Новый ингибитор альфа-химотрипсина и влияние на его активность ионов металлов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Г6 од

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

ИНСТИТУТ ХИМИИ И ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

СЕМЕНЕЦ ОЛЬГА ПАВЛОВНА

УДК 547..587:547.964:577Л5

НОВЫЙ ИНГИБИТОР о(,- ХИМОТРИШИНА И ВЛИЯНИЕ НА ЕГО АКТИВНОСТЬ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ

02.00.04 - физическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Бишкек - 1994

Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии Кыргызского государственного национального университета

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ш.Ж.Жоробекова Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Н.Ф.Казанская кандидат химических наук,доцент Б.У.Утиров

Ведущее предприятие - Институт химической физики РАН

Защита состоится "_JL" 1994г. в _час.

на заседании специализированного совета К 02.93.21 -в Институте химии и химической технологии HAH Кыргызской республики по адресу: 72Q021, Бишкек, пр. Чуй, 267

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке HAH Кыргызской республики (г.Бишкек, пр. Чуй, 265)

Автореферат разослан " 5 " Шоля^ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат химических наук

Ж.Т.Ахматова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Фермопты, являясь биологическими катализаторами,играют вашюйшую роль в функционировании живых организмов, и дисбаланс ферментных систем, как извост но, приводит к патологическому состоянию. Последнее может быть связано с функцией протеолитических ферментов.регуляция активности которых является одним из путей оздоровления организма.

В связи с этим поиск новых препаратов, в том числе и синтетических, обладающих способностью оказывать на активность протеолитических ферментов определенный эффект, и характеристика кинетических параметров представляются весьма актуальными.

На регуляцию активности ферментов под воздействием соответствующих эффокторов существенное влияние оказывают присутствующие в биологических системах ионы металлов. При этом существующие различные механизмы включения последних в фермент-эффекторные взаимодействия можно рассматривать как процессы комплексообразования ионов металлов с компонентами системы фермент-эффектор. С этой точки зрония весьма интересными и актуальными являются также исследования комплекс-ообразующой способности эффектора и фермента и возможности изменения активности их под воздействием ионов металлов. Полью работы являлось :

- синтез нового препарата (поли(6-окси 5~карбокси-1,3-фешшш) метилена), являющегося полиморным аналогом салициловой кислоты, обладающей противовоспалительными свойствами;

- исследование формы воздействия синтезированного полимора и ионов металлов но активность а хшо трипсина (и субтилиг.итгп в качество сравнения)

■ изучение влияния различных факторов на процесс гидролиза АТЭЭ под действием а хшотрипсипа в присутствии ПСК;

- определенно гашотичсгасих параметров рассматриваемой фер мептативпой реакции и фермент оффекториого взаимодействия.

Научная новизна работы состоит в следующем:

- Синтезирован и охарактеризован новый полиморный ингибитор (поли-(6-окси- 5-карСокси-1,3-фонилен) мотшюн) (ПСК), влияющий на активность протеиназ (а-химотрипсина, субтилизина шт.72) в реакциях гидролиза специфичоского субстрата (этилового эфира М -аргшшл Ь-тирозина );

- Рассчитаны гапгетические параметры роакций гидролиза АТЭЭ в присутствии ПСК и изучено влияние среда на ингибирующую способность полимора;

Синтозированшй ингибитор рассмотрен в качоство макромоло кулярного лиганда и изучено комплексообразование его с ионами биометаллов Мп (II), Со(II), N1(11). Определены константы устойчивости образующихся комплексов;

- Установлено участие металлокомплексов в процессах ингиби-рования а-химотрипсина и рассчитаны соответствующие константы ингибирования. Показано изменение сродства полимор-ного ингибитора к ферменту от природы ионов металлов и содержания их в реакционной системе;

Практическая значимость работы состоит в следующем:

- Синтезированный на основе салициловой кислоты, являющейся негормональным противовоспалительным средством, новый полимерный препарат и его металлокомплексы могут быть использованы для нужд медицины и биохимии;

- Предложен новый ингибитор протеиназ ( а-химотрипсина, субтилизина ) и способ регуляции его активности с помощью введения в систему, включающую данный ингибитор, ионов металлов определенной концентрации;

- Рассчитанные в ходе исследования кинетические параметры гидролиза АТЭЭ в присутствии ПСК могут быть использованы в биохимических и этимологических лабораториях;

- Полученный полиэлектролит (ПСК), имеющий регулярное строение и известный состав, может быть использован в качестве модели для изучения слсшшх биоактивных макромолекул;

- Синтезированный пропарат предлагается использовать в ка честве макромолекулярного лиганда в исследованиях .направленных на развитие теории координационной химии макромолекул .

