Полиэлектролитные комплексы как новый тип псевдостационарных фаз в мицеллярной электрокинетической хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

на правах рукописи

Шпак Алексей Витальевич

ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ КАК НОВЫЙ ТИП ПСЕВДОСТАЦИОНАРНЫХ ФАЗ В МИЦЕЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -2005

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научныйруководитель:

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Пирогов Андрей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Яшин Я.И. кандидат химических наук, с.н.с. Ванифатова Н.Г.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет

Защита состоится «3» марта 2005 г. в «16» часов «15» минут в ауд. 344 на заседании диссертационного совета Д.501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 11992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » февраля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

В последнее десятилетие метод капиллярного электрофореза получил такое же широкое распространение, как жидкостная и газовая хроматография. На сегодняшний день уже стало понятно, что капиллярный электрофорез не заменит жидкостную хроматографию, как считали многие ученые в начале девяностых годов прошлого века, а является методом, дополняющим хроматографию и имеющим свою область применения.

В классическом капиллярном зонном электрофорезе (КЗЭ), разделение основано на различии в собственных электрофоретических подвижностях определяемых соединений. Этот вариант электрофореза используется для анализа заряженных соединений в виде анионов или катионов. В методе мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) разделение основано на различном распределении определяемых компонентов пробы между псевдостационарной (мицеллярной) фазой и окружающим ее буферным раствором. МЭКХ, в отличие от варианта КЗЭ, позволяет определять как заряженные, так и незаряженные соединения и на сегодняшний день МЭКХ является одним из наиболее широко используемых вариантов капиллярного электрофореза.

Актуальность темы. Природа псевдостационарной фазы оказывает решающие влияние на взаимодействие между ней и разделяемыми соединениями, а, следовательно, и на селективность и эффективность электрофоретического разделения. По этой причине выбор и поиск новых псевдостационарных фаз является важной задачей. В последнее десятилетие наблюдается большой интерес к использованию псевдостационарных фаз на основе различных полимерных соединений. Применение псевдостационарных фаз на основе высокомолекулярных соединений позволяет решить многие проблемы, существующие при использовании классических мицелл: разделение смесей сильно гидрофобных смесей, высокая критическая концентрация мицеллообразования, существование точки Крафта и низкая устойчивость при большом содержании органического модификатора.

Цель работы. Полиэлектролитные комплексы ионогенных поверхностно активных веществ (ПАВ) с линейными противоположно заряженными полиэлектролитами, образующиеся при смешении водных растворов исходных компонентов, представляют собой соединения, стабилизированные кооперативной системой солевых связей и гидрофобными взаимодействиями. Целью данного исследования было изучение возможности использования водорастворимых

полиэлектролитных комплексов (ПЭК) в качестве нового типа псевдостационарных фаз в мицеллярной электрокинетической хроматографии. Конкретные задачи были следующими;

- поиск области существования водорастворимых и устойчивых комплексов, образованных полиакриловой кислотой (ПАК) и солями четвертичных аммониевых оснований, в условиях электрофоретического эксперимента;

- изучение влияния приложенного внешнего напряжения в разделяющем кварцевом капилляре на полиэлектролитные комплексы, выступающие, как в качестве псевдостационарной фазы, так и в качестве определяемых соединений в варианте капиллярного зонного электрофореза;

измерение электрофоретической подвижности полиакриловых кислот и полиэлектролитных комплексов;

- апробация полиэлектролитных комплексов в качестве псевдостационарных фаз для разделения и определения ряда замещенных фенолов, дансил-, карбобензокси- и бутоксикарбомоил-производных аминокислот;

сравнение основных электрофоретических характеристик разделения для полиэлектролитных комплексов и псевдостационарных фаз, образованных классическими мицеллообразователями (додецилсульфатом натрия (СДС) и др.);

- изучение влияния основных параметров полиэлектролитных комплексов: степени полимеризации полиакриловой кислоты длины алкильного радикала аммониевого основания состава полиэлектролитного комплекса и содержания комплекса в разделяющем буфере на селективность и эффективность разделения;

- установление механизма взаимодействия разделяемых анализируемых соединений с псевдостационарной фазой на основе полиэлектролитных комплексов.

Научная новизна. Впервые полиэлектролитные комплексы были предложены в качестве принципиально нового типа псевдостационарных фаз в МЭКХ.

Найдена область значений основных параметров полиэлектролитных комплексов, состава буферного электролита и условий электрофоретического разделения при которых полиэлектролитные комплексы могут быть использованы в качестве псевдостационарных фаз.

Показана уникальная селективность к замещенным фенолам по сравнению с классическими псевдостационарными фазами - относительное удерживание не имеет прямой зависимости с их гидрофобностью. Найдено, что разделение дансил-

производных аминокислот происходит в основном по хроматографическому распределительному механизму, их относительное удерживание увеличивается с увеличением гидрофобности, тогда как на удерживание карбобензокси-производных аминокислот добавление полиэлектролитных комплексов в разделяющий буферный электролит не оказывает влияние. Бутоксикарбомоил-производные имеют разный порядок миграции при использовании полиэлектролитных комплексов и СДС. Ни одна из известных на сегодняшний день псевдостационарная фаза не обладает таким различием во взаимодействии с близкими по свойствам группам соединений.

Показано, что электрофоретические свойства разделения - селективность и эффективность - на новом типе псевдостационарных фаз, могут быть легко изменены путем изменения состава комплекса степени полимеризации полиэлектролита или длины алкильного радикала алкилтриметиламмоний бромида Наличие

большого числа степеней свободы и простой переход от одной системы к другой, является неоспоримым достоинством нового типа псевдостационарных фаз.

Проведено сравнение с наиболее широко применяемой псевдостационарной фазой на основе додецилсульфата натрия (СДС).

Практическая значимость работы. Представлены примеры разделения смесей разных производных аминокислот и замещенных фенолов. Предложен способ определения кофеина в моче (за счет уникальной селективности прочие компоненты мочи не оказывают мешающее влияние). Осуществлено разделение смеси содержащей одновременно дансил- и карбобензокси-производные аминокислот. Разделены стереоизомеры иодпроизводных фенилкарбоновых кислот в реакционой смеси. (Следует отметить, что данные задачи не решаются с использованием СДС). Показана возможность использования нового типа псевдостационарных фаз для химического контроля качества лекарственных средств методом МЭКХ на примере Цефоперабола® и Цефобола®.

На защиту выносятся:

• Область условий, при которых полиэлектролитные комплексы, образованные

полиакриловой кислотой и четвертичными основаниями существуют как устойчивые псевдостационарные фазы для МЭКХ;

• Закономерности поведения полиэлектролитных комплексов под действием

приложенного напряжения в качестве псевдостационарной фазы и в качестве определяемых соединений;

• Данные по электрофоретическим подвижностям полиакриловых кислот с различными

степенями полимеризации и полиэлектролитных комплексов;

• Совокупность данных по условиям разделения ряда замещенных фенолов, ПАУ и

разных классов производных аминокислот;

• Результаты влияния основных параметров полиэлектролитных комплексов на

селективность и эффективность разделения;

• Зависимости удерживания различных классов соединений от гидрофобности и доли

заряженной формы анализируемого соединения для полиэлектролитных комплексов и додецилсульфата натрия;

• Способ определения кофеина в моче, разделение стереоизомеров иодпроизводных ß-

фенилкарбоновых кислот в реакционен смеси и пример проведения химического контроля качества лекарственных средств Цефоперабола® и Цефобола® методом МЭКХ с псевдостационарной фазой на основе полиэлектролитного комплекса.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международных конференциях и симпозиумах «Euroanalysis XII» (Дортмунд, Германия, 2002), «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Туапсе, Россия, 2002), «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (Томск, Россия, 2002), SBS 2003 - "100 Years of chromatography" (Москва, Россия, 2003), «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, Россия, 2003), 2nd Black Sea Basin Conference on Analytical Chemistry (Шиле-Стамбул, Турция, 2003), «Современное приборное обеспечение и методы анализа почв, кормов, растений и сельскохозяйственного сырья» (Москва, Россия, 2003), НРСЕ 2004 (Зальцбург, Австрия, 2004), «Euroanalysis XIII» (Саламанка, Испания, 2004); Всероссийском симпозиуме ««Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004), втором съезде общества биотехнологов России (Москва, 2004) и международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов - 2003» (Москва, 2003); научных коллоквиумах лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии МГУ.

Публикация результатов. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 13 тезисов докладов.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, общих выводов, списков цитируемой литературы и сокращений. Материал диссертации изложен на 182 страницах машинописного текста, содержит 76 рисунков и 17 таблиц, в списке цитируемой литературы 161 наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Обсуждена теория селективности и эффективности разделения в МЭКХ, рассмотрены основные типы псевдостационарных фаз на основе низкомолекулярных и высокомолекулярных соединений. Проанализированы данные о водорастворимых полиэлектролитных комплексах, образованных ионогенными ПАВ с линейными противоположно заряженными полиэлектролитами, на примере полиакриловой кислоты и алкилтриметиламмоний бромидов. На основе литературных данных были обоснованы и конкретизированы задачи диссертационной работы.

Экспериментальная часть Основная часть экспериментов по капиллярному электрофорезу выполнена на системе капиллярного электрофореза "HP3D СЕ" производства Agilent Technologies (Вальдбронн, Германия), оснащенной детектором с диодной матрицей. Также в работе были использованы системы капиллярного электрофореза серии "Капель" производства Люмэкс (Санкт-Петербург, Россия).

В работе применяли кварцевые капилляры с различным внутренним диаметром, длиной, модифицированной внутренней поверхностью, увеличенной длиной оптического пути в зоне детектирования; производства ACTG Inc. (Сан Диего, США), Agilent Technologies (Вальдбронн, Германия) и Polymicro Technologies (Феникс, США).

