fuc—76.5%, Xyl—1.3%, Rha—1.4%, Gal—20.2, Man—0.6% по данным ГЖХ ацетатов полиолов. Моносахаридный состав осадка гидролизата (60 минут), не растворившегося в метаноле (мольный %): Fuc—56.6%,Man—17.3%, GlcA—13.6%, Glc—12.5.

4.3.2 Получение ламинариолигосахаридов

Гидролиз ламинарана из L. cichorioides под действием эндо-(1—>3)-P-D-глюканазы из Mizuhopecten yessoensis. Ламинаран (2 мг) растворяли в 1 мл ацетатного буфера (буфер А, рН 4.5), содержащего 1 х 10"2 U фермента. Смесь инкубировали 60 мин. при 37°С. Реакцию останавливали кипячением. Продукты ферментативного гидролиза анализировали методом МАЛДИ МС.

Гидролиз ламинарана из L. cichorioides под действием эндо-(1—>3)-P-D-глюканазы из брюхоногого моллюска Littorina kurila. Ламинаран (2 мг) растворяли в 1 мл буфера А, содержащего 1 х 10"2U фермента. Смесь инкубировали 60 мин. при 37°С. Реакцию останавливали кипячением. Продукты ферментативного гидролиза анализировали методом МАЛДИ МС.

4.3.3 Получение ламинариолигозидов реакцией трансгликозилирования

Трансформация ламинарана из L. cichorioides под действием эндо-(1—>3)-(3-D-глюканазы из Mizuhopecten yessoensis в присутствии акцептора. Ламинаран (2 мг) и метил-P-D-глюкопиранозид (2 мг) растворяли в 1 мл 0.05М ацетатного буфера (рН 4.5) , содержащего 10"2 U фермента. Смесь инкубировали 5 мин при 37°С. Реакцию останавливали кипячением. Продукты трансгликозилирования1 анализировали методом МАЛДИ МС.

Трансформация ламинарана из L. cichorioides под действием эндо-(1—>3)-(3-D-глюканазы из Littorina kurila в присутствии различных акцепторов. Ламинаран (2 мг) и метил-Р-О-глюкопиранозид (или метил-p-D-ксилопиранозид (2 мг) или 20% метанол) растворяли в 1 мл 0.05М ацетатного буфера (рН 5.4) , содержащего 10"2 U фермента. Смесь инкубировали 10, 20, 30 мин. при 37°С. Реакцию останавливали кипячением в течение трех минут. Продукты трансгликозилирования анализировали методом МАЛДИ МС.

4.3.4 Анализ поли- и олигосахаридов с помощью МАЛДИ МС

МАЛДИ масс-спектры были записаны при ускоряющем напряжении в 19*кВ. В режиме регистрации положительных ионов использовали 50% раствор одномолярной 2,5-дигндроксибензойной кислоты (DHB) в смеси ацетонитрил/вода (1:1). В режиме регистрации отрицательных ионов в качестве матрицы использовали раствор фенилозазона Б-эрширо-пентозы (арабиноозазона), 10 мг/мл в метаноле [92]. Растворы матриц наносили на мишень в первую очередь в количестве 1 мкл и высушивали в потоке воздуха. Водные растворы исследуемых веществ (~1 мг/мл. для олигосахаридов и ~3 мг/мл для ламинаранов) наносили на мишень в количестве 1 мкл, после чего мишень высушивали в потоке воздуха. Для улучшения качества спектров применяли перекристаллизацию смеси вещество/матрица непосредственно на мишени с помощью метанола. Масс-спектры получены с использованием внешней калибровки по пику ангиотензина-П (Sigma) и пикам матрицы.

4.3.5 Анализ олигосахаридов с помощью ИЭР МС

ИЭР масс-спектры были получены при напряжении иглы в 4 кВ в отрицательном и 3.5 кВ в положительном режимах регистрации при температуре осушающего газа 325 °С и напряжении фрагментора 243 В. Пробоподготовка: сухой образец разбавляли в смеси ацетонитрил/вода (1:1) до получения концентрации -0.01 мг/мл и вводили полученный раствор с помощью шприцевого насоса (KD Scientific, США) со скоростью потока 5 мкл/мин. Калибровку проводили с помощью стандартной калибровочной смеси «HP MIX».

4.3.6 Анализ олигосахаридов с помощью ИЭР МС/МС

В тандсмпом режиме энергия столкновитсльной диссоциации выбиралась из промежутка 10-30 В по интенсивности фрагментных ионов. В качестве столкновительного газа применялся аргон.

