Структурная основа механизма ферментативной активности нуклеозидфосфорилазы из Salmonella typhimurium тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

На правах рукописи УДК 548 737

ПАВЛЮК БОГДАН ФИЛИППОВИЧ

СТРУКТУРНАЯ ОСНОВА МЕХАНИЗМА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ Salmonella typhimurmm

Специальность 01 04 18 - кристаллография, физика кристаллов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ООЗ17440Э

CffaJi&olL

Москва - 2007

003174409

Работа выполнена в Институте кристаллографии имени А В Шубникова Российской академии наук

Научные руководители доцент

кандидат физико-математических наук,

Михайлов Альберт Михайлович

кандидат физико-математических наук Габдулхаков Азат Габдрахманович

Официальные оппоненты профессор

доктор физико-математических наук,

Фейгин Лев Абрамович

доктор медицинских наук Штиль Александр Альбертович

Ведущая организация: Институт биоорганической химии РАН

Защита диссертации состоится «06» ноября 2007 г в «12 час 30 мин » на заседании Диссертационного совета Д 002 114 01 в Институте кристаллографии имени А В Шубникова РАН по адресу 119333 Москва, Ленинский проспект, 59

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии имени А В Шубникова РАН

Автореферат разослан «06 » октября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук

Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Уридинфосфорилаза - ключевой фермент пиримидинового обмена, который катализирует обратимый фосфоролиз уридина до урацила и рибоза-Г-фосфата Механизм его взаимодействия с субстратами детально не изучен Предположительно реакция протекает по механизму нуклеофильного замещения Интерес к исследованию данного фермента, кроме получения фундаментальных знаний о его структурной организации, вызван еще и тем, что при лечении ряда онкологических заболеваний необходимо ингибировать нуклеозидфосфорилазы и, в частности, уридинфосфорилазы Уровень гена экспрессии уридинфосфорилазы резко возрастает в клетках злокачественных новообразований у человека (в частности - рак прямой кишки) Высокая концентрация уридинфосфорилазы в раковой клетке снижает терапевтический эффект медицинских препаратов нуклеозидной природы, используемых при химиотерапии (5-фтор-урацил) Кроме того, замечена исключительная важность данного фермента для борьбы с некоторыми кишечными паразитами (например, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni)

Технические трудности, лежащие на пути получения высокогомогенного препарата в достаточном для проведения рентгеноструктурного анализа структуры ферментов из высших организмов, оказались на сегодняшний день непреодолимы Поэтому все внимание исследователей направлено на изучение структур уридинфосфорилаз из микроорганизмов Уридинфосфорилаза Salmonella lyphimurium (далее - ¿VUPh), исследуемая нами, близка по первичной последовательности к уридинфосфорилазе из Е coli Однако 5VUPh значительно отличается от £cUPh по ряду биохимических свойств обладает более широкой субстратной специфичностью, а также более высоким сродством к субстрату

Цель работы. Целью данной работы являлось выращивание высокосовершенных монокристаллов фермента, необходимых для получения с использованием синхротронного излучения высококачественных экспериментальных

рентгенографических наборов интенсивностей от кристаллов .SVUPh, как в свободном, так и в лигандированном состоянии, решение и уточнение по этим экспериментальным наборам пространственной организации энзима в различных состояниях с целью, прежде всего, непосредственной локализации по синтезам электронной плотности белка области активного центра фермента .SVUPh и однозначной идентификации аминокислотных остатков, входящих в состав нуклеозид- (пиримидин-, рибозо-) и фосфат-связывающих сайтов На основе сравнительного анализа трехмерных пространственных структур фермента, как нелигандированного, так и его комплексов с субстратом, продуктами ферментативной реакции и другими лигандами, установленных с высокой достоверностью, проанализировать структурно-функциональную взаимосвязь элементов ферментативного центра .SVUPh

Научная новизна. Впервые с высокой достоверностью решены и уточнены структуры нативного ферментра SVUPh, а также комплексов фермента с уридином, урацилом и ионом фосфата, тимином и ионом фосфата, и ионом калия На основе полученных данных построены пространственные структуры свободного и лигандированного фермента На основе результатов рентгеноструктурного анализа биокристаллов .SVUPh в нативной и лигандированной форме локализованы остатки аминокислот, входящие в состав нуклеозид- (пиримидин-, рибозо-) и фосфат- связывающих сайтов, определена область активного центра фермента Показано, что в связывании «фермент-субстрат (продукт)» участвуют остатки аминокислот из двух соседних мономеров, образующих гомодимер Установлено, что с точки зрения структурной организации для

формирования нуклеозид- (пиримидин-, рибозо-) и фосфат-связывающих сайтов необходимым и достаточным условием является гомодимерная организазация 5/иРИ На основании полученных структурных данных установлено, что на скорость прохождения ферментативной реакции может влиять положение петли, образованной аминокислотными остатками 223 - 334, которая открывает (закрывает) доступ субстрата в область активного центра белка Впервые показано, что для свободного фермента ЛиРЬ имеет место статистическое распределение положения петли - открытая или закрытая конформация Впервые установлено, что присутствие ионов калия стабилизирует «открытое» положение петли, что способствует доступу субстрата в область активного центра Идентифицированы аминокислотные остатки фермента, которые участвуют (дополнительно к аминокислотным остаткам 223 - 334, формирующим собственно петлю) в переходе петли из «закрытого» в «открытое» состояние

Практическая значимость работы Изучение структурных особенностей механизма связывания фермент-лиганд создает предпосылки для разработки перспективных медицинских препаратов, позволяющих во-первых, проявлять более низкое сродство к 5гиРЬ, тем самым повышать свою противоопухолевую активность при химиотерапевтическом воздействии, во-вторых, ингибировать уридинфосфорилазы в клетках кишечных паразитов на основании более высокого конкурентного связывания «фермент-субстрат»

Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах Список публикаций приведен в конце автореферата Наборы координат атомов для пяти решенных и уточненных пространственных структур йиРЬ и соответствующие им экспериментальные наборы рентгенодифракционных интенсивностей сданы в Международный банк белковых структур (РЭВ)

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка печатных работ Она изложена на И2 страницах, содержит ¿'¿рисунка и ■/¿таблиц

Основные положения, выносимые на защиту:

- Отработка методики выращивания высокосовершенных кристаллов нативной БШРЬ и комплексов фермента с различными субстратами и продуктами реакции Математическая обработка полученных на синхротронной станции рентгенодифракционных наборов интенсивностей

- Определение и уточнение кристаллических структур нативных БШРЬ с разрешением 1 90 А и 1 76 А соответственно

Решение и уточнение пространственных структур 8ШРЬ в комплексах с уридином, урацилом и ионом фосфата, тимином и ионом фосфата, и ионом калия, с разрешениями 2 90 А, 2 49 А, 1 7 А и 2 15 А соответственно

- Детальный анализ пространственных структур изучаемого фермента как в нативном состоянии, так и в его комплексах с лигандами для установления структурной основы механизма ферментативной активности в том числе

- выявление и идентификация аминокислотных остатков пиримидин-, рибоза-и фосфат-связывающих сайтов активного центра уридинфосфорилазы,

- установление дополнительных к сайтам связывания субстратов структурных образований фермента, важных для их функционирования, выявление и идентификация аминокислотных остатков, образующих вторичные структуры этих образований,

- установление числа активных центров, приходящихся на гексамерную молекулу уридинфосфорилазы, и их взаимозависимость,

- выяснение роли ионов калия при работе активного центра энзима Личный вклад автора. Автором выращены кристаллы нелигандированного фермента StUPh, а также его комплексов с различными субстратами, продуктами реакции и ионами калия, пригодные для рентгенографических исследований

Проведен предварительный рентгенодифракционный анализ выращенных кристаллов с целью выяснения их пригодности для дальнейшей работы Экспериментальные наборы интенсивностей для этого этапа работы получали на лабораторном источнике рентгеновского излучения (Институт кристаллографии РАН) и на источнике синхротронного излучения на базе станции белковой кристаллографии «Беток» на пучке синхротронного излучения накопителя Сибирь 2 Курчатовского центра синхротронного излучения и нанотехнологий

Для проведения исследования экспериментальные наборы интенсивностей собраны на белковых станциях синхротрона DESY (Гамбург, Германия) Последующая обработка интенсивностей проведена в комплексе математического обеспечения XDS

Решены и уточнены с высокой достоверностью пространственные структуры как свободного фермента в двух кристаллических формах, так и в комплексах с различными субстратами и продуктами реакции Построены пространственные модели исследуемых структур Определена область активного центра и установлены остатки аминокислот, входящие в состав нуклеозид- (пиримидин-, рибозо-) и фосфат-связывающих сайтов Проведен сравнительный анализ полученных структур Показано, что минимальной структурной организацией фермента, достаточной для связывания субстратов является гомодимер с двумя асинхронно работающими активными центрами Впервые установлено, что ионы калия стабилизируют петлю активного центра в открытой конформации, что приводит к увеличению (по сравнению с его нативной формой) скорости связывания ферментом субстрата

Апробация работы Результаты работ представлены на национальных и международных конференциях, в частности «IV Съезд общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова» (Пущино, 2006), «III Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), «Российский симпозиум «Космическое материаловедение - 2007» (Калуга, 2007)

Координаты атомов уточненных пространственных структур фермента в нативной форме, а также его комплексов с субстратами и продуктами реакции помещены в Международном банке белковых структур (PDB) под номерами PDB ID 20XF, 2IQ5, 2HWU, 2HRD, 20ЕС

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Введение. Во введении дана краткая характеристика нуклеозидфосфорилаз из различных источников, обоснована актуальность темы, необходимость исследований пространственной организации активного центра энзима как в нелигандированной форме, так и в форме его комплексов с субстратами, ингибиторами и продуктами реакции

Глава 1. Литературный обзор.

