Механизм ингибирования уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium (stuph) и homo sapiens (huphi) 2,2`-ангидроуридином по результатам рентгеноструктурного анализа и компьютерного моделирования тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ
|
Лашков, Александр Александрович
АВТОР
|
||||
|
кандидата физико-математических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2010
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
01.04.18
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
УДК 548.737
На правах рукописи
-Али
004614123
ЛАШКОВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ
МЕХАНИЗМ ИНГИБИРОВАНИЯ УРИДИНФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ SALMONELLA TYPHIMURIUM (S7UPH) И HOMO SAPIENS (tfUPHI) 2,2'-АНГИДРОУРИДИНОМ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА И КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ
Специальность 01.04.18 - «Кристаллография, физика кристаллов»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
2 5 НОЯ 2019
Москва-2010
004614123
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и Учреждении Российской академии наук Институте кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН
Научные руководители:
доктор физико-математических наук, профессор Роман Гербертович Ефремов кандидат физико-математических наук, доцент Альберт Михайлович Михайлов
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, профессор Владимир Юрьевич Лунин доктор медицинских наук, профессор Елена Николаевна Карева
Ведущая организация:
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского
Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Защита состоится «¿S ноября 2010 г. в ч.^?мин. на заседании диссертационного совета Д 002.114.01 в Учреждении Российской академии наук Институте кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН по адресу 119333, г. Москва, Ленинский проспект, д. 59 . i
\лМ '
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИК РАН . ! \
)
Автореферат разослан «_» октября 2010 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета Д 002.114.01 кандидат физико-математических наук
В.М. Каневский
Актуальность работы. Уридинфосфорилаза (UPh; Е.С. 2.4.2.3) является ключевым ферментом метаболизма противоопухолевых препаратов - антиметаболитов пиримидинов, которые, несмотря на их высокую токсичность, остаются основным средством химиотерапии онкологических заболеваний.
В опытах in vivo показано, что при консервативном лечении злокачественных новообразований [1] специфичные к уридинфосфорилазе ингибиторы усиливают лечебный эффект 5-фторурацила (5Fura) [1]. В связи с этим имеется возможность, применяя ингибиторы UPh, уменьшить дозу вводимого антиметаболита пиримидиновых оснований (5Fura), снизив тем самым токсическое действие последнего на здоровые ткани.
Следует обратить внимание на то, что ингибирование уридинфосфорилазы летально для некоторых паразитов (например, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni), являющихся возбудителями опасных заболеваний человека [2-4]. Таким образом, ингибиторы уридинфосфорилаз являются и перспективными противопаразитическими препаратами.
Установлено влияние UPh на устойчивость клеток нервной системы к гипоксии. Показано, что высокое содержание уридина в нейронах уменьшает степень гипоксического повреждения нервной ткани при ишемическом инсульте [5]. Ингибирование UPh приводит к снижению концентрации уридина, так как нарушается его ресинтез, в тканях нервной системы, что приводит к ухудшению состояния нервной ткани при инсульте.
Для разработки новых лекарственных препаратов - ингибиторов уридинфосфорилазы необходимо детальное исследование пространственной организации макромолекулярных комплексов уридинфосфорилаз бактерий и высших организмов методами рентгеноструктурного анализа при атомном разрешении и компьютерного моделирования.
Целью данной работы было изучение пространственной организации молекулы уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium (SiUPh) и уридинфосфорилазы человека (HVPhl) в комплексах с разными лигандами и установление структурной основы ингибирования этих уридинфосфорилаз 2,2'-ангидроуридином (ANU) методом рентгеноструктурного анализа. Компьютерное моделирование оптимальных ингибиторов (аналогов 2,2'-ангидроуридина) уридинфосфорилазы человека и бактерий.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
• определение атомных структур комплексов (iSfUPh) с 2,2'-ангидроуридином, ионом фосфата и калия методом рентгеноструктурного анализа биомакромолекул;
• решение структуры комплекса //UPhI с 2,2'-ангидроуридином методом молекулярного моделирования;
• анализ структур комплекса "фермент-ингибитор" для //UPhI и SiUPh; молекулярно-динамическое исследование//UPhI и 5/UPh;
• компьютерное конструирование потенциальных ингибиторов уридинфосфорилаз.
Научная новизна результатов.
Методом рентгеноструктурного анализа впервые установлены пространственные структуры атомного разрешения с высокой достоверностью комплексов ЗШРИ с 2,2'-ангидроуридином, ионами фосфата и калия (ГО РБВ: ЗОРБ, ЗС74, 1У1Ы, ЗБОО, ЗИШР).
Впервые выявлено место и характер связывания 2,2'-ангидроуридина с ЛиРЬ (ферментом-мишенью).
Методом молекулярного докинга впервые определена структура комплекса ЯиРМ с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата. Установлены аминокислотные остатки ЯиРЫ, связывающие 2,2'-ангидроуридин. Показаны различия ферментов ЯиРМ и в гидрофобной области сайта, связывающего пиримидиновый компонент 2,2'-ангидроуридииа. Впервые установлена идентичность механизма ингибирования ЯиРЫ и 5ШРЬ 2,2'-ангидроуридином.
Впервые исследована лабильность атомов молекул ЯиРМ, ЛиР1г и комплекса БШРИ с ионом калия методом молекулярной динамики. Выявлен^ отличия в подвижности элементов молекул Л11РЬ и Я11РЫ.
Впервые на основе 2,2'-ангидроуридина проведено конструирование т зШсо молекулы оптимального ингибитора, с высокой аффинностью для ЯиРЫ и 5/11РЬ. Это 5-замещенные или 6-замещенные 2,2'-ангидроуридины, где в качестве заместителя выступает короткая алифатическая насыщенная цепочка с ароматической группой на конце.
Практическая значимость. Изучение структурных аспектов взаимодействия уридинфосфорилаз человека и патогенных микроорганизмов с ингибитором - 2,2'-ангидроуридином и компьютерное конструирование структур высокоаффинных аналогов АЫи создало основу для синтеза противоопухолевых, противобактериапьных и противопаразитических препаратов нового поколения. Основные положения, выносимые на защиту:
• результаты рентгеноструктурного анализа 5ШРЬ и её комплексов с 2,2'-ангидроуридином, ионами фосфата и калия (ГО РБВ: ЗБРЗ, ЗС74, 1У1Ы, ЗББО, ЗР\\Ф);
• результаты компьютерного моделирования комплекса Я11РЫ с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата;
• структурные аспекты ингибирования 5711РИ и ЯиРМ 2,2'-ангидроуридином;
• результаты исследования лабильности атомов молекул Я11РЫ, ЗШРЬ и комплекса 5ШРЬ с ионом калия методом молекулярной динамики;
• результаты рационального конструирования на базе 2,2'-ангидроуридина новых высокоаффинных ингибиторов уридинфосфорилаз.
Вклад автора. Автором лично выполнены следующие этапы работы:
1) обработка экспериментальных интенсивностей рентгеновского спектра синхротронного излучения от кристаллов комплексов 5/11РЬ с лигандами;
2) решение и уточнение пяти атомных структур комплексов 5<иРЬ (ГО РБВ: ЗБРБ, ЗС74, 1У1Ы, ЗББО, ЗР\УР);
3) определение структуры комплекса //1)РИ1 с АКи и ионом фосфата методом молекулярного моделирования;
4) исследование подвижности функционально значимых элементов SiUPh и #UPhI методом молекулярной динамики;
5) анализ результатов рентгеноструктурного исследования и компьютерного моделирования;
6) создание структурной базы для исследования механизма ингибирования 5/UPh и #UPhI 2,2'-ангидроуридином;
7) молекулярный дизайн in silico новых ингибиторов SiUPh и #UPhI на основе созданной структурной базы.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах - список прилагается. Координаты атомов пяти пространственных структур макромолекулярных соединений и соответствующие им наборы модулей структурных факторов приняты Международным Банком Белковых Структур (PDB) - ID PDB: 3DPS, ЗС74, 1YIR, 3DDO, 3FWP.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на восьми национальных и международных конференциях, в конкурсе научных работ ИК РАН 2009 года -именная премия им. A.B. Белова. Список тезисов докладов прилагается. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитированной литературы. Она изложена на 162 страницах, содержит 22 рисунка и 25 таблиц.
Краткое содержание диссертации Введение. Во введении дана краткая биохимическая характеристика- фермента уридинфосфорилазы, обоснована актуальность темы и необходимость исследования структурных аспектов механизма ингибирования уридинфосфорилаз методами рентгеноструктурного анализа и компьютерного моделирования.
Глава 1. Литературный обзор
Литературный обзор состоит из трёх тематических разделов. В первом разделе описывается структура гена уридинфосфорилаз, структурная организация исследованных уридифосфорилаз, ферментативная функция, участие уридинфосфорилаз в метаболизме пиримидиновых оснований в низших и высших организмах.
Второй раздел обзора описывает применение уридинфосфорилаз и её специфических ингибиторов в лечении онкологических, инфекционных и сердечнососудистых заболеваний. Особое внимание уделяется участию уридинфосфорилазы в метаболизме уже применяющихся в медицинской практике фармакологических препаратов - аналогов пиримидиновых оснований. Рассматривается недавно установленный аспект участия уридинфосфорилазы в защите нервной ткани от гипоксического повреждения при инсульте.
Третий раздел посвящен известным ингибиторам уридинфефорилаз - аналогам субстратов. Приведена классификация, химические названия, биохимические и биологические свойства известных ингибиторов уридинфефорилаз - аналогов -субстратов и на основе этих данных делается выбор исследуемого ингибитора.
Глава 2. Материалы и методы
В главе описаны биологические и химические материалы. На основе литературных данных и личного опыта автора приведены краткие обзоры, посвященные использованным в работе методам кристаллизации биомакромолекул, съемки и первичной обработки рентгенодифракционных наборов, методам решения и уточнения пространственных структур биомакромолекул, способам оценки достоверности полученных данных, методам компьютерного моделирования и конструирования лекарственных препаратов.
Глава 3. Экспериментальная и расчетная часть
Наработка клеточного материала, содержащего ftUPh, выделение и очистка белкового препарата проведены по оригинальной методике, описанной в работах [6,
7].
Кристаллизацию нелигандированного фермента проводили методом «висячей» капли при следующих объемах и концентрациях веществ: противораствор объёмом 400 мкл содержал 100 мМ калий-ацетатного (рН 5.2) буфера и 20% (в объемных долях) PEG 6000; кристаллизационный раствор составлен из 3.5 мкл раствора SVUPh (20%) и 3.5 мкл противораствора [8].
Пригодные для рентгенодифракционного анализа кристаллы комплекса 5YUPh с 2,2'-ангидроуридином были выращены методом сокристаллизации (рис. 1). Противораствор (1 мл) содержал 18% (wh) PEG 4000 (Sigma) в 0.1 М Трис-НС1 буфере, рН 5.2. Кристаллизационный раствор получали смешиванием 3 мкл белка (концентрация 13 мг/мл в 0.05 М Трис-HCl буфере, рН 5.2) с 3 мкл противраствора, 0.5 мкл 10 мМ 2,2'-ангидроуридина [9, 10].
