Исследование структурных свойств полимеров амилоид β пептида и лизоцима методами силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

□0305В840

На правах рукописи

Украинцев Егор Владиславович

Исследование структурных свойств полимеров амилоид (3 пептида и

лизоцима методами силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии

Специальность 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2007

Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

Доктор физико-математических наук, профессор

Яминский Игорь Владимирович

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор Кандидат физико-математических наук

Шайтан Константин Вольдемарович Дюжев Николай Алексеевич

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится 16 мая 2007 г. в 15 час. на заседании диссертационного совета Д 501.002.01 в Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, Физический факультет МГУ, д.1, строение 35, Конференц-зал ЦКП физического факультета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан И апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Д 501.002.01

кандидат физико-математических наук

Т.В. Лаптинская

1 Общая характеристика работы

Актуальность темы

Одна из актуальных на сегодняшний день проблем, стоящая перед физиками, заключается в том, что нужно изучить влияние температуры, рН, типа поверхности и вида сорбции на конформацию молекул полимеров, а также механизм взаимодействия молекул, находящихся в нативном состоянии или в конформации с неправильной укладкой. Известно, что больше половины нейродегенеративных заболеваний связано с неправильным складыванием белковых молекул. Поэтому очень важно изучить влияние температуры, рН, типа поверхности и вида сорбции на конформацию молекул полимеров.

Физическая и химическая сорбция молекул к поверхности является важным фактором, определяющим конформацию молекул. Поэтому нужно исследовать, как будут меняться свойства макромоле-кулярного полимерного комплекса при его закреплении на поверхности. Изменение свойств полимеров при физической и химической сорбции пока еще не достаточно изучено. Большинство процессов в организме человека происходят на различных поверхностях, например мембранах клеток, поэтому очень важно знать, как различаются свойства молекул в объеме и на поверхности.

Цели работы

1. Изучить причины (изменение температуры, рН, вида поверхности и типа сорбции) и следствия (возникновение сильного межмолекулярного взаимодействия между одинаковыми молекулами, образование фибрилл и других типов агрегатов) кон-формационного перехода молекул биополимеров из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой.

2. Изучить конформационные переходы в биомакромолекулах с помощью атомно-силовой микроскопии и силовой спектроскопии.

3. На атомно-силовом микроскопе и на Атомных весах изучить межмолекулярное взаимодействие полимеров, находящихся в нативном состоянии и состоянии с неправильной укладкой на примере амилоид ¡3 пептида и лизоцима.

4. Определить факторы (температура, рН, вид поверхности и тип сорбции), которые влияют на конформацию молекул.

5. Изучить последствия изменения молекулами конформации на взаимодействие молекул между собой на примере амилоид ¡3 пептида и лизоцима.

6. Исследовать агрегацию молекул лизоцима на различных поверхностях (слюда, золото, графит) и при различных типах сорбции (физическая или химическая).

7. Исследовать влияние вида поверхности и типа сорбции на температуру конформационного перехода в лизоциме.

Научная новизна работы

1. Методами силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии определены условия, при которых происходит переход молекул полимеров амилоид /3 пептида и лизоцима из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой.

2. Впервые при помощи силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии изучено межмолекулярное взаимодействие полимеров амилоид ¡3 пептида и лизоцима, находящихся в состоянии с неправильной укладкой.

3. Впервые исследовано влияние температуры, рН, вида поверхности и типа сорбциии на конформацию молекул амилоид ¡3 пептида и лизоцима.

4. Впервые обнаружено, что все эти факторы могут приводить к изменению конформации молекул и к последующей агрегации полимеров с образованием фибрилл.

5. Впервые обнаружено, что молекулы полимеров, привитые к поверхности, могут агрегировать и образовывать фибриллы.

6. Впервые обнаружено, что химическая сорбция может способствовать агрегации полимеров.

7. Обнаружено, что химическая сорбция молекул лизоцима к поверхности золота и физическая сорбция молекул лизоцима на поверхность графита приводит к понижению температуры конформационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до комнатной температуры (20 °С).

8. Обнаружено, что физическая сорбция молекул лизоцима на поверхность слюды и слюды со слоем 3-аминопропилсилатрана приводит к понижению температуры конформационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до 50 °С.

На защиту выносятся следующие результаты и положения

1. Определены условия (температура, рН, вид поверхности и тип сорбции), при которых амилоид ¡3 пептид и лизоцим переходят из нативной конформации (неамилоидогенной конформации) в состояние с неправильной укладкой (амилоидогенную конфор-мация).

2. Обнаружено, что амилоид /? пептид (р1 = 5.5), химически сорбированный на поверхность слюды, изменяет свою конфор-мацию при повышении кислотности среды с рН5.6 до рН3.7 при комнатной температуре.

3. Обнаружено, что лизоцим (р1 = И), физически сорбированный на графит, химически сорбированный на слюду или золото, изменяет свою конформацию при повышении кислотности среды с рН4.5 до рНЗ.О при комнатной температуре.

4. Обнаружено, что лизоцим, физически сорбированный на слюду и слюду, обработанную 3-аминопропилсилатраном, изменяет свою конформацию (при рНЗ.О) при повышении температуры до 50 °С.

5. Этот конформационный переход происходит под действием различных факторов, таких как понижение рН, повышение температуры, близость поверхности из-за физической или химической сорбции.

6. Вследствии этого конформационного перехода происходит значительное увеличение вероятности взаимодействия двух молекул между собой по сравнению с нативной конформацией (в которой молекулы между собой почти не взаимодействуют),

например, сила взаимодействия двух молекул равна ~ 40 пН для амилоид /3 пептида и ~ 110 пН для лизоцима.

7. Это межмолекулярное взаимодействие приводит к агрегации амилоид /3 пептида и лизоцима. При этом могут образовываться линейные фибриллы и порообразные агрегаты.

8. Обнаружено формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе.

9. Обнаружено формирование фибрилл лизоцима, химически сорбированного на поверхность золота и отсутствие агрегации лизоцима, физически сорбированного на поверхность золота

10. Обнаружено, что химическая сорбция молекул лизоцима к поверхности золота и физическая сорбция молекул лизоцима на поверхность графита приводит к понижению температуры кон-формационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до комнатной температуры.

И. Обнаружено, что физическая сорбция молекул лизоцима на поверхность слюды и слюды со слоем АПС приводит к понижению температуры конформационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до 50 °С.

Научная и практическая ценность

Впервые измерено взаимодействие двух молекул амилоид /3 пептида и лизоцима, находящихся в состоянии с неправильной укладкой.

Впервые обнаружено, что физическая и химическая сорбция молекул к поверхности может приводить к изменению конформации этой молекулы.

Впервые исследовано влияние вида поверхности и типа сорбции на температуру конформационного перехода в лизоциме.