Глава состоит из двух основных тематических разделов, описывающих сравнительный анализ структур однодоменных нуклеозидфосфорилаз из различных источников и медицинское применение ингибиторов уридинфосфорилаз как при

химиотерапевтическом лечении, так и в качестве антибактериальных, противопаразитических препаратов

Изучение пространственной организации фермента методом рентгеноструктурного анализа позволяет достаточно точно идентифицировать структурные элементы фермента, участвующие в протекании биохимических реакций, установить аминокислотные остатки активного центра, а также выявить роль наиболее подвижных элементов пространственной организации энзима (петель) для функционирования белка

Акцент на обзор именно медицинского применения ингибиторов уридинфосфорилаз показывает практическую значимость поставленной задачи и проделанной работы, так как разработка противоопухолевых препаратов на основе полученных структурных и кинетических биохимических данных имеет большое социально-экономическое значение Глава 2. Материалы и методы.

В этой главе описаны биологические и химические материалы, использованные при выполнении настоящего исследования На основании литературных данных приведены краткие обзоры, посвященные описанию принципов выращивания совершенных кристаллов биомакромолекул, методов уточнения атомной структуры белков, способов оценки качества модели в процессе уточнения кристаллической структуры

Глава 3 Экспериментальная часть.

Кристаллизация свободного фермента уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium и получение комплексов «фермент-лиганд» в кристаллах.

Поиск условий кристаллизации нативной SVUPh проводили методом диффузии паров в висящей капле с предварительным скринингом компонентов, составляющих как кристаллизационные, так и маточные растворы (противорастворы)

Комплекс ÄUPh с ионом калия в кристаллах получали методом настаивания Получение комплексов фермента в кристаллах с субстратом (уридином) и продуктами реакции (урацилом, тимином и ионом фосфата) проводилось методом сокристаллизации

Визуальное качество кристаллов определяли с помощью бинокулярного микроскопа, а их рассеивающую способность - на лабораторном источнике рентгеновского излучения Института кристаллографии РАН Съемку кристаллов проводили в кварцевых капиллярах

Состав криорастворов для съемки при низких температурах (100 К - жидкий азот) подбирался на основе противорастворов, содержащих 25 % ПЭГ 400 Контроль качества криорастворов, а также тестовый сбор рентгенодифракционных данных полученных кристаллов проводился на базе станции белковой кристаллографиии «Ьелок» на пучке синхротронного излучения накопителя Сибирь 2 Курчатовского центра синхротронного излучения и нанотехнологий Получение наборов дифракционных данных

Дифракционные наборы данных с кристаллов нативного фермента, а также комплексов ftUPh с уридином, урацилом и ионом фосфата, тимином и ионом фосфата, ионом калия получены на рабочих станциях XII, XI3 и BW6 синхротрона DES Y (Гамбург, Германия) при температуре 100 К В качестве детектора использовался MARCCD

Решение и уточнение структур уридинфоефорилазы S. typhimiirium. it свободном и связанном состояниях.

Решение структур свободного и лигандированного фермента ¿'/UPh проводилось методом молекулярного замещения с использованием программы Phaser.

Уточнение пространственных структур SiUPh ароводилось с использованием программных комплексов CNS, Phénix и Refimc.

Корректность полученных результатов по ходу уточнения структуры контролировалась на основании данных, полученных при расчетах но программам Р roc heck, WhatCheck. На конечном этапе уточнения структура тестировалась программами What-IF и WhatCheck [1, 2].

Рисунки были приготовлены с использованием программ: CLUSTALW (www.infobiogen.fr/doc/ClustaIWJ, GENEDOC, Pymol ViewerLile (www.accelrys.com), Deep View/S wiss-Pdb Viewer (www.expasy.org/spdbv).

Глава. 4. Результаты и их обсуждение.

Выращивание кристаллов свободного и лигандированного фермента.

Первоначальный скрининг и дальнейшее варьирование условий кристаллизации позволили оптимизировать условия выращивания кристаллов нативного фермента. В качестве осадитедей использовали полиэтиленгликоли (ПЭГ) разных весов в диапозоне 3000-8000. Концентратрация осадителя а противорастворе варьировалась от 8 до 25% с шагом в 2.5%. Рабочие растворы готовили на Трис-малоновом буфере. Дипазоа значений рН составил 4.6-5.5. До нужного значения буфер доводили 0.1 M раствором NaOH. Концентрации белка в капле варьировалась от 3.5 до 5.6 мг/мл. Объем капли 6 мкл. В каждую каплю добавляли 0.2 мм д и океана или изо про пи левого спирта. Кристаллизационная плашка инкубировалась при температуре 21 °С.

В результате были получены кристаллы лапши ой StUPh размером 100x50x50 мкм (рис. I), в условиях: противораствор (1 мл) содержал 25 % ПЭГ 3350, 0.1 M NaOH-Трис-магтоновый буфер рН 5.2, концентрация белка в капле 3.5 мг/мл, объем капли 6 мкл, соотношение раствора белка и раствора осадителя в капле составило 1:1,

Для получения комплекса З/ЦРЬ с ионом калия методом настаивания кристалл нативпой 5/иРЬ петлей переносили в каплю (состав капли соответствовал

Рисунок 1. Кристаллы нелигандированного фермента .SYUPh

противораствору), содержащую от 50 до 100 мМ ацетата калия Настаивание проводили в течение 1 часа при температуре 21°С

Получение кристаллов комплексов фермента с субстратом (уридином), и продуктами реакции (урацилом и ионом фосфата, тимином и ионом фосфата) проводилось методом сокристаллизации В данном случае скрининг проводился в более узком диапазоне, так как использовались те условия, при которых были выращены кристаллы хорошего качества нелигандированной AUPh В качестве осадителей использовались ПЭГ 3000 и ПЭГ 3350 Использовались рабочие растворы, приготовленные на Трис-малоновом буфере, рН 5 2 Концентрация белка в капле варьировалась от 3 5 до 5 6 мг/мл В каплю добавляли эквимолярное количество раствора уридина (урацила, тимина) Суммарный объем кристаллизационного раствора -6 мкл В каждую каплю добавляли 0 2 мкл диоксана или изопропилового спирта Кристаллизационная плашка инкубировалась при температуре 21°С

В результате были выращены кристаллы комплексов StUPh с урацилом, тимином, уридином, в условиях противораствор (1 мл) содержал 20 % ПЭГ 3350, 0 1М NaOH-Трис-мэлоновый буфер рН 5 2, кристаллизационная капля содержала 4 мкл раствора StUPh (9 мг/мл), 1 5 мкл противораствора, 0 5 мкл 10 мМ раствора уридина (урацила, тимина ) Максимальный размер кристаллов достигал 150 -300 мкм

Сбор рентгенодифрационных данных с полученных кристаллов, решение и уточнение структур

Экспериментальные наборы модулей структурных амплитуд для кристаллов нативного и лигандированного фермента получены с помощью программы XDS [3] Характеристики рентгенодифракционных наборов интенсивностей приведены в табл 1

Решение структуры SiUPh проводили методом молекулярного замещения с использованием программы Phaser В качестве стартовой модели была выбрана структура фермента &UPh (пр гр P6i), определенная нами ранее при разрешении 2 5А (PDB код 1SJ9) [4] Молекулы воды и лигандов были исключены из стартовой модели

Уточнение пространственной структуры SVUPh проводилось с использованием опций anneal, minimize, bgroup программных комплексов CNS и Phenix Кроме того, в отдельных случаях использовали опции уточнения пакета программ ССР4

В ходе уточнения структур для обеспечения контроля процедуры уточнения из экспериментальных данных в самом начале работы были отобраны случайным образом 5% отражений, которые образовали контрольный набор, использовавшийся далее для расчета свободного R-фактора (Rfree) Уточнение позиций атомов модели SiUPh и их температурных факторов проводили в несколько этапов На всех этапах уточнения осуществляли контроль над стереохимическими параметрами (длины валентных связей, величины валентных углов, планарность заданных групп атомов, невалентные взаимодействия и др) Стадии кристаллографического уточнения чередовались с ручной корректировкой модели фермента с использованием разностных синтезов электронной плотности Визуальная корректировка модели проводилась с использованием графического программного комплекса COOT по картам электронной плотности разностных синтезов Фурье с коэффициентами (2Fo - Fc) и (Fo - Fc), где Fo, Fc — экспериментальные и расчетные модули структурных факторов соответственно Параметры уточненных структур .SrtJPh приведены в табл 2

