Комплексное исследование полисахаридов и фотосинтетических пигментов красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Кравченко Анна Олеговна

Комплексное исследование полисахаридов и фотосинтетических пигментов красной водоросли AЛпfe/f/ops/s НаЬеИИогт'я

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

3 июн 7015

005569693

Владивосток-2015

005569693

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Ермак Ирина Михайловна

Официальные оппоненты:

Щеголев Сергей Юрьевич

доктор химических наук, профессор, директор Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Титлянов Эдуард Антонинович

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией физиологии автотрофных организмов Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН

Ведущая организация:

Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, г. Сыктывкар

Защита состоится «23» июня 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреледении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата и диссертации размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «13» мая 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.б.н.

Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Красные водоросли - источник уникальных по структуре и физико-химическим свойствам биологически активных веществ. Основными структурными компонентами клеточной стенки красных водорослей являются сульфатированные полисахариды - агар и каррагинан, полимерная цепь которых построена из остатков галактозы, соединенных чередующимися р-(1—>4) и а-(1—>3) гликозидными связями. 4-О-замещенный моносахаридный остаток может быть представлен как галактозой, так и ее 3,6-ангидропроизводным и имеет ^конфигурацию в группе агара (Ц и Э-конфигурацию (О) в группе каррагинана. Гидроксильные группы могут быть сульфатированы, метилированы или замещены остатками пировиноградной кислоты. Каррагинаны классифицируются согласно местоположению и количеству сульфатных групп в моносахаридных остатках (Б) и присутствию 3,6-ангидрогалактозы (бА) в 4-О-связанных остатках. Химическая структура этих биополимеров сложна и разнообразна, что обусловлено видовой принадлежностью водорослей, фазой их жизненного цикла и условиями обитания. В случае каррагинанов сложность структуры связана как с возможным присутствием смеси нескольких типов каррагинанов в водоросли, так и комбинацией различных идеальных каррабиозных звеньев, распределенных вдоль полимерной цепи, что приводит к образованию гибридных структур. Термин ОЬгибрид предложен для агар-каррагинановых гибридных структур. В большинстве случаев трудно установить, имеет полисахарид гибридную структуру или представляет собой смесь различных полимеров, каждый из которых проявляет регулярность, типичную для классического агара или каррагинана.

Сульфатированные полисахариды красных водорослей обладают гелеобразующими свойствами, внесены в список пищевых добавок и последнее время, благодаря разнообразной биологической активности и физико-химическим свойствам, находят все большее применение в медицинской и фармацевтической промышленности. Физико-химические и биологические свойства этих полисахаридов тесно связаны с их структурой.

Наряду с полисахаридами красные водоросли содержат пигменты светособирающего комплекса - фикобилипротеины (ФБП), количество которых в клетке достаточно велико. ФБП (фикоэритрин (ФЭ), фикоцианин (ФЦ) и аллофикоцианин (АФЦ)) - высокомолекулярные комплексные соединения, в которых хромофорная группа пигмента ковалентно связана с остатком цистеина водорастворимого белка. Они обладают яркой окраской и очень интенсивной флуоресценцией, поэтому находят применение в иммунофлуоресцентной диагностике, цитометрии и других биологических исследованиях. ФБП весьма перспективны для использования в косметической и пищевой промышленности, где преимущество натуральных красителей перед синтетическими достаточно очевидно. В последнее время получены данные о разносторонней биологической активности ФБП.

Качественный и количественный состав сульфатированных полисахаридов и пигментов красных водорослей зависит от множества факторов: экзогенных, определяемых условиями произрастания водоросли (соленостью и температурой воды, освещенностью, концентрацией биогенных элементов), и эндогенных, связанных с физиологией макрофита, в частности его видовой принадлежностью и стадией развития. Последний фактор особенно важен, поскольку красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, характеризующийся чередованием вегетативного, полового и бесполого размножения. Проводимое в последние годы изучение структурных характеристик полисахаридов водорослей с учетом жизненного цикла макрофитов позволило установить новые структуры этих полимеров. Как известно, высокая степень вариабельности структуры сульфатированных полисахаридов из природных источников часто приводит к невоспроизводимости физико-химических и биологических свойств полимеров, получаемых из разных партий водорослей, собранных в различных условиях. Более того, адаптивные перестройки, происходящие в макрофитах в ответ на изменения параметров окружающей среды (освещение, температура воды), как известно, сопровождаются также изменением количества и соотношения пигментов светособирающего комплекса. Поэтому при комплексном исследовании водорослей особое внимание должно быть направлено на изучение влияния факторов среды их

з

обитания на количественные и структурно-химические характеристики физиологически-активных соединений - полисахаридов и ФБП.

Достаточно широко представленные на российском тихоокеанском побережье макрофиты семейства РЬу11ор1погасеае слабо изучены и, согласно немногочисленным литературным данным, являются источником необычных по структуре и физико-химическим характеристикам полисахаридов, которые содержат и агар, и каррагинан. Сведения о полисахаридном и пигментном составе представителя этого семейства -водоросли АЬМеШорв^ АаЬеИ'^огтя, обитающей в Дальневосточных морях России, и его зависимости от условий обитания и стадии жизненного цикла макрофита, отсутствуют. Вместе с тем, эта водоросль может оказаться новым потенциальным источником биологически активных соединений. В связи с этим изучение взаимосвязи полисахаридного и пигментного состава водоросли с условиями среды ее обитания и стадией жизненного цикла позволит определить наиболее благоприятные периоды для заготовки сырья и оценить возможность комплексного использования А. ПаЬеНПогтк.

Цель данной работы - структурное исследование сульфатированных полисахаридов из стерильной и репродуктивной форм красной водоросли А. ПаЪе1Шогт15 и выяснение факторов, влияющих на количественные и качественные характеристики полисахаридов и фотосинтетических пигментов (фикобилипротеинов).

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. исследовать полисахаридный состав и содержание фотосинтетических пигментов А. ПаЬеМТогтя в зависимости от таких параметров среды обитания водорослей, как температура воды и уровень фотосинтетически активной радиации (ФАР);

2. подобрать оптимальные условия для комплексного выделения ФБП и полисахаридов водоросли А. АаЬеПКогтя-,

3. установить структуру полисахаридов из стерильной и репродуктивной (карпоспорофит) форм А. АаЬе1Могт13.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. Работа поддержана грантами: ДВО РАН № 13-Ш-В-05-085 (руководитель Кравченко А.О.), РФФИ № 14-04000866А (руководитель д.х.н. Ермак И.М.), «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель к.б.н. Рассказов В.А.) и интеграционным грантом ДВО-УрО РАН (руководитель д.х.н. Ермак И.М.).

Научная новизна работы. Впервые изучен качественный и количественный полисахаридный и пигментный состав дальневосточной водоросли А. ПаЬе1Могт1з в зависимости от сезона ее сбора и показано, что освещенность и температура воды влияют на накопление в ней ФБП и сульфатированных полисахаридов. Разработан оптимальный метод комплексного выделения полисахаридов и ФБП из водоросли А. АаЬе/МогтЬ. Впервые установлена структура желирующих полисахаридов, выделенных из стерильной и репродуктивной (карпоспорофит) форм А. ИаЬеШогтя. Показано, что полисахарид из стерильной формы А. ЛаЬеШогт1з представляет собой каррагинан с гибридной каппа/бета структурой с соотношением соответствующих звеньев 3:1, а в состав полимерной цепи полисахарида из карпоспорофита входят преимущественно дисахаридные звенья йота-, каппа- и бета-каррагинанов, а также минорные количества ню-каррагинана. Установлено, что ксилоза, имеющая фуранозную форму, является заместителем одной из гидроксильных групп галактозы и занимает предположительно положение 6 1,3-связанной р-й-галактозы в полимерной цепи каррагинана.

Практическая значимость работы. Данные о влиянии факторов окружающей среды и стадии жизненного цикла водоросли на содержание ФБП и полисахаридов А. АаЬеМТогт/з могут быть использованы при выборе оптимального времени года для

Сокращения и условные обозначения. AnGal - 3,6-ангидрагалактоза, COSY - корреляционная спектроскопия, D -1,4-связанная a-D-галактоза, D6S - 1,4-связанная a-D-галактоза 6-сульфат, DA - 1,4-связанная З.б-ангидро-a-D-галактоза, DA2S - 1,4-связанная 3,6-ангидро-а-0-галактоза 2-сульфат, G - 1,3-связанная p-D-галактоза, G4S - 1,3-связанная p-D-галактоза 4-сульфат. Gal - галактоза. Glc - глюкоза. HSQC - гетероядерная одноквантовая корреляция. L- 1,4-связанная a-L-галактоза. ROESY-спектроскопия эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат, Xyl - ксилоза. АФЦ - аплофикоцианин, АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время, ДЕАЕ - диэтиламиноэтил, ИК - инфракрасный. ИЭР - ионизация электрораспылением. Кар - каротиноиды. МАЛДИ -матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, ОРБ - общий растворимый белок, ПС - полисахарид. ПТВ - протромбиновое время, СВ водоросли - сухой вес водоросли. ФАР - фотосинтетически активная радиация, ФБП -фикобилипротеины, ФЦ - фикоцианин, ФЭ - фикоэритрин, Хл а - хлорофилл а. ЯМР - ядерный магнитный резонанс.

заготовки сырья с целью получения максимального выхода целевого продукта. Разработанный метод комплексного выделения основных компонентов клеточной стенки красных водорослей - ФБП и полисахаридов с их максимальным выходом позволит рационально использовать воспроизводимое уникальное сырье Дальневосточного региона и сократить количество отходов производства.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Качественный и количественный пигментный и полисахаридный состав водоросли A. flabelliformis зависит от факторов среды ее обитания: температуры воды и фотосинтетически активной радиации (ФАР).

2. Последовательное выделение из A. flabelliformis ФБП и полисахаридов позволяет увеличить выход полисахаридов.

