Структура и механизм биологического действия некоторых полисахаридов и полифенолов растительного происхождения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Ермакова Светлана Павловна

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ И ПОЛИФЕНОЛОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

2 8 НОЯ 2013

ВЛАДИВОСТОК-2013

005541539

005541539

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Звягинцева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: Оводов Юрий Семенович

Академик РАН, доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, директор.

Булгаков Виктор Павлович

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук, главный научный сотрудник.

Новикова Ольга Данииловна

Доктор химических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук, ведущий научный сотрудник.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва

Защита состоится « 25 » декабря 2013 г. в « 10 » часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

№

Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение природных соединений - важная научная область, лежащая на стыке химии, биологии и медицины. Она включает работы по поиску, выделению, установлению строения, изучению химических превращений и биологических функций природных веществ. Эти исследования играют важную роль в углублении химических и биологических знаний, создают научную основу для разработки новых лекарств и биологически активных добавок к пище.

Исследования механизмов действия веществ привели к открытию новых свойств природных соединений, входящих в состав пищевого рациона человека. Были обнаружены противоопухолевые свойства полифенола из зелёного чая -эпигаллокатехин галлата. Присутствием резвератрола в красном вине был объяснён так называемый "французский парадокс" - тот факт, что сердечно-сосудистые заболевания относительно редко встречаются у жителей юга Франции, регулярно употребляющих красное вино (при местной диете богатой насыщенными жирами). Бурые водоросли, широко используемые в пищу в странах Юго-Восточной Азии, стали объектом повышенного интереса в связи с обнаружением у сульфатированных полисахаридов водорослей - фукоиданов - целого спектра биологических активностей, в том числе и противоопухолевой. Необходимо отметить, что фукоиданы часто образуют прочные комплексы с полифенолами, одним из которых является эпигаллокатехин галлат -известный полифенол зеленого чая. Актуальным представляется изучение механизмов действия фукоиданов различной структуры и полифенолов в процессах регуляции развития опухолей.

Онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности людей. Несмотря на усилия ученых и врачей во всем мире, это заболевание уносит огромное число человеческих жизней и занимает второе место по смертности после сердечно-сосудистой патологии. Основными методами лечения онкологических заболеваний являются хирургический, лучевая и химиотерапия. Однако хирургическое вмешательство не всегда дает желаемый результат вследствие распространения опухолевых клеток за пределы первичного очага и развития метастазов, а при лучевой терапии происходит повреждение пограничных здоровых тканей.

Поиск новых противоопухолевых средств ведут во многих направлениях - среди антиметаболитов, алкилирующих агентов, антибиотиков, гормонов. Препараты растительного происхождения составляют около 1 % от общего числа исследуемых противоопухолевых средств. Изучение противоопухолевой профилактической и терапевтической активностей природных соединений проводят научные коллективы разных стран. В Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук ведутся работы в области химии, биохимии, биотехнологии и молекулярной клеточной биологии природных соединений из наземных и морских организмов. Комплексное изучение новых природных соединений позволяет обнаружить вещества, обладающие противоопухолевыми свойствами, определить их оптимальные действующие концентрации и перспективные комбинации.

Таким образом, актуальным направлением профилактики и лечения онкологических заболеваний является поиск природных соединений, повышающих устойчивость организма к развитию опухолей, и снижающих возможность рецидива опухоли после проведенной лучевой или химиотерапии; а также исследование

механизмов их действия. Эффективным подходом представляется комбинированная противоопухолевая химиотерапия, сочетающая в себе препараты с различными механизмами действия.

Цель работы - определение структуры природных соединений, обладающих противоопухолевым действием, изучение их влияния на регулирование процессов клеточной трансформации, пролиферации и апоптоза для установления взаимосвязи между структурой и функцией.

В задачи исследования входили:

1. поиск биологически активных полисахаридов в бурых водорослях, произрастающих в морях Дальнего Востока России, Японии и Республики Корея (Японское и Охотское моря), Социалистической Республики Вьетнам (Южно-Китайское море) и Ливанской республики (Средиземное море);

2. сравнительное изучение полисахаридных композиций бурых водорослей разных регионов;

3. установление структуры выделенных полисахаридов с использованием химических, ферментативных и спектральных методов, систематизация по структурным типам;

4. определение взаимосвязи между структурой и функцией полисахаридов с применением химических и ферментативных методов их модификации;

5. изучение молекулярных механизмов биологического действия фукоиданов разных структурных типов и полифенолов растительного происхождения (катехинов зеленого чая, резвератрола);

6. определение возможностей комбинации веществ с различными механизмами действия для лечения онкологических заболеваний;

7. определение закономерностей, позволяющих прогнозировать свойства новых веществ;

8. выбор перспективных природных соединений для создания на их основе оригинальных отечественных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Содержание и структура водорастворимых полисахаридов бурых водорослей зависят от видовой принадлежности, среды обитания и стадии развития водоросли.

2. Фукоиданы бурых водорослей относятся к разным структурным группам, различающимся моносахаридным составом, типом связи ме>еду моносахаридными остатками в цепи полисахарида, степенью сульфатирования и ацетилирования, местоположением заместителей.

3. Фукоиданы бурых водорослей обладают канцерпревентивным и противоопухолевым действием. Избирательность биологического действия связана со структурными характеристиками фукоиданов.

4. Противоопухолевое действие ламинаранов бурых водорослей зависит от молекулярной массы и степени разветвления полисахарида.

5. Эпигаллокатехин галлат (EGCG) - катехин зеленого чая, влияет на пролиферацию, трансформацию и индукцию апоптоза раковых клеток. Механизм его действия обусловлен взаимодействием с белками, участвующими в передаче внутриклеточных сигналов.

6. Резвератрол - флавоноид красного вина, участвует в процессах пролиферации раковых клеток. Фукоидан из бурой водоросли Saccharina (=Laminaria) cichorioides обладает способностью усиливать апоптотическое действие резвератрола.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Выполнено сравнительное изучение состава полисахаридов 13 видов бурых водорослей. Выделены и охарактеризованы 32 фракции фукоиданов и 2 фракции ламинаранов из бурых водорослей, произрастающих в морях различных регионов. Их структурные характеристики были установлены физико-химическими и ферментативными методами. Впервые выделен высокомолекулярный разветвленный ламинаран, установлены структурные характеристики полисахарида, определяющие его противоопухолевое действие. Проведена систематизация структурных типов исследованных фукоиданов. Обнаружен новый структурный тип фукоидана.

Впервые проведено комплексное исследование противоопухолевой активности и механизма действия фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens, Saccharine cichoríoídes, Saccharína japónica, Undaria pinnatifida, Sargassum mcclurei, относящихся к разным структурным группам.

Впервые установлена избирательность противоопухолевого действия фукоиданов, обусловленная их структурой. Показано, что наличие 1—>3-связанных сульфатированных остатков a-L-фукозы необходимо для ингибирования как трансформации нормальных клеток, индуцированной эпидермальным фактором роста (EGF), так и роста колоний раковых клеток кишечника человека. Сульфатированный и частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 1->3- и 1-»4-связанных остатков а-/.-фукозы, ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека. Для ингибирования роста колоний опухолевых клеток молочной железы человека необходимо присутствие в молекуле фукоидана большого количества сульфатированных и частично ацетилированных остатков галактозы и фукозы, соединенных 1—>3- и/или 1—>4-0-гликозидными связями.

Получены новые сведения, касающиеся механизмов биологического действия водорастворимых полисахаридов бурых водорослей и полифенолов растительного происхождения.

Впервые показано, что взаимодействия эпигаллокатехин галлата (EGCG, катехина зеленого чая) с белком цитоскелета - виментином; белком, регулируемым глюкозой (GRP78); а также трансмембранной (IGF-1R) и цитоплазматической (Fyn) тирозинкиназами являются важными для регулирования процессов пролиферации и трансформации клеток, а также преодоления резистентности опухолевых клеток к лекарственным препаратам. Установлено, что галлатная группа является определяющей в проявлении катехинами биологической активности.

Впервые выявлен синергизм при совместном действии резвератрола и фукоидана из S. cichorioides: убедительно продемонстрировано, что терапевтическая активность резвератрола в присутствии фукоидана может быть значительно увеличена.

Показана высокая перспективность использования полисахаридов бурых водорослей, полифенолов растительного происхождения, а также сочетания этих веществ как основы для получения агентов с широким спектром биологической активности.

По результатам данной работы получены 2 патента РФ на изобретения, связанные с открытием новых перспективных противоопухолевых препаратов профилактической и терапевтической направленности.

Апробация работы. Результаты работы были представлены автором лично в виде устных и стендовых сообщений на различных Международных конференциях.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликованы 49 работ, в том числе 35 научных статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ (из них 21 в зарубежных и 14 статей в российских журналах), и 2 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав: обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, а также выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 478 источников, в том числе 414 на английском языке. Работа изложена на 253 страницах машинописного текста, содержит 71 рисунок и 16 таблиц.

Автор благодарна научному консультанту, профессору Звягинцевой Т.Н. за позитивную критику и справедливые замечания в ходе выполнения работы. Также благодарит всех сотрудников лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, а именно: к.х.н. Вищук О.С., к.х.н. Меньшову Р.В., к.б.н. Кусайкина М.И., к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Шевченко Н.М., к.х.н. Имбс Т.И., к.х.н. Захаренко A.M., м.н.с. Песенцеву М.С., м.н.с. Сильченко A.C., д.х.н. Бакунину И.Ю., д.х.н. Елякову Л.А., к.б.н. Дубровскую Ю.В., н.с. Киселеву М.И., вед. инж. Исакову Т.В. и лаб. Ляхову З.П. за всестороннюю поддержку и помощь на всех этапах выполнения и обсуждения работы. Автор благодарна также к.х.н. Исакову В.В., к.х.н. Анастюку С.Д. и к.ф.-м.н. Глазунову В.П. за получение и помощь в обработке спектральных данных; к.х.н. Зыковой Т.А., проф. Zigang D., проф. Bode A.M., проф. Zhu F., проф. Choi B.Y., проф. Choi H.S., проф. Kang B.S., проф. Cho Y.Y. (Hormel Institute, University of Minnesota, Austin, MN, США) - за помощь в работе и проведении отдельных экспериментов по изучению биологической активности; к.х.н. Иванчиной Н.В. - за помощь в ходе оформления диссертации; к.б.н. Горшковой И.А., к.б.н. Бердышеву Е.В. - за комментарии к работе и моральную поддержку. Отдельную благодарность хочется выразить сотрудникам отдела научной информации ТИБОХ ДВО РАН Бабко В.А., Зиновой С.М. и Чувилиной O.E. за квалифицированную помощь при работе с периодическими изданиями.

Обозначения:

АР-1 - ядерный транскрипционный фактор; АТР - аденозинтрифосфат; Cdc2 - ген клеточного цикла 2; c-foc - транскрипционный фактор; c-Jun - белок семейства транскрипционного фактора Jun; СОХ-2 - циклооксигеназа 2; ЕС - эпикатехин; ECG -эпикатехин галлат; EGC - эпигаллокатехин; EGCG - эпигаллокатехин галлат; EGF -эпидермальный фактор роста; EGFR - рецептор эпидермального фактора роста; ERKs -киназы, регулирующие внеклеточные сигналы; Fyn - белок Src-семейства тирозинкиназ; GRP78 - белок, регулируемый глюкозой; 1С50 - концентрация вещества, при которой происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50 %; IGF-1 -инсулиноподобный фактор роста 1; IGF-1 R - рецептор инсулиноподобного фактора роста 1; JNKs - Jun N-концевые киназы; Kd - константа диссоциации; МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы; MMPs - матриксные металлопротеиназы; MTS - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2-Н-тетразол; р38 - белок семейства MAP киназ; р53 - белок-супрессор опухолей; PGE2 - простагландин Е2; РКА -протеинкиназа A; RSV - резвератрол; STAT-1 - белок семейства транскрипционных факторов; ТРА- 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат; УФ - ультрафиолетовый.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Несмотря на успехи науки и техники в создании синтетических лечебных препаратов, лекарства из растений продолжают занимать важное место в народной медицине. Особенный интерес возник к изучению опыта использования растений, которые широко применяются в странах Азии. Показано, что в странах, где традиционно потребляется большое количество овощей, рыбы, водорослей, фруктов и чая (Юго-Восточная Азия, страны Средиземноморья), уровень заболеваемости раком гораздо ниже по сравнению с таковым в Европе и Америке. Эта статистика стимулирует изучение биологических особенностей компонентов пищи, составляющих основу традиционного питания той или иной страны.

1 Морские организмы как источники биологически активных полисахаридов, полисахаридгидролаз с уникальной специфичностью и их ингибиторов

1.1 Фукоиданы бурых водорослей

Бурые водоросли, запасы которых в мировом океане велики, являются богатым и легко возобновляемым сырьевым источником биологически активных полисахаридов (альгиновых кислот, ламинаранов и фукоиданов). Для выделения этих полисахаридов были выбраны бурые водоросли, распространенные в морях различных регионов: Дальнего Востока России, Японии и Республики Корея (Японское и Охотское моря), Социалистической Республики Вьетнам (Южно-Китайское море) и Ливанской республики (Средиземное море): Saccharine cichorioides {= Laminaría cichorioides), S. japónica (= Laminaria japónica), Fucus evanescens, Undaria pinnatifida, Costaría costata, Eisenia bicyciis, Ecklonia cava, Sargassum sp., Sargassum oiigocystum, S. horneri, S. mcciurei, Dictyopteris poiypodioides и Padina pavonica.

Для выделения полисахаридов из бурых водорослей нами были использованы с некоторыми модификациями разработанные в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН методы комплексной переработки водорослей и получения водорастворимых полисахаридов (рис. 1 ). Модификации методов выделения полисахаридов связаны с

Сухая водоросль изменением условий

| экстракция этанолом

Г

Обезжиренная водоросль

экстракция кислотой

Экстракт

1

Остаток водоросли

экстракция щелочью

Экстракт

диалиэ;

осаждение этанолом

Экстра Этне игр алиэация; диализ;

концентрирование; лиофильная сушка Водорастворимые полисахариды (Р)

анионобменная хроматография (Macro-Prep DEAE); диалш;

концентрирование;

предварительной обработки водоросли: вместо этанола использовали чистый и модифицированный (с добавлением 5 % этанола) сверхкритический диоксид углерода. Было изучено влияние различных условий предварительной обработки на выходы и структурные характеристики фукоиданов из F. evanescens, S. japonica и S. oiigocystum. Из водоросли, обработанной модифицированным сверхкритическим диоксидом углерода, были получены

высокосульфатированные гомогенные фракции фукоиданов. Модификация схемы выделения фукоиданов, связанная с заменой экстракции этанолом экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода с добавлением 5 % этанола, в ряде случаев позволит исключить стадию анионообменной хроматографии, что может сократить расходы на промышленное производство фукоиданов и упростить их стандартизацию.

Для фракционирования фукоиданов из бурых водорослей использовали анионообменный носитель Macro-Prep DEAE, элюирование полисахаридов проводили линейным градиентом NaCI. В результате разделения на Macro-Prep DEAE водорастворимых полисахаридов из изучаемых водорослей были получены фукоиданы, представленные в таблице 1.

гидрофобная хроматография (Полихром-1); конценгирование; у лиофильная сушка 1

Альгинаты (А) Ламинараны (I.} Фукоиданы!!')

Рисунок 1 - Схема выделения полисахаридов (альгинатов, ламинаранов и фукоиданов) из бурых водорослей

Таблица 1 - Характеристика фукоиданов, полученных из бурых водорослей анионообменной хроматографией на Macro-Prep DEAE1

Водоросль. Фракция Элюент [NaCI], M Выход, %2 Содержание, %3 Моносахаридный состав, моль/моль Fuc Ацетаты6

фукоидана Сульфаты4 Полифенолыь Fuc Gal Man Xyl Rha Glc

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Saccharina cichorioides

ScF1 0.9-1.1 1.0 21 0 1 0 0.2 0 0.03 0 H.O.

ScF2 1.1-1.6 2.2 39 0 1 0 0 0 0 0 -

Saccharina japónica

SjF1 0.4-0.9 0.8 10 0 1 0.6 0.3 0.02 0.03 0 H.O.

SjF2 1.0-1.6 3.0 23 0 1 0.55 0.02 0.03 3.0 0 +

lindaría pinnatifida

UpF1 0.4-0.9 1.1 14 0 1 0.5 0.15 0.03 0 0 H.O.

UpF2 1.0-1.6 1.8 29 0 1 0.9 0.02 0 0.08 0 +

Costaría costata

CcF 1.0-1.4 0.2 18.9 0 1.0 0.8 0 0.1 0.1 0 +

Eisenia bicyclis

EbF 0.8-1.4 1.4 13.5 0 1.0 0.3 0.1 0.1 0 0 -

Ecklonia cava

EcF1 0.8-1.3 0.8 19.1 0 1.0 0.2 0.1 0 0.2 0 -

EcF2 1.3-1.4 0.2 22.2 0 1.0 0.3 0 0.1 0 0.4 -

Fucus evanescens

FeF1 0.8-1.0 1.4 15 0 1 0.2 0.15 0.03 0.04 0 H.O.

FeF2 1.0-1.6 3.2 27 0 1 0.02 0 0 0 0 +

Sargassum sp.

SF1 0.1-0.2 0.1 6.2 1.8 1.0 0.4 0.3 0.2 0.2 0.1 +

SF2 0.5-0.8 0.4 19.6 4.9 1.0 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 -

SF3 0.9-1.0 0.3 23.3 7.6 1.0 0.4 0.1 0.1 0.1 0.1 -

SF4 1.2-1.4 0.4 28.8 6.0 1.0 0.3 0.1 0.1 0.1 0.1 +

со

Продолжение таблицы 1

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12

01с1уор1епэ ро!уроШоШев

ОрР1 0-0.3 следы 5.8 0 1.0 0.3 0.3 0.2 0.2 0.3 -

йрР2 0.4-0.7 0.1 12.7 0 1.0 0.1 0.3 0.4 0.2 0.1

РрРЗ 0.7-0.8 следы 13.1 0 1.0 0.2 0.3 0.2 0.2 0.1 . +

0рР4 0.9-1.0 0.1 13.4 0 1.0 0.8 0.1 0.2 0.3 | 0.2 +

РасИпа рауотса

РрР1 0.5-0.9 0.2 4.4 0.3 1.0 0.4 0.4 0.1 0.4 0.2 +

РрР2 0.9-1.3 0.1 14.9 1.1 1.0 0.6 0.4 0.1 0.4 0.2 +

РрРЗ 1.3-1.7 следы 17.9 1.5 1.0 1.4 0.2 0.1 0.3 0.3 +

вагдаззит 1югпеп

0.5-1.0 1.5 14.9 0 1.0 0.1 0 0 0.1 0 -

1.0-1.3 1.3 0 0 1.0 0 0 0 0.2 0 -

БИРЗ 1.3-1.7 0.3 16.9 0 1.0 0 0 0 0.5 | 0 -

вагдавзит оИдосуэШт

ЗоР1 0.5-1.0 1.5 17.4 0 1.0 0.2 0.8 0.1 0.1 0.2 н.о.