- Примечание в случае получения двойных комплексов 5ШРЬ с «урацил + ион фосфата» и «тимин + ион фосфата» в кристаллизационную каплю добавлялось 0 1 мкл 1 мМ раствора

Таблица 1 Основные характеристики наборов дифракционных данных собранных с кристаллов БШРЬ

Параметры Наименование объекта (кристалл)

Нативный фермент StUPH Комплекс StUPH с тимином Комплекс StUPH с ионом калия Комплекс StUPH с урацилом Комплекс StUPH с уридином

Пространственная группа R3 (№ 146 ) R3 (№146) Р2,2,2, (№ 19) Р2,2,2, (№ 19) P2i2i2, (№ 19) P2i2i2i (№ 19)

Параметры элементарной ячейки Â, град a=b=150 86, с=47 84 а = Р = 90, у = 120 a=b=151 66, с=47 92 а = Р = 90,у= 120 a = 88 79, b = 124 07, с = 134 11 а = Р=у=90 а = 88 52, Ь= 123 98, с = 133 52 а = 3 = т= 90 а = 89 00, b = 124 26, с = 133 96 а = Р= у= 90 а = 88 88, Ь= 123 99, с= 134 16 а = Р = у= 90

Число молекул в асимметричной части 1/3 (димер) 1/3 (димер) 1 (гексамер) 1 (гексамер) 1 (гексамер) 1 (гексамер)

Наименование станции* Х13 XII Х13 Х13 BW6 XII

Длина волны, Â 0 813 0 8126 0 8043 1 05 1 05 0 8043

Разрешение, Â 150 86-1 76 76 70-1 90 88 31-1 70 88 52-2 15 79 56-2 49 88 34-2 90

Общее число рефлексов 147750 147750 151477 276750 148261 122693

Число независимых рефлексов 39169 39169 55876 75645 49654 33545

Полнота набора, % 97 99 97 99 95 8 99 6 93 1 98 2

Мозаичность, град 0211 0211 031 0 287 0 67 0 43

I/o© 11 5 11 5 13 87 17 87 15 54 6 94

Rmerge» % 67 67 65 47 86 11 8

* Эксперимент по сбору рентгенодифракционных данных проводили на источнике синхротронного излучения (ОЕБУ, Гамбург)

Таблица 2. Параметры уточнения структур БШРИ

Параметры Наименование объекта (кристалл)

Нативный фермент ЭШРН Комплекс 5ЩРН с тимином Комплекс ЭЛ/РН с ионом калия Комплекс БШРН с урацилом Комплекс 8ШРН с уридином

Область разрешения, А 1 76-8 00 (1 760 - 1 807) 8 00-1 90 (1 950-1 900) 15 00-1 72 (1 75-1 72) 8 00-2 15 (2 41-2 15) 26 84-2 49 (2 51-2 49) 21 00-2 90 (2 99-2 90)

Срезка набора, а(|Р|) 2 2 0 2 2 0

Ум. (А^Юа) 1 9 1 86 1 7 2 26 22 2 29

Количество растворителя, % 39 6 34 02 38 4 45 51 447 42 54

Количество атомов аминокислотных остатков 3542 3548 11730 11196 11256 11006

Количество молекул воды 265 175 707 324 218 81

Количество атомов лигандов 0 0 203 3 70 107

1^ГасЮг, (%) 16 3(22 5) 20 37 (22 5) 15 5(16 2) 21 2(24 8) 22 1 (29 6) 21 2 (26 8)

Яосс, (%) 20 7(30 6) 24 69 (30 6) 18 4 (22 4) 24 1 (28 5) 25 4 (34 2) 25 5 (31 9)

Среднее значение температурного фактора (А2) для атомов 22 54 33 65 8 46 11 65 25 7 5 87

длин связей, А 0 007 0 009 0 008 0 005 0 006 0 006

валентных углов, град 1 138 1223 1 24 0 747 0 976 0 989

Статистика Рамачандрана распределения двугранных углов

в наиболее благоприятных областях, % 89 3 89 0 90 2 89 2 88 1 88 9

частично разрешенных областях, % 10 2 10 5 93 10 2 11 4 106

в разрешенных областях, % 05 05 05 06 05 05

в запрещенных областях, % 00 00 00 00 00 00

Код структуры в РОВ 20ХР 21(35 2Н1Ш 20ЕС 2Н\Ш

Электронная плотность не наблюдалась для первых чрех аминокислотных остатков N-конца во всех молекулах исследованных структур уридиифосфорилазы 6' 1урЫтигшт (остатки 1-5 6 каждой субъединице молекулы). Эти остатки были исключены из окончательной модели.

После расчета разностных карт электронной плотности (Го-Рс) для соответствующих, комплексов в области активного центра фермента были обнаружены пики электронной плотности, которые были интерпретированы как молекулы: уридина (рис. 2а); у ради л а и иона фосфата; тиминз и иона фосфата (рис. 26); и ионы калия. Соответствующие молекулы субстратов, продуктов реакции и растворители вписаны в области пиков электронной плотпости.

АмйША

HîsSB

Arg3ÚA

G] ni66А

ArgSIA

Glu 198A

Art: .10 A

IlisSB

Arg91A

Ghil98A

Argl6SA

M et L 97 A

Gin 166 A

б

Рисунок 2. Область активного центра фермента с вписанными в электронную

плотность молекулами дигапдов соответствующих комплексов с: (а) уридином (Urd) (ID PDB: 2HWU); (б) тимином (Tdr) и ионом фосфата (Php)

(ID PDB: 2HRD) Примечание: красными шариками обозначены молекулы воды

Пространственная организация фермента в свободном и лигандированном состоянии

Третичная структура мономера относится к классу аф-белков (рис. 3). В центре мономера находится смешанный (3-дист, окруженный спиральными участками. Общее содержание спиральных элементов вторичной структуры на мономер составляет 34%, а

ß-лент - 19%. Внутренняя часть молекулы выстлана преимущественно гидрофобными остатками.

Из настоящего ренттено структурного исследования кристаллов следует, что на асимметричную часть ячейки (табл. 2) приходится один гомодимер (нелигандированный фермент) гексамерной молекулы StUPh, возникающей благодаря кристаллографической оси симметрии третьего порядка, или генеамер (кристаллические комплексы StUPh), имеющий н е кристаллы раф и ческую ось симметрии третьего порядка (рис. 4). Четвертичная структура молекулы StUPh, как в кристаллическом состоянии, так и в растворе (результаты нативного электрофореза) является гшевдоге кс ам ер н ы м образованием с точечной группой симметрии Lj3L2, аналогично четвертичной структуре уридинфосфорилазы из Е, coli. Однако независимой структурно-функциональной единицей молекулы гексамерной молекулы StUPh является именно ее гомодимер.

Среднее квадратичное отклонение (r.m.s.d.) между атомами основной цепи субъединиц А и В гомодимера составило 0.695 А, что свидетельствует об идентичности хода основной цепи обоих мономеров. НаибольЕ/гее различие- приходится, прежде всего, на подвижные участки в области последовательности аминокислотных остатков с 160 по 169 и с 221 по 225.

Значение r.m.s.d, (1.865Ä) между атомами боковых цепей еубъедипиц гомодимера существенно выше, чем для атомов основной цепи, что свидетельствует о большой подвижности атомов боковых групп. Наибольшее отклонение имеют атомы боковых цепей, как в указанных выше участках, так и в аминокислотных остатках Arg30, Lys33, Lys40, Glu49, Arg87. HislOl, Glul42, Lysl45, His240.

Структурно-идентичные гомодимеры стабилизированы, прежде всего, за счет сил гидрофобного взаимодействия и водородных связей, которые практически равномерно распределяются по всей поверхности м ежсу бъедшш чноЙ» контакта.

В каждой из еубъедипиц гомодимера локализовано по два гидрофобных участка. Так, в А-субъединице одна из гидрофобных областей образована аминокислотными остатками 11е8бА, Leu211A, Leul6A, Cys206A, Phel28A, Phe89A, Val42A, ПебЗА,

Рисунок 3. Пространственная структурная организация мономера З^Р!! с элементами вторичной структур),1 молекулы

Ш205А, Ьеи203А, \'а!64А, Тгр53А, СукбЗА, Ьей202А, Уа124А, Ьси37А, Уа131 А, Уа178А, а вторая, более протяженная гидрофобная область, составлена остатками Ьеи57А, ии253Л, Ьеи252А. Vа!246А. Уа1245А, Уа1242А, Сук 136А, ЬеиГ40А, 1Ы47А, \'а:141А, Ис244А, МеЙ15А, Уа1131А, Уа1216А, Уа1109А, ЬеиЮЗА, Уа1107А, Уа1155А, Уа1219А, Ме1193А, Уа1104А, Уа1192А, Тгр187А, Ис228Л, 11е220А, Ме1234А, Туг195А.

