Полисахариды и низкомолекулярные метаболиты некоторых массовых видов бурых водорослей морей Дальнего Востока России. Способ комплексной переработки водорослей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ИМБС Татьяна Игоревна

ПОЛИСАХАРИДЫ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ НЕКОТОРЫХ МАССОВЫХ ВИДОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ МОРЕЙ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ. СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ВОДОРОСЛЕЙ.

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2010

003491693

Диссертация выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Звягинцева Т.Н., доктор химических наук, профессор;

Каминский В.А., доктор химических наук, профессор;

Ермак И.М., доктор химических наук, главный научный сотрудник; Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток, пр-т 100-лет Владивостоку, 159;

Защита состоится_19 февраля_2010г. в_ часов на заседании диссертационного

совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу:

690022, г. Владивосток, пр-т 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХ. Факс: (4232) 314050; e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г.Владивосток, пр-т 100-лет Владивостоку, 159, ДВГИ)

Автореферат разослан

2010 Г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Калинин В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современном обществе растет внимание к проблемам здоровья и долголетия. Это определяет все возрастающий спрос на продукты морского происхождения, в число которых входят морские водоросли, а также лечебно-профилактические препараты на основе водорослей. Бурые водоросли являются богатым и возобновляемым сырьем для получения ценных биологически активных полисахаридов - фукоиданов, ламинаранов и альгиновых кислот. Содержание йода, макро- и микроэлементов, маннита и свободных аминокислот в бурых водорослях выше, чем в наземных растениях. Практически неисчерпаемым источником бурых водорослей являются прибрежные воды морей Дальнего Востока России. К сожалению, в России в настоящее время этот биологический ресурс используется очень ограниченно, а его химический состав изучен недостаточно.

Широкое применение полисахаридов бурых водорослей, как терапевтических агентов, сдерживается проблемами получения продуктов со стандартными характеристиками, поскольку содержание и структура полисахаридов меняются в зависимости от вида, стадии развития водоросли, места произрастания, а методы их выделения и фракционирования недостаточно эффективны. Изучение сезонных изменений состава и строения отдельных полисахаридов и низкомолекулярных веществ бурых водорослей имеет практическое значение для определения оптимальных сроков сбора водорослей с целью стандартизации препаратов как полисахаридов, так и низкомолекулярных веществ и создания способа их комплексной переработки.

Традиционно основное внимание уделялось исследованию химического состава бурой водоросли Laminaria japónica, в то время как данные о составе, структуре и сезонной динамике полисахаридов, а также биологически активных низкомолекулярных веществ, ряда других массовых видов дальневосточных бурых водорослей, прежде всего Costaría cosíata, Undaria pinnatiflda. Fucus evanescens весьма ограниченны.

Цель работы. Целью данной диссертационной работы было установление закономерностей в изменении состава и структуры полисахаридов и низкомолекулярных метаболитов в зависимости от сезона сбора некоторых видов бурых водорослей, условий их выделения для получения продуктов со стандартными характеристиками, а также разработка способа комплексной переработки бурых водорослей для получения препаратов для медицины, косметологии, сельского хозяйства.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) исследовать влияние сезонасбора на состав и структурные характеристики полисахаридов из С. costata и U. pinnatiflda-, 2) оценить биологическую активность фукоидана из С. costata-, 3) исследовать влияние температурного режима экстракции на выход и фракционирование фукоиданов из С. costata и F. evanescens, имеющих различное строение полисахаридной цепи; 4) исследовать состав низкомолекулярных метаболитов С. costata, Laminaria cichorioides и F. evanescens и оценить биологическую активность водно-этанольных экстрактов из этих водорослей; 5) определить оптимальные условия

экстракции фукоидана из F. evanescens; 6) разработать схему комплексной переработки массовых видов бурых водорослей.

Научная новизна. Впервые установлены закономерности изменения состава и структуры полисахаридов бурых водорослей С. costata и U. pinnatifida в зависимости от сезона и стадии жизненного цикла водоросли. Показано, что в июле в С. costata содержится больше ламинарана, фукоидана и альгинатов, чем в апреле-мае. Обнаружено, что максимальное количество фукоидана в С. costata и U. pinnatifida содержится в период спороношения. Показано, что фертильные С. costata и U. pinnatifida содержат более сульфатированный и менее гетерогенный по моносахаридному составу фукоидан, чем стерильные растения. Впервые определены структурные характеристики полисахаридов из С. costata. Показано, что ламинаран представляет собой 1,3;1,6-|5-0-глюкан (1,3:1,6 как 5:1), а фукоидан является сульфатированным по С2 и С4 и частично ацегилированным галактофуканом. Определено, что фукоиданы в С. costata и F. evanescens представляют собой смесь различных структурных типов этих полисахаридов. Впервые показано, что фукоидан из С. costata, препятствует старению кожи под действием УФ облучения. Исследовано изменение состава низкомолекулярных веществ Laminaria cichorioides, С. costata в зависимости от сезона сбора. Впервые показана зависимость противоопухолевого действия водно-этанольных экстрактов из этих водорослей от сезона сбора. Впервые определены оптимальные условия экстракции фукоидана из F. evanescens. На основе этих исследований предложен универсальный способ комплексной переработки бурых водорослей и создана технология получения БАД на основе фуковданов.

Практическая ценность работы. Установлены периоды сбора водорослей С. costata и U. pinnatifida для выделения полисахаридов со стандартными характеристиками. Показана перспективность использования фукоидана из С. costata в качестве протектора кожи от действия УФ облучения и как противовирусного препарата при заражении ВКЭ. Показана перспективность использования экстракта F. evanescens для разработки противоопухолевых препаратов, а экстракта L. japónica в качестве стимулятора роста сои. Определены оптимальные условия выделения и очистки фукоидана из бурой водоросли F. evanescens. Разработан способ комплексной переработки бурых водорослей, который защищен патентом РФ № 2240816 и международным патентом № W02005/014657. Этот способ положен в основу технологии получения первых российских БАД к пище на основе фукоидана - «Фуколам-С» (свидетельство о гос. per. № 77.99.23.3.У. 1549.3.07) и «Фуколам» (свидетельство о гос. per. № 77.99.23.3.У.739.1.06) и водно-спировых экстрактов бурых водорослей для использования в косметике - «Фуколам-Э. Экстракт бурой водоросли жидкий» (сан.-эпид. заключение № 25.ПЦ.01.744.Т.000842.07.07).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-ой Международной конференции «Морские и прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки», Архангельск, 2005; на региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической технологии и биотехнологии», Владивосток, 2006; на 3-ей Международной конференции «Морские и

прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки», Владивосток, 2008; на объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008; на Симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств», Москва, 2008; на Международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений», Ташкент, 2009.

Публикация результатов исследования. Основные результаты исследования опубликованы в 6 статьях, 3 патентах РФ, 1 международном патенте, 5 тезисах докладов.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 119 стр., содержит 24 таблицы и 18 рисунков, состоит из введения, литературного обзора, раздела, посвященного обсуждению результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, который включает 305 работ, в том числе 228 иностранных источника, и приложения, где приведены свидетельства о гос. регистрации БАД. В ведении приводится обоснование актуальности исследования, сформулированы его цели и задачи. Литературный обзор посвящен изучению химического состава бурых водорослей, а также существующим способам выделения и очистки полисахаридов бурых водорослей и их комплексной переработке. Более подробно рассмотрены сульфатированные полисахариды - фукоиданы, их структурное разнообразие и проявляемая ими биологическая активность.

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. Звягинцевой Т.Н. Автор благодарит к.х.н. Шевченко Н.М., к.х.н. Назаренко E.JI. за консультации и помощь в работе, сотрудников контрольно-аналитической лаборатории, к.х.н. Исакова В.В. за получение ЯМР спектров, к.ф.-м.н. Глазунова В.П. за получение ИК спектров.

Сокращения и условные обозначения. ВКЭ - вирус клещевого энцефалита, САК -свободные аминокислоты, ЛВ - липофильные вещества, PL - полярные липиды, W+HC -воска и углеводороды, ЖК - жирные кислоты, ПНЖК - полиненасыщенные ЖК, UVB -ультрафиолетовое излучение с Х=280-320нм, ММР-1 - матричная металлозависимая пептидаза 1, Fma^, и Fxcn. - критерий Фишера, FLM - водорастворимые полисахариды, F -фукоидан, L - ламинаран, М - маннуронан, А - альгинат натрия.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Главное внимание в настоящем исследовании уделено изучению закономерностей в изменении содержания и структуры фукоиданов из С. costata и U. pinnatiflda в зависимости от сезона, выбору условий экстракции и очистки фукоидана из С. costata и F. evanescens, исследованию состава низкомолекулярных веществ некоторых бурых водорослей и созданию универсального способа их комплексной переработки.

1 Влияние сезона на состав полисахаридов С. costata

Полисахариды выделяли из талломов С. costata последовательной экстракцией (Рис. 1). Были получены фракции низкомолекулярных веществ и полисахаридов из образцов С. costata, собранных в различные сезоны: апрель (фракции Э4, FLM4, A4) -максимальное развитие водоросли; май (фракции Э5, FLM5, А5) -подготовка водоросли к спорогенезу; июнь (фракции Эб, FLM6, Аб) - спорогенез и июль (фракции Э7, FLM7, А7) -

начало разрушения слоевища. Изменение выхода выделенных фракций в зависимости от месяца сбора водоросли представлено на рисунке 2.

Водоросль свежая

Экстракция 96% этанолом, 40°С, 2 х 3 ч, центрифугирование

Водоросль обезжиренная, измельченная

Фракция Э

(низкомолекулярные вещ-ва)

Остаток водоросли

Экстракция 3% и 1,5% р-ром Na2C03,60°С, 8 ч, разбавление водой, центрифугирование

Экстракция HCl, 60°С, 2 х 3 ч, центрифугирование

Супернатант

Нейтрализация, концентрирование, диализ против воды, лиофильная сушка

Супернатант Осадок

Концентрирование, диализ, осаждение этанолом

Смешанная соль Супернатант

альгиновой кислоты

Фракция FLM (водорастворимые полисахариды)

Осаждение маннуронана (Фракция М) раствором HCl, центрифугирование, очистка супернатанта на ПХ-1

Растворение в воде, подкисление HCl до pH 2, центрифугирование

Фракция? (Фукоидан)

Фракция FL

Альгиновая Супернатант кислота

Растворение в воде, добавление N304, диализ против воды, лиофильная сушка

Фракция А (Альгинат натрия)

Фракция L (Ламинаран)

Фракция F

Рис. 1. Схема выделения полисахаридов из бурой водоросли С. costata.

1.1 Влияние сезона на содержание и состав альгинатов С со^а<а

Основная часть полисахаридов С. со5/а/а представлена альгинатами (фракции Ад-А7), их содержание увеличилось от 15,6% в апреле до 20,6% в июле (рис. 2). В спектрах "С-ЯМР этих фракций присутствовали интенсивные сигналы с химическими сдвигами 101,2 (С1), 70,6 (С2), 72,6 (СЗ), 79,2 (С4), 77,3 (С5) и 176,1 (С6) м.д., соответствующие 1,4-связанным остаткам р-О-маннуроновой кислоты (Им), а также менее интенсивные сигналы с химическими сдвигами 102,4 (С1), 66,0 (С2), 70,5 (СЗ), 80,7 (С4) и 69,8 (С5) м.д., соответствующие 1,4-связанным остаткам а-1-гулуроновой кислоты (То). Сезон сбора

водоросли существенно влиял на мономерный состав альгинатов. Величина отношения маннуроновой и гулуроновой кислот (Рм/Ро), содержание которых рассчитано из спектров 'Н-ЯМР, изменилась от 2,64 в апрельском образце до 1,87 в июльском, а средняя молекулярная масса альгинатов из С. с<м*а/а увеличилась до 710 кДа (табл. 1).

май июнь июль

-- 40 Рис. 2. Изменение

- 35 выходов фракций

-■ 30 i И,М, А, Э

■■ 25 ■■FLM (% от сухого веса

з S. QA водоросли),

-■ 20 я 1=1Э фукоидана (-□-)

15 i -О-Фукоиданы и уронана (-о-)

■ 10 S § —О-Уронаны (% от веса фракции

П,М) из С. соз/а/а

- 5 в зависимости

■ 0 от месяца сбора водоросли.

Таблица 1.

Влияние сезона на молекулярный вес, моносахаридный состав и структуру альгинатов (А) из С. соМа(а.

Фракция Мга, кДа Fm/Fg Fg Fm Fmm Fmg+gm Fgg

A4 560 2,64 0,275 0,725 0,67 0,10 0,23

А5 350 2,06 0,326 0,672 н.о. н.о. н.о.

А7 710 1,87 0,348 0,652 0,62 0,06 0,32

Мш - средняя весовая молекулярная масса, определена методом ВЭЖХ (Shodex Asahipak GS-520 HQ, 7,5 x 300 мм); F0 - содержание ¿-гулуроновой кислоты; Fm - D-маннуроновой кислоты; Fmm» Fgg, Fmg+gm - рассчитано из 'Н-ЯМР-спектров альгинатов.

Соотношение моносахаридов и их распределение в цепи полимера в виде Fmm-, Fgg-, Fmg- и fom-блоков определяют способность альгиновых кислот к гелеобразованию и их биологическую активность. Ранее было показано, что гель не образуется, если содержание L-гулуроновой кислоты в полисахариде меньше 20-25%. Наши данные показывают, что в июле С. costata содержит значительные количества способного к гелеобразованию высокомолекулярного альгината натрия, в структуре которого более 30 % составляют Fgg-блоки. В апреле и мае из водоросли можно выделить альгинат, обогащенный полиманнуроновыми блоками. Альгинаты из С. costata давали неокрашенные растворы. Эта их особенность, наряду с высоким выходом, делает альгинат натрия из С. costata привлекательным сырьем для использования в медицине и пищевой промышленности.

1.2 Влияние сезона на состав фракций водорастворимых полисахаридов С. costata.

Структурные характеристики и биологическая активность полисахаридов

Суммарный выход фракций водорастворимых полисахаридов (FLM4-FLM7), состоящих из ламинарана, фукоидана и уронана был невелик; в апреле он составил 1,2 %, а в июле увеличился до 3,4 %. В период с апреля по июль доля уронана во фракциях FLM

резко снизилась с 36,0 до 2,5%, а фукоидана, наоборот, увеличилась с 4,4 до 21,5% (рис. 2). В спектре 13С-ЯМР препарата FLM4 преобладали сигналы с химическими сдвигами 101,2, (С1), 71,3 (С2), 72,7(СЗ), 79,3 (С4), 77,2 (С5) и 176,4 (С6) м.д„ характерные для полиманнуроновой кислоты. Сигнал с хим. сдвигом при 17,08 м.д - типичный для a-L-фуканов, был незначительньм. Сигнал при 85,5 м.д., характерный дня ламинаранов, отсутствовал. Молекулярная масса фракции FLM4 находилась в интервале от 430 до 465 кДа. Таким образом, в апреле водорастворимые полисахариды С. costata представлены практически чистой полиманнуроновой кислотой, в то время как в июле количество маннуронанов уменьшилось более чем на порядок (рис. 2). Из раствора препарата FLM3 при рН 2,0 высадили маннуронан (фракция М5) с молекулярной массой 200 кДа и характерным для полисахаридов этого класса спектром 13С-ЯМР. Фракция FLMs, наряду с водорастворимым маннуронаном, содержала заметные количества фукоидана (рис.2). С апреля по июль содержание фукоидана в С. costata увеличилось в 5 раз (рис. 2); одновременно происходили существенные изменения в молекулярно-массовом распределении, моносахаридном составе и заряде фукоидана. В апреле и мае вегетативные растения синтезировали небольшие количества низкосульфатированного гетерогенного по моносахаридному составу фукоидана (рис. 3), в котором присутствовали Fue, Gal, Man и Rha в отношении 1,0:0,27:0,38:0,19. Этот фукоидан имел молекулярную массу в интервале от 200 до 800 кДа (рис. 4).