БоР2 1.0-1.3 1.3 24 0 1.0 0.4 0.2 0.1 0 0.2 н.о.

БоРЗ 1.3-1.7 0.3 32 0 1.0 0.3 0 0 0 0 н.о.

вагдавзит тсс/иге/

5тР1 0.7-0.8 0.23 16.8 0 1 0.7 1.3 0.2 0 | 0.4 -

БтР2 0.8-1.4 0.35 25.7 0 1 0.8 0.1 0.1 0 0.2 -

БтРЗ 1.4-1.8 0.29 35 0 1 0.7 0 0 0 0 -

из

1 - вещества белковой природы, определенные по методу Брэдфорд, отсутствовали во всех фракциях;

2 - % от веса обезжиренной водоросли;

3 - % от навески; н.о. - не определяли;

4 -турбидиметрический метод;

5 - метод Фолина-Чокапьте;

6 - спектры 13С ЯМР; (-) - сигналы, характерные для ацетатных групп отсутствовали; (+) - присутствовали сигналы 175.9 и 21.7 м.д.

1.1.1 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из

Saccharína cichorioides

Анализ моносахаридного состава образцов, полученных из S. cichorioides, показал, что фракция ScF1 содержала фукозу и небольшие количества маннозы и рамнозы; фракция ScF2 содержала только фукозу (табл. 1). Наиболее сульфатированным оказался фукан ScF2: 39 % сульфатных групп.

В ИК спектре ScF2 наблюдалась характерная полоса поглощения при 1230-1256 см'1 (S=0 колебания). Полосы поглощения при 851 и 830 см"1 (C-0-S деформационные колебания) для фукана ScF2 показывали, что сульфатные группы в данном полисахариде находятся в аксиальном положении при С4 и в экваториальном положении при С2. "С ЯМР спектры фукоиданов были сложными из-за гетерогенности моносахаридного состава, разветвленности и высокой степени сульфатирования, поэтому давали ограниченную информацию о структуре данных полисахаридов.

В 13С ЯМР спектре фукана ScF2 присутствовали сигналы углеродных атомов СН3-групп (16.3-16.5 м.д.), С1 (99.5-100.3 м.д.) и интенсивный сигнал С2 (67.7 м.д.) фукопиранозы; область сигналов СЗ-С5 остатков фукозы была плохо разрешена.

Для интерпретации ЯМР спектров были проведены химические модификации сульфатированных полисахаридов. После сольволитического десульфатирования степень сульфатирования фукана ScF2 снизилась на 30 % (остаток - 9 % сульфатных групп). В 13С ЯМР спектре десульфатированного фукоидана в области резонанса аномерных атомов углерода присутствовали сигналы с химическими сдвигами 96.6. (С1), 67.9 (С2), 76.3 (СЗ), 69.7 (С4), 67.8 (С5) и 16.3-16.5 м.д. (С6), которые характерны для 1—>3-связанных остатков a-i.-фукопиранозы. В области слабого поля 'Н ЯМР спектра десульфатированного полисахарида наблюдались сигналы разной интенсивности (4.4-5.4 м.д.), среди которых выделялся сигнал при 5.11 м.д. (H1 a-Fucp). В области резонанса протонов при С6 6-дезоксипираноз (1.2-1.35 м.д.) наиболее интенсивным был сигнал при 1.24 м.д. (Н6 a-Fucp).

Анализ двумерных 'Н-1Н COSY, TOCSY и NOESY спектров был затруднен из-за многочисленности кросс-пиков и их перекрывания. Однако серия наиболее интенсивных сигналов была идентифицирована как принадлежащая протонам остатков a-L-фукопиранозы (Н2 при 3.97; НЗ при 4.01; Н4 при 4.03 м.д; Н1 и Н6 - как указано выше).

Анализ МАПДИ ВП масс-спектров олигосахаридов, полученных методом автогидролиза фукана ScF2, дал следующий состав смеси: моносульфат, дисульфат фукозы (основные компоненты) и набор олигосахаридов со степенью полимеризации 2-5 и числом сульфатов на молекулу до 3. Фрагменты полисахарида содержали 2- и реже 4-сульфатированные 1 —>3-связанные остатки фукозы в качестве превалирующей структурной единицы. Расхождения с данными ИК спектроскопии фукоидана ScF2 могут быть связаны с частичным отщеплением сульфатов при С4 в процессе автогидролиза.

1.1.2 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из

Saccharína japónica

Полисахарид SjF1, выделенный из S. japónica, оказался гетерогенным по моносахаридному составу: помимо большого количества фукозы, галактозы и маннозы, он содержал минорные количества других моносахаридов (табл. 1). Фракция SjF2 отличалась высоким содержанием фукозы, галактозы и незначительным содержанием ксилозы и рамнозы (табл. 1). Содержание сульфатных групп для SjF1 и SjF2 составляло 10 и 23 % соответственно.

В ИК спектре SjF2 (аналогично спектрам фукоиданов из S. cichorioides) наблюдалось поглощение при 1230-1256 см''. Полосы поглощения при 849 и 823 см"1 для SjF2 показывали, что сульфатные группы в данном полисахариде находятся как в аксиальном положении при С4, так и в экваториальном - при С2.

В 13С ЯМР спектре галактофукана SjF2 имелись сигналы, характерные для остатка p-D-галактопиранозы: С1 (103.7 м.д.) и менее интенсивный сигнал С6 (62.0 м.д.), указывающий на присутствие свободной СНгОН группы. В спектре присутствовали также сигналы, характерные для ацетатных групп в полисахариде (21.7 м.д., СН3; 175.9 м.д., С=0). Аномерные сигналы С1 (99.5-101.7 м.д.) и С6 (16.5 м.д.), область сигналов С2-С5 (65.0-83.0 м.д.) свидетельствовали о наличии 1->3-0-гликозидной связи ме>кду остатками а-;_-фукопиранозы.

Согласно полученным данным сульфатированный полисахарид SjF2 являлся галактофуканом (табл. 1). Галактофуканы, выделенные из бурой водоросли S. japónica, отличаются от фукоиданов из других видов бурых водорослей семейства Laminarinaceae, построенных преимущественно из остатков a-L-фукозы. Значительное содержание галактозы отмечалось у фукоиданов из Eclonia киготе и Saccharína gurjanovae семейства ламинариевых.

1.1.3 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из

lindaría pinnatifida

Полисахарид UpF1, выделенный из U. pinnatifida, содержал фукозу, галактозу, незначительные количества маннозы, ксилозы и глюкозы. Фракция UpF2 содержала фукозу, галактозу в соотношении 1:0.9 и минорные количества маннозы, следовательно, представляла собой галактофукан (табл. 1). Содержание сульфатных групп, определенное турбидиметрическим методом, для UpF1 и UpF2 составляло 14 и 29% соответственно.

В ИК спектре высокосульфатированного галактофукана UpF2 (аналогично спектрам фукоиданов из S. cichorioides и S. japónica) наблюдалось характерное для сульфатов поглощение при 1230-1256 см"1. Полосы поглощения при 849 и 829 см'1 для UpF2 показывали, что сульфатные группы в данном полисахариде находятся как в аксиальном положении при С4, так и в экваториальном при С2 остатков фукозы и/или галактозы соответственно.

В 13С ЯМР спектре UpF2 имелись сигналы с химическими сдвигами 103.6-104.8 м.д. и интенсивный сигнал с химическим сдвигом 62.0 м.д., характерные для С1 остатков P-D-галактопиранозы и С6 свободной СН2ОН группы остатка P-D-галактопиранозы соответственно. Аномерные сигналы С1 (97.0-102.7 м.д.), С6 (16.4-16.9 м.д.) и интенсивный сигнал С2 (67.7 м.д.) указывали на присутствие 1->3- и 1 —>4-связанных остатков a-L-фуко- и p-D-галактопиранозы. Сигналы с химическими сдвигами 21.7 м.д. и 175.9 м.д. указывали на присутствие ацетатных групп в молекуле полисахарида.

1.1.4 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из

Costaría costata, Eisenia bicyclis и Ecklonia cava

Бурые водоросли С. costata, Е. bicyclis и Е. cava были собраны в Японском море (Восточное побережье Республики Корея). Фукоиданы CcF и EbF (табл. 1), выделенные из С. costata и Е. bicyclis, представляли собой сульфатированные (18.9 и 13.5% соответственно) галактофуканы, содержащие минорные количества других

моносахаридов. По данным ,3С ЯМР спектроскопии фукоидан CcF содержал ацетатные группы (21.0 и 173.7 м.д.).

Фукоиданы EcF1 и EcF2 из Е. cava представлены рамногалакто- и галактоглюкофуканами, содержащими 19.1 и 22.2 % сульфатов соответственно (табл. 1). К сожалению, 13С ЯМР спектры фукоиданов CcF, EbF, EcF1 и EcF2 оказались сложными и малоинформативными для анализа структуры, как у многих других фукоиданов водорослей. Они содержали интенсивные сигналы в аномерной области (96.5-102.7 м.д.), а также типичные для a-t-фукопиранозидов сигналы в области высокочастотных полей (16.5-16.9 м.д.).

В литературе имеются ограниченные сведения о характеристиках структуры сульфатированных полисахаридов бурых водорослей С. costata и Е. bicyclis. Информация о структуре фукоиданов из Е. cava отсутствует. Согласно литературным данным, фукоидан из Е. bicyclis (Тихоокеанское побережье, Япония) представляет собой высокосульфатированный (32.3 %) фукан. Из бурой водоросли С. costata (Японское море, Россия) были выделены сульфатированные галактофуканы, включающие также остатки маннозы и рамнозы. Различия в характеристиках структуры выделенных нами фукоиданов и описанных ранее в литературе, вероятно, обусловлены различными условиями произрастания водорослей, местом и временем их сбора, а также различиями в методах выделения и фракционирования фукоиданов.

1.1.5 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из

Fucus evanescens

Фракция FeF1 из F. evanescens имела гетерогенный моносахаридный состав. Она содержала фукозу, маннозу и незначительные количества рамнозы и ксилозы (табл. 1). Фракция FeF2 содержала фукозу с минорным количеством галактозы и ксилозы (табл. 1) следовательно, представляла собой сульфатированный фукан. Содержание сульфатных групп в FeF1 и FeF2 составляло 15 и 27 % соответственно.

В ИК спектре FeF2 (аналогично спектрам фукоиданов из S. cichorioides, S. japónica и U. pinnatilida) наблюдалось поглощение при 1230-1256 см"1 и полоса поглощения при 829 см'1, которые свидетельствовали о наличии сульфатных групп при С2 остатка фукозы в полисахариде.

В 13С ЯМР спектре фукана FeF2 наблюдали характерные сигналы для С1 (99.9 м.д.) и С6 (около 16.6 м.д.) а-£-фукопиранозы, а также сигналы, указывающие на присутствие ацетатных групп (21.7 м.д., СН3; 175.9 м.д., С=0) в полисахариде. Показано, что фукан из F. evanescens содержал помимо фукозы минорные компоненты - ксилозу, маннозу и галактозу (табл. 1). Положение минорных компонентов в структуре фукоидана не было установлено.

Для более детального структурного анализа фукана FeF2, полисахарид деполимеризовали методом автогидролиза и полученные олигосахариды анализировали с помощью МАЛДИ ВП и ИЭР масс-спектрометрии. Смесь состояла из моносульфатированной фукозы и набора фукоолигосахаридов с четной степенью полимеризации (п = 2-6) и числом сульфатных групп до 5. Анализ масс-спектров олигосахаридов, полученных из фукоидана FeF2, дал следующий состав смеси: [->3)-а-í.-Fucp-2-S03"-(1->]n, п = 1-4; p-D-Galp-2-S03"-(1->4)-p-D-Galp; a-L-Fucp-2-S03"-(1-»4)-a-¿-Fucp-2-S03"; a-Z.-Fucp-(1-»3)-GlcA; a-L-Fucp-(1->4)-a-L-Fucp-(1->3)-GlcA; a-L-Fucp-(1-»3)-a-L-Fucp-(1->4)-GlcA. С помощью ИЭР масс-спектрометрии в FeF2 был установлен тип

связи между остатками Fue и Gal; обнаружены остатки глюкуроновой кислоты и определен тип ее связей с остатками фукопиранозы.

1.1.6 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из

Dictyopteris polypodioides, Padina pavonica и Sargassum sp.

Основная часть полисахаридов D. polypodioides, P, pavonica и Sargassum sp. представлена альгинатами. Содержание в них водорастворимых полисахаридов, представленных практически только одними фукоиданами (ламинараны отсутствовали), было невелико. Суммарные выходы фукоиданов для водорослей D. polypodioides, Р. pavonica и Sargassum sp. составляли 0.3, 0.2 и 1.2 % соответственно от веса обезжиренной водоросли (табл. 1). Фукоиданы, выделенные нами из D. polypodioides, Р. pavonica и Sargassum sp., оказались сульфатированными гетерополисахаридами. Основным моносахаридным остатком практически всех фукоиданов являлась фукоза, исключение составлял высокосульфатированный гетерогенный полисахарид PpF3 с высоким содержанием галактозы. Гетерогенная структура фукоиданов, выделенных из D. polypodioides, Р. pavonica и Sargassum sp., подтверждалась данными 13С ЯМР спектроскопии. Как и у многих других фукоиданов из бурых водорослей, 13С ЯМР спектры полученных нами фукоиданов являлись сложными и малоинформативными для анализа структуры. Тем не менее, в них можно было выделить группы сигналов в аномерной области (96.5-102.7 м.д.), а также типичные для a-L-фукопиранозидов сигналы в области высокочастотных полей (16.5-16.9 м.д.). Сигналы 21.5-22.0 м.д. (СН3) и 175.3-176.1 м.д. (С=0) в ,ЭС ЯМР спектрах фракций DpF3, DpF4, PpF1, PpF2, PpF3, SF1 и SF4 свидетельствовали о наличии ацетатных групп.

Из водорослей Средиземного моря нами были выделены как низко-, так и высокосульфатированные фукоиданы. Наименьшая степень сульфатирования (4.4-6.2 %) наблюдалась у фракций DpF1, PpF1 и SF1. Наиболее высокосульфатированными были фракции DpF4, PpF3 и SF4 (13.4-28.8%). Полифенолы отсутствовали во фракциях фукоиданов, выделенных из D. polipodioides, содержание их в фукоиданах из Р. pavonica не превышало 1.5 %, в Sargassum sp. -7.6 %. Белки отсутствовали во всех фракциях фукоиданов.

1.1.7 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из

Sargassum hornerí

Фукоидан ShF1, выделенный из S. hornerí, представлял собой сульфатированный фукан, содержащий следовые количества галактозы и рамнозы, фукоидан ShF3 -сульфатированный рамнофукан (табл. 1). Степень сульфатирования ShF1 и ShF3 составляла 14.9 и 16.9 % соответственно. В ,3С ЯМР спектрах фукоиданов ShF1 и ShF3 присутствовали интенсивные сигналы в аномерной области, характерные для 1->3-связанных остатков фукозы (100.0-100.3 м.д.), и сигналы меньшей интенсивности, соответствующие остаткам 1-»4-связанной фукозы (98.9-99.7 м.д.). Вызывает интерес отсутствие сульфатных групп во фракции ShF2, элюируемой соответственно между фракциями ShF1 и ShF3. Фукоидан ShF2 состоял в основном из фукозы и небольшого количества рамнозы (табл. 1). 13С ЯМР спектр ShF2 содержал сигналы 99.1 и 94.8 м.д. приблизительно равной интенсивности, характерные для 1-»3- и 1 ->4-связанных несульфатированных остатков фукозы. Отсутствие сульфатных групп у фукоидана ShF2 подтверждено данными химического анализа. Причины сорбции его на анионообменной смоле не установлены.

1.1.8 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из Багдаззит тсс1иге1

Полисахарид ЭтР1, выделенный из & тсс/иге/, оказался гетерогенным по моносахаридному составу: помимо большого количества фукозы, маннозы и галактозы, он содержал минорные количества других моносахаридов (табл. 1). Фракция БтЯг отличалась высоким содержанием фукозы, галактозы и незначительным содержанием маннозы, ксилозы и глюкозы (табл. 1). Фракция БтРЗ содержала фукозу и галактозу в соотношении 1:0.7, следовательно, являлась галактофуканом (табл. 1). Содержание сульфатных групп для 8тР1, БтР2 и ЭтРЗ составило 16.8, 25.7 и 35 % соответственно.

В 13С ЯМР спектре галактофукана ЭтРЗ имелись сигналы С1 (102.7-104.1 м.д.), характерные для [З-О-галактопиранозы и менее интенсивный сигнал при С6 (61.7 м.д.), указывающий на присутствие свободной СН2ОН группы в остатке р-О-галактопиранозы, сигналы, характерные для ацетатных групп, отсутствовали. Интенсивный сигнал в области 69.7 м.д. соответствовал С6 остатков галактозы, связанных 1—»6-0-гликозидными связями. Аномерные сигналы С1 (96.0-100.4 м.д.) и С6 (15.5-17.7 м.д.), область сигналов С2-С5 (65.0-83.0 м.д.) свидетельствовали о наличии 1—>3-0-гликозидной связи между остатками а-/.-фукопиранозы.

Для установления структуры фукоидана ЭтРЗ использовали методы сольволитического десульфатирования и метилирования. В 13С ЯМР спектре десульфатированного фукоидана БтРЗ присутствовала большая группа сигналов в области резонанса аномерных атомов (96.5-102.7 м.д.). Фукоидан ЭтРЗ содержал остатки фукозы и галактозы, соединенные различным типом связи. Интенсивность пика (61.7 м.д.), соответствующего С6 со свободной гидроксильной группой в остатке галактозы, существенно увеличивалась после десульфатирования, что говорит о наличии сульфатных групп в положении С6 галактозы.

Характер замещения моносахаридных остатков в полисахариде был установлен метилированием. Анализ продуктов метилирования показал, что ЭтРЗ содержит 1-»3-связанные остатки фукозы, некоторое количество 1-»4-связанных остатков фукозы, 1->4- и 1->6-связанных остатков галактозы. При этом фукоза и галактоза находятся на невосстанавливающем конце молекулы фукоидана, на восстанавливающем конце содержатся 6-связанные остатки галактозы. Сульфатные группы находятся в свободных положениях С2, СЗ или С4 остатков фукозы и С6 галактозы.