Рисунок 4. Пространств синая структурная организация с элементами вторичной структуры молекулы: (а) димера (пативпая структура фермента, ГО РВВ: 20ХР); (б)

гексамера 51ЦРЬ (комплекс с ионом калия, ГО РОВ: 20ЕС) Влияние копок калия. Анализ разностных карт электронной плотности комплекса уридинфосфорилазы с ионом калия позволил локализовать пики электронной плотности

в районе 01и49, 11е69, 8ег73, которые были интерпретированы как ионы калия. Координационное окружение иона калия формируется остатками аминокислот из соседних субъединиц гомодимера. (рис. 46). При этом наблюдаются конформационные изменения остатков С1и49 и 8ег?3, входящих в координационную сферу К', по сравнению со структурой, где ионы калия отсутствуют (рис. 5). Данные структурные изменения аминокислотных остатков, связанные с образованием координационных связей ионов калия, вероятно, способствуют стабилизации гомодимера у ри д и нф осфор и л азы.

Рисунок 5. Копформации аминокислотных остатков в области локализации иона калия при его наличии (а) и отсутствии (б)

Активный центр фермента StUPii.

Сравнительный структурный анализ нативного фермента и его комплексов с: тимином и ионом фосфата; урацилом и ионом фосфата; уридином позволил локализовать остатки аминокислот, участвующих в связывании «фермент-субстрат (продукт)», определить нуклеозид- (пиримидин-, рибозо-) и фосфат-связывающие сайты, идентифицировать положение активного центра на поверхности фермента.

Нуклеозид-связывающий сайт. Анализ комплексов StUPh с урацилом, уридином и тимином, позволил локализовать пиримидин-связывающий сайт и идентифицировать аминокислотные остатки, входящие в его состав. Основными остатками во взаимодействии с урацилом являются Phel62A, Glnl66A, Argl68A и Arg223A (рис. 2) одной А-субъединицы гомодимера АВ. Данные аминокислотные остатки консервативны для большинства уридин фосфор и лаз и шрают ключевую роль в узнавании пиримидинового кольца субстрата. Следует отметить, что Phe7 сам не вступает во взаимодействие с субстратом, но его положение определяется наличием (отсутствием) пиримидинового кольца субстрата в активном центре. Молекулы урацила, тимина и ниримидиновая часть уридина образуют водородные связи с атомами боковой цепи Gin]66 и Argl68 (рис. 6). Показано, что в случае связывания уридина (урацила) NE2 и ОЕ1 атомы Glnl66 формируют водородные связи с N3- и 02-атомами пиримидинового кольца, a NH2 атом Argl68 взаимодействует с 04-атомом уридина (урацила). Однако в случае комплексов StUPh с тимином NE2 и ОЕ1 атомы Gin 166 формируют водородные связи только с N3-атомом пиримидинового кольца основания. Тем самым структурно показано, что сродство фермента к уридииу (урацилу) выше, чем к тимину. Так как StUPh расщепляет нуклеозиды, производные тимина и урацила, но не

а

б

расщепляет производные цитозина, то, следовательно, П1п166 и Аг§168 являются ключевыми остатками в узнавании субстрата при прохождении ферментативной реакции.

б

Т(1г

в

Рисунок 6. Ключевые аминокислотные остатки урацил-связывающего сайта и связанные с ними молекулы: (а) уридина (иге!) (Ш РОВ: 2НЛ\'и); (б) урацила (ига); (и) тимина (ТсЗг) (ГО РИВ: 2НТШ) Примечание: вероятные водородные связи показаны пунктирными линиями (значение длин связей приведены в А). Синими шариками обозначены молекулы поды.

Комплекс 8(ЦРЬ с уридином так же позволил локализовать место связывания рибозы (рис. 7). Р и бозо-с вязываю щи й сайт формируют Ат91 А, ТЬг94А, Ме^97 А, 01и198А А-субъединицы и Н^ЗВ В-субъединицы гомодимера АВ. С 2'- и 3'-гидроксилами рибозы формируют водородные связи А^91А, Ме(197А, 01и198А; с 4'-гидроксилом - ТЪг94А; с 5'-гидроксилом - Н^ВВ. Данные остатки также являются высоко консервативными среди уридинфосфорилаз из различных источников.

Рисунок 7. Ключевые аминокислотные остатки рибозо-связывающего сайта в комплексе 8ШРЬ с уридином (1Ы) (ГО РОВ: 2Н\Уи) Примечание: вероятные водородные связи показаны пунктирными линиями (значение длин связей приведены в А).

Ф ос фат-с в я з ы в ающ и й сайт. Комплекс ЗЛГРЬ с тимичом и ионом фосфата позволил локализовать фосфат-связывающий сайз и идентифицировать остатки аминокислот, участвующие в связывании фосфата (рис. 8). Атомы кислорода фосфатного иона образуют водородные связи с АгеЗОА, Ага9! А, ТЬг94А и 01у26Л А-субъединицы и Аг£48В В-субъединицы.

.\lctl97A

Агй48Р

2.81

С1у26А

2.76

ТЬг94А

Аг§91А

Рисунок 8. Взаимодействие иона фосфата (РЬр) с аминокислотными остатками в активном центре ЁЗШРЬ в комплексе с тимином Примечание: вероятные водородные связи показаны пунктирными линиями (значение длин связей приведены в А). Синими шариками обозначены молекулы воды.

Анализ структур полученных комплексов позволил выявить, что в формировании ахтианргО центра принимают участие аминокислотные остатки обеих субъединиц одного гомодимера. Каждый т активных центров включает в себя пиримидин-, рибозо-и фосфэт-связывающие сайты. Первый активный центр гомодимера АВ ЗЛТРЬ (А-а.ц.) образован аминокислотными остатками: С1у2бА, А^ЗОА, Arg91A, ТЪг94А, 01п166Аг Лгй168А, Ме1197А, ОЫ98А, Аг§223А А-субъединицы и Шв8В, Аг§48В - В-субъедипицы. Второй активный центр (В-а.ц.) - формируют С1у26В, А^ЗОВ, А^91 В, Т111-94В, 01п166В, А^168В, МеП97В, С1и!98В, Arg223B В-субъединицы и Ш8А, Аг^;48А А-субъединицы. Боковые группы остатков аминокислот каждого из активных центров располагаются в области субстратного каньона, находящегося на поверхности фермента.

С точки зрения пространственной структуры А- и В-а. ц. гомодимера достаточно идентичны - глп.я.с! между атомами основной цени равняется 0.940А. Следует отметить, что наибольшее различие наблюдается между боковыми группами А^48А и Аг§48В, которые повернуты друг относительно друга приблизительно на 90°, и Аг§30А и Аг§3013.

Таким образом, на гомодимер гсксамерной молекулы 8ШРЬ приходится два структурноподобпых ферментативных центра, каждый из которых включает в себя пиримидин-, рибозо- и фоефнт-связывакяцие сайты.

Анализ кристаллических структур фермента ЯЩРЬ, как в свободной, так и в лигандированной формах, позволил локализовать петлю, сформированную аминокислотными остатками 224-234, играющую важную роль при функционировании активного центра и находящуюся или в «открытой», или в «закрытой» копформации. Оказалось, что существенных изменений в позициях аминокислот, взаимодействующих с субстратами, не наблюдается. Основные изменения происходят и окружении

активного центра. Вероятно, данная петля открывает или закрывает доступ растворителя (субстрата) в область активного центра. Показано, что наблюдается статистическое распределение положения петли в пелигаидированной Ж1РЬ, в частности открытая конформаит петли была обнаружена в структуре, исследованной с разрешением 1.90А (Ш ТОВ: 2105), а закрытая - в структуре, исследованной с разрешением 1.76А (ГО РОВ: 20ХР). Закрытое положение этой петли фиксируется водородными связями, которые образует 01и227 с Агз168, Туг169 и Акр 170. При открытой конформации петли остаток С1и227 экспонирован в растворитель и взаимодействует с молекулами воды. Наиболее вероятно, что изменение положения петли, формируемой остатками 224-234, индуцируется взаимодействием субстратов и продуктов реакции с аминокислотными остатками активного центра (рис. 9).

Рисунок 9. Наложение двух пространственных, структур мономеров 5и7РЬ с открытой и закрытой конформацией петли Примечание: желтым цветом показана структура фермента с открытой конформацией петли; синим - структура с закрытой конформацией петли. Область петли обведена красным кружком.

Кроме того, было установлено, что присутствие иона калия в структуре фермента стабилизирует открытое положение петли (рис, 10). Вероятно, наличие данного щелочного металла может повышать активность фермента, так как упрощается прохождение молекул субстратов в область активного центра белка, что определяется фиксированным положением петли, имеющей открытую к он формацию.

Сравнительный анализ элементов вторичных структур субъединиц нелигандированных ферментов (ID PDB 2IQ5 и 20XF) и комплекса StUPh с ионом калия, для которых достаточно надежно идентифицировано открытое и закрытое положение петли на синтезах электронной плотности (1 44 о), позволил идентифицировать аминокислотные остатки, участвующие в переходе петли из открытого в закрытое положение (рис 10) В частности, аминокислотные остатки Asn230, А1а231, Glu232 и Thr233 образуют виток спирали при открытой конформации петли, который расплетается и переводит петлю в закрытое положение

10 20 30 40 50 60

11111!

