Исследование структуры ламинаранов - резерных глюканов бурых водорослей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени Н.Д.ЗЕЛИНСКОГО

Р Г О /■'

I' I и I-.; •

.' , ■ - • ■ , На правах рукописи

УДК 582.272:547.548.6

ЧИЖОВ Александр Олегович

1сследование структуры ламинаранов — резервных глюканов бурых водорослей

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1993

Работа выполнена в лаборатории растительных полисахарид Института органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор А.И.УСОВ.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Э.Е.НИФАНТЬЕВ, доктор химических наук, профессор Б.А.ДМИТРИЕВ.

Ведущая организация: А/0 "Биотехнология" (бывш. ВНИИ биотехнологии).

Зашита диссертации состоится "//" уфМ, 199^ г. в 1000 на заседании специализированного совета К 002.62.02 по присуждению кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН, 117913, Москва, Ленинский проспект, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН.

Автореферат разослан "Л" ьаглфя- 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

Н.Я.ГРИГОРЬЕВА

Актуальность проблемы. Ламинараны - внутриклеточные резервные писаны бурых водорослей, - являются низкомолекулярными аналогами -(1-3),р-(1-6)-глюканов грибов, обладающих иммуномодулирующей ак-авностью и используемых в качестве' противоопухолевых препаратов.■ втивные и сульфатированйые: ламинараны в опытах на мышах in vivo нижают. вязкость крови, стимулируют фагоцитоз и снижают содержание олестеринав крови; сульфатированный ламинаран обладает антикоагу-янтным действием, сульфатированные ламинариолигосахариды подавляют «змнокение вируса СПИД. Для нативного-ламинарана и (3-(1-3) -6)-'люкорлигосахаридов обнаружена выраженная активность элиситора фито-шексинов.'Таким образом, исследование структуры ламинаранов с ис-гольаованием современных физико-химических методов исследования с 1елъ» поиска новых, потенциально биологически активных представи-гелей этого класса является актуальней.задачей.

Настоящая работа представляет собой часть комплексного иссле-цования структуры полисахаридов морских водорослей, проводимой в Ла-5оратории растительных полисахаридов ИОХ РАН. . .

Цель работы. Цель данной работы заключается в выявлении закономерностей, определяющих структуру ламинаранов, для чего нами было проведено выделение и исследование детальной структуры ламинаранов из семи видов бурых водорослей (Chorda fllum, laminaria cichorloides. L.bongprdiana, Sphaerotrlchla divárlcata, Alarla angosta, Cy'stoseira barbota, C. crlntta), отличающихся таксономическим положением, местообитанием и содержанием ламинаранов. С целью выявления возмогших путей биосинтеза ламинарана было предпринято выделение и исследование олито-р-Б-глюкопиранозидов маннита из того же источника. С этой же целью нами проведена разработка эффективной методики разделения М- и G-цепей .ламинаранов и сравнительное изучение и* строения.

Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен нсеий

- г -

способ оценки содержания ламинаранов в биомассе бурых водорослей м< тодом ГЖХ. '

Из бурой водоросли СГюгйз. /Пит выделен ламинаран необычно] строения, содержащий разветвленные молекулы с (3-(1-3)- и р— (1—6 связями между остатками Б-глюкоциранозы. М-цепи этого ламинара] имеют в своем составе как £-(1-1)-, так и |3-(1-1),р-(1-б)-бис-глик< зилированные остатки маннита - ранее 'неизвестный для ламинараш структурный элемент. Ламинараны из прочих видов водорослей сход между собой и содержат цепи из (3-(1-3)-связанных остатков глюкопир: нозы с небольшим количеством (1-6)-связей и разветвлений. Подтвер: ден прежний вывод об отсутствии закономерной сеязи между таксоном] ческим положением бурой, водоросли и структурой соответствующего лш нарана. ■