Впервые изучена агрегация лизоцима на поверхности в условиях, когда она не происходит в растворе.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы докладывались на следующих конференциях:

1. 19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (США, 2005). Conformation-dependent interprotein interaction studied by AFM force spectroscopy. E.V. Ukraintsev, Т.О. Zaikova, J.F.W. Keana and Y.L.Lyubchenko;

2. 19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (США, 2005). Study of DNA-Sfi I complex stability using AFM force spectroscopy. A.V. Krasnoslobodtsev, L.S. Shlyakhtenko, E.V. Ukraintsev and Y.L. Lyubchenko;

3. International Conference on Nanoscience and Technology (Швейцария, 2006). Atomic balance observation of protein aggregation on a cantilever surface. G. Kiselev, A.Kudrinskii, E.Ukraintsev, I. Yaminsky, G.Lisichkin;

4. Третья Всероссийская конференция (с международным участием), Химия поверхности и нанотехнология (Россия, 2006). Изучение агрегации лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота и слюды, с помощью кантилевера для атомно-силовой микроскопии. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселев, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский.

б

Публикации

Основные результаты работы доложены на 3 конференциях и опубликованы в 3 статьях и 4 тезисах докладов.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав, заключения и списка литературы. Общий объем — 127 страниц, в том числе 45 рисунков и 1 таблица. Список литературы содержит 82 наименования.

2 Содержание диссертации

Во введении обосновывается актуальность темы, формулируются цели и задачи диссертационной работы и изложено ее краткое содержание.

В первой главе содержится обзор работ, связанных с исследованием межмолекулярных взаимодействий и агрегации белков. Сформулированы нерешенные задачи и обоснована постановка задачи диссертационной работы.

В первом параграфе главы 1 рассматриваются основные методы исследования межмолекулярных взаимодействий. Описаны основы и некоторые экспериментальные данные, полученные при помощи атомно-силовой микроскопии и силовой спектроскопии.

Во втором параграфе главы 1 рассмотрены общие свойства белков, исследованных в этой работе. Описаны проведенные ранее эксперименты по определению свойств амилоид /3 пептида и лизоцима.

В третьем параграфе главы 1 описано влияние поверхности на конформацию молекулы и влияние химической сорбции на конфор-мацию молекулы. Сформулирована нерешенная ранее задача о вли-

янии химической сорбции на конформацию молекулы.

В четвертом параграфе главы 1 описано исследование взаимодействия двух молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой. Сформулирована нерешенная ранее задача об исследовании взаимодействия двух одинаковый молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой.

Во второй главе описаны экспериментальные результаты по исследованию межмолекулярного взаимодействия и агрегации полимеров.

В первом параграфе главы 2 описаны эксперименты по изучению межмолекулярного взаимодействия на примере амилоид /3 пептида, проведенные мной в лаборатории Юрия Львовича Любченко в UNMC (University of Nebraska Medical Center, USA, Nebraska) в 2004 - 2005 году.

Известно, что процесс агрегации амилоид /3 пептида связан с возникновением болезни Альцгеймера. При определенных условиях молекулы амилоид ¡3 пептида теряют свою нативную конформацию (точнее, неамилоидогенную) и переходят в конформацию с неправильной укладкой (амилоигогенную). Молекулы, находящиеся в этом состоянии, взаимодействуют между собой, что приводит к образованию фибрилл. Возможно, что образование этих фибрилл каким-либо образом связано с развитием болезни Альцгеймера.

Эта работа является первой работой по исследованию взаимодействия двух одинаковых молекул, находящихся в конформации с неправильной укладкой. Эти эксперименты направлены на то, чтобы решить следующие задачи:

1. Определить, при каких условиях происходит конформаци-

онный переход в молекулах амилоид ¡3 пептида из-за понижения рН при комнатной температуре и физиологической ионной силе раствора (150 мМ).

2. Исследовать взаимодействие молекул амилоид (3 пептида, находящихся в нативной конформации и в конформации с неправильной укладкой.

3. Определить силу взаимодействия двух молекул амилоид ¡3 пептида, находящихся в конформации с неправильной укладкой.

Для решения этих задач был предложен новый способ закрепления молекул амилоид (3 пептида на поверхности. Он заключается в том, что каждая молекула пептида химически сорбируется (ковалентно пришивается) через SH группу цистеина, находящегося на N-конце молекулы, к малеимидной группе, закрепленной на поверхности слюды или SisN,* кантилевера, см. рис. 1.

2 этап

4 этап

Ал<}\Ал(

рСпюда или ойтриё'.

il^AEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSWSAIIGLMVGGVV)

/

Рис. 1. Способ закрепления амилоид /3 пептида на поверхностях слюды и острия кантилевера, использованный в моей работе.

Было установлено, что конформационный переход из натив-ного состояние в конформацию с неправильной укладкой в молекулах амилоид ¡3 пептида присходит в диапазоне рН5.6 — рН3.7 при комнатной температуре и физиологической ионной силе раствора (150 мМ), см. рис. 2.

Силовые кривые приведены в координатах „Сила" — „Расстояние между острием и образцом". Сила .Р определяется из закона Гука

б "50

-100-

рН5.б - нет взаимодействия

Взаимодействие двух молекул

10 20 30 40 50 60 70 Расстояние между образцоми остриеннм

0 10 20 30 40 50 Б0 70 Расстояние нежду образцом» остриен вм

Рис. 2. Типичные силовые кривые, получаемая на ACM Nanoscope Illa при значениях рН5.6 (А) и рН3.7 (Б) при исследовании межмолекулярного взаимодействия.

= Ы, где к — жесткость кантилевера, й — отклонения кантиле-вера, измеряемое при помощи лазерного луча. Расстояние й между образцом и кантилевером полагается равным в = й— Z, где Ъ — положение пьезосканера. В этих координатах шумовой сигнал имеет специфический (наклонный) вид [1].

Из литературных данных известно, что исследованный конфор-мационный переход сопровождается изменением вторичной структуры молекулы. Этот результат подтвержден данными экспериментов по компьютерному моделированию [2] и измерению циркулярного дихроизма раствора амилоид ¡3 пептида [3].

Было установлено, что молекулы амилоид/3 пептида находящиеся в нативном состояние, между собой практически не взаимодействуют. Однако, молекулы амилоид /3 пептида находящиеся кон-формации с неправильной укладкой взаимодействуют между собой.

На двух разных приборах была определена сила взаимодействия двух молекул амилоид ¡3 пептида, находящихся в конфор-мации с неправильной укладкой. Она оказалась равной ~ 40 пН,

а Б

0 10 20 30 40 50 Расстояние, нм

Сила. пН

Ó 10 20 30 40 50

Расстояние, нм

Рис. 3. Типичные силовые кривые, получаемая на ACM Nanoscqpe Illa (А) и ACM Molecular Force Probe 3D (Б) при исследовании меж-молекулярною взаимодействия. На гистограммах приведено распределение сил которые потребовалось приложить с острию, чтобы разорвать связь между двумя молекулами амилоид ß пептида, закрепленными на слюде и острие соответственно.

см. рис. 3.

Результаты, изображенные на рисунке 3 А, получены в результате 10 одинаковых экспериментов, проведенных в течение одного месяца. Было получено около 5000 силовых кривых, но только на нескольких десятков из них содержался пик, соответствующий взаимодействию двух молекул.

Также были проведены контрольные эксперименты, подтвердившие справдливость этих результатов.