1 - 60 i:SXSDVF.JLGlTKímLQGAQLAIVPGDPERVEKIAaniCKPVriA3.J.R£FTSURA2LDGX * Г ХЗЗЗЗТТХ SSS 13 -id-i ЗЗ-ЗЗЗЗХ S S Т Т 3SS5SXXXX

** I ХЗЗЗЗХТХ SSS 13 -H-i 33-Í33SX S S I X 33SSSXXXX

*** X X X-i 33XIX SSS ХЗ J-id 53Í3X5T S S X X 35S5SXXIX

"0 SO 90 100 110 120

1 ¡ 1 ! ! 61 - 120 AVIVC5XGIGGPSI3IAVEELAQLGIRXFLRIGIXGAXQPJIír*GDVLVIXA3T*RLDGA3 * SSSS -íJ..-i-!-íJ-i.JJ."-iJ-iJ.-iI SSSSSSSSSS X XX XXSSSS SSS 3Ci

-* SSSS J-íJ-!-íJ-í•>.JJJJJ.JI SSSSSSSSSS X XX XXSSSS SSS 33J

«** SSSS JJJJJJ.jjjjjjjj SSSSSSSSSS X XX XXSSSS 333 33J

.SO LJ.FAPUSFPA''ADFACTXAL"EAA:'SIGAIX.J"GT1A33DXFlFGCERY£Xjr5SR"

* ЗЗЗХХ X pí-JJ,IJJJJJJJ.JJ.I SSSS 3S3S3 33 XX X '

** ЗЗЗХХ X JJJJJJJJJ SSSS SSSSS 33 XX X '

*** ЗЗЗХХ X X-í.-iJJ..JJ.-iJ-i-i.J.-iJ.-iX SSSS SSSSS 33 XX X ■

190 200 210 220 230 240

t ' I I 1 i

240 KGSieSWQAl!G\lIIIYEnS3AXlLI3ICASQGLRAG:r.-AGVI\,íiaXGQSIF:iAEX21XQXES.'i

* xx4.-í-;-í.-í"j-í-,x sss jr,j-ij-íj j-í.-íhxi ssssssss sx x x.-'-;.-:.-í-í--"-!-!-i

** XX.-i-J!"->->-4-'-iX SSS ->J.rf-¡JH4TT SSSSSSSS SX X JJJJJ-JJ

*** XX-íH.-i.-ír'-L-'-íI SSS .J-i:H:H-iJ-í-,*TT SSSSSSSS SX X

250

241 - 253 A'TTWEAARRLL

** JJJJJJJ33J33

*»* rf-í.-iJ..JJ.-í333333

Рисунок 10. Сравнительный анализ первичной последовательности аминокислотных остатков и элементов вторичной структуры для мономеров молекул нелигандированных ферментов ЗШрЬ (ГО РОВ 2105 и 20ХР) и комплекса ЭШРЬ с ионом калия Примечание (*) нативная БШРЬ с открытой конформацией петли (1С РОВ 2105), (**) нативная ЗШРЬ с закрытой конформацией петли (ГО РОВ 20ХР), (***) комплекс с ионом калия с открытой конформацией петли (ГО РОВ 20ЕС)

Основные результаты и выводы:

1 Оптимизирована методика получения кристаллов высокого разрешения нелигандированной в виде димера

Получены наборы рентгенодифракционных интенсивностей на источнике синхронтронного излучения с разрешением 1 7бА

Решены и уточнены кристаллические структуры нелигандированного фермента с параметрами элементарной ячейки а=150 86 А, с=47 84 А, у = 120°, пргр 113, Кгасюг= 16 3%, Япее= 20 7%, гш её по длинам связей и валентным углам 0 007А и 1 138° соответственно (открытая конформация петли активного центра) и параметрами а= 151 66 А, с=47 92А, пр гр ЯЗ, К^сю^ 20 37 %, 24 69 %, г т б <1 по длинам связей и валентным углам 0 009А и 1 223° соответственно (закрытая конформация петли)

2 Исходя из разработанных условий кристаллизации нативного фермента, были оптимизированы условия получения комплексов БШРЬ с ионом калия, уридином, урацилом и ионом фосфата, тимином и ионом фосфата

С выращенных кристаллов комплексов получены наборы рентгенодифракционных интенсивностей на источнике синхронтронного излучения с разрешениями 1 70А (комплекс с тимином и ионом фосфата), 2 15А (комплекс с ионом калия), 2 49А (комплекс с урацилом и ионом фосфата), 2 90А (комплекс с уридином)

Решены и уточнены структуры комплексов БШРЬ с субстратами и продуктами реакции Параметры для комплекса с урацилом а=89 00 А, Ь=124 26 А, с=133 9бА, пр гр Р2[212| КгаС1ог= 22 1%, Ясгее= 25 4%, гт в с! по длинам связей и валентным углам 0 006А и 0 976° соответственно, для комплекса с тимином а=88 79 А, Ь=124 07 А, с=134 11 А, пргр Р212]21 11гасюг= 15 5%, 11^= 18 4%, гтвс! по длинам связей и валентным углам 0 008А и 1 24° соответственно, для комплекса с ионом калия а=88 52 А, Ь=123 98 А, с=133 52А, пр гр Р2,212ь КГас(ог,= 21 2%, КГгее= 24 1%, г ш в с1 по длинам связей и валентным углам 0 005А и 0 747° соответственно, для комплекса с уридином а=88 88 А, Ь=123 99 А, с=134 1бА, пр гр Р2,2,2,, КГмог,= 21 2%, 11Ггее= 25 5%, г ш в с1 по длинам связей и валентным углам 0 ООбА и 0 989° соответственно

3 На основании анализа уточненных структур комплексов Й11РЬ с лигандами

• установлены аминокислотные остатки пиримидин-, рибоза- и фосфат-связывающих сайтов,

• показано, что на гомодимер приходится два асинхронно работающих активных центра фермента, каждый из которых формируется аминокислотными остатками обеих субъединиц гомодимера

4 Анализ пространственной организации ферментативного центра ЛиРИ показал, что аминокислотные остатки с 222 по 230(233) включительно образуют петлю, регулирующую доступ субстрата к сайтам связывания энзима В двух своих крайних положениях петля находится в «открытой» конформации (составлена а о с 222 по 230) или «закрытой» (составлена а о с 222 по233)

Впервые показано, что для свободного фермента возможна, как «открытая», так и «закрытая» конформация петли

Впервые показано, что присутствие ионов калия стабилизирует положение петли в открытой конформации, что может привести к увеличению скорости ферментативной реакции

5 Сравнительный анализ нуклеозид- (пиримидин-, рибозо-) связывающего сайта комплексов БШРИ с уридином, урацилом и тимином показал, что сродство фермента к уридину (урацилу) выше, чем к тимину Кроме того, можно предположить, что разница в скорости биохимической реакции расщепления ферментом нуклеозидов производных

пиримидина связана не только с особенностью строения фермента, а также определяется природой, индуктивными и мезомерными эффектами заместителей нуклеозида

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) БФ Павлюк, В И Тимофеев, MB Донцова, А А Лашков, А Г Габдулхаков, A M Михайлов "Структурная организация мочекулы фермента уридинфосфоршазы из S Typhimw шт в свободном состоянии с разрешением I 90 À "// «IV Съезд общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова» С 192193,2006

2) В И Тимофеев, Б Ф Павлюк, А А Лашков, Т А Серегина, А Г Габдулхаков, |Б К Вайнштейн], A M Михайлов "Строение гомодимера мояекучы уридинфосфорилазы salmonella typhimurmm в нашивном состоянии при разрешении 1 9À"lI Кристаллография, 2007, том 52, №6, с 1117-1124

3) Vladimir I Timofeev, Alexandi A Lashkov, Bogdan Ph Pavlyuk, Tat'yana A Seiegina, Galina S Kachalova, Christian Betzel Azat G Gabdoulkhakov, Nadezhda E Zhukhlistova and Al'bert M Mikhailov "Ciystalhzation andptehminary X-ray structure of the Salmonella typhimurmm uridine phosphorylase with 2,2'-anhydroundine and potassium ion"//Acta Crystallographica .Section F, 2007, F63, Part 10, pp 852-854

4) T A Серегина, Б Ф Павлюк, В И Тимофеев, А В Ляшенко, H Е Жухлистова, A M Михайлов "Кристаллизация уридинфосфоршазы из salmonella typhimui ium в наземных условиях, микро- и макро- гравитации" // «Российский симпозиум «Космическое материаловедение - 2007» С 65,2007

5) Михайлов A M , Лашков А А , Тимофеев В И , Павлюк Б Ф , Корнилов В В "Атомная структура комтекса уридинфосфоричазы Salmonella typhimurmm с фосфат-ионом и 2,2 -ангидроуридином" H «III Российским симпозиум «Белки и пептиды»», Пущино - 2007, Тезисы докладов, С 26, 2007

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Vaguine, А А , J Richelle, and S I Wodak, SFCHECK a unified set of pioceduies for evaluating the quality of macromoiecular stiucture-factoi data and their agreement with the atomic model Acta Crystallographica Section D, 1999 55(1) p 191-205

2 Laskowski, R A , et al, PROCHECK a piogram to check the steieochemical quality of protein structures Journal of Applied Crystallogiaphy, 1993 26(2) p 283-291

3 Kabsch, W, Integration, scaling, space-gioup assignment and post tefinement XDS, in International Tables foi Crystallography, M G Rossmann and E F Arnold, Editois 2001, Dordiecht Kluwer Academic Publishers

4 Dontsova MV, Gabdoulkhakov AG, Molchan OK et al Pieliminaiy investigation of the thiee-dimensional stiuctuie of Salmonella Typhimw mm undine phosphorylase in the crystalline state ActaCiyst F 2005 V61 P 337-40

Заказ№ 76/10/07 Подписано в печать 05 10 2007 Тираж 150экз Уел пл 1,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76 (495) 778-22-20 ^ , 4 \v\vw с/г ги , е-тш1 т/о@с/г ги

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1 онкологические заболевания и методы химиотерапии опухолевых процессов основанные на применении аналогов пуринов и пиримидинов.