3. Наиболее эффективным методом выделения ФБП является экстракция их водным 1,5% раствором NaN03.

4. Структура полисахаридов из A. flabelliformis зависит от стадии жизненного цикла макрофита.

5. Желирующий полисахарид из стерильной формы A. flabelliformis представляет собой гибридный каппа/бета-каррагинан с соотношением каппа- и бета-звеньев 3:1 и содержит в минорных количествах звенья йота- и гамма-каррагинанов (предшественник бета-каррагинана).

6. Желирующий полисахарид из карпоспорофита A. flabelliformis представляет собой йота/каппа-каррагинан (соотношение йота:каппа 1:0,5), содержит звенья бета-каррагинана и минорные количества ню-каррагинана (предшественник йота-каррагинана).

7. В результате ферментативного гидролиза йота/каппа-каррагинана из А. flabelliformis получены высокомолекулярная фракция полисахарида, устойчивая к действию фермента, и олигосахариды: йота-каррабиоза, йота-карратетраоза, а также гибридные тетра- (DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S) и гексасахариды (DA2S-G4S-DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S-DA2S-G4S, DA2S-G4S-DA-G4S-DA2S-G4S).

8. Ксилоза, присутствующая в полисахаридах из обеих форм водоросли, является заместителем одной из гидроксильных групп галактозы. Данный моносахаридный остаток, имеющий фуранозную форму, занимает предположительно положение 6 1,3-связанного остатка ß-D-галактозы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены лично автором в виде устных докладов на 1st Symposium «Marine Enzymes and Polysaccharides», Nha Trang, 2012; II Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология», Саратов, 2014; XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2009; XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2012; а также в виде стендовых сообщений на XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2010; 4th Annual Russian-Korean Conferences «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology», Novosibirsk, 2012; 2nd International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, 2013.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных и зарубежных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 9 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН «7» апреля 2015 г.

Личный вклад соискателя в проведение исследования. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором при содействии сотрудников ЛМОАБИ и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, а также совместно с сотрудниками ЛФАО ИБМ им A.B. Жирмунского ДВО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Литературный обзор», «Результаты и обсуждение», «Экспериментальная часть», «Выводы» и «Список литературы», включающий 283 наименования. Диссертация изложена на 161 странице. Результаты представлены в 23 таблицах и иллюстрированы 32 рисунками.

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. И.М. Ермак за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы, к.х.н. А.О. Барабановой за помощь в постановке первых экспериментов, к.б.н. Е.В. Соколовой за проведение экспериментов по биологической активности полисахаридов, к.х.н. В.И. Горбач за полезные советы, д.х.н. Т.Ф. Соловьевой и всем сотрудникам ЛМОАБИ за внимание к работе, к.х.н. С.Д. Анастюку, к.ф.-м.н. В.П. Глазунову и к.х.н. В.В. Исакову за получение и помощь в интерпретации масс-спектров, ИК- и ЯМР спектров, к.б.н. Белоус

0.С. за сбор и идентификацию водоросли, а также сотруднице ЛФАО Института Биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН к.б.н. И.М. Яковлевой за помощь в проведении эксперимента и интерпретации результатов по сезонной динамике пигментов. Автор также благодарит Dr. W. Heibert (Франция, CERMAV-CNRS) за любезное предоставление фермента йота-каррагиназы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Влияние факторов среды обитания водоросли А. flabelliformis на ее пигментный и полисахаридный состав

Известно, что изменение факторов среды обитания водорослей (освещение, температура и концентрация биогенных элементов в морской воде) вызывает адаптивные перестройки в макрофитах, затрагивающие как структуру и функции фотосинтетического аппарата, так и полисахаридный состав растения. Данные о пигментном и полисахаридном составе водорослей рода Ahnfeltiopsis, произрастающих в умеренных широтах, и его зависимости от факторов среды обитания макрофита отсутствуют. В связи с возможностью использования А. flabelliformis для получения сульфатированных полисахаридов и ФБП одна из задач настоящей работы состояла в изучении зависимости качественного и количественного состава фотосинтетических пигментов и полисахаридов этой водоросли от основных факторов среды ее обитания в течение года. Водоросли были собраны в феврале-декабре 2009 г. в естественных местах обитания в Амурском заливе (мыс Красный) с глубины 2 м и представлены репродуктивной формой (карпоспорофитами), чтобы исключить вероятность влияния стадии жизненного цикла макрофита на его полисахаридный состав.

Таблица 1. Среднемесячные значения температуры воды (Т,°С) и среднесуточные значения дозы фотосинтетически активной радиации (ФАР, 400-700 нм), проникающей в толщу воды на месте сбора А. flabelliformis в Амурском заливе (Японское море) с февраля по декабрь 2009 г.

Месяц Т,°С Среднесуточная доза ФАР, моль ■ м'2 ■ сут"1

февраль* -1,0±0,5 2,02

март* 1,1±1,2 4,53

начало апреля* 2,8±0,3 3,33

конец апреля 5,5±1,3 21,34

май 7,6±1,6 10,75

июнь 11,6±0,9 7,21

июль 18,1 ±1,8 14,44

август 22,7±1,6 19,47

сентябрь 20,6±1,7 17,24

октябрь 13,6±2,8 7,25

ноябрь 2,8±0,4 3,88

декабрь* 1,3±1,4 0,78

Примечание: * - наблюдался ледовый покров

Основными факторами среды, влияющими на синтез пигментов в водорослях, являются освещение и температура воды. В связи с этим в месте обитания А. ПаЬеИ'^огт^ в течение 2009 г. были измерены температура воды и количество фотосинтетически активной радиации (ФАР), достигающей поверхности талломов водорослей, выраженное как среднесуточная доза ФАР (табл. 1). Максимальная температура воды была зарегистрирована в августе, а минимальная - с декабря по март. Максимальные среднесуточные интенсивности ФАР были отмечены в апреле, что связано с увеличением солнечной активности и таяньем льда в весенний период (табл.

1). Высокая доза ФАР зарегистрирована также в июле-сентябре, что обусловлено повышением прозрачности атмосферного воздуха и завершением во второй половине лета периода муссонов, характерных для Дальневосточного региона с мая по первую декаду июля. Соленость воды в месте произрастания водоросли в течение исследуемого периода менялась незначительно и составляла в среднем 32-33%о.

1.1. Пигментный состав водоросли А. ЛаЬе1Н^гт1з в зависимости от факторов среды ее обитания

ФБП были экстрагированы 0,1 М фосфатным буфером из водорослей, замороженных в жидком азоте и хранящихся при -80°С, и идентифицированы спектральным методом по максимумам поглощения, характерным для ФЭ при 565 нм, ФЦ - 615 нм и АФЦ - 650 нм. Содержание ФБП рассчитывали по формулам Розенберга. Наряду с ФБП из водорослей были выделены охлажденным 90% ацетоном хлорофилл а (Хл а) и каротиноиды (Кар), максимумы поглощения которых находятся в области 664 и 480 нм соответственно. Полученные данные были обработаны статистически с использованием однофакторного дисперсионного анализа АЫО\/А и многорангового [.ЗО-теста, а также расчета коэффициента Спирмена.

На протяжении всего периода исследования преобладающим пигментом в ряду ФБП у А. ПаЬеИНогтя был ФЭ, содержание которого колебалось от 55 до 70% в зависимости от сезона (рис. 1 А). Доля АФЦ составляла 20-35% суммы красных пигментов, а ФЦ-не превышала 15%.

5 С 48 •

г !

хЫЫнъЫР

> - S. 5 » I *

Рис. 1. Сезонные изменения содержания ФБП (Д), а также хлорофилла а (Хл а) и каротиноидов (Кар) (Б) в талломах A. flabelliformis из Японского моря

Максимальное содержание ФБП у A. flabelliformis зарегистрировано в мае-июне (рис. 1 А), что, вероятно, связано с резким снижением интенсивности света в период высокой повторяемости пасмурных дней поздней весной и в первую половину лета (табл. 1). Повышение содержания Хл а и Кар до максимальных годовых значений наблюдалось с декабря до начала апреля, когда было отмечено существенное снижение интенсивности света подо льдом зимой и ранней весной, а также в июне (табл. 1, рис. 1 Б). Такая реакция пигментного аппарата морских растений относится к разряду адаптивных в ответ на понижение интенсивности света.

Во второй половине апреля и в июле-сентябре наблюдалось достоверное (LSDtest, Р < 0,05) 2-3-кратное уменьшение содержания всех пигментов в водоросли до минимальных годовых значений (рис. 1). Это связано с тем, что после длительного периода подо льдом или в условиях пасмурной погоды с мая до второй половины июля водоросли, адаптированные к низкой освещенности, подвергались воздействию высоких интенсивностей солнечной радиации (табл. 1). Коэффициенты Спирмена свидетельствуют о достоверной отрицательной корреляции между ФАР и содержанием пигментов в талломах водоросли (табл. 2). Наблюдаемое в апреле и летний период снижение концентрации ФБП, Хл а и Кар у A. flabelliformis является результатом подавления фотосинтетической активности водорослей.

С наступлением периода пасмурной погоды в мае и снижением солнечной активности в октябре количество света, достигающего талломов, резко уменьшалось (табл. 1). В это же время в водоросли восстанавливался уровень пигментов до показателей, отмеченных в первую половину года, что выражалось в повышении (LSDtest, Р < 0,05) содержания ФБП (рис. 1 А), а затем накоплении (LSD-test, Р < 0,05) Хл а и Кар (рис. 1 Б).

Таблица 2. Значения коэффициента корреляции Спирмена, характеризующего связь между содержанием фотосинтетических пигментов у А. ЛаЬе1Могт1$ и факторами среды в феврале-декабре 2009 г.