Кристаллы комплекса SVUPh с ANU и ионами фосфата и калия выращены в аналогичных условиях с добавлением к кристаллизационной капле 0.1 мкл 1 мМ КН2Р04 [10].
Рисунок 1. Кристаллы молекулы уридинфосфорилазы, упаковка которых соответствует пространственной группе Р2,212,(а)иКЗ (б).
Состав криорастворов при получении рентгенодифракционных наборов при низкой температуре (100К, жидкий азот) подбирали на основе ПЭГ 400 и глицерина.
Наборы рентгенодифракционных интенсивностей для комплексов 5YUPh с лигандами собраны на белковых станциях (таблица 1) синхротрона DESY (Гамбург, Германия).
Первичная обработка экспериментальных наборов интенсивностей, и получение наборов структурных амплитуд осуществлены в комплексе программ "XDS" [11].
Получение стартовых наборов фазовой составляющей структурных факторов проведено методом молекулярного замещения в комплексе программ Phaser [12]. В качестве стартовой модели во всех случаях использовали структуру .SYUPh при разрешении 1.64 Á (ID PDB: 2I8A).
Структуры фермента 5<UPh уточняли в программных комплексах Phénix [13], CNS [14] и Refmac [15]. В процессе уточнения использовали опции "simulated annealing", "individual_sites", "individual_adp", "bulk solvent modeling", "anisotropic scaling". Стадии уточнения структур чередовались с ручной и полуавтоматической правкой моделей с помощью программы Coot [16, 17]. На конечных этапах уточнения в структурах были локализованы молекулы ингибитора, ионов фосфата и других лигандов. Позиции молекул воды определены в программе Coot (опция «Find waters») с использованием карты электронной плотности с коэффициентами |Fobs|-|Fcaic|. Достоверность структур оценивалась с использованием программ PROCHECK [18], WHAT_CHECK [19], WEB-сервиса MolProbity [20]. Статистические характеристики уточненных кристаллических структур приведены в таблице 2.
Результирующие координаты биомакромолекул и соответствующие им наборы структурных факторов SYUPh были приняты Международным банком белковых структур [http://deposit.pdb.org/validate].
Молекулярный докинг выполнен с использованием модуля Glide программного пакета Maestro (вариант "Extra Prescription" (ХР) с подвижным лигандом и неподвижной мишенью) [21]. Для ранжирования результатов докинга использовали оценочную функцию "Glide Score" [21].
Компьютерный дизайн новых ингибиторов осуществлён с помощью программы CombiGlide [21].
Исследование методом молекулярной динамики осуществлялось в комплексе программ GROMACS [22] с использованием набора силовых полей GROMACS/GMX.. Молекулярно-динамическую симуляцию систем проводили при температуре 310 К с использованием термостата Берендсена при изотропном давлении 101,3 кПа.
Таблица 1. Кристаллографические данные и параметры съемки кристаллов
Параметры Нелигандирован-ный фермент Комплекс с ANU и ионом калия Комплекс с ANU и ионом фосфата Комплекс с ионом фосфата Комплекс с ANU ионом фосфата н ионом калия
Пространственная группа КЗ P2I212I Р212121 P2I2121 P212I21
Параметры элементарной ячейки, Á, град а=150.86; Ь=150.86; с=47.84; a=ß=90 7=120 а=90.37; Ь=125.31; с=135.18; а=р=у=90 а=88.87; Ь=124.05; с= 134.3 8; a=ß=T=90 а=89.60; Ь=124.92; с=134.93; a=ß=y=90 а=88.790; Ь=124.070; с=134.100: а=р=у=90
Число молекул на независимую часть 1/3 1 1 1 1
Белковая станция, детектор XII, MAR CCD 165 мм. Х13, MAR CCD 165 мм. BW6, MAR CCD 235 мм. Х13, MAR CCD 165 мм. Х13, MAR CCD 165 мм.
Длина волны, Á 0.8126 1.050 1.050 0.803 0.803
Область разрешения, Á 20-1.8(1.9-1.8)* 20-2.38 (2.5-2.38)* 30-2.09(2.15-2.09)* 89-1.50(1.60-1.50)* 88.00-1.86(1.87-1.86)*
Общее число рефлексов 143075 (21423)* 227025 (26070)* 269989(18783)* 1381207(107637)* 303063 (4828)*
Число независимых рефлексов 37497 (5638)* 59688 (6801)* 87512(6614)* 216257(31238)* 110180(1827)*
Полнота набора, % 99.6 (99.9)* 95.9 (80.7)* 98.9 (93.0)* 86.30 (74.3)* 88.4 (93.6)*
Среднее значение I/GI 25.23 (6.45) 6.01 (2.73)* 10.04(3.76)* 9.17(1.04)* 10.00 (2.49)*
R-meare» /ó 5.8 (2.6)* 25.1 (61.8)* 12.2 (34.2)* 16.0(88.6)* 9.4 (50.6)*
Rmeas, % 4.3(25.1)* 20.3 (54.3)* 11.1 (41.2)* 15.3(92.9)* 7.7 (41.0)*
*В скобках приведены значения для слоя высокого разрешения.
Таблица 2. Статистические характеристики уточнения кристаллических структур
Параметры Нелига ндированны й фермент Комплекс с А1Ми и ионом калия Комплекс с АКи и ионом фосфата Комплекс с ионом фосфата Комплекс с АРШ, ионом фосфата и ионом калия
Область разрешения, А 18.70-1.80 (1.851.80)* 19.94-2.38 (2.442.38)* 28.75-2.11 (2.202.11)* 19.91-1.50 (1.521.50)* 28.00-1.86(1.91-1.85)*
Срезка набора, с(|Р|) >2 >0 >2 >2 >0
Ут, (А'Юа) 1.96 2.35 2.20 2.11 2.19
Количество растворителя, % 36.70 47.61 44.80 41.11 43.00
Число атомов белка 3567 11010 10937 11142 10965
Число молекул воды 254 374 641 1644 1015
Число атомов лигандов - 106 47 25 63
Ксг^ (%) 16.1 (16.8)* 20.8 (25.4)* 18.1 (21.7)* 16.6 (31.0)* 17.6 (24.8)*
Яггее (%) 20.0 (24.1)* 25.8 (33.9)* 21.9 (27.3)* 21.2 (36.5)* 20.6 (28.0)*
Среднее значение температурного фактора для атомов белка 25.1 34.8 21.0 19.6 19.5
г.ш.э.ё. (связей), А 0.006 0.007 0.007 0.007 0.007
г.т.в.ё. (углов), град 1.042 1.154 1.499 1.094 1.066
Точность определения координат по Луззати/(ОР1), А 0.166/0.115 0.303/0.267 0.222/0.168 0.234/0.098 0.188/0.132
Статистика Рамачандрана:
наиболее благоприятная область 89.9 89.5 88.4 89.6 88.7
разрешенная область 9.8 10.0 11.3 9.9 9.8
частично разрешённая область 0.5 0.4 0.2 0.5 0.5
запрещённая область 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0
Код структуры в РОВ ЗБРБ ЗС74 1У1Я ЗБОО ЗРШР
*В скобках приведены значения для слоя высокого разрешения.
Глава 4. Результаты и обсуждение Кристаллическая упаковка молекул
Упаковка молекул более плотная для кристаллов нелигандированной уридинфосфорилазы, чем для кристаллов комплексов уридинфосфорилазы с лигандами (таблица 2). Межмолекулярные контакты представлены водородными связями и ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями.
Кристаллы комплексов уридинфосфорилазы с лигандами, пространственная группа которых Р2\2\2\, очень похожи как по параметрам элементарной ячейки, так и
по кристаллической укладке. На независимую часть ячейки приходится гексамер уридинфосфорилазы (рис.2). I
Рисунок 2. Четвертичная структура комплекса молекулы ЛиРИ с 2,2'-ангидроуридином (АЖГ), ионами фосфата (Р04") и калия (К+); последние ; обозначены сферами большего радиуса. ГО РОВ: ЗР\УР. Буквами А, В, С, Е, Р обозначены субъединицы 5*1! РЬ.
Общие сведения о структуре молекул ЗШРЬ и /ШРЫ
Гексамерная молекула ЛиРИ (рис. 2), образованная шестью гомологичными субъединицами молекулярной массой 27 кБа каждая, укладка которых в молекуле соответствует точечной группе симметрии ЬзЗЬ2, может быть аппроксимирована тороидом. Высота молекулы около 54, а наружный диаметр В центре
молекулы находится канал диаметром 1 (к, который расширяется до 19А на её периферии [23].
Рисунок 3. Гомодимер ВБ гексамерной молекулы 5ШРЬ (ГО РГ)В ЗР\УР). Показаны положения иона калия (К+) в межмономерном пространстве, иона фосфата (Р04"3) и ингибитора (АЖГ).
;
Мономер молекулы ÄUPh, полипептидная цепочка которого состоит из 253 аминокислотных остатков, относится к нй(|<й§лков с архитектурой трехслойного a/ß/a сэндвича. В центральной области мономера находится смешанный ß -лист, окруженный спиралями. Трёхмерная структура содержит протяженные петли.
Четвертичная структура i/UPhl [24], в отличие от бактериальных SrtJPh и EcVPh [25], представляет собой гомодимер. Минимально необходимой для функционирования структурной единицей (рис. 3) в исследованных на сегодняшний момент уридинфосфорилазах эукариот и прокариот является гомодимер [6, 23, 24,26, 27].
Согласно исследованию стабильности и энергияи диссоциации 4 Gdis) олигомерных молекулярных комплексов структур ÄUPh и HUPhl, проведенных программой PISA (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot int/pistart.htmD [28], существование димера ÄUPh, мономера, тетрамера и гексамера HUPhl в растворе представляется сомнительным (табл. 3). Тем самым независимым методом показано, что в условиях водного раствора молекулы SrtJPh находятся в виде гексамера, а ffUPhl в виде димера.
Таблица 3. Интегральные характеристики поверхности макромолекул [28]
Число Стабильность молекулы Свободная Энергия
субъединиц в растворе энергия диссоциации,
сольватации, Af'dissi
ккал/моль
ккал/моль
2 да -29.8 29.3
4 нет - -
6 условно -112.8 4.3
6 (ftUPh) да -102.8 45.6
Активный центр
На каждый гомодимер (рис. 3) молекулы 5ШРЬ (рис. 2) приходится два структурно идентичных активных центра, составленных аминокислотными остатками обеих субъединиц (рис. 4). Активный центр состоит из фосфат- и нуклеозид-связывающего сайтов. Нуклеозид-связывающий сайт состоит, в свою очередь, из двух частей, остатки которых связывают углеводную и урацильную компоненту лиганда.