1.2 основные классы ингибиторов пиримидиновых фосфорилаз.

1.3 медицинское применение ингибиторов уридинфосфорилазы в химиотерапии опухолей.

1.4 медицинское применение ингибиторов уридинфосфорилазы, как антибактериальных и противопаразитических препаратов.

1.5 механизмы фосфоролиза на основании структурных и кинетических данных.

1.6 Общая характеристика нуклеозидфосфорилаз.

1.6.1 нуклеозидфосфорилазы состоящие из одного домена.

1.6.2 нуклеозидфосфорилазы состоящие из двух доменов.

1.6.3 рентгеноструктурные исследования.

1.6.4. структурная организация активного центра.

На сегодняшний день особый интерес для исследования уделяется, самым многочисленным функциональным классам белков: белки-ферменты. Без этих природных катализаторов невозможно протекание с приемлемой скоростью в физиологических условиях практически ни одной химической реакции в организме. Многие фармакологические препараты, применяемые в медицинской практике, взаимодействуют именно с белками-ферментами, ослабляя или, реже, усиливая, их каталитическую активность.

Некоторые белки-ферменты используются клетками опухолей и паразитических микроорганизмов для защиты от разрушительного воздействия на них со стороны лекарственных препаратов. Преодолеть подобный вид устойчивости можно двумя способами: либо искать новые варианты препаратов, устойчивые к ферментативной инактивации, либо попытаться селективно подавить ферментативную активность белка. Второй способ можно реализовать, используя высокоселективный ингибитор фермента.

Синтез новых высокоэффективных и высокоселективных ингибиторов, на сегодняшний день, невозможен без знания пространственной структуры белков-мишеней и пространственных аспектов взаимодействия белков с лигандами. Наиболее мощным методом исследования трёхмерных структур биомакромолекул на атомарном уровне является метод рентгеноструктурного анализа (РСА) монокристаллов. С помощью данного метода возможно определение пространственной структуры глобулярных белков с молекулярной массой от нескольких тысяч до нескольких сотен тысяч дальтон и их комплексов с субстратами и вероятными ингибиторами, а так же сложных надмолекулярных образований.

Нуклеозидфосфорилазы осуществляют фосфоролиз пуриновых и пиримидиновых оснований, и обеспечивают клетку предшественниками нуклеотидов, тем самым составляют альтернативу синтезу нуклеотидов de novo. Фосфоролиз заключается в расщеплении C-N гликозидной связи ионом фосфата с образованием свободного основания и рибоза-Г-фосфата.

Интерес к структурным особенностям нуклеозидфосфорилаз, и, в частности, уридинфосфорилазы возник из-за их способности инактивировать химиотерапевтические препараты - производные пуриновых и пиримидиновых оснований, в клетках злокачественных новообразований, а так же ввиду важности данного вида ферментов для жизнедеятельности многих паразитических микроорганизмов.

К настоящему времени описано большое количество нуклеозидфосфорилаз как низших, так и высших организмов. Несмотря на то, что нуклеозидфосфорилазы осуществляют схожую реакцию расщепления нуклеозида, среди них наблюдается низкая гомология аминокислотных последовательностей.

Объектом изучения в данной работе является фермент уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium (StUPh) - однодоменная пиримидиннуклеозидфосфорилаза. Механизм его взаимодействия с субстратами не изучен. Предположительно реакция протекает по механизму нуклеофильного замещения. До последнего времени структуры однодоменных пиримидинфосфорилаз были мало исследованы. Определена была только пространственная структура уридинфосфорилазы Escherichia coli (Е. coli). Изучавшаяся нами уридинфосфорилаза S. typhimurium, хотя и близка по последовательности к ферменту из Е. coli, отличается от него по ряду свойств: обладает более широкой субстратной специфичностью, а также более высоким сродством к субстрату. Поэтому основное внимание в данной работе было сосредоточено на исследовании пространственной структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium и ее комплексов с аналогами субстратов.

Полученные в ходе работы структурные данные могут, оказаться полезными в синтезе новых высокоселективных и высокоэффективных ингибиторов уридинфосфорилазы, с помощью которых увеличится эффективность и уменьшаться экономические затраты консервативного медикаментозного лечения целого ряда онкологических заболеваний.

Основные результаты и выводы:

1. Оптимизирована методика получения кристаллов высокого разрешения нелигандированной StUPh в виде димера.

Получены наборы рентгенодифракционных интенсивностей на источнике синхронтронного излучения с разрешением 1 ,7бА.

Решены и уточнены кристаллические структуры нелигандированного фермента с параметрами элементарной ячейки а=150.86 А, с=47.84 А, у = 120°, пр.гр. R3, Rfactor= 16.3%, Rfree= 20.7%, r.m.s.d. по длинам связей и валентным углам 0.007А и 1.138° соответственно (открытая конформация петли активного центра) и параметрами а=151.66 А, с=47.92А, пр.гр. R3, Rfactor= 20.37 %, Rfree= 24.69 %, r.m.s.d. по длинам связей и валентным углам 0.009А и 1.223° соответственно (закрытая конформация петли).

2. Исходя из разработанных условий кристаллизации нативного фермента, были оптимизированы условия получения комплексов StUPh с: ионом калия; уридином; урацилом и ионом фосфата; тимином и ионом фосфата.

С выращенных кристаллов комплексов получены наборы рентгенодифракционных интенсивностей на источнике синхронтронного излучения с разрешениями: 1.70А (комплекс с тимином и ионом фосфата); 2.15А (комплекс с ионом калия), 2.49А (комплекс с урацилом и ионом фосфата), 2.90А (комплекс с уридином).

Решены и уточнены структуры комплексов StUPh с субстратами и продуктами реакции. Параметры для комплекса с урацилом: а=89.00 А, Ь=124.26 А, с=133.9бА, пр.гр. P2i2,2u Rfactor= 22.1%, Rfree= 25.4%, r.m.s.d. по длинам связей и валентным углам 0.006А и 0.976° соответственно; для комплекса с тимином: а=88.79 A, b=124.07 А, с=134.11А, пр.гр. P2i2i2i( Rfactor= 15.5%, Rfree= 18.4%, r.m.s.d. по длинам связей и валентным углам 0.008А и 1.24° соответственно; для комплекса с ионом калия: а=88.52 А,

97 b=123.98 A, c=133.52A, np.ip. P2,2,2b Rfactor,= 21.2%, Rfree= 24.1%, r.m.s.d. no длинам связей и валентным углам 0.005А и 0.747° соответственно; для комплекса с уридином: а=88.88 А, Ь=123.99 А, с=134.1бА, пр.гр. P2i2i2ls Rfactors= 21.2%, Rfree= 25.5%, r.m.s.d. по длинам связей и валентным углам 0.006А и 0.989° соответственно.

3. На основании анализа уточнённых структур комплексов SVUPh с лигандами:

• установлены аминокислотные остатки пиримидин-, рибоза- и фосфат-связывающих сайтов;

• показано, что на гомодимер приходится два асинхронно работающих активных центра фермента, каждый из которых формируется аминокислотными остатками обеих субъединиц гомодимера.

4. Анализ пространственной организации ферментативного центра SYUPh показал, что аминокислотные остатки с 222 по 230(233) включительно образуют петлю, регулирующую доступ субстрата к сайтам связывания энзима. В двух своих крайних положениях петля находится в «открытой» конформации (составлена а.о. с 222 по 230) или «закрытой» (составлена а.о. с 222 по233).

Впервые показано, что для свободного фермента возможна, как «открытая», так и «закрытая» конформация петли.

Впервые показано, что присутствие ионов калия стабилизирует положение петли в открытой конформации, что может привести к увеличению скорости ферментативной реакции.

5. Сравнительный анализ нуклеозид- (пиримидин-, рибозо-) связывающего сайта комплексов StUPh с уридином, урацилом и тимином показал, что сродство фермента к уридину (урацилу) выше, чем к тимину. Кроме того, можно предположить, что разница в скорости биохимической реакции расщепления ферментом нуклеозидов производных пиримидина связана не только с особенностью строения фермента, а также определяется природой, индуктивными и мезомерными эффектами заместителей нуклеозида.

1.7 заключение

Нуклеозидфосфорилазы, мономеры которых состоят из одного или двух доменов, представляют собой два структурно индивидуальных семейства ферментов, что катализируют похожие фундаментальные биохимические реакции. Наиболее вероятно, что произошли они от разных предшественников и эволюционировали независимо.