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на научной конференции профессорско-преподавательского состава, посвя -щешюй 60-летию КГНУ (Бишкек 1993 г.), научной конференции факультета химии и технологии(Бишкек 1994 г.),на объединоном научном семинаре лаборатории Института химии и химической технологии НАН Кыргызской республики (Бишкек 1994 г.).

Публикации. По томе диссертации опубликовано пять научных работ.

Обьом работы. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, включая 41 таблицу и 47 рисунков, состоит из введения, литературной (1 глава) и экспериментальной (2-4 главы) частей, выводов и списка литературы, включающей 150 наименований.

Краткое содержание работы.

Глава 1. Современные представления о роли металлов в биологических системах.

В первой главе изложены сведения, освещающие современное состояние вопроса о возможности применения координационных соединений в качестве лекарственных препаратов. Как свидетельствуют литературные данные, ряд лекарственных препаратов, представляющих собой потенциальные лиганды (в частности, производные салициловой кислоты, эндогенные катехоламины и др. ), следует классифицировать как пестероидные противовоспалительные средства (НВПС).

Как известно, присутствие в биологических системах ионов металлов оказывает влияние на функционирование ферментов. Последние являются типичными макромолекулярными лигандами, и поэтому взаимодействие металлов с белками может быть описано согласно подходов координационной химии.

В связи с этим, изучение влияния ионов биометаллов и процессов их комплексообразования на активность ферментов представляет интерес с точки зрения регуляции работы белков в организме путем изменения их каталитических свойств.

Гласа 2. Физико химичоская характеристика полимера на основе салициловой кислотц и формальдегида.

Вторая глава диссертационной работы посвящена синтезу

полимера на основе салициловой кислоты и формальдегида, а

также определению физико-химических параметров полученного

соединения. Синтез полимера проводился в кислой среде при

г =98°С в присутствии катализатора щавелевой кислоты.

Продукт поликонденсации (ПСК) (поли-(6-окси-5-карбокси-

1,3-фенилен)метилен) представляет белый порошок, хорошо

растворимый в щелочах и спирто и плохо растворимый в воде и

растворах кислот. Элементный состав образца (С:63,08% 6

11:4.82% ,0:32.01 % ) соответствует полимору предполагаемого

строения„„„ 1 саон

саон он

+ пСНЛ

/

(гидроксильной ) обусловливает

Наличие в мономере ориентаптов I родй" группы) и II рода (карбоксильной группы избыток электронной плотности в молекуле салициловой кислоты в положениях 2,4, вследствие чего процесс поликонденсации, вероятно, протекает с замещением водорода имошю в этих положониях.

<*, Нч +

н>=0 +Н

роои

'ОН Нч Н

ч- с

2 он

/г

шон

СООН

соон

О)

-НН

Таблица 1

Важнейшие полосы поглощения в ИК -спектрах ПСК

Колебания группы

-1

vc=0(GOOH)

V (аром)

с=с

8 (алиф) о-н

fîOH

г>с_о(С00Н) рс_н(аром)

V

он

vc_H(apoM) г>с_н(алиф)

см

1660

1610 1490

1440

1290 1130

1210

900-650

3430

3030

2920

14.00

26.93

30.94

18.61

29.86 40.61

21.65

42.24-50.92

36. ZT

31.08

32.06

Т

Появление полос поглощения (1440 см"1, 2920 см-1) в ПК-спектре полученного соединения свидетельствует о наличии алифатических связей С-Н, отсутствующих в салициловой кислоте.