His8/D
PO, АгдЗО/В
Phe7/D4 Gln166/B
Arg168fB
■hr94/B
Ile220/B
Glu227/B
1221/B
Рисунок 4. Ингибитор (2,2'-ангидроуридин) и ион фосфата в активном центре (ГО
РОВ: ЗР\УР). Сплошными линиями показаны водородные связи. }
Урацил-связывающий сайт
Урацил-связывающий сайт ÄUPh (ID PDB: 1Y1R, ЗС74, 3FWP) формируется аминокислотными остатками Glnl66/B, Argl68/B, Arg223/B, Gly96/B, Phel62/B, Ile220/B, Val221/B. Ключевыми во взаимодействии с урацильными компонентами ингибитора являются Glnl66/B, Argl68/B и Arg223/B. В исследованных бактериальных уридинфосфорилазах эти аминокислотные остатки консервативны и, скорее всего, играют основную роль в узнавании пиримидинового кольца субстрата [23, 25, 26]. В урацил-связыающем сайте атом 04 урацильного фрагмента ингибитора ANU формирует водородные связи с теми же атомами, что и атом 04 ациклоуридинов (BAU, BBAU, ВВВА, PTAU, PSAU) [29] и субстратов [27] в £cUPh, | а именно: с Argl68/B (NHl_Argl68/B - 3.24 Ä - 04_ANU; NH2_Argl68/B - 2.82 Ä -04_ANU) и через молекулы воды с боковой группой Arg223/B (04_ANU - 2.60 Ä -НОН - 3.11 Ä - NHl_Arg 223/B). В отличие от ациклоуридинов (BAU, PTAU и др.) атом N3 2,2'-ангидроуридина оказался не связанным водородной связью с атомом ОЕ1 боковой цепи Gin 166, что объясняется другим по сравнению с ациклоуридинами [29] положением пиримидинового кольца в молекуле 2,2'-ангидроуридина из-за фиксации пиримидинового кольца в син-конформации. Также отсутствует водородная связь между атомом 02 2,2'-ангидроуридина и NE2 боковой цепи : Gin 166. Однако атом OEl_Glnl66/B связан с атомом 04 ингибитора 2,2'-ангидроуридина (OEl_Glnl66/B - 3.05 А - 04_ANU). Кроме того, наблюдается водородная связь между атомом NE2 этого аминокислотного остатка и №-атомом 2,2'-ангидроуридина (NE2_Glnl66/B - 3.39 А - N3_ANU).
При попарном сравнении аминокислотных остатков урацил-связывающих сайтов нелигандированных #UPhI [24] и SVUPh показана высокая степень | гомологии. Об этом свидетельствуют среднеквадратичные отклонения (R.M.S.D.) при попарном сравнении атомов основной цепи: Gln217/A/#UPhI Gln/166/B/ÄUPh - R.M.S.D=0.18 Ä; Arg219/A/#UPhI н> Argl68/B/ÄUPh -
R.M.S.D=0.56 Ä; Arg275/A/MJPhI -> Arg223/B/ÄUPh -R.M.S.D=0.43 АПри попарном сравнении координат атомов боковых цепей: Gln217/A///UPhI —> Gln/166/B/ÄUPh - R.M.S.D=0.47 Ä; Arg219/A/tfUPhI -> Argl68/B/SrtJPh -R.M.S.D=0.75 Ä; Arg275/A/tfUPhI Arg223/B/ÄUPh - R.M.S.D=0.40 А (приведены R.M.S.D., полученные при сравнении SrtJPh (3FWP) с //UPhI).
Гидрофобное окружение пиримидинового кольца ANU в ÄUPh формируется аминокислотными остатками Gly96/B, Phel62/B, Ile220/B, Val221/B (рис. 4). Из них в комплексах SVUPh (ID PDB: 1Y1R, ЗС74, 3FWP) гидрофобные остатки - Ие220/В и Val221/B - сосредоточены около 5-го положения пиримидинового кольца ANU. Гидрофобное окружение пиримидинового кольца ингибитора в //UPhI представлено остатками Glyl43/A, Phe213/A, Leu272/A, Leu273/A.
В активном центре субъединицы В ÄUPh (ID PDB: 3FWP) лигандированным ANU боковая цепь Phe7/D из соседнего мономера закрывает доступ растворителя к урацил-связывающему сайту. Положение фенильного кольца Phe7 в комплексах уридинфосфорилазы из iSYUPh (1Y1R, ЗС74, 3FWP) с ANU по сравнению с его положением в комплексах £cUPh с BAU и положением Tyr35/D (аналога остатка Phe7) в комплексе уридинфосфорилазы человека //UPhI (Tyr35/D) с BAU [24] отличается на 30 градусов. По нашему мнению, это объясняется ван-дер-ваальсовым взаимодействием боковых групп Phe7 (EcUPh) и Tyr35 (//UPhI) с атомами фенильного кольца BAU.
Рибозо-связывающий сайт
Рибозо-связывающий сайт субъединицы В гомодимера BD SYUPh (ID PDB: 1Y1R, 3C74, 3FWP) формируется аминокислотными остатками Glul98/B, His8/D, Thr94/B, Metl97/B, Участок взаимодействия с рибозной компонентой ANU в SrtJPh (ID PDB: 1Y1R, 3C74, 3FWP) находится в промежутке между урацил- и фосфат-связывающими центрами фермента (рис. 4). З'-Гидроксил рибозного компонента образует водородные связи с боковой группой Glul98/B (OE2_Glul98/B - 2.42 Ä -03'_ANU; OEl_Glul98/B - 3.03 Ä - 03'_ANU) в отличие от структур комплексов £cUPh и //UPhI с ациклоуридинами, где аналогичный остаток связан с молекулами воды. His8/DASYUPh из соседнего мономера образует водородную связь с 5'-гидроксилом рибозного компонента ANU (NE2_His8/D/ SfUPh - 2.68 Ä - 05'_ANU), подобно структурам комплексов /icUPh с ациклоуридинами [29]. Кроме того, гидроксильная группа боковой цепи остатка Thr94/B/ftUPh, помимо водородной связи с атомами фосфат-иона, образует водородную связь с атомом 04' углеводного компонента ингибитора (OGl_Thr/94B - 3.03 Ä - 04'_ANU).
Атом серы Metl97/B в &UPh (ID PDB: 1Y1R, 3C74, 3FWP) стабилизирует положение рибозной компоненты ANU посредством ван-дер-ваальсовых взаимодействий с атомами фуранозного кольца (СГ-С2'-СЗ'-С4'-04') (рис 4). Из этих данных следует, что рибозная компонента ANU связывается подобно рибозной компоненте субстратов данного фермента, в отличие от ациклоуридиновых ингибиторов.
В структуре комплекса iSrtJPh с ANU (ID PDB: ЗС74) по сравнению со структурой комплекса 5iUPh с ANU, ионами фосфата и калия (ID PDB: 3FWP) иначе ориентирован боковой радикал Argl68. Смещения радикала связаны, скорее всего, с
наличием водородной связи с атомом 04_ANU в субъединицах гомодимера BD из структуры ЗС74 (расстояния 04_ANU...NH2_Argl68 равны 3.6&и 4.044 , соответственно в В- и D-субъединице). Кроме того, расстояние 02'_ANU...0Gl_Thr94 в S/UPh (ID PBD: ЗС74) увеличено с 3.38 Ä до 4.23 Ä по сравнению со структурой SYUPh (3FWP), что связано, по-видимому, с влиянием иона фосфата на положение этого аминокислотного остатка.
Фосфат-связывающий сайт
Рассмотрим активный центр В-субъединицы гомодимера BD SiUPh (3FWP) (рис. 3,4), в сайте связывания которого находятся одновременно молекула субстрата РО43' (в фосфат-связывающим сайте) и молекула ингибитора ANU (в нуклеозид-связывающем сайте).
Ключевыми аминокислотными остатками фосфат-связывающего сайта В-центра являются Arg30/B, Arg91/B из В-субъединицы и Arg48/D - из D-субъединицы. С каждым из этих аминокислотных остатков атомы кислорода фосфатного иона образуют от одной до двух водородных связей (рис. 4). Кроме этого, во взаимодействии с ионом фосфата принимают участие гидроксильная атом кислорода боковой цепи Thr94/B и атом азота основной цепи NH_Gly26/B. Атом 03 иона фосфата связан водородной связью длиною 2.68 Ä с 03'_ANU.
Аминокислотные остатки аргинина связаны с ионом фосфата за счет сильного электростатического взаимодействия между положительно заряженными аминогруппами боковых цепей и отрицательно заряженными атомами кислорода иона фосфата.
По сравнению с активным центром субъединицы С той же молекулы, где ион фосфата отсутствует, положение боковой группы Arg30/B по сравнению с Arg30/C значительно изменилось (R.M.S.D=4Ä)Ji Менее значительно поменялось положение атомов боковых групп других аминокислотных остатков: Arg91/B (R.M.S.D=1.60 Ä) по сравнению с Arg91/C; Arg48/D (R.M.S.D=1.95Ä) по сравнению с Arg48/E. Атомы основной цепи Arg30/B (R.M.S.D=0.31 Ä), Arg91/B (RM.S.D.= 0.24А)и Arg48/D (R.M.S.D=0.11 А)практически не поменяли свое положение по сравнению с соответствующими аминокислотными остатками в нелигандированном активном центре субъединицы С SVUPh (3FWP).
Боковая цепь Arg64/A в структуре комплекса /ГОРЫ с BAU и фосфатом не связана с ионом фосфата. Отличие объясняется влиянием остатка Gln296///UPhI, с которым образует водородную связь Arg64 (NHl_Arg64/A///UPhI - 2.96 Ä -OEl_Gln296/A///UPhI). Аминокислотный остаток Gln296 по свойствам и положению боковой группы не имеет аналогов в структуре SrtJPh. Однако можно предположить, что у Arg64///UPhI имеется возможность связать ион фосфата при условии образования ротамера, аналогичного ротамеру Arg30/iSYUPh.
Роль петли L9 в связывании ингибитора
Особую роль в структуре SrtJPh играет петля L9, образованная аминокислотными остатками с Arg 223 по Thr 233 (рис. 5), которая открывает или закрывает доступ лигандов в активный центр.
«Закрытая» конформация петли в субъединице В структуры Л11РЬ (ГО РОВ ЗРАФ) фиксируется водородными связями и солевыми мостиками, которые образует С1и227/В с Аг§168/В (рис. 5). Аналогичное положение остатка 01и227 при «закрытой» конформации петли активного центра было отмечено также и для £сиРЬ [27].
Рисунок 5. Система водородных связей, фиксирующая «закрытую» конформацию петли Ь9 активного центра в субъединице В (Л1ГР11, ГО РОВ: ЗР\¥Р). Пунктирными линиями обозначены водородные связи.
При «открытом» состоянии активного центра, свободного от ингибитора и иона фосфата, например, в субъединице А той же структуры ÄUPh (ID PDB: 3FWP), остаток Glu227/A экспонирован в растворитель и взаимодействует с молекулами воды. Можно предположить, что петля действует как ворота, впускающие (выпускающие) лиганды к сайтам связывания. Изменение положения петли в структуре комплекса фермента с ионом фосфата и ANU (ID PDB: 3FWP) индуцируется взаимодействием ингибитора с аминокислотными остатками всех трех сайтов связывания активного центра одновременно. Аналогичная ситуация наблюдается при связывании ZicUPh как с ациклорибонуклеозидными ингибиторами и ионом фосфата, так и с некоторыми субстратами и псевдосубстратами [27, 29].