Пигмент Температура воды ФАР

ФЭ 0,305 -0,539*

ФЦ -0,112 -0,799***

АФЦ -0,150 -0,373*

Хла -0,308 -0,601"

Кар -0,601"* -0,657*"

Примечание: ФЭ - фикоэритрин, ФЦ - фикоцианин, АФЦ - аллофикоцианин, Хл а - хлорофилл а. Кар - каротиноиды. Достоверные значения влияния факторов среды на содержание пигментов и их соотношение при Р < 0,05 (*), Р < 0.01 (**), Р < 0,001 ("**) отмечены жирным шрифтом.

Таким образом, изменения в содержании пигментов А. ЯаЬеШогтк в течение года во многом регулируются сезонной динамикой светового и температурного режимов в месте обитания водоросли. Наиболее благоприятным временем для сбора водорослей с целью получения максимальных выходов ФБП является период, характеризующийся низкой освещенностью и невысокой температурой воды.

1.2. Полисахаридный состав водоросли А. ЯаЬе/Могпи'з (карпоспорофит) в зависимости от факторов среды ее обитания

Известно, что динамика накопления полисахаридов в тканях водорослей в течение года определяется не только прямым действием факторов внешней среды, но и опосредованным влиянием скорости роста растений на биосинтетические процессы в клетках. Уменьшение содержания сухого вещества (СВ) водоросли может косвенно отражать периоды ее активного роста, сопровождающиеся преобладанием синтеза белка в сравнении с полисахаридами. В связи с этим наряду с содержанием полисахаридов (ПС) было определено содержание СВ водоросли и общего растворимого белка (ОРБ) в зависимости от сезона сбора макрофита, температуры воды и ФАР.

Содержание СВ у А. ЛаЬеШ^гт1з существенно (АЫОУА, р2,з=45,566; Р < 0,05) варьирует в течение года (рис. 2). Максимальное накопление СВ водорослей (28% от сырого веса) зарегистрировано в зимние месяцы (рис. 2), что может быть связано с замедлением скорости роста макрофитов при низких температурах. В весенний и летний периоды отмечено статистически достоверное (ивй-тест, Р < 0,05) снижение этого показателя до минимальных значений (16,8% от сырого веса) в сентябре. В течение года наблюдалась статистически достоверная (Спирмен тест, Р < 0,001) отрицательная корреляция между содержанием СВ водоросли А. АаЬеИНогтя, температурой воды и среднесуточной дозой ФАР (табл. 3).

Рис. 2. Сезонные изменения содержания сухого вещества (СВ), полисахаридов (ПС) и общего растворимого белка (ОРБ) в талломах водоросли А. flabelliformis

Содержание ОРБ в тканях А. flabelliformis также варьирует (ANOVA, F2i3=45,566; Р < 0,05) в течение года (рис. 2), но не зависит от температуры воды и ФАР (Спирмен тест, Р > 0,05) (табл. 3). Уровень ОРБ в талломах водоросли достигает максимальных показателей в июне, а минимальных - в период с сентября по март (рис. 2).

Количество полисахаридов, экстрагируемых при 80°С водой из водоросли, варьировало от 5,9 до 26,7% от сухого веса водорослей и зависело (ANOVA, F2.3=45,566; Р < 0,05) от времени сбора макрофита в течение года (рис. 2). Максимальные выходы

8

ПС у А. АаЬе1Могт13 наблюдались в ноябре-феврале (рис. 2), когда температура воды не превышает 3°С, а освещенность была минимальной (табл. 1). В весенние и летние месяцы уровень ПС у водорослей снижается в 1,5 и 2 раза соответственно (1_50-тест, Р < 0,05), достигая минимальных показателей в сентябре (рис. 2). Согласно статистическому анализу между количеством продуцируемого водорослью ПС, температурой воды и дозой ФАР наблюдалась достоверная (Спирмен тест, Р < 0,001) отрицательная корреляция (табл. 3). Вероятно, при высоких освещенности и температуре воды возрастает скорость роста водоросли, и фотоассимиляты расходуются на производство резервных компонентов клеточной стенки, а не на синтез структурных полисахаридов. Характер сезонных изменений в содержании ПС А. АаЬеШЬгт/'з аналогичен динамике содержания СВ водоросли (рис. 2), тогда как корреляционная взаимосвязь между количеством ОРБ и ПС в течение исследуемого периода отсутствовала.

Таблица 3. Коэффициенты корреляции Спирмена, характеризующие связь сухого вещества, общего растворимого белка, полисахаридов, химического состава полисахаридов с факторами среды обитания водоросли А. 11аЬе1Шогт1з в феврале-декабре 2009 г.

Температура воды ФАР

СВ -0,858*** -0,615***

ПС -0,841*** -0,651***

ОРБ 0,025 0,029

Gal -0,085 -0,260

AnGal 0,379 0,092

Glc -0,516* 0,012

Xyl -0,774*** -0,414

so/ 0,297 0,544**

Примечание: СВ - сухое вещество водоросли, ПС - полисахарид, ОРБ - общий растворимый белок, ФАР -фотосинтетически активная радиация, Gat - галактоза; AnGal - 3,6-ангидрогалактоза; Glc - глюкоза; Xyl - ксилоза. Достоверные значения влияния факторов среды на содержание СБ водоросли, ОРБ, ПС и их химический состав при Р < 0,05 (•), Р < 0,01 (**), Р < 0,001 {"') отмечены жирным шрифтом.

Снижение количества ПС в июле-сентябре до минимальных годовых значений, вероятно, связано с общей потерей биомассы водоросли в условиях совместного неблагоприятного воздействия высоких интенсивностей света и температуры воды (рис. 2, табл. 1), что косвенно подтверждается падением содержания ОРБ и СВ (рис. 2), а также процессами фотоингибирования, наблюдающимися у A. flabelliformis в этот период (рис. 1). Высокое содержание ПС в апреле, несмотря на резкое повышение уровня ФАР, обусловлено тем, что температура воды, которая также влияет на накопление ПС (табл. 3), остается в этот период невысокой (+5,5°С), что в целом благоприятствует биосинтезу ПС, количество которых достоверно не изменяется по сравнению с мартом (рис. 2).

Основными моносахаридами выделенных ПС являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза, количество которых незначительно варьирует в течение года (табл. 4) и не зависит от факторов внешней среды (температура воды, ФАР) (Спирмен тест, Р > 0,05) (табл. 3). В летние месяцы (июнь-июль) в полисахариде повышается содержание 3,6-ангидрогалактозы (табл. 4), что может быть связано с тем, что в этот период в молодых частях растения синтезируются преимущественно желирующие полисахариды.

В полисахариде из A. flabelliformis присутствуют незначительные количества глюкозы и ксилозы, на содержание которых статистически достоверное отрицательное влияние оказывает температура воды (табл. 3, 4).

Согласно статистическому анализу, количество сульфатных групп в ПС прямо пропорционально дозе ФАР в месте обитания водорослей (Спирмен тест, Р < 0,01) (табл. 3), при этом высокое их содержание отмечалось в апреле-мае и июле-августе (табл. 4).

Молярное соотношение галактозы, 3,6-ангидрогалактозы и сульфатных групп позволяет сделать предположение о структурных особенностях синтезируемых полисахаридов (табл. 4). Так, для ПС из A. flabelliformis, собранной в июне, характерна более регулярная структура (AnGal:Gal 1,0:1,4), типичная для желирующих типов каррагинанов, в то время как для полимера из водоросли, собранной в зимние месяцы, этой регулярности не наблюдается (AnGal:Gal 1,0:2,9).

э

Таблица 4. Химический состав полисахаридов, выделенных из высушенной водоросли А. ПаЬе1Шгт'13 (80°С), собранной с февраля по декабрь 2009 г. в Амурском заливе (мыс Красный, Японское море)

Месяц сбора Содержание, % от навески ПС Молярное соотношение AnGal:Gal:S03Na

Gal AnGal Glc xyi SOjNa

февраль 42,2 12,7 4,7 4,3 23,2 1,0:2,9:2,6

март 29,1 12,4 3,5 3,2 25,3 1,0:2,1:2,9

апрель 28,3 13,1 4,0 2,8 26,7 1,0:1,9:2,8

май 30,2 14,0 3,1 3,5 27,0 1,0:1,9:2,7

июнь 27,6 17,4 1,2 1,6 25,6 1,0:1,4:2,1

июль 32,6 15,6 1,6 1,7 26,6 1,0:1,9:2,4

август 32,2 14,8 2,0 1,6 26,1 1,0:1,9:2,5

сентябрь 34,3 11,5 2,1 2,3 21,7 1,0:2,6:2,6

ноябрь 28,1 13,0 1,5 2,8 25,1 1,0:1,9:2,7

декабрь 32,5 14,3 2,0 2,7 24,2 1,0:2,0:2,4

Примечание: Gal - галактоза; AnGal - 3,6-ангидрогалактоза; Glc - глюкоза; Ху1 - ксилоза

Таким образом, наиболее благоприятным временем сбора водоросли А. №Ье////гогт/5, позволяющим получить полисахариды с высоким выходом, является период, характеризующийся низкими температурами воды и ФАР (ноябрь-февраль). В условиях высокой освещенности среды обитания водоросли (апрель, июль-август) в клеточной стенке макрофита синтезируются галактаны с высокой степенью сульфатирования.

2. Комплексное выделение фикобилипротеинов и полисахаридов водоросли А. ПаЬеШогтк

Перспективы широкого использования компонентов клеточной стенки красных водорослей - ФБП и ПС в различных областях промышленности и медицины обуславливают необходимость разработки методов их комплексного извлечения с максимальным выходом продуктов, что позволяет рационально использовать природные ресурсы.

Таблица 5. Содержание ФБП, выделенных из А. АзЬе/Л/огт/'з, собранной в июле 2012 г. (в мг/г сухой массы водоросли)

Пигмент Цистокарлы Стерильное растение

метод 1 метод 2 метод 2

ФЭ 0,78±0,08 1,44 ±0,05* 1,35±0,04*

ФЦ 0,17±0,01 0,27±0,02* 0,11 ±0,02*,**

АФЦ 0,17±0,04 0,21 ±0,02 0,33±0,03*,**

Примечание: * - Р * 0.05 между методами 1 и 2; ** - Р < 0,05 между цистокарпами и стерильными растениями метода 2.