Средновесовая молекулярная масса синтезированного соединения, определенная методом гель-фильтрации ( С -50, рН=Ю, I =0,1 ), составляет 3500+350Д. Возникающие в ходе эксперимента гидрофобные взаимодействия между матрицей геля и ПСК были блокированы подбором соответствующих элюэнтов (табл.2).

Таблица 2

Дашшо объемов выхода ПСК в процессе голь фильтрации

Сефадекс Элюент УГ.Д'Г \сгго7' МЛ \ск' ш

С 25 0.05н. ЫаОН + 0.1н ИаС1 16 42 48

С - 50 0.05н. ИаОН 4 0.1н ЫаС1 19 41 43

0.05н. ИаОН + 0.1н ЫаС1 + 4 М (Ш2)2С0 28 45 53

0.05н. ЫаОН 4 0.1Н N801 + Ъ% СэНг0Н 2 5 16 33 28

Для характерно т ики полимера как макромолекулярного лиганда было проведено определение констант диссоциации функциональных групп. Знчение рК ионизации гидроксильных групп , определенное методом спектрофотометрии, составило I3.36f0.02 (1=2.О;^ 20°С). По данным потенциометрического

б

титрования при различных ионных силах с использовашем уравнения Гендерсопа-Гассельбаха, модифицированного для полиэлектролитов, были рассчитаны константы диссоциации карбоксильных групп

рКдас - рН а/(1-а) (1)

где а - степень диссоциации при данном значении рН п - коэффициент,учитывающий полиэлектролитную природу полимора

Таблица 3

Значения рКШР ПСК при различных ионных силах

I, м 0.001 0.1 0.5 1 .0

РКдис 4.94 4.38 3.52 3.38

п 1.82 1.66 1 .35 1.09

Рост кислотных свойств ПСК по мере увеличения ионной силы связан с экранированием заряда на макроионе противоионами фонового электролита №И0_), что, в свою очередь, облегчает процесс диссоциации соседних функциональных групп полимора. Большее значение рК ПСК (4.38) по сравнению с

пизкомолекуляргам аналогом салициловой кислотой (рКдис.=3.0) обусловлено изменением электростатического заряда на поверхности макроионов при диссоциации поликислоты. Об этом свидетельствует изменение электростатической свободной энергии ионизации, рассчитанной по Теифорду.

Вычисленные величины Сэл (табл.4) демонстрируют уменьшение последней при повышении ионной силы раствора. По мере возрастания заряда на макроионе происходит увеличение свободной электростатической энергии ионизации, что сопровождается изменением конформации макромолекулы. Об этом свидетельствуют результаты вискозиметрических исследований растворов полимера.

Таблица 4

Плоктростатичоская свободная энергия ионизации макроиона ПСК в водном рлстворо

8 3 10 11 12

13

14

15

16 17

1-0.101.

11 .93 14.38 18.37

о<~> по

26.15 23.31 44.83 11.52 13.11 14.79

10-" 103 103 103 103 ю4 ю4 ю5 ю5 ю5

(1ЭД. ,Дж/моль 1-0.Б м

4.57 5.78 7.13 8.63 10.27 11.37 13.03 4.01 4.56 5.15

1010:

о

ю-102 104 ю4 10е 10е ю5

1=1.0 иС

4.06

5.03 6.28 7.59

9.04 20.31 45.17

6.02 4.38 4.94

10-Ю3 10103 10103 ю3 ю4 105 105

Условия опита

£=20°С

Конформациошшо превращения макроиона ПСК с ростом температуры приводят 1С преобретепию молекулой более сферической формы, в связи с потерей гидратациошюй воды (рис. 1)

Таблица 5

Зависимость удельной вязкости от рН

рН 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0

Что* 10-2 1.8 2.62 2.68 4.91 15.4

Условия опыта:1=0.1; 1;=25°С;с= 25 г/л

Таким образом, синтозировашшй полимор можно рассматривать как полиэлектролит, обладающий способностью к конформа-ционной изменчивости в зависимости от условий среды.