В #UPhI аналогичная петля L9 образована остатками с Arg 275 по Pro 284 [24]. В структуре комплекса //UPh [24] с BAU и ионом фосфата петля L9 находится в закрытой конформации. Боковая цепь Asp279, соответствующая боковой цепи Glu227 в SWJPh, в #UPh образует водородные связи с остатками белковой молекулы [24].
Ион калия в структурах комплексов SrtJPh с ингибитором.
В исследованных структурах >S7UPh, £cUPh [10, 27, 30], содержащих ион калия, данный ион находится в межмономерной области каждого гомодимера гексамерной молекулы в месте расположения её локальной оси симметрии второго порядка молекулы.
Сайты связывания iSVUPh в присутствии иона К+ в молекуле более доступны для молекул субстрата или ингибитора по сравнению с нелигандированным ферментом, не содержащим ион К+.[10, 31]. Непосредственного влияния иона калия на структуру сайтов связывания ANU не выявлено.
Отметим, что в нелигандированной структуре Z/UPhl и её комплексе с BAU, решенных методом рентгеноструктурного анализа [24], ион калия в межмономерной области авторами публикации [24] не локализован.
Описанные выше результаты рентгеноструктурного анализа могут быть расширены исследованиями подвижности отдельных фрагментов биомакромолекул, используя метод молекулярной динамики (МД).
Согласно графику зависимости среднеквадратичных флуктуаций (Я.М.З.Р.) положений атомов основной цепи, наблюдаются локальные изменения подвижности остатков петли Ь9 активного центра и остатков, координирующих ион калия на границе мономеров димера 5У11Р11 (рис. 6) в зависимости от присутствия иона калия
Рисунок 6. График зависимости средних
флуктуаций (Я.М.З.Р.)
координат атомов основной цепи аминокислотных
остатков от номера остатка для димера 5ШРЬ: черная линия - нелигандированный фермент, красная - комплекс ЛиРЬ с ионом калия Применена последовательная нумерация остатков для димеров. Стрелками показаны № аминокислотного остатка пики флуктуаций атомов
основной цепи петли Ь9.
субъединица 1 субъединица 2
Агд64/А
Агд48/[Э Агд138/А
Агд91/Б
Н|536/В
[■<31п217\, !|п166/вИ
Агд219« Агд168/а^;
1еи273/А Уа1221/В
Решение структуры комплекса НиРМ с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата методом молекулярного докинга
Рисунок 7. Наложение структур активных центров комплексов 5ШРИ и Н11РМ с АИи и ионом фосфата [32]. Аминокислотные остатки активного центра ЛиРИ и атомы ингибитора в нём окрашены коричневым цветом, а для /ШРЫ - синим цветом.
Протокол молекулярного
докинга был отработан на комплексе ЛиРЬ с АЬШ, ионами фосфата и конформация А1Чи в смоделированном комплексе
калия. Положение
соответствовали положению и конформации АКи в кристаллической структуре
8ШРИ (К.М.Б.О.дци ~ 0.5 А). Проведен докинг А1Ми в активный центр А-субъединицы гомодимера АВ ЯиРЫ. АИи в комплексе с ЯиРЫ образует следующие воодородные связи с аминокислотными остатками сайтов связывания: 04_АШ - 2.63 А - Ш2_А^219/А/ЯиРМ; 05'_АШ - 2.91 А - ЫЕ2Шз36/В///иРЫ,.
: 04_АШ - 2.63 А - ЫН2_Аг£219/А/ЯиРЫ, Ы7_АЫи - 3.52 А - 0Е1_01п217/А/ ЯиРМ, 04_АЫи - 3.31 А - НОН - 3.11 А - Ш1_А^275/А/ЯиРМ. В результате установлено, что аминокислотные остатки активного центра ЛиРЬ и ЯиРИ, образующие водородные связи с ингибитором, идентичны (рис. 7)
Различия аминокислотных остатков гидрофобного «кармана» активного центра ЛиРЬ и ЯиРЬ (Рго229/ЛиРЬ 11е226/ЯиРЫ, Ие220/5ШРЬ Ьеи257/ЯиРЫ, Уа1221 /ЛиРЬ —> Ьеи258/ЯиРЫ) приводят к изменению ван-дер-ваальсовой поверхности этого «кармана». В результате этого происходит смещение А1Чи в смоделированном комплексе Я11РЫ по сравнению со структурой комплекса ЛиРЬ с АЖГ, полученной методом рентгеноструктурного анализа (рис. 7).
Конструирование нового ингибитора уридинфосфорилазы класса 2,2'-ангидроуридина, замещённого в 5-м положении урацильного кольца
На основании результатов рентгеноструктурного анализа комплекса ЛиРЬ с 2,2'-ангидроуридином и ионом Р04"3 можно предположить, что возможный заместитель пятого положения пиримидинового кольца АЫи состоит из короткой гидрофобной цепочки, которая будет взаимодействовать с гидрофобным «карманом» около атома С5 пиримидинового кольца и ароматической группы, которая будет формировать стэкинг взаимодействия с остатками РЬе162 и РЬе7 соседнего мономера.
(а) (б)
Рисунок 8. Сконструированный ингибитор в активном центре ЛиРИ (а) и сконструированные ингибиторы с разным числом звеньев насыщенной углеводородной цепочки в активном центре Я11РЫ (б).
Результаты молекулярного дизайна при «открытой» конформации активного центра ЛиРЬ (табл. 4, рис. 8а.) и ЯиРЫ (табл. 4, рис. 86) согласуются с предположениями относительно связывания ациклоуридинов, имеющих фенильный
заместитель в 5 положении урацильного кольца (BAU, BBAU, ВВВА, PTAU, PSAU), высказанными на основании рентгеноструктурного анализа [29]. Имеющаяся разница в сконструированных заместителях (табл. 4) обусловлена, по всей видимости, разницей в конформации и аминокислотном составе петли (остатки 223-233/ÄUPh, 275-284///UPhI), а также различием в положении и типе боковой группы Phe7/SrtJPh(Tyr3 5/tfUPhI).
Наблюдаются различия во взаимодействии групп-заместителей сконструированных ингибиторов с аминокислотными остатками карманов активного центра в рассматриваемых структурах. Для имидазольного кольца ингибитора SrtJPh характерно стэкинг-взаимодействие с Phe7/'ÄUPh, которое значительно меньше выражено при рассмотрении контактов пиридинового кольца ингибитора #UPhI с Tyr35///UPhI. В свою очередь для атома азота пиридиновой группы сконструированного ингибитора //UPhI с заместителем №1 (табл. 4) наблюдается водородная связь с атомом ND1 His36/B/#UPhI. !
Таблица 4. Выборка оптимальных заместителей 5-го положения ANU.
№ п/п Заместители урацильного кольца ANU, &UPh GlideScore Заместители урацильного кольца ANU, HUPhI GlideScore
1 NK Ц/ -9.02 -10.84
2 -8.92 -10.49
3 -8.83 "X) -10.42
4 -8.81 -10.42
5 -8.68 ^jO -10.34
6 -8.67 -10.11
Конструирование нового ингибиторауридинфосфорилазы класса 2,2'-ангидроуридина, замещённого в 6-м положении урацильного кольца
Был проведен молекулярный дизайн заместителя 6-ого положения урацильного кольца. В результате была сформирована выборка заместителей 6-го положения АЖ1, оптимальных для связывания с £ШРЬ и /ШРЫ. Первые шесть заместителей приведены в таблице 5.
Выявлены следующие закономерности в структуре заместителя. Главной функциональной группой является либо бензольное, либо пиридиновое кольцо, вне зависимости от источника уридинфосфорилазы. Различия структур наблюдаются в количестве звеньев оптимальной углеводородной цепочки (табл. 5). Для уридинфосфорилазы человека характерны заместители 6-ого положения
ароматического кольца ANU с числом атомов большим, чем для уридинфосфорилазы S/UPh (табл. 5).
Таблица 5. Выборка оптимальных заместителей 6-го положения ANU._
№ Формула заместителя GldeScore Формула заместителя GldeScore
п/п урацильного кольца ANU, SfUPh, урацильного кольца ANU, tfUPhl
1 -7.42 -7.64
2 0 -7.21 -7.12
3 —о -6.31 -7.11
4 —G -6.14 ^Xj -7.05
5 — -6.04 -6.78
6 -5.88 -6.77
Заключение
1) Основной эффект ингибирования уридинфосфорилазы АЖГ заключается в установлении связей АЫи с аминокислотными остатками нуклеозид-связывающего сайта ЛиРЬ. Как показано нами выше, определяющую роль в связывании АЫи, так же как и субстратов играет связь с рибозным компонентом ингибитора, который располагается в активном центре. Остатки ТЬг94/В, Н1з8/Б, в1и198/В (рис. 4, 9) образуют водородные связи с атомами ингибитора, аналогичные связям с рибозным компонентом уридина. Кроме того, в связывании 2,2'-ангидроуридина принимает
участие Аг§166/В, образуя контакт с атомом 04 рассматриваемого ингибитора.
Рисунок 9. Сравнение положений А1Ми (оранжевый) и уридина (красный) по отношению к ключевым остаткам нуклеозид-связывающего сайта активного центра ЛиРЬ. Сплошными линиями показаны водородные связи.
GIU19S/B
В случае с уридином остатки С1п166/5ШРЬ и Аг£168/5ШРЬ в стабилизируют обмен электронами между атомом 04'-рибозы и атомами пиримидинового кольца. В результате ион оксокарбения стабилизируется отрицательно заряженным ионом фосфата акте ферментативной реакции [27]. Ион фосфата связывается наа -стороне рибозного кольца, где его расположение позволяет участвовать в Бм1 нуклеофильной атаке СГ- позиции [27].
По сравнению с уридином в случае связывания А>Ш И-гликозидная связь остается стабильной как за счет фиксации пиримидинового кольца в син-положении атомом 02, так и за счет иного, чем в случае с субстратами уридинфосфорилазы, взаимного расположения урацильного кольца и остатков С1и168 и А^166 (рис. 9).
Следует учитывать и то, что молекула А1*Ш имеет меньше вращательных степеней свободы, чем уридин. Это приводит к уменьшению энтропийной составляющей свободной энергии комплекса фермент-ингибитор. При практически неизменной энтальпии комплексов, определяемой связями фермент-ингибитор, эффект уменьшения энтропийной составляющей положительно сказывается на «времени жизни» комплекса фермент-ингибитор и вероятности его самопроизвольного распада.
Исходя из аналогичности пространственной организации активных центров ЛиРЬ и /ШРЫ, можно предположить и идентичность механизмов ингибирования АШ ЛиРЬиЛиРЫ.