В процессе работы использовали следующие приборы: спектрофотометр «Shimadzu 2201» (Япония); термостат «Memmert» (Германия) и «Ikater 2» (Германия); ультразвуковую ванну «Sonorex RK 225» (Германия); роторный испаритель «Buchi» (Япония); рН метры «Mettler Toledo» (Швецария), магнитную мешалку с термостатированием.

Для получения полиэлектролитных комплексов были использованы алкилтриметиламмоний бромиды и полиакриловые кислоты со степенями

полимеризации (Pw) от 60 до 7200. Для приготовления фосфатных буферов использовали 200 мМ раствор или коммерческий 50 мМ фосфатный буфер (Agilent

Technologies, исходный рН 7.0), оттитрованный 3 М НС1 до рН равного 5.95-6.05.

Получение полиэлектролитных комплексов Полиэлектролитные комплексы ПЭК, образованные по реакции между полиакриловой или полиметакриловой кислотами (и их солями) и алкилтриметил-

аммоний бромидами, представляют собой соединения, стабилизированные образованием системы ионных связей и мицеллоподобными агрегатами. Структура и свойства получаемого комплекса зависят от ряда параметров: степени полимеризации полиакриловой кислоты (Р№); длины алкильного радикала алкилтриметиламмоний бромида (С„); состава комплекса (<р), а он в свою очередь зависит от состава реакционной смеси (г), рН раствора, наличия низкомолекулярных неорганических солей.

Состав реакционной смеси z выражали в виде отношения молярной концентрации ионов ПАВ к молярной концентрации звеньев полиэлектролита: г — [ПАВ]/[ПЭ]. Состав полиэлектролитного комплекса определяется отношением числа ионов ПАВ (пПАВ) в частице ПЭК к числу звеньев полиэлектролита (пПЭ), включенных в поликомплекс: ф = пПАВ/пПЭ. Полиэлектролитные комплексы (рис. 1) получали, добавляя по 30-50 мкл раствора ПАВ к раствору полиакриловой кислоты при рН 6.0 и непрерывном перемешивании.

Рис. 1. Схема водорастворимого полиэлектролитного комплекса, образованного полиакриловой кислотой и бромидом додецилтриметиламмония.

Область применимости комплексов в качестве псевдостационарных фаз

Одной из самых главных проблем являлось нахождение параметров полиэлектролитных комплексов и электрофоретических условий, при которых ПЭК могут использоваться в качестве псевдостационарных фаз в МЭКХ. Если к основному их преимуществу следует отнести большое число степеней свободы по изменению селективности разделения, то основным недостатком можно считать ограниченную область условий, при который полиэлектролитные комплексы могут использоваться в качестве псевдостационарных фаз, обеспечивающих воспроизводимые результаты.

В качестве ключевых параметров нами были выбраны три параметра, определяющие непосредственно молекулярные характеристики комплекса - и

три основных параметра определяющие свойства буфера - рН; концентрация фосфата

натрия и ПЭК, мМ. Центральная часть треугольника на рис. 2 ограничивает область существования водорастворимого ПЭК, который можно в дальнейшем использовать в качестве псевдостационарной фазы в МЭКХ. Центральная часть треугольника на рис. 3, в свою очередь, определяет основные параметры разделяющего буфера.

Рис. 2. Область существования водорастворимого ПЭК (10), которые можно в дальнейшем использовать в качестве псевдо-стационарной фазы в МЭКХ. Рис. 3. Оптимальные параметры (20) разделяющего буфера.

Электрофоретическая подвижность полиэлектролитных комплексов и полиакриловых кислот

Целью данной части работы было определение подвижности полиакриловой кислоты (табл. 1) с различной степенью полимеризации, ее полиэлектролитных комплексов в варианте капиллярного зонного электрофореза. В этом случае полиэлектролитный комплекс или поликислота выступают в роли анализируемых соединений, пробы.

Эти данные необходимы для выяснения поведения полиэлектролитных комплексов под действием приложенного напряжения: происходит ли распад комплекса, изменяется ли состав. Значения подвижностей полиэлектролитных комплексов позволяют рассчитать время миграции псевдо-стационарной фазы, что необходимо для расчета и оптимизации параметров разделения в МЭКХ.

Таблица 1. Электрофоретические подвижности полиакриловых кислот (п=5, Р=0,95)

Степень полимеризации ПАК, Подвижность, |!*104 см2/В*сек

60 -(3.13 ±0.06)

1800 -(3.10 ±0.04)

3500 - (3.01 ± 0.08)

Электрофоретические подвижности зависят от соотношения двух параметров, характеризующих образец: эффективного радиуса и эффективного заряда, а это отношение практически не отличается для полиакриловой кислоты с разной степенью полимеризации.

На рис. 4 представлена электрофореграмма разделения смеси полиакриловых кислот с тремя различными степенями полимеризации. Пики полианионов не разрешаются полностью.

Рис. 4. Электрофореграмма смеси ПАК с разными Р„. Буферный электролит: 50 мМ борат, рН 9.3. Капилляр: 60 см (52 см) х 50 мкм. Напряжение: 25 кВ. Детектирование: 190 нм. Проба: смесь трех ПАК, каждого по 20 мкг/мл. Ввод пробы: 300 мбар*сек Пики: 1 - Р\г=3500, 2 -Р\у=1800 и 3 - Р^60.

Для оценки селективности новых псевдостационарных фаз принято использовать модельные смеси замещенных фенолов, что позволяет сравнивать селективности разных псевдостационарных фаз между собой.

При использовании фосфатного буфера рН 6.0 без добавки полиэлектролитного комплекса все фенолы выходят вместе с электроосмотическим потоком в виде одного пика. Когда же полиэлектролитный комплекс ПАК (додецилтриметиламмоний бромид), ср=0.3 был добавлен в буферный электролит, пики фенолов полностью разрешаются. В данном случае реализуется вариант МЭКХ, и разделение фенолов основано на их различном распределении между ПЭК и окружающей водной фазой.

Порядок выхода фенолов при использовании полиэлектролитного комплекса был следующий: фенол < резорцин < /ьнитрофенол < о-аминофенол < р-хлорфенол. Пики всех фенолов полностью разрешены до базовой линии. Для данной системы эффективность разделения была невысокой - на уровне 35000 тт/метр. Псевдостационарная фаза на основе полиэлектролитного комплекса

•с*«14 « I 1« » И М 11 10 11 2« М II М 11 14 Л и 40 41 мни

Производные фенола

(<р=0.3) очень сильно отличается по селективности по отношению к фенолам по сравнению с СДС (рис. 5).

8 CXphe 5,3 6.«

/ 6 5 Я ПАК Р\*=1800/ДТАБ, <р=0.3 | В СДС 1

4 3 I 1.6 о,« шт B""s J,v в К 3.2 ЯМ Ш":

2 1 ■ 0 1 1,о 1,0 В ' ■ ; Щ > В : °'2 '

/ / ^ у ^ j* У / / / ^ / сГ

Рис. 5. Относительная селективность разделения фенолов. Буферный электролит: 0 -100 мМ СДС, 50 мМ фосфат, рН 6.0; * - 17.4 мМ ПАК Р„=1800/ДТАБ (<р=0.3), рН 5.9.

В качестве модельных анализируемых растворов использовали смеси дансил-, карбобензокси- и бутоксикарбонил-производных аминокислот. Использование разных производных аминокислот позволяет оценить влияние дериватизирующего агента на селективность и эффективность разделения при использовании псевдостационарных фаз нового типа. Параметры гидрофобности (LogD) и доля заряженной и нейтральной формы для использованных соединений, рассчитанные с помощью программы ACD lab® приведены в табл. 2.

Дансил-производные аминокислот

При использовании 50 мМ фосфатного буфера рН 6.0, реализуется вариант капиллярного зонного электрофореза. Семь дансил-производных детектируются в виде неразрешенных пиков (рис. 6А).

Добавка полиэлектролитного комплекса ПАК/ДТАБ в буфер приводит к разделению смеси производных на индивидуальные пики рис. 6В. Времена миграции дансил-производных увеличиваются с увеличением содержания ПЭК в разделяющем буфере (рис. 6С). Это является одним из основных доказательств того, что реализуется механизм лежащий в основе метода МЭКХ.

В сравнении с СДС псевдостационарной фазой полиэлектролитные комплексы Р„=1800/ДТАБ (ч>=0.1-0.3) и РЖ=3500/ДГАБ (<р=0.1-0.3) проявляют аналогичный порядок удерживания для дансил- производных аминокислот (рис. 7).

Таблица 2. Параметры гидрофобности и отношения заряженных и нейтральных форм

для производных аминокислот и фенолов, рН 6.0

Соединение Обозначение LogD, ACDIab® Доля нейтральной формы, % Доля заряженной формы, %

>Ях ° Дансил-производные аминокислот (DNS-AAs)

DNS серии DNS-Ser -1.21 7 93

DNS треонин DNS-Thr -0.87 11 89

DNS лейцин DNS-Leu 1.45 90 10

DNS норлейцин DNS-NorLeu 1.63 92 8

DNS Валин DNS-Val 0.91 83 7

DNS метионин DNS-Met 1.44 85 15

DNS фенил ал анин DNS-Phe 1.76 89 11

сн, о 1 « CH,-C-0-C-NH-

сн' N-tert-бутоксикарбонил-производные аминокислот (BOC-AAs)

ВОС серии BOC-Ser -2.25 1 99

ВОС аланин BOC-Ala -0.88 12 88

ВОС треонин BOC-Thr 0.89 87 13

ВОС фенилаланин BOC-Phe 0.85 86 14

X сУ ^ Фенолы

о-Аминофенол 0.44 96 0

Резорцин 0.88 100 0

Фенол 1.48 100 0

р-Нитрофенол 1.57 98 2

р-Хлорфенол 2.43 100 0

"" А

Рис. 6. Электрофореграмма дансил-производных аминокислот. Буферный электролит: (А) 50 мМ фосфат, рН 6.0; (В) 50 мМ фосфат, 7.9 мМ ПАК Р„=1800/ДТАБ ((р=0.3) рН 6.0; (С) 50 мМ фосфат, 15.8 мМ ПАК Р„=1800/ДТАБ (ф=0.3), рН 6.0. Капилляр: 80.5 см (72 см) х 50 мкм. Напряжение: 30 кВ. Ток: 64 мкА. Детектирование: 254 нм. Проба: смесь дансил-производных, каждого по 10 мкг/мл. Ввод пробы: 150 мбар*сек.