Водоросли A. flabelliformis, собранные в июле 2012 г. в б. Троицы, были разобраны по морфологическим признакам на репродуктивную форму (с цистокарпами) и стерильные растения. Для выделения пигментов использовали два метода: экстракцию 0,1 М фосфатным буфером (рН 6,8) (метод 1) и 1,5% NaN03 (рН 6,5) (метод 2). ФБП из А. flabelliformis с цистокарпами экстрагировали по методу 1 и 2, а ФБП из стерильных растений - по методу 2. Идентификацию пигментов проводили спектральным методом по максимумам поглощения, характерным для ФЭ при 565 нм, ФЦ - 615 нм и АФЦ - 650 нм.

Количество ФБП, экстрагируемых методом 2, выше, чем методом 1 (табл. 5). При этом экстракция водным раствором NaN03 увеличивает выход ФЭ в 2 раза (one-way ANOVA), а ФЦ - в 1,5 раза, по сравнению с фосфатным буфером.

После извлечения пигментов из водоросли выделяли полисахариды, проводя их экстракцию водой при 80°С. В результате такой последовательной экстракции выход ПС был в 1,6 раз больше, чем без предварительного выделения пигментов (табл. 6), что мох<но объяснить дополнительным разрушением клеточной стенки водоросли в процессе первоначальной экстракции пигментов. Содержание ПС у A. flabelliformis с

цистокарпами в 1,5 раза выше, чем у стерильных растений независимо от способа выделения пигментов (табл. 6).

Таблица 6. Выходы и химический состав полисахаридов (ПС), выделенных при 80°С из А. ЛаЬе////огт/з, собранной в июле 2012 г.

Стадия жизни Метод выделения ФБП Выход ПС, % от сухой массы водоросли Содержание, % от навески ПС Молярное соотношение AnGal:Gal:S03Na

га О AnGal о О X го Z о (Л

цист. без экстракции ФБП 31,5±2,7 34,4 13,0 3,7 2,7 22,6 1,0:2,4:2,4

метод 1 51,3±4,3 1 32,8 12,6 2,9 0,9 21,4 1,0:2,3:2,4

метод 2 49,3±1,2' 35,8 13,3 2,7 1,4 24,1 1,0:2,4:2,5

ст. р. метод 2 31,8±1,8 30,3 15,2 1,7 1,5 15,8 1,0:1,8:1,5

Примечание: цист. - цистокарпы, ст. р. - стерильные растения, * - Р < 0,05 между выходами ПС без экстракции ФБП и с экстракцией ФБП; ** - Р < 0,05 между стерильными растениями и цистокарпами после экстракции ФБП.

Таким образом, водоросль A. fíabelliformis, находящаяся на репродуктивной стадии развития (с цистокарпами), продуцирует значительно больше ФБП и ПС, чем стерильные растения.

Сравнительный химический анализ ПС, выделенных из репродуктивной и стерильной форм водоросли A. fíabelliformis, показал, что основными моносахаридами полимера являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза (табл. 6). Содержание галактозы во всех исследуемых образцах ПС было высоким (30-36%) независимо от стадии развития водоросли, в то время как количество 3,6-ангидрогалактозы в ПС из стерильных растений в 1,2 раза выше, а содержание сульфатных групп в 1,5 раза ниже, чем у растений с цистокарпами (табл. 6). Помимо основных моносахаридов в полисахаридах A. fíabelliformis в незначительных количествах присутствовали глюкоза и ксилоза, содержание которых было выше в ПС, выделенном из водоросли без предварительной экстракции ФБП (табл. 6).

Для сравнительного анализа структуры полисахаридов из водорослей с цистокарпами и стерильных растений использовали метод ИК-спектроскопии. Полученные спектры полисахаридов были сопоставлены со спектрами каррагинанов известных структурных типов. В ИК-спектрах обоих ПС интенсивная полоса поглощения в области 1240-1250 см"1 (рис. 3) указывает на присутствие значительного количества сульфатных групп (-S=0 ассиметричная вибрация), а полосы поглощения при 932 см"1 (С-0 вибрация 3,6-ангидрогалактозы) и 849 см"1 (вторичная аксиальная сульфатная группа при С-4 1,3-р-О-галактозы) позволяют предположить, что в структурах обоих ПС присутствуют дисахаридные звенья каппа-типа. Полоса поглощения при 805 см"1 (вторичная аксиальная сульфатная группа при С-2 3,6-ангидро-0-галактозы) в спектре ПС из A. fíabelliformis с цистокарпами (рис. 3 А) указывает на присутствие в структуре этого ПС звеньев йота-каррагинана. В ИК-спектре ПС из стерильных растений присутствует полоса слабой интенсивности при 890 см"1 (С-Н вибрация несульфатированной галактозы) (рис. 3 Б), характерная как для бета-, так и альфа-каррагинанов. Отсутствие в ИК-спектре ПС из стерильной формы A. fíabelliformis (рис. 3 Б) полосы поглощения при 805 см"1, свойственной сульфатной группе при С-2 3,6-ангидрогалактозы альфа-каррагинана, свидетельствует в пользу бета-каррагинана.

Рис. 3. ИК-спектры полисахаридов, выделенных из репродуктивной (с цистокарпами) {А) и стерильной (Б) форм A. fíabelliformis 11

Таким образом, последовательная экстракция из водоросли ФБП и ПС позволяет увеличить выход последнего в 1,6 раз, при этом более эффективно пигменты экстрагируются 1,5% раствором №ЫОз. Содержание ФБП и ПС в репродуктивной водоросли выше, чем в стерильной. Согласно данным ИК-спектроскопии можно предположить, что полисахарид из водоросли с цистокарпами построен в основном из каппа и йота-звеньев каррагинана, а из стерильных растений - из каппа- и бета-каррагинана.

3. Структура полисахарида, выделенного из стерильной формы А. АаЬеШ^гпи'з

Особенности структуры полисахаридов красных водорослей, определяющие физико-химические свойства этих полимеров, а также играющие важную роль в проявлении ими физиологической активности, в значительной степени зависят от стадии жизненного цикла макрофита. В связи с этим, большая часть работы посвящена установлению структуры полисахаридов, выделенных из стерильной и репродуктивной (карпоспорофит) форм А. ИаЬЫШогт^.

3.1. Выделение, фракционирование и химический анализ полисахаридов

Полисахарид, выделенный из стерильной формы А. ИаЬеЧИогтт, разделяли на желирующую (КС1-нерастворимую) и нежелирующую (КС1-растворимую) фракции, выход и состав которых представлен в таблице 7. Молекулярные массы желирующего и нежелирующего полисахаридов, измеренные вискозиметрически, составили 84 и 90 кДа соответственно. Как видно из таблицы 7, стерильная форма анфелтиопсиса накапливает преимущественно желирующий полисахарид, структура которого была изучена в данной работе.

Таблица 7. Выход и химический анализ полисахаридных фракций из стерильной водоросли А. ИаЬеШйзгтк, собранной в б. Троицы в июле 2012 г.

Фракция Выход ПС, % от сухой массы водоросли Содержание Б, % от навески ПС Со держание, % от навески ПС Молярное соотношение АгЮаЮа^ЗОзМа

га! АпСа! ас Ху1 ЭОзМа

I 31,8 8,1 34,9 15,0 2,0 2,1 18,7 1:2,1:1.7

А 25,1 11,9 35,1 21,8 2,1 1,1 21,6 1:1,4:1,4

В 4,1 11.6 33,6 2,3 4,2 5,1 23,4 1:13,0:14,2

Согласно химическому анализу, желирующий ПС наряду с галактозой и 3,6-ангидрогалактозой в незначительных количествах содержит ксилозу (табл. 7), которая может присутствовать либо за счет ксилана, соэкстрагируемого с галактаном, либо в качестве единичных остатков ксилозы, замещающих гидроксильные группы галактана. Наличие глюкозы в исследуемых образцах может быть обусловлено присутствием в клеточной стенке водоросли флоридного крахмала.

Для идентификации и отнесения желирующего ПС к группе каррагинана или агара проводили его частичный восстановительный гидролиз, и полученный гидролизат анализировали с помощью ГЖХ. Как показали результаты, ПС из А. АаЬе1Шогт1$ включает в себя только дисахаридные звенья 4-0-р-0-галактопиранозил-3,6-ангидро-0-галактозы (каррабиозы), что позволяет его отнести к каррагинану. Молярное соотношение АпОа1:Са1 указывает на нерегулярную структуру этого ПС (табл. 7).

3.2. Структурный анализ желирующего полисахарида

Для установления структуры полисахарида и отнесения его к определенному типу каррагинанов использовали методы ИК-Фурье и ЯМР спектроскопии, сопоставляя полученные спектры со спектрами известных структур каррагинанов. ИК-спектр ПС аналогичен спектру суммарной фракции ПС из стерильной формы А. ПаЬе1Шогт'13 (рис. 3 Б), согласно которому полисахарид представляет собой каппа/бета-каррагинан.

В спектре ,3С ЯМР полисахарида в области резонанса аномерных атомов углерода наблюдается четыре сигнала разной интенсивности, характерные для С-1 1,4-связанной 3,6-ангидро-а-галактозы (95,2 и 95,6 м.д) и С-1 1,3-связанной З-Р-галактозы (103,3 и 103,2 м.д) бета- и каппа-каррагинанов соответственно (рис. 4 Б). В области резонанса аномерных протонов спектра 1Н ЯМР также присутствуют четыре сигнала

различной интенсивности. Сигналы при 4,61 и 4,64 м.д. характерны для Н-1 галактозы, а сигналы при 5,10 и 5,12 м.д. - для Н-1 3,6-ангидрогалактозы бета- и каппа-каррагинанов соответственно (рис. 4 А). Интегральные интенсивности сигналов при 5,12, 5,10 и 4,87 м.д. имеют соотношение 3:1:3. Сигналы слабой интегральной интенсивности в спектре 1Н ЯМР при 5,32 и 5,20 м.д. могут быть отнесены к аномерным протонам 3,6-ангидро-а-галактозы 2-сульфат йота-каррагинана и а-галактозы 6-сульфат гамма-каррагинана соответственно. ОЕРТ-135 эксперимент показал наличие двух оксиметиленовых групп при 62,0 и 70,1 м.д., последняя из которых замещена, как видно из значения величины ее химического сдвига.