Рис. 1. Зависимость соотношения полуосей а/Ь макромолекулы ПСК и приведенной вязкости от температуры (1,я) рН = 11; I = 0.1;1 - 18 г/л 2-25 г/л

Глава 2. Комплексообразование ГОК с ионами переходных металлов <' Мп (II), Со (II), N1 (II;)

Известно, что присутствие в биологических системах ионов металлов привносит специфические особенности в функционирование систем, связанные с копр .тонированием функциональных груш лиганда и перераспределением электронной плотности. 5 связи с этим представляло интерес рассмотреть взаимодействие синтезированного полимера 'ПСК) с ионами биометаллов (Мп III), Со (II), N1 (II) ).

Согласно современным представлениям процесс ксмплексообразования можно рассматривать с одной стороны, как связывание ненов металлов с отдельными функциональными группами полимера, а о другой - как связывание ионов металлов клубком макромолекулы в целом.

В первом случае для определения устойчивости координационных узлов нами использовался метод потенциометрического титрования. Как известно, концентрацию лигандэ в подобных случаях в приближенной форме рассчитывается по количеству функциональных груш макромолекулы. .Установлено, что среднее число Еъергума для

координационных узлов в рассматриваемых макрокомплсксах, определенное на основе экспериментальных дашшх (рис.2), приближается к двум. В связи с этим слодуот предположить образование координационных узлов в соотношением лигапд металл I: I и 2-1 с доминированием последних.

рис.2 Функции образования Бьеррума в изучаемых системах ПСК+Ме (II); I- МП (II) , 2 - Со (II), 3 - N1 (II) Исходя из величин рассчитанных констант устойчивости, ионы металла располагаются в ряд Ирвинга-Вильямса (табл. В)

Таблица б

Константы устойчивости координационных узлов комплексов ПСК

с металлами

Металл К1 1в к, 1 в К2 Рг 1в Рг

Мп2+ 5 01- К* 2.70 0.39' 1С? 1.59 I 95-10 4.29

Со2 + 7 59- И* 2.88 0.47-10 1.67 2 54 4.40

8 32 И* 2.92 0.84-10 1.92 8 95-10" 4.87

о -з -н

Условия опыта 1=0.1; 1=20 С;[ПСК] = 7-10 М;СМе] = 4.2*10 М

Отметим, что меньшая устойчивость полимерных комплексов (табл.б) по сравнению с соответствующими низкомолекулярными аналогами ( рКуст-Ып3а1г= 5.60, рКу0Т_Со3а1г= 6.54,

рК..ЛФ ...а , = 6.94 ), по всей видимости, обусловлена прост-

У»-» I •Ыд.ьЭ&Л.^

ранственными затруднениями при достижении макролигандом

необходимой для образования комплекса оптимальней конформа ции.

Изучение взаимодействия ПСК, как макромолекулярного клубка, с ионами металлов осуществлялось методом гель-фильтрации (сефадекс С-50, обьем колонки 50»1.6 см, скорость элюирования 7 мл/час, 1=0.1, 1=20°С ). Константы образования макрокомплексов рассчитывались согласно

нетермодинамического подхода равновесий - по формуле:

ИЕ

теории множественных

¿К1Шравн

Ш

(2)

N

Т, * 1=1

1 К1СМраш1

Зксперимситальшо дошше, представлсшшо в координатах Скот чарда, показывают, что образование комплексов в рассматриваемых системах протекает как связывание ионов металлов по множеству центров на макромолекуле ПСК с формированием отдельных координационных узлов(рис.3).

ХёСМе]

рис. 3 График Скэтчарда для связывания ПСК с ионами Мпг+(П). Врезки к рис: Координаты Хилла для образования координационных центров типа А и В Условия опыта t=2a С , рН=6.0; 1=0.1^;ПСК =1.6-10 М

Следует отметить,что различие величин Кд и Кц (табл.7) свидетельствует не о наличии в макромолекуле центров разной афинности , а обусловлено проявлением аффекта соседа, связанного с тем, что при образовании координационных узлов происходит снижение сродства соседних функциональных групп лиганда к металлу за счет оттягивания электронной плотности и подавления отрицательного электростатического заряда макроиона.