Кроме того, были предложены модели взаимодействия двух молекул амилоид ¡3 пептида, которые подтверждаются экспериментальными данными, см. рис, 4, В эксперименте для величины L получено значение L—17 ± 1 нм. Теоретические модели дают значения 13 и 17 нм соответственно для параллельного и антипараллельного взаимодействия ß листов амилоид 3 пептида.

лоид ¡3 пептида: (А) с параллельным и (Б) с антипараллельным взаимодействием /3 листов амилоид /3 пептида.

Таким образом первая поставленная задача по исследованию условий, при которых происходит конформационный переход, и межмолекулярных взаимодействий, возникающих между двумя молекулами амилоид ¡3 пептида, полностью решена.

Во втором параграфе главы 2 рассмотрены эксперименты, проведенные мной на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ в лаборатории зондовой микроскопии под руководством Игоря Владимировича Яминского в 2005 — 2006 годах.

После того, как было обнаружено взаимодействие молекул амилоид ¡3 пептида, находящихся в конформации с неправильной укладкой, было принято решение более подробно изучить физические последствия этого взаимодействия. Из литературных данных известно, что взаимодействие молекул амилоид /3 пептида, находящихся в конформации с неправильной укладкой, приводит агрегации белка [4]. В качестве модельной системы был выбран лизоцим из белка куриных яиц (hen egg white lysozyme), который обладает похожими

свойствами: молекулы лизоцима, находящиеся в растворе, при понижении рН и повышенной температуре (рН2, 57 °С) организуются в фибриллы [5].

Эта работа является первой работой по исследованию влияния физической и химической сорбции молекул лизоцима к поверхностям слюды, золота и графита на конформацию этой молекулы. Эти эксперименты направлены на то, чтобы решить следующие задачи:

1. Определить, при каких условиях происходит конформацион-ный переход в лизоциме.

2. Определить силу взаимодействия молекул лизоцима, находящихся в конформации с неправильной укладкой.

3. Определить, как влияют на конформацию молекулы, находящейся в нативной конформации следующие факторы: близость этой молекулы к гидрофобной и гидрофильной поверхности, физическая и химическая сорбция лизоцима на поверхности слюды, золота и графита.

4. Исследовать агрегацию лизоцима на различных поверхностях при тех условиях, при которых не происходит агрегация лизоцима в растворе.

Для решения этих задач было использовано несколько способов закрепления лизоцима на поверхности: физическая сорбция из раствора, химическая сорбция (ковалентная пришивка) через МН2 группы к глутаровому альдегиду, который прикреплялся либо к ИНг группам 4-аминотиофенола, закрепленного на золоте, либо к МНг группам 3-аминопропилсилатрана, закрепленного на слюде или 81зН4 кантилевере, см. рис. 5 и 6.

Из литературных данных известно, что в растворе при низких рН лизоцим изменяет конформацию только при повышенной температуре [5]. При этом физическая сорбция белка на различно заряженные кремниевые частички приводит к понижению этой температуры [6].

Рис. 5. Схема второго этапа иммобилизиции лизоцима. (А) Механизм создания аминогрупп на поверхности золота. (Б) Механизм создания аминогрупп на поверхности кремния и слюды.

При помощи атомно-силового микроскопа ФемтоСкан [8] было определено, что при физической сорбции лизоцима на поверхность графита и химической сорбции на поверхность золота образование фибрилл происходит при комнатной температуре, см. рис. 7.

Таким образом впервые обнаружено, что химическая сорбция молекул лизоцима к поверхности золота и физическая сорбция молекул лизоцима на поверхность графита приводит к понижению температуры конформационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до комнатной температуры (при рН 3 буферного раствора, в котором находится белок), в то время как физическая сорбция при рН 4.8 на кремниевые частички приводит к понижению этой температуры на 12 - 20 °С [6].

Для изучения влияния температуры раствора на конформацию

Б

А

/

В

/1

/

/ /

ОНС(СН2)зСНО / -мн2 -/

/

—Ы=СН(СН2)3СНО

-М=СН(СН2)зСНО

-Ы=СН(СН2)3СНО

-М=СН(СН2ЬСН=М-1_

/

Н2МС(СН2ОН)3 /

-М=СН(СН2)зСН=МС(СН2ОН)з

Рис. 6. Схема 3-5 этапов иммобилизиции лизоцима. (А) Третий этап — химическая сорбция глутарового альдегида к N112 группам, закрепленным на поверхности. (Б) Четвертый этап — химическая сорбция лизоцима (Ь) к глутаровому альдегиду. (В) Пятый этап — блокировка непрореагировавших альдегидных групп.

молекул, физически сорбированных на различных подложках, и для определения температуры конформационного перехода в молекулах лизоцима была проведена серия экспериментов по агрегации лизоцима на свежесколотой поверхности слюды, слюды со слоем 3-аминопропилсилатрана и золота при температуре 50 °С.

На образце слюды, находящемся в буферном растворе в течение 11 дней, были обнаружены порообразные агрегаты, которые уже были обнаружены ранее [7], см. рис. 8 А. В некоторых участках поверхности также были обнаружены линейные фибриллы.

А на образце, находящемся в буферном растворе в течение 22 дней при температуре 50 °С, были обнаружены только линейные фибриллы, см. рис. 8 Б. Из этих результатов можно сделать вывод, что, возможно, в некоторых случаях порообразование предшествует образованию фибрилл. Аналогичные предположения были сделаны

Рис. 7. Изображения поверхности золота со слоем лизоцима. Они демонстрируют изменение формы агрегатов лизоцима, химически сорбированного на поверхность золота, в течение 1 мин (А). 4.5 (Б) и 19 ч (В). (Г) Изображение фибрилл лизоцима на. поверхности графита, образовавшиеся в течение 7 дней вследствие физической адсорбции белка на поверхность.

в работе [7].

Результаты этих экспериментов говорят о том, что близость поверхности приводит к понижению температуры конформационного перехода, но не до комнатной, как в случае графита, а до температуры в диапазоне 20 — 50 °С.

Рис. 8. (А) Изображение поверхности слюды со слоем лизоцима, физически сорбированного на поверхность в течение 11 дней при температуре 50 °С. (Б) Изображение поверхности слюды со слоем лизоцима. физически сорбированного на поверхность в течение 22 дней при температуре 50 °С.

На образцах слюды со слоем 3-ам ин о пр оп и леи л атр ана, находящихся в буферном растворе в течение 11 и 22 дней при температуре 50 °С, были обнаружены только линейные фибриллы, см. рис, 9 Б. Это также свидетельствует о понижении температуры Информационного перехода до 20 — 50 °С, потому что таких фибрилл не было на образце, находящемся в буферном растворе в течение 7 дней при температуре 20 °С, см. рис. 9 А.

На образцах золота находящихся в буферном растворе в течение 11 и 22 дней при температуре 50 °С не было обнаружено никаких агрегатов (как и на образце, находящемся в буферном растворе в течение 7 дней при температуре 20 °С). см. рис. 10. Эти результаты говорят о том. что при сорбции лизоцима на золото не происходит значительного понижения температуры конформационного перехода.