Для более детального структурного анализа фукоидан БтРЗ деполимеризовали автогидролизом, полученную смесь олигосахаридов анализировали с помощью МАЛДИ-ВП и ИЭР масс-спектрометрии. Ниже приведены фрагменты, структуры которых были установлены масс-спектрометрическими методами:

1. а-/.-Риср-2-803'-(1 ->3)-а-/.-Риср-2-803"

2. а-/.-Риср-(1 ->3)-а-(.-Риср-2,4-ди-803'

3. а-/.-Риср-2-803'-(1 -*4)-а-/.-Риср-2,3-ди-30з"

4. а-/.-Риср-2,4-ди-30з"-(1 ->3)-а-/.-Риср

5. р-0-Са1р-4,3-ДИ-30з"-(1 ->3)-а-/.-Риср-2-80з"

6. р-0-Са1р-6,3-ди-303"-(1 ->4)-а-/.-Риср-3-303"

7. а-/.-Риср-2,4-ди-30з"-(1 ->4)-р-0-0а1р-2-303"

8. a-¿-Fucp-(1->4)-p-D-Galp-3-SOз"-(1-)3)-a-L-Fucp-2-SOз'-(1->3)-a-L-Fucp-2-SOз"

9. а-1-Риср-2-803'-(1 -»4)-р-0-Са1р-(1-»3)-а-/.-Риср-2-80з"-(1 ->4)-р-0-Са1р-(1 ->3)-а-ЬРиср

10. р-0-Са1р-2-803'-(1 ->3)-а-^-Риср-2-80з'-(1-»4)-р-0-Са1р-(1->3)-а-/.-Риср-(1 ->3)-а-/.-Рис р

11.[->3)-а-/.-Риср-2-303"-(1->]п, п = 1-4

12. а-ЬСа1р-2-30з"-(1 -*4)-а-£-0а1 р

13. а-(.-Риср-2-303'-(1 ->4)-а-Л-Рис/>2-803"

Показано, что фрагменты полисахарида содержали 1—>3- и 1->4-связанные остатки фукозы 2- и реже 3- и/или 4-сульфатированные и галактозы (структуры 1-7, 11-13). Следует отметить, что нами впервые показано чередование остатков фукозы и галактозы в главной цепи полисахарида (структуры 8-10). Полученные данные существенно дополняют информацию о структурном многообразии фукоиданов.

1.2 Ламинараны бурых водорослей

В предыдущих разделах показано структурное разнообразие водорастворимых полисахаридов бурых водорослей - фукоиданов, которые гетерогенны по моносахаридному составу, степени сульфатирования и ацетилирования. Другие водорастворимые полисахариды бурых водорослей - ламинараны, низкомолекулярные 1->3;1-»6-р-0-глюканы (М, = 3-6 кДа), значительно различаются как соотношением, так и способом включения 1-»3- и 1->6-связей в цепь р-О-глюкана.

1.2.1 Выделение ламинаранов из Е/'вел/а ЫсусНв

По модифицированной схеме выделения полисахаридов, представленной на рис. 2, с использованием дробного осаждения полисахаридов из экстракта обезжиренной водоросли 2-мя и 4-мя объемами 96 % этанола были получены водорастворимые полисахариды 1ЕЫ. и 2ЕЫ. соответственно (табл. 2). Анализ моносахаридного состава образцов 1ЕЫ и 2ЕЫ показал, что фракции содержали глюкозу, то есть являлись ламинаранами. 13С ЯМР спектры ламинаранов 1ЕЫ. и 2ЕЫ- были практически идентичны. Они включали сигналы, характерные для остатков глюкопиранозы, замещенной по положениям 3 и/или 6, и сигнал малой интенсивности с химическим сдвигом 64.5 м.д., характерный для маннита. Молекулярные массы ламинаранов были установлены гель-проникающей хроматографией: 19-27 кДа (1ЕЫ.) и 2.5-5.5 кДа (2ЕЫ) и подтверждены МАЛДИ ВП масс-спектрометрией (для 2ЕЫ.). Ламинаран (фракция 1ЕЫ), имеющий молекулярную массу, значительно (практически в 5 раз) превышающую традиционную для ламинаранов (3-6 кДа), выделен впервые. Соотношение связей 1 —»3:1 —>6 в ламинаранах 1ЕЫ. и 2ЕЫ. было рассчитано из сравнения интенсивностей сигналов аномерных протонов в 'Н ЯМР спектрах и составило для обеих фракций 1.5:1 (табл. 2).

Таблица 2 - Характеристика ламинаранов из Е. ЫсусНэ

Фракция ламинарана Выход, %* Интервал молекулярных масс, кДа** Соотношение связей 1 —»3:1 —»6***

1ЕЫ 0.6 19-27 1.5:1

2ЕЫ 1.0 2.5-5.5

' - % от веса обезжиренной водоросли;

** - гель-проникающая хроматография на колонке 5ирегс1ех 75 НИ; ""-спектры 'Н ЯМР.

Сухая водоросль

_| экстракция (70 % QH5OH, 23 °С, 10 дн.)

Обезжиренная водоросль Экстракт

экстракция (0.1 М HCl, pH 2.5, 60 °С, 2 х 2 ч)

Остаток водоросли

| экстракция (2 % Na2C03, 55 "С, 2 х 2 ч) Экстракт

1 Экстракт

нейтрализация;

концентрирование;

осаждение (96 % С2Н5ОН, 1:2)

диализ;

осаждение (96 % С2Н5ОН, 1:3)

Г

1ЕЬР

Н20, гидрофобная хроматография (Полихром-1, 15 % С2Н5ОН); анионообменная хроматография (Macro-Prep DEAE, Н30); концентрирование, лиофильная сушка

анионообменная хроматография (DE АЕ-целл юл оза)

0.5 М NaCl, диализ; концентрирование; лиофильная сушка

1.0 М NaCl, диализ; концентрирование; лиофильная сушка

1.5 М NaCl, диализ; концентрирование; лиофильная сушка

!EbF2

lEbL

НгО, гидрофобная хроматофафия (Полихром-1, 15 % С2Н5ОН); анионообменная хроматография (Macro-Prep DEAE, Н20); концентрирование, лиофильная сушка

0.5 М NaCl, диализ; концентрирование; лиофильная сушка

Супернатант

концентрирование; осаждение (96 % С2Н5ОН, 1:4)

2ЕЬР

Супернатант

анионообменная хроматография (DEAE-целлюлоза)

1.0 М NaCl, диализ; концентрирование; лиофильная сушка

1.5 М NaCl, диализ; концентрирование; лиофильная сушка

2ЕМ,

Рисунок 2 - Схема выделения полисахаридов (альгинатов, ламинаранов и фукоиданов) из бурой водоросли В. ЫсусНэ ЕЬА - альгиновые кислоты; ЕР - водорастворимые полисахариды; ЕЫ_ - ламинараны, ЕЬР - фукоиданы

1.2.2 Структура высокомолекулярного ламинарана из Elsenia bicyclis

1.2.2.1 Исследование структуры ламинарана классическими химическими

методами

Установление характеристик структуры необычного высокомолекулярного ламинарана 1 EbL (далее - EbL) было проведено с использованием химических, физико-химических и ферментативных методов. Характер замещения моносахаридных остатков в полисахариде был установлен методом метилирования. С помощью ГЖХ-МС в виде ацетатов частично метилированных полиолов были идентифицированы 2,3,4,6-тетра-OMe-GIc; 2,4,6-Tpn-OMe-Glc; 2,3,4-Tpn-OMe-Glc и 2,4-fln-OMe-Glc, соответствующие концевым невосстанавливающим 1-»3-, 1->6- и 1-»3;1-»6-связанным остаткам глюкозы, в соотношении 1:2.8:1.2:0.8. Наличие довольно большого количества невосстанавливающих концов, а также «точек ветвления» говорит о высокой разветвленное™ полисахарида. Деградация по Смиту ламинарана EbL приводила к его деполимеризации. Продукты деградации по Смиту были разделены на три олигосахаридные фракции EbLdSI, EbLdS2 и EbLdS3 методом гель-проникающей хроматографии и изучены с помощью ЯМР спектроскопии и МАЛДИ ВП масс-спектрометрии. Продукты деградации представляли собой смесь олигосахаридов со степенью полимеризации 5-9 (EbLdS2) и 7-18 (EbLdSI), из чего следовало, что остатки 1-»6-связанной глюкозы входят в основную цепь ламинарана. Интересно, что в 'Н ЯМР спектрах фракций EbLdSI и EbLdS2 помимо сигналов, характерных для С1 1->3-связанной p-D-глюкозы (4.7-4.8 м.д.), имелись также сигналы малой интенсивности 4.52 (С1) и 4.22 м.д. (С6), свидетельствующие о наличии 1->6-связанных остатков глюкозы (соотношение связей 1—>3:1—>6 = 4:1). Возможно, некоторые остатки глюкозы в ламинаране гликозилированы по положению 6 не единичными остатками глюкозы, а остатками ламинариолигосахаридов, что обеспечивает недоступность подобной конструкции для реагента. В 1Н ЯМР спектре наиболее низкомолекулярной фракции EbLdS3 присутствовали только сигналы, характерные для 1-*3-связанных остатков глюкозы (4.7-4.8 м.д.), а масс-спектр содержал сигналы, свидетельствующие о наличии олигосахаридов со степенью полимеризации 2-4, имеющих на восстанавливающем конце остаток глицерина. Эти данные позволили предположить, что протяженность участков, построенных из остатков 1->3-связанной глюкозы без разветвлений или с разветвлениями в виде одного остатка глюкозы по положению 6, составляет не более четырех остатков глюкозы.

1.2.2.2 Ферментативная трансформация ламинарана из Eisenia bicyclis

Было проведено изучение кинетики накопления продуктов гидролиза ламинарана EbL ферментами различного типа действия: эндо-1-»3-р-0-глюканазой LIV из Pseudocardium sacchalinensis (смесь олигосахаридов обозначена как EbLendo) и экзо-1 ->3-|3-0-глюканазой из Chaetomium indicum (продукты обозначены как EbLexo' и EbLexo). Ламинаран из Saccharina cichorioides (ScL) был использован в качестве образца сравнения. Его структурные характеристики следующие: соотношение связей 1 —»3:1 —>6 = 10:1; 1->6-связанные остатки глюкозы находятся в виде единичных ответвлений от основной цепи, состоящей из 1->3-связанных остатков глюкозы, интервал М, - 3-6 кДа.

Фракции олигосахаридов ЕЫепйо и ЕЫехо были получены исчерпывающим ферментолизом (степень гидролиза ламинарана 25.2 и 42.8 % соответственно). Дополнительно была получена фракция ЕЫехо' (степень гидролиза ламинарана 18.7%). В результате гель-проникающей хроматографии продуктов ферментативного гидролиза фракций ЕЫепс1о и ЕЫехо были получены препараты глюкоолигосахаридов ЕЫепсЫ, ЕЫепЬо2, ЕЫепсЫ, ЕЫепс1о4 и ЕЫехо1, ЕЫехо2, ЕЫехоЗ, ЕЫехо4, ЕЫехо5, различающиеся по степени полимеризации и соотношению связей 1 —>3:1 —>-6. Из фракции ЕЫехо' была выделена и охарактеризована наиболее высокомолекулярная фракция ЕЫ.ехо'1. Характеристики ламинариолигосахаридов представлены в табл. 3.

Набор олигосахаридов, полученных из ЕЫ_ после гидролиза экзоглюканазой, показал структурное разнообразие фрагментов в исходном ламинаране. Можно предположить, что продукты гидролиза ламинарана ЕЫ экзо-1->3-р-0-глюканазой из С. ¡псИсит, содержащие только 1-»6-связанные остатки глюкозы: гентиоби-, три- и тетраозу, образовывались из фрагментов, находящихся в разветвлениях, а продукты, содержащие 1-»3-связанные остатки глюкозы на невосстанавливающем конце: р-О-Иср-(1 -.з)-р-о-аср-(1 —б)-о-ас; р-о-аср-(1->з)-р-о-с1ср-(1 -»б)-р-о-аср-(1 -»б)-о-31с,

возникали из фрагментов цепи ламинарана.

Таблица 3 - Характеристика продуктов ферментативного гидролиза ламинарана

Фракция Выход, %* Степень полимеризации олигосахаридов" Соотношение связей 1 —»3:1 —»6***

Эндоглюканаза

ЕЫепсЫ 37.0 &С9-С!С2Э 1:1

ЕЫеПс!о2 14.2 С1с4-С1с,2 0.9:1

ЕЫепс)оЗ 17.8 С1с2-С1сз 1:1

ЕЫепйо4 6.1 ас -

Экзоглюканаза

ЕЫехо'1 - асз-асгз 1.4:1

ЕЫехо1 18.7 С1с4-С1с12 0.6:1

ЕЫехо2 6.3 С1с4 0.5:1

ЕЫехоЗ 4.7 С1с3 0.6:1

ЕЫехо4 10.3 С1с2 0:1

ЕЫ.ехо5 34.7 й1с -

* - % от навески исходного ламинарана ЕЫ.; " - спектры МАЛДИ ВП; '"-спектры 'Н ЯМР.

Ламинаран ЕЫ - сильноразветвленный высокомолекулярный 1->3;1-»6-р-0-глюкан, по данным ЯМР спектроскопии включает в себя следующие фрагменты структуры: -*3)-р-0-аср-(1-»3)- и/или ->3,6)-Э-0-аср-(1-»3)-; -»6)-р-0-С1ср-(1->3)- и/или р-0-С1ср-(1—>3)-; -»3)-р-0-аср-(1 —6)- или ->6)-р-0-С1ср-(1— 6)- и -*6)-р-0-аср-(1-»6)-и/или р-0-С1ср-(1—>6)-.

Ферментативным гидролизом было показано, что ламинаран ЕЫ содержал около 18 % (табл. 3) участков, включающих фрагмент структуры —>3)-р-0-С1ср-(1—>6)-р-0-С1ср-(1-»3)-р-0-аср-(1-», различные варианты которых представлены на рис. 3 (А, Б, В). Ламинаран ЕЫ отличался высоким содержанием 1-»6-связанных остатков глюкозы (соотношение связей 1 —>3:1 —>6 = 1.5:1), которые находились как в ответвлениях, так и в

основной цепи ламинарана. Протяженность участков, построенных из остатков 1—>3-связанной глюкозы, составляла не более четырех остатков (рис. 3 Г), большинство 1-»3-связанных блоков представляли собой дисахаридные звенья. 1->6-Связанные остатки глюкозы, предположительно, сосредоточены на невосстанавливающих концах молекул. Степень полимеризации 1—>6-связанных блоков не превышала трех остатков глюкозы (рис. 3 Д). Анализ полученных данных показал, что в ответвлениях по положению 6 могут находиться как единичные остатки глюкозы (рис. 3 Б), так и остатки ламинариолигосахаридов (рис. 3 В), а также гентиобиозы и гентиотриозы (рис. 3 Е).

А х= 2-4 Г

+

р-о-ск^-о Б у =1-3 Д

I1 +

Т В-в-Окр-ПГ^бЫЗ-о-акр-ГП.

-»■з)-р-г-гас^(1 в ^ ^ '

г = 1-3

Рисунок 3 - Фрагменты структуры ламинарана ЕЫ.

Таким образом, использование ферментов из РвеиЬосагсИит БассЬаНпеп&в и СЬаеЮтшт /'псИсит позволило не только установить структурные фрагменты, из которых построен необычный ламинаран, но и получить стандартные фракции олигосахаридов для исследования их биологического действия.

1.2.3 Противоопухолевая активность ламинарана из Е/вел/а ЫсусПв и продуктов его ферментативного гидролиза

Изучение биологической активности веществ на первом этапе предполагает определение их токсичности. Цитотоксичность - это свойство физических воздействий или химических веществ вызывать патологические изменения в клетках.

Препараты ЕЫ-, ЕЫ_епс1о1, ЕЫ.епс1о2, ЕЫ.ехо'1 и ЕЫ-ехо1 были не токсичны (до 200 мкг/мл) по отношению к клеткам рака кишечника РШ-1 и меланомы человека БК-МЕЬ28В (МТЭ метод). Показано, что исследуемые препараты (100 мкг/мл) более эффективно ингибировали рост колоний клеток ОШ-1, чем клеток 5К-МЕ1--28. Общие закономерности действия сохранялись для обоих типов клеток (рис. 4).

Ингибирование роста колоний клеток БК-МЕЬгв и 01Л>-1 высокомолекулярным ламинараном ЕЫ составляло 15 и 38 % соответственно. Фракции олигосахаридов ЕЫ-епсЫ и ЕЫ.ехо'1, обогащенные 1->6-связанными остатками глюкозы и характеризующиеся интервалом степени полимеризации (СП) 9-23, в сравнении с ЕЫ. показывали более высокое противоопухолевое действие по отношению к обоим типам клеток. Уменьшение молекулярной массы олигосахаридов (СП = 4-13 остатков глюкозы, фракции ЕЫепс1о2 и ЕЫ_ехо1) приводило к снижению их активности. Сравнение действия препаратов ЕЫ.епс1о1 и ЕЫехо'1, а также ЕЫ_епс1о2 и ЕЫ_ехо1, характеризующихся сходным интервалом молекулярных масс, но различным

соотношением связей 1 —»3:1—^6 (табл. 3), показало, что противоопухолевая активность олигосахаридов возрастала с увеличением количества 1->6-связанных остатков глюкозы.

А Б

Рисунок 4 - Действие фракций ЕЬЦ ЕЫ_епс1о1, ЕЫ_епс1о2, ЕЫ.ехо'1 и ЕЫ.ехо1 на рост колоний клеток меланомы 8К-МЕ1--28 (А) и рака кишечника человека 0иЭ-1 (Б). *р < 0.05; **р< 0.005 (достоверное отличие от контроля)

Проведенные исследования позволили выявить взаимосвязь между противоопухолевым действием ламинариолиго- и полисахаридов, выделенных из бурой водоросли Е. ЫсусНБ, и характеристиками их структуры. Уменьшение молекулярной массы нативного ламинарана, а также увеличение содержания 1—>6-связанных остатков глюкозы способствовало возрастанию противоопухолевой активности. Самым перспективным противоопухолевым агентом являлся препарат ЕЫепс1о1, полученный гидролизом ламинарана из Е. ЫсусНв эндоглюканазой. Он представлял смесь олигосахаридов со степенью полимеризации в интервале 9-23 и соотношением связей 1 —>3:1 —>6 = 1:1.

2 Биологическая активность фукоиданов из бурых водорослей

2.1 Цитотоксическая активность фукоиданов

Для изучения взаимосвязи структуры и биологической активности фукоиданов были выбраны два структурных типа фуканов (1-»3-а-/.-фукан из Saccharina cichorioides и 1-»3;1->4-а-г.-фукан из Fucus evanescens) и галактофуканы (из Saccharina japónica и Lindaría pinnatifida), отличающиеся содержанием остатков Gal, степенью замещения С6 остатков Gal, степенью сульфатирования и ацетилирования; а также модифированные аналоги (дезацетилированные, десульфатированные, деполимеризованные) этих полисахаридов.

Для определения концентрации фукоиданов из S. cichorioides (ScF2), S. japónica (SjF2), F. evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2), при которой проявляется их действие на жизнеспособность клеток, был использован MTS метод. Эпидермальные клетки мыши JB6 CI41, клетки рака кишечника HCT 116, НТ-29 и DLD-1, молочной железы Т-47 D и меланомы SK-MEL-28, SK-MEL-5, RPMI-7951 человека обрабатывали фукоиданами в концентрациях от 50 до 400 мкг/мл и инкубировали в течение 24 ч.

Фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 не влияли на жизнеспособность нормальных эпидермальных клеток мыши JB6 CI41 в концентрациях до 400 мкг/мл. Аналогичные

результаты были получены при изучении действия фукоиданов по отношению к клеткам рака кишечника НТ-29, DLD-1 и меланомы человека SK-MEL-28 и SK-MEL-5.

Наблюдался незначительный эффект действия исследуемых фукоиданов по отношению к клеткам рака кишечника человека НСТ 116 (степень ингибирования составляла менее 15%). Фукоиданы SjF2, FeF2 и UpF2 ингибировали жизнедеятельность клеток рака молочной железы T-47D на 36, 30 и 20 % соответственно. Фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 в концентрациях до 400 мкг/мл ингибировали рост клеток меланомы человека RPMI-7951 от 20 до 40%. Однако, действие ни одного фукоидана (до 400 мкг/мл) не приводило к 50 % гибели исследованных клеток в течение 24 ч.

Обработка клеток меланомы человека RPMI-7951 высокосульфатированными фракциями фукоиданов из D. polypodioides (DpF4), P. pavonica (PpF3) и Sargassum sp. (SF4) в концентрации до 200 мкг/мл не приводила к торможению их роста и не сопровождалась массовой гибелью клеток. Аналогичное действие отмечено для фукоиданов из S. horneri (ShF1, ShF2, ShF3), E cava (EcF1, EcF2), C. costata (CcF) и E bicyclis (EbF) по отношению к клеткам меланомы SK-MEL-28 и рака кишечника DLD-1 человека.

Нами впервые проанализирована активность фукоиданов, различающихся по строению главной цепи, моносахаридному составу, положению сульфатных групп и степени сульфатирования, на жизнеспособность различных типов клеток. Показано, что высокосульфатированные 1-»3-а-/.-фукан из S. cichorioides (сульфатные группы в положениях С2 и С4), 1->3;1->4-а-/.-фукан из F. evanescens с незначительным содержанием галактозы (сульфатные группы преимущественно в положении С2 и небольшое количество при С4), галактофукан из S. japónica (содержит 1->3- и несвязанные остатки a-i-фукопиранозы и p-D-галактопиранозы, сульфатные группы преимущественно в положении С2 и небольшое количество при С4) и U. pinnatifida (содержит 1->3- и 1-»4-связанные остатки а-^-фукопиранозы и р-О-галактопиранозы, сульфатные группы преимущественно в положении С4 и небольшое количество при С2) не оказывали или оказывали незначительное влияние на жизнеспособность исследованных клеток. Отсутствие токсичности делает данные фукоиданы перспективными для изучения их действия на пролиферацию опухолевых клеток.

2.2 Действие фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток

К основным свойствам злокачественных опухолей относят повышенную способность к пролиферации, утрату способности к полной дифференцировке и апоптотической гибели, а также инвазивный рост и метастазирование. Для изучения действия фукоиданов ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 на пролиферацию опухолевых клеток использовали препараты в концентрации 200 мкг/мл (рис. 5), так как в этой концентрации они не были токсичны к выбранным типам клеток.

Действие исследуемых фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток проявлялось в различной степени. Показано, что все фукоиданы в концентрации 200 мкг/мл незначительно влияли на пролиферацию раковых клеток кишечника человека НСТ 116 (рис. 5 А), НТ-29 и DLD-1 (данные не приведены).

Фукан ScF2 слабо ингибировал пролиферацию клеток меланомы человека SK-MEL-5 (рис. 5 Г): на 20 % по сравнению с контролем. Степень ингибирования роста клеток меланомы человека SK-MEL-28, RPMI-7951 и клеток рака молочной железы человека Т-47D составляла 30, 50 и 40 % соответственно (рис. 5 В, Д, Б). Фукан FeF2 обладал

более выраженным действием: ингибировал пролиферацию клеток меланомы человека 5К-МЕ1--28, 5К-МЕ1_-5 и РРМ1-7951 более чем на 40 % (рис. 5 В, Г, Д), тогда как степень ингибирования роста клеток рака молочной железы человека Т-470 составляла 32 % по сравнению с контролем (рис. 5 Б). Галактофукан 11рР2 проявлял высокую антипролиферативную активность по отношению к клеткам Т-470 (степень ингибирования пролиферации составляла 60 %) и был менее активен по отношению к ЗК-МЕ1_-28, ЭК-МЕЬ-б и ПРМ1-7951 клеткам (степень ингибирования - 36, 50 и 41 % соответственно) (рис. 5). Галактофукан Э]Р2 в различной степени ингибировал пролиферацию клеток меланомы человека ЗК-МЕ1_.-28, ЭК-МЕЬб и ЯРМ1-7951 (степень ингибирования - 45, 55 и 48 % соответственно), ингибирование пролиферации клеток Т-470 составляло 29 % (рис. 5).

О 24 48 72 О 24 48 72 0 24 48 72

Время обработки, ч

Рисунок 5 - Влияние фукоиданов (200 мкг/мл) ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 на жизнеспособность клеток НСТ 116 (A), T-47D (Б), SK-MEL-28 (В), SK-MEL-5 (Г) и RPMI-7951

(Д)

Установлено, что исследуемые нами сульфатированные полисахариды проявляли специфичность действия: все фукоиданы практически не ингибировали рост клеток рака кишечника человека НСТ 116, НТ-29 и DLD-1, но были эффективны по отношению к опухолевым клеткам молочной железы и меланомы человека. Необходимо отметить, что влияние на пролиферацию каждого типа клеток связано с индивидуальными структурными характеристиками фукоиданов. Наибольшим влиянием на пролиферацию опухолевых клеток молочной железы обладал высокосульфатированный галактофукан из Undaria pinnatifida. Он содержит 1->3- и 1->4-связанные остатки cc-L-фукопиранозы и p-D-галактопиранозы, сульфатные группы преимущественно в положении С4 и небольшое количество при С2. Для клеток меланомы человека наиболее эффективным был высокосульфатированный фукан из Fucus evanescens, который содержит 1->3- и 1->4-связанные остатки a-L-фукопиранозы, сульфатные группы преимущественно в положении С2 и небольшое количество при С4.

2.3 Влияние фукоиданов на неопластическую трансформацию клеток, индуцированную эпидермальным фактором роста

Канцерогенез - это многоступенчатый процесс, включающий стадии инициирования (трансформации нормальных клеток в опухолевые), развития

(формирования колоний) и прогрессии (роста колоний) опухоли. Одной из перспективных стратегий борьбы с канцерогенезом является поиск веществ, способных препятствовать начальному этапу - трансформации нормальных клеток в опухолевые под действием различных стимулирующих факторов (например, эпидермального фактора роста - EGF, трифорболового эфира - ТРА, УФ излучения, гормонов и др.). Для определения так называемой канцерпревентивной активности веществ in vitro широко используют метод неопластической трансформации нормальных клеток в мягком агаре.

Для изучения влияния выделенных нами фукоиданов ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 на неопластическую трансформацию эпидермальных клеток мыши JB6 CI41, индуцированную эпидермальным фактор ом роста (EGF), была выбрана концентрация фукоиданов 50 мкг/мл, при которой различия в их действии проявлялись наиболее выражено (рис. 6), Клетки JB6 CI41 (без обработки EGF, контроль) не образовывали

колонии в мягком агаре, тогда как под действием EGF происходила их трансформация и, как следствие, образование колоний (рис. 6). Фукан ScF2 ингибировал неопластическую

трансформацию клеток на 65 % по сравнению с контролем, а обработка клеток фукоиданами SjF2, FeF2 и UpF2 приводила к снижению количества трансформированных клеток на 39, 35 и 55 % соответственно (рис. 6). Фукан из S. cichoríoides ингибировал

неопластическую трансформацию JB6 CI41 клеток, индуцированную другим стимулирующим фактором - ТРА, более чем на 50 %.

Установлено, что фукоиданы в концентрации 50 мкг/мл ингибировали неопластическую трансформацию JB6 CI41 клеток, индуцированную EGF (рис. 6). Необходимо отметить, что данные о канцерпревентивном действии фукоиданов бурых водорослей в литературе отсутствуют.

2.3.1 Молекулярный механизм канцерпревентивного действия фукоидана из бурой водоросли Saccharína cichoríoides

Исследуемые фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 ингибировали трансформацию эпидермальных клеток мыши JB6 CI41, индуцированную EGF, поэтому представляло интерес исследование влияния фукоиданов на процесс активации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) - трансмембранного гликопротеина, обладающего тирозинкиназной активностью.

Для изучения молекулярного механизма действия был выбран фукан ScF2 из бурой водоросли S. cichoríoides. Он ингибировал трансформацию JB6 CI41 клеток, индуцированную EGF, в наибольшей степени по сравнению с фукоиданами из S. japónica, F.evanescens и U. pinnatifida (рис. 6).

Под влиянием EGF происходило фосфорилирование EGFR и протеинкиназы МЕК 1/2, которая, в свою очередь, активировала протеинкиназы семейства ERKs и JNKs. Фукан ScF2 в концентрации 10 мкг/мл эффективно ингибировал фосфорилирование

Рисунок 6 - Влияние фукоиданов ЗсР2, РеР2 и 11рР2 на неопластическую трансформацию эпидермальных клеток мыши иВ6 С141 клеток, индуцированную ЕвР. *р < 0.05 (достоверное отличие от контроля)

ЕСРВ и МЕК 1/2, активированное ЕвР, а в концентрации 100 мкг/мл практически полностью блокировал их фосфорилирование (рис. 7). Важно отметить, что обработка клеток фуканом в сочетании с ЕвР не приводила к изменению экспрессии белков ЕСРИ и МЕК 1/2.

Фукан 8сР2 ингибировал фосфорилирование протеинкиназ ЕЯК 1/2 и ЛГ\1К 1/2, вызванное действием ЕвЯ, а также следующих за ними в МАРК каскаде р-90И8К и с-.|'ип. Эффективность ингибирования возрастала с увеличением его концентрации. Экспрессия анализируемых белков (ЕйРИ, МЕК 1/2, ЕИК 1/2, Л\1К 1/2, р90взк, с-]ип (3ег73)) оставалась постоянной (рис. 7).

ScF2, мкг/мл 1 10 50 100

w и* 4 ИМ

---i «а>»||

p-EGFR

: Jp-MEK 1П (Ц МЕК 1/2

— — — Р mm ^ jp

mw» •<*>■

p-ERK 1/2 ERK 1/2

p-JNK 1/2 JNK 1/2

р-р90»'»

'Jp-c-jim (Ser73) c-jun (Ser73)

Рисунок 7 - Влияние фукана ScF2 на фосфорилирование EGFR, МЕК 1/2, ERK1/2, p-90RSK, JNK 1/2 и c-jun, индуцированное EGF

EGF BaSOj ScF2

Рисунок 8 - Взаимодействие фукана ScF2 с эпидермальным фактором роста

Для экспериментального

изучения прямого действия ScF2 по отношению к EGF и его рецептору был получен фукоидан в нерастворимой форме и проведено его связывание с EGF (рис. 8). Установлено, что фукан связывался с EGF и, как следствие, ингибировал фосфорилирование EGFR и MAP киназ. Блокирование активации этих белков фуканом приводило к подавлению АР-1 активности и ингибированию трансформации клеток,

индуцированной EGF.

2.4 Действие фукоиданов на самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток

С помощью метода мягкого агара мы исследовали действие фукоиданов бурых водорослей на самопроизвольное формирование и рост колоний клеток рака кишечника человека (рис. 9). Фукоиданы (50 мкг/мл) из бурых водорослей S. cichorioides (ScF2), S. japónica (SjF2), F. evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2) ингибировали самопроизвольное формирование и рост колоний раковых клеток кишечника человека в различной степени (рис. 9). Фукан ScF2 оказался наиболее эффективным при обработке всех исследуемых линий опухолевых клеток кишечника человека. Он ингибировал формирование и рост колоний НСТ 116, НТ-29 и DLD-1 клеток на 29, 44 и 76% соответственно (рис. 9 А, Б, В). Наиболее выраженное противоопухолевое действие ScF2 обнаружено на клетки DLD-1: фукан снижал не только количество колоний опухолевых клеток, но и значительно уменьшал их размеры (рис. 9 Г).

Фукоиданы SjF2, FeF2 и UpF2 обладали менее выраженным действием на самопроизвольное формирование колоний клеток кишечника человека. Они

незначительно ингибировали рост колоний HCT 116 клеток, степень ингибирования составляла 3, 12 и 9% для SjF2, FeF2 и UpF2 соответственно (рис. 9 А). Фукоиданы SjF2, FeF2 и UpF2 замедляли рост колоний НТ-29 клеток в равной степени: на 25, 29 и 28 % соответственно (рис. 9 Б), тогда как обработка DLD-1 клеток данными полисахаридами приводила к снижению роста колоний на 57, 48 и 39 % соответственно (рис. 9 В).

300» 2500 2(Ю0 1500

; юоо

: 500

HCT 116 88% 91%

** ч

5000 Ю0% 4000 - ||

3000 - В

2000 - В 1000 - I о JBL^-

7J* 71% 72%

| 2000

! i5oo

I

i 1000 500 0

100% i

43% Ч% ' +

JZL

контроль ScF2 SjF2 FcF2 UpF2

UpF2

Рисунок 9 - Влияние фукоиданов БсРг, Э]Р2, РеР2 и ирЯ2 на формирование и рост колоний клеток рака кишечника человека НСТ 116 (А), НТ-29 (Б) и 010-1 (В, Г). *р < 0.05; **р< 0.005 (достоверное отличие от контроля)

С помощью метода мягкого агара была исследована способность фукоиданов (100 мкг/мл) бурых водорослей ингибировать формирование и рост колоний клеток меланомы 8К-МЕЬ-28 (рис. 10 А), вК-МЕ1_-5 (рис. 10 Б), ВРМ1-7951 (рис. 10 В) и раковых клеток молочной железы человека Т-470 (рис. 10 Г).

Галактофуканы 11рР2 и Э)Р2 оказались наиболее эффективными на модели раковых клеток молочной железы: ингибировали формирование и рост колоний клеток на 75 и 64 % соответственно, тогда как фуканы 5сР2 и РеР2 ингибировали данный процесс на 18 и 30% соответственно (рис. 10 Г). Фукан РеР2 обладал сильным ингибирующим действием по отношению к клеткам меланомы человека, он угнетал рост колоний 8К-МЕ1_-28, ЭК-МЕЬ-б и ИРМ1-7951 на 56, 54 и 51 % соответственно (рис. 10 А, Б, В). Фукоиданы ЭсР2, Э]Р2 и ирР2 в меньшей степени тормозили рост колоний клеток меланомы человека (рис. 10 А, Б, В). Наиболее сильное ингибирование колоний клеток 5К-МЕ1_-5 - 71 % показал галактофукан 3)'Р2.

УФ излучение - это основной фактор риска развития меланомы. Главным источником ультрафиолета, который повреждает генетический материал клеток кожи, является солнечный свет. Предполагается, что именно фукоиданы выполняют в бурых водорослях защитные функции от УФ излучения и высыхания. Бурая водоросль Р. еуапезеепв произрастает в сублиторальной зоне и постоянно испытывает воздействие солнечных лучей. Возможно, поэтому этот вид водоросли синтезирует фукоидан, который имеет особенности структуры, позволяющие проявлять более высокое противоопухолевое действие на модели клеток меланомы человека, по сравнению с

фукоиданами из водорослей S. cichoríoides, произрастающими на глубине от 10 до 30 м.

5000

S. japónica и U. pinnatifida,

SK-MF.I.-28

гЬ

5|%

контроль ScF2 SjF2 FeF2 UpF2

100%

i

il Иг

10 100% I

о—™

71%

т

Нп

1

36% 25%

i i i

контроль ScF2 SjF2 FeF2 UpF2

Рисунок 10 - Влияние фукоиданов ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 на формирование и рост колоний клеток SK-MEL-28 (A), SK-MEL-5 (Б), RPMI-7951 (В) и T-47D (Г). *р < 0.05; "р< 0.005 (достоверное отличие от контроля)

2.5 Действие полисахаридов из бурых водорослей Fucus evanescens, Costaria costata и Alaria fistulosa на активацию матриксных металлопротеиназ, индуцируемую УФ излучением

Степень инвазивного роста и метастазирование опухолевых клеток определяются их способностью расщеплять

компоненты экстраклеточного матрикса (ЭКМ) - базальные мембраны и межтканевую строму, состоящие из различных структурных белков: коллагенов, эластинов, ламининов и т.д. Многие протеолитические

ферменты, такие как катепсины, сериновые протеазы, способны лизировать отдельные компоненты ЭКМ in vitro, однако разлагать все структуры ЭКМ могут только матриксные металлопротеиназы (ММР). На клетках фибробластов крайней плоти человека (HS68) нами показано, что коммерческий

1 ю

Рисунок 11 - Влияние экспрессию белка (А) и индуцируемые УФ излучением, (достоверное отличие от контроля)

£100 МДЖ/см2)

100 FvF, мкг/мл

фукоидана FvF на мРНК ММР-1 (Б), р < 0.05

фукоидан из Fucus vesiculosus (FvF) ингибировал экспрессию белка ММР-1, индуцируемую УФ излучением на 85% (10 мкг/мл) и 87% (100 мкг/мл) и экспрессию мРНК ММР-1 на 77% (10 мкг/мл) и 82 % (100 мкг/мл) (рис. 11).

Известно, что коммерчески доступный фукоидан из F. vesiculosus представляет собой смесь фукоиданов, поэтому было исследовано действие более гомогенных фукоиданов из других источников на экспрессию белка и мРНК ММР-1. Фукоидан FeF2 из F. evanescens проявлял выраженное ингибирующее действие на пролиферацию и формирование колоний клеток меланомы человека, поэтому была изучена его способность подавлять экспрессию ММР-1, индуцируемую УФ излучением. Показано, что фукоидан FeF2 (10 и 100 мкг/мл) ингибировал экспрессию белка ММР-1, индуцируемую УФ излучением в клетках кератиноцитов человека НаСаТ (степень ингибирования составляла 33 и 58% соответственно, рис. 12 А), и экспрессию мРНК ММР-1 (степень ингибирования - 28 и 59% соответственно, рис. 12 Б). Под действием УФ излучения происходило фосфорилирование протеинкиназ ERK 1/2, JNK 1/2, р38, тогда как обработка клеток фукоиданом (100 мкг/мл) приводила к значительному снижению активности данных белков (рис. 12 В).