65

со

55 50 45 * 40 1»

I"

а»

20

(5 10 5 0

-о- SO>Na' —Fue

-e-G«l

--Мал

—»-Rha -•-G1C

— хи

апрель май июнь

Рис.3. Изменение содержания

моносахаридов Fue, Gal, Man, Rha, Xyl, Glc во фракциях FLM (% от суммы нейтральных моносахаридов) и сульфатов (% от веса фракции), в зависимости от месяца сбора водоросли С. costata.

Рис.4. Молекулярно-массовое распределение фукоиданов из майского (а) и июльского (б) образцов водоросли С. соя1а1а. Разделение фукоиданов проводили на последовательно соединенных колонках ЭЬоёех АваЫрак СБ-520 Н(3 и 03-620 Н(2 (7,5 х 300 мм), стандарты - пуллуланы.

С апреля по июль в фукоидане увеличилось содержание Fue и Gal (с 60 до 80 мол % в сумме), а содержание Man и Rha значительно уменьшилось (рис. 3). Отношение между Fue и Gal в фукоидане на протяжении наблюдаемого периода практически не менялось.

В июне-июле из генеративных растений выделили фукоидан, представляющий собой галактофукан (Fuc:Gal:Man:Rha как 1:0,29:0,08:0,06). В июле содержание сульфатов в полисахаридах увеличилось в 5 раз по сравнению с апрелем (рис. 3). Впервые показано, что по мере роста С. costata молекулярная масса фукоидана значительно уменьшилась и к июлю находилась в интервале от 20 до 300 кДа (рис. 4), что особенно интересно в связи с тем, что полисахариды с низкой молекулярной массой предпочтительнее в качестве биологически активных веществ. Таким образом, из С. costata, собранной в июне-июле, выделили фукоидан с меньшей молекулярной массой, более сульфатированный и менее гетерогенный по моносахаридному составу, чем из водоросли, собранной в апреле-мае.

Было исследовано ингибирующее действие фукоидана из С. costata майского сбора на UVB-индуцируемую экспрессию матричной металлозависимой пептидазы I (ММР-1) в клетках кератиноцитов человека НаСаТ. Предварительная обработка клеток фукоиданом ингибировала экспрессию ММР-1 и активацию ее промотера на 37,3, 53,3 и 58,5% при концентрациях 0,01, 0,1 и 1 мг/мл соответственно. Этот фукоидан может быть предложен как перспективное терапевтическое средство для предотвращения старения кожи под действием ультрафиолетового облучения.

Содержание ламинарана в С. costata с апреля по июль увеличилось в 3,5 раза, но не превысило 1% от фракции водорастворимых полисахаридов (FLM) (рис. 3). Изучение строения ламинарана (L7) показало, что он является типичным представителем этой группы полисахаридов - 1,3;1,6-Р-1)-глюканом. В спектре 13С-ЯМР этой фракции присутствовали сигналы с химическими сдвигами 103,9 (С1), 74,6 (С2), 85,6 (СЗ), 69,5 (С4), 77,3 (С5) и 62,1 (С6) м.д., которые характерны для 1,3-связанных остатков (З-й-глюкопиранозы, и сигналы с химическими сдвигами 70,1 (С6), 75.9 (С5) и 71.0 (С4) м.д., свидетельствующие о присутствии 1—>3,6- и 1,6-связанных остатков глюкозы. Отношение между 1,3- и 1,6-связанными остатками Р-£>-глюкопиранозы составило 5:1. Молекулярная масса ламинарана находилась в интервале 4-5 кДа.

Во фракции фукоидана F7 основными моносахаридами были Fue и Gal в отношении 1,0:0,29. В спектре 13С-ЯМР фракции F7 (рис. 5) имелись сигнал при 16,9 м.д., характерный для СНз-группы фукопиранозы, и сигналы при 21,66 м.д. и 173,9 м.д., указывающие на присутствие О-ацетильных групп. Сигналы при 62,56 и 176,06 м.д. указывали на присутствии в образце, соответственно, гексопираноз с незамещенными СН2ОН-группами, а также уроновых кислот.

В ИК-спектре фракции F7 наблюдались полосы поглощения при 1731 (С=0 связь), 1264 (S=0 связь) и 823 см"1 с плечом при 846 cm"'(S-0-C связи). Последнее характерно для сульфатных групп, находящихся, соответственно, в аксиальном (при С4) и в экваториальном положениях (при С2). Математический анализ контура полосы при 823 см"' показал, что она состоит из двух компонентов с частотами колебаний при 846 и 818 см"1. Отношение площадей Sg46 /Seis составило 1,23. Следовательно, сульфатные группы в фукоидане находятся в положении С4 (80%) и в положении С2 (20%). Таким образом,

Гиср-Сб

фукоидан фракции представлял собой сульфатированный по С4 и С2, частично ацетилированный галактофукан.

I

Рис. 5.

Спектр 13С-ЯМР нативного фукоидана, выделенного из С. со$1Ша июльского сбора (фракция р7).

НехА-С6

✓ 0Ас(С*О)

160 140 120

Jf

II. Нехр-ф

'I1! /

i

i

OAc(CHJ \

ivJ ' LvmummW

« , 20 [ppm]

Было исследовано противовирусное действие фукоидана р7 на культуре клеток почек эмбриона свиньи, зараженных вирусом клещевого энцефалита (КЭ) (штамм Р-73). Установлено, что фукоидан в концентрациях 100, 500 и 1000 мкг/мл ингибировал репродукцию и развитие цитопатического действия вируса КЭ, однако, дозозависимого действия выявлено не было. Фукоидан цитотоксического действия не оказывал.

Таким образом, максимальные количества ламинарана, фукоидана и альгинатов содержались в генеративной С. с<и/а?я, собранной в июне-июле. Для выделения альгината, обогащенного маннуроновой кислотой, водоросль рекомендуется собирать в мае, а высокомолекулярного альгината, обогащенного гулуроновой кислотой, и низкомолекулярного, сульфатированного и частично ацетилированного галактофукана - в летние месяцы.

2 Влияние сезона на содержание и моносахаридиый состав фукоидана U. pinnatijida

Водоросль U. pinnatijida имеет морфологически разграниченные части таллома: вегетативную (пластина) и репродуктивную (спорофиллы). Листовая пластина составляет основную часть таллома в период с апреля по июнь. В июле, в период спороношения, спорофиллы составляют до 76% от веса цельного таллома водоросли.

Содержание фукоидана в U. pinnatifida с апреля по июль увеличилось в 5 раз (рис. 6), достигнув максимума, когда спорофиллы составляли основную часть таллома водоросли. Значительно изменился моносахаридиый состав фукоидана: содержание Gal увеличилось, Man - уменьшилось, а содержание Fue практически не изменилось (рис. 7). Мольное отношение Fuc:Gal изменилось от 1,0:0,34 в апреле до 1,0:0,69 в июле. В апреле U. pinnatifida синтезировала гетерофукан примерно с одинаковым содержанием маннозы и галактозы, а в июне-июле фукоидан, представляющий собой галактофукан.

в 5 i« о К 20

Ы ё lis

чо са

u g 10

s 5

Т- х

I

§ " „ б 0

К В,

5 -

-1-

Апрель Май Июнь Июль

Апрель

Man □ Fue □ Gal

Июнь Июль

Рис. 6. Изменение содержания фукоидана Рис. 7. Изменение моносахаридного из и. ртпаЦ[1(1а в зависимости от сезона. состава фукоидана из (У. ртпаИ^а в

зависимости от сезона.

3 Влияние стадии жизненного цикла С. costata и U. pinnatifida на содержание и

моносахаридный состав фукоидана

Спорангии у С. costata образуются на поверхности пластины, a U. pinnatifida имеет спорофиллы - специализированный орган, где формируются и созревают споры, которые можно отделить от основного растения. Июньские сборы водоросли С. costata содержали фертильные и стерильные особи. Фракция водорастворимых полисахаридов ПЛУЦерт из фертильных растений содержала в своем составе больше всего фукоидана (28,3%), по сравнению с фракциями FLM5 (стерильные особи: 13,4%) и FLM6 (смесь фертильных и стерильных особей: 16%). В случае U. pinnatifida в мае были отобраны взрослые растения с развитыми спорофиллами, но имеющие разный репродуктивный статус: фертильные, имеющие спорофиллы с развитыми сорусами, и вегетативные, спорофиллы которых не содержали парафиз или спорангиев. В спорофиллах фертильных особей содержание фукоидана (15%) было в 5 раз выше, чем вегетативных (3%). Очевидно, что имеется прямая связь между увеличением содержания фукоидана в С. costata и U. pinnatifida и началом спороношения.

При переходе С. costata к спороношению в фукоидане увеличилось содержание Fue с 47,4 до 65,2 мол %, Gal с 13,1 до 18,0 мол %, значительно уменьшилось содержание Man и Rha (рис. 8), отношение Fuc:Gal:Man:Rha изменялось от 1,0:0,27:0,38:0,19 до 1,0:0,27:0,05:0,03.

Для U. pinnatifida также наблюдались изменения в составе нейтральных моносахаридов при переходе водоросли к спороношению: в фукоидане из спорофилл содержание Gal увеличилось с 27,0 до 42,8 мол%, содержание Fue не изменилось, содержание Man уменьшилось в 4,7 раза (рис. 9), отношение Fuc:Gal изменялось от 1,0:0,51 до 1,0:0,80.

Таким образом, при переходе водорослей к спороношению моносахаридный состав фукоидана как в С. costata, так и в U. pinnatifida, существенно изменялся. В вегетативных растениях содержались преимущественно гетерополисахариды, построенные из Man, Fue, Rha и Gal, а в генеративных - полисахариды, состоящие, в основном, из Gal и Fue.

Изменение состава моносахаридов фукоидана показывает, что не только содержание, но и структура этого полисахарида связаны с развитием органов размножения и выходом спор.

3 Е

I

« S я В

Я 3

я я 1 1 i | §1

70 -60 -50 -40 " 30 -20 -10 -0 -

1

■ Man

□ Fue

□ Gal HRha

! I

ti

чР К

o4 O

0 E

я Й

x 3

Я д

1 1 8- | 5 &

r ) зК

^ <D

60 50 40 30 20 " 10 0

■ Man □ Fue -i-, a Gal

без сорусов

с сорусами

без сорусов с сорусами

Рис. 8. Моносахаридный состав фукоидана из С. costata с сорусами и без сорусов.

Рис. 9. Моносахаридный состав фукоидана из спорофилл U. pinatifida с сорусами и без сорусов.

4 Сравнительное исследование состава водно-этанольных экстрактов L. cichorioides, С. costata, L. japónica и F. evanescens и их биологической активности

Существующие технологии получения полисахаридов из водорослей зачастую предполагают предварительную обработку сырья этанолом. Для расширения области использования бурых водорослей были исследованы состав и свойства низкомолекулярных веществ водно-этанольных экстрактов из L. cichorioides, С. costata, F. evanescens, L. japónica, которые являются побочными продуктами при выделении полисахаридов. F. evanescens была собрана в июле, L. cichorioides, L. japónica (2-ого года развития) и С. costata были собраны в мае. Состав экстрактов представлен в табл. 2.

Таблица 2.

Состав F. evanescens L. cichorioides L. japónica С. costata

Сухие вещества экстракта (% от веса сухой водоросли) 28,0 ± 1,66 39,0 ±0,97 32,0 ±1,28 29,0 ±2,06

Сухие вещества экстракта (г/100 мл) 1,97 ±0,13 1,32 ±0,18 2,68 ± 0,9 1,24 ±0,17

% от сухих веществ экстракта

Минеральные вещества 35,0 ±2,55 56,0 ± 1,81 48,0 ±2,1 60,0 ±2,31

Маннит 24,0 ±0,12 27,5 ±0,31 26,0 ±0,31 15,1 ±0,23

Белок 8,1 ±0,11 3,6 ±0,83 1,6 ±0,91 1,7 ±0,83

Полифенольные соединения 10,1 ± 1,45 1,4 ±0,23 0,7 ±0,3 2,0 ± 0,28

Свободные аминокислоты 0,98 1,1 10,6 5,06

Нейтральные сахара 4,0 ± 0,34 3,6 ±0,36 0,56 ± 0,43 0,7 ±0,51

Липофильньге вещества 8,9 ± 0,93 4,6 ± 0,45 3,3 ±0,78 12,0± 1,18

Производные хлорофилла 4,8 ±0,61 0,9 ±0,21 н.о. 1,7 ± 0,34

Минеральные вещества составляли примерно половину от сухих веществ экстрактов, больше всего их было в экстракте из С. соЛа/а. Качественный состав минеральных веществ экстрактов исследуемых водорослей был очень близок (табл. 3). Во всех

экстрактах преобладали ионы одновалентных металлов: в экстрактах водорослей порядка Ьатшапа1ез больше всего содержалось ионов калия, в экстракте из К еуалегсе/м - натрия. Содержание ионов кальция и магния в экстрактах было значительно меньше, чем ионов одновалентных металлов, (табл. 3). Экстракт из Р. еуапезсегк отличался высокой концентрацией ионов железа, кобальта, марганца и никеля.

Таблица 3.

Состав макро- и микроэлементов экстрактов бурых водорослей.

Элементы | F. evanescens | L. cichoríoides | L. japónica \ С. costata

Содержание макроэлементов (% от сухих веществ экстракта, xl0~j)

К 2,3 8,5 5,5 6,2

Na 7,24 2,72 2,80 4,16

Mg 1,52 0,88 1,10 0,96

Ca 0,28 0,08 0,11 0,12

h 35,0 900,0 540,0 30,0

Содержание микроэлементов (% от сухих веществ экстракта, х 10"6)

Мп 37,2 1,84 1,36 1,48

Zn 6,4 11,6 10,2 10,8

Se 1,2 1,2 1,2 1,2

Со 2,4 0,8 0,7 0,4

Fe 52,0 14,8 17,6 27,2

Ni 12,4 4,0 3,33 3,72

Cd 0,03 0,03 0,03 0,03

Pb 0,05 0,05 0,05 0,05

Бурые водоросли - природный источник йода. Высокое содержание йода обнаружено в экстрактах из L. cichoríoides (9,0 мг/г) и L. japónica (5,4 мг/г). Значительную долю органических веществ в бурых водорослях составлял маннит, который легко экстрагируется из водоросли этанолом. Высокое содержание маннита найдено в экстрактах из L. cichoríoides и L. japónica (табл. 2). Фукоиданы и уронаны в экстрактах практически отсутствовали: не более 1 и 0,5% соответственно.

Азотистые вещества водорослей представлены, главным образом, белками и свободными аминокислотами (САК). В этанольный экстракт переходят практически все САК. Больше всего САК извлекалось из L. japónica (табл.2). В экстрактах мы обнаружили 18 аминокислот, среди них 7 незаменимых: Val, Leu, Тре, Ile, Lys, Туг, Phe, доля которых составила 5,2,13,3,6,0 и 1,3% от суммы САК для С. costata, F. evanescens, L. cichoríoides и L. japónica соответственно. Основная часть САК - это глутаминовая кислота (наибольшее ее содержание, 77% от суммы САК, в экстракте из L. japónica), и аланин (наибольшее его содержание, 50% от суммы САК, в экстракте из С. costata).