Таблица 7

Характеристика процесса комплексообразования ПСК с металлами

Металл КД,М-1 Хд Кд ,М~1 Хд

Мп2 + 1.86'Ю4 6.2 1.56 4.28-Ю2 16.9 1.81 Со2+ г.бЗ'Ю4 7.8 1.0 9.12-Ю2 17.8 1.23

И12 + Э.ЭЭ'Ю'1 8.6 1.0 1.24*103 19.6 1.20

Условия опыта: 1=0.1М;рН=б.0; г=20°С; Ше] = 2-10"3- 8»10~5 М

Число координациошшх узлов и (табл.Т) в

макромолекулярном комплексе ПСК возрастает по мере усиления комплексообразующей способности металлов в следующем ряду Мп <Со <N1.

Для характеристики состояния центрального иона и симметрии координационного узла были изучены электронные спектры поглощения в интервале X = 260-1100 нм (табл.8). Замещение молекул воды в координационной сфере ионов металлов функциональными группами салициловой кислоты и ПСК приводит к смещению полос поглощения , характерных для акваионов в коротковолновую область, что связано с усилением

поля лигандов. Известно, что возрастание величины Dq указывает на увеличение прочности связи металл-лиганд.

Таблица 8

Значения электронных переходов и параметр расщепления Пд комплексов металлов с Н20, салициловой кислотой и ПСК

Комплекс Х,нм V,CM~1 Электронные переходы CM Конфигурация

525 19736

Mn(HgO)g+ 495 410 360 340 20394 23026 27302 32020 X - Vo 850 Правильный октаэдр

505 17699 X -*X<4g>

Mn - Sal2 489 395 345 315 20449 25316 28985 31746 X ->4T2e(4G) X 953 Искаженный октаэдр

560 17857

Мп - ПСК 490 398 350 320 21710 25032 27630 31056 6A1g -4T2g(4G) X -4E1g(4G) X 6A, -*4E (4G) 1« s 950 Искаженный октаэдр

Со(Н20)^+ 1100 525 495 9008 18308 20394 4т. -Ит (F) 1g 1« 4T, ->4A„ lg 2g X -4т1й(Р) 930 Мало искажен ный октаэдр

Со - Sal2 1040 570 480 9615 19607 20833 X ->4T1g(F) 4T1 1g 2g 4T, (P) 1g 1« 992 .Искаженный октаэдр

продолжение Таблицы 8

Значения электронных переходов и параметр расщепления Dq комплексов металлов с Н20, салициловой кислотой и ПСК

Со - ПСК

1078 520 490

9276 19230 20408

"ig

1

"1g

V Ä2g

954

Искаженный октаэдр

Ni(H20)2+

1125 670 394

3888 14925 25380

2g ^' .3T2g(P)

3А2

ге {ге

88 8

Правильный октаэдр

Ni - Sal

1045 680 385

9569 14705 25974

2g ^g

%в(¥) %g(F)

957

Искаженный октаэдр

Ni - ПСК

1090 660 390

9174 15640 25641

2g

%в(Р) 3T2g(F)

917

Искаженный октаэдр

Следует отметить, что полосы поглощения салицилатных комплексов Со(II) и N1(11) значительнее смещены в коротковолновую область, чем для полимерных аналогов.Сопоставление величин Dq (табл.8) свидетельствует о меньшей прочности связи металл-лиганд у комплексов Со(II) и N1(11) с ПСК по сравнению с салицилатами этих металлов, что вполне согласуется со значениями констант устойчивости вышеуказанных соединений (табл.6).

Таким образом, на основании исследования взаимодействия ионов металлов с ПСК показано, что макромолекулярная природа последних обусловливает проявление при комплексообразовании их с ионами металлов концентрационных и кооперативных эффектов.

з

3

3

3

3

Глава 4. Ингибирование активности а-химотрипсина ПСК и влияние на процесс ионов металлов

Первая часть настоящей главы посвящена изучению влияния ПСК на процесс гидролиза этилового эфира П-аргинил-Ь-тирозина под действием а-химотрипсина при различных условиях среды. (рН=5.3-8.5; 1=0.05-0.22 М ). Изучение кинетики соответствующих ферментативных процессов осуществлялось на рН-стате Radiometer ТТТ-1с(Дания) при t=20°C.