аОЛУ-ГАг

2,4

2,6

2,1

1,6 I :

1,3 12 1,3

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1? 1,1^ I ' • ^^ ?

■ 111111

У А /

Рис. 7. Относительная селективность разделения дансил-треонина и остальных дансил -производных аминокислот. Буферный электролит: --- - 100 мМ СДС, 50 мМ фосфат, рН 6.0;

■ - 2.3 мМ ПАК Р„=6250/ДТАБ (ф=0.3) рН 6.0.

Зависимость относительного удерживания дансил-производных от концентрации псевдостационарной фазы РИ=1800/ДТАБ (<р=0.3) представлена на рис. 8. Были получены линейные зависимости (Я2 = 0.995-0.999) в диапазоне содержания псевдостационарной фазы от 4.6 до 20.2 мМ.

6

о -,-.-,-.—.-.-,-.-.-,

0 2 4 6 В 10 12 14 16 1В 20 С<РАДЛТАВ), пМ

Рис. 8. Зависимость относительного удерживания дансил- производных от содержания комплекса РЖ=1800/ДТАБ ((р=0.3) в 50 мМ фосфатном буфере.

При экстраполяции линии зависимостей для всех производных пересекаются в точке с концентрацией равной 3.2 мМ. Экспериментально было подтверждено, что добавка ПЭК в буферный электролит на уровне 3 мМ и менее не влияет на удерживание дансил-производных аминокислот.

Полученные результаты для дансил-производных аминокислот позволяют сделать вывод о том, что в данном случае реализуется вариант МЭКХ и основной вклад в

механизм удерживания на полиэлектролитных комплексах вносят гидрофобные взаимодействия между мицелло-подобной фазой ПЭК и разделяемыми соединениями.

Карбобензокси-производные аминокислот Разделение девяти карбобензокси-производных с двумя разными 50 мМ фосфатными буферами (рН 6.0), с добавкой 7.9 мМ полиэлектролитного комплекса ПАК Р„,=1800/ДТАБ (ф=0.3) и без нее представлено на рис. 9.

Рис. 9. Элекгрофореграмма карбобензокси-произюдньк аминокислот. Буферный электролит: (А) 50 мМ фосфат, рН 6.0; (В) 50 мМ фосфат, 7.9 мМ ПАК Р„=1800/ДТАБ (Ф=0.3) рН 5.9. Капилляр: 80.5 см (72 см) х 50 мкм. Напряжение: 30 кВ. Ток: 62 мкА Детектирование: 210 им. Проба: каждого по 6 мкг/мл. Ввод пробы: 150 мбар*сек

Времена миграции карбобензокси-производных увеличились на несколько минут в случае добавки комплекса, что связано с увеличением вязкости буферного электролита.

Относительное удерживание карбобензокси производных повышается при увеличении содержания комплекса, но на порядок меньше, чем в случае дансил-производных, что связано с увеличением гидродинамической вязкости буфера Графики зависимостей относительного удерживания карбобензокси-производных параллельны и не имеют общей точки пересечения, в отличие от аналогичных зависимостей для дансил-производных.

Таким образом найдено, что добавка полиэлектролитного комплекса не влияет на

электрофоретическое поведение карбобензокси-производных аминокислот. Вариант

мицеллярной электрокинетической хроматографии не реализуется.

14

Бутоксикарбомоил-производные аминокислот

Порядок миграции бутоксикарбомоил-производных аминокислот при использовании ПО мМ СДС следующий: ВОС-8ег < ВОС-А1а< ВОС-ТЪт =ВОС-РЬе.

Пики ВОС-ТЬг и ВОС-РИе не разрешаются, несмотря на то, что эффективность разделения превышает 1 млн. тт/м.

В сравнении с СДС псевдостационарной фазой добавка 2.3 мМ полиэлектролитного комплекса Р„ = 6250/ДТАБ (((рЮЛ) в 50 мМ фосфатный буфер рН 5.8 приводит к полному разделению пиков четырех бутоксикарбомоил-производных. Порядок миграции с полиэлектролитным комплексом следующий:

Происходит изменение порядка миграции и

полностью разрешаются пики и

Следовательно, разделение ароматических производных аминокислот и изменение порядка их удерживания, обусловлено специфическими взаимодействиями соединений с полиэлектролитным комплексом. Эффективность разделения на псевдостационарной фазе на основе ПЭК в разы ниже чем при использовании СДС, что не мешает, однако,

полному разрешению пиков всех комнонентов смеси.

* * *

Разная селективность псевдостационарных фаз на основе полиэлектролитных комплексов является их достаточно уникальным свойством, поскольку система, не имеющая в своем составе каких-либо специфических функциональных групп, взаимодействует с одним типом производных (дансил), не взаимодействует с другим типом (карбобензокси) и проявляет отличную от СДС селективность по отношению к фенолам и бутоксикарбомоил-производным аминокислот. Причиной этого является, по-видимому, реализация нескольких механизмов миграции.

Зависимость электрофоретических параметров разделения от характеристик

комплексов

Свойства псевдостационарной фазы на основе ПЭК напрямую зависят от молекулярных характеристик ПЭК, а его строение и структура является функцией таких параметров как - степень полимеризации длина алкильного радикала и состав

комплекса

Число возможных комплексов (Б) с разными молекулярными характеристиками, образующими псевдо-стационарные фазы с различными электрофоретическими характеристиками разделениями, Дф=0.05 приведено в табл. 3.

Таблица 3. Число комплексов (Б) с различными молекулярными характеристиками

Алкильный радикал триметиламмоний бромида Число комплексов, Р, (Дф = 0.05)

Возможно Изучено

Сю 30 6

Си 24 22

См 18 4

С,6 12 4

Состав полиэлектролитного комплекса (ф) Электрофореграмма смеси шести фенолов с использованием буферных электролитов, различающихся только составом полиэлектролитного комплекса, (р, представлено на рис. 10. Оба буфера содержат 50 мМ фосфата рН 6.0, первый буфер содержал 9.3 мМ ПЭК Р„=1800/ДТАБ состава ц>=0.05 (рис. 10А); а второй, 10.4 мМ ПЭК но состава При составе пики всех фенолов

полностью разрешены и мы имеем следующую последовательность выхода: фенол < резорцин <р-нитрофенол < о-аминофенол <р-хлорфенол. При использовании комплекса с на электрофореграмме регистрируется четыре пика и другой порядок выхода:

фенол < о-аминофенол < резорцин = р-нитрофенол < р-хлорфенол.

•пЧи ВДН Е. «^2*4.11 А АВ-ЯРЛММД 3, 1Д 5 Л11В (

МЧ1 *я я » оып ■. |»Я<.Я МнЯ (ММТЛВ-ММА Б .,, 1; «А М* 1Я -*' 5 б _к_д_ГЧ_^ . „ ¿л,

Рис. 10. Электрофореграмма фенолов. Буферный электролит: (А) 50 мМ фосфат, 9.2 мМ ПАК Р„=1800/ДГАБ (ф=0.05) рН 5.9; (Б) 50 мМ фосфат, 17.4 мМ ПАК Р„=1800/ДТАБ (ч>=0.3) рН

6.0; Капилляр: 68.5 см (60 см) х 50 мкм. Напряжение: 25 кВ. Детектирование: 254 нм. Проба: каждого по 2 мкг/мл. Ввод пробы: 100 мбар*сек. Пики: 1 = о-диаминобензол, 2 = фенол, 3 = резорцин, 4 =р-нитрофенол, 5 = о-аминофенол и 6 =р-хлорфенол.

Зависимость относительной селективности разделения дансил-производных от состава комплекса для комплексов, образованных полиакриловыми кислотами с Р„.=1800/Рц,=6250 и ДТАБ, представлена на рис. 11. Было найдено, что оптимальные условия для разделения достигаются при <|> = 0.3 для ПЭК РИ=1800/ДТАБ и <р = 0.2 при использовании ПЭК Р„=6250/ДТАБ.

Рис. 11. Зависимость относительной селективности разделения дансил-треонина и остальных дансил-производных (а') от состава комплекса (ф) для комплексов; (А) Р„=1800/ ДТАБ, (Б) Р„=6250/ДТАБ.

Степень полимеризации полиакриловой кислоты (Р„) Зависимость относительной селективности разделения дансил-треонина и остальных дансил-производных {а") от степени полимеризации полиакриловой кислоты, образующей комплекс, представлена на рис. 12. Селективность разделения пары ТЬг/ОЫ8-РЬе существенно уменьшается при использовании полиакриловой кислоты с большей степенью полимеризации: 3.2 ДЛЯ Рж=1800, 2.2 для Р„=3500 и 1.3 в случае Р„=6250.

Рис. 12. Зависимость относительной селективности разделения дансил-треонина и остальных дансил производных (от') от степени полимеризации полиакриловой кислоты, образующей полиэлектролитный комплекс с ДТАБ.

Длина алкильного радикала На разделение фенолов изменение длины алкильного радикала влияет в меньшей

степени, чем на разделение дансил-производных. Изменения порядка миграции не

происходит. Замена ДТАБ на ТТАБ (рис. 13Б) приводит к тому, что ухудшается

селективность разделения - не разделяются пики о-диаминобензола и фенола и

уменьшается эффективность пиков о-аминофенола и р-хлорфенола; а при использовании

ЦТАБ (рис. 13В) не детектируются пики о-диаминобензола и резорцина.