1. Yamashita М., Fenn J. В. Negative-Ion Production with the Electrospray Ion-Source. // J. Phys. Chem. 1984. V. 88. N. 20. P. 4671-4675.

2. Aleksandrov M. L., Gall L. N., Krasnov N. V., Nikolaev V. I., Pavlenko V. A., Shkurov V. A. Mechanism of Ion Formation during the Electrohydrodynamic Sputtering of a Liquid into a Vacuum. // J. Anal. Chem-Ussr. 1984. V. 39. N. 9. P. 1268-1274.

3. Rollgen F. W., Bramer-Weigner E., Buttering L. J. // J. Phys Colloq. 1984. V. 45, Supplement 12. P. C9-297.

4. Schmelzeisen-Redeker G., Buttering L. J., Rollgen F. W. Desolvation of ions and molecules in thermospray mass spectrometry // Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes. 1989. V. 90. N. 2. P. 139-150.

5. Hillenkamp F., Karas M. Mass-Spectrometry of Peptides and Proteins by Matrix-Assisted Ultraviolet-Laser Desorption Ionization. // Methods in Enzymol. 1990. V. 193. P. 280-295.

6. Karas M., Hillenkamp F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. // Anal. Chem. 1988. V. 60. N. 20. P. 2299-2301.

7. Stump M. J., Fleming R. C., Gong W. H., Jaber A. J., Jones J. J., Surber C. W., Wilkins C. L. Matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. // Applied Spectroscopy Reviews. 2002. V. 37. N. 3. P. 275-303.

8. Chen X. J., Carroll J. A., Beavis R. C. Near-ultraviolet-induced matrix-assisted laser desorption/ionization as a function of wavelength. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998. V. 9. N. 9. P. 885-891.

9. Knochenmuss R. A quantitative model of ultraviolet matrix-assisted laser desorption/ionization. // J. Mass Spectrom. 2002. V. 37. N. 8. P. 867-877.

10. Dreisewerd K. The desorption process in MALDI. // Chem. Reviews. 2003. V. 103. N. 2. P. 395-425.

11. Karas M., Kruger R. Ion formation in MALDI: The cluster ionization mechanism. // Chem. Reviews. 2003. V. 103. N. 2. P. 427-439.

12. Zenobi R., Knochenmuss R. Ion formation in MALDI mass spectrometry. // Mass Spectrom. Reviews. 1998'. V. 17. N. 5. P. 337-366.

13. Knochenmuss R., Zenobi R. MALDI ionization: The role of in-plume processes. // Chem. Reviews. 2003. V. 103. N. 2. P. 441-452.

14. Spengler В., Cotter R. J. Ultraviolet-Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry of Proteins above 100000 Daltons by Pulsed Ion Extraction Time-of-Flight Analysis. // Anal. Chem. 1990. V. 62. N. 8. P. 793-796.

15. Vorm O., Roepstorff P.Mann M. Improved resolution and'very high sensitivity in MALDI TOF of matrix surfaces made by fast evaporation. // Anal. Chem. 1994. V. 66. N. 19. P. 3281-3287.

16. Xiang F., Beavis R*. C. A method'to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization^ by the fabrication of thin protein-doped poly crystal line films. // Rapid Commun: Mass Spectrom. 1994. V. 8. P. 199-204.

17. Mechref Y., Novotny, M. V. Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry of acidic glycoconjugates facilitated by the use of spermine as a co-matrix. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998. V. 9. N. 12. P. 1293-1302.

18. Gusev A. I., Wilkinson W. R., Proctor A., Hcrcules D. M. Improvement of Signal Reproducibility and Matrix/Comatrix Effects in Maldi Analysis. // Anal. Chem. 1995. V. 67. N. 6. P. 1034-1041.

19. Laine R. A. Glycobiology 4 // (1994).

20. Barber M., Bordoli R. S., Sedgwick R. D., Tyler A. N. Fast Atom Bombardment of Solids (Fab) a New Ion-Source for Mass-Spectrometry. // J. Chem. Soc. - Chem. Commun. 1981. V. N. 7. P. 325-327.

21. Karas M., Bachmann D., Bahr U., Hillenkamp F. Matrix-Assisted Ultraviolet-Laser Desorption of Nonvolatile Compounds. // Int. J.Mass Spectrom Ion Proc. 1987. V. 78. P. 53-68.