Контрольные эксперименты показывают, что за 22 дня в буфер-

О КЮ 18М нм С 800 [2Ю 1ЙСЮ нн

Рис. 9. {А} Изображение поверхности слюды со слоем 3* аминопропилсилатрана и слоем лизоцима, физически сорбированного на поверхность в течение 7 дней при температуре 20 °С. (Б) Изображение поверхности слюды со слоем 3-аминопропилсилатрана и слоем лизоцима, физически сорбированного на поверхность в течение 22 дней при температуре 50 °С.

Рис. 10. (А) Изображение поверхности золота со слоем лизоцима. физически сорбированного на поверхность в течение 7 дней при температуре 20 °С. (Б) Изображение поверхности золота со слоем лизоцима, физически сорбированного на поверхность в течение 11 дней при температуре 50 °С.

чЪ>вср\ность Тип собрцнн^ Золото Слюда (ОН группы) Слюда+ АПСсш.) Графит Кремний

Физическая сорбция >50 °С 20-50 °С 20-50 °С <20 °С При рН V S. В растворе 7IX на отрицательно заряженных кремннееых частицах -59°С, на незаряженных кремниевых ч/кпищах -SI°C. Czeshk andR Winter, Effect of temperature oil the conformation of Ivsozyme adsorbed to silica particles, Phys Cliem Client Phy's, 2001, V 3, PP 235-339

Химическая прививка <20 °С -20 °С -20 °С

Таблица 1. Температуры конформационного перехода в лизоциме при буферного раствора рНЗ на различных поверхностях. В растворе даже при более низком рН2 (еще более способствующем конфор-мационному переходу) конформационный переход происходит только при 57 °С [5].

ном растворе фибрилл или пор не появляется, т.е. все агрегагаты -это следствие комплексообразования на поверхности.

Таким образом было исследована агрегация лизоцима на поверхностях графита, слюды, слюды со слоем 3-аминопропилсилатрана и золота при температурах 20 °С и 50 °С, и при физическом и химическом типе сорбции. Эти данные сведены в таблицу 1.

Кроме этого при помощи нового метода исследования межмолекулярного взаимодействия на Атомных весах [9] была определена сила взаимодействия двух молекул лизоцима, находящихся в состоянии с неправильной укладкой, которая оказалась равной 113 ± 24 пН. Этот метод заключается в измерении изгиба кан-тилевера, на одну из сторон которого нанесен лизоцим, см. рис. 11.

В этой работе при помощи атомно-силового микроскопа

Поверхностное натяжение, Н/м

0,04

-0,04

0

3

4

1

0

4

8

12 Время, ч

Рис. 11. Временная зависимость поверхностного натяжения пленки лизоцима, находящейся на золотой (1) и кремниевой (2) поверхности кантилевера; 3, 4 - результаты соответствующих контрольных экспериментов, в которых кантилевер не обрабатывали лизоцимом.

ФемтоСкан исследовано формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке. Обнаружено, что при комнатной температуре и рН 3 буферного раствора, т.е. в условиях, при которых агрегация в растворе не происходит, на поверхности может наблюдаться образование фибрилл. Установлено, что близость молекул лизоцима к поверхности графита способствует их агрегации. Обнаружено, что физическая сорбция лизоцима на поверхность золота не приводит к его агрегации, а химическая сорбция лизоцима к поверхности золота способствует образованию фибрилл. На Атомных весах измерена сила взаимодействия молекул лизоцима.

В главе 3 описаны полученные результаты и проведен анализ этих результатов.

Основные результаты и выводы

1. Обнаружено, что изменение структурных свойств амилоид (3 пептида и лизопима (конформационный переход молекул из на-тивного состояния в состояние с неправильной укладкой) происходит из-за изменения температуры, рН, вида поверхности и типа сорбции и приводит к изменению межмолекулярного взаимодействия и к образованию фибрилл и других типов агрегатов.

2. Определены условия (повышение кислотности среды с рН6 до рНЗ, повышение температуры с 20 °С до 50 °С, близость поверхности и тип сорбции), при которых амилоид ¡3 пептид и лизоцим переходят из нативной конформации в состояние с неправильной укладкой.

3. Вследствии конформационного перехода из нативной конформации в состояние с неправильной укладкой происходит резкое увеличение вероятности взаимодействия двух молекул между собой по сравнению с нативной конформацией, в которой молекулы почти не взаимодействуют между собой, например, сила взаимодействия двух молекул в состоянии с неправильной укладкой равна Г ~ 40 пН для амилоид ¡3 пептида и Г ~ 110 пН для лизоцим а.

4. В экспериментах наблюдалось формирование фибрилл и поро-образных агрегатов лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе. Агрегация лизоцима связана с различием в межмолекулярном взаимодействии молекул, находящихся на поверхности (в состоянии с неправильной укладкой) и в растворе (в нативной конформации) при одинаковых параметрах среды (рНЗ, 20 °С).

5. Обнаружено, что химическая сорбция молекул лизоцима к поверхности золота и физическая сорбция молекул лизоцима на поверхность графита приводит к понижению температуры кон-формационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до комнатной температуры.

6. Обнаружено, что физическая сорбция молекул лизоцима на поверхность слюды и слюды со слоем 3-аминопропилсилатрана приводит к понижению температуры конформационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до 50 °С.

4 Цитируемая литература

1. С. Ray, J.R. Brown, В.В. Akhremitchev, Single-molecule Force Spectroscopy Measurements of "Hydrophobic Bond "between Tethered Hexadecane Molecules // J. Phys Chem. В - 2006, - 110(35), - pp.17578-17583.

2. A. Rubinstein, L. Kinarsky, Y. Lyubchenko and S. Sherman, High Temperature Molecular Dynamics Simulations of the Amyloid 0 (1-40) Peptide // The First Annual Nebraska EPSCoR Research Expo April 20, 2005, p.20.

3. C. McAllister, M. Karymov, Y. Kawano, A.Y. Lushnikov, A. Mikheikin, V.N. Uversky and Y.L. Lyubchenko, Protein Interactions and Misfolding Analyzed by AFM Force Spectroscopy // Journal of Molecular Biology, — 2005, — v.354, - N.5, - pp.1028 - 1043.

4. W.B. Stine, Jr., K.N. Dahlgren, G.A. Krafft, and M.Jo LaDu, In Vitro Characterization of Conditions for Amyloid-/? Peptide Oligornerization and Fibrillogenesis // The journal of biological chemistry, — 2003, — v.278, — N.13,- pp.11612 - 11622.

5. L.N. Arnaudov, Renko de Vries, Thermally Induced Fibrillar Aggregation of Hen Egg White Lysozyme // Biophys J., — 2005, - v.88, - p.515-526.

6. С. Czeslik and R. Winter, Effect of temperature 011 the conformation of lysozyine adsorbed to silica particles, // Phys. Chern. Chern. Phys., — 2001,

- v.3, - pp.235-239.

7. M. Stefani, Protein misfolding and aggregation: new examples in medicine and biology of the dark side of the protein world // Biochimica et Biophysica Acta,

- 2004, - v.1739, - pp.5-25.