Впервые создан эффективный метод разделения М- и О-цепей ламт ранов,основанный на восстановительном аминировании О-цепей по реам с 2-аминопиридином и диметиламин-бораном с последующим разделением катионите сферой Б-ЮОО; 1фоведена характеристика М- и О-цепей , тре-х образцов ламинаранов» (1ш1паг1а ЬурегЬагеа, Ъ. с1сПог1о1& ОюпЗа /Иит), в результате чего впервые продемонстрирована структ; ная близость М- и О-цёпей. '

Мз водоросли (Яюгва /Пыл выделено пять олито-р-Б-глюкопирано-зидов маннита (из них три - ранее неизвестных), которые по своем: строению соответствуют фрагментам структуры М-цепей ее ламинарана Отдельные представители этого набора олигосахаридов обнаружены и : ■других водорослях, хотя в других случаях прямой корреляции межд структурами олигосахаридов и ламинаранов не наблюдалось.'

Выделенные и охарактеризованные ламинараны и олиго-р-В-глюкоп ранозилы маннита могут быть использованы для определения их имму» модулирующей и злкситорной активности.

Апробация работы. Результата работы были представлены на Конференции молодых ученых ИОХ РАН (1991 ■т..) и на конкурсе на лучшую работу ИОХ РАН (1.993 г.),.

Публикации. По теме'диссертации имеется 4 публикации. Структура и объем работы. Диссертация состоит из ВЕеденля, литературного обзора, посвяденного анализу, -выделения и исследова-шш структуры ламинаранов, обсуждения результатов, эксперженталь-кой.части, еыеодое и приложения. Работа изложена на стр..

содержит 9 рис., 13 табл. Библиография - 125 ссылок.

СОДЕРКШЕ РАБОТЫ. 1. Определение содержания лашшаранов в биомассе бурше водорослей. Выделение ламинаранов из биомассы. Для поиска новых источников ламвнаравов необхода', преете;; и с-кстрый метод определения их наличия и сценки их количества в сиг-масс0 ЕодсрослеС. Предложенный нами способ основан ка определении глхкезы ь гидролизате биомассы методом ГНХ в виде ацетата глг.'хск:-нктрклв с внутренним сганлзртом. Навеску внутреннего стандарта -.ли -инозита; предварительно прибавляют к. навеске, биомассы. Гидролиз целесообразно проЕодигь 2Н трифторуксусной-кислотой (2ГА, 6-5 ч,\2д'-,. При действии НБ?СЕ'НС1 в пиридине восстанавливающие сахара дзют ск-сгош (альдктоды и инозит в. эту реакцию не вступают;. При последующе!.-. ацетилпронаник уксусным ангидридом они превращаются , в ацетаты аль-дононитрклоь, альдитолы при ацетилировании дают ссстветстЕухсие-тЯх— таты. Таким образом, предложенный способ открывает еозкзекость сц'--еить содержание не только лампнарвна (б Биде пектаацетата глххокг-китрила), но- и фукоидакоЕ (е Еиде тетраацетата фукокошггрилг:; и ман-нита Т: г.ид?' его гексаацетата), что Еанно для комплокснсгс пз**чг-нп::; бурах Еодопослек. Для количественного определения ?тим углах"" пользоем-к кал'.лрэЕС-так кпззйхшиектк, ргссигтгшнк:- ш. псест-гяпг/ г--

зультатов модельных оштов. Для того, чтобы удостовериться в отсутствии значительных количеств лихо-инозита или других веществ, производные которых могут дать пики с близкими временами удерживания, прс водили контрольный ошт без внутреннего стандарта.

Оценка содержания ламинарана в образцах биомассы водорослей предложенным способом представлена в табл. 1. Систематическое завышение результатов этого определения по сравнению с результатами экстракции может быть объяснено существованием иных . источников глюкозы и частичной потерей ламинаранов при их выделении. Проведенное

Таблица 1

Характеристика лашшаранов из бурых водорослей.