22. Mock К. K., Davey M., Cottrell, J. S. The Analysis of Underivatised Oligosaccharides by Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. // Biochem. andBiophys. Res. Commun. 1991. V. 177. N. 2. P. 644-651.

23. Garozzo D., Spina E., Sturiale L., Montaudo G., Rizzo, R. Quantitative-Determination of Beta(l-2) Cyclic Glucans by Matrix-Assisted Laser-Desorption Mass-Spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1994. V. 8. N. 5. P. 358-360.

24. Huberty M. C., Vath J. E., Yu W.Martin S. A. Site-Specific Carbohydrate Identification in Recombinant Proteins Using Mald-Tof Ms. // Anal. Chem. 1993. V. 65. N. 20. P. 2791-2800.

25. Shen X. D., Perreault H. Characterization of carbohydrates using a combination of derivatization, high-performance liquid chromatography and mass spectrometry. // J. Chromatography A. 1998. V. 811. N. 1-2. P. 47-59.

26. Harvey D. J. Quantitative Aspects of the Matrix-Assisted Laser-Desorption Mass-Spectrometry of Complex Oligosaccharides. // Rapid Coinmun. Mass Spectrom.1993. V. 7. N. 7. P. 614-619.

27. Fenn J. В., Mann M., Meng С. K., Wong S. F., Whitehouse, С. M. Electrospray Ionization-Principles and Practice. // Mass Spectrom. Reviews. 1990. V. 9. N. 1. P. 37-70.

28. Meng С. K., Mann M., Fenn J. B. Of Protons or Proteins a Beams a Beam for a That (Burns,O.S.). // Zeitschrift Fur Physik D-Atoms Molecules and Clusters. 1988. V. 10. N. 2-3. P. 361-368.

29. Burlingame, A. L., Boyd, R. K.Gaskell, S. J. Mass-Spectrometry. // Anal. Chem.1994. V. 66. N. 12. P. R634-R683.

30. Reinhold, V. N., Reinhold, В. В., Costello, С. E. Carbohydrate Molecular-Weight Profiling, Sequence, Linkage, and Branching Data Es-Ms and Cid. // Anal. Chem.1995. V. 67. N. 11. P. 1772-1784.

31. Wilm, M. S., Mann, M. Electrospray and Taylor-Cone Theory, Doles Beam of Macromolecules at Last. // Int. J. Mass Spectrom. 1994. V. 136. N. 2-3. P. 167-180.

32. Bahr, U., Pfenninger, A., Karas, M., Stahl, B. High, sensitivity analysis of neutral underivatized oligosaccharides by nanoelectrospray mass spectrometry. // Anal. Chem. 1997. V. 69. N. 22'. P. 4530-4535.

33. Безукладников, П. В., Елякова, Л. А., Звягинцева, Т. Н.Миргородская, О. А. Изучение реакции, катализируемых карбогидразами, с помощью масс-спектрометрии ЭРИАД. //Химия природ, соедпн. 1989. № 1. С. 54-59.

34. Busch, К. L., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Mass Spectrometry/Mass Spectrometry: Techniques and- Applications of Tandem Mass Spectrometry // (VCH, New York, 1988).

35. Cooks, R. G., Beynon, J. H., Caprioli, R. M., Lester, G. R: Metastable Ions // (Elsevier, Amsterdam, 1973).

36. McLafferty, F. W. Tandem Mass Spectrometry // (JohnWiley & Sons, Inc., New York, 1983).

37. Bosso, С., Heyraud, A., Patron, L. Oligosaccharide Characterizations by Fast-Atom-Bombardment Mass-Spectrometry Fragmentation Study in Relation to the Substituent at the Reducing End. // Organ. Mass Spectrom. 1991. V. 26. N. 4. P. 321334.

38. Carr S. A., Reinhold V. N., Green B. N., Flass J. R. Enhancement of Structural Information in Fab Ionized Carbohydrate Samples by Neutral Gas Collision. // Biomed Mass Spectrom. 1985. V. 12. N. 6. P. 288-295.

39. Domon В., Muller D. R., Richter W. J. Identification of Interglycosidic Linkages and Sugar Constituents in Disaccharide Subunits of Larger Glycosides by Tandem Mass-Spectrometry. // Organ. Mass Spectrom. 1989. V. 24. N. 5. P. 357-359.