8. Филонов А.С., Гаврилко Д.Ю., Яминский И.В. Программное обеспечение для обработки трехмерных изображений "ФемтоСкан Онлайн". М.: Центр перспективных технологий, 2005. 89 с. (http://www.nanoscopy.net). Filonov A.S., Gavrilko D.Yu., Yaminsky I.V., FemtoScan Online SPM Image Processing Software Manual, Moscow, Advanced Technologies Center, 2005 -89 p. (http://www.nanoscopy.net).

9. Киселев Г.А., Багров Д.В., Горелкин П.В., Яминский И.В Сенсор на основе атомно-силового микроскопа // Сенсор, — 2005, — N.4, — с.22.

Публикации

1. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселев, A.A. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский, Формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе // Высокомолекулярные соединения, серия Б, — 2007, - том 49, - N.1, - с.125-129. Принята к печати 24.08.2006 г.

2. Украинцев Е.В., Киселев Г.А., Багров Д.В., Горелкин П В., Кудринский A.A., Лисичкин Г.В., Яминский И.В, Атомные весы: новые возможности исследования взаимодействия молекул // Датчики и системы, — 2007, — N.1, — с.18-21. Номер подписан в печать 22.10.2006 г.

3. Y.L. Lyubchenko, A. Kransnoslobodtsev, L.S. Shlyakhtenko, Е. Ukraintsev, Т.О. Zaikova and J.F.W. Keana, Nanomedicine and

protein misfolding diseases // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, — 2005, — v.l. — pp.300-305.

Тезисы докладов

1. 19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (США, 2005). Conformation-dependent interprotein interaction studied by AFM force spectroscopy. E.V. Ukraintsev, Т.О. Zaikova, J.F.W. Keana and Y.L.Lyubchenko;

2. 19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (США, 2005). Study of DNA-Sfi I complex stability using AFM force spectroscopy. A.V. Krasnoslobodtsev, L.S. Shlyakhtenko, E.V. Ukraintsev and Y.L. Lyubchenko;

3. International Conference on Nanoscience and Technology (Швейцария, 2006). Atomic balance observation of protein aggregation on a cantilever surface. G, Kiselev, A.Kudrinskii. E.Ukraintsev, I. Yaminsky, G.Lisichkin;

4. Третья Всероссийская конференция (с международным участием), Химия поверхности и нанотехнология (Россия, 2006). Изучение агрегации лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота и слюды, с помощью кантилевера для атомно-силовой микроскопии. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселев, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский.

Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического ф-та МГУ Тираж /£>0экз. Заказ № //

1 Введение

2 Литературный обзор

2.1 Методы исследования: атомно-силовая микроскопия, силовая спектроскопия и молекулярная динамика.

2.1.1 Атомно-силовая микроскопия.

2.1.2 Силовая спектроскопия.

2.1.3 Молекулярная динамика.

2.2 Объекты исследования: амилоид (3 пептид и лизоцим. Их структура, и свойства.

2.2.1 Амилоид (3 пептид.

2.2.2 Лизоцим.

2.3 Влияние поверхности на конформацию молекулы. Влияние химической сорбции на конформацию молекулы.

2.3.1 Влияние поверхности на конформацию молекул амилоид (3 пептида и их агрегацию.

2.3.2 Влияние поверхности на конформацию молекул СМА и их агрегацию.

2.3.3 Влияние химической сорбции на конформацию молекулы

2.4 Взаимодействие молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой и их агрегация

2.4.1 Исследование взаимодействия двух молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой

2.4.2 Переход молекул полимеров из нативной конформа-ции в состояние с неправильной укладкой приводит к последующей агрегации.

Цель и задачи исследования

1. Определить причины (изменение температуры, рН, вида поверхности и типа сорбции) и следствия (возникновение сильного межмолекулярного взаимодействия, образование фибрилл и других типов агрегатов) изменения структурных свойств амилоид (3 пептида и лизоцима: конформационного перехода молекул из нативпого состояния в состояние с неправильной укладкой.

2. Изучить конформационные переходы в биомакромолекулах с помощью атомно-силовой микроскопии и силовой спектроскопии.

3. На атомно-силовом микроскопе и на Атомных весах™ изучить межмолекулярное взаимодействие полимеров, находящихся в иативном состоянии и состоянии с неправильной укладкой на примере амилоид /3 пептида и лизоцима.

4. Определить факторы (температуры, рН, вид поверхности и тип сорбции), которые влияют на коиформацию молекул.

5. Изучить последствия изменения молекулами копформации на взаимодействие молекул между собой на примере амилоид (3 пептида лизоцима.

6. Исследовать аргегацию молекул лизоцима на различных поверхностях (слюда, золото, графит) и при различных типах сорбции (физическая или химическая).

7. Исследовать вляиние вида поверхности и типа сорбции на температуру конформационного перехода в лизоциме.

Научная новизна диссертации

Методами силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии определены условия, при которых происходит переход молекул полимеров амилоид /? пептида и лизоцима из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой.

Впервые при помощи силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии изучено межмолекулярпое взаимодействие полимеров амилоид /? пептида и лизоцима, находящихся в состоянии с неправильной укладкой.

Обнаружено влияние близости поверхности и химической прививки на конформацию молекулы.

Обнаружено, что оба эти фактора могут приводить к изменению кон-формации молекулы.

Обнаружено что молекулы полимеров, привитые к поверхности, могут агрегировать и образовывать фибриллы.

Обнаружено, что химическая прививка молекул лизоцима к поверхности золота и физическая собрция молекул лизоцима на поверхность графита приводит к понижению температуры конформационного перехода из пативпого состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до комнатной температуры (при рН 3 буферного раствора, в котором находится белок).

Практическая значимость работы

Одна из актуальных на сегодняшний день проблем, стоящая перед физиками, заключается в том, что неизвестен механизм взаимодействия молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой. Эту проблему нужно решать, т.к. больше половины нервных заболеваний связано с неправильным складыванием белковых молекул.

Физическая и химическая прививка молекул к поверхности является важным фактором, определяющим копформацию молекул. Поэтому важно знать, как будут меняться свойства макромолекулярного полимерного комплекса при его закреплении на поверхности. Изменение свойств полимеров при физической сорбции и ковалентной иммобилизации пока еще не достаточно изучено. Большинство процессов в организме человека происходят на различных поверхностях, например мембранах клеток, поэтому очень важно знать, как различаются свойства молекул в объеме и на поверхности.

На защиту выносятся следующие результаты и положения

1. Определены условия (температура, рН, вид поверхности и тип сорбции), при которых амилоид (3 пептид и лизоцим переходят из па-тивной конформации в состояние с неправильной укладкой.

2. Обнаружено, что амилоид (3 пептид, химически сорбированный на поверхность слюды, изменяет свою копформацию при повышении кислотности среды с рНб.б до рН3.7 при комнатной температуре.

3. Обнаружено, что лизоцим, физически сорбированный на графит, химически сорбированный на слюду или золото, изменяет свою кон-формацию при повышении кислотности среды с рН4.5 до рНЗ.О при комнатной температуре.

4. Обнаружено, что лизоцим, физически сорбированный на слюду и слюду, обработанную 3-аминопропилсилатраном, изменяет свою кон-формацию (при рНЗ.О) при повышении температуры до 50 °С.