Рис. 13. Электрофореграмма фенолов (254 нм). Буферный электролит:

(A) 17.4 мМ ПАК Р„=1800/(ДТАБ С12), <Н>.2 рН 6.0; капилляр: 68.5 см (60 см) * 50 мкм. (Б) 10.0 мМ ПАК Р„=1800/(ТТАБ См), <р=0.2 рН 5.9; капилляр: 80.5 см (72 см) х 50 мкм.

(B) 9.3 мМ ПАК Р„=1800/(ЦТАБ См), ф=0.2 рН 6.0; капилляр: 80.5 см (72 см) * 50 мкм.

Проба: смесь фенолов, каждого по 2-5 мкг/мл. Идентификация пиков: 1 = о-диаминобензол, 2 = фенол, 3 = резорцин, 4 = р-нитрофенол, 5 = о-аминофенол и 6 = р-хлорфенол.

Разделение смеси дансил- и карбобензокси-производных аминокислот При разделении смеси, содержащей 6 дансил- и 10 карбобензокси- производных

аминокислот, с использованием СДС в качестве модификатора, на электрофореграмме в

виде неразрешающихся пиков в диапазоне времени 14.0-14.5 мин выходят пять

производных: CBZ-Val, CBZ-Ser, CBZ-Ala, DNS-Thr и DNS-Ser; на 17.6 мин: DNS-Met и

CBZ-Tyr; на 21.5 мин DNS-Leu и CBZ-NorLeu. Пики девяти из шестнадцати

производных не удается разделить.

Используя уникальную селективность нового типа фаз удалось добиться полного

разделения дансил-производных в смеси карбобензокси- и дансил-производных (рис.

14). Карбобензокси-производные не удерживаются полиэлектролитным комплексом -

десять производных выходят в виде шести близко стоящих пиков от 19 до 22 мин, и не

совпадают по миграции времени с дансил-производными, как это происходит в случае

сдс.

DNS-Thr

DNS-Ser DNS-Vül

10 CBZ-AAs

—■ — i ■ ■ ■ ■—i -- ■ ■ i ■ ■ ■ ■ i—•

_ю_ag_за_m

Рис. 14. Электрофореграмма смеси дансил и карбобензокси производных аминокислот. Буферный электролит: 30 мМ фосфат, 18 мМ ПАК Р„ = 1800/ДТАБ (ф = 0.3) pH 5.8. Капилляр: 80.5 см (72 см) х 50 мкм. Напряжение: 25 кВ. Детектирование: 254 нм. Проба: каждого по 5 мкг/мл. Ввод пробы: 250 мбар*сек.

Конечно, данный пример нельзя в полной мере назвать аналитическим приложением, которое получит широкое распространение в аналитической практике. Однако, его цель - показать уникальную селективность псевдостационарных фаз на основе полиэлектролитных комплексов.

Определение кофеина в моче Кофеин (1,3,7-триметилксантин) является стимулятором центральной нервной системы. Это соединение входит в список запрещенных препаратов международного олимпийского комитета. Предложен способ определения кофеина в моче с

19

использованием псевдостационарной фазы на основе ПЭК. Электрофореграмма образца мочи пациента, принимавшего кофеин в больших дозах с целью достижения наркотического эффекта представлена на рис. 15.

Рис. 15. Электрофореграмма образца мочи пациента, принимавшего кофеин в больших дозах с целью достижения токсического эффекта. Буферный электролит: 50 мМ фосфат, 9.3 мМ ПАК Рж = 1800/ДТАБ (ф = 0.2) рН 6.0. Капилляр: 82 см (73.5 см) х 50 мкм. Напряжение: 30 кВ. Детектирование: 273 нм. Проба: моча разбавленная в два раза 20 мМ фосфатным буфером. Ввод пробы: 100 мбар*сек.. Найдено 74 ± 7 мкг/млкофеина (п=5, Р=0,95).

Следует отметить, что при использовании псевдостационарной фазы на основе СДС время удерживания кофеина совпадает со временем удерживания некоторых эндогенных соединений и данная задача не решается.

Контроль качества лекарственных средств Цефоперабола® и Цефобола®

Метод МЭКХ с псевдостационарной фазой на основе ПЭК был использован для химического контроля качества действующих веществ цефоперазона (Цефоперабол®) и цефотаксима (Цефобола®). На представленной электрофореграмме водного раствора содержащего 2000 мкг/мл лекарственного средства Цефоперабола® (цефоперазон) (рис. 16) видно 7 пиков, принадлежащих примесям. Общее содержание примесей - 4.1%.

Содержание цефоперазона в препарате для приготовления инъекционного раствора Цефоперабол®, содержащем цефоперазон в чистом виде, составило 95.9 ± 0.3% (п=5, Р=0,95). В препарате Цефобола® (цефотаксима) было найдено 4 пика, принадлежащих примесям; содержание цефотаксима 98.1 ± 0.4% (п=5, Р=0,95).

В методе жидкостной хроматографии с фотометрическим детектированием некоторые примеси элюировались вместе с пиком действующего вещества, что

.0' ^ -',-М* ^.-.-О*.",,':«' С':

ЭОЛ

72 мкг/мл кофеина

приводило к неверному результату испытания на чистоту и допустимые пределы примесей.

Рис. 16. Электрофореграмма раствора содержащего 2000 мкг/мл Цефоперабола® (цефоперазон). Буферный электролит: 40 мМ фосфат, 21 мМ ПАК Р„= 6250/ДТАБ, ф = 0.2 рН 6.0; капилляр: 60 см (52 см до детектора) х 75 мкм. Напряжение: 25 кВ. Детектирование: 254 нм. Ввод пробы: 600 мбар*сек.

Таким образом, показано, что применение псевдостационарных фаз на основе водорастворимых полиэлектролитных комплексов позволяет изменить (и в ряде случпев, значительно улучшить) селективность определения веществ в методе МЭКХ и повысить правильность анализа.

ВЫВОДЫ

1. Впервые полиэлектролитные комплексы были использованы в качестве нового типа псевдостационарных фаз в мицеллярной электрокинетической хроматографии для разделения замещенных фенолов и различных классов производных аминокислот.

2. Найдены параметры полиэлектролитного комплекса полиакриловой кислоты с алкилтриметиаламмоний бромидами; и основных электрофоретических условий, при которых они могут использоваться как псевдостационарные фазы.

3. Изучено влияния приложенного внешнего напряжения в разделяющем кварцевом капилляре на полиэлектролитные комплексы, выступающие как в качестве псевдостационарной фазы, так и в качестве анализируемых соединений в варианте капиллярного зонного электрофореза.

4. Найдены электрофоретические подвижности полиакриловых кислот и образованных ими полиэлектролитных комплексов.

5. Изучено влияние основных параметров полиэлектролитных комплексов: степени

полимеризации полиакриловой кислоты, длины алкильного радикала аммониевого

21

основания, состава полиэлектролитного комплекса и содержания комплекса в разделяющем буферном электролите на селективность и эффективность разделения. Проведено их сравнение с додецилсульфатом натрия.

6. Найдено, что псевдостационарные фазы на основе полиэлектролитных комплексов проявляют уникальную и легко изменяемую селективность по сравнению с додецилсульфатом натрия: фенолы и бутоксикарбомоил-производные аминокислот имеют другой порядок удерживания, а на разделение карбобензокси-производных добавка комплекса в буфер не оказывает влияния.

7. Предложен способ определения кофеина в моче. За счет изменения селективности устранено мешающее влияние компонентов матрицы. Осуществлено разделение смеси, содержащей одновременно дансил- и карбобензокси-производные. Разделены стереоизомеры иодпроизводных р-фенилкарбоновых кислот в реакционной смеси. Показана возможность использования нового типа псевдостационарных фаз для контроля качества лекарственных средств методом МЭКХ. (Данные задачи не решаются с использованием СДС).

Основные результаты изложены в следующих публикациях:

1. Pirogov A.V., Shpak A.V., Shpigun O.A., Application of polyelectrolytes complexes as novel pseudostationary phases in CE and MEKC. / European Conference on Analytical Chemistry «Euroanalysis XII». Dortmund. Germany. 2002. September 8-13. P. 136.

2. Шпак А.В., Пирогов А.В., Шпигун O.A., Определение аминокислот методом капиллярного электрофореза без предварительной дериватизации. / Материалы Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии». Туапсе. 2002. 6-11 октября. С. 244.

3. А.В. Шпак, А.В. Пирогов, O.A. Шпигун, Использование полиэлектролитных комплексов полиакриловой кислоты и четвертичных аммониевых солей в качестве новых псевдостационарных фаз в мицеллярной электрокинетической хроматографии. / Материалы Международной конференции «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий». Томск. 2002. 26-28 ноября. ч. II. с. 234-237.

4. Шпак A.B., Псевдо-стационарные фазы для МЭКХ на основе полиэлектролитных комплексов. / Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2003» (секция химия). Москва 2003. 15-18 апреля. ч.1. С. 51.

5. A.V. Pirogov, A.V. Shpak, O.A. Shpigun, Application of polyelectrolyte complexes as novel pseudo-stationary phases in MEKC // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 375. P. 1199-1203.

6. A.V. Shpak, A.V. Pirogov, O.A. Shpigun, Micellar electrokinetic chromatography with polyelectrolyte complexes as a micellar pseudo-stationary phase. / Proceedings of the 3rd

International Symposium on Separations in BioSciencies - SBS 2003 "100 years of chromatography". Moscow. Russia. 2003. May 13-18. Moscow. 2003. P. 264.

7. A.B. Шпак, А.В. Пирогов, О.А. Шпигун, Электрофоретические методы определения аминокислот. / Материалы международного форума «Аналитика и Аналитики». Воронеж. Россия. 2-6 июня 2003 г. С. 192.