40. Gillece-Castro B. L., Burlingame A. L. Biological Mass Spectrometry // (ed. McCloskey, A. L. B. a. J. A.) (Elsevier, Amsterdam, 1990).

41. Orlando R., Bush C. A1., Fenselau C. Structural-Analysis of Oligosaccharides by Tandem Mass-Spectrometry Collisional Activation of Sodium Adduct Ions. // Biomed. Environ. Mass Spectrom. 1990. V. 19. N. 12. P. 747-754.

42. Duffin K. L., Welply J. K., Huang E., Henion J. D. Characterization of N-Linked Oligosaccharides by Electrospray and Tandem Mass-Spectrometry. // Anal. Chem.1992. V. 64. N. 13. P. 1440-1448.

43. Linsley К. В., Chan S. Y., Chan S., Reinhold В. B„ Lisi P. J., Reinhold V. N. Applications of Electrospray Mass-Spectrometry to Erythropoietin N-Linked and O-Linked Glycans. // Anal. Biochem. 1994. V. 219. N. 2. P. 207-217.

44. Phillips N. J., Apicella M. A., Griffiss J. M., Gibson B. W. Structural Studies of the Lipooligosaccharides from Haemophilus-Influenzae Type-B Strain-A2. // Biochem.1993. V. 32. N. 8. P. 2003-2012.

45. Perreault, PI., Costello С. E. Liquid secondary ionization, tandem and matrix-assisted laser-desorption ionization time-of-flight mass-spectrometric characterization of glycosphingolipid derivatives// Org. Mass Spectrom. 1994. V. 29. P. 720-735.

46. Spengler В., Kirch D., Kaufmann R., Lemoine J. // Org. Mass Spectrom. 1994. V. 29. P. 782.

47. Domon В., Costello С. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. // Glycoconj. J. 1988. V. 5. N. 4. P. 397-409.

48. Zaia J., Miller M. J. C., Seymour J. L., Costello С. E. The role of mobile protons in negative ion CID of oligosaccharides. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007. V. 18. N. 5. P. 952-960.

49. Karlsson N. G., Karlsson H., Hansson G. C. Sulphated mucin oligosaccharides from porcine small intestine analysed by four-sector tandem mass spectrometry. // J. Mass Spectrom. 1996. V. 31. N. 5. P. 560-572.

50. Minamisawa Т., Hirabayashi J. Fragmentations of isomeric sulfated monosaccharides using electrospray ion trap mass spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. V. 19. N. 13. P. 1788-1796.

51. Tissot В., Salpin J. Y., Martinez M., Gaigeot M. P., Daniel, R. Differentiation of the fucoidan sulfated L-fucose isomers constituents by CE-ESIMS and molecular modeling. // Carbohydr. Res. 2006. V. 341. N. 5. P. 598-609.

52. Carroll J. A., Willard D., Lebrilla С. B. Energetics of Cross-Ring Cleavages and Their Relevance to the Linkage Determination of Oligosaccharides. // Analytica Chimica Acta. 1995. V. 307. N. 2-3. P. 431-447.

53. Saad О. M., Leary J. A. Delineating mechanisms of dissociation for isomeric heparin disaccharides using isotope labeling and ion trap tandem mass spectrometry. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004. V. 15. N. 9. P. 1274-1286.

54. Desaire H., Leary J. A. Utilization of MS3 spectra for the multicomponent quantification of diastereomeric N-acetylhexosamines. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000. V. 11. N. 12. P. 1086-1094.

55. Angel A. S., Nilsson Bl Analysis of Glycoprotein Oligosaccharides by Fast-Atom-Bombardment Mass-Spectrometry. //Biomed. Environ. Mass Spectrom. 1990. V. 19. N. 11. P. 721-730.

56. Звягинцева Т. H., Елякова Jl. А., Исаков, В. В. // Биоорган, химия. 1995. № 21. С. 208-216.

57. Т. H. Звягинцева, Т. H. Макарьева, С. П. Ермакова, Л. А. Елякова. Получение п-нитрофенил-ламинариолигозидов реакцией трансгликозилироваиия, катализируемой эндо-1,3-(3-0-глюканазой из морского моллюска // Биоорган, химия. 1998, Т. 24. № 3. С. 219-223.

58. Sinnott М. L. Catalytic Mechanisms of Enzymatic Glycosyl Transfer. // Chem. Reviews. 1990. V. 90. N. 7. P. 1171-1202.