5. Этот конформационный переход происходит иод действием различных факторов, таких как понижение рН, повышение температуры, близость поверхности из-за физической сорбции и химической прививки.

6. Вследствии этого конформационного перехода происходит резкое увеличение вероятности взаимодействия двух молекул между собой по сравнению с нативной конформацией (в которой молекулы между собой почти не взаимодействуют), например, сила взаимодействия двух молекул равна F ~ 40 пН для амилоид /3 пептида и F ~ 110 пН для лизоцима.

7. Меж молекулярное взаимодействие молекул, находящихся в состоянии с неправильной укладкой, приводит к агрегации амилоид/? пептида и лизоцима. При этом могут образовываться линейные фибриллы и порообразные агрегаты.

8. Обнаружено формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе.

9. Обнаружено формирование фибрилл лизоцима, химически привитого к поверхности золота и отсутствие агрегации лизоцима, физически сорбированного на поверхность золота.

10. Обнаружено, что химическая прививка молекул лизоцима к поверхности золота и физическая собрция молекул лизоцима на поверхность графита приводит к понижению температуры конформационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до комнатной температуры.

11. Обнаружено, что физическая собрция молекул лизоцима на поверхность слюды и слюды со слоем 3-амииопропилсилатрана приводит к понижению температуры конформационного перехода из натив-ного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до 50 °С.

Личный вклад автора

Все экспериментальные измерения поверхностей образцов па атомио-силовом микроскопе и сил взаимодействия методом силовой спектроскопии выполнены автором лично. Автор принимал участие в измерении сил взаимодействия па Атомных весах™. Все образцы приготовлены автором (кроме некоторых этапов, таких как напыление золота и синтез веществ). Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты представлены на двух международных конференциях и российской конференции. Публикации

1. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселев, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский, Формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе // Высокомолекулярные соединения, серия Б, — 2007, — том 49, — N.1, - с.125-129. Принята к печати 24.08.2006 г.

2. Украинцев Е.В., Киселев Г.А., Багров Д.В., Горелкин П.В., Кудринский А.А., Лисичкин Г.В., Яминский И.В, Атомные весы: новые возможности исследования взаимодействия молекул // Датчики и системы, 2007, —N.1, — с. 18-21. Номер подписан в печать 22.10.2006 г.

3. Y.L. Lyubchenko, A. Kransnoslobodtsev, L.S. Shlyakhtcnko, E. Ukraintsev, Т.О. Zaikova and J.F.W. Keana, Nanomedicine and protein misfolding diseases // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, — 2005, — v.l, — pp.300-305.

Тезисы докладов

1. 19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (США, 2005). Conformation-dependent interprotein interaction studied by AFM force spectroscopy. E.V. Ukraintsev, Т.О. Zaikova, J.F.W. Keana and Y.L. Lyubchenko;

2. 19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (США, 2005). Study of DNA-Sfi I complex stability using AFM force spectroscopy. A.V. Krasnoslobodtsev, L.S. Shlyakhtenko, E.V. Ukraintsev and Y.L. Lyubchenko;

3. International Conference on Nanoscience and Technology (Швейцария, 2006). Atomic balance observation of protein aggregation on a cantilever surface. G. Kiselev, A.Kudrinskii, E.Ukraintsev, I. Yaminsky, G.Lisichkin;

4. Третья Всероссийская конференция (с международным участием), Химия поверхности и нанотехнология (Россия, 2006). Изучение агрегации лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота и слюды, с помощью кантилевера для атомно-силовой микроскопии. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселев, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Ямипский.

2 Литературный обзор

Выводы

На основе работы можно сделать следующие выводы:

• Обнаружено, что изменение структурных свойств амилоид j3 пептида и лизоцима (конформационпый переход молекул из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой) происходит из-за изменения температуры, рН, вида поверхности и типа сорбции и приводит к изменению межмолекулярного взаимодействия и к образованию фибрилл и других типов агрегатов.

• Определены условия (повышение кислотности среды с рН6 до рНЗ, повышение температуры с 20 °С до 50 °С, близость поверхности и тип сорбции), при которых амилоид/? пептид и лизоцим переходят из нативной коиформации в состояние с неправильной укладкой.

• Вследствии конформационного перехода из иативной коиформации в состояние с неправильной укладкой происходит резкое увеличение вероятности взаимодействия двух молекул между собой по сравнению с нативной копформацией, в которой молекулы почти не взаимодействуют между собой, например, сила взаимодействия двух молекул в состоянии с неправильной укладкой равна F ~ 40 нН для амилоид (3 пептида и F ~ 110 пН для лизоцима.

• В экспериментах наблюдалось формирование фибрилл и иорооб-разных агрегатов лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе. Агрегация лизоцима связана с различием в межмолекулярном взаимодействии молекул, находящихся на поверхности (в состоянии с неправильной укладкой) и в растворе (в нативной конформации) при одинаковых параметрах среды (рНЗ, 20 °С).

• Обнаружено, что химическая прививка молекул лизоцима к поверхности золота и физическая сорбция молекул лизоцима на поверхность графита приводит к понижению температуры конформацион-ного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до комнатной температуры.

• Обнаружено, что физическая сорбция молекул лизоцима на поверхность слюды и слюды со слоем 3-аминопропилсилатрана приводит к понижению температуры копформационного перехода из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой по крайней мере до 50 °С.

Благодарность

В заключение хочу выразить благодарность своему научному руководителю Игорю Владимировичу Яминскому, а также Киселеву Глебу, выполнявшему эксперименты на Атомных весах™, Алексею Кудринскому за помощь в приготовлении образцов, за синтез необходимых веществ и подготовку двух рисунков, Мешкову Георгию за всестороннюю помощь, Юрию Львовичу Любченко за руководство экспериментами по измерению сил межмолекулярного взаимодействия, Алексею Краснослободцеву и Людмиле Сергеевне Шляхтенко за проведение ряда экспериментов по измерению сил межмолекулярного взаимодействия. Хочу также выразить признательность всем студентам и аспирантам лаборатории зондо-вой микроскопии за дружеское участие и поддержку.

1. Binnig G., Quate С. Atomic force microscope // Phys.Rev.Lett., — 1986,- v.56, pp.930-933.

2. M.O. Галлямов, И.В. Ямииский, Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот, Москва, 1998.

3. Bustamante С., Vesenka J., Tang C.L., Rees W., Guthod M., Keller R., Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy // Biochemistry, — 1992, — v.31, — pp.22-26.

4. Lin J.N., Drake В., Lea A.S., Hansma P.K., Andrade J.D., Direct observation of immunoglobulin adsorption dynamics using the atomic force microscope // Langmuir, — 1992, — v.6(2), — pp.509-511.

5. J.H. Hoh, J.-P. Revel, P.K. Hansma, Tip-sample interactions in atomic force microscopy: I. Modulating adhesion between silicon nitride and glass // Nanotechnology, — 1991, — v.2, — pp.119.

6. M. Rief, H. Clausen-Schaumann and H.E. Gaub, Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules // Nature structural biology, — 1999,- v.6, N.4, - pp.346-349.

7. T. Strunz, K. Oroszlan, R. Schafer,H.-J. Giintherodt, Dynamic forcespectroscopy of single DNA molecules, // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, - v.96, - p.11277-11282.