Нуклеозидфосфорилазы, вовлеченные в фосфоролиз большого количества пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов, имеют только два способа укладки белковой молекулы. Анализ последовательностей нуклеозидфосфорилаз в сочетании с известными пространственными структурами обеспечил информацией относительно структурно -функциональной взаимосвязи в обоих этих семействах и помог объяснить различия и схожесть, что существует среди принадлежащих им ферментов. В то время как укладка белковой молекулы в первом и втором типах не похожа, положение субстратов в активном центре и конформация связанных нуклеозидов оказались подобными. К тому же, хотя механизм катализа для тимидинфосфорилаз не изучен так, как для пуриновых нуклеозидфосфорилаз, он возможно очень похож на предполагаемый механизм катализа для ферментов первого типа.

Кроме этого, примеры нуклеозидфосфорилаз показали, что пространственные структуры часто более консервативны среди белков выполняющих одинаковые функции, чем их аминокислотные последовательности. Поэтому структурная информация может служить более точной оценкой в определении дальнего родства, чем идентичность последовательностей, а также может оказаться полезной для поиска клинически пригодных ингибиторов.

Из вышеизложенного следует, что структурная информация об уридинфосфорилазе из различных организмов, как в нативном состоянии, так и в комплексе с субстратами, псевдосубстратами и ингибиторами, важна не только для оптимизации противоопухолевой терапии, но и для создания новых антибиотиков и противопаразитических препаратов.

Объектом изучения в данной работе является фермент уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium. Механизм его взаимодействия с субстратами не изучен. До последнего времени структуры уридинфосфорилаз были мало исследованы. Определена была только пространственная структура уридинфосфорилазы Escherichia coli. Изучавшаяся нами уридинфосфорилаза S. typhimurium, хотя и близка по последовательности к ферменту из Е. coli, отличается от него по ряду свойств: обладает более широкой субстратной специфичностью, а также более высоким сродством к субстрату (табл. 4). Поэтому основное внимание в данной работе было сосредоточено на исследовании пространственной структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium и ее комплексов с аналогами субстратов.

1. Давыдов, М.И. and Е.М. Аксель, Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2002 г. ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, 2004: р. 256.

2. Boyle, P. and J. Ferlay, Cancer incidence and mortality in Europe, 2004. Ann Oncol, 2005.16(3): p. 481-8.

3. Ганцев, Ш.Х., Онкология. 2004: ООО "Медицинское информационное агентство". 550.

4. Visser, G.W., et al., Tissue distribution of 18F.-5-fluorouracil in mice: effects of route of administration, strain, tumour and dose. Cancer Chemother Pharmacol, 1990.26(3): p. 205-9.

5. Kemeny, N., Role of chemotherapy in the treatment of colorectal carcinoma. Semin Surg Oncol, 1987.3(3): p. 190-214.

6. Куценко, C.A., Основы токсикологии. 2002, Санкт-Петербург.

7. Heidelberger, С., et al., Fluorinated pyrimidines. VI. Effects of 5-fluorouridine and 5-fluoro-2'-deoxyuridine on transplanted tumors. Proc Soc Exp Biol Med, 1958. 97(2): p. 470-5.

8. Drabikowska, A.K., et al., Inhibitor properties of some 5-substituted uracil acyclonucleosides, and 2,2-anhydrouridines versus uridine phosphorylase from E. coli and mammalian sources. Biochem Pharmacol, 1987. 36(23): p. 4125-8.

9. Veres, Z., et al., Inhibition of uridine phosphorylase by pyrimidine nucleoside analogs and consideration of substrate binding to the enzyme based on solution conformation as seen by NMR spectroscopy. Eur J Biochem, 1988. 178(1): p. 173-81.

10. Watanabe, S. and T. Uchida, Cloning and expression of human uridine phosphorylase. Biochem Biophys Res Commun, 1995. 216(1): p. 265-72.

11. Darnowski, J.W. and R.E. Handschumacher, Tissue uridine pools: evidence in vivo of a concentrative mechanism for uridine uptake. Cancer Res, 1986. 46(7): p. 3490-4.

12. Lee, K.H., et al., Inhibition of nucleoside transport in murine lymphoma L5178Y cells and human erythrocytes by the uridine phosphorylase inhibitors 5-benzylacyclouridine and 5-benzyloxybenzylacyclouridine. Cancer Res, 1984. 44(9): p. 3744-8.

13. Niedzwicki, J.G., et al., Structure-activity relationship of ligands of the pyrimidine nucleoside phosphorylases. Biochem Pharmacol, 1983. 32(3): p. 399-415.

14. Veres, Z., et al., Biological activity of the potent uridine phosphorylase inhibitor 5-ethyl-2,2'-anhydrouridine. Drugs Exp Clin Res, 1987. 13(10): p. 615-21.

15. Iigo, M., et al., Differential effects of 2,2'-anhydro-5-ethyluridine, a uridine phosphorylase inhibitor, on the antitumor activity of 5-fluorouridine and 5-fluoro-2-deoxyuridine. Biochem Pharmacol, 1990. 39(7): p. 1247-53.

16. Pugmire, M.J. and S.E. Ealick, Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylases. Biochem J, 2002. 361(Pt 1): p. 1-25.

17. Morgunova, E., et al., Atomic structure at 2.5 A resolution of uridine phosphorylase from E. coli as refined in the monoclinic crystal lattice. FEBS Lett, 1995.367(2): p. 183-7.

18. Burling, F.T., et al., Structure of Escherichia coli uridine phosphorylase at 2.0 A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2003. 59(Pt 1): p. 73-6.

19. Jimenez, B.M., et al., Inhibition of uridine phosphorylase from Giardia lamblia by pyrimidine analogs. Biochem Pharmacol, 1989. 38(21): p. 3785-9.

20. Lee, C.S., B.M. Jimenez, and W.J. O'Sullivan, Purification and characterization of uridine (thymidine) phosphorylase from Giardia lamblia. Mol Biochem Parasitol, 1988. 30(3): p. 271-7.

21. Levene P.A. and Medigreceanu F. On nucleases. J. Biol. Chem. 1911, V.9, pp. 65 83.

22. Levene P A., Yamagawa M. and Weber I. On nucleosidases. I. General properties. J. Biol. Chem. 1924, V.60, pp. 693 706.

23. Levene P. A. and Weber I. On nucleosidases. II. Purification of the enzyme. J. Biol. Chem. 1924, V.60, pp. 707 715.

24. Kalckar H.M. Enzymatic synthesis of a nucleoside. J. Biol. Chem. 1945, V. 158, pp. 723-724.

25. Kalckar H.M. The enzymatic synthesis of purine ribosides. J. Biol. Chem. 1947, V. 167, pp. 477-486.

26. Friedkin M. and Roberts D. The enzymatic synthesis of nucleosides. I. Thymidine phosphorylase in mammalian tissue. J. Biol. Chem. 1954, V.207, pp. 245 256.

27. Friedkin M. and Roberts D. The enzymatic synthesis of nucleosides. II. Thymidine and related pyrimidine nuclosides. J. Biol. Chem. 1954, V.207, pp. 257 266.

28. Paege L.M., Schlenk F. Bacterial uracil riboside phosphorylase. J. Arch. Biochem. Biophys. 1952, V.40, pp. 42 49.

29. Kalckar H.M. Enzymatic microanalysis of purine compounds. J. Biol. Chem. 1945, V.158, pp. 313 314.

30. Kalckar H.M. Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes. III. Studies of the enzymes of purine metabolism. J. Biol. Chem. 1947, V.167, pp. 461 475.

31. Kalckar H.M. Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes. II. Determination of adenine compounds. J. Biol. Chem. 1947, V. 167, pp. 445-459.

32. Kalckar H.M. Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes. I. Determination of hydroxypurine compounds. J. Biol. Chem. 1947, V.167, pp. 429 443.

33. Lewis A.S., Glantz M.D. Bovine brain purine-nucleoside phosphorylase purification, characterization, and catalytic mechanism. J. Biochemistry. 1976, V.15, pp.4451 -4457.

34. Porter D.J. Purine nucleoside phosphorylase. Kinetic mechanism of the enzyme from calf spleen. J. Biol. Chem. 1992, V.267, pp. 7342 7351.

35. Lewis A.S., Glantz M.D. Monomeric purine nucleoside phosphorylase from rabbit liver. Purification and characterization. J. Biol. Chem. 1976, V.251, pp. 407-413.

36. Milman G., Anton D.L., Weber J.L. Chinese hamster purine-nucleoside phosphorylase: purification, structural, and catalytic properties. J. Biochemistry. 1976, V.15, pp. 4967 4973.

37. Jensen K.F., Nygaard P. Purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Purification and some properties. Eur. J. Biochem. 1975, V.51, pp. 253 265.

38. Shirea H, Yokozeki K. Purifications and properties of orotidine-phosphorolyzing enzyme and purine nucleoside phosphorylase from Erwinia carotovora AJ 2992. J. Agric. Biol. Chem. 1991, V.55, pp. 1849 1857.