Номер Источник Место и время Выход лами- Опрэд.ме- Соотн.М обр. ламинарана сбора водоросли наранаД тодом ГЯХ.Ж и в-цеп

1. Оюгба /Пит

2. тот же

3. тот же

4 .БрЬаегогПсЫа (НиагЬсМа

5. 1ш1паг1а с1сУюг1о1'вез

6. 1дт1тюг1а ЪотщзгсИапа

7. А1аг1а

8. СуэХове1га ЪогЪага

9. СузХозе1га сПтгИа

о.Попова.Японское 0.8 море, шв.1981 г.

Зал. Восток, Япон- 0.056 ское море,май 1988г,

о.Шикотан, 0.075 авг. .1988 г.

зал.Посьета, 0.58 Японское море сент. 1977 г.

там же, 9.5 сент. 1986 г. Камчатка, Аеччин- ,0.01 екая губа, октябрь 1990 г. там же, тогда же

Крым, Черное море, янв.' 1990'г. там же, дек. 1989 г.

1.7

0.35

0.14

2.5 1.5 1.3 1 .8

14.5 0.5

5.7 0.8 0.8

3:1

1:1

4.3:'

2:1

■*М-цепи отсутствуют.

случае С./Пит исследование показало, что низкомолекулярвая часть [аминарана проходит через-диализную мембрану; содержание' остзтксв •люкозы с учетом этого "низкомолекулярного" ламинарана и олиго-р-Б-'люкопиранозидов Б-маннита должно составить 2.6%, что удовлетворительно совпадает с данными ГЖХ <2-5%, табл. 1). Таким образом, несмотря на наблюдаемое расхождение, результаты гидролиза симбатнк выходам ламинарана из биомассы и предложенная методика может Сыть гак?льзована для оценки его содержания» • .

Предварительную экстракцию .биомассы проводили -смесью хлороформ -метанол - вода 2:4:1 с целью извлечения низкомолекулярных веществ и после добавления хлороформа и расслаивания экстракта получали неполярную фракцию (липидов и пигментов) и фракцию полярных веществ (11В), в основном состоящую из маннита и солей. Дальнейшую экстракцию с целью комплексного извлечения полисахаридов проводили по методике, разработанной Э.Персиваль с сотр.: 80%-ным этанолом извлекали фракцию "спирторастворимых веществ" (СВ); содержащую пигментк, маннит и олигосахариды, 2%-ным_тшым раствором СаС12 (при 20° и 70°С) экстрагировали ламинаран и соответствующую фракцию фукоидана, одновременно удерживая альгинат в осадке 6 виде кальциевой соли. Зкстракт 2%-ным СаС12 диализовали, упаривали и лиофнлизовали, ламинаран отделяли от фукоидана методом ионообменной хроматографии на ВЕАЕ-сефадексе А-25; нейтральный глюкан - ламинаран - элюировали водой, а фракции сопутствующего фукоидана - ступенчатым градиентом НаС1. Помимо возможности комплексного извлечения полисахаридоЕ бурш: водорослей, ионообменная хроматография позволяет избежать потерь ламинарана при переосаждении в случае его еысоксй растворимости и небольшого содержания в биомассе.

Состав изучаемых ламинаранов.

На осноеоник результатов гидролиза и анализа гидролиз а тов (ТТл

ацетатов альдитолов или альдононитрилов), мы показали, что ламина-раш из водорослей, рода Cystoaeira состоят исключительно из остатков глюкозы (т.е. имеют'в .своем составе только G-цепи), тогда Kai остальные содержат остатки глюкозы и маннита (т.р. состоят из М-к G-цепей). , Соотношение М- и G-цепей было определено следующт образом: образец ламинарана подвергали действию КаВНд, при этоь ксящеЕые остатки глюкозы. G-цепей восстанавливались в сорбит. Образец гидролизовали 2Н ТРА и гидролизэт пропускали через анионит в Oí форме для удаления глюкозы (необратимо осаждается на анионите).'Сое несение мзннкта и сорбита в элюате, определенное ГЖХ в виде ацетате соответствует соотношению М- и G-цепей в исследованных ламинараназ (табл. 1).