Больше всего липофильных веществ (ЛВ) содержалось в экстракте из С. costata (табл. 2), главными ЛВ были PL (в основном, гликолипиды) и W+HC (табл. 4). В экстрактах ламинариевых водорослей PL составили 50% от общих ЛВ, больше, чем в экстракте фукуса. В экстракте из F. evanescens обнаружено наибольшее количество стеринов, среди них на долю фукостерина приходилось 73%, а холестерина и метиленхолестерина - лишь 17,7 и 5,7% соответственно. Из ламинариевых наибольшее

количество стеринов обнаружено в экстракте из L. japónica, главным из которых был метиленхолестерин (78%).

Таблица 4.

Состав липофильных веществ (JIB) водно-этанольных экстрактов бурых водорослей.

Водоросли JIB, % от сухих веществ экстракта PL | FFA | ST | TG | W+HC | FAE

% от липофильных веществ

F. evanescens 8,9 ±0,93 29,9 7,8 14 8,6 9,6 2,7

L. cichorioides 4,6 ±0,45 57,7 7,1 1,7 1,3 28,1 -

С. costata 12,0 ±1,18 47,4 2,0 6,7 8,8 31,1 -

L. japónica 3,3 ±0,78 48,5 1,2 10,7 8,6 19,9 1Д

РЬ - полярные липиды, ББА - свободные жирные кислоты, БТ - стерины, ТС -триглицериды, '№+НС - воска и углеводороды, РАЕ - этиловые эфиры жирных кислот.

Таблица 5.

Состав основных ЖК (% от суммы) водно-этанольных экстрактов бурых водорослей.

Жирные кислоты F. evanescens L. cichorioides L. japónica С. costata

14:0 12,8 7,4 7,2 10,5

16:0 14,0 11,0 11,0 15,3

16:1п-7 2,0 3,5 2,6 1,0

18:1п-9 9,9 7,1 12,6 16,5

18:2п-6 7,3 7,0 6,8 7,5

18:3п-3 11,1 4,8 3,3 3,5

18:4п-3 11,1 20,6 13,9 11,7

20:4п-6 7,6 11,2 14,3 14,3

20:5п-3 13,5 19,1 8,2 11,4

Основными насыщенными жирными кислотами (ЖК) в экстрактах водорослей были 14:0 и 16:0 (табл. 5). Уровень 18:1п-9, которую относят к главным ЖК бурых водорослей, в экстракте из С. costata достигал 16,5%, а уровень Cis-го полиненасыщенных ЖК (ПНЖК) - около 50% от суммы ЖК. В экстракте из L. cichorioides отмечено самое высокое содержание 20:5п-6 и 18:4п-3 (табл. 5). Во всех экстрактах преобладали ПНЖК n-З серии, соотношение п-З/п-6 для экстрактов водорослей составило 1,2-2,4.

Сравнительное изучение состава водно-этанольных экстрактов водорослей показало, что при качественном сходстве состава между ними существуют значительные количественные различия. Значительный интерес представлял экстракт из F. evanescens, который обогащен веществами белковой природы, тирозином, фенилаланином и полифенольными соединениями. В этом экстракте определили высокий уровень ионов натрия, железа, марганца, никеля, липофильных веществ и производных хлорофилла.

S Влияние сезона на состав водно-этанольных экстрактов бурых водорослей

L. cichorioides и С. costata

Доля органических веществ в экстрактах возрастала с мая по сентябрь. Для L. cichorioides содержание маннита в экстрактах сентябрьских образцов была в 2 раза больше (53,6%) по сравнению с майскими образцами (табл. 2). Экстракты из сентябрьских образцов L.cichorioides и С. costata содержали больше полифенольных соединений (5,5 и 2,7% соответственно) и хлорофилла (2,2 и 3,1% соответственно) по сравнению с

экстрактами из майских сборов (табл. 2). В экстрактах из L. cichorioides, С. Costaía, F. evanescens среди САК было отмечено присутствие таурина в июльских образцах. В экстракте из июльского образца С. costata уровень JIB был вдвое ниже (6,5%) по сравнению с майским (12,0%), а уровень JIB в экстракте из майского образца L. cichorioides составил 4,6%, резко упал до 1,4% в июльском, и вновь увеличился до 4,9% в сентябрьском образце. Очевидно, что при сборе водоросли следует учитывать сезонную зависимость содержания биогенных веществ в водно-этанольных экстрактах.

6 Биологическая активность водно-этанольных экстрактов бурых водорослей

Для изучения противоопухолевой активности экстрактов было исследовано их действие на раковые клетки кишечника человека НТ-29 и DLD-1. В концентрации 50 мкг/мл наиболее сильным ингибирующим действием обладал экстракт из F. evanescens, который угнетал рост колоний клеток DLD-1 и НТ-29 на 67 и 63% соответственно. Для L. cichorioides и С. costata наиболее сильное ингибирующее действие показали экстракты этих водорослей, собранных в июле, они ингибировали рост клеток DLD-1 на 64 и 56%, а клеток НТ-29 на 50 и 44% соответственно. Поскольку наибольшее ингибирующее действие показали экстракты из генеративных водорослей, они являются перспективными объектами для дальнейшего выяснения их действующего начала.

Для изучения рострегулирующей активности экстрактов было исследовано их действие на проростки сои Glycine max. Все экстракты в концентрации 100 мкг/мл стимулировали рост как корневой системы проростка, так и стебля. Наиболее сильное ростстимулирующее действие показали экстракты из L. japónica и F. evanescens, которые увеличивали рост корня на 20 и 24%, а стебля - на 26 и 15% соответственно. Предварительная обработка семян сои всеми экстрактами в концентрации 2 мг/мл приводила к повышению урожайности. Наибольший прирост урожайности на 15,6 и 11,7% наблюдали при обработке семян экстрактами из L. japónica и F. evanescens соответственно. Целесообразно рекомендовать экстракты в качестве стимулятора роста при выращивании сои на полях.

В заключение следует отметить, что исследование химического состава водно-этанольных экстрактов показало, что они могут быть рекомендованы как для получения отдельных веществ (фукостерина, полифенольных соединений, маннита), так и для изготовления на их основе композиций для медицины и сельского хозяйства.

7 Оптимизация условий выделения фукоиданов из бурых водорослей

7.1 Влияние температурного режима экстракции на выход и фракционирование фукоиданов, имеющих различное строение полисахаридной цепи

Для выделения фукоиданов обезжиренные водоросли С. costata и F. evanescens июльского сбора последовательно экстрагировали 3 ч раствором НС1 (рН 2) при 20°С (холодная экстракция, фракции F1), а затем при 60°С (горячая экстракция, фракции F2). Остаток водоросли F. evanescens дополнительно экстрагировали 12 ч при 60°С (фракция F3). Выходы и характеристики полученных фракций фукоиданов приведены в таблице 6.

Для С. соь1Ша выход фракций фукоидана СсП был примерно в 2 раза выше, чем выход фракции СсР2. Для Р. еуапеясет наибольший выход был получен при горячей экстракции (табл. 6). Было отмечено высокое содержание уронанов и пониженное содержание белка во фракции Р2 для обеих водорослей (табл. 6).

Таблица 6.

Выходы и характеристики фракций фукоиданов, выделенных экстракцией при рН 2 из

Показатели Водоросли

С. costata F. evanescens

Фракция F1 F2 F1 F2 F3

Выход, %* 2,5 0,9 2,5 5,1 1,2

Уронаны, %** 2,2 5 0,3 5,0 54,8

Фукоидан, %** 21,A 17,4 65,0 89,7 15,8

Сульфаты, %** 17,0 12,3 22,7 21,8 8,1

Белок, % 3,1 2,5 9Д 6,3 2,6

Молекулярная масса, кДа 80-300 70-240 820 840 и.о.

Нейтральные моносахариды (мольные %) Fue 58,2 72,7 86,3 86,0 60,8

Gal 20,0 15,7 4,7 6,0 3,3

Man 1,8 6,8 1,5 1,5 26,0

Rha 4,2 1.4 0 0 0

Xyl 4,1 1,7 1,2 1,6 6,0

Glc 11,7 1,6 6,3 4,9 3,9

* - % от веса сухой обезжиренной водоросли, **-% от веса фракции

Наличие глюкозы в составе нейтральных моносахаридов указывало на присутствие во фракциях F1 и F2 ламинарана. Следует отметить, что содержание ламинарана в обеих водорослях невелико (табл. 6). Из F. evanescens при разных температурах были выделены сульфатированные фуканы (фракции FeFl и FeF2), практически не отличающиеся по моносахаридному составу, содержанию сульфатов и молекулярным массам. Дополнительная экстракция F. evanescens при высокой температуре с небольшим выходом дала фракцию фукоидана FeF3 с высоким содержанием Man (26% от суммы нейтральных моносахаридов) и уроновых кислот (50% от фракции) (табл. 6).

Молекулярно-массовое распределение фукоиданов во фракции CcFl из С. costata было неоднородным, находилось в интервале от 20 до 600 кДа с главным максимумом при 300 кДа и двумя пиками меньшей интенсивности при 80 и 560 кДа. Фракция CcF2 содержала полисахариды с меньшей молекулярной массой с максимумом при 70 кДа и незначительными пиками при 33 и 240 кДа.

Сравнительная оценка содержания сульфатных групп в фукоидане фракций CcFl и CcF2 проводилась по сравнению отношений величин интенсивностей полос поглощения валентных колебаний сульфатных групп при 1260-1264 см"1 и скелета сахарного кольца при 1082 см"1 (ИК-спектры). Сравнение полученных величин отношений показало, что содержание сульфатных групп во фракции CcFl было на 25% больше, чем во фракции CcF2, т.е. при холодной экстракции был получен более сульфатированный фукоидан. Кроме того, фракция фукоиданов (CcF2) содержала меньше Gal, но больше Man, чем фракция CcFl (табл. 6).

При последовательной экстракции С. costata были получены разные по составу и молекулярной массе фракции фукоиданов. В то же время, аналогичные фракции фукоиданов FeFl и FeF2 из F. evanescens практически не различались (табл. 6). Однако, при дополнительном экстрагировании P. evanescens в более жестких условиях (60°С, 12 ч) была получена фракция фукоидана FeF3, свойства которой (высокое содержание альгиновых кислот и значительная доля Man в составе моносахаридов, низкое содержание сульфатов) были близки к свойствам фракции CcF2 из С. costata (табл. 6). Это позволяет предположить, что фракции фукоиданов CcF2 и FeF3 извлекаются при разрушении клеточных стенок, причем для F. evanescens этот процесс требует более жестких условий.

Для детальной характеристики полисахаридов С. costata фракцию CcFl очищали гидрофобной хроматографией от примеси ламинарана, получили фракцию фукоидана CcFl-f, которую дополнительно разделяли ионообменной хроматографией. Получили подфракции CcFl-f-0,5 и CcFl-f-1,5, характеристики которых приведены в таблице 7. Подфракция CcFl-f-0,5 содержала низкосульфатированный гетерогенный по моносахаридному составу фукоидан с высоким содержанием маннозы и глюкуроновой кислоты (табл. 7). В этой подфракции присутствовали примерно в равных количествах фукоиданы с молекулярными массами 40 и 620 кДа. Высокосульфатированная подфракция CcFl-f-1,5 составляла около 70% от исходного фукоидана (CcFl-f) (табл. 7). Около 90% от суммы моносахаридов этой подфракции были представлены Fue и Gal в соотношении 1,0:0,28. Основную часть подфракции CcFl-f-1,5 составили фукоиданы с молекулярной массой 160 кДа, в меньшем количестве - с молекулярной массой 70 кДа. Следовательно, фракция CcFl содержала два структурных типа фукоиданов -слабозаряженный уронофукоманнан и высокосульфатированный галактофукан в весовом соотношении 1:2.

Таблица 7.

Характеристика подфракций CcFl-f-0,5 и CcFl-f-1,5, полученных хроматографией на DEAE-целлюлозе фракции фукоидана CcFl-f из С. costata._

Фракция Выход % Mm, кДа S03Na ■%* Моносахариды, мольные %

Fue Gal Man Rha Xyl Glc GlcA

Fl-f 100 80-800 17,3 55,1 18,1 9,2 11,5 4,3 1,8 H.O.

Fl-f-0,5 29 20-200, 200-800 6,7 22,6 6,4 37,0 4,2 4,6 9,6 15,5

Fl-f-1,5 69 40-600 23,8 70,2 19,8 7,0 0,0 0,0 0,0 3,0

* - % от веса фракции фукоидана. н.о. - не определяли

Таким образом, показана гетерогенность состава фукоиданов С. и Р.

еуапе5сею и возможность фракционирования нативных фукоиданов, используя разные температурные режимы экстракции.

7.2 Оптимизация условий выделения фукоидана из бурой водоросли Л еуаимсе/ы

Р. еуалегсеи.? содержала наибольшее количество фукоидана, представлявшего собой практически чистый сульфатированный фукан. Для оптимизации условий выделения фукоидана использовали в качестве сырья сухую обезжиренную водоросль Р. еуапезеет, которая после удаления низкомолекулярных соединений и солей содержала 14%

фукоидана (далее по тексту - сырье). Вместе с фукоиданом из сырья экстрагируются ламинаран и уроианы, а также низкомолекулярные вещества и соли, которые не полностью экстрагировались водным этанолом. Поэтому необходимо подбирать оптимальные условия экстракции для получения однородного по составу продукта с наибольшим выходом. Мы предлагаем комплексную переработку водоросли, поэтому нашими критериями были максимальный выход фукоидана, селективность его выделения и снижение потерь альгиновой кислоты, которая будет выделяться на следующей стадии.

В предварительных экспериментах были выбраны следующие условия экстракции фукоидана из сырья: средний размер частиц сырья - 5 мм, кислотность экстракционной среды рН 2,5, отношение водоросль: экстрагент - 1:15, температура - 50°С, кратность экстракций - 2. Для проверки степени влияния каждого из этих факторов на процесс экстракции фукоидана был проведен оптимизационный эксперимент по типу дробной реплики с двумя уровнями пяти переменных (25"2) с определяющими контрастами. Задача оптимизации сводилась к определению значений условий экстракции, обеспечивающих максимальный выход фукоидана и минимальное содержание сопутствующих веществ. План и результаты факторного эксперимента приведены в таблице 8.

Таблица 8.

План и результаты факторного эксперимента (с двумя уровнями пяти переменных) по оптимизации экстракции фукоидана из К еуапезсепя.____

№ Факторы эксперимента Уь% У:, % Уз, % У<,%

опыта Хо Х1.РН Хг, оаз Хз., Х4°С мм

1 1 15 1,5 3 2 65 2 78,0 27,4 45,1 88,4

2 1 15 3,5 3 2 35 8 55,6 21,9 76,9 46,0

3 1 15 1,5 1 2 35 8 46,0 14,9 69,2 62,0

4 1 15 3,5 1 2 65 2 44,2 15,0 76,4 54,0

5 1 15 1,5 3 4 35 2 52,6 21,2 46,8 74,2

6 1 15 3,5 3 4 65 8 94,8 26,4 93,4 54,0

7 1 15 1,5 1 4 65 8 70,0 19,5 65,9 76,0

8 1 15 3,5 1 4 35 2 35,2 13,1 84,8 44,2

9 1 15 2,5 2 3 50 5 49,0 19,4 64,1 56,4

10 1 15 2,5 2 3 50 5 62,0 18,4 70,3 67,4

11 1 15 2,5 2 3 50 5 48,0 20,6 54,7 60,0

12 1 15 2,5 2 3 50 5 50,0 19,4 65,0 57,0

Выход процесса У, (функция отклика) определили, как У] - выход фукоидана (% от содержания в сырье); - выход экстрактивных веществ (% от веса сырья); Уз - выход водорастворимых полисахаридов (% от веса экстрактивных веществ); У* - выход фукоидана (% от веса водорастворимых полисахаридов). Независимыми переменными (ХО были: Хо - соотношение сырье: экстрагент; Х[ - значение рН; Х2 - кратность, раз; Хз -продолжительность, ч; X» - температура, °С; X5 - степень измельчения сырья, мм.