39. Gilpin R.W. and. Sadoff H.L. Physical and catalytic properties of the purine nucleoside phosphorylases from cells and spores of Bacillus cereus T. J. Biol. Chem, Mar 1971; 246: 1475 1480.

40. Krenitsky Т.А., Mellors J.W. and Barclay M. Pyrimidine nucleosidases. J. Biol. Chem. 1965, V.240, pp. 1281- 1286.

41. Delia Ragione F, Oliva A, Gragnaniello V, Russo G.L., Palumbo R, Zappia V. Physicochemical and immunological studies on mammalian 5'-deoxy-5'-methylthioadenosine phosphorylase. J. Biol. Chem. 1990, V.265, pp. 6241 -6246.

42. Ferro A.J., Wrobel N.C. and Nicolette J.A. 5-Methylthioribose 1-phosphate: A product of partially purified, rat liver 5'-methylthioadenosine phosphorylase activity. J. Biochimica et Biophysica Acta Enzymology. 1979, V.570, pp. 65-73.

43. Kim B.K., Cha S., Parks R.J. Purine nucleoside phosphorylase from human erythroyctes. II. Kinetic analysis and substrate-binding studies. J. Biol. Chem. 1968, V.243, pp. 1771 1776.

44. Kim B.K., Cha S, Parks R.J. Purine nucleoside phosphorylase from human erythrocytes. I. Purification and properties. J. Biol. Chem. 1968, V.243, pp. 1763-1770.

45. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. Фаир-Пресс. Москва. 1998,715 с.

46. Carlson J.D., Fischer A.G. Characterization of the active site of homogeneous thyroid purine nucleoside phosphorylase. J. Biochim. Biophys. Acta. 1979, V.571, pp. 21 -34.

47. Erion M.D., Takabayashi K., Smith H.B., Kessi J., Wagner S., Honger S., Shames S.L., Ealick S.E. Purine nucleoside phosphorylase. 1. Structure-function studies. J. Biochemistry. 1997, V.36, pp. 11725 11734.

48. Erion M.D., Stoeckler J.D., Guida W.C., Walter R.L., Ealick S.E. Purine nucleoside phosphorylase. 2. Catalytic mechanism. J. Biochemistry. 1997, V.36, pp. 11735-11748.

49. Krenitsky ТА. Uridine phosphorylase from Escherichia coli : Kinetic properties and mechanism. J. Biochimica et Biophysica Acta Enzymology. 1976, V.29, pp. 352-358.

50. Kraut A., Yamada E.W. Cytoplsmic uridine phosphorylase of rat liver. Characterization and kinetics. J. Biol. Chem. 1971, V.246, pp. 2021-2030.

51. Zappia V., Delia Ragione F., Pontoni G., Gragnaniello V., Carteni-Farina M. Human 5'-deoxy-5'-methylthioadenosine phosphorylase: kinetic studies and catalytic mechanism. J. Adv. Exp Med. Biol. 1988, V.250, pp. 165-177.

52. Garbers D.L. Demonstration of 5'-methylthioadenosine phosphorylase activity in varius rat tissues. Some properties of the enzyme from rat lung. J. Biochimica et Biophysica Acta Enzymology. 1978, V.523, pp. 82 - 93.

53. Shugart L., Mahoney L., Chastain B. Kinetic studies of Drosophila melanogaster methylthioadenosine nucleoside phosphorylase. Int. J. Biochem. 1981, V.13,pp. 559-564.

54. Bennett E.M., Li C., Allan P.W., Parker W.B., Ealick S.E. Structural basis for substrate specificity of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase. J. Biol. Chem. 2003, V.278, pp. 47110 47118.

55. Narayana S.V. Refined structure of purine nucleoside phosphorylase at 2.75 A resolution. J. Acta Crystallogr. 1997, D53, pp. 131 142.

56. Koellner G., Luic M., Shugar D., Saenger W., Bzowska A. Crystal structure of calf spleen purine nucleoside phosphorylase in a complex with hypoxanthine at 2.15 A resolution. J. Mol. Biol. 1997, V.265, pp. 202 216.

57. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Federov A.A., Almo S.C., Ealick S.E. Calf spleen purine nucleoside phosphorylase complexed with substrates and substrate analogues. J. Chen. Biochemistry. 1998, V.37, pp. 7135 7146.

58. Appleby T.C., Erion M.D., Ealick S.E.The structure of human 5'-deoxy-5'-methylthioadenosine phosphorylase at 1.7 A resolution provides insights into substrate binding and catalysis. J. Structure Fold Des. 1999, V.7, pp. 629 -641.

59. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Koszalka G.W., Krenitsky T.A., Ealick S.E. The crystal structure of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase: a comparison with the human enzyme reveals a conserved topology. J. Structure. 1997, V.5, pp. 1373 1383.

60. Burling F.T., Kniewel R., Buglino J.A., Chadha Т., Beckwith A., Lima C.D. Structure of Escherichia coli uridine phosphorylase at 2.0 A. J. Acta Cryst. 2003, D59, pp. 73-76.

61. Appleby T.C., Mathews I.I., Porcelli M., Cacciapuoti G., Ealick S.E. Three-dimensional structure of a hyperthermophilic 5'-deoxy-5-methylthioadenosine phosphorylase from Sulfolobus solfataricus. J. Biol. Chem. 2001, V.276, pp. 39232 39242.

62. Pugmire M.J., Ealick S.E. Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylases. J. Biochem. 2002, V.361, pp. 1-25.

63. Zappia V., Oliva A., Cacciapuoti G., Galletti P., Mignucci G., Carteni-Farina M. Substrate specificity of 5'-methylthioadenosine phosphorylase from human prostate. J. Biochem. 1978, V.175, pp. 1043-1050.

64. Dontsova M.V., Savochkina Yu.A., Gabdoulkhakov A.G. et al. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of uridine phosphorylase from Salmonella Typhimurium. Acta Cryst. D. 2004. V.60. P.709-711.

65. Dontsova M.V., Gabdoulkhakov A.G., Molchan O.K. et al. Preliminary investigation of the three-dimensional structure of Salmonella Typhimurium uridine phosphorylase in the crystalline state. Acta Cryst. F. 2005. V.61. P.337-40.

66. Laster L., Blair A. An intestinal phosphorylase for uric acid ribonucleoside. J. Biol. Chem. 1963, V.238, pp. 3348 3357.

67. Zimmerman M. and Seidenberg J. Deoxyribosyl Transfer. I. Thymidine phosphorylase and nucleoside deoxyribosyltransferase in normal and malignant tissues. J. Biol. Chem. 1964, V.239, pp. 2618-2621.

68. Zimmerman M. Deoxyribosyl transfer. II. Nucleoside.-pyrimidine deoxyribosyltransferase activity of three partially purified thymidine phosphorylases. J. Biol. Chem. 1964, V.239, pp. 2622 2627.

69. Молчан O.K., Дмитриева H.A., Романова Д.В., JI. Эррайс Лопес, В.Г. Дебабов, А.С. Миронов. Выделение и первичная характеристика уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium. Биохимия. 1998, Т.63, вып. №2, с. 235 239.

70. Brunger, А.Т., et al., Crystallography & NMR System: A New Software Suite for Macromolecular Structure Determination. Acta Ciystallographica Section D, 1998. 54(5): p. 905-921.

71. Collaborative, The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Ciystallographica Section D, 1994. 50(5): p. 760-763.

72. Vagin, A. and Teplyakov, MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst., 1997.30: p. 1022-1025.

73. Winn, M.D., M.N. Isupov, and G.N. Murshudov, Use of TLS parameters to model anisotropic displacements in macromolecular refinement. Acta Ciystallographica Section D, 2001. 57(1): p. 122-133.

74. Brunger, A.T., M. Karplus, and G.A. Petsko, Ciystallographic refinement by simulated annealing: application to crambin. Acta Ciystallographica Section A, 1989. 45(1): p. 50-61.

75. Brunger, A.T., A. Krukowski, and J.W. Erickson, Slow-cooling protocols for ciystallographic refinement by simulated annealing. Acta Ciystallographica Section A, 1990.46(7): p. 585-593.

76. Kuriyan, J., et al., X-ray refinement of protein structures by simulated annealing: test of the method on myohemerythrin. Acta Ciystallographica Section A, 1989.45(6): p. 396-409.

77. Emsley, P. and K. Cowtan, Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D, 2004. 60(12 Part 1): p. 21262132.

78. Vaguine, A.A., J. Richelle, and S.J. Wodak, SFCHECK: a unified set of procedures for evaluating the quality of macromolecular structure-factor data and their agreement with the atomic model. Acta Crystallographica Section D, 1999. 55(1): p. 191-205.

79. Laskowski, R.A., et al., PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. Journal of Applied Crystallography, 1993. 26(2): p. 283-291.

80. Hooft, R.W.W., et al., Errors in protein structures. Nature, 1996. 381: p. 272-272.

81. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. J. Nature. 1970, V.227, pp. 680 685.

82. Kabsch, W., Integration, scaling, space-group assignment and post refinement. XDS., in International Tables for Crystallography, M.G. Rossmann and E.F. Arnold, Editors. 2001, Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.1. Благодарности