3. Изучение строения ламинаранов.

3.1. Спектры С ЯМР лашшаранов.

1 °

Спектры WC Я5£Р были измерены нами для всех образцов ламинара-нов, количество которнх было достаточно для съемки (>10 мг, образцы 1,4,5,7,8,9, табл. 1). Большая часть изученных ламшаранов (из Sphaeratrichia divaricata, laminaria cichorioiáes, L. bongardiana. Alaria angosta, Cystosetra barbata, C.crinlta, но не Chorda fllvm) имеют набор интенсивных сигналов, характерный-для р-(1-3)-глюканов (основная р-{1-3)-цепь, звенья А): I03.73fc0.11 (0-1), 74.44±0.13 ÍC-2), 65.67t0.18 (С-3), 69.4jlD.04 (С-4), 76.8bi0.08 (С-5), 62.00± ±0.04 (С-6) м.д. Кроме того, е этих спектрах присутствуют минорные сигналы, напр. для ламинарана из SjXiaerotrichia divaricata 104.46 -G-1), 87.50 (С-3, звено С), 77.30 , 77.13 (С-3 к'С-5, В), 75.12,

В6, 74.73 (предположительно, С-2), 70.88 (С-4, В), 6S.66 (пред--с.-о^телько, С-6, C,D) (все - в D»0. 75-80°С). .

■i о . .

Zzyzx c6pS?OY, HS ОСНЭЕаНИН спектров ' С Я::':г' -"г:7Л

СНгОН

НО

снаон снао-

СН20-

но41-{

он

он

он

в

р-( 1-3)—цепь- с заметным количеством р-(1-6)-разветвлений.

Ламинаран из СХюгба. /Пит имеет принципиально дной спектр '^С ЯМР (рис.1).'Практически все сигналы, за исключением незамещенного С-б (62.01 м.д.), расщеплены и образуют частично перекрывающиеся группы, поэтому точное их отнесение-затруднительно. В аномерной области (С-1) шеются только три близких по положению и интенсивности сигнала 104.5, 103.90 и 103.79 м.д., свидетельствующих о присутствии исключительно (З-гликсзидных связей между остатками глюкопкрано-зы з данном ламинаране. Б области замещенных С-3 имеются также . три сигнала соизмеримой интенсивности 86.48, 86.40 м.д. (С-З.С) и 35.67 (С-3, А). Следующая группа сигналов может быть разделена на две:

105 100 95

Рис. 1. Спектр

).0 85 80 ' 75 70 65 60 55 м.д.

Я,'? лашшграна из СпогЗз /Ит (75 '-'Гц, Ь;С ;.

V7.0tj.3 м.д.' (С-3,- B,D 0-5 А,В)-и 76.1+0.2 м.д. (С-5, C,D), такое предположительное отнесение сделано с учетом ^-эффекта гликозилиро-Еания по с-6. . Точное отнесение сигналов группы С-2, так ке как и группы С-4 и замещенных С-б (С, D) затруднительно вследствие близос тп соответствующих сигналов и недостатка фактического материала.