В

Рисунок 12 - Влияние фукоидана FeF2 на экспрессию белка (А) и мРНК ММР-1 (Б) и фосфорилирование МАРК А (В), индуцируемые УФ излучением. *р < 0.05; **р< 0.005 (достоверное отличие от контроля)

Полисахарид из Costaría costata (CcF) оказывал аналогичное действие при концентрациях на два порядка ниже. CcF ингибировал экспрессию белка ММР-1, индуцируемую УФ излучением (15 мДж/см2), в клетках кератиноцитов человека НаСаТ на 42 % (0.01 мкг/мл), 57 % (0.1 мкг/мл) и 70 % (1 мкг/мл). Полисахарид в концентрациях 0.01, 0.1 и 1 мкг/мл также эффективно ингибировал экспрессию мРНК (степень ингибирования составляла 7, 22 и 59 % соответственно). В отличие от фукоидана FeF2 -сульфатированного фукана (табл. 1), CcF содержал остатки уроновой кислоты (28.2%) (табл. 4).

Для подтверждения предположения о возможном влиянии уронанов на активацию белка и экспрессию мРНК ММР-1 исследовано действие водорастворимого уронана из Alaria fistulosa (AfU). В 13С ЯМР спектре полисахарида AfU присутствовали интенсивные сигналы схимическими сдвигами 101.2 (С1), 176.5 (С6), 71.2 (С2), 72.6 (СЗ), 79.1 (С4) и 77.1 м.д. (С5), характерные для полиманнуроновой кислоты. Соотношение остатков маннуроновой и гулуроновой кислот в AfU составляло 3:1.

лДж/ст|2) мы/мл

АШ (10 мкг/мл) на 47% ингибировал экспрессию белка ММР-1, индуцируемую УФ излучением в клетках кератиноцитов человека НаСаТ, и экспрессию мРНК (степень ингибирования составляла 90 %). Возможно, более сильное действие полисахарида СсР на экспрессию белка и мРНК ММР-1, индуцированную УФ излучением, обусловлено присутствием в моносахаридном составе его молекулы остатков уроновой кислоты.

Таблица 4 - Характеристика полисахаридов, полученных из Costaría costata и Alaría fistulosa

Фракция* Выход** % Мг, кДа Содержание, %*" Моносахаридный состав,

Уроновые кислоты S03Na" Fue Gal Man Xyl Rha G le

CcF 0.3 н.о. 28.2 5.3 23.4 5.1 8.2 2.1 0 4.0

AfU 21.5 30-40 32 0 0 0 0 0 0 0

* - CcF - фракция полисахаридов из С. costata

AfU - фракция полисахаридов из A. fistulosa ** - % от веса сухой обезжиренной водоросли *** - % от навески полисахарида н.о. - не определен

Нами впервые показано, что фукоиданы из Fucus vesiculosus, F. evanescens, водорастворимые полисахариды из С. cosíala и A. fistulosa ингибировали в клетках кератиноцитов человека не только экспрессию белка ММР-1, но и уровень мРНК, индуцированные УФ излучением. При этом фукоидан из F. evanescens уменьшал фосфорилирование белков митоген-активированных протеинкиназных (MAP) сигнальных каскадов; ERK 1/2, JNK 1/2 и р38, индуцированное УФ излучением. Следовательно, фукоиданы из Fucus vesiculosus и Fucus evanescens, водорастворимые полисахариды из Costaría costata и Alaría fistulosa способны предотвращать экспрессию ММР-1, индуцируемую УФ излучением, на транскрипционном и трансляционном уровнях, изменяя активность клеточных белков МАРК сигнального каскада.

2.6 Действие фукоиданов на элементы врожденного иммунитета

2.6.1 Действие фукоиданов на созревание дендритных клеток

В качестве агентов, индуцирующих созревание дендритных клеток (DCs), исследованы три образца фукоиданов:

1. Фукоидан из F. vesiculosus (FvF) производства компании «Sigma», США.

2. Фукоидан из F. evanescens (FeF), полученный в соответствии с известным способом (Шевченко Н.М., 2004).

3. Композиция, содержащая фукоидан из Saccharína cichoríoides (ScF) (Shevchenko N., 2005).

Препараты FvF и ScF увеличивали уровень экспрессии кластеров дифференциации CD40, CD80, CD83 в дендритных клетках подобно липополисахариду (LPS). Фукоидан FeF имел незначительный эффект на экспрессию маркеров дендритных клеток. Наиболее сильное действие на экспрессию кластеров оказывал фукоидан ScF. Дальнейшее изучение механизма действия фукоиданов на процесс созревания дендритных клеток продолжали с препаратом ScF. Иммуногистохимический анализ показал, что иммунореактивность MHC-II и CD86 значительно увеличивалась после двух дней культивирования с фукоиданом ScF и LPS по сравнению с показателями в

контроле (рис. 13). Препарат БсР также индуцировал типичные морфологические изменения при созревании дендритных клеток (рис. 13).

Giemsa DIC CD86 МНC-CU merge

ScF-mDC

LPS-mDC

Рисунок 13 - Индукция маркеров дендритных клеток с использованием РЕ-конъюгированных CD-80 антител и FITC-конъюгированных МНС-СП антител

Уровень экспрессии иммуносупрессора IL-10 по сравнению с контролем увеличивался в клетках, обработанных ScF или LPS. Однако экспрессия IL-12p70 в клетках, обработанных ScF, была ниже, чем при стимуляции липополисахаридом (рис. 14). ScF индуцировал способность DCs экспрессировать фактор некроза опухоли альфа (TNF-a) и уровень экспрессии сопоставим с уровнем, полученным при обработке клеток LPS. Дендритные клетки поддерживали активацию Т-клеток: они стимулировали пролиферацию Т-клеток при культивировании в течение 5 дней (рис. 15).

¡DC ScF-mDC LPS-mDC

Рисунок 14 - Экспрессия цитокинов в дендритных клетках, обработанных ScF или LPS. *р < 0.05; **р< 0.005 (достоверное отличие от контроля)

БС:ТС = 25:1

Рисунок 15 - Стимуляция роста Т-клеток под действием дендритных клеток, обработанных БсР или LPS. *р < 0.05 (достоверное отличие от контроля)

muL-io

ШШ IL-12p40 5Si8 IL-12p70 BTNF-alpha

Установлено, что фукоиданы являются индукторами созревания дендритных клеток. Об этом свидетельствовали: экспрессия маркера терминальной дифференцировки (CD83) дендритных клеток, увеличение экспрессии поверхностных молекул антигенного представления (МНС II класса), костимулирующих молекул (CD40 и CD86), молекулы адгезии (CD11c) и активационного маркера (CD38). Данные процессы способствовали образованию иммунного синапса для обмена информацией между антигенпрезентирующими клетками и Т-лимфоцитами и дифференцировке активированных Т-клеток в эффекторные.

2.6.2 Действие фукоиданов на толл рецепторы

Важной задачей в исследовании механизмов активации толл рецепторов (TLRs), является идентификация и исследование специфических лигандов для каждого конкретного рецептора. В работе использовали три клеточные линии эмбрионального почечного эпителия человека НЕК293, содержащие в составе своего генома ген соответствующего TLR человека (TLR2, гетеродимера TLR2/TLR6 или TLR4) а также репортерный ген фермента ß-галактозидазы под контролем транскрипционного ядерного фактора (NF-kB) зависимого промотера. Установлено, что фукоиданы из бурых водорослей Saccharína japónica (SjF), Saccharine cichorioides (ScF) и Fucus evanescens (FeF) в исследуемых концентрациях (до 1 мг/мл) не оказывали влияния на клетки HEK293-null, не экспрессирующие TLRs (контроль).

При исследовании взаимодействия фукоиданов с толл рецепторами установлено, что препараты SjF, ScF и FeF в исследуемых концентрациях (от 0.1 мкг/мл до 1.0 мг/мл) различались по способности специфически связываться с рецепторами. Так, фукоиданы из S. japónica, S. cichorioides и F. evanescens (1.0 мг/мл) в клетках HEK293-TLR2 вызывали активацию NF-kB: ОП405нм = 1-53; 1.85; 2.43 соответственно по сравнению с контролем (ОПаобнм = 0.4). В качестве положительного контроля, подтверждающего функциональность TLR2, проводили активацию NF-kB под действием липопептида: ОПад5нм = 2.66.

При исследовании взаимодействия фукоиданов с гетеродимером TLR2/TLR6 установлено, что фукоиданы из S. japónica, S. cichorioides и F. evanescens в клетках HEK293-TLR2/TLR6 вызывали активацию NF-kB в концентрации 10 мкг/мл (ОПдо5нм = 1.72; 1.95; 2.2 соответственно) по сравнению с контролем (ОП405нм = 1.15). При действии липопептида, подтверждающего функциональность рецептора, ОП4о5нм = 2.67.

При исследовании взаимодействия фукоиданов с TLR4 установлено, что фукоиданы из S. japónica и S. cichorioides, взаимодействуя с TLR-4, активировали NF-kB в интервале концентраций 100-1000 мкг/мл, а фукоидан из F. evanescens - от 10 до 1000 мкг/мл по сравнению с интактными клетками в контроле. Наилучший эффект, сопоставимый с действием липополисахарида (LPS) из Е. coli, показал фукоидан из F. evanescens.

Необходимо было показать, что полученный результат обусловлен действием фукоидана, и LPS отсутствует в препарате фукоидана. Известно, что 3-гидрокситетрадекановая кислота (3-ОНС,4) является основным жирнокислотным компонентом большинства LPS. Для определения содержания эндотоксинов грамотрицательных бактерий в составе препарата, было проведено исследование на предмет присутствия в нем метилового эфира гидрокситетрадекановой кислоты. Установлено, что в масс-спектре стандарта 3-ОНС,4 присутствовал основной фрагментарный ион с массой М+ равной 103 ед., характерный для распада по связи СЗ-С4. Ни в одном из продуктов гидролиза фукоидана таких ионов не было, что свидетельствовало об отсутствии З-ОНСн, а также других 3-гидроксижирных кислот, которые могут присутствовать в эндотоксинах. Проведенное исследование с использованием методов ГЖХ и ГЖХ-МС свидетельствовало об отсутствии в составе фукоидана эндотоксина. Следовательно, фукоиданы являются самостоятельными лигандами для TLRs.

3 Наземные растения как источники биологически активных полифенолов

Фукоиданы могут содержать в качестве примесей полифенолы, вклад которых в биологическую активность фукоиданов практически не изучен. Для выяснения более глубокого механизма действия соединений этого класса нами были выбраны полифенолы растительного происхождения (катехины зеленого чая и резвератрол). Выбор обусловлен тем, что в литературе содержатся единичные ссылки о присутствии в водорослях основного полифенола зеленого чая - эпигаллакатехин галлата. Кроме того, эпигаллакатехин галлат и резвератрол - доступные коммерческие препараты.

3.1 Биологическая активность катехинов зеленого чая

3.1.1 Действие эпигаллокатехин галлата на пролиферацию клеток: взаимодействие с виментином и регулирование его функций

Для идентификации белков, связывающихся с эпигаллокатехин галлатом (EGCG), были использованы эпидермальные клетки мыши JB6 0141, которые находят применение как модель для изучения развития опухоли in vitro и аффинная хроматография на EGCG-Сефарозе 4В (рис. 16 А). Фракции высокоаффинных к EGCG белков, элюированные с EGCG-Сефарозы 4В Т1 -буфером, разделяли 2D электрофорезом и окрашивали SYPRO Ruby (рис. 16 Б). Виментин (точки, обведенные кольцом, Мг = 53.7 кДа; рН 5.05) - промежуточный филамент цитоскелета (intermediate filament, IF), с помощью МАЛДИ ВП масс-спектрометрии был идентифицирован как белок, связывающийся с EGCG (рис. 16). Константа диссоциации (Kd) комплекса виментин-EGCG составляла 3.3 нМ, что свидетельствует о высоком сродстве EGCG к виментину.

Т1 буфер

I 30 V, мл

Рисунок 16 - Идентификация in vitro белков супернатанта лизата JB6 CI41 клеток после аффинной хроматографии. А. Аффинная хроматография белков JB6 CI41 клеток. Б. 2D электрофорез белков, высокоаффинных к EGCG

Согласно литературным данным, фосфорилирование белков IF серин/треонин протеинкиназами приводит к деструктурированию филамента. Виментин фосфорилируется киназами Cdc2 и РКА: Cdc2 фосфорилирует виментин по Ser50, РКА - по Ser55. Показано, что EGCG связывался с виментином по участкам, необходимым для фосфорилирования этого белка киназами РКА и Cdc2 и, как следствие, ингибировал активность РКА (рис. 17 А, верхняя панель, линии 3-5) и Cdc2 (рис. 17 А, нижняя панель, линии 4-5). Важным структурным фрагментом EGCG при взаимодействии с виментином являлась галлатная группа, так как среди аналогов EGCG (ЕС, ECG и EGC

ЕССС, мкМ

2] р-РКА "Г] р-С(1с2

ЕССС ЕС ЕСС ЕвС (мкМ) 20 20 20 20

- эпикатехин, эпикатехин галлат и эпигаллокатехин соответственно) только эпикатехин галлат (20 мкМ), содержащий галлатную группу, как и БвСО, ингибировал активность Сс1с2 (рис. 17 Б, линия 4).

А Исследованы роль виментина в

регуляции клеточной пролиферации и влияние ЕвСв на этот процесс. Показано, что в контрольных Л36 С141 клетках, экспрессирующих виментин (вЯР з1РЫА, рис. 18 А, верхняя панель, пиния 1; рис. 18 Б), пролиферация во времени была выше (рис. 18 В), чем в ЛВ6 С141 клетках с пониженной экспрессией виментина (виментин э1ЯЫА, рис. 18 А, верхняя панель, линия 1; рис. 18 Б). Пролиферация контрольных Л36 С141 клеток снижалась в зависимости от дозы через 72 ч после обработки клеток ЕйСО (Ю5о = 16 мкМ, рис. 18 Г). При этом ЕбСв не влиял на пролиферацию иВ6 С141 клеток с пониженной экспрессией виментина (рис. 18 Г). Впервые показано, что связывание ЕОСв с виментином является важным в каскаде регулируемой виментином пролиферации клеток, и этот процесс происходит через ингибирование фосфорилирования виментина.

■■ЙУ:::;

^чГ]

р-Сс!с2

Рисунок 17 - Фосфорилирование виментина. А. Фосфорилирование РКА (верхняя панель) и Сс1с2 (нижняя панель).

Б. Эффект Ев Св и его аналогов на активность Сс1с2

ОУР зМША Виментин .мПГч'Л

Внментнн

Внментпн 511ША

ОКР 5ИША

10 15 ЕССС, мкМ

Рисунок 18 - Влияние ЕвСв на пролиферацию контрольных иВ6 0141 клеток (вРР зИМА) и иВ6 С141 клеток с пониженной экспрессией виментина (виментин в^ЫА). А и Б. Характеристика вРР з1ВМА и виментин иВ6 С141 клеток. В. Зависимость

пролиферации ЛВ6 С141 клеток от времени. Г. Зависимость пролиферации ЛВ6 С141 клеток от концентрации ЕвСО. * р<0.05; ** р<0.005 (достоверное отличие от контроля)

3.1.2 Действие эпигаллокатехин галлата на апоптоз опухолевых клеток: взаимодействие с белком, регулируемым глюкозой, и влияние на его функции

Для идентификации других белков, взаимодействующих с ЕвСв, как и в случае с виментином, использовали лизат эпидермальных клеток мыши ивб С141 и носитель для аффинной хроматографии ЕйСС-Сефарозу 4В (рис. 19).

Установлено, что белок, регулируемый глюкозой (ОЯР78, точки, обведенные кольцом, Мг = 72.3 кДа; рН 5.07), связывался с ЕйСв. На рис. 19 приведены электрофореграммы белков лизата ЛВ6 С1 41 клеток (рис. 19 А, Б, Г) и рекомбинантного СИР78 (гОВР78) (рис. 19 В) после аффинной хроматографии (ЕвСО-Сефароза 4В). Показано, что ЕвСв связывается с СЯР78 (рис. 19 В и Г, линии 2). Кс! составила 0.7 мкМ. Полученные данные подтверждают специфическое взаимодействие между СИР78 и ЕвСС.

rG№78

ЕСгСС-Офаром 4В Ссфаропа 4В GKP78{74 кДа)

Лизат

ЕССС-Сефарспа 4В Сефарозл 4В ! «< GRP78 (74 кДа)

Рисунок 19 - Идентификация in vitro белков супернатанта лизата JB6 CI41 клеток после аффинной хроматографии. А и Б. 2D электрофорез белков, высокоаффинных к EGCG. Гели окрашивали SYPRO Ruby (А) или проводили перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (Б). В и Г. SDS-PAGE rGRP78 (В) и белков лизата JB6 CI41 клеток (Г) после аффинной хроматографии. Гели окрашивали Кумасси (В) или проводили перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (Г). Линия 1, В и Г - rGRP78 и GRP78 в клеточном лизате соответственно (контроль). Линия 2, В и Г - белки (rGRP78 и клеточный лизат соответственно), высокоаффинные к EGCG после проявления антителами против GRP78. Линия 3, В и Г - связывание rGRP и белков клеточного лизата с носителем Сефароза 4В, не содержащим EGCG (контроль)

Для идентификации участков связывания GRP78 с EGCG были созданы конструкции функциональных доменов GRP78. Установлено, что EGCG взаимодействовал с рекомбинантными белками (GST-GRP78), содержащими участки связывания с аденозинтрифосфатом (АТР).

АТР и EGCG конкурировали за взаимодействие с GRP78 в дозозависимой манере: связывание EGCG с GST-GRP78 уменьшалось с ростом концентрации АТР и наоборот, связывание АТР с GST-GRP78 уменьшалось с ростом концентрации EGCG.

GRP78 осуществляет свои многочисленные функции за счет энергии гидролиза АТР. EGCG, в концентрациях 5 и 10 мкМ, ингибировал способность GST-GRP78 гидролизовать АТР на 56 и 71 % соответственно. Таким образом, катехин зеленого чая EGCG конкурировал с АТР за взаимодействие с GST-GRP78 в АТР связывающем домене и, как следствие, оказывал влияние на функции GRP78 в клетках, поскольку

известно, что GRP78 мутанты, не способные гидролизовать АТР, теряют проапоптотические фукции.

Среди аналогов EGCG только ECG подобно EGCG ингибировал гидролиз АТР (на 64 %), катализируемый GST-GRP78, другие аналоги (эпикатехин (ЕС) и эпигаллокатехин (EGC)) проявили более слабое ингибирующее действие (на 38 и 53 % соответственно). Вероятно, галлатная группа, которая присутствует только в EGCG и ECG, является важной структурной характеристикой для проявления исследуемой активности.