8. A.V. Shpak, A.V. Pirogov, O.A. Shpigun, Application ofpolyelectrolytes complexes as a pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography. / Proceedings of the 2nd Black Sea Basin Conference on Analytical Chemistry. Sile-Istanbul. Turkey. 2003. September 14-17. P. 41.

9. A.B. Шпак, А.В. Пирогов, Определение водорастворимых форм неорганических анионов в почвах методом капиллярного электрофореза. / Материалы международной конференции «Современное приборное обеспечение и методы анализа почв, кормов, растений и сельскохозяйственного сырья». Москва. ВНИИА. 2-4 декабря 2003. Издательство ВНИИА. 2003. с. 42-44.

10. Шпак А.В., Пирогов А.В., Шпигун ОА, Определение аминокислот методом капиллярного электрофореза без предварительной дериватизации. // Журн. аналит. химии. 2003. Т. 58. № 7. С. 729.

11. A.V. Shpak, A.V. Pirogov, O.A. Shpigun, Micellar electrokinetic chromatography with polyelectrolyte complexes as micellar pseudo-stationary phases // J. Chromatogr. В 2004. V. 800. P.91-100.

12. A.V. Shpak, A.V. Pirogov, O.A. Shpigun, Application of polyelectrolyte complexes as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography. / Proceedings ofthe 17th International Symposium on Microscale Separations and Capillary Electrophoresis - HPCE 2004. Salzburg. Austria 2004. Febrary 8-12. Salzburg. 2004. P. 94.

13. A.B. Пирогов, А.В. Шпак, О.А. Шпигун, Полиэлектролитные комплексы в ионной хроматографии и капиллярном электрофорезе. / Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы». Москва. 15-19 марта 2004. Москва С. 48.

14. А.В. Шпак, Д. С. Немцева, А.В. Пирогов, О.А. Шпигун, Определение подвижности полиакриловой кислоты и ее полиэлектролитных комплексов методом капиллярного электрофореза / Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы». Москва 15-19 марта 2004. Москва С. 117.

15. Shpigun O.A., Shpak A.V., Pirogov A.V., The unique selectivity of a pseudo-stationary phases in MEKC based on polyelectrolyte complexes. / European Conference on Analytical Chemistry «Euroanalysis XIII». Salamanca Spain. 2004. September 5-10. P. PS2-205.

16. Шпак А.В., Шамшурин Д.В., Комарова Н.В., Зинченко В.И., Асанов А.Н., Возможности и перспективы метода капиллярного электрофореза в медицине. / Материалы второго съезда «Общества биотехнологов России». Москва 13-15 октября 2004. с. 122-123.

ог.оо

Подписано в печать 28 января 2005 г. Заказ 455. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ. Тел. 778-97-47

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография.

1.2.1. Удерживание и разрешение.

1.2.2. Эффективность.

1.2.3. Селективность.

1.2. Псевдостационарные фазы на основе низкомолекулярных соединений.

1.3. Псевдостационарные фазы на основе полимерных соединений.

1.3.1. Полимерные мицеллы.

1.3.2. Анионные полимеры.

1.3.3. Катионные полимеры.

1.3.4. Дендримеры.

1.3.5. Полимерные псевдостационарные фазы, содержащие хиральный селектор.

1.3.6. Смешанные полимерные псевдостационарные фазы.

1.4. Полиэлектролитные комплексы.

2. ПРИБОРЫ, АППАРАТУРА, ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение полиэлектролитных комплексов.

3.2. Апробация комплексов в качестве псевдостационарных фаз.

3.2.1. Комплексы приготовленные в присутствии бромида натрия.

3.2.2. Комплексы приготовленные в отсутствии бромида натрия.

3.2.2. Область применимости комплексов в качестве псевдостационарных фаз.

3.3. Электрофоретическая подвижность полиэлектролитных комплексов и полиакриловых кислот.

3.4. Селективность ПЭК по сравнению с СДС.

3. б. 1. Производные фенола.

3.6.2. Дансил-производные аминокислот.

3.6.3. Карбобензокси- производные аминокислот.

3.6.4. Бутоксикарбомоил-производные аминокислот.

3.5. Зависимость электрофоретических параметров разделения от концентрации и основных характеристик комплексов.

3.5.1. Концентрация комплекса в буферном электролите.

3.5.2. Состав полиэлектролитного комплекса (<р).

3.5.3. Степень полимеризации полиакриловой кислоты (Pw), её полидисперсность.

3.5.4. Длина алкильного радикала.

3.6. Аналитические приложения.

3.6.1. Одновременное определение дансил- и карбобензокси-производных аминокислот

3.6.2. Определение кофеина в моче.

3.6.3. Контроль качества лекарственных средств цефоперазона и цефотаксима.

3.6.4. Определение стереоизомеров при иодировании гомологов бензойной кислоты через таллирование.

ВЫВОДЫ.

В последнее десятилетие метод капиллярного электрофореза получил такое же широкое распространение, как жидкостная и газовая хроматография. На сегодняшний день уже стало понятно, что капиллярный электрофорез не заменит жидкостную хроматографию, как считали многие ученые в начале девяностых годов прошлого века, а является методом, дополняющим хроматографию и имеющим свою область применения.

В классическом капиллярном зонном электрофорезе (КЗЭ), разделение основано на различии в собственных электрофоретических подвижностях определяемых соединений. Этот вариант электрофореза используется для анализа заряженных соединений в виде анионов или катионов. В МЭКХ разделение основано на различном распределении определяемых компонентов пробы между псевдостационарной (мицеллярной) фазой и окружающим ее буферным раствором. Метод мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), в отличие от варианта КЗЭ, позволяет определять как заряженные, так и незаряженные соединения и на сегодняшний день МЭКХ является одним из наиболее широко используемых вариантов капиллярного электрофореза.

Актуальность темы. Природа псевдостационарной фазы оказывает решающие влияние на взаимодействие между ней и разделяемыми соединениями, а, следовательно, и на селективность и эффективность электрофоретического разделения. По этой причине выбор и поиск новых псевдостационарных фаз является важной задачей. В последнее десятилетие наблюдается большой интерес к использованию псевдостационарных фаз на основе различных полимерных соединений. Применение псевдостационарных фаз на основе высокомолекулярных соединений позволяет решить многие проблемы, существующие при использовании классических мицелл: разделение смесей сильно гидрофобных смесей, высокая критическая концентрация мицеллообразования, существование точки Крафта и низкая устойчивость при большом содержании органического модификатора.

Цель работы. Полиэлектролитные комплексы ионогенных поверхностно активных веществ (ПАВ) с линейными противоположно заряженными полиэлектролитами, образующиеся при смешении водных растворов исходных компонентов, представляют собой соединения, стабилизированные кооперативной системой солевых связей и гидрофобными взаимодействиями. Целью данного исследования было изучение возможности использования водорастворимых полиэлектролитных комплексов (ПЭК) в качестве нового типа псевдостационарных фаз в мицеллярной электрокинетической хроматографии. Конкретные задачи были следующими:

- поиск области существования водорастворимых и устойчивых комплексов, образованных полиакриловой кислотой (ПАК) и солями четвертичных аммониевых оснований, в условиях электрофоретического эксперимента;

- изучение влияния приложенного внешнего напряжения в разделяющем кварцевом капилляре на полиэлектролитные комплексы, выступающие, как в качестве псевдостационарной фазы, так и в качестве определяемых соединений в варианте капиллярного зонного электрофореза; измерение электрофоретической подвижности полиакриловых кислот и полиэлектролитных комплексов;

- апробация полиэлектролитных комплексов в качестве псевдостационарных фаз для разделения и определения ряда замещенных фенолов, дансил-, карбобензокси- и бутоксикарбомоил-производных аминокислот;

- сравнение основных электрофоретических характеристик разделения для полиэлектролитных комплексов и псевдостационарных фаз, образованных классическими мицеллообразователями (додецилсульфатом натрия, СДС и др.);

- изучение влияния основных параметров полиэлектролитных комплексов: степени полимеризации полиакриловой кислоты (Pw), длины алкильного радикала аммониевого основания (С„), состава полиэлектролитного комплекса (ф) и содержания комплекса в разделяющем буфере на селективность и эффективность разделения;

- установление механизма взаимодействия разделяемых анализируемых соединений с псевдостационарной фазой на основе полиэлектролитных комплексов.

Научная новизна. Впервые полиэлектролитные комплексы были предложены в качестве принципиально нового типа псевдостационарных фаз в МЭКХ.

Найдена область значений основных параметров полиэлектролитных комплексов, состава буферного электролита и условий электрофоретического

разделения при которых полиэлектролитные комплексы могут быть использованы в качестве псевдостационарных фаз.

Показана уникальная селективность к замещенным фенолам по сравнению с классическими псевдостационарными фазами - относительное удерживание не имеет прямой зависимости с их параметром гидрофобности. Найдено, что разделение дансил-производных аминокислот происходит в основном по хроматографическому распределительному механизму, их относительное удерживание увеличивается с увеличением гидрофобности, тогда как на удерживание карбобензокси-производных аминокислот добавление полиэлектролитных комплексов в разделяющий буферный электролит не оказывает влияние. Бутоксикарбомоил-производные имеют разный порядок миграции при использовании полиэлектролитных комплексов и СДС. Ни одна из известных на сегодняшний день псевдостационарная фаза не обладает таким различием во взаимодействии с близкими по свойствам группам соединений.

Показано, что электрофоретические свойства разделения - селективность и эффективность - на новом типе псевдостационарных фаз, могут быть легко изменены путем изменения состава комплекса (tp), степени полимеризации полиэлектролита (Pw) или длины алкильного радикала алкилтриметиламмоний бромида (Сп). Наличие большого числа степеней свободы (F), и простой переход от одной системы к другой, является неоспоримым достоинством нового типа псевдостационарных фаз.

Проведено сравнение с наиболее широко применяемой псевдостационарной фазой на основе додецилсульфата натрия (СДС).