Для определения ошибки эксперимента было поставлено 4 опыта в нулевых условиях (опыты 9-12, табл. 8).

По результатам факторного эксперимента описание функции отклика в виде линейных уравнений регрессии имели вид:

Уг 59,6 - 2,1 XI + 10,7 Х2 + 5,8 Х3 + 9,9 Ха + 7,1Х5 (1) У2= 19,9 - 0,8Х, + 4,3 Х2 + 0,6 Х3 + 1,7 Х4 + 0,8 Х5 (2)

У3= 69,8 + 13,1 X, + 4,3 Х2 + 0,8 Х3 + 2,5 Ха + 6,5 Х5 (3) У4= 62,4 - 12,8 XI + 3,3 Х2 + 2,2 Х3 + 3,3 Х4 - 2,8Х5 (4)

Проверка значимости коэффициентов при факторах X; в уравнениях (1-4) по критерию Стьюдента (с надежностью 95%) показала, что в уравнении (1) и (2) значимо отличны от нуля только коэффициенты при Х2, Х4 и Х5, а в уравнениях (3) и (4) - при Хь

Это означает, что в выбранном диапазоне увеличение кратности (Х2) и температуры экстракции (Х4) должно приводить к увеличению выхода фукоидана (У0 и экстрактивных веществ (У2). При увеличении рН среды (Х0 следует ожидать повышения доли полисахаридов в экстрактивных веществах (Уз) и уменьшения доли фукоидана во фракции полисахаридов (У4). Поскольку уменьшение размера частиц сырья (Х5) при статическом режиме экстракции не приводило к повышению выхода фукоидана, рекомендовано сырье измельчать до размера 1-3 см.

Как показали результаты ре1рессионного анализа уравнения (1), оно удовлетворительно описывает выход фукоидана в процессе экстракции. Экспериментальная проверка модели в условиях иных, чем те, которые использовались для получения уравнения (1), подтвердила адекватность ее применения для описания процесса (^зга1. = 5,42; Гтаб.ъ = 5,79; р = 0,05).

Для масштабирования процесса экстракции фукоидана из Р. еуапе$сет необходимо учитывать следующие закономерности. На выход фукоидана положительно влияло повышение температуры экстракции. Однако, учитывая, что экстрагирование проводят при достаточно низких значениях рН, повышение температуры выше 70°С может привести к частичному кислотному гидролизу фукоидана. Увеличение кратности экстрагирования также положительно влияло на выход фукоидана, но при многократном экстрагировании водоросли (более 2 раз) при температуре >60°С извлекался гетерогенный по составу фукоидан и уменьшалась селективность экстракции. Изменение рН в заданном интервале (1,5-3,5) влияло на выход фракции водорастворимых полисахаридов и содержание фукоидана в этой фракции. Варьируя значение рН от 1,5 до 3,5 и выше можно получать фракцию полисахаридов с разным содержанием фукоидана и альгината. Для получения фракции полисахаридов, обогащенной фукоиданом, экстракцию следует проводить при рН 2,0-2,5.

Мы провели 3-х кратную экстракцию сырья при 65°С, результаты которой даны в таблице 9. Составы 1 и 2 экстрактов практически идентичны и их следует объединять. При необходимости получения гетерогенного фукоидана можно проводить 3-ю экстракцию, выход которой составляет 12% от суммарного.

По результатам оптимизации были выбраны условиях экстракции фукоидана: рН 2,5; при 65±5°С; два раза по 3 ч, гидромодуль 1:15; при этом содержание фукоидана в сумме экстрактивных веществ составило от 40 до 50%.

Для очистки фукоидана бурой водоросли К еуапеясет от ламинарана и низкомолекулярных примесей мы использовали ультрафильтрацию на мембранах с пределом удерживания 5 кДа. Одновременно с очисткой экстракта происходило его концентрирование. Конечный продукт получали осаждением фукоидана из концентрата этиловым спиртом. Характеристика экстрактов приведена в таблице 10. В результате

очистки был получен препарат полисахаридов, содержащий 86,7% фукоидана (табл. 10).

Таблица 9.

Характеристика экстрактов, выделенных из Г. еуапезсет при рН 2,5; 65°С; 3 часа._

Характеристики Ступени экстракции

1-й экстракт 2-й экстракт 3-й экстракт

Выход, %* 6,3 3,3 1,3

Уронаны, %** 2,8 5,0 20,0

Фукоидан, %** 65,0 89,7 55,7

Сульфаты, %** 22,7 23,2 15,0

Нейтральные моносахариды (мольные %) Рис 86,3 85,8 79,6

ва! 4,7 4,9 4,2

Мал 1,5 1,3 9,0

Ху1 1,2 5,8 6,0

в1с 6,3 1,2 1,2

*- % от веса сухой обезжиренной водоросли; **- % от экстрактивных веществ

Таблица 10.

Характеристика экстрактов (до и после очистки на ультрафильтрационной установке) и конечного продукта из К еудпеаееяз. ____

Характеристика Исходный экстракт Концентрат Ультрафильтрат Конечный продукт

Экстрактивные вещества, %* 26,4 ±1,1 14,7 ±1,2 11,7 12,1 ±0,9

Фукоидан, %* 10,9 ±0,3 10,7 ±0,6 0,2 10,5 ±0,6

Водорастворимые полисахариды, %* 13,4 ±1,0 12,6 ±0,7 0,8 11,3 ±0,8

Доброкачественность, %** 41,3 72,7 1,7 86,7

*- % от веса сухой обезжиренной водоросли;

**- содержание фукоидана (% от экстрактивных веществ).

Таблица 11.

Характеристика фукоидана и полисахаридной композиции (БАД «Фуколам-С»), полученных из Т7. еудледсеад._

Характеристика Название продукта

Фукоидан БАД «Фуколам-С»

Выход, %* 10,5 ±0,6 11-13%

Содержание фукоидана, %** 86,0 ±1,6 Не менее 60%

Уронаны, %** 2,7 ±0,8 Не более 35%

Мт, кДа 820 840

Сульфаты, %** 21,3 ±1,5 Не менее 17%

Зола, %** 24,0 ±0,8 Не более 25%

Влага, %** 12,2 ±1,1 Не более 15%

Белок, %** 7,0 ±0,9 и.о.

*- % от веса сухой обезжиренной водоросли; **- % от экстрактивных веществ

Выход фукоидана составил 75-78% от содержания в сырье. Выбранные условия экстрагирования и очистки были использованы для получения полисахаридной фракции, содержащей фукоидан и альгинат из бурой водоросли Р. еуаиеясети, которая зарегистрирована как «Фуколам-С - сырье для пищевой промышленности и производства БАД к пище» (табл. 11). На основе этой композиции была создана БАД к пище «Фуколам». Показана эффективность включения БАД «Фуколам» в комплексную терапию с целью коррекции липидного и углеводного обмена. «Фуколам-С» апробирован в качестве основы для иммуноэнтеросорбента, рекомендованного для лечения ожоговых больных и больных с гнойно-септическими заболеваниями.

73 Способ комплексной переработки бурых водорослей

Наша работа показала, что из бурых водорослей можно получить различные продукты: водно-этанольный экстракт, содержащий биологически активные низкомолекулярные вещества, водорастворимые полисахариды (ламинараны, фукоиданы, маннуронаны), которые можно выделить и использовать и как смеси, и как индивидуальные продукты, и альгинат натрия (рис. 10).

Сырьё: бурые водоросли

85-96% этана! Экстракция I 40±2°С, 3-3.5 ч

96% этанол

12% НС1

3%№,СО,

1 ч

III

Суммарный экстракт Фракция Э

Обезжиренная водоросль

Экстракция I 22±2°С,рН 2-2.5,3 ч

III

Фракция

Р.

/

12% НС1 Экстракция I _1

Вода 65±5°С,рН 2-2.5,3 ч II

III

Фракция

гЛаминаран •■Фукоидан

Маннуранан ^Ламинаран

►Фукоидан Маннуранан

Экстракция 80±2°С,рН 10-12

Фракция А

Рис. 10. Технологическая схема комплексной переработки бурых водорослей.

Оптимизация условий получения фукоидана из Р. етпезсепв позволила определить влияние параметров экстракции на качество и количество фукоидана. На основе проведенных исследований разработан способ комплексной переработки бурых водорослей, который защищен патентом РФ и международным патентом. Данный способ обладает универсальным характером и позволяет получать различные продукты из разных видов бурых водорослей.

ВЫВОДЫ

1. Установлены закономерности изменения состава и структуры полисахаридов бурых водорослей Costaría cosíala и Undaria pinnatifida в зависимости от сезона и стадии жизненного цикла. В С. costata содержание альгинатов с апреля по июль увеличилось в 1,5 раза, отношение в них маннуроновой и гулуроновой кислот уменьшилось в 1,4 раза, а доля маннуронанов - на порядок. В U. pinnatifida и С. costata содержание фукоиданов с апреля по июль увеличилось в 5 раз, достигнув максимума в спороносящих растениях. Показано, что стерильные водоросли синтезировали низкосульфатированные гетерофуканы, а фертильные растения - высокосульфатированные галактофуканы.

2. Установлено, что водоросли С. costata и Fucus evanescens содержат фукоиданы различных структурных типов. Предложен способ их разделения последовательной экстракцией при разных температурах.

3. Определены состав полисахаридов и структурные характеристики ламинарана и фукоидана из генеративной С. costata. Ламинаран представлял собой 1,3;1,6-(5-0-глюкан (1,3:1,6 как 5:1) с молекулярной массой 4-5 кДа, а фукоидан - частично ацетилированный галактофукан, сульфатированный по С2 и С4, который ингибировал репродукцию и развитие цитопатического действия вируса клещевого энцефалита in vitro.

4. Исследован состав низкомолекулярных веществ С. costata, Laminaria cichorioides, L. japónica и F. evanescens. Показана зависимость состава низкомолекулярных веществ С. costata и L. cichorioides от сезона сбора водоросли.

5. Установлено ингибирующее действие экстрактов С. costata, L. cichorioides и F. evanescens на раковые клетки кишечника человека. Показана зависимость биологической активности экстрактов от сезона сбора водоросли. Обработка экстрактами L. japónica, С. costata, L. cichorioides и F. evanescens семяи сои увеличивала ее урожайность до 15%.

6. Для F. evanescens определены оптимальные условия экстракции фукоидана, составлена адекватная система уравнений зависимости качества и количества продукта от параметров экстракции. Разработан эффективный метод очистки фукоидана от низкомолекулярных примесей.

7. Предложен способ комплексной переработки бурых водорослей. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Фильченков A.A., Завелевич М.П., Храновская H.H., Запорожец Т.С., Имбс Т.И., Звягинцева Т.Н., Беседнова H.H. Изучение способности фукоиданов из дальневосточных бурых водорослей модулировать апоптоз клеток МТ-4 лейкоза человека in vitro // Росс, биотерапевтический журнал. 2006. Т. 5. № 4. С. 30-37.

2. Фильченков A.A., Завилевич М.П., Имбс Т.И., Звягинцева Т.Н., Запорожец Т.С. Повышение чувствительности злокачественных лимфоидных клеток человека к этопозиду при действии фукоидана полисахарида бурых водорослей // Эксперим. онкология. 2007. Т. 29. № 3. С. 181-185.

3. Имбс Т.И., Красовская Н.П., Ермакова С.П., Макарьева Т.Н., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Сравнительное исследование химического состава и противоопухолевой активности водно-этанольных экстрактов бурых водорослей Laminaria cichorioides, Costaria costata и Fucus evanescens II Биол. моря. 2009. T. 35. № 2. С. 140-146.

4. Moon HJ., Park K.S., Ku M.J., Lee M.S., Jeong S.H., Imbs T.I., Zvyagintseva T.N., Ermakova S.P., Lee Y.H. Effect of Costaría costata Fucoidan on Expression of Matrix Metalloproteinase-1 Promoter, mRNA, and Protein // J. Nat. Prod. 2009. V. 72. P. 1731-1734.

5. Имбс Т.Н., Шевченко H.M., Суховерхое C.B., Семенова Т.Л., Скрипцова A.B., Звягинцева Т.Н. Влияние сезона на состав и структурные характеристики полисахаридов бурой водоросли Costaria costata II Хим. прир. соед. 2009. № 6. С. 661-665.

6. Майстровский К.В., Запорожец Т.С., Федянина Л.Н., Каленик Т.К., Моткина Е.В., Имбс Т.И. Влияние иммуномодулятора фукоидана из бурых водорослей Fucus evanescens на показатели антиоксидантной системы, липидного и углеводного обмена у мышей // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. № 3. С. 103-105.

7. Имбс Т.И., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Технология комплексной переработки бурых водорослей с различным полисахаридным составом // Тез.докл. Второй Международной научно-практ. конф. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, безпозвоночные и продукты их переработки». М.: Изд-во ВНИРО. 2005. С. 189-192.

8. Имбс Т.И., Красовская Н.П., Звягинцева Т.Н. Сравнительное исследование водно-этанольных экстрактов бурых водорослей Laminaria cichorioides, Costaría coctata, Fucus evanescens // Тез. докл. Третьей Международной научно-пракг. конф. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». Владивосток: ТИНРО-Центр. 2008. С. 317.

9. Майстровский К.В., Раповка Ю.В., Запорожец Т.С., Звягинцева Т.Н., Имбс Т.И., Раповка В.Г. Коррекция липидного и углеводного обмена у больных облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей сульфатированным полисахаридом из бурой водоросли Fucus evanscens. Тез. докл. Объед. иммунол. форума. Санкт-Петербург // Росс, иммунологический журнал. 2008. Т. 2 (11). № 2-3. С. 323.

10. Запорожец Т.С., Беседнова H.H., Кузнецова Т.А., Звягинцева Т.Н., Имбс Т.И., Шевченко Н.М.. Сульфатированные полисахариды из бурых водорослей - основа для разработки лекарственных препаратов // Тез. докл. Симпозиума «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств». М.: «Слово». 2008. С. 89.

11. Имбс Т.И., Герасименко Н.И., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Состав веществ бурой водоросли Costaría costata // Тез. докл. II Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» Владивосток. ДВО РАН. 2006. С. 67.

12. Патент РФ № 2240816. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением препаратов для медицины и косметологии / Шевченко Н.М., Имбс Т.И., Урванцева А., Кусайкин М.И., Корниенко В.Г., Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. II БИМП N° 33, С. 444-445.2004.

13. W02005/014657 Method of processing seaweed / Shevchenko N., Imbs T., Urvantseva A., Kusaikin M., Komienko V., Zvyagintseva T., Eleakova L. // Internat. Bureau WIPO. 2005.

14. Патент РФ 2315487. Биологически активный продукт из бурой водоросли, биологически активная добавка к пище, безалкогольный напиток, парфюмерно-косметическое средство / Шевченко Н.М., Имбс Т.И., Звягинцева Т.Н., Кусайкин М.И., Кузнецова Т.А., Запорожец Т.С., Беседнова H.H., Гафуров Ю.М., Рассказов В.А. Таран В.Н. // Бюл. № 3. 2008.