Спектр С ЯМР ламшарана из Chorda filvm указывает на присутствие значительного количества р-(1-6)-связей, по крайней мере, в разветвлениях. Наличие'большого количества разветвлений и Енутрице-почечных 1-6)-связей в этом ламинаране было подтверждено на основание данных метилирования, расщепления по Смиту и ферментолиза. 3.2. Исследование лашшаранов методой метилирования. Образцы,исследуемых ламинараноЕ были подвергнуты метилированию по Хакомори с последующим .гидролизом полученных метилированных полисахаридов и ГЖХ-анализом гидролизата в виде "ацетатов альдитолов. Как показал проведённый.анализ (табл. 2), ламинаран из Chorda filvm (образцы 1-3) действительно тлеет необычную структуру (см. ниже), тогда как остальные ламинараны (обр.. 4-9) относятся к типу хорошо известного "растворимого" ламинарана: основной пик на хроматограмме принадлежит 1,3,5-три-0-ацетил-2,4,6-три-0-метилсорбиту (соответствует зьену А). Меньшие по интенсивности пики, принадлежащие 1,5-ди-С-ацетил-2,3,4,б-тетра-0-метцлсорбйту - и : '1,3,5,6-тетра-0-ацетил-2,4-ди-О-метилсорбиту, соответствуют, концевым звеньям (В) и "точкам разветвления" (С). Следует отметить, что по данным метода метилирования все указанные.ламинараны содержат небольшое количество р-(1-б; глюкозы (В). Этот минорный структурный фрагмент известен для. некоторых "растворит" лггяшаранов, хотя не был ранее упомянут для I. ' oichoricloss (обр.4). • .'•. ;■

Б кссдздоЕашшх дамияаранах, креме выделенных иг • Болпрогле! t-c.-: Cj^iosetra (oop.'S, 9), обнарукены остатки i-О-зач^да^шс-го vsh-

ХаОлщв £

Типы углеводных остатков в их соотношение в ламинаранах (анализ методом метилирования, ГЖХ ацетатов частично метилированных альдитолов, интенсивность относительно пикв 1,5-0-ацетил-2,3,4,6-тетр8-0-мети.л-

сорбита)

Номер сб Прпр ода соответствушего углеводного -остатка

1)Мап-о1 С1?р( 1-» -И )Йап-о1(£*г ->3)йср(1 ■* ' ?

1. 0.01 1 .0 0.03. 2.25 * - ". "*

2. С.1 1.0 0.07 3.3 2.0 'Г; . Е

0.25 1 .0 0.03 0.9 1 .0 0.7

0.4 1.0 нет 13.2 0.15 1."

£. С.25 1 .0 сл. 0.15

6. 0.13 1 .0 тат 0.2 0. :

7 „ 0.27 1 .0 сл. * 0.1 0.17

8. ЕГОТ 1.0 нет •4 • С и.с! 0. г

г ■ нет 1 .0 нет 6.4 . 0.2 3-Е

нита (I). Для трех образцов лвминарана из С./Пиг., Еаделенных из г.?.: • кассы водорослей, собранных в различных места:: е г разное врем;:. лучены Слизкие результат, что показывает всдсв™-) спвцкфвчнгсть леминсЕьнь. 1*мпэк> соизмеримых колпесзз неэтично мстилггоЕп-пгд. »частично агетилирзванних сороктоь, с_,г.тветст2укдих зеэньяч а. Е, С ; I., в гпгззднзагах метилированного лшз?ат)знь из 0. ,-*( •:;•;*• 'птк'.тс:

количества :-С-ане:хл-^,Зг4,д,5-пекть-:>-мет1:лм':;:7::: 1-ах=тил-£, 3 , ,5-тР?р&-С-г/етЕЛ?.'.аннит& о'рагхд; '

Гзксг .-•¿гультгт сгкглае::, "то остатки манить ь и-цег.гл: гл

нарань из С. film.'

сн2 но-но-

сн2 но-но-

-он -он сн2он

-он он сн2о-

F

3.3. Деградация по Смиту лаыинарана из Ctozräa flitz?..

При р&сщеплении ламинарии» ш Cnvdz filvr¡ по Смиту были обнаружена гл^-фик, (11-£-0-ламк-■¡арк:'иозйл->гж!1:с^кй (2) к нсгкь-гителх.ние количества быспех олиго-сьхц-улсъ-, позмерньк фракция отсутствовала. Соединения 1 и 2 были •.^дсг-екц ь cqotjjoishkk '.3:1. Строение 1 и 2 было установлено с по-

ен 2 он

сн2он

сн2он

но

он j

\|_/ HO-J

сн2

!

j

Ьн

но

он

,XL-

HO'

СН20Н

он

о-сн2

но-!