Практическая значимость работы. Представлены примеры разделения смесей разных производных аминокислот и замещенных фенолов. Предложена методика определения кофеина в моче (за счет уникальной селективности прочие компоненты мочи не оказывают мешающего влияние). Осуществлено разделение смеси содержащей одновременно дансил- и карбобензокси-производные аминокислот. Разделены стереоизомеры иодпроизводных p-фенилкарбоновых кислот в реакционой смеси. (Следует отметить, что данные задачи не решаются с использованием СДС). Показана возможность использования нового типа псевдостационарных фаз для химического контроля качества лекарственных средств методом МЭКХ на примере Цефоперабола® и Цефобола®.

На защиту выносятся:

• Область условий, при которых полиэлектролитные комплексы, образованные полиакриловой кислотой и четвертичными основаниями существуют как устойчивые псевдостационарные фазы для МЭКХ;

• Закономерности поведения полиэлектролитных комплексов под действием приложенного напряжения в качестве псевдостационарной фазы и в качестве определяемых соединений;

• Данные по электрофоретическим подвижностям полиакриловых кислот с различными степенями полимеризации и полиэлектролитных комплексов;

• Совокупность данных по условиям разделения ряда замещенных фенолов, ПАУ и разных классов производных аминокислот;

• Результаты влияния основных параметров полиэлектролитных комплексов на селективность и эффективность разделения;

• Зависимости удерживания различных классов соединений от гидрофобности и доли заряженной формы анализируемого соединения для полиэлектролитных комплексов и додецилсульфата натрия;

• Способ определения кофеина в моче, разделение стереоизомеров иодпроизводных Р-фенилкарбоновых кислот в реакционой смеси и пример проведения химического контроля качества лекарственных средств Цефоперабола® и Цефобола® методом МЭКХ с псевдостационарной фазой на основе полиэлектролитного комплекса.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международных конференциях и симпозиумах «Euroanalysis XII» (Дортмунд, Германия, 2002), «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Туапсе, Россия, 2002), «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (Томск, Россия, 2002), SBS 2003 - "100 Years of chromatography" (Москва, Россия, 2003), «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, Россия, 2003), 2nd Black Sea Basin Conference on Analytical Chemistry (Шиле-Стамбул, Турция, 2003), «Современное приборное обеспечение и методы анализа почв, кормов, растений и сельскохозяйственного сырья» (Москва, Россия, 2003), НРСЕ 2004 (Зальцбург, Австрия, 2004), «Euroanalysis XIII» (Саламанка, Испания, 2004); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004), втором съезде общества биотехнологов России (Москва, 2004) и международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов - 2003» (Москва, 2003); научных коллоквиумах лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии МГУ.

Публикация результатов. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 13 тезисов докладов.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, общих выводов, списков цитируемой литературы и сокращений. Материал диссертации изложен на 182 страницах машинописного текста, содержит 76 рисунков и 17 таблиц, в списке цитируемой литературы 161 наименование.

выводы

1. Полиэлектролитные комплексы впервые были использованы в качестве нового типа псевдостационарных фаз в мицеллярной электрокинетической хроматографии для разделения замещенных фенолов и различных классов производных аминокислот.

2. Найдены параметры полиэлектролитного комплекса полиакриловой кислоты с алкилтриметиаламмоний бромидами и основных электрофоретических условий, при которых они могут использоваться как псевдостационарные фазы.

3. Изучено влияния приложенного внешнего напряжения в разделяющем кварцевом капилляре на полиэлектролитные комплексы, выступающие как в качестве псевдостационарной фазы, так и в качестве анализируемых соединений в варианте капиллярного зонного электрофореза.

4. Найдены электрофоретические подвижности полиакриловых кислот и образованных ими полиэлектролитных комплексов.

5. Изучено влияние основных параметров полиэлектролитных комплексов: степени полимеризации полиакриловой кислоты, длины алкильного радикала аммониевого основания, состава полиэлектролитного комплекса и содержания комплекса в разделяющем буферном электролите на селективность и эффективность разделения. Проведено их сравнение с додецилсульфатом натрия.

6. Найдено, что псевдостационарные фазы на основе полиэлектролитных комплексов проявляют уникальную и легко изменяемую селективность по сравнению с додецилсульфатом натрия: фенолы и бутоксикарбомоил-производные аминокислот имеют другой порядок удерживания, а на разделение карбобензокси-производных добавка комплекса в буфер не оказывает влияния.

7. Предложена методика определения кофеина в моче. За счет изменения селективности устранено мешающее влияние компонентов матрицы. Осуществлено разделение смеси, содержащей одновременно дансил- и карбобензокси-производные. Разделены стереоизомеры иодпроизводных |3-фенилкарбоновых кислот в реакционной смеси. Показана возможность использования нового типа псевдостационарных фаз для контроля качества лекарственных средств методом МЭКХ. (Данные задачи не решаются с использованием СДС).

1. Heiger D. High performance capillary electrophoresis. Germany. Agilent tecnologies. 2000. P.135.

2. Ануфриева P.M., Бессчетнова Т.Ю., Система капиллярного электрофореза. СПб.: Петрополис. 2001. С. 6-12.

3. Волощук A.M. Руководство по капиллярному электрофорезу. М.: Москва. 1996. С.1.-19, 77-84, 134-149.

4. Terabe S., Otsuka К., Ichikawa К., Tsuchiya A., Ando Т. // Anal. Chem. 1984. V. 56. P.1.I-115.

5. Mark D.Trone and Morteza G.Khaledi. Statistical evaluation of linear solvation energy relationship models used to characterize chemical selectivity in micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 2000. V. 886. P. 245-257.

6. Joselito P.Quirino and Shigeru Terabe. Electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 1999. V. 856. P. 465-482.

7. Mark D.Trone, Juan P.Mack, Henry P.Goodell, and M.G.Morteza G.Khaledi. Characterization of chemical selectivity in micellar electrokinetic chromatography: VI. Effects of surfactant counter-ion. // J. Chromatogr. A 2000. V. 888. P. 229-240.

8. Morteza G.K. Micelles as separation media in high-performance liquid chromatography and high-performance capillary electrophoresis: overview and perspective. // J. Chromatogr. A 1997. V. 780. P. 3-40.

9. Ozaki H., Ichihara A., Terabe S. Micellar electrokinetic chromatography using high-molecular-mass surfactants: comparison between anionic and cationic surfactants and effects of modifiers. // J. Chromatogr. A 1995. V. 709. P. 3-10.

10. Colin F.Poole and Salwa K.Poole. Interphase model for retention and selectivity in micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 1997. V. 792. P. 89-104.

11. Muijselaar P.G., Otsuka K., Terabe S. Micelles as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 1997 V. 780. P. 41-61.

12. Balchunas A.T., Sepaniak M.J. The influense of control of electroosmotic flow on the electrophoretic separation. // Anal. Chem. 1987. V. 59. P. 1466-51.

13. Lux J.A., Yin H., Schomburg G. Electrokinetic chromatography without electroosmotic flow. // J. High Resolut. Chromatogr. 1990. V. 13. P. 145-149.

14. Cai J., Rassi E. Complementary use of capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic capillary chromatography for mutual confirmation of results in forensic drug analysis. // J. Chromatog. 1992. V. 608. P. 31-35.

15. Ahuja E.S., Nielsen K.R., Foley J.P., Little E.L. Separation of compounds by capillary electrokinetic chromatography with a mixed pseudo-stationary phase based on sodium dodecyl sulfate and Brij 35. // Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 26-29.

16. Terabe S., Otsuka K., Ando T. Bang broadening in micellar electrokinetic chromatography. // Anal. Chem. 1989. V. 61. P. 251-256.

17. Davis J.M. Separation of six phenylureas and chlorsulfuron standards by micellar, mixed micellar and microemulsion electrokinetic chromatography. // Anal. Chem. 1989. V. 61. P. 2455-59.

18. Yu L., Davis J.M. Strategy for selecting separation buffers for obtain the system with high efficiency. //Electrophoresis 1995. V. 16. P. 2104-08.

19. Yang S., Bumgarner J.G., Khaledi M.G. Chemical selectivity in micellar electrokinetic chromatography II. Rationalization of elution patterns in different surfactant systems. J. Chromatogr. A // 1996 V. 738. № 2. P. 265-274.

20. Bumgarner J.C., Khaledi M.G. Chemical selectivity in micellar electrokinetic chromatography II. Rationalization of elution patterns in different surfactant systems. // J. Chromatogr. A 1996. V. 738. P. 265-274.

21. Yang S., Khaledi M.G. Linear solvation energy relationships in micellar liquid chromatography and micellar electrokinetic capillary chromatography. // J. Chromatogr. A 1995 V. 692. P. 301-310.

22. Yang S., Khaledi M.G. Quantitative structure-activity relationships studies with micellar electrokinetic chromatography. // Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 499-504.

23. Muijselaar P.G.H.M., Claessens H.A., Cramers C.A. Using retention indeces for study selectivity in micellar electrokinetic chromatography. // Anal. Chem. 1994. V. 66. P. 635639.

24. Muijselaar P.G. Retention indices in micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 1997. V. 780 P. 117-127.

25. Muijselaar P.G.H.M., Claessens H.A., Cramers C.A. Retention indices and group selectivity in micellar electrokinetic chromatography. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 118488.

26. Bumgarner J.C., Khaledi M.G. Chemical selectivity in micellar electrokinetic chromatography. //Elecrophoresis 1994. V. 15. P. 1260-64.

27. Gaillon L., Cozette S., Lelievre J., and R.Gaboriaud. New pseudo-stationary phases for electrokinetic capillary chromatography: Complexes between bovine serum albumin and sodium dodecyl sulfate. // J. Chromatogr. A 2000. V. 876. P. 169-182.

28. Schwarz M.A., Neubert H.H., Dongowski G. Characterization of interactions between bile salts and drugs by micellar electrokinetic capillary chromatography. Part I. // Pharmaceutical Research 1996. V. 13. №. 8. P. 1174-1180.