8. M. Ludwig, M. Rief, L. Schmidt, H. Li, F. Oesterhelt, M. Gautel, H.E. Gaub, AFM, a tool for single-molecule experiments // Applied Physics A, 1999, - v.68, - N.2, - pp.173-176.

9. Т.Е. Fisher, A.F. Oberhauser, M. Carrion-Vazquez, P.E. Marszalek and J.M. Fernandez, The study of protein mechanics with the atomic force microscope // Trends in Biochem. Sci., — 1999, — v.24, — pp.379-384.

10. S. Cocco, J.F. Marko, R. Monasson, Theoretical models for single-molecule DNA and RNA experiments: from elasticity to unzipping // arXiv : cond та£/0206238г;1Шшг2002.

11. P. Cluzel, A. Lebrun, C. Heller, R. Lavery, J.-L. Viovy, D. Chatenay, F. Caron, DNA: an extensible molecule // Science, — 1996, — v.271, — pp.792-794.

12. Т.Е. Fisher, P.E. Marszalek, A.F. Oberhauser, M. Carrion-Vazquez and J.M. Fernandez, The micro-mechanics of single molecules studied with atomic force microscopy // Journal of Physiology, — 1999, — v.520, — Ж1, pp.5—14.

13. P.E. Marszalek, H. Lu, H. Li, M. Carrion-Vazquez, A.F. Oberhauser, K. Schulten and J.M. Fernandez, Mechanical unfolding intermediates in titin modules // Nanture, 1999, - v.402, - pp. 100-104.

14. M.O. Piramowicz, P. Czuba, M. Targosz, K. Burda and M. Szymonski, Dynamic force measurements of avidin-biotin and streptavdin-biotin interactions using AFM // Acta biochimica Polonica, — 2006, — v.53, — N.l, pp.93-100.

15. Bustamante C.J., Marko J.F., Siggia E.D., and Smith S.B., Entropic elasticity of A-phage DNA // Science, 1994, - v.265, - p. 1599-1600.

16. M. C. Murphy, I. Rasnik, W. Cheng, T.M. Lohman, and T. Ha, Probing Single-Stranded DNA Conformational Flexibility Using Fluorescence Spectroscopy // Biophysical Journal, —2004, — v.86, — pp.2530-2537.

17. M.C. Williams, K. Pant, I. Rouzina and R.L. Karpel, Single molecule force spectroscopy studies of DNA denaturation by T4 gene 32 protein // Spectroscopy, 2004, - v.18, - pp.203-211.

18. B. Maier, D. Bensimon, and V. Croquette, Replication by a single DNA polymerase of a stretched single-stranded DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, — 2000, — v.97, — N.22, — pp. 12002-12007.

19. C.G. Baumann, S.B. Smith, V.A. Bloomfield and C. Bustamante, Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, - v.94, - pp.6185-6190.

20. J.-C. Meiners and S.R. Quake, Femtonewton Force Spectroscopy of Single Extended DNA Molecules // Physycal review letters, — 2000, — v.84, N.21, - pp.5014-5017.

21. W. Zhang, R. Barbagallo, C. Madden, C.J. Roberts, A. Woolford and S. Allen, Progressing single biomolecule force spectroscopy measurements for the screening of DNA binding agents // Nanotechnology, — 2005, — v.16, pp.2325-2333.

22. M. Rief, M. Gautel, A. Schemmel, and H.E. Gaub, The Mechanical Stability of Immunoglobulin and Fibronectin III Domains in the Muscle

23. Protein Titin Measured by Atomic Force Microscopy // Biophijsical Journal, 1998, - v.75, - pp.3008-3014.

24. F. Oesterhelt, M. Rief and H.E. Gaub, Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water // New Journal of Physics, — 1999, — v.l, — pp.6.1-6.11.

25. M.S.Z. Kellermayer, L. Grama, A. Karsai, A. Nagy, A. Kahn, Z.L. Datki, and B. Penke, Reversible Mechanical Unzipping of Amyloid /?—Fibrils // The journal of biological chemystry, — 2005, — v.280, — N.9, — pp.8464-8470.

26. M.S.Z. Kellermayer, S.B. Smith, C. Bustamante, and H.L. Granzier, Mechanical Fatigue in Repetitively Stretched Single Molecules of Titin // Biophysical Journal, — 2001, — v.80, — pp.852-863.

27. H. Higuchi, Y. Nakauchi, K. Maruyama, and S. Fujime, Characterization of beta-connectin (titin 2) from striated muscle by dynamic light scattering // Biophys. J., 1993, - v.65, - pp.1906-1915.

28. M.S.Z. Kellermayer, S. Smith, C. Bustamante, and H. L. Granzier, Mechanical manipulation of single titin molecules with laser tweezers // Adv. Exp. Med. Biol, 2000, - v.481, - pp.111-128.

29. M.S.Z. Kellermayer, S. Smith, C. Bustamante, and H. L. Granzier, Complete Unfolding of the Titin Molecule under External Force // Journal of structural biology, — 1998, — v. 122, — pp. 197-205.

30. Y.L. Lyubchenko, A. Kransnoslobodtsev, L.S. Shlyakhtenko, E. Ukraintsev, Т.О. Zaikova and J.F.W. Keana, Nanomedicine and protein misfolding diseases // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2005, - v.l, - pp.300-305.

31. C. McAllister, M. Karymov, Y. Kawano, A.Y. Lushnikov, A. Mikheikin, V.N. Uversky and Y.L. Lyubchenko, Protein Interactions and Misfolding Analyzed by AFM Force Spectroscopy // Journal of Molecular Biology,- 2005, v.354, - N.5, - pp.1028-1043.

32. Pamela Y. Meadows, Jason E. Bemis, and Gilbert C. Walker, Single-Molecule Force Spectroscopy of Isolated and Aggregated Fibronectin Proteins on Negatively Charged Surfaces in Aqueous Liquids // Langmuir, 2003, - N.19, -pp.9566-9572.

33. M. Grandbois, M. Beyer, M. Rief, H. Clausen-Schaumann, H.E. Gaub, How Strong is a Covalent Bond? // Science, 1999, - v.283, - N.5408,- pp.1727-1730.

34. K.B. Шайтан, Конформацнонная подвижность белка с точки зренияфизики, Соросовский образовательный журнал, — 1999, — N.5, — с. 8-13.

35. A. Rubinstein, L. Kinarsky, Y. Lyubchenko and S. Sherman, High Temperature Molecular Dynamics Simulations of the Amyloid /3 (1-40) Peptide // The First Annual Nebraska EPSCoR Research Expo April 20, 2005.

36. B. Urbane, L. Cruz, F. Ding, D. Sammond, S. Khare, S. V. Buldyrev, H. E. Stanley, and N. V. Dokholyan, Molecular Dynamics Simulation of Amyloid (3 Dimer Formation // Biophysical Journal, — 2004, — v.87, —pp.2310-2321.

37. K. Shiraki, M. Kudou, S. Nishikori, H. Kitagawa, T. Imanaka and M. Takagi, Arginine ethylester prevents thermal inactivation and aggregation of lysozymc // Eur. J. Biochem., — 2004, — v.271, — pp.3242-3247.