59. Harvey D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. // Mass Spectrom: Rev. 1999. V. 18. N. 6.- P. 349-450:

60. Bjorndal Н., Ilellerquist С. G., Lindberg В., Svensson S. // Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1970. V. 9. P. 610-619.

61. Daniel R., Chevolot L., Carrascal M., Tissot В., Mourao P. A. S., Abian J. Electrospray ionization mass spectrometry of oligosaccharides derived from fucoidan of Ascophyllum nodosum. 11 Carbohydr. Res. 2007. V. 342. N. 6. P. 826-834:

62. Noseda M. D., Cerezo A. S. Room-Temperature, Low-Field С-13-Nmr Spectra of Degraded Carrageenans .3. Autohydrolysis of a Lambda Carrageenan and of Its Alkali-Treated Derivative. // Int. J. Biol. Macromol. 1993. V. 15. N. 3. P. 177-181.

63. Stortz C. A., Cerezo A. S. Specific Fragmentation of Carrageenans. // Carbohydr. Res. 1987. V. 166. N. 2. P. 317-323.

64. Stortz C. A., Cerezo A. S. Room-Temperature, Low-Field С-13-Nmr Spectra of Degraded Kappa-Iota-Carrageenans. // Int. J. Biol. Macromol. 1991. V. 13. N. 2. P. 101-104.

65. Беседнова H. H., Иванушко Л. А., Звягинцева Т. H., Елякова Л. А. Иммунотропные свойства 1—>3; 1 —>6-Р-В-глгоканов. // Антибиотики и химиотерапия. 2000. т. 45. № 2. С. 37-44.

66. Kobayashi A., Tai A., Kawazu К. Structural Elucidation of an Elicitor-Active Oligosaccharide, Ln-3, Prepared from Algal Laminaran. // J. Carbohydr. Chem. 1995. V. 14. N. 6. P. 819-832.

67. Manners D. J., Seiler A., Sturgeon R. J. Studies on Beta-Glucanases .6. Observations on the Endo-(l-.4)-Beta-D-Glucanase Activity of Extracts of Barley. // Carbohydr. Res. 1982. V. 100. N. Mar. P. 435-440.

68. Percival E., McDowell, R. H. Chemistry and Enzymology of Marine Algal Polysaccharides // (Academic Press, New York and London, 1967).

69. Stone B. A., Clarke A. E. Chemistry and Biology of (l-3)-Glucans, La Trobe University Press // (La Trobe University Press, Melbourne, Australia, 1992).

70. Read S. M., Currie G., Bacic A. Analysis of the structural heterogeneity of laminarin by electrospray-ionisation-mass spectrometry. // Carbohydr. Res. 1996. V. 281. N. 2. P. 187-201.

71. Chen P., Baker A. G., Novotny M. V. The use of osazones as matrices for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. // Anal. Biochem. 1997. V. 244. N. 1. P. 144-151.

72. Dell A. F.A.B.-mass spectrometry of carbohydrates. // Adv Carbohydr. Chem. Biochem. 1987. V. 45. P. 19-72.

73. Chizhov A. O., Dell A., Morris H. R., Reason A. J., Haslam S. M., McDowell R: A., Chizhov O. S., Usov A. I. Structural analysis of laminarans by MALDI and FAB mass spectrometry. // Carbohydr. Res. 1998. V. 310. N. 3. P. 203-210.

74. Nishino Т., Nagumo Т., Kiyohara H., Hamada H. Structural characterization of a new anticoagulant fiican sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome. II Carbohydr. Res. 1991. V. 211. N. 1. P. 77-90.

75. Glabe С. G., Grabel L. В., Vacquier V. D., Rosen S. D. Carbohydrate Specificity of Sea-Urchin Sperm Binding a Cell-Surface Lectin Mediating Sperm-Egg Adhesion. // J. Cell Biol. 1982. V. 94. N. 1. P. 123-128.

76. Mourao P. A. S., Bastos I. G. Highly Acidic Glycans from Sea-Cucumbers -Isolation and Fractionation of Fucose-Rich Sulfated Polysaccharides from the Body Wall of Ludwigothurea-Grisea. II European J. Biochem. 1987. V. 166. N. 3. P. 639645.

77. SeGall G. K., Lennarz W. J. Chemical characterization of the component of the jelly coat from sea urchin eggs responsible for induction of the acrosome reaction. // Dev Biol. 1979. V. 71. N. 1. P. 33-48.