15. Патент РФ №2329864. Пористый сорбент с гепатопротекторными свойствами / Коненков В.И., Любарский М.С., Рачковская Л.Н., Бгатова Н.П., Беседнова H.H., Бородин Ю.И., Кузнецова Т.А., Имбс Т.И., Кусайкин М.И., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н., Таран В.Н. // Бюл. № 21.2008.

Соискатель

Имбс Т. И.

ИМБС Татьяна Игоревна

ПОЛИСАХАРИДЫ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ НЕКОТОРЫХ МАССОВЫХ ВИДОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ МОРЕЙ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ. СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ВОДОРОСЛЕЙ.

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 15.01.2010 г. Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1.0. Уч. изд. л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ № 209531

Отпечатано в Типографии «Краски» 690048, г. Владивосток, пр-т 100-летия, 43, тел.: 36-26-16,55-95-31, www.kpacku.com e-mail: info@kpacku.com

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1 Альгиновые кислоты.

2.1.1 Общие сведения.

2.1.2 Структурные характеристики.

2.1.3 Водорастворимые уронаны.

2.1.4 Биологическая активность.

2.2 Фукоиданы.

2.2.1 Общие сведения.

2.2.2 Структурные характеристики.

2.2.3 Биологическая активность.

2.2.3.1 Антикоагулянтные свойства.

2.2.3.2 Противовоспалительные свойства.

2.2.3.3 Противоопухолевая активность.

2.2.3.4 Противовирусное действие.

2.2.3.5 Другие примеры биологической активности фукоиданов.

2.3 Ламинараны.:.

2.3.1 Общие сведения.

2.3.2 Структурные характеристики.

2.3.3 Биологическая активность.

2.4 Другие первичные метаболиты бурых водорослей.

2.4.1 Маннит.

2.4.2 Азотистые вещества. Белки и свободные аминокислоты.

2.4.3 Липиды бурых водорослей и их биологическая активность.

2.4.4 Стерины бурых водорослей и их биологическая активность.

2.4.5 Пигменты бурых водорослей и их биологическое действие.:.:.

2.5 Вторичные метаболиты бурых водорослей.

2.5.1 Полифенольные соединения и их биологическая активность.

2.6 Способы выделения и очистки полисахаридов и других биологически активных веществ из бурых водорослей. Технологии переработки бурых водорослей.

2.6.1 Экстракционные технологии.

2.6.2 Фракционирование экстрактов водорастворимых полисахаридов :„.:.

2.6.3 Технологии получения фукоидана.:.

2.6.4 Технологии получения альгиновой кислоты и альгинатов.

2.6.5 Технологии комплексной переработки бурых водорослей.:.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Влияние сезона на состав и структурные характеристики полисахаридов бурых водорослей С. costata и U. pinnatifida.:.

3.1.1 Влияние сезона на состав полисахаридов водоросли С. costata.

3.1.1.1 Влияние сезона на содержание и состав альгинатов водоросли С. costata

3.1.1.2 Влияние сезона на состав фракций водорастворимых полисахаридов водоросли С. costata. Структурные характеристики и биологическая активность отдельных полисахаридов.:.

3.1.2 Влияние сезона на содержание и моносахаридный состав фукоидана водоросли Undaria pinnatifida.

3.1.3 Влияние стадии жизненного цикла водорослей С. costata и U. pinnatifida на содержание и моносахаридный состав фукоидана.:.

3.2 Сравнительное исследование состава водно-этанольных экстрактов водорослей L. cichorioides, С. costata, L.japonica и F. evanescens и их биологической активности.

3.2.1 Влияние сезона на состав водно-этанольных экстрактов бурых водорослей L. cichorioides и С. costata

3.2.2 Противоопухолевая активность водно-этанольных экстрактов бурых водорослей L. cichorioides, С. costata и F. evanescens.

3.2.3 Влияние водно-этанольных экстрактов бурых водорослей L. cichorioides, С. costata, L. japonica и F. evanescens на рост проростков и урожайность сои Glycine max (L.) Merr.

3.3 Оптимизация условий выделения фукоиданов из дальневосточных бурых водорослей.

3.3.1 Влияние температурного режима экстракции на выход и фракционирование фукоиданов, имеющих различное строение полисахаридной цепи.

3.3.2 Сравнительный анализ фукоиданов фракций CcFl и CcF2 из С. costata, выделенных последовательно при 20°С и при 60°С.

3.3.3 Оптимизация условий выделения фукоидана из бурой водоросли F. evanescens!

3.3.4 Очистка экстракта, содержащего фукоидан, от сопутствующих веществ.

3.3.5 Способ комплексной переработки бурых водорослей

4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1 Материалы.

4.2 Оборудование.

4.3 Методы.

5 ВЫВОДЫ.

В современном обществе растет внимание населения к проблемам здоровья и долголетия. Это определяет спрос на продукты питания морского происхождения, в число которых входят морские водоросли, продукты их переработки, а также лекарственные и лечебно-профилактические препараты на их основе.

Бурые водоросли являются богатым и возобновляемым сырьем для получения ценных биологически активных полисахаридов — фукоиданов, ламинаранов и альгиновых кислот. Содержание йода, макро- и микроэлементов, маннита и свободных аминокислот в бурых водорослях выше, чем в наземных растениях. Практически неисчерпаемым источником бурых водорослей могут быть прибрежные воды морей Дальнего Востока России. К сожалению, в России в настоящее время этот биологический ресурс используется очень ограниченно в силу многих причин, в том числе и потому, что его химический состав изучен недостаточно. За рубежом переработка водорослей является высокоэффективной и высокодоходной отраслью производства. Современные технологии переработки водорослей требуют сырье со стандартным составом. В качественном отношении химический состав бурых водорослей достаточно стабилен, однако количественное содержание отдельных химических соединений зависит от рода и вида растения. В пределах одного вида на химический состав значительно влияют возраст, физиологическое состояние, место и сезон сбора водоросли.

Широкое применение полисахаридов бурых водорослей (альгинатов, фукоиданов и i t ' 4 ламинаранов), как терапевтических агентов, сдерживается проблемами получения г < » ' 4 конечных продуктов со стандартными характеристиками. Эти трудности связаны с тем, I что не только содержание, но и структура полисахаридов меняются в зависимости от вида, стадии развития водоросли, места произрастания, а методы их выделения и фракционирования недостаточно эффективны.

Для успешного внедрения полисахаридов и низкомолекулярных метаболитов бурых s I водорослей в терапевтическую и лечебно-профилактическую практику необходимо изучить химический состав массовых видов бурых водорослей Дальневосточных морей, установить динамику его изменения в течение жизненного цикла водоросли, определить периоды максимального накопления биологически активных соединений и разработать эффективную технологию их производства с учетом большой вариабельности состава исходного сырья.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Бурые водоросли (Phaeophyta) — в основном, морские растения. Свое название они получили из-за бурого пигмента фукоксантина. Этого пигмент в различных количественных соотношениях с хлорофиллом, каротином и ксантофиллом обуславливает окраску бурых водорослей от оливково-зеленого до темно-бурого. Произрастают водоросли на литорали и сублиторали на глубине до 20-30м, при слабом уклоне дна могут распространяться на 5-1 Окм от берега. Эти макроводоросли особенно широко распространены в холодных частях Атлантического и Тихого океанов, где преобладают виды, относящиеся к отрядам Fucales и Laminariales. В теплых водах наиболее распространены бурые водоросли рода Sargassum [1].

В дальневосточных морях произрастает около 200 видов бурых водорослей [2], среди них 15 видов относят к промысловым. Основные промысловые виды водорослей I

Дальнего Востока — это Laminaria japonica, L. gurjanovae, L. angustata, Cymathera japonica. В качестве потенциально промысловых, среди прочих, считаются Costaria costata, Fucus evanescens, L. cichorioides [3].

Бурые водоросли издавна используют в качестве пищевого продукта, а также как эффективное средство для лечения и профилактики многих заболеваний.

Полисахариды являются главными компонентами биомассы водорослей и выполняют ряд важнейших биологических функций: служат энергетическим резервом, участвуют в построении клеточных стенок, образуют наружные капсулы и межклеточный матрикс, препятствуют дегидратации, создают барьер для проникновения в клетку солей из морской воды или, напротив, обеспечивают избирательное поглощение катионов, необходимых для построения минерального скелета.

Полисахариды, получаемые из водорослей, обладают уникальными физико-химическими свойствами и находят широкое практическое применение[4]. Рациональное использование полисахаридов водорослей, понимание их биологической роли невозможно без установления их химического строения. С химической точки зрения эти соединения изучены недостаточно и очень неравномерно. Наиболее характерными полисахаридами бурых водорослей являются альгиновые кислоты и их соли, ламинараны (1,3- и/или 1,3-; 1,6-р-0-глюканы) и сульфатированные полисахариды — фукоиданы.

-955 ВЫВОДЫ

1. Установлены закономерности изменения состава и структуры полисахаридов бурых водорослей Costaria costata и Undaria pinnatifida в зависимости от сезона и стадии жизненного цикла. В С. costata содержание альгинатов с апреля по июль увеличилось в 1,5 раза, отношение в них маннуроновой и гулуроновой кислот уменьшилось в 1,4 раза, а доля маннуронанов - на порядок. В U. pinnatifida и С. costata содержание фукоиданов с апреля по июль увеличилось в 5 раз, достигнув максимума в спороносящих растениях. Показано, что стерильные водоросли синтезировали низкосульфатированные гетерофуканы, а фертильные растения — высокосульфатированные галактофукапы.

2. Установлено, что водоросли С. costata и Fucus evanescens содержат фукоиданы различных структурных типов. Предложен способ их разделения последовательной экстракцией при разных температурах.

3. Определены состав полисахаридов и структурные характеристики ламинарана и фукоидана из генеративной С. costata. Ламинаран представлял собой 1,3;1,6-Р-0-глюкан (1,3:1,6 как 5:1) с молекулярной массой 4-5 кДа, а фукоидан — частично ацетилированный галактофукан, сульфатированный по С2 и С4, который ингибировал репродукцию и развитие цитопатического действия вируса клещевого энцефалита in vitro.

4. Исследован состав низкомолекулярных веществ С. costata, Laminaria cichorioides, L. japonica и F. evanescens. Показана зависимость состава низкомолекулярных веществ С. costata и L. cichorioides от сезона сбора водоросли.

5. Установлено ингибирующее действие экстрактов С. costata, L. cichorioides и F. evanescens на раковые клетки кишечника человека. Показана зависимость биологической активности экстрактов от сезона сбора водоросли. Обработка экстрактами L. japonica, С. costata, L. cichorioides и F. evanescens семян сои увеличивала ее урожайность до 15%.

6. Для F. evanescens определены оптимальные условия экстракции фукоидана, составлена адекватная система уравнений зависимости качества и количества продукта от параметров экстракции. Разработан эффективный метод очистки фукоидана от низкомолекулярных примесей.

7. Предложен способ комплексной переработки бурых водорослей.

1. Van den Hoek С., Mann D.G., Jahns H.M. Algae. An introdaction to Phycology. University Press. Cambridge. 1995. 623 p.

2. Гусарова И.С., Суховеева M.B., Моргутова И.А. Аннотированный список водорослей-макрофитов северного Приморья // Владивосток: ТИНРО. 2000. Т. 127. С. 626-641.

3. Суховеева М.В., Подкорытова А.В. Промысловые водоросли и травы морей Дальнего Востока: биология, распространение, запасы, технология переработки. Владивосток: ТИНРО-центр. 2006. 243 с.

4. Draget K.I., Мое S.T., Skjak-Brask G., Smidsrad О. In Food polysaccharides and their applications. (Eds Stephen A.M., Phillips G.O., Williams P.A.). CRC Press. Boca Raton. 2006. 289 p.

5. Stanford E.C. On Algin: A new substance obtained from some of the commoner species of marine algae // Chem. News. 1883. V. 47. P. 254-257.

6. Kloareg В., Quatrano R.S. Structure of cell walls of marine algae and ecophysiological functions of the matrix polysaccharides // Oceanography and Marine Biology. New York. 1988. V. 26. P. 259-315.

7. Sato S., Tanbara K. Distribution of metals and components of polysaccharides in Laminaria japonica II Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1980. V. 46. N. 6. P. 749-756.

8. Haug A., Larsen В., Smidsrad O. Uronic acid sequence in alginate from different sources // Carbohydr. Res. 1974. N. 32. P. 217-225.

9. Усов А.И. Альгиновые кислоты и альгинаты: методы анализа, определения состава и установления строения // Успехи химии. 1999. Т. 68. № 11. С. 1051-1061.

10. Shinohara М., Kamono Н., Aoyama Т., Bando Н., Nishizawa М. Relationships between Guluronate contents in alginates determined by H-NMR spectroscopy and their average molecular weights // Fish. Sci. 1999. V. 65. N. 6. P. 909-913.

11. Leal D., Matsuhiro В., Rossi M. and Caruso F. FT-IR spectra of alginic acid fraction in three species of brown seaweeds // Carbohydr. Res. 2008. N. 343. P. 308-316.

12. Davis T.A., Ramirez M., Mucci A., Larsen B. Extraction, isolation and cadmium binding of alginate from Sargassum spp. // J. Appl. Phycol. 2004. V. 16. P. 275-284.

13. Skjak-Brak G. Alginates: biosynthesis and some structure-function relationships relevant to biomedical and biotechnological application // Biochem. Plant Polysacch. 1992. V. 20. P. 27-33.

14. Haug A. Composition and properties of alginates: Report № 30. Oslo: Norwegian Inst, of Seaweed Res. 1964. 123 p.

15. Sousa A.P.A., Torres M.R., Pessoa C., Moraes M.O., Rocha Filho F.D., Alves A.P.N.N., Costa-Lotufo L.V. In vivo growth-inhibition of sarcoma 180 tumor by alginates from brown seaweed Sargassum vulgare II Carbohydr. Polym. 2007. V. 69. P. 7-13.

16. Smit A.J., Fujihara M., Nagumo T. Effect of the content of D-mannuronic acid and L-guluronic acid blocks in alginates on antitumor activity // Carbohydr. Res. 1992. V. 224. P. 343-347.

17. Fujihara M., Nagumo T. An influence of the structure of alginate on the chemotactic activity of macrophages and the antitumor activity // Carbohydr. Res. 1993. V. 243. P. 343347.

18. Mao W.J., Li B.F., Gu Q.Q., Fang Y.C., Xing H.T. Preliminary studies on the chemical characterization and antihyperlipidemic activity of polysaccharide from the brown alga Sargassum fusiforme II Hydrobiologia. 2004. V. 512. P. 63-66.

19. Chandia N.P., Matsuhiro В., Mejias E., Moenne A. Alginic acids in Lessonia vadosa: Partial hydrolysis and elicitor properties of the polymannuronic acid fraction // J. Appl. Phycol. 2004. V. 16. P. 127-133.

20. Хотимченко Ю.С., Ковалев B.B., Савченко O.B., Зиганшина О.А. Физико-химические свойства, физиологическая активность и применение альгинатов полисахаридов бурых водорослей // Биология моря. 2001. Т. 27. № 3. С. 151-162.

21. Smit A.J. Medicinal and pharmaceutical uses of seaweed natural products: A review // J. Appl. Phycol. 2004. V. 16. P. 245-262.