29. Little E.L., Foley J.P. Mixed micelles as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography. // J. Microcol. Sep. 1992. V. 4. P. 145-149.

30. Otsuka K., Kashihara M., Kawaguchi Y., Koike R., Hisamitsu Т., Terabe S. Mixed micellar systems containing a chiral surfactant. // J. Chromatogr. A 1993. V. 652. P. 253259.

31. Otsuka K., Karuhaka K., Higashimori M., Terabe S. Selectivity in capillary electrophoresis in the presence of micelles, chiral selectors and non-aqueous media. // J. Chromatogr. A 1994. V. 680. P. 317-322.

32. Muijselaar P.G., Otsuka K., Terabe S. On-line coupling of partial-filling micellar electrokinetic chromatography with mass spectrometry. // J. Chromatogr. A 1998. V. 802. I. l.P. 3-15.

33. Terabe S., Katsura Т., Okada Y., Ishihama Y., Otsuka K., Applications of in-capillary reaction micellar electrokinetic chromatography in the food industry. // J. Microcol. Sep. 1993. V. 5. P. 23-27.

34. Ahuja E.S., Foley J.P. Influence of the counter-ion on critical micelle concentration, Krafft point and electrophoretic mobility in MEKC. // Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 2315-19.

35. Shoichi Katsuta and Koichi Saitoh. Control of separation selectivity in micellar electrokinetic chromatography by modification of the micellar phase with solubilized organic compounds. //J. Chromatogr. A 1997. V. 780. P. 165-178.

36. Takeda S., Wakida S., Yamane M., Kawahara A., Higashi K. Separation of aniline derivatives by micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 1993. V. 653. P. 109-114.

37. Renou-Gonnord M.F., David K. Optimized micellar electrokinetic chromatographic separation of benzodiazepines. // J. Chromatogr. A 1996. V. 735. P. 249-261.

38. Reekkola M.L., Jumppanen J.H. Capillary electrophoresis of diuretics. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 735. P. 151-164.

39. Trenerry V.C., Robertson J., Wells R.J. Analysis of illicit amphetamine seizures by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 708. P. 169-176.

40. Agbodjan A.A., and Khaledi M.G. Study of solute partitioning into cationic vesicles of dihexadecyldimethylammonium bromide using electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1024. P. 145-153.

41. Eva Schneiderman and Apryll M.Stalcup. Cyclodextrins: a versatile tool in separation science. //J. Chromatogr. В 2000. V. 745. P. 83-102.

42. Bretnall A.E., Clarke G.S. Investigation and optimisation of the use of micellar electrokinetic chromatography for the analysis of six cardiovascular drugs. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 700. P. 173-178.

43. Lurie I.S., Chan K.C., Spratley Т.К., Casale J.F., Issaq H.J. Separation and detection of acidic and neutral impurities in heroin via capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. В 1995 V. 669. P. 3-13.

44. Shen Hu and Paul R.Haddad. Micellar electrokinetic capillary chromatographic separation and fluorescent detection of amino acids derivatized with 4-fluoro-7-nitro-2,l,3-benzoxadiazole . //J. Chromatogr. A. 2000. V. 876. P. 183-191.

45. Ong C.P., Hg C.L., Lee H.K., Li S.F.Y. Separation of amino acid derivatives. // Electrophoresis 1994. V. 15. P. 1273-1279.

46. Philip Zakaria, Miroslav Маска, and Paul R.Haddad. Separation of opiate alkaloids by electrokinetic chromatography with sulfated-cyclodextrin as a pseudo-stationary phase. // J. Chromatogr. A. 2003. V. 985. P. 493-501.

47. Lukkari P., Siren H. Ion-pair chromatography and micellar electrokinetic capillary chromatography in analyzing beta-adrenergic blocking agents from human biological fluids. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 717. P. 211-217.

48. Muijselaar P.G.H.M., Claessens H.A., Cramers C.A. Determination of structurally related phenothiazines by capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 735. P. 395-402.

49. Toshiro Watanabe and Shigeru Terabe. Applications of in-capillary reaction micellar electrokinetic chromatography in the food industry. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 880. P. 295-301.

50. Bjergegaard C., Moller P., Sorensen H. Determination of thiocyanate, iodide, nitrate and nitrite in biological samples by micellar electrokinetic capillary chromatography. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 717. P. 409-414.

51. Crosby D., Rassi E.I. Separation of urea herbicides by micellar electrokinetic chromatography with cationic surfactants. // J. Liq. Chromatogr. 1993. V. 16. P. 2161-2171.

52. Ji A.J., Nunez M.F., Machacek D., Ferguson J.E., Iossi M.F., Pai C.K., Landers J.P. Separation of urinary estrogens by micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 669. P. 15-26

53. Farran A., Serra C., Sepaniak M.J. Three different approaches for the separation of MCPA and 2,4-D by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 835. P. 209215.

54. Joselito P.Quirino and Shigeru Terabe. On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography: IV. Field-enhanced sample injection. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 251-257.

55. Hong W., Andersson P.E., Engstrom A., Blomberg L.G. Direct and indirect chiral separation of amino acids by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 704. P. 179-193.

56. Yoshihide Tanaka, Yasuhiro Kishimoto, Koji Otsuka, and Shigeru Terabe. Strategy for selecting separation solutions in capillary electrophoresis-mass spectrometry. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 817. P. 49-57.

57. Lamoree M.N., Tjaden U.R., Greef J. On-line coupling of micellar electrokinetic chromatography to electrospray mass spectrometry. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 712. P. 219-225.

58. Maichel B. and Kenndler E. Recent innovation in capillary electrokinetic chromatography with replaceable charged pseudoststionary phases or additives. Electrophoresis 2000 V. 21. P. 3160-3173.

59. Shamsi S.A., Palmer C.P., and Warner I.M. Molecular micelles: novel pseudostationary phases for CE. // Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 140a-149a.

60. Palmer C.P., Khaled M.Y., McNair H.M. Polymeric poly(sodium undecylenate) pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography. // J. High Resolut. Chromatogr. 1992. V. 15. P. 756-762.

61. Palmer C.P. and Tanaka N. Selectivity of polymeric and polymer-supported pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 1997. V. 792. P. 105-124.

62. Palmer C.P. Polymeric and polymer-supported pseudostationary phases in micellar electrokinetic chromatography: performance and selectivity. // Electrophoresis 2000. V. 21. P. 4054-4072.

63. Palmer C.P., Terabe S. Micelle polymers, polymer surfactants and dendrimers as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography. // Anal. Chem. 1997. V. 69. 1852-1860.

64. Akbay C., Warner I.M., Shamsi S.A. Electrokinetic chromatography of twelve monomethylbenza.anthracene isomers using a polymrized anionic surfactant. // Electrophoresis 1999. V. 20. P. 145-151.

65. Tellman K.T., Palmer C.P. Polymers of sodium-N-undec-10-ene-l-oyl taurate and sodium-N-undec-10-ene-l-oyl aminoethyl-2-phosphonate as pseudo-stationary phases for electrokinetic chromatography. // Electrophoresis 1999. V. 20. P. 152-161.

66. Edwards S.H. and Shamsi S.A. Micellar electrokinetic chromatography of polychlorinated biphenyl congeners using a polymeric surfactant as the pseudostationary phase. //J. Chromatogr. A 2000. V. 903. P. 227-236.

67. Fujimoto C., Fujise Y., and Kawaguchi S. Macromolecular surfactant as a pseudo-stationary phase in micellar electrokinetic capillary chromatography. // J. Chromatogr. A 2000. V. 871. P. 415-425.

68. Fujimoto С. Application of linear solvation energy relationships to polymeric pseudostationary phases in micellar electrokinetic chromatography. // Electrophoresis 2001. V. 22. P. 1322-1329.

69. Tanaka N., Nakagawa K., Hosoya K., Palmer C.P., and Nakajima T. Control of migration time window and selectivity in electrokinetic chromatography with mixed polymeric pseudostationary phases.//J. Chromatogr. A 1998. V. 802. №. 1. P. 23-33.

70. Shi W., Watson C.J., and Palmer C.P. Sulfonated acrylamide copolymers as pseudo-stationary phases in electrokinetic chromatography . J. Chromatogr. A 2001. V. 905. p. 281290.

71. Shi W. and Palmer C.P. Effect of pendent group structures on the chemical selectivity and performance of sulfonated copolymers as novel pseudophases in electrokinetic chromatography. //Electrophoresis 2002. V. 23. P. 1285-1295.

72. Kolb S., Kutter J.P., and Welsch T. New selectivity in electrokinetic chromatography using a polymeric dye as novel separation carrier. // J. Chromatogr. A 1997. V. 792. P. 151156.

73. Peterson S.D. and Palmer C.P. An anionic siloxane polymer as a pseudostationary phase for electrokinetic chromatography. // Electrophoresis 2000. V. 21. P. 3174-3180.

74. Peterson S.D. and Palmer C.P. Alkyl modified anionic siloxanes as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography: I. Synthesis and characterization. // J. Chromatogr. A 2001. V. 924. P. 103-110.

75. Peterson S.D. and Palmer C.P. Novel alkyl-modified anaonic siloxanes as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography: II. Selectivity studied by linear solvation energy relationships. // Electrophoresis 2001. V. 22. P. 3562-3566.

76. Peterson S.D. and Palmer C.P. Novel alkyl-modified anionic siloxanes as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography: III. Performance in organic-modified buffers. // J. Chromatogr. A 2002. V. 959. P. 255-261.

77. Schulte S. and Palmer C.P. Alkyl-modified siloxanes as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography. // Electrophoresis 2003. V. 24. P. 978-983.

78. Erim F.B. Effect of cationic polymer on the separation of phenols by capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. A 1997. V. 768. P. 161-167.