Для описания ферментативного процесса,протекающего с участием эффектора (Э) была выбрана следующая кинетическая схема

Е + S ES £ +Р + +

и

ЕЭ+S ЕЭ +Р

где Е-фермент, ES-фермент-субстратный комплекс, ЕЭ-фермет-эффекторный комплекс, кг - константа скорости распада комплекса Михаэлиса, Kg- константа его диссоциации, Кэ- константа диссоциации фермент-эффекторного комплекса Выявлено, что в присутствии ПСК происходит подавление активности а-химотрипсина, при этом наблюдается как изменение константы Михаэлиса (Ks ), так и максимальной скорости реакции (Vmax)(рис.4).

Кинетические параметры изучаемой реакции (K^3.43fO.I2)«IÖ^M; а=0.53 ß=0,65 ) свидетельствуют о смешанном типе ингибирования. Известно, что ароматические соединения,представляющие собой структурные аналоги боковой цепи специфических субстратов, являются конкурентными ингибиторами а-химотрипсина. Наличие длинной цепочки салицилатных фрагментов ПСК создает,по всей видимости, пространственные затруднения полному погружению ароматического кольца в гидро-

фобную полость фермента и тем самым не позволяют процессу ингибирования протекать конкурентно.

сйшмотрипсина. Условия опыта.4=20 С, рН=7.8, 1=0.1 СЕ] =3.71' Ю-8 М, [ПСК] «КГ? М: 1-0, 2-2.85;3-5.71; 4-8.10

Изучение ингибирования активности а-химотрипсина ПСК в растворах различной ионной силы показало (табл.9), что ингибирукшй эффект понижается по мере роста фонового электролита.

Таблица 9

Влияние ионной силы на константу ингибирования ПСК

Ионная сила, М 0,05 0,1 0,22

Константа ингибирования к±,м 2.2«10~5 3.43'Ю-5 1.02 «Ю-4

Условия опыта:рН=7.8 г=20°С [Е]=3.71.Ю_8М, [Б 1=1.8-8.0«Ю^А [ПСК] =2.85 -5.71.Ю-5 М

Этот эффект,вероятно,связан с экранирующим действием противоионов фонового электролита на отрицательно заряженные центры молекул ингибитора, появляющиеся в результате диссоциации карбоксильных групп,и последующим затруднением электростатических взаимодействий ингибитора с белковой

молекулой. Это позволяет предположить,что решающую роль в процессе взаимодействия ПСК с ферментом играют гидрофобные взаимодействия. Подобное предположение вполне согласуется с результатами,полученными при изучении влияния рН на процессы ингибирования ПСК химотриптического гидролиза АТЭЭ (табл.10).

Таблица 10

Влияние рН среды на активность а-химотрипсина в присутствии ПСК

рн V ,М»с шах ^кат'° 1 к±,м

5.3 6.5 7.8 8.5 8.0«10Т -Б 2.63*10 8.0 .106 8.33.105 21.56 70.89 215.63 224.53 (1.02+0,10).Ю"5 (2.41±0.19) »Ю-5 (3.43±0Л5) «Ю-5 (4.57±0.21)'10~5

Условия опыта:г=20°с;[ПСК]= 5.71«КГ5 М;СБЗ =3.71-7.8.Ю-8 М;

[Б]= 1.8-8.1 >КГ3М

В порядке сравнения ингибирующего эффекта на активность протеиназ было рассмотрено влияние изучаемого полимера на реакцию гидролиза АТЗЭ в присутствии субтилизина в исследуемом интервале рН. Установлено,что ингибирующее влияние ПСК на активность субтилизина в интервале рН=5.3-б.5 эффективнее ,чем для а-химотрипсина(рис.5).

Принимая во внимание положительно заряженный центр субтилизина и наличие отрицательного заряда на макроионе ингибитора (ПСК), можно предположить , что в отличие случая с а-химотршсином при образовании фермент-ингибиторного комплекса между ПСК и субтилизнном реализуются как гидрофобные, так и в значительной степени и электростатические взаимодействия. По мере роста рН (рН>6,5) у макромолекулы субтилизина, имеющего изоэлектрическую точку при рН=9.1, происходит уменьшение соотношения положительных зарядов к отрицательным в связи с депротонированием ИН^-

s.s B.S ?,5* ÍS pH

рис.5 рН-зависимость ингибирования активности субтилизина

(I) и а-химотрипсина (3) ПСК.