I

он сн2сн

1

1

спектров '"С fílv'f; iaf¡*zcv¡i2 ооразец 1 can получек окасд^ваем тхкзяо^сг-ы тетраапетйтом -- Расцепление г&минврана иг С. flltai ve Cía ту показало, что в е-ток*. гл>~:ьне отсутствуют крупнее блоки из )-сьярашш2 остатков глгкс'пптъвог и. 3.4. Ферментативное расщеплешь льшнарана из' Chor ¿a fílvn льминаринаэой из ыолвюска 5г.ú --la ícli'Jizsizrs. НьлйЧ1"г остатков кькккгь í- углеводных целей под-

^г^нтатпь?-:!.'!/ к:---1.' üopííó^r; ло^агатг-на к; счor\ia

/ÍI-" нее к -hóc- ; ■ -т л^^г-'г^г-; £ rít-o.! j ¿'liüis-

. :■ .:. о;>: '••j.-:- г''1";-?.:, чт: :-тст то:-

пепляег. генциосяогу, г прк действии его на комкерческк? "н-г-рас?-:'-ри>а£" ламннаран иг 1а?ЛпсПа ПурзгЪсге-з в качестве главна: ггр'г-.пук-тов образуются глгхоза и ламинарибпоза. При полном шдралиге еогаг:: 1 иг С. fílш были получены глэеным образом глкксза, ламинаркжзз :■ гениаоопсза. При частично!.". ферментативном гидролизе р-закцкк останавливали на стадии максимального накопления тсн- и тетраса::аг:":в, -лученный гидролиза? освобождал: от полимерной фракщп: с ггсмо^г гель-х2сме?сгЕ2$пк, а Зггзкцяю олЕгосгхаскдов разделяли Бс£Х н*-локке с сдяасероом с-1£ (рт; .ОДЕгосагарслу в получение ^ы^.-.:-хатактегизсе аля методов егогячес—ясннс^ мзсс-сеекткяг-тсяг. 72Г-". £;, з также кетслс". г.'етялгрсванг.я после пр^дЕ^рятелънг:': гес-

сгавсвленил .'¡аЗ!5,. Было установл;;-^, что е

?£?с содержались прсЕгЕодны" как ксногаглесенн^гс ^рзкпк:: ¡м. НО, так дззамезеннсго (?, крайняя КС 4, какнгта, что

4 п.

1

Ч

щ

О 10 20 30 40 50 60 70 80 мл

Рис. 2. "н^'ко^оЛ'-к г*.г;

гсгнатак а ::г 7• • •. "•: ¿а".

:—- - ~ ".' - --- — - - - "'С - - ;. - _ г

G1 G2

^ G1 G2. G3

Таблица 3.

Состав фракций продуктов ферментолиза глвкана из Chorda ftlvm лашшариназой из Spisula solidlssima.

К фракции Состав фракции (еыход, мг)

ВИМС,псевдомолекулярные ионы

1 (13.Q) глпкозачманнит

2 (2.8) генциобиоза+глю-

козилманнит(2:3)

3 (1.9) лакинарибиоза

4 (0.35) 1 ,6-ди-0-6-1кглю- 529 (Ii+iia) +

копиранозилманнит 551 (М+2Ьть-К)4

5 (ок.1.) 1-О-р-генциобко-

ЗИЛ-Б-МаНЕЕТ

6 (ск.1.) 1-0-р-ламинариб::о-

зилманнит+3-0-6-

Б-Г.1ККОЗИЛГ-?Н1Н5С-

биоза

7 (ок.1.) -генщотриоза+?

8 (6.3) б-О-р-глжкозил- 52?