22. Onsoyen E. Commercial applications of alginate // Carbohydr. Eur. 1996. V. 14. P. 26-30.

23. Mabeau S., Kloareg B. and Joseleau J.P. Fractionation and analysis of fucans from brown algae // Phytochemistry. 1990. V. 29. P. 2441-2445.

24. Облучинская Е.Д., Воскобойников Г.М., Галынкин В.А. Содержание альгиновой кислоты и фукоидана в фукусовых водорослях Баренцева моря // Прикл. биохим. и микроб. 2002. Т. 38. С. 213-216.

25. Kylin H. Hope-Seylers Z. New polisaccharide, isolated of brown algae Laminaria digitata II J. Physiol. Chem. 1913. V. 83. P. 171.

26. Grauffel V., Kloareg В., Mabeau S., Durand P., Jozefonvicz J. New natural polisaccharides with potent antithrombic activity: fucans from brown algae // Biomaterials. 1989. V. 10. P. 363-369.

27. Nishino Т., Nishioka C., Ura H. Isolation and partial characterization of a novel amino sugar-containing fucan sulfate from commercial Fucus vesiculosus fucoidan // Carbohydr. Res. 1994. V. 255. P. 213-224.

28. Anno K., Terahata H., Hayashi Y. Isolation and purification of fucoidin from brown seaweed Pelvetia wrightii II Agri. Biol. Chem. 1966. V. 30. P. 495-499.

29. Chandfa N.P., Matsuhiro B. Characterization of a fucoidan from Lessonia vadosa (Phaeophyta) and its anticoagulant and elicitor properties // Int. J. Biol. Macromol. 2008. V. 42. P. 235-240.

30. Mian J., Percival E. Carbohydrates of the brown seaweeds Himanthalia lorea and Bifurcaria bifurcate Part II. Structural studies of the "fucans" // Carbohydr. Res. 1973. V. 26. P. 147-161.

31. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. Structure of a fiicoidan from the brown seaweed Fucus evanescens II Carbohydr. Res. 2002. V. 337. P. 719-730.

32. Bilan M.I., Grachev A.A., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. Structure of a fiicoidan from the brown seaweed Fucus serratus II Carbohydr. Res. 2006. V. 341. P. 238-245.

33. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. A highly regular fraction of a' fiicoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. // Carbohydr. Res. 2004. V. 339. P. 511-517.

34. Kitamura K., Matsuo M., Yasui T. Fucoidan from brown seaweed Laminaria angustata var. longissima // Agric. Biol. Chem. 1991 V. 55. N. 2. P. 615-616.

35. Nishino Т., Aizu Y., Nagumo T. The influence of sulfate content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its antitrombin activity // Tromb. Res. 1991. V. 64. P. 723-731.

36. Albuquerque I.R.L., Queiroz K.C.S., Alves L.G., Santos E.A., Leite E.L., Rocha H.A.O. Heterofiicas from Dictyota menstrualis have anticoagulant activity II Brazilian. J. Med. Biol. Res. 2004. V. 37. P. 167-171.г

37. Duarate M., Cardoso M., Noseda M. Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum II Carbohydr. Res. 2001. V. 333. P. 281-293.

38. Ponce N.M.A., Pujol C.A., Damonte E.B., Flores M.L., Stortz C.A. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies // Carbohydr. Res. 2003. V. 338. P. 153-165.

39. Li В., Wei X.-J., Sun J.-L., Xu Sh.-Y. Structural investigation of a fucoidan containing as Ifucose-free core from the brown seaweed Hizikia fusiforme II Carbohydr. Res. 2006. V. 341. P. 1135-1146.

40. Percival E., Glucoroxylofucan, a cell-wall component of Ascophyllum. nodosum II Carbohydr. Res. 1968. V. 7. P. 272-283.t ,

41. Chevolot L., Mulloy В., Ratiskol J., Foucault A., Colliec-Jouault S. A disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae // Carbohydr. Res. 2001. V. 330. P. 529-535.

42. Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., Haslam S.M., McDowell R.A., Shashkov A.S., Nifantev N.E., Khatuntseva E.A. and Usov A.I. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum II Carbohydr. Res. 1999. V. 320. P. 108-119

43. Kusaykin M.I., Chizhov A.O., Grachov A.A., Alekseeva S.A. A comparative study of specificity of fucoidanases from marinemicroorganisms and invertebrates // J. Appl. Phycol. 2006. V. 18. P. 369-373.

44. Билан М.И., Захарова A.H., Грачев A.A., Шашков А.С., Нифантьев Н.Э., Усов А.И. Полисахариды водорослей 60. Фукоидан из тихоокеанской бурой водоросли Analipus japonicus (Harv.) Winne // Биоорг. химия. 2007. Т. 33. № 44. С. 38-46.

45. Tako М., Yoza Е., Tohma S. Chemical characterization of acetyl fucoidan and alginate from commercially cultured Cladosiphon okamuranus И Bot. Marina. 2000. V. 43. P. 393398.

46. Усов А.И., Билан М.И. Фукоиданы — сульфатированные полисахариды бурых водорослей // Успехи химии. 2009. Т. 78. № 8. С. 846-862.

47. Bilan M.I. and Usov A.I. Structural analysis of fucoidans // Nat. Prod. Com. 2008. V. 3. N. 10. P. 1639-1648.

48. Kloareg В., Demarty M., Mabeau S. Polyanionic characteristic of purified sulphated homofucans from brown algae // Int. J. Biol. Macromol. 1986. V. 8. P. 380-386.

49. Abdel-Fattah A.F., Hunssein M.M.D., Salem H.M. Stadies of the purification and some properties of sargassan, a sulphated heteropolysaccharides from Sargassum linifolium II Carbohydr. Res. 1974. V. 33. P. 9-17.

50. Sakai Т., Kimura H., Kojima K., Shimanaka K., Ikai K., Kato I. Marin bacterial sulfatedfucoglucuronomannan (SFGM) lyase digests brown algal SFGM into trisaccharides // Mar.t

51. Biotechnol. 2003. V. 5. P. 70-78.-10165. Sakai Т., Kawai Т., Kato I. Isolation and characterization of a fucoidan-degrading marine bacterial strain and its fucoidanase // Mar. Biotechnol. 2004. V. 6. P. 335-346.

52. Усов А.И., Смирнова Г.П., Клочкова Н.Г. Полисахариды водорослей. Сообщение 58. Полисахаридный состав тихоокеанской бурой водоросли Alaria fistnlosa P.et R (Alariaceae, Laminariales) // Изв. A. H. Сер. хим. 2005. № 5. С. 1245-1249.

53. Hemmingson J.A., Falshaw .R., H.Furneaux R., Thompson K. Structure and antiviral activity of the galactofucan sulfates extracted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta) // J. Appl. Phycol. 2006. V. 18. P. 185-193.

54. Xue C.-H., Fang Y., Lin H., Chen L., Li Z.-J., Deng D., Lu С.-Х. Chemical characters and antioxidative properties of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica II J. Appl. Phycol. 2001. V. 13. P. 67-70.

55. Шевченко H.M., Анастюк С.Д., Герасименко Н.И., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Звягинцева Т.Н. Полисахаридный и липидный состав бурой водоросли Laminaria gurjanovae //Биоорг. химия. 2007. V. 33. Р. 96-107.

56. Zhu W., Ooi V.E.C., Chan P.K.S., Ang P.O. Isolation and charactarization of sulfated polysaccharide from the brown alga Sargassum patens and determination of its anti-herpes activity // Jr. Biochem. Cell Biol. 2003. V. 81. P. 25-33.

57. Nishino Т., Takabe Y., Nagumo T. Isolation and partial charactarization of a noval P-D-galactan sulfate from the brown seaweed Laminaria angustata var. longissima II Carbohydr. Polym. 1994. V. 23. P. 165-173.

58. Dillon Т., Kristensen K., O'hEochdha C. Seed mucilage of Ascophyllum nodosum (L.) //, . Proc. Roy. Irish. Acad. 1953. V. 55B. P. 189-194.

59. Ozawa Т., Yamamoto J., Yamagishi Т., Yamazaki N., Nishizawa M. Two fucoidans in the holdfast of cultivated Laminaria japonica //J. Nat. Med. 2006. V. 60. P. 236-239.

60. Berteau O., Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and overview of enzymes active toward this class of polysaccharide // Glycobiology. 2003. V. 13. N. 6. P. 29-40.

61. Li В., Lu F., Wei X., Zhao R. Fucoidan: Structure and Bioactivity // Molecules. 2008. V. 13. P. 1671-1695.

62. Mourao P.A.S. Us of Sulfated Fucans as Anticoagulant and Antithrombotic Agent: Future

63. Ушакова H.A., Морозевич Г.Е., Устюжанина H.E., Билан М.И., Усов А.И., Нифантьев Н.Э., Преображенская М.Е. Антикоагулянтная активность фукоиданов из бурых водорослей // Биомед. химия. 2008. Т. 54. № 5. С. 597-606.

64. Кузнецова Т.А., Беседнова Н.Н., Мамаев А.Н., Момот А.П., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Антикоагулянтная активность фукоидана из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens II Бюлл. эксп. биол. и мед. 2003. Т. 136. № 11. С. 532-534.

65. Yoon S.J., Pyun Y.R., Hwang J.K., Mourao P.A.S. A sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides has mainly heparin cofactor II-dependent anticoagulant activity // Carbohydr. Res. 2007. V. 342. P. 2326-2330.

66. Nishino Т., Nagumo T. Anticoagulant and antithrombin activities of oversulfated fucans // Carbohydr. Res. 1992. V. 229. P. 355-362.

67. Nishino Т., Nagumo T. Sugar constituents and blood-anticoagulant activities of fucose-containing sulfated polysaccharides in nine brown seaweed species // Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1987. V. 61. P. 361-363.

68. Dobashi K., Nishino Т., Fujihara M. Isolation and preliminary characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides with blood-anticoagulant activity from seaweed Hizikia fusiforme II Carbohydr. Res. 1989. V. 194. P. 315-320.

69. Nishino Т., Yokoyama G., Dobashi K. Isolation, purification and characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities // Carbohydr. Res. 1989. V. 186. P. 119-129.

70. Li В., Rui X.Z., Xin J.W. Anticoagulant activity of fucoidan from Hizikia fusiforme // Agro Food Ind. Hi-tech 2008. V. 19. P. 22-24.

71. Lasky L.A. Selectin-carbohydrate interactions and the initiation of the inflammatory response // Annu. Rev. Biochem 1995. V. 64. P. 113-139.

72. Maruyama Н., Tamauchi Н., Lizuka М., Nakano Т. The role of NK cells in antitumor activity of dietary fucoidan from Undaria pinnatifida sporophylls (Mekabu) // Planta Med 2006. V. 72. P. 1415-1417.

73. Philchenkov A., Zavelevich M., Imbs Т., Zvyagintseva Т., Zaporozhets T. Sensitization of• jhuman malignant lymphoid cells to etoposide by fucoidan, a brown seaweed polysaccharide //Exp. Oncol. 2007. V. 29.N. 3. P. 181-185.

74. Haneji К., Matsuda Т., Tomita М., Kawakami Н., Ohshiro К., Uchihara J., Masuda М., Takasu N., Tanaka Y., Ohta Т., Mori N. Fucoidan extracted from Cladosiphon okamuranus

75. Tokida induces apoptosis of human T-Cell leukemia virus type 1-infected T-Cell lines and primary adult T-Cell leukemia cells // Nutrit. Cancer. 2005. V. 52. P. 189-201.

76. Liu J.M., Bignon J., Haroun-Bouhedja F., Bittoun P., Vassy J., Fermandjian S., Wdzicczak-Bakala J., Boisson-Vidal C. Inhibitory effect of fucoidan on the adhesion of adenocarcinoma cells to fibronectin // Anticancer Res. 2005. V. 25. P. 2129-2133.

77. Matsubara К., Xoe C., Zhao X., Mori M., Sungawara Т., Yirata T. Effects of middle molecular weight fucoidans on in vitro and ex vivo angiogenesis of endothelial cells // Int. J. Mol. Med. 2005. V. 15. P. 695-699.

78. Lee J.B., Hayashi K., Hashimoto M., Nakano Т., Hayashi T. Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu) // Chem. Pharm. Bull. 2004. V. 52. P. 10911094.

79. Hayashi K., Nakano Т., Hashimoto M., Kanekiyo K., Hayashi T. Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes simplex virus infection // Int. Immunopharmacol. 2008. V. 8. P. 109-116.

80. Nishino Т., Hayashi Т., Hayashi K. An antivirally active sulfated polysaccharide from Sargassum horneri (Turner) C. Agardh // Biol. Pharm. Bull. 1998. V. 21. P. 730-734.

81. Adhikaria U., Mateub C.G., Chattopadhyaya K.C., Pujolb A., Damonteb E.B., Ray B. Structure and antiviral activity of sulfated fucans from Stoechospermum marginatum II Phytochemistry. 2006. V. 67. P. 2474-2482.

82. Mandal P., Mateu C.G., Chattopadhyay K., Pujol C.A., Damonte E.B., Ray B. Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica II Antivir. Chem. Chemother. 2007. V. 18. P. 153-162.

83. Zhu W, Ooi V.E.C., Chan P.K.S., Ang P.O. Isolation and characterization of a sulfated polysaccharide from the brown alga and determination of its anti-herpes activity // J. Biochem. Cell Biol. 2003. V. 81. P. 25-33.

84. McClure M.O., Moore J.P., Blanc D.F., et. al. Investigations into the mechanism by which sulfated polysaccharides inhibit HIV infection in vitro // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1992. V. 8. P. 19-26.

85. Ш.Лапшина Л.А., Реунов А.В, Нагорская В.П., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М. Действие фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens на формирование ВТМ-специфических включений в клетках листьев табака // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 1.С. 1-4.

86. Hidari K.I.P.J., Takahashi N., Arihara M., Nagaoka M., Morita K., Suzuki T. Structure and anti-dengue virus activity of sulfated polysaccharide from a marine alga // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. V. 376. P. 91-94.

87. Zvyagintseva Т., Shevshenko N., Nazarova I., Scobun A., Luk'yanov P., Elyakova L. Inhibition of complement activation by water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds // Сотр. Biochem. Physiol. 2000. V. 126. P. 209-215.

88. Zhao X., Xue C.-H., Li B.-F. Study of antioxidant activities of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica II J. Appl. Phycol. 2008. V. 20. P. 431-436.

89. Xue C.-H., Fang Y., Lin H., Chen L., Li Z.-J., Deng D., Lu Ch.-X. Chemical characters and antioxidative properties of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica // J. Appl. Phycol. 2001. V. 13. P. 67-70.

90. Rocha De Sousa M.C., Marques C.T., Guerra Dore C.M., Ferreira Da Silva F.R., Oliveira Rocha H.A., Leite E.L. Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds // J. Appl. Phycol. 2007. V. 19. P. 153-160.

91. Ruperez P., Ahrazem O., Leal J.A. Potential antioxidant capacity of sulfates from the edible marine brown seaweed Fucus vesiculosus II J. Agr. Food Chem. 2002. V. 50. N. 4. P. 840845.

92. Shibata H., Kimura-Takagi I., Nagaoka M., Hashimoto S., Aiyama R., Iha M., Ueyama S., Yokokura T. Properties of fucoidan from Cladosiphon okamuranus Tokida in gastric mucosal protection // BioFactors. 2000. V. 11. P. 235-245.

93. Maruyama H., Tanaka M., Hashimoto M., Inoue M., Sasahara T. The suppressive effect of Mekabu fucoidan on an attachment of Cryptosporidium parvum oocysts to the intestinal epithelial cells in neonatal mice // Life Sci. 2007. V. 80. P. 775.