78. Li В., Lu F., Wei X. J., Zhao R. X. Fucoidan: Structure and bioactivity. // Molecules. 2008. V. 13. N. 8. P. 1671-1695.

79. Black W. A. P., Dewar E. Т., Woodward F. N. Manufacture of algal chemicals. IV.-Laboratory-scale isolation of fucoidin from brown marine algae. // J. Sci. Food Agric. 1952. V.3.P. 122-129.

80. Nishino Т., Nishioka C., Ura H., Nagumo, T. Isolation and Partial Characterization of a Novel Amino Sugar-Containing Fucan Sulfate from Commercial Fucks Vesiculosa Fucoidan. // Carbohydr. Res. 1994. V. 255. P. 213-224.

81. Conchie J., Percival' E. G. V. Fucoidin part II. The hydrolysis of a methylated fucoidin prepared from Fucus vesiculosus. II J. Chem. Soc. 1950. V. P. 827-833.

82. O'Neill A. N. Degradative studies on-fucoidan. // J. Amer. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 5074-5076.

83. Anno K., Seno N., Ota M. Isolation of L-fucose 4-sulfate from fucoidan. // Carbohydr. Res. 1970. V. 13. P. 167-169.

84. Patankar M. S., Oehninger S., Barnett Т., Williams R. L., Clark G. F. A Revised Structure for Fucoidan May Explain Some of Its Biological-Activities. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. N. 29. P. 21770-21776.

85. Bilan, M. I., Grachev, A. A., Ustuzhanina, N. E., Shashkov, A. S., Nifantiev, N. E., Usov, A. I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag. // Carbohydr. Res. 2002. V. 337. N. 8. P. 719-730.

86. Bilan M. I., Grachev A. A., Ustuzhanina N. E., Shashkov A. S., Nifantiev N. E., Usov A. I. A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. // Carbohydr. Res. 2004. V. 339. N. 3. P. 511-517.

87. Bilan M. I., Grachev A. A., Shashkov A. S., Nifantiev N. E., Usov A. I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L. // Carbohydr. Res. 2006. V. 341. N. 2. P. 238-245.

88. Schweiger R. G. Methanolysis of fucoidan. I. Preparation of methyl a-L-fucoside and L-fucose. // J. Org. Chem. 1962. V. 27. P. 4267-4272.

89. Chizhov A. O., Dell A., Morris H. R., Haslam S. M., McDowell R. A., Shashkov A. S. Nifant'ev N. E., Khatuntseva E. A., Usov A. I. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum. И Carbohydr. Res. 1999. V. 320. N. 1-2. P. 108-119.

90. Mian J., Percival E. Carbohydrates of the brown seaweeds Himanthalia lorea and Bifurcaria bifurcata Part II. structural studies of the "fucans". // Carbohydr. Res. 1973. V. 26. P. 147-161.

91. Hussein M. M., Abdel A., Salem H. M. Sulfated heteropolysaccharides from Padina pavoia. II Phytochem. 1980. V. 19. P. 2131-2132.

92. Hussein M. M., Abdel A., Salem H. M. Some structural features of a new sulfated heteropolyssaride from Padina pavoia. II Phytochem. 1980. V. 19. P. 2133-2135.

93. Chevolot L., Mulloy В., Ratiskol J., Foucault A., Colliec-Jouault S. A disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae. // Carbohydr. Res. 2001. V. 330. N. 4. P. 529-535.

94. Marais M. F., Joseleau J. P. A fucoidan fraction from Ascophyllum nodosum. И Carbohydr. Res. 2001. V. 336: N. 2. P. 155-159.

95. Li В., Wei X. J., Sun J. L., Xu S. Y. Structural investigation of a fucoidan containing a fucose-free core from the brown seaweed, Hizikia fusiforme. II Carbohydr. Res. 2006. V. 341. N. 9. P. 1135-1146.

96. Duarte M. E. R., Cardoso M. A., Noseda M. D., Cerezo A. S. Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum. II Carbohydr. Res. 2001. V. 333. N. 4. P. 281-293.

97. Ponce N. M. A., Pujol C. A., Damonte E. В., Flores M. L., Stortz, C. A. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies. // Carbohydr. Res. 2003. V. 338. N. 2. P. 153-165.