Особенностью GRP78 является способность существовать во взаимообратимых олигомерной и мономерной формах. Полученный нами рекомбинантный GST-GRP78 существовал в виде димера и мономера (рис. 20, линия 1). Содержание димера GST-GRP78 уменьшалось с увеличением концентраций АТР (рис. 20 А), из чего следовало, что при связывании с АТР рекомбинантный GST-GRP78 обладал способностью к переходу из неактивной олигомерной в активную мономерную форму in vitro (рис. 20 А, линии 2-4). В отличие от АТР, при связывании EGCG с GST-GRP78 происходил переход в неактивную димерную форму (рис. 20 Б, линии 2-4). Подобное действие (в меньшей степени) оказывал аналог EGCG - ECG (рис. 20 В, линия 4); ЕС и EGC (рис. 20 В, линии 3 и 5) не влияли на процесс перехода форм.

egcg

Д Рисунок 20 - Влияние АТР, EGCG и его

egcg аналогов на информационные изменения

мкм GRP78. А. Эффект АТР на конверсию

димера GST-GRP78 в мономер. Б. Эффект EGCG на процесс олигомеризации GST-GRP78. В. Эффект аналогов EGCG на ib: grp78 процесс олигомеризации GST-GRP78. Г.

Эффект EGCG на конформационные изменения GST-GRP78, индуцированные АТР. Д. Эффект EGCG на процесс олигомеризации GRP78 в JB6 CI41 клетках. М - мономер; D - димер; Т - тетрамер; О -олигомер

Следовательно, важным структурным элементом для проявления данной активности, аналогично связыванию EGCG с виментином, является галлатная группа EGCG. Установлено, что EGCG (10 мкМ) способен предотвращать процесс перехода GST-GRP78 в мономерную форму под действием АТР (рис. 20 Г, линия 5). Показано, что GRP78 присутствует в JB6 С141 клетках в мономерной, димерной и олигомерной формах

(рис. 20 Д, линия 1) и EGCG индуцирует преобразование мономерной формы в димерную и олигомерную формы в дозозависимой манере (рис. 20 Д, линии 2-4).GRP78 - трансмембранный белок, который взаимодействует с прокаспазой 7 и проявляет проапоптотические функции. Для определения участков связывания GRP78 с рекомбинантной прокаспазой 7 использовали конструкции для экспрессии рекомбинантных белков, содержащих функциональные домены GRP78. Прокаспаза 7 взаимодействовала со всеми исследуемыми конструкциями белка GRP78, то есть имела многочисленные участки связывания с GRP78. Однако более выраженное взаимодействие наблюдалось с конструкциями белка, содержащими АТР связывающий домен. Прокаспаза 7 и EGCG конкурировали за связывание с GRP78: с увеличением концентрации EGCG связывание прокаспазы 7 с GST-GRP78 уменьшалось. Следовательно, АТР связывающий участок GRP78 важен как для взаимодействия этого белка с прокаспазой 7, так и с EGCG.

Одним из механизмов антиапоптотического действия GRP78 является увеличение его экспрессии, которое ведет к формированию ингибиторного комплекса, что, в свою очередь, подавляет активацию прокаспазы 7. В результате происходит усиление роста опухолевых клеток и развивается их устойчивость к действию противораковых лекарственных препаратов. Для определения роли EGCG в регуляции апоптоза в Т24/83 клетки рака крови человека был встроен вектор, содержащий ген GRP78. Показано, что в клетках Т24/83 с повышенной экспрессией GRP78 (рис. 21, панель 1, линии 1 и 5 в сравнении), активация прокаспазы 7 этопозидом - ингибитором топоизомеразы - была ниже (рис. 21, панель 2, линии 3 и 7 в сравнении) по сравнению с контрольными клетками. Обработка клеток Т24/83 EGCG в концентрации 10 мкМ не приводила к активации прокаспазы 7 (рис. 21 А, панель 2, линии 2 и 6), так как концентрации EGCG, при которых наблюдаются ингибирование пролиферации и апоптоз для этого типа клеток составляют 40-80 мкМ. После обработки клеток EGCG в сочетании с этопозидом (рис. 21, панель 2, линии 4 и 8 в сравнении), наблюдалось усиление активации прокаспазы 7 и, как следствие, уменьшение устойчивости клеток к этопозиду. А Рисунок 21 - Влияние

EGCG на апоптоз, индуцированный этопозидом в клетках рака крови человека Т24/83. А. Эффект EGCG на активацию прокаспазы 7, индуцированную

этопозидом, в клетках с различным уровнем экспрессии GRP78. Б и В. Данные проточной

цитометрии по

содержанию

апоптотических клеток при обработке

этопозидом в отсутствии или присутствии EGCG. " р<0.005; *** р<0.0001 (достоверное отличие от контроля)

Согласно результатам проточной цитометрии, после обработки контрольных клеток Т24/83 этопозидом апоптоз составлял более 20 % (рис. 21 Б). При этом EGCG не

T24/83-pcDNA T24/83-GRP78

Этопозид (20 мкМ) . F.GCG (10 |iM) Прокаспаза 7 Кяспяза 7 GKP78

[1-Я1СТИН

Б

к 30

¡I20 О §

1 g 10

т

Этопознд (20 мкМ) -EGCG (10 мкМ) -

Этопознд (20 мкМ] EGCG (10 мкМ!

усиливал действие этопозида. Обработка этопозидом клеток Т24/83 со встроенным вектором ОИР78 приводила к незначительному апоптозу (9 %), то есть проявлялось антиапоптотическое действие 6ЯР78. При обработке клеток этопозидом и ЕЭСО количествоапоптотических клеток увеличивалось в два раза. Следовательно, ЕвСв предотвращал устойчивость клеток к действию этопозида.

Для подтверждения результатов о действии ЕйСв изучено его влияние на апоптоз клеток рака молочной железы человека МОА-МВ-231 и Т-470. Показано, что ЕвСв усиливал в исследуемых клетках активацию прокаспазы 7, индуцированную этопозидом, и предотвращал антиапоптотический эффект ОЯР78, что играет важную роль для уменьшения устойчивости клеток к действию лекарственных препаратов.

Опухолевые клетки обладают способностью самопроизвольно образовывать колонии в системе мягких агаров. Исследовано влияние ЕОСС на самопроизвольное формирование и рост колоний клеток МОА-МВ-231 и Т-470. При обработке клеток низкими концентрациями ЕвСв или этопозида наблюдалось незначительное ингибирование колоний клеток (рис. 22 А и Б, правые панели, столбцы 2 и 3 соответственно). Однако, при совместной обработке клеток МОА-МВ-231 и Т-470 этопозидом и ЕвСв уменьшались как число (рис. 22 А и Б, правые панели, столбцы 4) так и размер колоний (рис. 22 А и Б, левые панели, столбцы 4) в сравнении с клетками, обработанными только этопозидом или ЕССв. Таким образом, ЕОСб предотвращал устойчивость МОА-МВ-231 и Т-470 клеток по отношению к препарату этопозид.

А

Рисунок 22 - Влияние ЕОСв на формирование колоний клеток рака молочной железы Т-470 (А) и МОА-МВ-231 (Б). ** р<0.005; *** р<0.001 (достоверное отличие от контроля)

Полученные нами данные позволяют понять ранее неизвестные механизмы действия полифенолов зеленого чая и обосновать возможные пути использования данных соединений в профилактике и лечении раковых заболеваний.

3.1.3 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток: взаимодействие с онкогеновыми тирозинкиназами и регулирование их функций

Для поиска белков, являющихся мишенью для EGCG, компанией Upstate Biotechnology (США) совместно с институтом Хормела (Hormei Institute University of Minnesota, MN, США) было проведено тестирование взаимодействия EGCG с коммерчески доступными белками (киназами) (в эксперименте использовали 101 киназу). Согласно полученным данным EGCG значительно ингибировал активность тирозиновых протеинкиназ: Fyn и рецептора инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-IR).

3.1.3.1 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток, индуцируемую эпидермальным фактором роста

Коммерческая (рис. 23 А) или иммунопреципитированная из JB6 CI41 клеток (рис. 23 Б) киназа Fyn фосфорилировала пептид Cdc2. EGCG в концентрациях 5, 10 и 20 мкМ, ингибировал способность коммерческой (на 31, 90 и 92% соответственно, рис. 23 А) и иммунопреципитированной из лизата клеток (на 16, 33 и 90 % соответственно, рис. 23 Б) киназы Fyn фосфорилировать пептид Cdc2.

+ Fyn К1ШЯ1Н, 100 нг 20 EGCG, мкМ + Пшггид (субстрат), 250 мкМ

эд 'EGCG, мкМ + Пептид (субстрат), 250 v

Рисунок 23 - Определение активности Руп. Активность коммерческой Руп (А) и иммунопреципитированной из С141 клеток (Б) после обработки ЕвСй. * р<0.05; ** р<0.005 (достоверное отличие от контроля)

Определение непосредственного взаимодействия ЕвСй с Руп проводили аффинной хроматографией на ЕССС-Сефарозе 4В. Установлено, что Руп связывался с ЕССй, но не с Сефарозой 4В (контроль). Константа диссоциации (ИМ) комплекса составляла 0.3 мкМ. Показано, что ЕйСв связывался с ЗН2 доменом Руп. ЭН2 домен участвует во взаимодействии с молекулами рецепторов и сигнальных белков, поэтому было исследовано действие ЕОСй на фосфорилирование Руп и белков сигнальных путей, регулируемых данной киназой.

Фосфорилирование Руп в активированных макрофагах, а также в нормальных фибробластах под влиянием ростовых факторов представлено в ряде исследований. Моделью для изучения трансформации клеток под действием различных факторов, таких как эпидермальный фактор роста (ЕОР) и трифорболовый эфир (ТРА), являются клетки иВ6 С141. Мы показали, что до 20 мкМ ЕвСС не оказывал влияние на жизнеспособность иВ6 С141 клеток (рис. 24 А) и замедление пролиферации клеток наблюдалось через 72 ч после обработки клеток ЕйСй (рис. 24 Б).

60 80 100

EGCG.MKM В|)С„я>ч

Рисунок 24 - Влияние EGCG на жизнеспособность (А) и пролиферацию (Б) JB6 CI41 клеток. * р<0.05 (достоверное отличие от контроля)

Согласно литературным данным, EGF индуцирует фосфорилирование ERK. Исследован процесс функционального перераспределения сигналов, исходящих от Fyn. Показано, что EGF фосфорилировал Fyn (рис. 25 А, линия 2) и EGCG ингибировал этот процесс в дозозависимой манере (рис. 25 А, линии 3-5), однако не оказывал влияние на фосфорилирование ERK, индуцированное EGF (рис. 25 Б, линии 3-6). Следовательно, ERK не участвовал в передаче через Fyn сигнала, активированного EGF.

Известно, что EGF индуцирует клеточную трансформацию, поэтому было исследовано влияние EGCG на этот процесс. EGF индуцировал трансформацию JB6 С141 клеток (рис. 25 В), но при обработке клеток EGCG количество колоний уменьшалось в дозозависимой манере (рис. 25 В).

20 F.GCG, мкМ EGF, lft нг/мл Íp-Fyn (Thrl2)

10 20 EGCG, мкМ

EGF, 10 нг/мл EGCG, мкМ

Рисунок 25 - Влияние ЕвСв на фосфорилирование Руп (А), ЕИК (Б) и формирование колоний иВ6 С141 клеток (В), индуцированные ЕвР. * р<0.05; ** р<0.005 (достоверное отличие от контроля)

Показано, что формирование и размер колоний в клетках siRNA-Fyn JB6 CI41 (экспрессия Fyn подавлена) были ниже, чем в контрольных JB6 CI41 клетках. Впервые установлено, что уменьшение уровня киназы Fyn подавляло трансформацию клеток, индуцируемую EGF, и это подтверждало предположение, что Fyn участвует в данном процессе.

Исследовано участие Fyn в процессах регуляции транскрипционных факторов или киназ. Впервые показано, что фосфорилирование STAT1, ATF-2 и р38 в клетках siRNA-Fyn JB6 CI41 было ниже, чем в контрольных клетках pcDNA JB6 CI41. EGCG ингибировал фосфорилирование всех перечисленных белков. Установлено, что EGCG

блокировал непосредственное участие Fyn в трансформации JB6 CI41 клеток, индуцируемой EGF.

3.1.3.2 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток, индуцируемую инсулиноподобным фактором роста 1

Роль EGGG в регуляции сигнального пути, проходящего через рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R), не изучена. Использовали коммерческий IGF-IR и иммунопреципитированный из R+ клеток (рис. 26 В) с повышенной экспрессией IGF-IR (рис. 26 А и Б соответственно). Показано, что EGCG ингибировал активность IGF-IR (рис. 26 А, нижняя панель и рис. 26 Б) в дозозависимой манере. Следует отметить, что EGCG ингибировал как фосфорилирование субстрата IGF-IR - IGF-1 Rtide (рис. 26 А, нижняя панель), так и аутофосфорилирование рецептора (рис. 26 А, верхняя панель).

Взаимодействие EGCG и IGF-IR подтверждено аффинной хроматографией (EGCG-Сефароза 4В). Следует отметить, что связывание с рецептором, иммунопреципитированным из YF3 клеток, содержащих рецептор с мутациями в киназном домене IGF-IR (Y1131F, Y1135F и Y1136F), не происходило. Согласно данным компьютерного моделирования EGCG взаимодействовал с IGF-IR в домене, связывающем АТР, и аминокислоты Gin 977, Lys1003, Met1052, Thr1053, Asp1123 играли важную роль во взаимодействии.

А Б

О О О 2.5 5 10 20 EGCG (мкМ) О О 0 2.5 5 10 20 EGCG (мкМ)

+ - + + + + + IGF-lRtide (6.25 кмоль) + - + + + + + IGF-lRtide (6.2S и,моль)

- + + + + + +■ IGF-IR (200 in) + + + + + + IP: IGF-IR (50 мкл)

] аугофосфорнлнро.анп. П P-IGF-imme

p-IGF-lRtide ВИИЯИИИИИИР! не связанный 32р.дтр

не связанный "P-ATP S ."GF"'R

МштЯшйЩШ бета-актин

Рисунок 26 - Влияние EGCG на активность IGF-IR. (А) Активность коммерческого IGF-IR и (Б) иммунопреципитированного из R+ клеток (В) после обработки EGCG тестировали методом киназной активности

Было исследовано влияние EGCG на активацию IGF-IR под действием IGF-1 и фосфорилирование белков, вызванное этой активацией. В клетках R+, экспрессирующих высокий уровень IGF-IR (рис. 26 В), EGCG ингибировал фосфорилирование IGF-IR, ERK (Tyr202/Tyr204) и Akt (Ser473), вызванное активацией IGF-1. В R" клетках, не содержащих IGF-IR, фосфорилирование указанных белков не наблюдалось.

Показано, что рост R+ клеток происходил быстрее, чем клеток R , не содержащих IGF-IR (рис. 27 А). Полученные данные подтверждали, что IGF-IR является важным звеном в процессе пролиферации клеток. Исследовано влияние EGCG на действие рецептора в данном процессе. EGCG ингибировал рост R*, но не R" клеток (рис. 27 Б). Впервые показано, что действие EGCG на процесс регуляции роста опухолевых клеток происходит с участием IGF-IR.

3.0

2.0

8 с = о

1.0

о

(К+) клетки

(Я-) клетки

^ (Я-) клетки

1 2 3 4 5 д Время, дни 5 10 15

ЕвСС, мкМ

Рисунок 27 - Влияние ЮР-ИЗ на пролиферацию (А) и ЕвСв на жизнеспособность (Б) и 1=1- клеток. Клетки были не обработаны (А) или обработаны (Б) ЕбСС, жизнеспособность клеток оценивали во времени. * р<0.05 (достоверное отличие от контроля)

В" клетки, в которых отсутствует экспрессия ЮР-1Н, не способны трансформироваться под действием ЮМ. Я* клетки образовывали колонии в мягком агаре под действием ЮР-1 и ЕОСв в дозозависимой манере ингибировал этот процесс (рис. 28 А). Установлено, что МСР-7 клетки, экспрессирующие высокий уровень ЮР-1Я, образовывали колонии в мягком агаре под действием ЮР-1 и ЕвСв в дозозависимой манере ингибировал этот процесс (рис. 28 Б).

1(^-1, (20 иг/мл) ЕОСС, (мкМ)

Рисунок 28 - Влияние ЕйСв на формирование колоний (А) и МСР-7 (Б) клеток индуцированное ЮР-1. * р<0.05 (достоверное отличие от контроля)

Впервые показано, что одним из механизмов блокирования трансформации опухолевых клеток является ингибирование активности ЮР-1П полифенолом чая ЕвСв, как результат их взаимодействия.

3.2 Биологическая активность резвератрола

Исследовано взаимодействие резвератрола (ИвУ), его гидроксилированного (ЯБ\/1) и метоксилированного (ИБУг) аналогов с циклооксигеназой 2 (СОХ-2). Взаимодействие с СОХ-2 изучено нами с использованием аффинной

хроматографии (резвератрол-Сефароза 4В, рис. 29).

Коммерчески доступная СОХ-2 (рис. 29 А, линия 1) и иммунопреципитированная из клеток рака кишечника человека НТ-29 (рис. 29 Б, линия 1) связывались с резвератролом (рис. 29 А, линия 3; рис. 29 Б, линия 3 соответственно). Взаимодействие гидроксилированного, но не метоксилированного аналога резвератрола подтверждено диагностикой поверхностного плазмонного резонанса (ЭРв-диагностикой) с СОХ-2 (рис.

Е 4000

5

о 3000 »

| 2000 о

£ 1000

о

К®-1, (20 яг/мл) ЕвСС, (мкМ)

29 В). Константу диссоциации (КИ) комплекса СОХ-г-ЯБУ определяли с использованием флуоресцентной спектроскопии. Кс1, определенная методом титрования СОХ-2 различными концентрациями ЯБУ, составляла 58 мкМ. Полученные данные подтверждали непосредственное специфическое взаимодействие между ЯЭУ и СОХ-2.

В

СОХ-2 ЯвУ-Со^ Сефчрозя 4В

Лтет ШУ.! . Сефарош

)

Рисунок 29 - Идентификация белков, высокоаффинных к резвератролу. А и Б. Электрофореграммы коммерческой СОХ-2 (А) и белков лизата НТ-29 клеток (Б) после аффинной хроматографии (резвератрол-Сефароза 4В). Линия 1, А и Б - коммерческая СОХ-2 и СОХ-2 в клеточном лизате соответственно (контроль). Линия 2, А и Б -взаимодействие СОХ-2 и белков клеточного лизата с носителем Сефароза 4В (контроль). Линия 3, А и Б - белки (СОХ-2 и клеточный лизат соответственно), высокоаффинные к резвератролу после проявления антителами против СОХ-2. В. Демонстрация взаимодействия НБУ, ВЭ\/1 и ИЭУг с СОХ-2 ЭНв-диагностикой

Кроме того, была определена активность коммерческой и иммунопреципитированной из лизата клеток НТ-29 СОХ-2 по изменению синтеза простагландина Е2 (РЭЕг). Показано, что ЯЭУ обладал способностью ингибировать синтез РЭЕ2 (1С5о = 50 мкМ), индуцированный коммерческой СОХ-2, при этом только И8\/1 обладал более сильным ингибирующим действием (1С5о = 25 мкМ), НЭ\/2 не ингибировал синтез РЭЕ2. Целекоксиб, известный ингибитор СОХ-2, ингибировал синтез РЭЕ2 с 1С50 = 10 мкМ.