Г I

Рис. 4. Спектры 1Н (А) и "С (Б) ЯМР желирующего полисахарида, выделенного из стерильной формы водоросли A. fíabelliformis

Анализ двумерных спектров 1Н-1Н COSY (рис. 5 А), 1Н-1Н ROESY и 1Н-13С HSQC (рис. 5 Б) позволил провести отнесение сигналов протонов моносахаридных остатков, С/Н корреляцию и определить порядок и последовательность гликозидных связей между моносахаридными остатками. В области резонанса аномерных атомов спектра 1Н- С HSQC присутствуют кросс-пики Н-1/С-1 при 5,10/95,2, 5,12/95,6, 4,64/103,2 и 4,61/103,3 м.д., соответствующие четырем типам остатков галактозы (рис. 5 Б). Анализ спектров показал, что в структуре ПС присутствуют два типа дисахаридных звеньев, которые отличаются друг от друга только наличием или отсутствием сульфатной группы при С-4 1,3-связанной р-галактозы, на что указывают кросс-пики при 4,87/74,3 и 4,14/66,7 м.д., соответствующие Н-4/С-4 сульфатированной и несульфатированной 1,3-связанной р-галактозы. На наличие сульфатной группы при С-4 1,3-связанной р-галактозы указывает то, что сигнал в спектре С ЯМР сдвинут на 7,6 м.д. в область слабого поля по сравнению с сигналом С-4 несульфатированной 1,3-связанной р-галактозы. Эффект гликозилирования галактопиранозного остатка по С-3 свидетельствует о том, что моносахаридные остатки в составе обоих дисахаридных звеньев имеют D-конфигурацию, что хорошо согласуется с результатами частичного восстановительного гидролиза.

Рис. 5. Спектры 'Н-'Н COSY (А) и 13С-1Н HSQC (Б) желирующего полисахарида из A. fíabelliformis

13

Согласно данным спектра 1Н-1Н ROESY (не приведен), кросс-пики между сигналами Н-1 DA и Н-3, Н-4 G4S (5,12/3,99 и 5,12/4,87 соответственно) и Н-1 DA' и Н-3, Н-4 G (5,10/3,86 и 5,10/4,14 соответственно), а также Н-1 G4S и Н-4,5 DA (4,64/4,62 и 4,64/4,66 соответственно) и Н-1 G и Н-4,5 DA' (4,61/4,62 и 4,61/4,66 соответственно) указывают на то, что в обоих типах дисахаридных звеньев остатки галактозы и 3,6-ангидрогалактозы соединены чередующимися (В-(1—>4) и а-(1—>3)-связями.

Таким образом, исследуемый желирующий ПС из стерильной формы водоросли A. flabelliformis представляет собой каппа/бета-каррагинан с соотношением звеньев каппа- и бета-типа 3:1 и содержит минорные количества йота- и гамма-каррагинанов.

Для изучения особенностей строения полисахарида, включая информацию о минорных компонентах, исходный полисахарид был деполимеризован мягким кислотным гидролизом (0,1 N HCI, 37°С, 2 и 24 ч). Продукты гидролиза анализировали методом МАЛДИ масс-спектрометрии (МС). Уже за 2 ч гидролиза масс-спектр МАЛДИ в режиме регистрации анионов показал наличие как коротких, так и протяженных сульфатированных олигосахаридов, а в режиме регистрации катионов были обнаружены также и несульфатированные олигосахариды. Наличие несульфатированных фрагментов (бета-звеньев) на ранней стадии гидролиза свидетельствует о том, что ПС содержит довольно большое количество таких фрагментов, скорость отщепления которых по сравнению с каппа-блоками выше.

Состав и строение ключевых фрагментов продуктов гидролиза ПС за 2 и 24 ч были охарактеризованы с помощью тандемного МАПДИ МС (техника «potential LIFT») (табл. 8). Согласно полуколичественной оценке МАЛДИ МС, основными компонентами смеси является дисахаридное звено каппа-каррагинана (табл. 8, № 1) и «гибридный» тетрасахарид, содержащий фрагменты как каппа-, так и бета-звеньев (табл. 8, № 5), наличие которых в цепи полисахарида согласуется с данными спектроскопии 13С ЯМР (рис. 4 Б).

Таблица 8. Структурные характеристики ключевых фрагментов, обнаруженных методом МАЛДИ МС в смеси олигосахаридов, полученной кислотным гидролизом желирующего полисахарида из A. flabelliformis за 2 и 24 ч

№ Режим регистрации анионов № Режим регистрации катионов

m/z состав/структурные характеристики иона [М - Na]" m/z состав/структурные характеристики иона [М + Na]*

1 403,04 [DA-G4S]" [G4S-DA]" 13 347,09 [G-DA + Na]* [DA-G + Na]*

2 565,12 [DA-G-D6S]" [D6S-G-DA]' [G-G4S-DA]" 14 491,14 [DA-G-DA + Na]*

3 649,03 [DA-G4S-DA2S]" [DA2S-G4S-DA]' только за 2 ч гидролиза 15 509,14 [G-DA-G + Na]* [DA-G-D + Na]*

4 667,04 [DA-G4S-D6S]' [D6S-G4S-DA]" 16 611,09 [D-DA-G4S + Na]* [G4S-DA-D + Na]* DA-G4S-D + Na]*

5 709,16 [G4S-DA-G-DA]" [G-DA-G4S-DA]" [DA-G4S-DA-G]' 17 653,18 [G-DA-G-DA + Na]* [DA-G-DA-G + Na]*

6 811,09 [(DA-G4S)2r [(G4S-DA)2r [G-DA-G4S-DA2S]" [G4S-DA2S-G-DA]" 18 671,17 [DA-G-D-G + Na]* [G-D-G-DA + Na]*

7 829,11 [G-DA-G4S-D6S]" JG-D6S-G4S-DA]" 19 899,16 [(AnGal)3Gal2(S03Na) + Na]*

8 871,21 [(AnGal)2Gal3(S03Na)]" 20 917,18 [(AnGal)2Gal3(S03Na) + Na]*

9 955,14 |(AnGal)3Gal2(S03Na)2]" 21 1061,23 [(AnGal)3Gal3(S03Na) + Na]*

10 1015,27 [(AnGal)3Galj(S03Na)2]" 22 1163,18 ((AnGal)3Gal3(S03Na)2 + Na]*

11 1117,22 [(AnGal)3Gal3(S03Na)2]" 23 1265,43 [(AnGal)3Gal3(S03Na)3+ Na]*

12 1219,18 [<AnGal)3Gal3(S03Na)3]"

Примечание: М представляет собой натриевую соль моно/олигосахарида в случае, если он сульфатирован

Тандемный МАЛДИ масс-спектр аниона с т/г 667,04 (рис. 6 А) содержит сигнал, соответствующий фрагментному иону а2А3 с m/z 607,00, который образуется в результате разрыва гексапиранозного кольца 6-сульфатированной галактозы (D6S) на восстанавливающем конце. Это может указывать на присутствие в полимерной цепи гамма-звеньев (предшественник бета-каррагинана), что согласуется с данными спектроскопии 1Н ЯМР (табл. 8, № 5, рис. 4 Л).

В тандемном МАЛДИ масс-спектре аниона с m/z 811,09 (рис. 6 Б) присутствует сигнал, соответствующий фрагментному иону У'г с m/z 505,00, образующемуся в результате разрыва а-(1—>3) гликозидной связи и отщепления фрагмента йота-звена. Олигосахарид, совпадающий по соотношению m/z с фрагментами, построенными из каппа-блоков, в данном случае может состоять из фрагментов, содержащих включения остатков бета- и йота-звеньев (табл. 8, № 6).

Рис. 6. Тандемные масс-спектры МАЛДИ анионов с m/z 667,04 (А) и m/z 811,09 (Б)

В масс-спектре олигосахаридов (гидролиз 0,1 N HCl, 24 ч), полученном с помощью масс-спектрометра с электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов (ИЭР МС/МС), наблюдаются сигналы, соответствующие ионам [Xyl+Na]* с m/z 173,053 и [XylHex+Na]* с m/z 335,113. Анализ тандемного масс-спектра иона с m/z 335,113 позволяет предположить, что данный дисахарид построен из остатков ксилозы и гексозы (вероятнее, галактозы), находящейся на восстанавливающем конце. Факт присутствия ß-D-ксилозы в качестве заместителя гидроксильной группы при С-4 или С-6 1,3-связанной ß-D-галактозы или при С-3 1,4-связанной a-D-галактозы был установлен ранее для полисахаридов из водорослей семейств СогаШпасеае и Solieriaceae.

Таким образом, согласно данным МАЛДИ основными звеньями, входящими в полимерную цепь полисахарида, являются каппа-каррабиоза, каппа-карратетраоза, каппа-каррагексаоза, бета-каррабиоза, бета-карратетраоза, тетра- и гекса-олигосахариды с различной последовательностью чередования каппа- и бета-звеньев и минорные количества йота- и гамма-каррагинана. Согласно данным ИЭР МС/МС, ксилоза, определенная химическим анализом (табл. 7), присутствует в полисахариде в качестве заместителя одной из гидроксильных групп галактозы.