98. Bilan M. I., Usov A. I. Structural analysis of fucoidans. // Nat. Prod. Comms. 2008. V. 3.N. 10. P. 1639-1648.

99. Ciucanu I., Kerek F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates // Carbohydr. Res. 1984. N. 131. P. 209-217.

100. Усов А. И., Смирнова Г. П., Билан М. И., Шашков А. С. Бурая водоросль Laminaria saccharina как источник фукоидана// Биоорган, химия. 1998. Т. 24 № 6. С. 437-445.

101. Taylor R. L., Shively J. Е., Conrad Н. Е. Stoichiometric Reduction of Uronic Acid Carboxyl Groups in Polysaccharides. In Methods in Carbohydrate Chemistry // (ed. Whistler, R. L., BeMiller, J. N.) (Academic Press, New York, San Francisco, 1976).

102. Zhang Z. Q., Yu G. L., Zhao X., Liu H. Y., Guan H. S., Lawson A. M., Chai W. G. Sequence analysis of alginate-derived oligosaccharides by negative-ion electrospray tandem mass spectrometry. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2006. V. 17. N. 4. P. 621630.

103. Rabenstein D. L. Heparin and heparan sulfate: structure and function. // Nat. Prod. Reports. 2002. V. 19. N. 3. P. 312-331.

104. Fukuta K., Nakamura T. Induction of hepatocyte growth factor by fiicoidan and fucoidan-derived oligosaccharides. // J. Pharmacy and Pharmacol. 2008. V. 60. N. 4. P. 499-503.

105. Shanmugam M., Mody К. H. Heparinoid-active sulphated polysaccharides from marine algae as potential blood anticoagulant agents. // Curr. Sci. 2000. V. 79. N. 12. P. 1672-1683.

106. Lindahl U., Backstrom G., Thunberg L. The Antithrombin-Binding Sequence in Heparin Identification of an Essential 6-O-Sulfate Group. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. N. 16. P. 9826-9830.

107. Zaia J., Costello С. E. Tandem mass Spectrometry of sulfated heparin-like glycosaminoglycan oligosaccharides. // Anal. Chem. 2003. V. 75. N. 10. P. 24452455.

108. Zaia J. Mass spectrometry of oligosaccharides. // Mass Spectrom. Reviews. 2004. V. 23. N. 3.P. 161-227

109. Saad, O. M.Leary, J. A. Heparin sequencing using enzymatic digestion and ESI-MSn with HOST: A heparin/HS oligosaccharide sequencing tool. // Anal. Chem. 2005. V. 77. N. 18. P. 5902-5911.

110. Berteau O., Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide. // Glycobiol. 2003. V. 13. N. 6. P. 29-40.

111. Huggett A. G., Nixon D. A. Enzymatic determination of blood glucose. // Biochem. J. 1957. V. 66. P. 12.

112. Pesentseva M. S., Kusaykin M. I., Anastyuk S. D., Sova V. V., Zvyagintseva T. N. Catalytic properties and mode of action of endo-(l—>3)-beta-D-glucanase and beta

113. D-glucosidase from the marine mollusk Littorina kurila. // Carbohydr. Res. 2008. V. 343. N. 14. P. 2393-2400.

114. Шевченко, H. M., Анастюк, С. Д., Герасименко, Н. И., Дмитренок, П. С., Исаков, В. В.Звягинцева, Т. Н. Полисахаридный и липидный состав бурой водоросли Lominaria gurjanovae. II Биоорган, химия. 2007. т. 33. № 1. С. 96-107.

115. Звягинцева Т. Н., Широкова Н. И., Елякова, Л. А. // Биоорган, химия. 1994. т. 20. № 12. С. 1349-1358.

116. Yoon S. J:, Pyun Y. R., Iiwang J. K., Mourao P. A. A sulfated fiican from the brown alga Laminaria cichorioides has mainly heparin cofactor II-dependent anticoagulant activity. // Carbohydr. Res. 2007. V. 342. N. 15. P. 2326-2330.

117. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith, F. // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

118. Sawardeker J. S., Sloneker J. H., Jeanes, A. // Anal. Chem. 1965. V. 37. P. 16021604.

119. Jones Т. M., Albersheim P. A Gas Chromatographic Method for the Determination of Aldose and Uronic Acid Constitulents of Plant Cell Wall Polysaccharides. // Plant Physiol. 1972. V. 49. P. 926-936.

120. Кошелева, Л. П.Глебко, Л. И. // Химия природ, соедип. 1977. № 4. С. 500-502.