94. Percival E., Dowell R.H. Chemistry and Enzymology of Marine Algal Polysacharides. London: Acad. Press. 1967. 219 p.

95. Звягинцева Т.Н., Беседнова H.H., Елякова JI.А. Структура и иммунотропное действие 1,3; 1,6-р-0-глюканов. Владивосток: Дальнаука. 2002. 160 с.

96. Ki-Hoon Kim, Yea-Woon Kim, Han Bok Kim, Burm Jong Lee, Dong Seok Lee. Anti-apoptotic activity of laminarin polysaccharides and their enzymatically hydrolyzed oligosaccharides from Laminaria japonica II Biotechnol. Let. 2006. V. 28. P. 439-446.

97. Solov'eva T.F., Elyakova L.A., Zvyagintseva T.N., Yermak I.M. Polysaccharides from the Russia Pacific coast algae and their enzymatic transformation // J. Marine Technol. Soc. 1996. V. 30. N. 1. P. 35-39.

98. Патент РФ 2034026. Криопротектор животных клеток / Елякова JI.A., Лихацкая Г.Н., Звягинцева Т.Н., Аминин Д.Л. // БИ. № 12. 1995.

99. Клочкова Н.Г., Березовская В.А. Водоросли камчатского шельфа. Распространение, биология, химический состав. Владивосток: Дальнаука. 1997. 154 с.

100. Справочник по химическому составу и технологическим свойствам водорослей, беспозвоночных и морских млекопитающих / Ред. В.П.Быков. М.: Изд. ВНИРО. 1999. 262 с.

101. Усов А.И., Клочкова Н.Г. Бурые водоросли Камчатки как источник маннита // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. С. 1236-1240.

102. Podkorytova A.V. Chemical composition and exploitation of brown alga of the Far East Coast. European Meeting: Marine Phytobenthos Stadies and thear Application / Taranto. 1990. P. 85.

103. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. М.: Пищ. пром-ность. 1972. 355с.

104. Подкорытова А.В. Комплексное использование ламинарии японской, культивируемой в двухгодичном цикле // 4-е Всесоюзное совещ. по научно-техн. проблемам марикультуры. Владивосток: ТИНРО. 1983. С. 132-133.

105. Подкорытова А.В. Динамика некоторых свободных аминокислот ламинарии японской в процессе роста и созревания репродуктивной ткани // Исследования по технологиям новых объектов промысла. Владивосток: ТИНРО. 1980. С. 53-57

106. Duval J., Berkaloff C., Jupin H. Photosynthetic properties of plastids isolated from macrophytic brown seaweeds // Physiol. Veg. 1983. V. 21. P. 1145-1157.

107. Li R., Brawley S.H., Close T.J. Proteins immunologically related to dehydrins in fucoid algae // J. Phycology. 1998. V. 34. P. 642-650.

108. Yermakova S.P., Sova V.V, Zvyagintseva T.N. Brown seaweed protein as an inhibitor of marine mollusk endo-(l->3)-p-D-glucanases // Carbohydr. Res. 2002. V. 337. P. 229-237.

109. Hayashi K., Kida S., Kato K., Yamada M. Component fatty acids of acetone-soluble lipids of 17 species of marine benthic algae // Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 1974. V. 40. N. 6. P. 609617.

110. Nelson M.M., Phleger C.F., Nichols P.D. Seasonal lipid composition in macroalgae of the northeastern Pacific Ocean // Bot. Marina. 2002. Y. 45. N. 1. P. 58-65.

111. Khotimchenko S.V., Vaskovsky V.E., Titlyanova T.V. Fatty acids of marine algae from the Pacific coast of North California // Bot. Marina. 2002. V. 45. N. 1. P. 17-22.

112. Honya M., Kinoshita Т., Ishikawa M., Mori H., Nisizawa K. Seasonal variation in the lipid content of cultured Laminaria japonica: Fatty acids, sterols, beta-carotine and tocopherol // J. Appl. Phycol. 1994. V. 6. N. 1. P. 25-29.

113. Герасименко Н.И., Бусарова Н.Г., Моисеенко О.П. Возрастные изменения в содержании липидов, жирных кислот и пигментов у бурой водоросли Costaria costata II Физиология растений. 2009. Т. 56. № 6. С. 1-8.

114. Jones A.L., Harwood J.L. Lipid composition of the brown algae Fucus vesiculosus and Ascophyllum nodosum II Phytochemistry. 1992. V. 31. N. 10. P. 3397-3403.

115. Dembitsky V.M., Rozentsvet O.A., Pechenkina E.E. Glycolipids, phospholipids and fatty acids of brown algae species // Phytochemistry. 1990. V. 29. N. 11. P. 3417-3421.

116. Takagi Т., Asahi M., Itabashi Y. Fatty acid composition of twelve algae from Japanese waters // Yukagaku. 1985. V. 34. N. 12. P. 1008-1012.

117. Хотимченко C.B., Светашев В.И. Сравнительное исследование жирных кислот макрофитов Японского моря // Биология моря. 1983. № 5. С. 45-50.

118. Xiancui Li, Xiao Fan, Lijun Han, Qingxiang Lou. Fatty acids of some algae from the Bohai Sea//Phytochemistry. 2002. V. 59. P. 157-161.

119. Freile-Pelegrin Y., Morales J.L. Antibacterial Activity in Marine Algae from the Coast of Yucatan, Mexico // Bot. Marina. 2004. V. 47. P. 140-146.

120. Chajes V., Bougnoux P., Omega-6/omega-3 polyunsaturated fatty acid ratio and cancer // W. Rev. Nutr. Diet. 2003. V. 92. P. 133-151.

121. Colombo M.L., Rise P., Giavarini F., Angelis L.De, Galli C., Bolis C.L. Marine macroalgae as sources of polyunsaturated fatty acids // Plant Foods Hum. Nutr. 2006. V. 61. P. 67-72.

122. Das U. Beneficial effect(s) of n-3 fatty acids in cardiovascular diseases: but, why and how? // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2000. V. 63. N. 6. P. 351-362.

123. Еляков Г.Б., Стоник B.A. Стероиды морских организмов. М.: Наука. 1988. 208 с.

124. Patterson G.W., Karlander Е.Р. Terminal steps in biosynthesis of plant sterols // Plant Physiol. 1968. V. 40. N. 1. P.46.

125. Jensen A. Present and future needs for algae and algal products // Hydrobiologia. 1993. V. 260/261. P. 15-23.

126. Турин И.С., Ажгихин И.С. Биологически активные вещества гидробионтов -источник новых лекарств и препаратов. М.: Наука. 1981. 186 с.

127. Lee Y.S., Shin К.Н., Kim В.-К., Lee S. Anti-diabetic activities of fucosterol from Pelvetia siliquosa И Arch. Pharmacal. Res. 2004. V. 27. P. 1120-1122.

128. Ostlund R. E. Phytosterols in human nutrition // Ann. Rev. Nutr. 2002. V. 22. P. 533-549.

129. Jeffrey S.W. Report of green algal pigments in the Central North Pacific Ocean // Mar. Biology. 1976. V. 37. P. 33-37.

130. Smith B.M., Melis A. Photosystem stoichiometry and excitation distribution in chloroplasts from surface and minus 20 meter blades of Macrocystis pyrifera, the gigant kelp // Plant Physiology. 1987. V. 84. P. 1325-1330.

131. Яценко Г.К. Кислородный обмен и фотосинтетические пигменты черноморской цитозиры // Физиология растений. 1963. Т. 10. № 6. С. 661-666.

132. Tarakhovskaya E.R., Maslov Y.I. Description of the photosynthetic apparatus of Fucus vesiculosus L. in early embrogenesis // Biology Bull. 2005. V. 32. P. 456-460.

133. El-Nakeeb M.A., Jousef R.T. Antimicrobial activity of sodium cooper chlorophyllin // Pharmazie. 1974. V. 29. P. 48-50.

134. Рубис А.И. Хлорофилл и применение его препаратов в медицине и сельском хозяйстве. Владивосток. 1976. 104 с.

135. Лукьяненко В.И., Фрагина А.И., Черноморский С.А. Антимикробные, регенеративные и дезодорирующие свойства препаратов хлорофилла // Стоматология. 1973. № 2. С. 95-97.

136. Nomura Т., Kikuchi М., Kubodera A., Kawakami Y. Proton-donative antioxidant activity of fucoxanthin with l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. V. 42. P. 361-370.

137. Yan X.J., Chuda Y., Suzuki M., Nagata T. Fucoxanthin as the major antioxidant in Hizikia fusiformis, a common edible seaweed // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. V. 63. N. 3. P. 605-607.i

138. Shiratori K., Ohgami K., Ilieva I., Jin X.-H., Koyama Y., Miyashita K., Yoshida K., Kase S., Ohno S. Effects of fucoxanthin on lipopolysaccharide-induced inflammation in vitro and in vivo // Exp. Eye Res. 2005. V. 81. P. 422-428.

139. Nishino H., Tsushima M., Matsuno Т., Tanaka Y., Okuzumi J., Murakoshi M. Antineoplastic effect of halocynthiaxanthin, a metabolite of fucoxanthin // Anti-Cancer Drugs. 1992. V. 3. P. 493-497.

140. Kotake-Nara E., Asai A., Nagao A. Neoxanthin and fucoxanthin induce apoptosis in PC-3 human prostate cancer cells // Cancer Let. 2005. V. 220. P. 75-84.

141. Kotake-Nara E., Kushiro M., Zhang H., Sugawara Т., Miyashita K., Nagao A. Carotenoids affect proliferation of human prostate cancer cells // J. Nutr. 2001. V. 131. P. 3303-3306.

142. Maeda H., Hosokawa M., Sashima Т., Takahashi N., Kawada Т., Miyashita K. Fucoxanthin and its metabolite, fucoxanthinol, suppress adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells // Intern. J. Molec. Medicine. 2006. V. 18. P. 147-152.

143. Maeda H., Hosokawa M., Sashima Т., Funayama K., Miyashita K. Fucoxanthin from edible seaweed, Undaria pinnatifida, shows antiobesity effect through UCP1 expression in white adipose tissues // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 332. P. 392-397.

144. Усов А.И., Чижов O.C. Химические исследования водорослей. М.: Наука. 1988. 48 с. (Новое в жизни, науке, технике. Серия Химия. №5).

145. McInnes A.G., Ragan М.А., Smith D.G., Walter J.A. High-molecular weight phloroglucinol-based tannins from brown algae: structural variants // Hydrobiologia 1984. V. 116/117. P. 597-602.

146. Glombitza K.W., Keusgen M. Fuhalols and dehydroxyfuhalols from the brown alga Sargassum spinuligerum II Phytochemistry. 1995. V. 38. P. 987-995.

147. Pereira R.C., Cavalcanti D.N.; Teixeira V.L. Effects of secondary metabolites from tropical Brazilian brown alga Dictyota menstrualis on the amphipod Parhyale hawaiensis // Mar. Ecol. Prog. Ser. 2000. V. 205. P. 95-100.

148. Hellio C., Bremer G., Pons A., Le Gal Y, Bourgougnon N. Ingibition of the development of microorganisms (bacteria and fungi) by extracts of marine algae from Brittany (France) // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000b. V. 54. P. 543-549.

149. Yolanda Freile-Pelegrin, Morales J.L. Antibacterial activity in marine algae from the coast of Yucatan. Mexico // Bot. Marina. 2004. V. 47. P. 140-146.

150. Kubanek J., Jensen P.R., Keifer P.A., Sullards M.C., Collins D.O., Fenical W. Seaweed resistance to microbial attack: a targeted chemical defense against marine fungi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 6916-6921.

151. Barbosa J.P., Teixeira V.L., Pereira R.C. A dolabellant diterpene from the brown alga Dictyota pfaffii as chemical defense against herbivores //Bot. Marina. 2004. V. 47. P. 147151.

152. Geiselman J.A., McConnell O.J. Poliphenol in brown algae Fucus vesiculosus and Ascophyllum nodosum: chemical defenses against the marine herbivorous snail, Littorina littorea // J. Chem. Ecol. 1981. V. 7. P. 1115-1133.

153. Pavia H., Toth G.B. Inducible chemical resistance to herbivory in the brown seaweed Ascophyllum nodosum//Ecology. 2000. V. 81. P. 3212-3225.

154. Ragan M.A., Glombitza K.W. Phlorotannins, brown algal polyphenols // Prog. Phicol. Res. 1986.V. 4. P. 129-241.

155. Jennings J.G., Steinberg P.D. Phlorotannins versus other factors affecting epiphyte abundance on the kelp Ecklonia radiate II Oecologia 1997. V. 109. P. 461-473.

156. Hwang H., Chen Т., Nines R.G., Shin H.C., Stoner G.D. Photochemoprevention of UVB-induced skin carcinogenesis in SKH-1 mice by brown algae polyphenols // Int. J. Cancer. 2006. V. 119. P. 2742-49.

157. Sandsdalen E., Haug Т., Stensvag K., Styrvold O.B. The antibacterial effect of a polyhydroxylated fucophlorethol from the marine brown alga Fucus vesiculosus // W. J. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 19. P. 777-782.

158. Nakamura Т., Nagayama K., Uchida K., Tanaka R. Antioxidant activity of phlorotannins from the brown alga Eisenia bicyclis II Fish. Sci. 1996. V. 62. N. 6. P. 923-926.

159. Xiaojun Y., Xiancui L., Chengxu Z., Xiao F. Prevention of fish oil rancidity by phlorotannins from Sargassum kjellmanianum II J. Appl. Phycol. 1996. V. 8. P. 201-203.

160. Cerantola S., Breton F., Ar Gall E. and Deslandes E. Co-occurrence and antioxidant activities of fucol and fucophlorethol classes of polymeric phenols in Fucus spiralis II Bot. Marina. 2006. V. 49. P. 347-351.

161. Kim Y.C., An R.B., Yoon N.Y., Choi J.S. Hepatoprotective Constituents of the Edible Brown alga Ecklonia stolonifera on Tacrine-induced Cytotoxicity in Hep G2 Cells // Arch. Pharm Res. 2005. V. 28. N. 12. P. 1376-1380.

162. Faulkner D.J. Marin natural products metabolites of marina algae and herbivorous marine mollusks //Nat. Prod. Reports. 1984. V. 1. P. 251-280.

163. Kikuchi Т., Yokoi Т., Nakazawa S. et al. Structure and absolute configuration of sargatriol, a new isoprenoid chromenol from a brown alga Sargassum tortile C. Agardh. // Chem. Pharm. Bull. 1983. V. 31. P. 106-113.

164. Ishitsuka M., Kusumi Т., Nomura Y., Konno Т., Kakisawa H. New geranylgeranylbenzoquinone derivatives from Sargassum tortile II Chem. Lett. 1979. P. 1269-1272.

165. Finch P., Percival E., Rhaman M.A. Carbohydrates of the antarcnic brown seaweeds Ascoseira mirabilis II Phytochemistry. 1986. V. 25. P. 443-447.

166. Облучинская Е.Д. Комплексная технология переработки водорослей рода Fucus // Материалы Всероссийского семинара «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». Барнаул. 2002. С. 252-254.

167. Пономарев В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья. М.: Медицина. 1976. 204 с.

168. Percival Е.Е., Venegas J., Weigel H. Carbohydrates of the brown seaweed Lessonia nigrescens II Phytochemistry. 1983. V. 22. P. 1429-1433.

169. Облучинская Е.Д., Минина С.А. Совершенствование способа получения экстракта из фукусовых водорослей // Хим.фарм. журн. 2004. Т. 38. № 6. С. 36-39.