Условия ошта 1=0.1 t=20°C

1-[S]=2,Q»I0~3M, [Е]= 3.2»Ю~а МДПСЮ = 2,0«10_5М

2-CS]=2.7'I0~3M, [Е]= 3.71'Ю-8 М, СПСЮ = 5.71«КГ5М

3- субтилизин + АТЭЗ + sal; [S]= 2.0'Ю-3 М,

[Е3= 3.2.I0"8 M,Csal]= 2,0'Ю*4 М

V¿-скорость гидролиза АТЭЭ в присутствии ингибитора,

\ -скорость гидролиза АТЭЭ в его отсутствие

-групп и диссоциацией карбоксильных. В связи с этим, вероятно, имеет место ослабление электростатических взаимодействий между отрицательно заряженной молекулой ингибитора и белком, что обусловливает ослабление ингибирующего эффекта ПСК активности субтилизина при рН>6.Б (по сравнению с а-химотрипсином).

Сравнение рК ионизации групп а-химотрипсина, ответственных за связывание с субстратом (р%6.5) и ингибитором (рК=6.2), показывает незначительное различив этих величин. В связи с этим следует допустить, что связывающий центр катализатора является одним из многих участков белка, по которым происходит связывание ПСК с oí-химотрипсином (рис.6)

ингибирования ПСК в изучаемых системах от pH. 1=0.1 t=20°C

Во второй части главы 4 проведено исследование влияния ионов металлов (Mn(II), Со(II), N1(11)) на ингибирование «¿-химотрипсина в реакции гидролиза субстрата поли-(6-акси-5-карбокси-1.3-фенилен)метиленом (ПСК). Предварительно было исследовано влияние ионов металлов на изучаемую реакцию. Определение параметров ингибирования для всех металлов проводилась согласно схемы 2, полученные данные представлены в таблице II.

Результаты исследования позволяют заключить, что макромолекула фермента содержит комплексообразукщие центры.

Таблица II

Параметры ингибирования активности а-химотрипсина в реакциях гидролиза АТЭЭ ионами металлов.

Ингибитор

Мп' Со' Nl:

2+ 2+ 2 +

Параметры

К±,М

(2.47+0.08)»10 (6.53+0.12)»10 (2.27+0.10)»I0-5

-л

-5

ингибирования

а

0.55 0.71 1.45

0.31 0.43 1.0

Условия опыта: 1=0.1; t=20°C; СЕ]= 3.7I«I0-SM,[Sl= I.8-8.I«I0"3M, [Ме]= 6.0-IO"5- I.8«I0"3M

взаимодействие которых с изучаемыми ионами металлов приводит к обратимой инактивации «¿-химотрипсина по различным механизмам, о чем свидетельствуют значения £ и $ (табл.П). Экспериментальные значения констант ингибирования ионов металлов показывают, что по способности к комплексообразованию с а-химотрипсином ионы металлов располагаются в ряд Ирвинга-Вильямса.

Для выяснения возможности участия в процессе ингибирования металлокомплексов ПСК, образующихся в реакционной системе ПСК-Мег+-Е, исследовано влияние ионов металлов на процесс ингибирования активности а-химотрштсина ПСК. Выявлено, что при постоянной концентрации ПСК по мере увеличения содержания металла в системе происходит нелинейное уменьшение скорости реакции (рис.6).

Теоретические величины скоростей ферментативной реакции, полученные при помощи кинетических уравнений , описывающих двухкомпонентное ингибирование как по взаимозависимому, так и по взаимонезависимому типу не соответствует экспериментальным данным. Этот факт указывает на существенное влияние образующихся металлокомплексов на активность а-химотрипсина в данных многокомпонентных системах.

Используя уравнение для скорости ферментативной реакции, описывающее кинетическую схему с участием трех ингибиторов, были рассчитаны кажущиеся константы ингибирования для металлокомплексов ПСК. Анализ зависимости К1 показывает (рис.7), что при данных концентрациях ионов металлов в реакционной системе комплексы характеризуются более сильным сродством к белковой молекуле, поскольку значения рК± превышает рК± для ПСК (рК±=4.46).