Изучена роль СОХ-2 в клеточной пролиферации с использованием клеток СОХ-2+/+ и СОХ-2-/-, экспрессирующих и не содержащих СОХ-2 соответственно (рис. 30 А). Показано, что клетки СОХ-2+/+ растут быстрее, и ЯЭУ и Я5\/1, но не ИБУг ингибировали рост этих клеток (рис. 30 А). Установлено, что ИЭУ и ИЭ\/1, но не ИЭУг,

Ъ !•«

"л

С

5

г

5 ми ¡1«

3 «Ь

ЕЗСОХ 2 :------Э-щкпш

•I

I СОХ2+/+

, т сох2-/-

контроль

□ 1«У

и

Ръ йЯУ-г

Контроль ККУ ИXV-1 \'-2 нелекокснГ)

I I

Время, дни

Рисунок 30 - Влияние резвератрола и его аналогов на пролиферацию клеток СОХ-2+/+ и СОХ-2-/- после 6 дней обработки (А) и клеток НТ-29 во времени (Б). * р<0.05 (достоверное отличие от контроля)

ингибировали рост клеток рака кишечника человека НТ-29, экспрессирующих высокий уровень СОХ-2 (рис. 30 Б). При этом ИЭХ/! обладал более сильным ингибирующим

действием на пролиферацию исследуемых клеток по сравнению с Я3\/, и его влияние было сопоставимо с действием целекоксиба (рис. 30 Б).

Изучена роль резвератрола и его аналогов в процессах самопроизвольного образования и роста колоний клеток НТ-29 (рис. 31). Показано, что Р!5У и ЯЗ\/1, но не ИЗ\/2 ингибировали данный процесс (рис. 31).

Рисунок 31 - Влияние резвератрола и его аналогов на формирование колоний клеток рака кишечника НТ-29. * р<0.05; ** р<0.005 (достоверное отличие от контроля)

Полученные нами данные впервые показали непосредственное взаимодействие резвератрола с СОХ-2 и, как следствие, ингибирование способности фермента продуцировать РвЕ2. Установлено, что ингибирование резвератролом пролиферации и трансформации раковых клеток происходит с участием циклооксигеназы 2, при этом гидроксилированный аналог резвератрола оказался более эффективным по отношению к исследованным процессам.

3.2.1 Синергическое действие резвератрола и фукоидана из бурой водоросли ЗассЬаг'та е/сЛог/'о/с/ев

Нами показан синергизм противоопухолевого действия резвератрола (ИЗУ) и фукоидана из Э. сюЬопЫс/еБ (ЭсР2) с целью повышения эффективности лечения злокачественных новообразований. Резвератрол проявлял цитотоксическую активность по отношению к клеткам кишечника человека НСТ 116: концентрация резвератрола, при которой погибало 50 % клеток (1С50), составляла 55 мкМ (рис. 32). Фукоидан ЭсР2 не обладал цитотоксическим эффектом по отношению к данному типу клеток.

Показано, что резвератрол подавлял пролиферацию НСТ 116 клеток на 34, 60 и 71 % после инкубации клеток с веществом в течение 24, 48 и 72 ч соответственно (рис. 33 А). Фукоидан ЗсР2 незначительно подавлял пролиферацию раковых клеток кишечника человека (степень ингибирования составляла менее 15%) (рис. 5 А). Действие резвератрола (40 мкМ, 24 ч) усиливалось после предварительной обработки клеток фукоиданом ЭсР2 (100, 200 и 300 мкг/мл) на 23, 28 и 32 % соответственно (рис. 33 Б). В данном случае имеет место синергизм действия при совместном введении двух веществ.

1С„ = 55 Мкм

О 20 40 60

Концентрация, мкМ

Рисунок 32 - Цитотоксичность резвератрола по отношению к опухолевым клеткам кишечника человека НСТ 116. * р<0.05 (достоверное отличие от контроля)

1

31% П 27% й

+ ИЗУ, 40 МКМ

200 300 БсР2, м кг/мл

V, 40 мкм мкг/мл

100 20<1 300

Время обработки, ч

Рисунок 33 - Влияние резвератрола (40 мкМ) (А) и совместное действие резвератрола и фукоидана ЭсР2 (Б) на пролиферацию опухолевых клеток кишечника человека НСТ 116. * р<0.05; ** р<0.005 (достоверное отличие от контроля)

Была исследована способность фукоидана модулировать апоптоз НСТ 116 клеток, индуцированный резвератролом. Идентификацию апоптоза опухолевых клеток человека проводили с помощью метода вестерн-блота, определяя активность каспазы 9 (инициаторная) и каспаз 7, 3 (эффекторные) (рис. 34). Появление фосфатидилсерина на

внешней стороне плазматической мембраны в процессе апоптоза раковых клеток регистрировали методом проточной цитометрии с окрашиванием аннексином-У/Р1 (рис. 35). Показано, что добавленный отдельно фукоидан ЭсР2 не индуцировал активацию каспаз в НСТ 116 клетках. Обработка клеток резвератролом сопровождалась

активаций прокаспазы 3. При совместном введении резвератрола и фукана наблюдался синергический эффект: происходила активация каспазы 9 (рис. 34) и, как следствие, активация каспаз 3 и 7. Важно отметить, что активация каспаз усиливалась с увеличением концентрации фукоидана БсРг. Полученный результат можно рассматривать как

' ^ | Прокнспазл 9 ****** \ Прокяспаза 7

Прокаспааа 3 Клеил 3 Р-актин

Рисунок 34

резвератрола и активацию каспаз каспаз 7 и 3

Совместное действие фукоидана ЗсР2 на 9, 7, 3 и расщепление

косвенное подтверждение наличия у фукоидана ЭсР2 апоптоз стимулирующей активности на данном виде опухоли.

Согласно результатам проточной цитометрии, содержание апоптотических клеток в культурах, обработанных и не обработанных фукоиданом, не отличалось (6 и 9 % соответственно). Обработка клеток резвератролом приводила к апоптозу 28 % клеток. Существенное повышение числа апоптотических клеток (до 52 %) наблюдалось при обработке НСТ 116 клеток резвератролом и фукоиданом всР2 (рис. 35). Таким образом, фукоидан БсР2 из Б. асЬогМеэ усиливал апоптоз НСТ 116 клеток, индуцированный резвератролом.

Резвератрол, 0 мкМ Фукоидан, 0 мкг/мл

Резвератрол, 40 мкМ Фукоидан, 0 мкг/мл

10" к и. 10°

Резвератрол, 40 мкМ Фукоидан, 100 мкг/мл

Ж 1

Резвератрол, 40 мкМ Фукоидан, 200 мкг/мл

шР' \

Резвератрол, 40 мкМ Фукоидан, 300 мкг/мл

10° ю1 102 103 ры-н

'Резвератрол, 40 мкМ 100 200 300 Фукоидан,;мкг/мл

Рисунок 35 - Совместное действие резвератрола и фукоидана из £ с/сЛол/ойе® на индукцию апоптоза опухолевых клеток кишечника человека НСТ 116. * р<0.05 (достоверное отличие от контроля)

Впервые обнаружено свойство фукоидана из бурой водоросли й. с/сЛог/ойев усиливать антипролиферативное и проалоптотическое действие резвератрола по отношению к опухолевым клеткам кишечника человека. Установлен молекулярный механизм реализации апоптоза, связанный с активацией каспаз 9, 7 и 3 в клетках рака кишечника человека. Полученные результаты подтверждают перспективность использования фукоиданов для профилактики и лечения онкологических заболеваний.

ВЫВОДЫ:

1. В работе охарактеризованы фукоиданы 13 видов бурых водорослей, собранных в различных регионах. Фукоиданы 10 видов водорослей изучены впервые. Установлено, что наибольшее количество фукоиданов продуцируют водоросли порядка Риса1ез, среднее - 1_аттапа1ез, наименьшее - 0|с1уо1а1ез. Содержание фукоиданов уменьшается, а гетерогенность их моносахаридного состава возрастает с повышением температуры среды обитания водорослей.

2. Показано, что фукоиданы водорослей порядка Dictyotales представляют собой гетерогенные полисахариды, Laminarïales - фуканы и галактофуканы, Fucales -полисахариды различного строения: от фуканов до гетерогенных полисахаридов. Установлено, что при использовании предварительной обработки водорослей сверхкритическим диоксидом углерода происходит удаление гетерогенных низкосульфатированных фракций фукоиданов, что позволяет сократить число стадий очистки.

3. Проведена систематизация структурных типов исследованных фукоиданов. Фукоидан из Saccharína cichorioides представляет собой высокосульфатированный 1—>3-a-L-фукан; 1—>3;1-»4-а-Ьфукан из Fucus evanescens содержит сульфатные (при С2 и С4) и ацетатные группы. Получены несколько типов галактофуканов. Галактофукан из Saccharína japónica построен из 1—»3-связанных остатков a-1-фукозы и 1—>6-связанных остатков p-D-галактозы, сульфатированных по положениям С2 и менее по С4 и частично ацетилированных. Галактофукан из Lindaría pinnatifida построен из 1—<3- и 1—>4-связанных остатков a-L-фукозы и p-D-галактозы, сульфатированных по положениям С4 и менее по С2, и частично ацетилированных. В галактофукане из Sargassum mcclurei впервые обнаружены фрагменты, состоящие из чередующихся остатков a-1-фукозы и р-

0-галактозы, сульфатированных по положениям С2, СЗ и С4. Остатки фукозы соединены 1->3-, 1->4-связями, галактозы -1-»4- или 1->6- связями.

4. Показано, что фукоиданы незначительно влияют на пролиферацию раковых клеток человека, но эффективно ингибируют трансформацию нормальных клеток, индуцированную EGF, и самопроизвольное формирование и рост колоний опухолевых клеток человека. Впервые установлены избирательность противоопухолевого действия фукоиданов и взаимосвязь структурных элементов фукоиданов с их противоопухолевым действием.

5. Фукоиданы из Fucus evanescens и Costaría costata подавляют экспрессию ММР-1, индуцируемую УФ излучением в клетках керанотиноцитов человека, на транскрипционном и трансляционном уровнях, изменяя активность клеточных белков МАРК сигнального каскада. Установлена физиологическая роль взаимодействия митоген активированной протеинкиназы JNK 1/2 с супрессором опухолевого роста p16INK4a в ответ на действие ультрафиолетового излучения, заключающаяся в ингибировании активности онкогена H-RasG12V. Это позволяет объяснить механизмы образования рака кожи, вызванных УФ радиацией.

6. Впервые выделен высокомолекулярный (19-27 кДа) сильноразветвленный ламинаран из Eisenia bícyclis. Основная цепь ламинарана состоит из 1->3- и 1-несвязанных остатков p-0-глюкоэы (1->3:1-»6 = 1.5:1): протяженность участков, построенных из 1-»3-связанных остатков глюкозы, составляет не более четырех, а из

1-»6- - не более трех моносахаридов. Показано, что уменьшение молекулярной массы нативного ламинарана из 5. bicyclis до определенного предела (степень полимеризации 9-23) и увеличение содержания 1 ->6-связанных остатков р-О-глюкозы (1 —>3:1 —>6 = 1:1) приводят к возрастанию противоопухолевой активности.

7. Впервые показано участие эпигаллокатехин галлата в процессах пролиферации клеток и апоптозе, обусловленных взаимодействием с белком цитоскелета -виментином и белком, регулируемым глюкозой, соответственно. Установлено, что галлатная группа эпигаллокатехин галлата является важной для взаимодействия с виментином, GRP78 и регулирования их функций.

8. Впервые установлено, что эпигаллокатехин галлат подавляет трансформацию клеток через ингибирование активности цитоплазматической (Fyn) и трансмембранной (IGF-IR) тирозинкиназ. Установлен механизм ингабирования активности Fyn и IGF-1R эпигаллокатехин галлатом.

9. Впервые показано, что EGCG блокирует непосредственное участие Fyn в EGF индуцируемой трансформации JB6 CI41 клеток. Установлено, что эпигаллокатехин галлат и фукоидан из S. cichorioides ингибируют процесс трансформации клеток, индуцируемый EGF, через различные сигнальные пути.

10. Показана роль резвератрола, его гидроксилированного и метоксилированного аналогов в процессах регулирования активности циклооксигеназы 2 и, как следствие, подавления пролиферации опухолевых клеток. Установлено, что высокосульфатированный a-L-фукан из Saccharina cichorioides усиливает антипролиферативное действие резвератрола и апоптоз опухолевых клеток кишечника человека, индуцированный резвератролом. Молекулярный механизм реализации апоптоза связан с активацией инициаторных и эффекторных каспаз при совместном действии резвератрола и фукоидана.

11. Полученные данные позволяют рассматривать фукоиданы бурых водорослей, полифенолы растительного происхождения, а также сочетанные композиции фукоиданов и полифенолов как перспективные препараты для предупреждения и дополнительной терапии раковых заболеваний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Звягинцева Т.Н., Сова В.В., Бакунина И.Ю., Сундукова Е.В., Шевченко Н.М., Ермакова С.П., Елякова Л.С. Морские организмы как источники биологически активных полисахаридов, полисахарид гидролаз с уникальной специфичностью и их ингибиторов // Химия в интересах устойчивого развития. - 1998. - Т. 6. - С. 417-326.

2. Звягинцева Т.Н., Макарьева Т.Н., Ермакова С.П. Препаративное получение п-нитрофенилламинариолигозидов реакцией трансгликозилирования, катализируемой эндо-1,3-р-О-глюканазой из морского моллюска // Биоорган, химия. - 1998. - Т. 23. - С. 219-223.

3. Звягинцева Т.Н., Сова В.В., Ермакова С.П., Скобун А.С., Елякова Л.А. Поиск ингибиторов и активаторов эндо-1,3-|3-0-глюканаз в морских водорослях и травах // Биология моря. -1998.-Т. 24.-С. 246-249.

4. Ermakova S.P., Sova V.V., Zvyagintseva T.N. Brown seaweed protein as an inhibitor of marine mollusk endo-1,3-p-D-glucanases // Carbohyd. Res. - 2002. - Vol. 337 - P. 229-237.

5. Ermakova S., Choi B.Y., Choi H.S., Kang B.S., Bode A.M., Dong Z. The intermediate filament protein vimentin is a new target for epigallocatechin gallate // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280. - P. 16882-16890.

6. Choi B.Y., Choi H.S., Ко К., Cho Y.Y., Zhu F., Kang B.S., Ermakova S.P., Ma W.Y., Bode

A.M., Dong Z. The tumor suppressor p16(INK4a) prevents cell transformation through inhibition of c-Jun phosphorylation and AP-1 activity // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2005. - Vol. 12. - P.699-707.

7. Ermakova S.P., Kang B.S., Choi B.Y., Choi H.S., Schuster T.F., Ma W.Y., Bode A.M., Dong Z. (-)-Epigallocatechin gallate overcomes resistance to etoposide-induced cell death by targeting the molecular chaperone glucose-regulated protein 78 // Cancer Res. - 2006. - Vol. 66. - P. 9260-9269.

8. Cho Y.Y., Yao K., Bode A.M., Bergen H.R. 3rd, Madden B.J., Oh S.M., Ermakova S., Kang

B.S., Choi H.S., Shim J.H., Dong Z. RSK2 mediates muscle cell differentiation through regulation of NFAT3 // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282. - P. 8380-8392.

9. Li M„ He Z„ Ermakova S., Zheng D„ Tang F„ Cho Y.Y., Zhu F„ Ma W.Y., Sham Y„ Rogozin E.A., Bode A.M., Cao Y., Dong Z. Direct inhibition of insulin-like growth factor-l receptor kinase

activity by (-)-epigaliocatechln-3-gallate regulates cell transformation // Cancer Epidem. Biomar. - 2007. - Vol. 16. - P. 598-605.

10. Lee N.Y., Ermakova S.P., Choi H.K., Kusaykin M.I., Shevchenko N.M., Zvyagintseva T.N., Choi H.S. Fucoidan from Laminaría cichorioides inhibits AP-1 transactivation and cell transformation In the mouse epidermal JB6 cells // Mol. Carcinogen. - 2008. - Vol. 47. - P. 629-637.

11. Lee N.Y., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N., Kang K.W., Dong Z., Choi H.S. Inhibitory effects of fucoidan on activation of epidermal growth factor receptor and cell transformation in JB6 CI41 cells // Food Chem. Toxicol. - 2008. - Vol. 46. - P. 1793-1800.

12. Zykova T.A., Zhu F„ Zhai X., Ma W.Y., Ermakova S.P., Lee K.W., Bode A.M., Dong Z. Resveratrol directly targets COX-2 to inhibit carcinogenesis // Mol. Carcinogen. - 2008. - Vol. 47. - P. 797-805.

13. Kusaykin M., Bakunina I., Sova V., Ermakova S., Kuznetsova Т., Besednova N., Zaporozhets Т., Zvyagintseva T. Structure, biological activity, and enzymatic transformation of fucoidans from the brown seaweeds // Biotechnol. J. - 2008. - Vol. 3. - P. 904-915.

14. He Z„ Tang F„ Ermakova S„ LI M„ Zhao Q., Cho Y.Y., Ma W.Y., Choi H.S., Bode A.M., Yang C.S., Dong Z. Fyn is a novel target of (-)-epigallocatechin gallate in the inhibition of JB6 CI41 cell transformation // Mol. Carcinogen. - 2008. - Vol. 47. - P. 172-183.

15. Moon H.J., Lee S.H., Ku M.J., Yu B.C., Jeon M.J., Jeong S.H., StonikV.A., Zvyagintseva T.N., Ermakova S.P., Lee Y. H. Fucoidan inhibits UVB-induced MMP-1 promoter expression and down regulation of type I procollagen synthesis in human skin fibroblasts H Eur. J. Dermatol. -

2009.-Vol. 19.-P. 129-134.

16. Moon H.J., Park K.S., Ku M.J., Lee M.S., Jeong S.H., Imbs T.I., Zvyagintseva T.N., Ermakova S.P., Lee, Y. H. Effect of Costaría costata fucoidan on expression of matrix metalloprotelnase-1 promoter, mRNA, and protein//J. Nat. Prod. - 2009. - Vol. 72. - P. 1731-1734.

17. Вищук O.C., Ермакова С.П., Тин Ф.Д., Звягинцева Т.Н. Противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей // Тихоокеан. мед. журн. - 2009. - Т. 3. - С. 92-96.

18. Звягинцева Т.Н., Ермакова С.П., Кусайкин М.И., Шевченко Н.М., Федоров С.Н., Квак Я.Й. Средство, индуцирующее созревание дендритных клеток // Патент РФ на изобретение № 2361598.-20.07.2009.

19. ИмбсТ.И., Красовская Н.П., Ермакова С.П., Макарьева Т.Н., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Сравнительное исследование химического состава и противоопухолевой активности водно-этанольных экстрактов бурых водорослей Laminaria cichorioides, Costaría costata и Fucus evanescens I/ Биология моря. - 2009 - Т. 35. - С. 140-146.