79. Potocek В., Chmela E., Maichel В., Tesarova E., Kenndler E., and Gas B. Capillary pseudostationary phase: determination of capacity factors and characterization by solvation parameters. // Anal. Chem. 2000. V. 72, №. 1. P. 74-80.

80. Maichel В., Potocek В., Gas В., Chiari M., and Kenndler E. Separation of neutral compounds by capillary electrokinetic chromatography using polyethyleneimine as replaceable cationic pseudostationary phase. // Electrophoresis 1998. V. 19. P. 2124-2128.

81. Gogova К., Maichel В., Gas В., and Kenndler E. Electrokinetic chromatography with micelles, polymeric and monomeric additives with similar chemical functionality as pseudo-stationary phases. // J. Chromatogr. A 2001. V. 916. P. 79-87.

82. Maichel В., Gas В., and Kenndler E. Diffusion coefficient and capacity factor in capillary electrokinetic chromatography with replaceable charged polymeric pseudophase. // Electrophoresis 2000. V. 21. P.1505-1512.

83. Izzo G., Maria-Augusta Raggi, Maichel В., and Kenndler E. Separation of olanzapine, carbamazepine and their main metabolites by capillary electrophoresis with pseudo-stationary phases. // J. Chromatogr. В 2001. V. 752. P. 47-53.

84. Zakaria P., Маска M., and Haddad P.R. Electrokinetic chromatography utilizing two pseudostationary phases providing ion-exchenge and hydrophobic interactions. // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 1241-1248.

85. Zakaria P., Маска M., and Haddad P.R. Mixed-mode electrokinetic chromatography of aromatic bases with two pseudo-stationary phases and pH control. // J. Chromatogr. A 2003. V. 997. P. 207-218.

86. Tanaka N., Fukutome Т., Tanigawa Т., Hosoya K., Kimata K., Araki Т., and Unger K.K. Structural selectivity provided by starburst dendrimers as pseudostationary phase in electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 1995. V. 699. P. 331-341.

87. Stathakis C., Arriada E.A., Dovichi N.J., Protein profiling employing capillary electrophoresis with dendrimers as pseudostationary phase media. // J. Chromatogr. A 1998. V. 817. P. 233-238.

88. Ann L.Gray and James T.Hsu. Novel sulfonic acid-modified Starburst dendrimer used as a pseudostationary phase in electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 1998. V. 824. P. 119-124.

89. Billiot H.F., Billiot E.J., Warner I.M. Comparison of monomeric and polymeric amino acid based surfactants for chiral separations. // J. Chromatogr. A 2001. V. 922. P. 329-338.

90. Billiot H.F., Billiot E.J., Warner I.M. Depth of penetration of binaphthyl derivatives into the micellar core of sodium undecenoyl leucyl-leucinate surfactants. // J. Chromatogr. A 2002. V. 950. P. 233-239.

91. Stefan J. Tribodeaux, Eugene J.Billiot, and Warner I.M. Enantiomeric separations using poly (1 valine ) and poly( 1 - leucine ) surfactants - Investigation of steric factors near the chiral center. // J. Chromatogr. A 2002. V. 966. P. 179-186.

92. Haddadian F., Billiot E.J., Shamsi S.A., and Warner I.M. Chiral separations using polymeric dipeptide surfactants: effect of number of chiral centers and steric factors. // J. Chromatogr. A 1999. V. 858. P. 219-227.

93. Zhang K., Krishnaswami Raja, and Lifang Sun. Looking into the high efficiency of chiral separations using a chiral-polymer as pseudo stationary phase for micellar electrokinetic chromatography. // Analytica Chimica Acta 2003. V. 496. P. 185-193.

94. Katsuura H., Kawamura H., Manabe M., Kawasaki H., Maeda H. Binding of a surfactant counterion to low-charge-density poly(acrylic acid) and poly(methacrylic acid). // Colloid Polym. Sci. 2002. V. 280. P. 30-37.

95. Michael S.Leonard and Morteza G.Khaledi. A mixed ionic block copolymer-surfactant pseudo-stationary phase in micellar electrokinetic chromatography. // J. Sep. Sci. 2002. V. 25. P.1019-1026.

96. Otsuka Koji and Terabe S. Enantiomer separation of drugs by micellar electrokinetic chromatography using chiral surfactants. // J. Chromatogr. A 2000. V. 875. P. 163-178.

97. Wan H. and Blomberg L.G. Chiral separation of amino acids and peptides by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A 2000. V. 875. P. 43-88.

98. Yarabe H. H., Billiot E., Warner I. M., Enantiomeric separations by use of polymeric surfactant electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 179-206.

99. Palmer C.P. Micelle polymers, polymer surfactants and dendrimers as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A 1997. V. 780. P. 75-92.

100. Palmer C.P. Recent progress in the development, characterization and application of polymeric pseudophases for electrokinetic chromatography. // Electrophoresis 2002. V. 23. P. 3993-4004.

101. Goddard E.D. Interactions of surfactants with polymers and proteins. Florida. CRC Press. 1990.289 р.

102. Касаикин В.А., Литманович Е.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Самоорганизация мицеллярной фазы при связывании додецилсульфата натрия полидиаллилдиметиламмоний хлоридом в разбавленном водном растворе. // ДАН. Физ. Химия. 1999. Т. 367. № 3. С.359-362.

103. Ibragimova Z.Kh., Kasaikin V.A., Zezin A.B., Kabanov V.A. Non-stoichometric polyelectrolyte complexes of polyacrylic acid and cationic surfactants. // J. Polym. Sci. USSR. 1986. V. 28. P. 1826-33.

104. Kasaikin V.A., Zakharova J.A., Self-organization in complexes of polyacids with oppositely charged surfactants. Colloids and surfaces. 1999. V. 147. P. 107-114.

105. Beyer P., Nordmeier Е. Ultracentrifugation, viscometry, рН, and dynamic light scattering studies of the complexation of ionene with poly(acrylic acid) and poly(methacrylic acid). // European Polymer J. 1999. V. 35. P. 1351-65.

106. Kuhn P.S., Levin Y., Barbosa M.C. Complex formation between polyelectrolytes and ionic surfactants. Chem. Phys. Lett. 1998. V. 298. P. 51-56.

107. Kochanowski A., Witek E., Bortel E. Wholly water-soluble interpolymer complexes formed by interaction of strong anionic and cationic polyelectrolytes. // J. Macromolec. Sci. 2003. V. A40. № 5. P. 449-460.

108. Bokias G., Staikos G. A quantitative description of the viscometric behaviour of partially neutralized poly(acrylic acid) in aqueous solutions studied by the isoionic dilution method. Polym. // 1995. V. 36. № 10. P. 2079-82.

109. Huglin M.B., Webster L. Complex formation between poly(4-vinylpyridinium chloride) and polysodium(2-acrylamido-2-methyl propane sulfonate). in dilute aqueous solution. Polym. // 1996. V. 37. № 7. P. 1211-15.

110. Крюкова Г.Н. Дис. . канд. хим. наук. М: МГУ, 1982. С. 240.

111. Ибрагимова З.Х., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Полиэлектролитные водорастворимые комплексы полианионов с бифильными катионами. // Высокомолек. Соед. А, 1986. Т. 28. № 8. С. 1640-46.

112. Scheutjens J.M., Fleer G. Statistical theory of the adsorption of interacting chain molecules. II. Train, loop and tail size distribution. // J. Phys. Chem. 1980. V. 84. P. 178188.

113. Досон P., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. С.544.

114. Hong W., Andersson Р.Е., Engstrom A., Blomberg L.G. Direct and indirect chiral separation of amino acids by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 704. P. 179-193.

115. Глущенко H.H., Плетенева T.B., Попков B.A. Фармацевтическая химия. М.: Академия, 2004. С. 31-50.1. СОКРАЩЕНИЯ

116. КЭ капиллярный электрофорез

117. МЭКХ мицеллярная электрокинетическая хроматография

118. КЗЭ капиллярный зонный электрофорез

119. ЭОП электроосмотический поток

120. ККМ критическая концентрация мицеллообразования

121. Nmin минимальное число агрегацииto время выхода электрофоретического потокаtm «мертвое время», время миграции мицеллк' емкостный фактор

122. К коэффициент распределения

123. N эффективность разделения (число теоретических тарелок)о коэффициент селективности

124. ЦТАБ цетилтриметиламмоний бромид

125. ДТАБ додецилтриметиламмоний бромид

126. ТТАБ тетрадецилтриметиламмоний бромиду

127. ТБАБ тетрабутиламмоний бромид1. СДС додецилсульфат натрия

128. PFOS перфтороктансульфонат лития

129. ER линейные отношения энергии сольватации

130. ЕСТ триоксиэтиленалкилацетата натрия

131. Brij 35 полиоксиэтилен(23)додеканолом1. ЦЦ циклодекстрин

132. ПАУ полициклические ароматические углеводородыпАЦН поли-10 - андецеленат натрияпАЦС поли -10 - андеценилсульфат натрия

133. ВВМА- бутил акрилата-бутил метакрилата-метакриловой кислоты

134. AMPS 2-акрилаида-2-метил-1-пропансульфоновой кислоты1. PEI Полиэтиленмин1. Полибрен 3,6-ионен

135. ПАВ поверхностно активные вещества

136. ПЭ-ПАВ комплекс полиэлектролит - поверхностно активное вещество

137. ПЭ-ПЭ комплекс полиэлектролит-полиэлекгролит

138. AlkTMAB алкилтриметиламмоний бромид

139. ПЭК полиэлектролитный комплекс1. ПАК полиакриловая кислота

140. ПМАК полиметакриловая кислота

141. Pw средневесовая степень полимеризации1. MW:M„ полидисперсностью

142. ККА критическая концентрация агрегации

143. Nn3 среднее число цепей полиэлектролита

144. Ппав среднее число ионов ПАВ, входящих в состав частицы ПЭК