Выявлено, что для системы Ш+ПСК+а-химотрипсин + АТЭЭ в исследуемом интервале концентраций металла (рис.7) наблюдается уменьшение константы ингибирования по мере увеличения содержания никеля. Данное явление, по-видимому, связано с тем, что комплексы металлов, обладающих высокой координирующей способностью (N1 (II)), проявляют оптимум ингибирования активности а-химотрипсина при низких

рис.6 Влияние ионов Со(II) на скорость гидролиза АТЭЭ под действием «£-химотрипсина в присутствии ПСК Условия опыта 1=0.1; рН=7.8; [БЬЮ-3, М: 1 -1.8

1вШ91

рис.7 Зависимость констант ингибирования от содержания

ионов металлов в системе ПСК-Ме2+-с£-химотрипсин. Субстрат-АТЭЭ. г=20°С,рН=7.8;1=0.1;[3]=2.71'КГ3 М; [Е]=3.71'10_8М

Точка на оси . ординат соответствует значению р^ (ПСК).

концентрациях, тогда как иош металлов, находящиеся ниже в ряду Ирвинга-Вильямса (Со(II), Mn (II)), облегчают образование фермент-ингибиторных комплексов при более высоких концентрациях (рис.7).

Таким образом, по усилению влияния на ингибирующую способность ПСК по отношению к et-химотрипсину ионы металлов располагаются в ряд, соответствующий ряду устойчивости Ирвинга-Вильямса : Ni> Со> Мп.

Проведенные исследования позволяют заключить что, металлокомплексы ПСК являются достаточно сильными ингибиторами а-химотрипсина, активность которого может меняться как от природы, так и от содержания ионов металлов в системе.

ВЫВОДЫ

1. Синтезирован макромолекулярный лиганд, являющийся полимерным аналогом салициловой кислоты, и обладающий свойствами полиэлектролита и конформационной изменчивостью.

2. Изучены процессы комплексообразования ПСК с ионами металлов, рассчитаны константы устойчивости образующихся комплексов. Показано, что рассматриваемые макрокомплексы характеризуются более низкой устойчивостью по сравнению с низкомолекулярными аналогами. В зависимости от природы металла рассматриваемые соединения укладываются в ряд Ирвинга-Вильямса.

3. Установлена ингибирующая способность синтезированного полимера по отношению к а-химотрипсину и субтилизину.В случае а-химотрипсина выявлена доминантная роль гидрофобных взаимодействий при образовании фермент-ингибиторного комплекса.

4. Установлено влияние образующихся в рассматриваемой системе металлокомплексов ПСК на процесс ингибирования активности а-химотрипсина в реакции гидролиза АТЭЭ.

5. Показана возможность регуляции ингибирующей способности под действием ионов металла в зависимости от природы и содержания последних в реакционной системе.

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1. Семенец О.П., Жоробекова Ш.Ж., Шарафутдинов Т.З. Физико-химическая характеристика полимера на основе салициловой кислоты и формальдегида.-Тезисы докладов научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава КГУ.- Бишкек, 1993 г.-с.17.

2. Жоробекова Ш.Ж., Семенец О.П. Физико-химическая характеристика полимера на основе салициловой кислоты и формальдегида.-Вестник КГНУ- N I -1994.

3. Жоробекова Ш.Ж., Семенец О.П. Комплексообразование полисалициловой кислоты с ионами переходных металлов (Мп(П), Со(П), N1(11)).-Деп.КыргИНТИ N 704 от 3.06.1994.

4. Жоробекова Ш.Ж., Семенец О.П. Влияние рН среды на ингибирование активности а-химотрипсина полисалициловой кислотой.- Деп.КыргИНТИ N 705 от 3.06.1994.

5. Жоробекова Ш.Ж., Семенец О.П. Эффекты комплексообра-зования ионов металлов в процессах ингибирования активности а-химотрипсина поли(6-окси-5-карбокси-1,3-фенилен)метиленом.-Деп.КыргИНТИ N /УЗ от 25.06. 1994.