ламияарибисга

9 (2.1) 1-0-р-гешисСио- 691 Ш+йа;""

гил-6-О-р-глюкозил- 713 (М+2Па-Н"~ Б-маннит *

глюкозилтетрасахариды 639 (M+Na)'

10 (5.9) глюкотетрасахариды + 669 (К+№) +

тркглюкозилманнит ' 691 (Y+Ha)'T

твеишает присутствие ранее неизвестного структурного фрпгчентЕ 7. ъ ламанарэне из С. film. Так как среда продуктов фергентолгаз стгу--ствовэлк с.сгосах8рнаы с "посторонними" гласезялакк сеязяя, г:- т'-тгазование лпсдуктон траисглнкозил1П}ОР2хП1л е ei*~ ^ --^-т-- ~г - -^ _ м&йтсжзб представляется маловероятным.

3.5. О связи строения лаыинараноь с таксономическим положением водорослей.

Ь 1978 г. З.Персивалъ на основании доступного в то Еремя материала сделала еывод ос отсутствии корреляции между таксономией бурых водорослей и структурой содержащихся в них ламннараноь. Наши данные находятся в соответствии с ?т::м выводом. Так, перЕые пять водорослей кг лаЗл. i относятся к кдг-гзу фюгоосяоровнх, причем роды lanínarta, Cnerda и Alaria - к порядку ламинариевых. Sphaerot^ícnia áivariccta такгономпч^скн удалена от ек, хотя ламинараны из jüxiiTicrla и .-.i^ia (гг^ятс сходны с ламивараном из £. áivcricaia и отличается от лами-h;¡t:s,hí, из С. filwi. Лажнараны из водороглей масса циклеспоровых .г.гсчласс фукусовые) из Cystoesíra batata и C.criniza не содержат fc.ü^Ta. Эта особенность состава также вряд ли ?«же? «та сглзака с таксономией: хотя для айсенана из Ascos* ira 11 i а 'класс еикло-cscpcBK;. подкласс гекезейровке) было отмечено отсутствие остатков .vüsstа, • г:,: коримые" ламинаранн из некоторых водорослей рода íve^c.- "'-лее близкого к Cyszoseira, их содержат.

:£кик образе;,:, близкие виды водорослей могут содержать раадичак-стн по состав;» ¿ строению рг-зервнае глхканы, и наоборот - похожие лагхгнатаны могут пр. гутстэоЕать в гедореглях систематически удален-ныл видов•-

Разделение W к G-шпеи лашшзранов. г :97С г. Д-..Стар:оу был предложен мэтед разделения и- и "-цехе;: ла'днаравгг пснсобменнс!: хроматографе:: на гнпс-кпггх в медибд:. ? -кг.:: л.г.гг'.'/.г. Ггссг-сг-: :-".:г :-:а!.с: експех-иментальное исследован::;- показало.

реакция заключается во взаимодействии восстанавливающего конца с 2-аминопиридином с образованием основания Шиффз, которое далее восстанавливают комплеком диметиламин-боран в пиридкламинопроизЕоднке (в-РА!)). М-цепи, не имевшие свободных альдегидных груш, остаются инертными в условиях модификации. Продукты реакции разделяли ионообменной хроматографией на катионите.

Б случае г/одйлхации полимерных молекул по реакции восстановительного актирования ключевым моментом является количественное образование основания Виффа. Ванное значение имеет такне ЕЫбор условий для хроматографического разделения модифицированных и немсди-фицироЕанных молекул. Прежде чем осуществить ЕссстаноЕительнсе амн-кфование ламинаранов, мы исследовал:: этот подход на модельном соединении, в_качестве которого был выбран коммерчески декстрек 1СТ, облгдекщяЯ хорошей растворимостью в Еоде п примерно тсй зге молекулярной массой, что и большинство лаккнзрансв. Реакаг» лгоеодя.-; о г-аккнэпируккем в условиях, различающихся продан.»»'«!.« растворителем, количество» вводимого амина и природой используемого ь?сст&кс-Еителя. После проведения Еосстаковлтельного ашкирования зггбктск З-Бккнспзрзгйка и другие нигхоколекуяярше вещества отделяла г?л»— хтсм&тогрь&«>й, 'получс-ннкй полимер разделяли на катконкто,