Сгенерированы структуры предполагаемых лекарственных препаратов -потенциальных высокоселективных ингибиторов уридинфосфорилаз. Они являются 5- или 6-замещенными 2,2'-ангидроуридинами, где в качестве заместителя выступает алифатическая насыщенная цепочка с ароматической группой на конце. Для 5-замещенных 2,2'-ангидроуридинов имеются отличия в предпочтительном типе ароматической группы модельного ингибитора /ШРЫ (пиридиновый цикл) и ЛиРЬ (имидазольный цикл), что объясняется различным аминокислотным окружением активного центра фосфорилаз из разных источников при высокой гомологии сайтов связывания. Для 6-замещённых 2,2'-ангидроуридинов имеются лишь отличия в длине углеводородной цепочки оптимального заместителя.
Основные результаты и выводы.
1) Методом рентгеноструктурного анализа впервые установлены с высокой достоверностью и приняты Международным банком белковых структур (РОВ) структуры при атомном разрешении следующих биомакромолекул :
- нелигандированной 5ШРЬ при разрешении 1.80 А (ГО РБВ ЗБРБ);
- комплекса Л1)РЬ с 2,2'-ангидроуридином (А1Чи) и ионом калия при разрешении 2.38 А (ГО РБВ ЗС74);
- комплекса ЛиРЬ с АЖГ и ионом фосфата при разрешении 2.11 А (1У1Я);
- комплекса БШРЬ с А>Ги, ионами фосфата и калия при разрешении 1.86 А (ГО РБВ ЗР\¥Р).
- комплекса &иРЬ с ионом фосфата при разрешении 1.5 А (ЗББО);
Методом молекулярного моделирования определена структура комплекса
уридинфосфорилазы человека с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата.
2) Впервые выявлено место и характер связывания 2,2'-ангидроуридина с S/UPh (ферментом-мишенью). Взаимодействия между ферментом и ингибитором осуществляются посредством водородных связей, ван-дер-ваальсовых контактов и стэкинг-взаимодействий. Методом рентгеноструктурного анализа показано, что в комплексе AUPh с ANU и ионом фосфата состояние петли L9 активного центра предпочтительно «закрытое», в то время как для комплекса только с ANU наблюдаются как «закрытое», так и «промежуточное» состояния. Показано, что 2,2'-ангидроуридин является конкурентным ингибитором S/UPh и его действие обратимо.
3) Установлено, что четвертичной структурой комплекса //UPIiI с ANU и ионом фосфата является гомодимер. Выявлены аминокислотные остатки //UPhI, связывающие ингибитор. Показаны различия ферментов //UPhI и SfUPh в гидрофобной области сайта, связывающего урацильный компонент ANU. Механизм ингибирования //UPhI и SiUPh 2,2'-ангидроуридином аналогичен. Полученные данные можно использовать при дизайне перспективных высокоаффинных ингибиторов уридинфосфорилаз из бактерий и человека, являющихся химиотерапевтическими и противомикробными препаратами.
4) Методом молекулярной динамики было установлено влияние иона калия на структурную стабилизацию молекулы SÏUPh. Особенно подвержены изменениям аминокислотные остатки петли L9 активного центра и начального участка спирали Н8. Отмечено увеличение плотности контактов в области межсубъединичного взаимодействия в димерах в присутствии иона калия. Методом молекулярной динамики показано, что петля L9 в S/UPh и //UPhI меняет свою конформацию и положение.
5) Впервые проведено конструирование in silico молекул высокоаффинных ингибиторов как для #UPhI, так и для SïUPh на основе 2,2'-ангидроуридина. Они являются 5- или 6-замещенными ANU, где в качестве заместителя выступает алифатическая насыщенная цепочка с ароматической группой на конце. Для 5-замещенных 2,2'-ангидроуридинов имеются отличия в предпочтительном типе ароматической группы ингибитора //UPhI (пиридиновый цикл) и SfUPh (имидазольный цикл), что объясняется различным аминокислотным окружением активного центра фосфорилаз из разных источников. Для 6-замещённых 2,2'-ангидроуридинов имеются отличия в длине углеводородной цепочки оптимального заместителя.
Список публикаций в рецензируемых журналах по теме диссертации:
1) А.А.Лашков, Н.Е.Жухлистова, С.Е.Сотниченко, А.Г.Габдулхаков, А.М.Михайлов. Структурная основа механизма ингибирования уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium. Кристаллография, 2010, том 55, №1, стр. 1183-1199.
2) A.A.Lashkov, N.E.Zhukhlistova, A.G. Gabdoulkhakov, A.A.Shtil, R.G, Efremov, C.Betzel, A.M.Mikhailov. The X-ray structure of Salmonella typhimurium uridine nucleoside phosphorylase complexed with 2,2>-anhydrouridine, phosphate and
potassium ions at 1.86 A resolution. Acta Crystallographica Section D. Biological Crystallography. 2010, 66(Pt 1), pp.51-60.
3) А.А.Лашков, Н.Е.Жухлистова, А.Г.Габдулхаков, А.М.Михайлов. Сравнительный анализ пространственный структуры гомодимеров уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium в нелигандированном состоянии и в комплексе с ионом калия. Кристаллография , 2009, том 54, №2, стр. 291-302.
4) A.A.Lashkov, A.G.Gabdoulkhakov, A.A.Shtil, A.M.Mikhailov. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of Salmonella typhimurium uridine phosphorylase complexed with 5-fluorouracil. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystallization Communicatios. 2009, F65, pp. 601-603.
5) В.И.Тимофеев, Б.Ф.Павлюк, А.А.Лашков, Т.А.Серёгина, А.Г.Габдулхаков, Б.К.Вайнштейн и А.М.Михайлов. Строение гомодимера молекулы уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium в нативном состоянии при разрешении 1.9 А. Кристаллография, 2007, том 52, №6, стр. 1117-1124.
6) V.I.Timofeev, A.A.Lashkov, A.G.Gabdoulkhakov, B.Ph.Pavlyuk, G.S.Kachalova, C.Betzel, E.Yu.Morgunova, N.E.Zhukhlistova, A.M.Mikhailov. Isolation, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Salmonella typhimurium uridine phosphorylase crystallized with 2,2'-anhydrouridine. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystallixation Communications. 2007, F63, pp. 852-854.
7) M.V.Dontsova, A.G.Gabdoulkhakov, O.K.Molchan, A.A.Lashkov, M.B.Garber, A.S.Mironov, N.E.Zhukhlistiva, E.Yu.Morgunova, W.Voelter, Ch.Betzel, Ya.Ahang, S.E.Ealick A.M.Mikhailov. Preliminary investigation of the three-dimensional structure of Salmonella typhimurium uridine phosphorylase in the crystalline state. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystallization Communications. 2005, F61, pp. 337-340.
Список тезисов конференций:
1) Лашков А.А., Донцова М.В., Гадбдулхаков А.Г. и Михайлов A.M. Исследование структурной организации активных центров уридинфосфорилазы S.typhimurium по данным рентгеноструктурного анализа. // V Национальная конференция РСНЭ НАНО - 2005. Москва, 14-19 ноября 2005 г. Сб. тезисов. С.109.
2) Тимофеев В.И., Лашков А.А., Донцова М.В., Гадбдулхаков А.Г. и Михайлов A.M. Исследование структурной организации активных центров уридинфосфорилазы S.typhimurium в нативном состоянии по данным рентгеноструктурного анализа. // V Национальная конференция РСНЭ НАНО -2005. Москва, 14-19 ноября 2005г. Сб. тезисов. С.142.
3) Лашков А.А., Тимофеев В.И., Павлюк Б.Ф. и Михайлов A.M. Рентгеноструктурное исследование комплексов уридинфосфорилазы S.typhimurium с ингибитором, ионом фосфата и ионом калия. // VI Национальная конференция РСНЭ НАНО- 2007. Москва, 12-17 ноября 2007г. Сб. тезисов. С.128.
4) Лашков А.А., Гадбдулхаков А.Г., Жухлистова Н.Е., Штиль А.А. и Михайлов A.M. Кристализация комплекса белка-мишени уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium с противораковым лекарственным препаратом 5-фторурацилом. // VIII Национальная конференция по росту кристаллов. Москва, 17-21 ноября 2008г. Сб. тезисов. С.369.
5) Лашков А.А., Жухлистова Н.Е., Штиль А.А. и Михайлов A.M. Атомная структура наноразмерного комплекса белка-мишени уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium с противораковым лекарственным препаратом 5-фторурацилом.// Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнологии в онкологии». Москва, б декабря 2008г. Сб. тезисов. С. 152.
6) Лашков А.А., Пырков Т.В., Михайлов A.M., Ефремов Р.Г. Структурное исследование комплексов уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium и компьютерный дизайн эффективных ингибиторов.// XXI зимняя молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва, 9-11 2009г. Сб. тезисов. С.34.
7) Лашков А.А., Жухлистова Н.Е., Ефремов Р.Г. и Михайлов A.M. Структура комплексов человеческой и бактериальной уридинфосфорилаз с ингибитором 2,2'- ангидроуридином.// VII- Национальная конференция РСНЭ-НБИК 2009. Москва, 16-21 ноября 2009г. Сб. тезисов. С.38.
8) Жухлистова Н.Е., Лашков А.А., Михайлов A.M. Особенности пространственного строения активного центра уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium в кристаллических комплексах с ингибитором и (или) субстратом.// VII-Национальная конференция РСНЭ-НБИК 2009. Москва, 16-21 ноября 2009г. Сб. тезисов. С.77.
Список цитируемой литературы:
1. Iigo, М., Nishikata, К., Nakajima, Y., Szinai, I., Veres, Z., Szabolcs, A. & De Clercq, E., Differential effects of 2,2'-anhydro-5-ethyluridine, a uridine phosphorylase inhibitor, on the antitumor activity of 5-fluorouridine and 5-fluoro-2'-deoxyuridine. Biochem Pharmacol, 1990. 39(7): p. 1247-53.
2. el Kouni, M. H., Naguib, F. N., Niedzwicki, J. G., Iltzsch, M. H. & Cha, S., Uridine phosphorylase from Schistosoma mansoni. J Biol Chem, 1988. 263(13): p. 6081-6.
3. Jimenez, В. M., Kranz, P., Lee, C. S., Gero, A. M. & O'SuIlivan, W. J., Inhibition of uridine phosphorylase from Giardia lamblia by pyrimidine analogs. Biochem Pharmacol, 1989. 38(21): p. 3785-9.
4. Lee, C. S., Jimenez, В. M. & O'SuIlivan, W. J., Purification and characterization of uridine (thymidine) phosphorylase from Giardia lamblia. Mol Biochem Parasitol, 1988.30(3): p. 271-7.
5. Choi, J. W., Shin, C. Y., Choi, M. S., Yoon, S. Y., Ryu, J. H„ Lee, J. C., Kim, W. K., El Kouni, M. H. & Ко, К. H., Uridine protects cortical neurons from glucose deprivation-induced death: possible role of uridine phosphorylase. J Neurotrauma, 2008. 25(6): p. 695-707.
6. Dontsova, M. V., Savochkina, Y. A., Gabdoulkhakov, A. G., Baidakov, S. N., Lyashenko, A. V., Zolotukhina, M., Errais Lopes, L., Garber, M. В., Morgunova, E. Y., Nikonov, S. V., Mironov, A. S., Ealick, S. E. & Mikhailov, A. b. M., Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of uridine phosphorylase from Salmonella typhimurium. Acta Crystallographica Section D, 2004. 60(4): p. 709-711.