20. Ku M.J., Jung J.W., Lee M.S., Cho В.К., Lee S.R., Lee H.S., Vlschuk O.S., Zvyagintseva T.N., Ermakova S.P. Effect of Fucus evanescens fucoidan on expression of matrix metalloproteinase-1 promoter, mRNA, protein and signal pathway // Journal of Life Science. -

2010. - Vol. 20. - P. 1603-1610.

21. Федореев C.A., Кулеш Н.И., Мищенко Н.П., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Средство, обладающее противоопухолевой активностью II Патент РФ на изобретение Na 2414920. -27.03.2011.

22. Дрозд Н.Н., Шевченко Н.М., Ермакова С.П., Лапикова Е.С., Макаров В.А., Звягинцева Т.Н. Влияние структурных характеристик фукоиданов из бурых водорослей на антикоагулянтную активность и подвижность комплексов с сульфатом протамина при электрофорезе //Хим.-фарм. журнал. - 2011. - Т. 45. - С. 45-50.

23. Меньшова Р.В., Ермакова С.П., Rachldi S.M., Al-Hajje A.Y., Звягинцева Т.Н., Kanaan Н.М. Сезонные изменения состава, структурных характеристик и противоопухолевые свойства полисахаридов бурой водоросли Padina pavonica (Ливан) в зависимости от состава //Химия природ, соединений. - 2011. - Т. 47. - С. 297-301.

24. Соколова Р.В., Ермакова С.П., Awada S.M., Звягинцева Т.Н., Kanaan Н.М. Состав, структурные характеристики и противоопухолевые свойства полисахаридов бурых водорослей Dictyopteris poiypodioides и Sargassum sp. (Ливан) // Химия природ, соединений. -2011. - Т. 47. - С. 297-301.

25. Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С., Макаренкова И.Д., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Сульфатированные полисахариды водорослей - модификаторы функций врожденного

иммунитета при бактериальных, вирусных и паразитарных инфекциях // Успехи соврем, биологии. - 2011. -Т. 131 - С. 503-517.

26. Ermakova S., Sokolova R., Kim S. M., Urn В. H., Isakov V., Zvyagintseva T. Fucoidans from brown seaweeds Sargassum horneri, Eclonia cava, Costaria costata: structural characteristics and anticancer activity II Appl. Biochem. Biotech. - 2011. - Vol. 164. - P. 841-850.

27. Vishchuk O.S., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. Sulfated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonlca and Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics, and antitumor activity// Carbohyd. Res. - 2011. - Vol. 346. - P. 2769-2776.

28. Ермакова С.П., Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Михайлов В.В., Звягинцева Т.Н. Влияние метаболитов бурых водорослей на синтез О-гликозилгидролаз бактериями, деградирующими таллом Fucus evanescens // Микробиология. - 2012 - Т. 81. - С.

29. Макаренкова И.Д., Семанова И.Б., Ахматова Н.К., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н., Ермакова С.П. Влияние сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей на пролиферативную и цитотоксическую активность спленоцитов мышей // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - Т. 6. - С. 68-75.

30. Меньшова Р.В., Лепёшкин Ф.Д., Ермакова С.П., Покровский О.И., Звягинцева Т. Н. Влияние условий предварительной обработки бурых водорослей сверхкритическими флюидами на выход и структурные характеристики фукоиданов // Химия природ, соединений. -2012. - Т. 48. - С. 823-826.

31. Макаренкова И.Д., Логунов Д.Ю., Тухватулин А.И., Семенова И.Б., Звягинцева Т.Н., Горбач В.И., Ермакова С.П., Беседнова Н.Н. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей - лиганды толл-подобных рецепторов // Биохимия. Серия В: Биомедицинская химия. - 2012. - Т. 58. - № 3. - С. 318-325.

32. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Ermakova S.P., Vishchuk O.S., Nazarenko E.L., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Anticancer activity in vitro of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens and its low-molecular fragments, structurally characterized by tandem mass-spectrometry // Carbohyd. Polymer. - 2012. - Vol. 87. - P. 186-194.

33. Vishchuk O.S., Tarbeeva D.V., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. The structural characteristics and biological activity of fucoidans from the brown algae Alaría sp. and Saccharina japónica of different reproductive status // Chem. Biodlvers. - 2012. - Vol. 9. - P. 817-828.

34. Ermakova S., Men'shova S., Vishchuk O., Kim C., Um B„ Isakov V., Zvyagintseva, T. Water-soluble polysaccharides from the brown alga Eisenia bicyclis: Structural characteristics and antitumor activity // Algal Res. - 2013. - Vol. 2. - P. 51-58.

35. Vishchuk O.S., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. The effect of sulfated 1,3-alpha-L-fucan from the brown alga Saccharina cichorioides Miyabe on resveratrol-induced apoptosis in colon carcinoma cells // Mar. Drugs. - 2013. - Vol. 11. - P. 194-212.

36. Меньшова P.В., Ермакова С.П., Ум Б.Х., Звягинцева Т.Н. Состав и структурные характеристики полисахаридов бурой водоросли Eisenia bicyclis И Биология моря. -2013. - Т. 39. - № 3. - С. 213-218.

37. Pham D.T., Menshova R.V., Ermakova S.P., Anastyuk S.D., Bui M.L., Zvyagintseva T.N. Structural characteristics and anticancer activity of fucoidan from the brown alga Sargassum mcclurei// Mar. Drugs.-2013.-Vol. 11.-P. 1456-1476.

396-402.

Соискатель

Ермакова С.П.

Ермакова Светлана Павловна

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ И ПОЛИФЕНОЛОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Пописано в печать 8.11.13. Формат 60х841Аб

Усл. печ. л. 1.00 Уч. изд. л. 1.00 Тираж 120 экз. Заказ 621

Отпечатано в Дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

05201450329

Ермакова Светлана Павловна

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ И ПОЛИФЕНОЛОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

Научный консультант: д.х.н., профессор Звягинцева Т.Н.

ВЛАДИВОСТОК - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................................................7

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР............................................................................................................................................17

2.1 Канцерогенез....................................................................................................................................................................17

2.1.1 Стадии развития канцерогенеза..............................................................................................................17

2.1.2 Экзогенные канцерогенные факторы................................................................................................18

2.2 Фукоиданы..........................................................................................................................................................................25

2.2.1 Общие сведения......................................................................................................................................................25

2.2.2 Характеристики структуры фукоиданов..........................................................................................25

2.2.2.1 Структурные группы фукоиданов................................................................................................31

2.2.3 Фармакинетика, биодоступность и токсичность фукоиданов....................................41

2.2.4 Противоопухолевое действие фукоиданов....................................................................................44

2.2.4.1 Антипролиферативное действие фукоиданов..................................................................44

2.2.4.2 Проапоптотическое действие фукоиданов..........................................................................51

2.2.4.2.1 Определение понятия «апоптоз». Отличительные признаки апоптоза......................................................................................................................................................51

2.2.4.2.2 Сигнальные пути при апоптозе..............................................................................................52

2.2.4.2.3 Митоген-активируемые протеинкиназные каскады..........................................54

2.2.4.2.4 Индукция апоптоза фукоиданами......................................................................................56

2.2.4.3 Антиметастатическое действие фукоиданов......................................................................60

2.2.4.4 Антиангиогенное действие фукоиданов................................................................................62

2.3 Катехины — полифенолы зеленого чая..................................................................................................65

2.3.1 Состав и структура катехинов. Эпигаллокатехин галлат................................................65

2.3.2 Фармакокинетика и биодоступность эпигаллокатехин галлата................................67

2.3.3 Биологическая активность эпигаллокатехин галлата..........................................................69

2.3.3.1 Антиоксидантная активность эпигаллокатехин галлата..........................................69

2.3.3.2 Регуляция клеточного цикла и индукция апоптоза эпигаллокатехин 71 галл атом...............................................................................

2.3.3.4 Блокада неоангиогенеза эпигаллокатехин галлатом..................................................75

2.3.3.5 Ингибирование металлопротеиназ эпигаллокатехин галлатом........................77

2.3.3.6 Эпигаллокатехин галлат и циклооксигеназа-2..................................................................78

2.3.3.7 Фотозащитный эффект эпигаллокатехин галлата..........................................................78

2.4 Заключение.................................................................................... 79

3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................................................. 80

3.1 Морские организмы как источники биологически активных полисахаридов,

полисахаридгидролаз с уникальной специфичностью и их ингибиторов........ 80

3.1.1 Фукоиданы бурых водорослей......................................................... 80

3.1.1.1 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов

из Saccharina cichorioides.......................................................... 89

3.1.1.2 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов

из Saccharina japónica............................................................. 90

3.1.1.3 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов

из Undaria pinnatifida.............................................................. 91

3.1.1.4 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов

из Costaría costata, Eisenia bicyclis и Ecklonia cava.......................... 92

3.1.1.5 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов

из Fucus evanescens................................................................. 93

3.1.1.6 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов

из Sargassum sp., Dictyopteris polypodioides и Padina pavonica............ 95

3.1.1.7 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов

из Sargassum horneri................................................................ 96

3.1.1.8 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов

из Sargassum mcclurei.............................................................. 96

3.1.1.9 Содержание и анализ структуры фукоиданов в зависимости от

порядка и места произрастания водорослей................................... 99

3.1.2 Ламинараны бурых водорослей....................................................... 101

3.1.2.1 Актуальность изучения ламинаранов, полисахаридгидролаз и их ингибиторов........................................................................... 101

3.1.2.2 Выделение ламинаранов из бурой водоросли Eisenia 103 bicyclis..................................................................................

3.1.2.3 Структура высокомолекулярного ламинарана из Eisenia 105 bicyclis...................................................................................

3.1.2.3.1 Исследование структуры ламинарана классическими химическими методами....................................................... 105

3.1.2.3.2 Ферментативная трансформация ламинарана из Eisenia

bicyclis................................................................................................. 106

3.1.2.4 Противоопухолевая активность ламинарана из Eisenia bicyclis и 110 продуктов его ферментативного гидролиза.....................................

3.1.3 Биологическая активность фукоиданов из бурых

водорослей................................................................................. 111

3.1.3.1 Цитотоксическая активность фукоиданов...................................... 111

3.1.3.2 Действие фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток.............. 113

3.1.3.3 Влияние фукоиданов на неопластическую трансформацию клеток, вызванную действием эпидермального фактора роста...................... 115

3.1.3.4 Молекулярный механизм канцерпревентивного действия фукоидана

из бурой водоросли Saccharina cichorioides.................................... 117

3.1.3.5 Действие фукоиданов на самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток.................................................................. 120

3.1.3.6 Действие полисахаридов из бурых водорослей Fucus evanescens, Costaria costata и Alaria fistulosa на активацию матриксных металлопротеиназ, индуцируемую УФ излучением........................... 123

3.1.3.7 Действие фукоиданов бурых водорослей на элементы врожденного иммунитета........................................................................... 128

3.1.3.7.1 Действие фукоиданов бурых водорослей на созревание дендритных клеток............................................................. 128

3.1.3.7.2 Действие фукоиданов на толл рецепторы................................. 133

3.2 Наземные растения как источник биологически активных полифенолов........ 139

3.2.1 Биологическая активность катехинов зеленого чая..................................... 139

3.2.1.1 Действие эпигаллокатехин галлата на пролиферацию клеток: взаимодействие с виментином и регулирование его функций............. 139

3.2.1.2 Действие эпигаллокатехин галлата на апоптоз опухолевых клеток: взаимодействие с белком, регулируемым глюкозой, и влияние на его функции................................................................................ 144

3.2.1.3 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток: взаимодействие с онкогеновыми тирозинкиназами и регулирование их функций................................................................................ 156

3.2.1.3.1 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток, индуцируемую эпидермальным фактором роста........................ 157

3.2.1.3.2 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток, индуцируемую инсулиноподобным фактором роста 1.................. 162

3.2.2 Биологическая активность резвератрола........................................... 167

3.3 Синергическое действие резвератрола и фукоидана из бурой водоросли Saccharina cichorioid.es............................................................................................................................................172

3.4 Заключение........................................................................................................................................................................176

4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................................................................................179

4.1 Приборы и материалы..............................................................................................................................................179

4.1.1 Приборы........................................................................................................................................................................179

4.1.2 Материалы..................................................................................................................................................................180

4.2 Методы....................................................................................................................................................................................184

4.2.1 Аналитические методы....................................................................................................................................184

4.2.2 Общие методы........................................................................................................................................................185

4.2.2.1 Экстракция водорослей органическими растворителями......................................185

4.2.2.2 Экстракция водорослей сверхкритическим диоксидом углерода..................185

4.2.2.3 Экстракция полисахаридов из бурых водорослей........................................................185

4.2.2.4 Хроматография..............................................................................................................................................186

4.2.2.5 ИК-спектроскопия......................................................................................................................................186

4.2.2.6 ЯМР спектроскопия..................................................................................................................................186

4.2.2.7 Хромато-масс-спектрометрия..........................................................................................................186

4.2.2.8 МАЛДИ масс-спектрометрия..........................................................................................................187

4.2.2.9 Кислотный гидролиз фукоиданов................................................................................................187

4.2.2.10 Определение моносахаридного состава..............................................................................187

4.2.2.11 Десульфатирование фукоиданов................................................................................................188

4.2.2.12 Автогидролиз фукоиданов..............................................................................................................188

4.2.2.13 Ферментативный гидролиз..............................................................................................................188

4.2.2.14 Получение фукоидана в нерастворимой форме........................................................................188

4.2.2.15 Связывание фукоидана с эпидермальным фактором роста in vitro............189

4.2.2.16 Деградация по Смиту............................................................................................................................189

4.2.2.17 Метилирование..........................................................................................................................................189

4.2.2.18 Получение ацетатов полиолов......................................................................................................190

4.2.2.19 Получение продуктов исчерпывающего ферментативного гидролиза ламинарана......................................................................................................................................................190

4.2.2.20 Частичный гидролиз альгинатов................................................................................................190

4.2.2.21 Культивирование клеток..................................................................................................................190

4.2.2.22 Трансфекция и культивирование стабильных клеточных линий..................190

4.2.2.23 Определение цитотоксической активности природных соединений.... 191

4.2.2.24 Измерение клеточной пролиферации....................................................................................191

4.2.2.25 Неопластическая трансформация клеток (метод мягкого агара)..................191

4.2.2.26 Приготовление лизата клеток......................................................................................................192

4.2.2.27 Электрофорез в полиакриламидном геле..........................................................................192

4.2.2.28 Перенос белков на мембрану (Вестерн-блот)................................................................192

4.2.2.29 Аффинная хроматография................................................................................................................193

4.2.2.30 Подготовка проб и двумерный электрофорез................................................................194

4.2.2.31 Анализ гелей................................................................................................................................................194

4.2.2.32 Идентификация белков с помощью МАЛДИ ТОФ масс-спектрометрии..............................................................................................................................194

4.2.2.33 Метод проточной цитометрии......................................................................................................195

4.2.2.34 Люциферазный метод. Определение активности с-Бов, с-1ип и АР-1... 195

4.2.2.35 Определение активности ММР-1..............................................................................................196

4.2.2.36 Определение активности киназ..................................................................................................196

4.2.2.37 Определение активности вКР78..........................................................................................197

4.2.2.38 Конверсия вЯР78....................................................................................................................................197

4.2.2.39 Иммунопреципитация..........................................................................................................................197

4.2.2.40 Экспрессия и выделение рекомбинантных белков....................................................197

4.2.2.41 С5Т-виментинЛЖР78/Руп/ ЮБЯ аффинное связывание и определение константы диссоциации......................................................................................198

4.2.2.42 Статистическая обработка данных..........................................................................................199

5 ВЫВОДЫ......................................................................................................................................................................................200

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................................203

Приложения................................................................................................................................................................................250

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Изучение природных соединений - важная научная область, лежащая на стыке химии, биологии и медицины. Она включает работы по поиску, выделению, установлению строения, изучению химических превращений и биологических функций природных веществ. Эти исследования играют важную роль в углублении химических и биологических знаний, создают научную основу для разработки новых лекарств и биологически активных добавок к пище [1].

Исследования механизмов действия веществ привели к открытию новых свойств природных соединений, входящих в состав пищевого рациона человека. Были обнаружены противоопухолевые свойства полифенола из зелёного чая - эпигаллокатехин галлата. Присутствием резвератрола в красном вине был объяснён так называемый "французский парадокс" - тот факт, что сердечно-сосудистые заболевания относительно редко встречаются у жителей юга Франции, регулярно употребляющих красное вино (при местной диете богатой насыщенными жирами). Бурые водоросли, широко используемые в пищу в странах Юго-Восточной Азии, стали объектом повышенного интереса в связи с обнаружением у сульфатированных полисахаридов водорослей — фукоиданов — целого спектра биологических активностей, в том числе и противоопухолевой. Необходимо отметить, что фукоиданы часто образуют прочные комплексы с полифенолами, одним из которых является эпигаллокатехин галлат — известный полифенол зеленого чая. Актуальным представляется изучение механизмов действия фукоиданов различной структуры и полифенолов в процессах регуляции развития опухолей.

Онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности людей. Несмотря на усилия ученых и врачей во всем мире, это заболевание уносит огромное число человеческих жизней и занимает второе место по смертности после сердечно-сосудистой патологии. Основными методами лечения онкологических заболеваний являются хирургический, лучевая и химиотерапия. Однако хирургическое вмешательство не всегда дает желаемый результат вследствие распространения опухолевых клеток за пределы первичного очага и развития метастазов, а при лучевой терапии происходит повреждение пограничных здоровых тканей.

Поиск новых противоопухолевых средств ведут во многих направлениях - среди антиметаболитов, алкилирующих агентов, антибиотиков, гормонов. Препараты растительного происхождения составляют около 1 % от общего числа исследуемых

противоопухолевых средств. Изучение противоопухолевой профилактической и терапевтической активностей природных соединений проводят научные коллективы разных стран. В Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук ведутся работы в области химии, биохимии, биотехнологии и молекулярной клеточной биологии природных соединений из наземных и морских организмов. Комплексное изучение новых природных соединений позволяет обнаружить вещества, обладающие противоопухолевыми свойствами, определить их оптимальные действующие концентрации и перспективные комбинации.

Таким образом, актуальным направлением профилактики и лечения онкологических заболеваний является поиск природных соединений, повышающих устойчивость организма к развитию опухолей, и снижающих возможность рецидива опухоли после проведенной лучевой или химиотерапии; а также исследование механизмов их действия. Эффективным подходом представляется комбинированная противоопухолевая химиотерапия, сочетающая в себе препараты с различными механизмами действия.

Цель работы - определение структуры природных соединений, обладающих противоопухолевым действием, изучение их влияния на регулирование процессов клеточной трансформации, пролиферации и апоптоза для установления взаимосвязи межд