4. Свойства и структура полисахарида, выделенного из репродуктивной (карпоспорофит) формы А. flabelliformis

Водоросли А. flabelliformis, представленные карпоспорофитами, были собраны в апреле 2009 г. у м. Красный (Амурский залив, Японское море). Экстракцию полисахаридов проводили водой при 80°С. Для фракционирования выделенных полисахаридов использовали 4% раствор KCl, который позволил получить желирующий каррагинан из стерильной формы А. flabelliformis. Однако в случае карпоспорофита анфелтиопсиса использование этой соли не приводило к разделению полисахаридов на желирующую и нежелирующую фракции. Согласно химическому анализу, основными моносахаридами, входящими в состав суммарного полисахарида, являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза (табл. 9).

А

Б

Таблица Э. Выход и химический анализ полисахаридных фракций из карпоспорофита А. ПаЬе1Могт15, собранного у м. Красный (Амурский залив) в апреле 2009 г.

Фракция Выход ПС, % от сухой массы водоросли Содержание Б, % от навески ПС Сод ержание, % от навески ПС Молярное соотношение AnGal:Gal:S03Na

О AnGal о О X го 2 О И

Z 22,8 10,5 28,3 13,1 4,0 2,8 26,7 1:1,9:2,8

А 18,8 7,2 31,6 15,6 н/о 3,1 32,6 1:1,8:2,9

В 3,0 - 22,1 1,7 8,1 8,4 14,9 1:11,6:12,3

Исследуемый ПС содержит незначительные количества глюкозы и ксилозы, которые могут быть структурными единицами флоридного крахмала и ксилана соответственно. С целью их возможного отделения от основного галактана была использована ионообменная хроматография на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой. Элюцию вещества проводили ступенчатым градиентом концентраций - 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 2,0 и 4,0 М №С1 в воде.

В результате хроматографии ПС было получено шесть фракций с наибольшим выходом фракций А12 и АТ6 (табл. 10). Согласно химическому анализу, все полученные фракции ПС представляют собой галактаны различной степени сульфатирования, которые содержат также глюкозу, ксилозу и белок. С возрастанием концентрации 1МаС1 во фракциях полисахаридов снижается содержание глюкозы, галактозы и белка и увеличивается количество ксилозы. Таким образом, в процессе ионообменной хроматографии не происходит отделения ксилозы и белка от галактана.

Таблица 10. Выход и химический анализ полисахаридов А. АаЬе///Лзгтй после ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе

Фракция Элюент [NaCI], M Выход, % Белок*, % от навески ПС Содержание, % от навески ПС

Gal | AnGal Glc Xyl SOjIMa

Af 1 0,25 17,2 11,5 34,3 | н/о 5,6 11,5 2,8

Af2 0,5 23,5 10,5 23,4 н/о 3,6 8,1 10,0

Af5 2,0 12,0 5,4 25,1 12,6 2,2 16,6 20,6

AfS 4,0 20,1 4,0 18,2 10,5 2,8 20,3 19,2

Примечание: " - содержание белка определяли по методу Лоури

Согласно литературным данным, белок может быть ковалентно связан с полисахаридом, что, вероятно, в нашем случае делает невозможным его отделение хроматографическим методом. В связи с этим, для очистки полисахарида от белка была проведена последовательная обработка исследуемого галактана протеазой из Streptomyces caespitosus и обработка по методу Севага. В результате ферментативной обработки содержание белка снизилось в 1,5 раза. Последующая обработка ПС по методу Севага позволила уменьшить количество белка в 2 раза по сравнению с исходным образцом.

Согласно аминокислотному анализу, белок в ПС характеризуется повышенным содержанием кислых аминокислот - аспарагиновой и глутаминовой (11,2 и 7,5% соответственно), фосфосерина (6,3%), а также нейтральной аминокислоты - глицина (11,5%). Минорными аминокислотами являются гистидин (0,9%), 1-метилгистидин (1,0%) и орнитин (0,7%). Содержание остальных аминокислот варьирует в пределах 2-5%. Данный белок содержит значительное количество незаменимых аминокислот: Val (5,1%), Leu (4,0%), Phe (3,6%) и Lys (4,6%), что может быть полезно при возможном использовании исследуемого ПС в качестве биологически активной добавки.

Известно, что пролин, гистидин, серин, треонин и аспарагиновая кислота могут участвовать в образовании пептид-О-гликозидной связи. В нашем случае аспарагиновая кислота является одной из основных аминокислот белка, количества серина и фосфосерина составляют 5,3 и 6,3% соответственно, что позволяет предположить, что белок ковалентно связан с исследуемым ПС посредством этих аминокислотных остатков.

Для получения предварительных данных о структуре ПС из карпоспорофита А. flabelliformis был использован метод ИК-спектроскопии. В ИК-спектре исследуемого ПС интенсивная полоса поглощения в области 1240-1250 см"1 (рис. 7) указывает на наличие значительного количества сульфатных групп. В этом спектре присутствуют полосы поглощения при 932 см'1 (С-0 вибрация 3,6-ангидрогалактозы) и 847 см (вторичная аксиальная сульфатная группа при С-4 1,3-р-0-галактозы), которые позволяют отнести полисахарид к каппа-каррагинану. Полоса поглощения при 805 см"1 (вторичная аксиальная сульфатная группа при С-2 1,4-связанной 3,6-ангидро-а-0-галактозы) (рис. 7) может указывать на наличие в структуре ПС дисахаридных звеньев йота-типа. Кроме того, в ИК-спектре сульфатированного галактана наблюдается небольшое плечо при 890 см"1 (С-Н вибрация несульфатированной галактозы), характерное для бета- и альфа-каррагинанов.

Рис.7. ИК-спектр суммарной фракции полисахарида, выделенного из карпоспорофита А.

ПаЬеИ№огт&

Таким образом, согласно данным ИК-спектроскопии, выделенный полисахарид содержит дисахаридные звенья как каппа-, так и йота-типов каррагинана.

Известно, что йота-каррагинан, в отличие от каппа-каррагинана, проявляет высокую специфичность к ионам Са2*, образуя с солями кальция гели. В связи с этим, исследуемый полисахарид, содержащий дисахаридные звенья йота-каррагинана, был фракционирован с помощью СаС1г на желирующие и нежелирующие фракции. Как и в случае со стерильной формой водоросли, количество нежелирующей фракции ПС из карпоспорофита А. АаЬеШ/оггт'в составило только 3%. Молекулярная масса желирующего ПС, по данным вискозиметрии, составляет 250 кДа. Согласно химическому анализу, основными моносахаридами этого ПС являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза, а ксилоза присутствует в незначительных количествах (табл. 9). Нежелирующий ПС из А. АаЬе1Могт1$, в отличие от желирующего ПС, характеризуется высоким содержанием глюкозы и ксилозы.

4.1. Структурный анализ желирующего полисахарида

Для идентификации желирующего ПС из карпоспорофита А. ИаЬеШ1огт\5 и отнесения его к определенному типу каррагинанов использовали методы ИК-Фурье и ЯМР спектроскопии. Полученные спектры были сопоставлены со спектрами известных структур каррагинанов. ИК-спектр желирующего ПС аналогичен спектру суммарной фракции ПС (рис. 7), согласно которому исследуемый ПС представляет собой в основном йота/каппа-каррагинан и содержит остатки несульфатированной галактозы.

Анализ спектров ЯМР исследуемого полисахарида подтверждает данные ИК-спектроскопии (рис. 8). В спектре 13С ЯМР полисахарида в области резонанса аномерных атомов углерода наблюдаются шесть сигналов разной интенсивности, характерных для С-1 1,4-связанной 3,6-ангидро-а-О-галактозы (92,9, 96,2 и 95,9 м.д.) и С-1 1,3-связанной р-й-галактозы (102,9, 103,1 и 103,2 м.д.) йота-, каппа- и бета-каррагинанов соответственно (рис. 8 Б). Спектр 13С ЯМР в области относительно сильного поля имеет типичный для йота-, каппа- и бета-типов полисахарида вид. йЕРТ-135 эксперимент показал наличие двух оксиметиленовых групп при 62,0 и 70,1 м.д., последняя из которых замещена, как видно из значения величины ее химического сдвига.

-I-1-1—I-1-1-1-Г—!-1-1-1—I-1—г—1-1-r-1—i—i—i—

100 90 SO 70 «o «t

£

Рис. 8. Спектры 1H (Л) и "С (Б) ЯМР желирующего полисахарида, выделенного из карпоспорофита A. flabelliformis

В области резонанса аномерных протонов спектра 1Н ЯМР присутствуют пять сигналов различной интенсивности (рис. 8 А). Сигнал с 5 5,3 м.д. относится к Н-1 1,4-связанной 3,6-ангидро-а-галактозы 2-сульфат йота-каррагинана, а сигналы с 5 5,09 и 5,07 м.д. - к Н-1 1,4-связанной 3,6-ангидро-а-галактозы каппа- и бета-каррагинана соответственно. Сигнал при 4,61 м.д. характерен для Н-1 1,3-связанной (¡-D-галактозы бета-каррагинана, а сигнал при 4,64 м.д. - для Н-1 1,3-связанной p-D-галактозы 4-сульфат, входящей в состав как каппа-, так и йота-каррагинана. Сигнал слабой интегральной интенсивности при 5,5 м.д. (рис. 8 А) может быть отнесен к аномерному протону а-галактозы 2,6-дисульфат ню-каррагинана (предшественник йота-каррагинана). Согласно данным спектроскопии ЯМР, соотношение йота- и каппа-звеньев в полимерной цепи составляет 1:0,5.

Таким образом, из данных химического анализа, ИК- и ЯМР спектроскопии следует, что исследуемый желирующий полисахарид из карпоспорофита A. flabelliformis представляет собой йота/каппа-каррагинан с соотношением звеньев йота- и каппа-типа 1:0,5, а также содержит звенья бета-каррагинана и минорные количества ню-каррагинана.