7. Molchan, О. К., Dmitrieva, N. A., Romanova, D. V., Lopes, L. E., Debabov, V. G. & Mironov, A. S., Isolation and initial characterization of the uridine phosphorylase from Salmonella typhimurium. Biochemistry (Mosc), 1998. 63(2): p. 195-9.
8. Тимофеев, В. И., Павлюк, Б. Ф., Лашков, А. А., Серёгина, Т. А., Габдулхаков, А. Г., Вайнштейн, Б. К. & Михайов, А. М., Строение гомодимера молекулы уридиифосфоршазы из Salmonella typhimurium в нативном состоянии при разрешении 1.9 А. Кристаллография, 2007. 52(6): р. 1117-1124.
9. Timofeev, V. I., Lashkov, A. A., Gabdoulkhakov, A. G„ Pavlyuk, В. P., Kachalova, G. S„ Betzel, С., Morgunova, Е. Y., Zhukhlistova, N. E. & Mikhailov, A. M„ Isolation, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Salmonella typhimurium uridine phosphorylase crystallized with 2,2'-anhydrouridine. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2007. 63(Pt 10): p. 852-4.
10. Лашков, А. А., Жухлистова, H. E., Габдулхаков, А. Г. & Михайлов, A. M., Сравнительный анализ пространственный структуры гомодимеров уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium в нелигандированном состоянии и в комплексе с ионом катя. Кристаллография, 2009. 54(2): р. 291-302.
11. Kabsch, W., Integration, scaling, space-group assignment and post refinement. XDS., in International Tables for Crystallography, Rossmann, M. G. & Arnold, E. F., Editors. 2001, Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.
12. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W„ Adams, P. D., Winn, M. D„ Storoni, L. C. & Read, R. J., Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography, 2007. 40(4): p. 658-674.
13. Adams, P. D., Afonine, P. V., Bunkoczi, G„ Chen, V. B„ Davis, I. W., Echols, N„ Headd, J. J., Hung, L.-W., Kapral, G. J., Grosse-Kunstleve, R. W., McCoy, A. J., Moriarty, N. W., Oeffner, R., Read, R. J., Richardson, D. C„ Richardson, J. S., Terwilliger, Т. C. & Zwart, P. H., PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D, 2010. 66(2): p. 213-221.
14. Brunger, А. Т., Adams, P. D., Clore, G. M., DeLano, W. L„ Gros, P., Grosse-Kunstleve, R. W., Jiang, J.-S., Kuszewski, J., Nilges, M., Pannu, N. S., Read, R. J., Rice, L. M., Simonson, T. & Warren, G. L., Crystallography & NMR System: A New Software Suite for Macromolecular Structure Determination. Acta Crystallographica Section D, 1998. 54(5): p. 905-921.
15. Murshudov, G. N., Vagin, A. A. & Dodson, E. J., Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1997. 53(Pt 3): p. 240-55.
16. Emsley, P. & Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D, 2004. 60(12 Part 1): p. 2126-2132.
17. Emsley, P., Lohkamp, В., Scott, W. G. & Cowtan, K., Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D, 2010. 66(4): p. 486-501.
18. Laskowski, R. A., MacArthur, M. W., Moss, D. S. & Thornton, J. M„ PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. Journal of Applied Crystallography, 1993. 26(2): p. 283-291.
19. Hooft, R. W. W., Vriend, G., Sander, C. & Abola, E. E., Errors in protein structures. Nature, 1996. 381: p. 272-272.
20. Davis, I. W., Leaver-Fay, A., Chen, V. B, Block, J. N„ Kapral, G. J., Wang, X., Murray, L. W., Arendall, W. В., 3rd, Snoeyink, J., Richardson, J. S. & Richardson, D. C., MolProbity: all-atom contacts and structure validation for proteins and nucleic acids. Nucleic Acids Res, 2007. 35(Web Server issue): p. W375-83.
21. Friesner, R. A., Banks, J. L., Murphy, R. В., Haigren, T. A., Klicic, J. J., Mainz, D. Т., Repasky, M. P., Knoll, E. H„ Shelley, M., Perry, J. K., Shaw, D. E„ Francis, P. & Shenkin, P. S., Glide: a new approach for rapid, accurate docking and scoring. 1. Method and assessment of docking accuracy. J Med Chem, 2004. 47(7): p. 1739-49.
22. David Van Der, S., Erik, L., Berk, H., Gerrit, G., Alan, E. M. & Herman, J. С. В., GROMACS: Fast, flexible, and free. Journal of Computational Chemistry, 2005. 26(16): p. 1701-1718.
23. Dontsova, M. V., Gabdoulkhakov, A. G., Molchan, О. K., Lashkov, A. A., Garber, M. В., Mironov, A. S., Zhukhlistova, N. E., Morgunova, E. Y., Voelter, W., Betzel, C., Zhang, Y., Ealick, S. E. & Mikhailov, A. M., Preliminary investigation of the three-dimensional structure of Salmonella typhimurium uridine phosphorylase in the crystalline state. Acta Crystallograph Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2005. 61(Pt 4): p. 337-40.
24. Roosild, T. P., Castronovo, S., Fabbiani, M. & Pizzorno, G., Implications of the structure of human uridine phosphorylase I on the development of novel inhibitors for improving the therapeutic window of fluoropyrimidine chemotherapy. BMC Struct Biol, 2009. 9: p. 14.
25. Morgunova, E., Mikhailov, A. M., Popov, A. N., Blagova, E. V., Smirnova, E. A., Vainshtein, В. К., Mao, C., Armstrong Sh, R., Ealick, S. E., Komissarov, A. A. & et al., Atomic structure at 2.5 A resolution of uridine phosphorylase from E. coli as refined in the monoclinic crystal lattice. FEBS Lett, 1995. 367(2): p. 183-7.
26. Burling, F. Т., Kniewel, R., Buglino, J. A., Chadha, Т., Beckwith, A. & Lima, C. D., Structure of Escherichia coli uridine phosphorylase at 2.0 A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2003. 59(Pt 1): p. 73-6.
27. Caradoc-Davies, Т. Т., Cutfield, S. M„ Lamont, I. L. & Cutfield, J. F., Crystal structures of Escherichia coli uridine phosphorylase in two native and three complexedforms reveal basis of substrate specificity, induced conformational changes and influence of potassium. J Mol Biol, 2004. 337(2): p. 337-54.
28. Krissinel, E. & Henrick, K., Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. J Mol Biol, 2007. 372(3): p. 774-97.
29. Bu, W„ Settembre, E. C„ el Kouni, M. H. & Ealick, S. E., Structural basis for inhibition of Escherichia coli uridine phosphorylase by 5-substituted acyclouridines. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2005. 61(Pt 7): p. 863-72.
30. Lashkov, A. A., Zhukhlistova, N. E., Gabdoulkhakov, A. H., Shtil, A. A., Efremov, R. G., Betzel, C. & Mikhailov, A. M., The X-ray structure of Salmonella typhimurium uridine nucleoside phosphorylase complexed with 2,2'-anhydrouridine, phosphate and potassium ions at 1.86 A resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 1): p. 51-60.
31. Пашков, А. А., Жухлистова, H. E., Сотниченко, С. E., Габдулхаков, А. Г. & Михайлов, A. M., Структурная основа механизма ингибирования
уридинфосфорияазы из Salmonella typhimurium. Кристаллография, 2010. 55(1): p. 1 183-1199.
32. Lashkov, A. A., Zhukhlistova, N. E., Gabdoulkhakov, A. H., Shtil, A. A., Efremov, R. G„ Betzel, C. & Mikhailov, A. M., The X-ray structure of Salmonella typhimurium uridine nucleosidephosphorylase complexedwith 2,2'-anhydrouridine, phosphate and potassium ions at 1.86 A resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66(Pt 1): p. 51-60.
Заказ№ 36-a/l0/10 Подписано в печать 06.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1
¿^Ч ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30
(Пэг)) www. cfr. ru; e-mail: info@cfr. ru
СОДЕРЖАНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.1. уридинфосфорилаза - фермент метаболизма уридина.
1.1.1. Общие сведения об уридинфосфоршазе.
1.1.2. Участие уридинфосфоршазы в гомеостазе уридина.
1.1.3. Влияние ингибиторов уридинфосфоршаз на гомеостаз уридина.
1.1.4. Уридинфосфоилазная активность различных тканей в норме и при патологии.
1.2. Применение уридинфосфорилазы и её специфических ингибиторов в медицинской практике.
1.2.1. Ингибиторы уридинфосфорилазы как перспективные антимикробные и антипаразитические препараты.
1.2.2. Участие уридинфосфорилазы в метаболизме 5-фторураг1ила. Ингибиторы уридинфосфорилазы как модуляторы активности 5-фторурацила.
1.2.3. Экспрессия уридинфосфорилазы в опухолевых клетках. Чувствительность опухолей различного происхождения к ингибиторам уридинфосфоршазы.
1.2.4. Уридинфосфорилаза в активации капецитабина.
1.2.5. Защитное действие уридина при ишемии нервной ткани и миокарда
1.3. Ингибиторы фосфорилаз.
1.3.1. Общая классификация ингибиторов уридинфосфорилазы.
1.3.2. Производные ациклонуклеозидов.
1.3.3. Производные бензилациклоуридинов.
1.3.4. Ингибирующая активность структурных аналогов уридина.
1.3.5. Производные ангидроуридина.
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
И. 1. Материалы.
11.1.1. Биологические материалы.
11.1.2. Химические материалы.
П.2. Программное обеспечение.
П.З. Методы.
11.3.1. Кристаллизация.
П.З. 1.1. Метод равновесного диализа.
П.З. 1.2. Метод диффузии паров растворителя.
П.З .1.3. Применение информационных технологий для поиска условий кристаллизации.
11.3.2. Рентгенодифракционный эксперимент. '.
П.3.2.1. Методы рентгеновской съёмки кристаллов.
П.3.2.2. Использование синхротронного излучения в рентгеноструктурном анализе.
П.3.2.3. Регистрация дифрагированных интенсивностей рентгеновского излучения.
П.3.2.4. Ограничения метода РСА, обусловленные радиационным разрушением биополимеров.
П.3.2.5. Обработка рентгенодифракционных данных.
П.3.2.6. Определение начального набора фаз структурных факторов.
Метод молекулярного замещения.
П.3.2.6.1. Метод молекулярного замещения.
П.3.2.7. Методы уточнения структур.
II.3.2.8. Оценка достоверности уточнённых структур.
П.3.2.8.1. Критерии достоверности структурных данных.
П.3.2.8.2. Стандартный кристаллографический Ы-фактор (К^О.
11.3.2.8.3. Я^е.
П.3.2.8.4. БОМ.
II. 3.2.8.5. Распределение торсионных углов ср и \(/ на карте Рамачандрана
П.3.2.8.6. Длины валентных и ионных связей.
П.3.2.8.7. Значение углов валентных связей.