170. Main A. J., Percival Е. Carbohydrates of the brown seaweeds Himanthalia lorea, Bifurcaria bijilrcata, and Padina pavonia. Part I. Extraction and fractionation // Carohydr. Res. 1973. V. 26. P.133-137.

171. Усов А.И., Смирнова Г.П., Клочкова Н.Г. Полисахариды водорослей 55. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Камчатки // Биоорг. химия. 2001. Т. 27. № 6. С. 444-448.

172. Патент РФ 2240816. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением препаратов для медицины и косметологии / Шевченко Н.М., Имбс Т.И., Урванцева A.M., Кусайкин М.И., Корниенко В.Г., Звягинцева Т.Н., Елякова J1.A. // БИ № 33. 2004.

173. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B., Isakov V.V., Scobun A.S., Sundukova E.V., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds // Carbhydr. Res. 1999. V. 322. P. 32-39.

174. Sagawa T.I.H., Kato I. Fucoidan as functional foodstuff. Structure and biological potency // Jap. J. Phycol. 2003. V. 51. P. 19-25.

175. WO 97 47 208 (CL. A21D2/18) Foods or drinks / Umeda Y., Kihara H., Ikai K., Kato I., (Takara Shuzo Co., Ltd).18.12.1997.

176. Патент РФ 2135518. Способ получения водорастворимых полисахаридов бурых водорослей / Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М., Попивнич И.Б. // БИ. № 23. 1999.

177. Патент РФ 2302429. Способ получения фукоидана из ламинарии / Врищ Э.А., Ковалев Н.Н., Эпштейн JI.M., Якуш Е.В., Беседнова Н.Н., Артюков А.А., Кузнецова Т.А., Запорожец Т.С. // БИ. № 19. 2007.

178. Патент US № 5948405 (A). Fucans with low molecular weight having anticoagulant, antitrombinic and antitrombotic activity / Cedro A., Porto R., Cattaneo F., Trendo F., Ferro L., Lanzarotti E. (Crinos industria farmaco IT.). 07.09.1999.

179. Уинтон Ф.У., Лосон Т.Б. Производство продуктов питания из океанических ресурсов. Т. 2. М.: ВО «Агропромиздат». 1989. 410 с.

180. Patent JP 60186503 A. Preparation of high polymer consisting essentially of alginate / Asahi Keisuke. (FUJI CHEM IND Co Ltd. JP.). 6.03.1984.

181. Патент РФ 2197249. Способ получения медицинского очищенного альгината натрия / Кайшева Н.Ш., Компанцева В.А. II БИ. №3. 2003.

182. Кизеветтер И.В., Суховеева М.В., Шмелькова Л.П. Промысловые морские водоросли и травы дальневосточных морей. М.: Легкая и пищевая пром-сть. 1981. 112 с.

183. Пат. Япония 910926. Способ получения маннита, йода, хлоридов натрия и калия, как побочных продуктов при получении альгината натрия: № 3-15-68 МКИ 5 A 23L1/337. Р.Ж.И.С.М. 1993. № 5. С. 34.

184. Патент РФ 2360545. Способ переработки бурых водорослей / Герасименко Н.И., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н., Козловская Э.П. // БИ. № 19. 2009.

185. Патент РФ 2233104. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением йодсодержащих и полисахаридных продуктов / Аминина Н.М., Вишневская Т.И., Гурулева О.Н., Подкорытова А.В. // БИ. № 18. 2004.

186. Патент РФ 2337571. Способ комплексной переработки фукосовых водорослей (варианты) / Облучинская Е.Д. // БИ. №31. 2008.

187. Усов А.И., Кошелева Е.А., Яковлев А.П. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей японского моря // Биоорг. химия. 1989. Т. 11. № 6. С. 830-836.

188. Подкорытова А.В. Обоснование и разработка технологии ионозависимых полисахаридов при комплексной переработке морских водорослей: Дис. д-ра техн. наук. 1996. Москва. ВНИРО. 344 с.

189. Maruyama Н., Tamauchi Н., Hashimoto М., Nakano Т. Antitumor activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from sporophylls of Undaria pinnatifida II In Vivo. 2003. V. 17. N.3.P. 245-249.

190. Skriptsova A., Khomenko V., Isakov V. Seasonal changes in growth rate, morphology and alginate content in Undaria pinnatifida at the northern limit in the Sea of Japan (Russia) // J. Appl. Phycol. 2004. V. 16. P. 17-21.

191. Jothisaraswathi S., Babu В., Rengasamy R. Seasonal studies on alginate and its composition II: Turbinaria conoides (J.Ag.) Kutz. (Fucales, Phaeophyceae) // J. Appl Phycol. 2006. V. 18. P. 161-166.

192. Honya M., Mori H., Anzai M., Araki Y., Nisizawa K. Monthly changes in the content of fucans, their constituent sugars and sulphate in cultured Laminaria japonica // Hydrobiologia. 1999. V. 398/399. P. 411-416.

193. Пржеменецкая (Макиенко) В.Ф. Costaria costata (Turn.) Saund. (Phaeophyta, Laminariales) в дальневосточных морях // Комаровские чтения. Владивосток. 1988. Вып. 35. С. 36-51.

194. Grasdalen Н., Larsen В., Smidsrad О. I3C-n.m.r. stadies of monomeric composition and sequence in alginate // Carbohydr. Res. 1981. V. 89. P. 179-191.

195. Indergaard M., Skjak-Breek G., Jensen A. Stadies on influence of nutrience on the composition and structure of alginate in Laminaria saccharina (L.) Lamour. (Laminariales, Phaeophyceae) // Bot. Marina.11990. V. 33. P. 277-288.

196. Nagumo Т., Nishino T. Fucan sulfates and their anticoagulant activities. In: Dumitriu, S. (Ed.). Polysaccharides in medicinal applications. New-York-Basel-Hong-Kong. 1996. P. 545-574.

197. Звягинцева Т.Н., Широкова Н.И., Елякова JI.A. Структуры ламинаранов из некоторых бурых водорослей (Россия) // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. № 12. С. 1349-1358.

198. Mori Н., Kamei Н., Nishide Е., Nishizawa К. Sugar constituents of some sulfated polysaccharides from the sporophylls of wakame (Undaria pinnatifida) and their biological activities // Mar. Algae. Pharm. Sci. 1982. V. 2. P. 109-115.

199. Nishino Т., Nagumo T. Change in the anticoagulant activity and comparison of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome during refrigerated storage of the fronds // Bot. Marina. 1991. V. 34. P. 387-389.

200. Marais M-F., Joseleau J-P. A fucoidan fraction from Ascophyllum nodosum II Carbohydr. Res. 2001. V. 336. P. 155-159.

201. Thompson K.D., Dragar C. Antiviral activity of Undaria pinnatifida against herpes simplex virus // Phytother. Res. 2004. V. 18. N. 7. P. 551-555.

202. Speransky V.V., Brawley S.H., McCully M.E. Ion fluxes and modification of the extracellular matrix during gamete release in fucoid algae // J. Phycol. 2001. V. 37. N. 4. P. 555-573.

203. Skriptsova A.V., Shevchenko N.M., Zvyagintseva T.N., Imbs T.I. Montly changes in the content and monosaccharide composition of fucoidan from Undaria pinnatifida (Laminariales, Phaeophyta) I I J. Appl. Phycol. 2009. DOI 10.1007/s 10811-009-9438-5.

204. Cann S.A., van Netten J.P., van Netten C. Hypothesis: Iodine, selenium and the development of breast cancer // Cancer. Causes. Contr. 2000. V. 11. P. 121-127.

205. Freile-Pelegnn Y. and Morales J.L. Antibacterial activity in marine algae from the coast of Yucatan, Mexico // Bot. Marina. 2004. V. 47. P. 140-146.v. i , ' ' * . •

206. Engel S., Puglisi M.P., Jensen P.R., Fenical W. Antimicrobial activities of extracts from tropical Atlantic marine plants against marine pathogens and saprophytes // Mar. Biol. 2006. V. 149. P. 991-1002.

207. Lim S.N., Cheung P.C.K., Ooi V.E.C., Ang P.O. Evaluation of antioxidative activity of extracts from a brown seaweed, Sargassum siliquastrum // J. Agric. Food Chem. 2002. V. 50. P. 3862-3866

208. Hudson J.B., Kim J.H., Lee M.K., DeWreede R.E., Hong Y.K. Antiviral compounds inч \extracts of Korean seaweeds: Evidence for multiple activities I I J. Appl. Phycol. 1999. V. 10. P. 427-434.

209. Патент РФ №2034560. Средство для профилактики рака «Кламин» / Некрасова В.Б., Никитина Т.В., Курныгина В.Т., Фрагина А.И., Беспалов В.Г., Вайнштейн В.А., Иванова В.В. // БИ. № 13. 1995г.• I

210. Mooney P.A., Van Staden J. Algae and cytokinins // J. Plant Physiol. 1986. V. 123. P. 1-21.

211. Verkleji F.N. Seaweed extracts in agriculture and horticulture: a review // Biol. Agric. Hortic. 1992. V. 8. P. 309-324.

212. Саенко Г.Н. Металлы и галогены в морских организмах. М.: Наука. 1992. 200 с.

213. Hou X., Yan X., Chai С. Chemical species of iodine in some seaweed. II. Iodinebound biological macromolecules // J. Radioanal. Nucl. Chem. 2000. V. 245. N. 3. P. 461-467.

214. Кизеветтер И.В. Биохимия сырья водного происхождения. М: Пищ. пром-сть. 1973. 424 с.

215. Matsuyama К., Abe К., Kaneko Т. Seasonal variation in chemistry components from Laminaria religiosa // Copyu. Jap. J. Phycol. 1982. V. 30. N. 2. P. 134-138.

216. Mori H., Nisizawa K., Sugar constituents of sulfated polysaccharides from the fronds of Sargassum riggoldianum II Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1982. V. 48. P. 981-988.

217. Thomas M., Albersheim J., Albersheim P. A Gas Chromatographic Method for the Determination of Aldose and Uronic Acid Constitulents of Plant Cell Wall Polysaccharides // Plant Physiol. 1972. V. 49. P. 926-936.

218. Nishino Т., Nishioka C., Ura H., Nagumo T. Isolation and partial characterization of a novel amino sugar-containing fucan sulfate from commercial Fucus vesiculosus fucoidan // Carbohydr! Res. 1994. V. 255. P. 213-224.

219. Fitton J.H. Fucoidans: Healthful saccharides from the sea II GlycoSci. Nutr. 2005. V. 6. N. l.P. 1-6.

220. Black W.A.P., Dewar E.D., Woodward F.N. Manufacture of algal chemicals. IV. Laboratory-scale isolation of fucoidin from brown marine algae // J. Sci. Food Agric. 1952. V. 3. P. 122-129.

221. Усов А.И., Чижов А.О. Полисахариды водорослей. Углеводный состав бурой водоросли Chorda filum II Биоорган, химия. 1989. Т. 15. № 2. С. 208-216.

222. Плюснин А.Н., Тихонова JI.A. Кинетика набухания лекарственного сырья растительного происхождения. Набухание горечавки крупнолистной в воде и водно-спиртовой смеси // Хим. фарм. ж. 1996. № 2. С. 39-41.

223. Гурулева О.Н. Обоснование технологии фукоидана при комплексной, переработке бурых водорослей дальневосточных морей. Автореферат диссертации канд. техн. наук. Владивосток: ТИНРО-Центр. 2006. 23 с.

224. Минина С.А., Громова Н.А. Теория и аппаратурное оформление процесса экстракции. Л.: ЛХФИ. 1985. 39 с.-118283. Максимов В.Н. Многофакторный эксперимент в биологии. М.: Изд. Московского университета. 1980. 33 с.

225. W02005/014657 Method of processing seaweed / Shevchenko N., Imbs Т., Urvantseva A., Kusaikin M., Kornienko V., Zvyagintseva Т., Eleakova L. // International Bureau WIPO. 2005.;

226. Grasdalen H., Larsen В., Smidsrod O. A P.M.R. study of the composition and sequence of urinate residues in alginates // Carbohydr. Res. 1979. V. 68. P. 23-31.

227. Grasdalen H. High-field, 'H-n.m.r. spectroscopy of alginate: sequential structure and linkage conformations // Carbohydr. Res. 1983. V. 118. P. 255-260.. t

228. Dodgson K.S. Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymatic and non-enzymatic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters // Biochem. 1961. V. 78. N. 2. P. 312-319.

229. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Reiber P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

230. Настойки, экстракты, эликсиры и их стандартизация / Ред. Багирова В.Л., Северцев В .А. СПб: СпецЛит. 2001. 223 с.

231. Vaskovsky V.E., Isay S.V. Quantitative determination of formaldehyde liberated with periodate oxidation//Analyt. Biochem. 1969. V. 30. P. 25-31.

232. Кизеветтер И.В., Грюнер B.C., Евтушенко B.A Переработка морских водорослей и других промысловых водных растений. М.: Пищ. пром-ность. 1967. 416 с.

233. Хавезов И., Цалев Д. Атомно-абсорбционный анализ. Л.: Химия. 1983. 144 с.

234. Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.I. Protein measurement with the Folin phenol reagent //J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

235. Santalova E.A., Makarieva T.N., Gorshkova I.A., Dmitrenok A.S., Krasokhin V.B., Stonik V.A. Sterols from six marine sponges // Biochem. Systematics and Ecology. 2004. V. 32. P. 153-167.

236. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Агрохимиздат. 1985. 351 с.ш1.-'."I1. СВИДЕТЕЛЬСТВОо государственной регистрации7799.23.3.У.739.1 061. Ol30.01.2006 Г,

237. Срок действия свидетельства о государственной регистрации ушщ^^к^яш^ весь импортной продукции ШРя^ЧМв .#«1г И 3 £& ли*, V»? '

238. Руководитель (заместитель руководителя) Федеральной службы по надзору в сфере зашиты нрав потреби гелей и благополучия человека00256941. ЩМ1. М. П.27994. Москва, Вадковский пер., 18/201. ЛЛО ^.ряии

239. У 9284-067^026981 70-2006); Тихоокбажжий hhci итуг

240. Лриморский край, Хасансхий ^йон, •••

241. АЙ)'. Российская Федерация; для йспоп^зйвания 6!" :тве„напитк<)в, мясных,зё^цодогицески активных добёвбк к лише./: Щ it?

242. Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю.

243. САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

244. СООТВЕТСТВУЮТ j^yCPPjF^f^QWW) государственным санитарно эпидемиологичес»Лш^1р^й^м и нормативам (ненужное зачеркнуть, указать полное наименование санитарных правил)1. ЧЕЛОВЕКА

245. Настоящим санитарно-эпидемиологическим заключением удостоверяется что требования, установленные в проектной документации {перечислить рассмотренные документы, указать наименование и адрес орг анизации-разработчика):

246. ТУ 9284-068-02698170-2007 «ФУКОЛАМ-Э Экстракт бурой водоросли жидкий» (взамен ТУ 9284-040-02698170-2007) Разработчик Тихоокеанский институт биоорганической химии 690022, Приморский край, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостоку, 159

247. Основанием для признания представленных документов соответствующими (нет соответствующими) государственным санитарно-эпидемиологическим правилам и нормативам являются (перечислить рассмотренные документы):

248. Главный государственный санитарный врач (заместитель главного государственного санитарного врача)

249. Формат А4. Блачк Срок хранения 5 лет.532024

250. ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПС) НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ1307.2007 г.25.ПЦ.01.744.Т.000842.07.07