Для установления особенностей структуры ПС из карпоспорофита A. flabelliformis был проведен тщательный анализ суммарного ПС, в составе которого обнаружены ксилоза и глюкоза. В результате мягкого кислотного гидролиза ПС (0,1 N HCI, 37°С, 50 ч), протекающего без разрушения 3,6-ангидрогалактозы, и последующего фракционирования продуктов гидролиза на колонке с Р-10 были получены две фракции олигосахаридов с выходом 24,0 и 39,8% соответственно (рис. 9, табл. 11). Молекулярная масса фракции II, измеренная по методу, основанному на реакции восстанавливающих Сахаров с ферроцианидом, составила 5,3 кДа (табл. 11).

Таблица 11. Характеристика фракций олигосахаридов, полученных гель-хроматографией на биогеле Р-10 смеси продуктов кислотного гидролиза (0,1 N HCI, 37°С, 50 ч) полисахарида из А. flabelliformis

Образец Выход, % от навески ПС Белок, % М, кДа Содержание. % от навески ПС

Gal AnGal Glc Xyl S03Na

фракция 1 24,0 10,8 - 37,2 1,0 10,9 12,3 9,2

фракция II 39,8 3,0 5,3 31,9 17,8 1,5 0,2 26,3

Рис. 9. Гель-хроматография на колонке с биогелем Р-10 смеси продуктов кислотного гидролиза (0,1 N HCI, 37°С, 50 ч) полисахарида из A. flabelliformis

Согласно результатам химического анализа, основными моносахаридами фракции II являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза, тогда как фракция I содержит очень мало 3,6-ангидрогалактозы и значительное количество глюкозы, ксилозы и белка (табл. 11). Спектр 13С ЯМР фракции II идентичен спектру желирующего ПС из карпоспорофита А ЛОДеШэ/777(5 (рис. 8 Б), который представляет собой йота/каппа-каррагинан и содержит звенья бета-каррагинана. ,

Фракция ! характеризуется высоким содержанием ксилозы (табл. 11), поэтому анализ структуры этой фракции может дать информацию о местоположении ксилозы в исследуемом полисахариде. В связи с этим было проведено метилирование фракции I. Основными компонентами фракции I, по данным метилирования, являются 2,4-ди-О-метилгалактоза, 4-О-метилгалактоза и 2,3,6-три-О-метилгалактоза в соотношении 1:1,6:2,4, две из которых соответствуют 1,3-связанной галактозе, замещенной при С-6 и при С-2 и С-6 соответственно, а третья - незамещенной 1,4-связанной галактозе. Помимо этого, во фракции I присутствуют 1,4-ди-О-метилгалактоза и 2,3,4-три-О-метилгалактоза, первую из которых можно отнести к 1,3-связанной галактозе, расположенной на восстанавливающем конце и замещенной при С-2 и С-6, а вторую - к галактозе на невосстанавливающем конце, замещенной при С-6. Таким образом, можно предположить, что основная углеводная цепь фракции I построена из остатков галактозы, соединенных чередующимися (3-(1—>4) и а-(1—<3)-гликозидными связями, в которой 1,3-связанная галактоза в большинстве своем имеет заместители при С-6.

Согласно химическому анализу, фракция I содержит 12,3% ксилозы (табл. 11), которая может присутствовать в качестве единичных остатков ксилозы, замещающих гидроксильные группы галактана при С4 или С6 1,3-0-Р-галактозы или при СЗ 1,4-а-0-галактозы. По данным метилирования, в состав фракции I входит 2,3,5-три-О-метилксилоза. Данный моносахаридный остаток указывает на то, что ксилоза находится на невосстанавливающем конце, поэтому, скорее всего, она является заместителем одной из гидроксильных групп галактана. Это подтверждается данными МАЛДИ, полученными для желирующего полисахарида из стерильной формы А. АаЬеНИогтя, приведенными выше. Тот факт, что ксилоза присутствует в качестве заместителя гидроксильной группы галактана, объясняет невозможность отделения этого моносахарида при ионообменной хроматографии полисахарида (табл. 10). Надо отметить, что остатки ксилозы в галактанах встречаются исключительно в пиранозной форме, о чем, согласно литературным данным, свидетельствует наличие в продуктах метилирования 2,3,4-три-О-метилксилозы. Однако в нашем случае присутствие в продуктах метилирования 2,3,5-три-О-метилксилозы позволяет предположить, что этот моносахарид имеет фуранозную форму.

В состав фракции I в небольших количествах входит и глюкоза. 2,3-ди-О-метилглюкоза и 2,3,6-три-О-метилглюкоза соответствуют 1,4-связанной глюкозе, первая из которых замещена при С-6. 2,3,4,6-тетра-О-метилглюкоза указывает на присутствие невосстанавливающего сахарного остатка, который может относиться либо к терминальной глюкозе а-(1—>4)-глюкана (флоридного крахмала), либо к моносахариду, отвечающему за точку ветвления основной цепи глюкана при С-6. Полученные результаты позволяют предположить, что суммарный ПС содержит в незначительных количествах а-(1—>4)-0-глюкан, который может быть ассоциирован с галактаном, имеющим сложную макромолекулярную организацию.

4.2. Масс-спектрометрический анализ продуктов ферментативного гидролиза полисахарида из А. ПаЬеШ^гт1в

При анализе гибридных структур каррагинанов широко используют специфические ферменты - каррагиназы. Как показали анализы, представленные выше, исследуемый ПС состоит из звеньев каппа-, бета- и йота-каррагинанов, с преобладанием последних. В связи с этим ферментативный гидролиз проводили с помощью рекомбинантной йота-каррагиназы из МюгоЬиШег 1Ьегто1о1егап$, любезно предоставленной французскими

коллегами. В качестве стандарта использовали коммерческий йота-каррагинан из Eucheuma spinosum («Sigma»). Полученную смесь продуктов гидролиза разделяли методом ВЭЖХ (рис. 10). В результате ферментативного гидролиза ПС наряду с низкомолекулярными продуктами (смесь олигосахаридов), была получена высокомолекулярная фракция ПС, обозначенная как резистентная фракция (РФ), с выходом 19% (рис. 10, табл. 12). Сравнительный анализ продуктов ферментативного гидролиза исследуемого полисахарида и стандартного образца йота-каррагинана на ВЭЖХ свидетельствует о присутствии в полимерной цепи полисахарида из А. flabelliformis звеньев йота-карратетраозы (27%), йота-каррабиозы (6%), а также гибридных тетра- (9%) и гексасахаридов (39%), содержащих каппа- и йота-звенья (рис. 10, табл. 12).

Рис. 10. Высокоэффективная жидкостная хроматография смеси олигосахаридов, полученных в результате ферментативного гидролиза полисахарида из А, flabelliformis

Для анализа смеси олигосахаридов, полученной в ходе ферментативного гидролиза каррагинана, и уточнения характера расположения дисахаридных звеньев был использован метод масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ИЭР MC). Состав и структура олигосахаридов представлена в таблице 12. Последовательность моносахаридных звеньев установлена методом тандемной (режим МС/МС) масс-спектрометрии ИЭР. Согласно полученным данным, согласующимся с результатами ВЭЖХ, основными компонентами исследуемого ПС являются гибридные гексаолигосахариды с различной последовательностью чередования каппа- и йота-звеньев и тетрасахарид йота-каррагинана, а также йота-каррабиоза и гибридные тетрасахариды каппа/йота-каррагинана (рис. 10, табл. 12).

Таблица 12. Состав и структура олигосахаридов, образующихся в результате ферментативного гидролиза полисахарида из карпоспорофита А. flabelliformis

m/z Состав и структура олигосахаридов Выход, %

- РФ 19

266,20 DA-G4S-DA2S-G4S-DA2S-G4S DA2S-G4S-DA2S-G4S-DA-G4S DA2S-G4S-DA-G4S-DA2S-G4S 39

236,49 DA2S-G4S-DA2S-G4S 27

289,01 DA-G4S-DA2S-G4S DA2S-G4S-DA-G4S 9

241,01 DA2S-G4S 6

В тандемном масс-спектре йота-каррабиозы характерно наличие сигнала, соответствующего иону Y, с m/z 259,01, образующегося в результате разрыва а-(1->3) связи и отщепления остатка G4S с восстанавливающего конца.

В тандемном ИЭР МС/МС гибридного трижды сульфатированного тетрасахарида присутствуют сигналы высокой интенсивности, соответствующие фрагментным ионам Сз с m/z 313,03 и В3 с m/z 304,02, которые образуются при разрыве гликозидных связей

олигосахаридов с каппа-звеном на восстанавливающем конце. Анализ масс-спектра показывает, что в полимерной цепи присутствует два возможных варианта (изомера) данного тетрасахарида DA2S-G4S-DA-G4S и DA-G4S-DA2S-G4S. Фрагментные ионы В, и В'2с m/z 222,99 и 232,00 соответственно указывают на наличие структуры DA-G4S-DA2S-G4S. Учитывая особенности действия фермента йота-каррагиназы, можно предположить, что данные фрагменты находятся на восстанавливающем и невосстанавливающем концах исходного полимера, т.е. являются терминальными.

Анализ тандемного масс-спектра гибридного гексасахарида показывает, что в полимерной цепи присутствует три возможных варианта (изомера) данного гексасахарида: DA2S-G4S-DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S-DA2S-G4S, DA2S-G4S-DA-G4S-DA2S-G4S, из которых первые два являются терминальными фрагментами молекул полисахарида, а третий - внутренним.

Таким образом, согласно данным ферментативного гидролиза и ИЭР МС/МС, основными компонентами, входящими в состав полимерной цепи полисахарида из А. flabelliformis, являются йота-карратетраоза, йота-каррабиоза, а также гибридные тетра-(DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S) и гексасахариды (DA2S-G4S-DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S-DA2S-G4S, DA2S-G4S-DA-G4S-DA2S-G4S), содержащие йота-и каппа-звенья.