38. V. N. Uversky, Protein folding revisited. A polypeptide chain at the folding misfolding - nonfolding cross-roads: which way to go? // Cell. Mol. Life Sci., - 2003, - v.60, - pp.1852-1871.

39. A.T. Petkova, Y. Ishii, J.J. Balbach, O.N. Antzutkin, R.D. Leapman, F. Delaglio, and R. Tycko, A Structural Model for Alzheimer's beta-Amyloid Fibrils Based on Experimental Constraints from Solid State

40. NMR // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, — 2002, v.99, - N.26, - pp.16742-16747.

41. Serpell L.C., Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly // Diochim Biophys Acta, — 2000, — v.1502, — pp.16-30.

42. C.E. Giacomelli, W. Norde, Conformational Changes of the Amyloid /3-Peptide (1-40) Adsorbed on Solid Surfaces // Macromolecular Bioscience, 2005, - v.5, - N.5, - pp.401-407.

43. Dobson C.M., Principles of protein folding, misfolding and aggregation // Semin. Cell. Dev. Biol., 2004, - v.15, - pp.3-16.

44. Егоров В.В., Грудинииа Н.А., Соловьев К.В., Влияние пептида NTQATNRNTD иа аномальный фибриллогенез лизоцима // Электронный научный журнал «Исследовано в России», — 2006, — стр.2475-2481. http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/256.pdf

45. W.B. Stine, Jr., K.N. Dahlgren, G.A. Krafft, and M.Jo LaDu, In Vitro Characterization of Conditions for Amyloid-/? Peptide Oligomerization and Fibrillogenesis // The journal of biological chemystry, — 2003, — v.278, N.13, - pp.11612 — 11622.

46. S.J. Wood, B. Maleeff, T. Hart and R. Wetzel, Physical, Morphological and Functional Differences between pH 5.8 and 7.4 Aggregates of the Alzheimer's Amyloid Peptide A/? // J. Mol. Biol, 1996, - v.256, -pp.870-877.

47. Christopher M. Yip and JoAnne McLaurin, Amyloid beta Peptide Assembly: A Critical Step in Fibrillogenesis and Membrane Disruption // Biophysical Journal, — 2001, — v.80, —pp.1359-1371.

48. Т. Kowalewski, D. Holtzman, In situ atomic force microscopy study of Alzheimer's ^-amyloid peptide on different substrates: New insights into mechanism of /?-sheet formation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, — 1999,- v.96, pp.3688-3693.

49. H.K.L. Blackley, G.H.W. Sanders, M.C. Davies, C.J. Roberts, S.J.B. Tendler and M.J. Wilkinson, In-situ Atomic Force Microscopy Study of ^-Amyloid Fibrillization Ц J. Mol. Biol., 2000, - v.298, - p.833-840.

50. И.Н. Сердюк, Физика и структурная биология в начале XXI века, курс лекций в Институте Белка РАН, г. Пущино, www. mbec. protres. ru

51. L.C. Serpell, M. Sundea, and C.C.F. Blakea, The molecular basis of amyloidosis // CMLS, Cell. mol. life sci., 1997, - v.53, - pp.871-887.

52. M. Zhu, P.O. Souillac, C. Ionescu-Zanetti, S.A. Carter, and A.L. Fink, Surface-catalyzed Amyloid Fibril Formation // The journal of biological chemystry, 2002, - v.277, - N.52, - pp.50914-50922.

53. Киселев Г.А., Багров Д.В., Горелкип П.В., Яминский И.В. Сенсор на основе атомно-силового микроскопа // Сенсор, — 2005, — N.4, — с.22.

54. M.Fisher, Proline to the rescue Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2006, - vol.103, - no. 35, - pp. 13265-13266.

55. M. Stcfani, Protein misfolding and aggregation: new examples in medicine and biology of the dark side of the protein world // Biochimica et Biophysica Acta, — 2004, v.1739, — pp.5-25.

56. C. Exley, N.C. Price, S.M. Kelly and J. Derek Birchall, An interaction of /^-amyloid with aluminium in vitro // Federation of European Biochemical Societies, 1993, - v.324, - N.3, - pp.293-295.

57. M. Kawahara, K. Muramoto, K. Kobayashi, H.Mori, Y. Kuroda, Aluminum promotes the aggregation of Alzheimer's amyloid/^-protein in vitro // Biochemical and biophysical research communications, — 1994, v.198, - N.2, - pp.531-535.

58. Bieschke J., Zhang Q., Powers E.T., Lerner R.A., Kelly J.W., Oxidative metabolites accelerate Alzheimer's amyloidogenesis by a two-step mechanism, eliminating the requirement for nucleation // Biochemistry, 2005, - v.5, - N.44(13), - pp.4977-4983.

59. И. Яминский, Кристаллы из белка, // Наука и эюизнъ, — N.1, — 2004, с. 58-61.

60. I. V. Yaminsky, N. V. Gvozdev, М. I. Sil'nikova, and L. N. Rashkovich., Atomic Force Microscopy Study of Lysozyme Crystallization // Crystallography Reports, — 2002, — Vol. 47, — Suppl. 1, — pp. S149-S158.

61. C. Ray, J.R. Brown, B.B. Akhremitchev, Single-molecule Force Spectroscopy Measurements of "Hydrophobic Bond"between Tethered Hexadecane Molecules // J. Phys. Chem. В 2006, - 110(35), -pp.17578-17583.

62. R. Merkel, P. Nassoy, A. Leung, K. Ritchie, E. Evans, Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy // Nature, 1999, - v.397, - pp.50-53.

63. A. Janshoff, M. Neitzert, Y. Oberdorfer, and H. Fuch, Force spectroscopyof molecular systems single molecule spectroscopy of polymers and biomolecules // Angew. Chem. Int. Ed, - 2000, - v.39, - pp.3212-3237.

64. A. Noy, D.V. Vezenov, and C.M. Lieber // Chemical force misroscopy, Annu. Rev. Mater. Sci., 1997, - v.27, - p.381-421.

65. J. Li, A Scanning Probe Study of Self-Assembled Alkylsilane Films, A thesis submitted to the Department of Chemistry in conformity with the requirements for the degree of Master of Science.

66. L.N. Arnaudov, Renko de Vries, Thermally Induced Fibrillar Aggregation of Hen Egg White Lysozyme // Diophys J., — 2005, — v.88., p.515-526.

67. К. Oura, V.G. Lifshits, А.А. Saranin, A.V. Zotov, M. Katayama. Surface Science — An introduction, Springer-Verlag, Berlin 2003. p.438.

68. L.S. Shlyakhtenko, V.N. Potaman, R.R. Sinden, A.A. Gall and Y.L. Lyubchenko // Nucleic Acids Research, — 2000, — v.28, — N.18, — pp.3472.

69. G.G. Stoney // Proc. R. Soc., bond., 1909, - Ser. A, - v.82, - p.172.

70. C. Czeslik and R. Winter, Effect of temperature on the conformation of lysozyme adsorbed to silica particles, jjPhys. Chem. Chem. Phys., — 2001, v.3, -pp.235-239.