П.3.2.8.8. Ограничения планарности.
II.3.2.8.9. Хиральность.
II. 3.3. Компьютерное моделирование.
11.3.3.1. Метод классической молекулярной динамики.
П.3.3.1.2. Температура в МД эксперименте.
11.3.3.1.3. Выбор длины траектории.
П.3.3.1.4. Протокол молекулярной динамики.
П.3.3.1.5. Ограничения метода классической молекулярной динамики . 73 Н.3.3.2. Виртуальный скрининг и конструирование новых лекарственных препаратов.
Н.З.З.З. Молекулярный докинг.
П.3.3.3.1. Методы подгонки формы.
Н.З.З.З.2. Метод постепенного конструирования.
П.3.3.3.3. Генетический алгоритм.
П.3.3.3.4. Анализ решений докинга.
П.3.3.4. Виртуальный скрининг, основанный на поиске фармакофоров.
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТ И РАСЧЁТЫ.
III. 1. Экспериментальная часть.
III. 1.1. Выделение и очистка препарата.
III. 1.2. Кристаллизация.
III. 1.3. Получение экспериментального набора интенсивностей.
III.2. Расчетная часть.
111.2.1. Обработкарентгенодифракционных данных.
111.2.2. Решение и уточнение пространственных структур.
III. 2.3. Докинг и компьютерное конструирование новых ингибиторов.
III. 2.4. Исследование методом молекулярной динамики.
ГЛАВА IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
IV. 1. Общее описание структуры уридинфосфорилаз.
IV. 1.1. Кристаллическая упаковка молекул.
IV. 1.2. Пространственная организация молекул.
IV.2. Активный центр.
IV.2.1. Сайты связывания лигандов структуры StTJPh с ионом фосфата и
2,2'-ангидроуридином.
IV.2.1.1. Фосфат-связывающий сайт.
IV.2.1.2. Урацил-связывающий сайт.
IV.2.1.3. Рибозо-связывающий сайт.
IV.2.2. Предполагаемое влияние гидрофобных свойств молекулы ингибитора на его связывание.
IV.2.3. Роль петли L9 в связывании ингибитора.
IV.3. Детальное сравнение субъединиц различных структур комплексов tUPh.
IV.4. Ион калия в структуре комплекса уридинфосфорилазы с лигандами
2.2'-ангидроуридином и ионом фосфата).
IV.5. Исследование лабильности молекул StUPh и#ЦРн1 методом молекуляр1юй динамики.
IV.6. ДОКИНГ 2,2'-АНГИДРОУРИДИНА в АКТИВНЫЙ ЦЕНТР #UPHI.
IV.7. In silico дизайн высокоселективного ингибитора (потенциального лекарственного препарата).
IV. 7.1. Конструирование нового ингибитора уридинфосфорилазы класса 2,2'-ангидроуридина, замещённого в 5-м положенииурацилъного кольца 136 IV. 7.2. Конструирование нового ингибитора уридинфосфорилазы класса 2,2'-ангидроуридина замещённого в 6-м положении урацилъного кольца.
Множество лекарственных препаратов, используемых в настоящее время, взаимодействует с белками-ферментами. Это относится как к непосредственному механизму действия препарата (фармакокинетика), так и к превращению и разрушению лекарственных средств в организме и в очаге патологического процесса (фармакодинамика). Модулируя активность белков-ферментов, можно повысить эффективность лечения и снизить побочные эффекты. Одним из таких интересных с фармакологической точки зрения, белков является уридинфосфорилаза.
Уридинфосфорилаза (УФаза; UPh; Е.С. 2.4.2.3) с участием иона фосфата катализирует реакцию превращения уридина в урацил [1]. Фермент участвует в ре-синтезе пиримидиновых оснований. Уридинфосфорилаза как объект исследования представляет интерес для многих областей медицины. Этот фермент играет решающую роль в так называемом быстром клиренсе, то есть выведении из организма избытков плазменного уридина. Внутривенное введение частично очищенной бактериальной уридинфосфорилазы приводит к быстрому фосфоролизу уридина плазмы и ингибированию активности «реутилизационного» пути на 65-92% [2].
В организме человека уридинфосфорилаза принимает участие в метаболизме противоопухолевых препаратов - антиметаболитов пиримидинов, которые, несмотря на высокую токсичность, остаются основным средством химиотерапии некоторых видов опухолей, например, плоскоклеточного рака прямой кишки [3]. Противоопухолевый препарат 5-фторурацил (5ФУ) является антиметаболитом урацила из-за конкуренции за тимидилатсинтетазу. В результате действия 5ФУ нарушается синтез нуклеиновых кислот и достигается остановка пролиферации и/или гибель опухолевых клеток. 5ФУ — важнейший компонент современной химиотерапии - успешно применяется при раке толстой кишки, молочной железы, органов пищеварения, мочеполовой системы, а также при опухолях кожи. M.Iigo и соавт. [4] показали, что ингибиторы уридинфосфорилазы способствуют увеличению активности 5ФУ при химиотерапии индуцированного рака молочной железы у мышей линии BDFj и трансплантатов плоскоклеточного рака толстой кишки человека у безтимусных мышей. В опытах на мышах линии CD8Fi установлено, что введение ингибитора уридинфосфорилазы - бензилациклоуридина (BAU) (240 мг/кг) позволило уменьшить дозу 5ФУ в 1.5 раза при той же терапевтической эффективности [5]. Тем самым показана возможность изменения активности 5ФУ специфическими ингибиторами уридинфосфорилазы с целью снижения токсичности основного препарата.
Перспективным является применение ингибиторов уридинфосфорилаз не только для борьбы с онкологическими заболеваниями, но и с некоторыми инфекционными, вызванными бактериями и простейшими, так как ре-синтез уридина, протекающий преимущественно с участием уридинфосфорилазы и урацилфосфорибозилтрансферазы, чрезвычайно важен для жизнедеятельности микроорганизмов. Роль УФазы в обмене уридина у высших организмов менее значима, чем для микроорганизмов, так как большая часть пиримидиновых оснований в клетках высших организмов синтезируется де ново, и только значительно меньшая синтезируется путем ресинтеза [6]. Клетки же многих микроорганизмов лишены тимидинфосфоралазной активности, и именно уридинфосфорилаза катализирует в них фосфоролиз как рибо-, так и дезоксирибопиримидин нуклеозидов. Инактивация фермента-хозяина не будет столь существенна для высших организмов в целом, как инактивация единственного фермента для паразита. Ингибирование УФазы, как показали опыты in vivo, летально для некоторых паразитов (например, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni), являющихся возбудителями заболеваний человека [7-9]. Основой создания новых антипаразитических препаратов и антибиотиков могут быть структуры атомного разрешения комплексов ферментов-мишеней прокариот и высших организмов с низкомолекулярными химическими соединениями (лекарство).
Однако нерациональное применение ингибиторов фосфорилаз, особенно с недостаточно высокой тканеспецифичностью, может вызвать осложнения. Исследования на смешанной культуре клеток астроцитов с нейронами и на реперфузированном мозге показали, что уридин защищает клетки от гибели. Степень повреждения клеток в этих опытах контролировали как морфологически, так и по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - маркера клеточного повреждения при ишемии. Кроме того, этой группой исследователей показано, что в протекторном (защитном) действии уридина принимает участие уридинфосфорилаза нейронов и астроцитов. Для выяснения роли уридинфосфорилазы в защитном действии уридина было определено, насколько блокирование УФазы влияет на протекторный эффект уридина в ишемизированных нейронах [10]. Таким образом, ингибирование уридинфосфорилазы в клетках мозга (нейронах и клетках астроцитарной нейроглии) и кардиомиоцитах может ухудшить состояние тканей при ишемии. Однако, по-видимому, существует способ снижения негативных последствий приема ингибиторов уридинфосфорилаз путем конструирования ингибиторов, не способных проникать через гистогематические барьеры, в частности, гемато-энцефалический барьер.
Коиш М.Н. с соавторами показал, что соединения класса 2,2'-ангидроуридинов являются эффективными ингибиторами для большинства уридинфосфорилаз клеток бактерий и простейших [11, 12]. В связи с этим, из широкого класса ингибиторов УФазы был выбран ингибитор - 2,2'-ангидроуридин.
Разработка новых лекарственных препаратов-ингибиторов ферментативной активности невозможна без понимания механизма ингибирования на атомно-молекулярном уровне. Под механизмом ингибирования мы понимаем структурно-функциональные особенности взаимодействия фермент-ингибитор, такие как структура сайтов связывания ингибитора, характер взаимодействий атомов ингибитора с атомами фермента, структурно-функциональные изменения, происходящие при образовании комплекса фермент-ингибитор. Для этого необходимо детальное исследование пространственной организации макромолекулярных комплексов уридинфосфорилаз бактерий и высших организмов методами рентгеноструктурного анализа при атомном разрешении и компьютерного моделирования. На основании результатов этих исследований можно предложить структурно-функциональный аспект механизма ингибирования данного белка-мишени, что, в свою очередь, позволяет конструировать химические соединения-ингибиторы, более комплиментарные сайтам связывания ферментов и, возможно, более эффективные в качестве лекарственного препарата.
Целью данной работы было изучение пространственной организации молекулы уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium (ÄUPh) и уридинфосфорилазы человека (ЯСРЫ) в комплексах с разными лигандами и установление структурной основы ингибирования этих уридинфосфорилаз 2,2'-ангидроуридином (ANU) методом рентгеноструктурного анализа. Компьютерное моделирование оптимальных ингибиторов (аналогов 2,2'-ангидроуридина) уридинфосфорилазы человека и бактерий.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
• определение атомных структур комплексов iS/UPh с 2,2'-ангидроуридином, ионом фосфата и калия методом рентгеноструктурного анализа биомакромолекул;
• решение структуры комплекса 7/UPhI с 2,2'-ангидроуридином методом молекулярного моделирования;
• анализ структур комплекса "фермент-ингибитор" для /TUPhl и StUPh;
• молекулярно-динамическое исследование iiUPhl и »SVUPh;
• компьютерное конструирование потенциальных ингибиторов уридинфосфорилаз.