5. Биологическая активность полисахаридов А. АаЬеШТогт1з

Известно, что сульфатированные полисахариды способны взаимодействовать с кофакторами каскада коагуляции в процессе ингибирования свертывания крови. В связи с этим, было изучено антикоагулирующее действие полисахаридов из стерильной формы А. АаЬеН^огтя (суммарного, каппа/бета и нежелирующего) по их способности подавлять процесс коагуляции по протромбиновому времени (ПТВ) (внешний путь коагуляции) и активированному частичному тромбопластиновому времени (АЧТВ) (внутренний путь коагуляции).

Согласно анализу ПТВ, ни один из исследуемых полисахаридов не влияет на внешний путь коагуляции (рис. 11). В то же время анализ АЧТВ свидетельствует о антикоагулирующей активности полисахаридов. Так, суммарный ПС и каппа/бета, каррагинан увеличивают время коагуляции на 25 и 50% соответственно, а нежелирующий - на 67% (рис. 11). Более сильное действие нежелирующих полисахаридов на внутренний путь коагуляции может быть обусловлено их большей степенью сульфатирования.

РВ5 гепарин суммир. желпр. нежслир.

Рис. 11. Изменение времени коагуляции в присутствии полисахаридов из стерильной формы A. flabelliformis (С = 10 мкг х мл"1, конечное значение). Результаты выражены как % изменения тромбинового времени относительно отрицательного контроля PBS (100%). * - достоверные отличия при Р < 0,05 (ANOVA)

Рис. 12. Влияние желирующих полисахаридов из стерильной и репродуктивной (карпоспорофит) форм А. ПаЬе/Могпи'з на образование АФК.

Результаты выражены как % изменения содержания АФК относительно отрицательного контроля

PHS ЛИС ИшВ Kaimuföent mitÄniis

О 25 мы/мл

и Я) MKrfMH □ ICK) мм/мл

Таким образом, результаты АЧТВ и ПТВ анализа показывают, что каррагинаны воздействуют главным образом на внутренний путь коагуляции, тогда как их влияние на внешний путь коагуляции отсутствует.

Известно, что полисахариды способны к многоточечному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных клеток, оказывая на иммунную систему как стимулирующее, так и супрессивное действие. Одним из показателей взаимодействия

веществ с иммунокомпетентными клетками является их способность стимулировать формирование активных форм кислорода (АФК). Была изучена способность каппа/бета-и йота/каппа-каррагинанов из А. flabelliformis индуцировать образование АФК иммунокомпетентными клетками. В качестве положительного контроля использовали липополисахарид (ЛПС) из Escherichia coli.

Согласно результатам анализа, ЛПС индуцировал в 2 раза больше образование АФК, чем отрицательный контроль PBS (рис. 12). Исследуемые каппа/бета- и йота/каппа-каррагинаны проявляли меньшую по сравнению с ЛПС способность стимулировать образование АФК (рис. 12). Эти полисахариды активизируют выработку АФК в среднем на 50% по сравнению с отрицательным контролем независимо от концентрации каррагинана (рис. 12). В то же время йота/каппа-каррагинан при высокой концентрации (100 мкг/мл) не показывает активности.

Таким образом, исследованные каппа/бета- и йота/каппа-каррагинаны способны взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками крови человека, проявляя способность индуцировать образование АФК.

Выводы

1. Установлено влияние фотосинтетически активной радиации и температуры воды среды обитания водоросли А. flabelliformis на ее пигментный и полисахаридный состав. Показано, что низкий уровень ФАР способствует наибольшему накоплению ФБП и полисахаридов в водоросли.

2. Показано, что благоприятным временем сбора водоросли А. flabelliformis для получения сульфатированных полисахаридов с высоким выходом является период, характеризующийся низкими температурами воды и ФАР (ноябрь-февраль). В условиях высокой интенсивности ФАР среды обитания водоросли (апрель, август-сентябрь) в клеточной стенке макрофита синтезируются галактаны с высокой степенью сульфатирования.

3. Подобраны оптимальные условия для комплексного выделения из А. flabelliformis ФБП и полисахаридов. Показано, что более эффективно пигменты экстрагируются из макрофита водным 1,5% раствором NaN03. При последовательной экстракции ФБП, а затем полисахарида, выход последнего увеличивается в 1,6 раза.

4. Проведен сравнительный качественный и количественный анализ полисахаридов, выделенных из стерильной и репродуктивной форм А. flabelliformis. Показано, что репродуктивная форма водоросли продуцирует в 1,5 раза больше полисахарида, чем стерильная. Установлено, что независимо от стадии развития в водоросли А. flabelliformis синтезируются в основном желирующие типы полисахаридов, отнесенные к каррагинанам.

5. Установлено, что желирующий полисахарид из стерильной формы А. flabelliformis имеет гибридную каппа/бета структуру с соотношение каппа- и бета-звеньев 3:1. Показано, что полимерная цепь этого полисахарида построена из каппа-каррабиозы, каппа-карратетраозы, каппа-каррагексаозы, бета-каррабиозы, бета-карратетраозы, тетра- и гекса-олигосахаридов с различной последовательностью чередования каппа- и бета-звеньев.

6. Установлено, что желирующий полисахарид из карпоспорофита А. flabelliformis представляет собой йота/каппа-каррагинан с преобладанием звеньев йота-типа, содержит звенья бета-каррагинана и минорные количества ню-каррагинана.

7. Показано, что основными звеньями йота/каппа-каррагинана являются йота-каррабиоза, йота-карратетраоза, а также гибридные тетра- (DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S) и гексасахариды (DA2S-G4S-DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S-DA2S-G4S, DA2S-G4S-DA-G4S-DA2S-G4S) с различной последовательностью йота- и каппа-звеньев.

8. Показано, что в каррагинанах из A. flabelliformis заместителем одной из гидроксильных групп галактозы является ксилоза в фуранозной форме, которая, вероятно, занимает положение 6 1,3-связанной p-D-галактозы.

9. Показано, что полисахариды из обеих форм водоросли проявляют антикоагулирующую активность и индуцируют образование АФК.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Кравченко А.О.. Белоциценко Е.С., Яковлева И.М., Барабанова А.О., Ермак И.М. Сезонные изменения содержания фотосинтетических пигментов у красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis Японского моря // Изв. ТИНРО. - 2011. - Т. 166. - С. 123-133.

2. Kravchenko А.О., Belous O.S., Glazunov V.P., Ermak I.M. Comprehensive study of phycobiliproteins and sulfated polysaccharides from the red alga Ahnfeltiopsis flabelliformis II Chemistry of Natural Compounds. - 2013. - Vol. 49, N 2. - P. 201-205.

3. Kravchenko A.O.-. Anastyuk S.D., Isakov V.V., Sokolova E.V., Glazunov V.P., Yermak I.M. Structural peculiarities of polysaccharide from sterile form of Far Eastern red alga Ahnfeltiopsis flabelliformis // Carbohydr. Polym. - 2014. - Vol. 111. - P. 1-9.

4. Кравченко A.O., Яковлева И.М., Барабанова A.O. Сезонная динамика содержания пигментов и полисахаридов красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis (Harv.) Masuda. (Rhodophyta, Phyllophoraceae) // XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. - 2009. - С. 39.

5. Кравченко А.О.. Барабанова А.О., Яковлева И.М., Ермак И.М. Химический анализ полисахаридов красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis (Rhodophyta, Phyllophoraceae) // XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. - 2010. - С. 32.

6. Barabanova А.О., Kravchenko А.О.. Yakovleva I.M.. Yermak I.M. Seasonal fluctuations of photosynthetic pigments and sulfated polysaccharides in Ahnfeltiopsis flabelliformis (HARV.) MASUDA. (Rhodophyta, Phyllophoraceae) II 9th International Marine Biotechnology Conference. Qingdao. - 2010. - P. 479-480.

7. Барабанова A.O., Кравченко A.O.. Яковлева И.М., Ермак И.М. Влияние экзогенных факторов на полисахаридный и пигментный состав красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis (Rhodophyta, Phyllophoraceae) // IV Международная научно-практическая конференция. Южно-Сахалинск. - 2011. - С. 196-197.

8. Kravchenko А.О., Yakovleva I. М., Byankina А.О., Yermak I.M. Seasonal changes of phycobiliproteins and sulfated polysaccharides from Far Eastern red alga Ahnfeltiopsis flabelliformis (Rhodophyta, Phyllophoraceae) // 4th Annual Russian-Korean Conferences «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology». Novosibirsk. - 2012. - P. 117.

9. Kravchenko A.O.. Yermak I.M. Sulfated polysaccharides and phycobiliproteins from red alga Ahnfeltiopsis flabelliformis (Rhodophyta, Phyllophoraceae) II 1st Symposium «Marine Enzymes and Polysaccharides». Nha Trang. - 2012. - P. 16.

10. Кравченко A.O. , Белоус О.С. Комплексное исследование водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis (Rhodophyta, Phyllophoraceae) // XIV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. - 2012. - С. 24.

11. Kravchenko А.О.. Glazunov V.P., Anastyuk S.D., Isakov V.V., Yermak I.M. Composition of phycobiliproteins and polysaccharides from two forms of red alga Ahnfeltipsis flabelliformis II 2nd International Symposium on Life Sciences. Vladivostok. - 2013. - P. 79.

12. Кравченко A.O., Анастюк С.Д., Исаков В.В., Соколова Е.В., Глазунов В.П., Ермак И.М. Структурные особенности сульфатированного полисахарида красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis // II Всероссийская конференция «Фундаментальная гликобиология». Саратов. - 2014. - С. 38.

Соискатель

Кравченко А.О.

Кравченко Анна Олеговна

Комплексное исследование полисахаридов и фотосинтетических пигментов красной водоросли Ahufeltiopsisflabelliformis

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 20.04.2015. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 130 экз. Заказ 150.

Отпечатано в типографии Дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, Владивосток, ул. Пушкинская, 10