Выводы
• Методом рентгеноструктурного анализа впервые решены и уточнены с высокой достовернотью пространственные структуры атомного разрешения следующих биомакромолекул:
- комплекса ЛиРЬ с 2,2'-ангидроуридином (ингибитором уридинфосфорилазы — модулятором активности химиотерапевтических препаратов) и ионом калия (эффектором уридинфосфорилазы) при разрешении 2.38 А (Ягасюг = 20.80%; К^е = 25.80%, БР1= 0.267 А, Я.М.8.Б. = 0.007 А для длин связей и К.М.З.Б. = 1.154° для валентных углов; 99.5% аминокислотных остатков находятся в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана;
- комплекса ^/иРЬ с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата (субстратом уридинфосфорилазы) при разрешении 2.11 А (Красин- = 18.10%, Я&ес = 21.90%, БР1= 0.168 А, Я.М.8.Б. = 0.007 А для длин связей и К.М.8.Б. = 1.499° для валентных углов; 99.7% аминокислотных остатков находятся в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана;
- комплекса 5ШР11 с 2,2'-ангидроуридином, ионами фосфата и калия при разрешении 1.86 А (Я^ = 17.60%, Я&ее = 20.60%, БР1= 0.132 А, Я.М.8.Б. = 0.007 А длин связей и Я.М.8.Б. = 1.066° для валентных углов; 99.5% аминокислотных остатков в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана;
- нелигандированной уридинфосфорилазы 5*. ¿уркутигшт при разрешении 1.80 А (Я^ = 16.08%; 11^=20.01%; БР1= 0.115 А; Я.М.8Х>= 0.006 А для длин связей и Я.М.8.Б.= 1.042° для валентных углов; 99.7% аминокислотных остатков в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана;
- комплекса Л11РЬ с ионом фосфата при разрешении 1.5 А (Б^асюг = 16.60%, К&ее = 21.20%, БР1= 0.098 А, Я-М-БЛ). = 0.007 А длин связей и Я.М^.О. = 1.094° для валентных углов; 99.5% аминокислотных остатков в наиболее благоприятных и разрешённых областях статистики Рамачандрана. Координаты атомов пространственных структур вышеприведённых пяти макромолекулярных соединений и соответствующие им наборы экспериментальных модулей структурных факторов депонированы в международный банк белковых структур (РОВ). Им присвоены следующие идентификационные номера ГО РБВ: ЗБРБ, ЗС74, тЛ, ЗОБО, ЗР\¥Р соответственно.
• Впервые выявлено место и характер связывания 2,2'-ангидроуридина с ЛиРЬ (ферментом-мишенью). Взаимодействия между ферментом и ингибитором осуществляются посредством водородных связей, ван-дер-ваальсовых контактов и стэкинг взаимодействий. На основании экспериментальных и литературных данных сделан вывод о том, что 2,2'-ангидроуридин является конкурентным ингибитором уридинфосфорилаз и его действие обратимо.
• Методом молекулярного докинга впервые определена структура комплекса уридинфосфорилазы человека с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата. Четвертичной структурой указанного комплекса является гомодимер. Установлены аминокислотные остатки /ШРЫ, связывающие 2,2'-ангидроуридин. Показаны различия ферментов //ЫРЫ и ЛиРЬ в гидрофобной области сайта, связывающего гетероциклический компонент 2,2'-ангидроуридина. Механизм ингибирования /ГОРЫ и 5ШРЬ 2,2'-ангидроуридином аналогичен. Полученные данные можно использовать для рационального дизайна новых перспективных ингибиторов бактериальных и человеческих уридинфосфорилаз, являющихся; химиотерапевтическими и противомикробными препаратами. . ' .
• Ме годом рентгепос груктурного анализа впервые показано, что г в ком п л ексеу ри ди н ф о с ф ор и л аз б*. ¡уркуп г г тит с 2,2'-ангидроуридином и ионом фосфата состояниегактивногощентращредпочтительно чоакрытое»;,, в то время как для' комплекса: только с 2,2'-ангидроуридином наблюдаются.как «закрытое»; так;и5«промежуточное» состояния., .
• Методом молекулярной динамики было установлена влияния иона калия; на структурную стабилизацию молекулы бЖРК:. Особенно эти изменения- приходятся на минокислотные остатки петли Е9 и начального участкач спирали« Н8. Отмечено?« увеличение; плотности- контактов в-• области •• межсубъединич11 ого взаимодействия в ^ димерах, в присутствии иона1, калия. Методами молекулярной! динамики- показано,1 что петля Е9 активного центра ферментов 5ШР11 и //ЦРЫ меняет свою конформацию и положение в гтростанстве '
В первые проведено конструирование т $Шсо молекулы высокоафинного ингибитора как; для //ИРЫ, так и для 6711РЬ на основе 2,2'-ангидроуридина. Они являются 5-замещенными!или 6-замещенными 2,2'-ангидроуридинами, где в качестве заместителя; выступает короткая алифатическая насыщенная цепочка с ароматической группой на конце. Для 5-замещенных 2,2'-ангидроуридинов имеются* отличия? в предпочтительном; типе ароматической группы ингибитора //ЦРНГ: (пиридиновая, группа) и б'/иРИ (имидазольная группа), что объясняется различным аминокислотным окружением активного центра фосфорилаз из разных источников при высокой гомологии сайтов связывания;. Для 6-замещённых 2,2'-ангидроуридинов имеются лишь, отличия в длине углеводороднойщепочки высокоафинного заместителя.
Благодарности
Автор выражает искреннюю признательность:
• сотрудникам группы A.M. Михайлова Лаборатории белковой кристаллографии Института кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН — в.н.с., к.ф.-м.н. Н.Е. Жухлистовой, с.н.с., к.ф.-м.н. А.Г. Габдулхакову, к.б.н. Ю.С. Савочкиной, к.б.н. М.В. Донцовой, н.с., к.х.н. A.B. Ляшенко, к.х.н. Б.Ф. Павлюк, инж. Т.А. Серёгиной, инж. Ю.Н. Жуковой, инж. С.Е. Сотниченко и инж. И.И. Прокофьеву - за помощь и дружескую поддержку, которая в огромной степени способствовала исследованию пространственной организации биомакромолекулярных комплексов уридинфосфорилаз методом рентгеноструктурного анализа;
• коллективу лаборатории моделирования биомолекулярных систем Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН за помощь в компьютерном моделировании структуры биомакромолекул;
• д.б.н., профессору Миронову A.C., к.б.н. Савочкиной Ю.А. и к.б.н. Донцовой М.В. за предоставление препарата »SVUPh для кристаллизации;
• Серёгиной Т.А. и Донцовой М.В. за помощь при кристаллизации биомакромолекулярных комплексов;
• проф. X. Бетзелю (Christian Betzel, DEZY, Hamburg, Germany) и к.ф.-м.н. Г.С. Качаловой за предоставленную возможность работы на белковых станциях синхротрона DEZY (Hamburg, Germany);
• к.ф.-м.н. Габдулхакову А.Г за помощь в экспериментальной и расчетной частях исследования;
• к.ф.-м.н. Жухлистовой Н.Е. и д.м.н. Штилю A.A. за критическое обсуждение результатов работы;
• д.ф.-м.н., профессору Ефремову Р.Г. и к.ф.-м.н., доценту Михайлову A.M. за предложенную тему, руководство работой, неоценимую помощь и поддержку.
1У.8. Заключение
1) Основной эффект ингибирования уридинфосфорилазы 2,2'-ангидроуридином заключается в установлении связей 2,2'-ангидроуридина с аминокислотными остатками нуклеозид-связывающего сайта активного центра S/UPh. Как показано нами выше, определяющую роль в связывании 2,2'-ангидроуридина, так же как и субстратов, играет связь с рибозным компонентом ингибитора, который располагается в активном центре. Остатки Thr94/B, His8/D, Glul98/B (рис. 12, 22) образуют водородные связи с атомами ингибитора, аналогичные связям с рибозным компонентом уридина. Кроме того, в связывании 2,2'-ангидроуридина принимает участие Argl66/B, образуя контакт с атомом 04 рассматриваемого ингибитора.
Glu198/B
Рисунок 22. Сравнение положения 2,2'-ангидроуридина (оранжевый) и уридина (красный) по отношению к ключевым остаткам нуклеозид-связывающего сайта активного центра Л11РЬ. Сплошными линиями показаны водородные связи.
В случае с уридином остатки С1п166/5/11РЬ и А^168/ЛиР11 в акте ферментативной реакции стабилизируют обмен электронами между атомом
04'-рибозы и атомами пиримидинового кольца. В результате ион оксокарбения стабилизируется отрицательно заряженным ионом фосфата. Ион фосфата связывается на а-стороне рибозного кольца, где его расположение позволяет участвовать в 8>Д нуклеофильной атаке С1'- позиции [191].
По сравнению с уридином, в случае связывания 2,2'-ангидроуридина Ы-гликозидная связь остается стабильной как за счет фиксации пиримидинового кольца в син-положении атомом 02, так и за счет иного, чем в случае с субстратами уридинфосфорилазы, взаимного расположения урацильного кольца и остатков в1и168 и А^166 (рис. 20).
Следует учитывать и то, что молекула 2,2'-ангидроуридина имеет меньше вращательных степеней свободы, чем уридин. Меньшее число степеней свободы приводит к уменьшению энтропийной составляющей свободной энергии комплекса фермент-ингибитор. При практически неизменной энтальпии комплексов, определяемой связями фермент-ингибитор, эффект уменьшения энтропийной составляющей увеличивает «время жизни» и уменьшает вероятность распада комплекса фермент-ингибитор и вероятности его самопроизвольного распада.
Исходя из аналогичности пространственной организации активных центров 5>иРЬ и /ШРЫ, как было показано нами ранее, полагаем и идентичность ингибирования 2,2'-ангидроуридином этих уридинфосфорилаз.
2) Сгенерированы структуры соеденений - потенциальных лекарственных препаратов на основе высокоселективных ингибиторов уридинфосфорилаз. Они являются 5-замещенными или 6-замещенными 2,2'-ангидроуридинамы, где в качестве заместителя выступает короткая алифатическая насыщенная цепочка с ароматической группой на конце. Для 5-замещенных 2,2'-ангидроуридинов имеются отличия в предпочтительном типе ароматической группы ингибитора /ШРЫ (пиридиновая) и бШРИ (имидазольная группа), что объясняется различным аминокислотным окружением активного центра фосфорилаз из разных источников при высокой гомологии сайтов связывания. Для- 6-замещённых 2,2'-ангидроуридинов имеются лишь, отличия, в длине углеводородной цепочки оптимального заместителя.
IV.9. Перспективы
Ввиду ухудшения экологической обстановки и изменения образаt жизни людей, проблема онкологических заболеваний в ближайшей-перспективе, будет острее, чем на данный момент. В то же время намечается тенденция адаптации новых злокачественных образований и микроорганизмов — паразитов человека - к лекарственным препаратам^ уже применяющимся в медицинской практике. Создание новых биологически активных соединений требует описания на-молекулярном уровне взаимодействий «лиганд-рецептор». Создание новых лекарственных препаратов, взаимодействующих- с белками' обмена нуклеотидов, к которым относится уридинфосфорилаза, представляется автору перспективным направлением, молекулярной фармакологии.
Автором в работе исследованы структурные основы1 ингибирования уридинфосфорилаз бактерий и человека перспективным- препаратом 2,2'-ангидроуридином. 1 и сделан первый шаг на пути рационального конструирования препаратов нового поколения на основе 2,2'-ангидроуридина. В дальнейшем автор предполагает проведение экспериментального исследования физико-химических свойств новых соединений — ингибиторов уридинфосфорилаз1 различных эукариот и прокариот методами аналитической знзимологии и биохимии, а также исследования структурных особенностей взаимодействия новых соединений с уридинфосфорилазами методами рентгеноструктурного анализа. Представляется интересным всестороннее исследование биологических свойств новых ингибиторов на культурах клеток in vitro и доклинические испытания in vivo.