■он

он

сн2он

О-РАВ

нейтральную фракцию водой (А), а модифицированную - 0.2 К водным аммиаком (Б). Контроль за разделением осуществляли по поглощению элю-ата при л=315 ем и по цветной реакции на углеводы с фенолом и серной кислотой. Полученные фракции подвергали кислотному пиролизу, продукты гидролиза обрабатывали, как рекомендовано для превращения моносахаридов в ацетаты альдонокитрилов, и полученные производные анализировали методом ГКХ. В модельных опытах мы стремились севсти к минимуму выход нейтральной фракции (А) и убедиться б полном отсутствии в ней тфпхзкаминопроизводных; во фракции В анализ методом ГЕХ должен был показать только наличие глюкозы (ь виде ацетата глюконо-Елтрплэ1 и небольшого количества 1-(2-пнридиламшю)-1-дегоксисорбита {ъ Екае его ацетата) при полном отсутствие сорбита (продукта гидролиза восстаноьленних нэмидюЗРпшфованных цепей).■Хорошее разделение нейтральной и юдафишрованной фракций удалось осуществить только с использованием сферой? Б—10ОО (в Шь- форме).

Обычно применяемые условия восстановительного екннпрзванкя в таноле ел! Д воде с цпзкоборгилридом нгтрия в качестве восстановн-е случае декстранв • ОТ дают слизком осдьзоС гкхсд продукта прямого восстановления полисахарида. Удовлетворительные результаты удалось получить при проведении реакции в расплоъе апетата 2-акЕнспври-диния ,к?01л-ок реагента на три порядка;, г..использовании г качестве восстановителя комплекса ди;:-. - ..тглин-с-орак. г атом случье к?йграль-ноя 'фракций, образующаяся из декстрань 10", составляет не более 1/7 от тагфшпрэргнной фракции (рис. с. а':.

Стттжалькые условия дпкпческсй юзггкаапЕ г. последующего хрг-

д:;/ •••• использованы для разделения V,- и С-цепе* тре;. образцов дами-нат^оков: к~\мл*ет.ч-'Скогс поепаоото и? 1ог''г.о" ■ о 1"неоогт-

воримы:!" лачиваран), "вастворпг/.ого" лепнпгЕна и? ¡.те^ и

Рис. 3. Разделение глюканов на нейтральную (А) и модифицированную 2-аминопнридином (В) фракции на сфероне $-1000.

Кривые элкшии: _ :----, - поглощение элюата ,

■ ■ | ~ Реа^чия с фенолом и серной

кислотой.

а) Еекстран ЮТ (модельный опыт)

Ламп ньраны: Ъ) Lar.ir.aiUa /шрелЬС-ЕД., с М.. Ы.скс>иеЫи, й) ¿Лип.

глюканз из СЬогда /СХтлп. Кривые элюции модифицированных ламинаранов при хроматографии на сфероне Б-1000 приведены на рис. 3 (соответственно Ь, с и й).

Анализ состава фракций А и В для каждого ламинарана, проведенный описанным выше методом (гидролиз и ГЖХ ацетатов альдононитри-лов), показал, что во всех случаях в гидролизатах нейтральных фракций (А) содержится незначительное количество сорбита, а пиридалами-нопроизводное глюкозы отсутствует; в гидролизатах фракций В альди-толы не обнаружены. Это означает, что в условиях ионообменной хроматографии происходит. четкое ' разделение модифицированных и немо-дифицированных молекул полисахарида, а вкладом побочной реакции прямого восстановления С-цепей можно пренебречь. Соотношение площадей пиков на элюционных кривых; полученных по реакции с фенолом и серной кислотой, довольно хорошо совпадает с соотношением К- и Б-цепей в исследованных ламикаранах, которое было определено по соотношению маннита и сорбита в продуктах восстановления.

Строение фракций К- и О-РАВ для каждого ламинарана было изучено

Таблица 4

Типы углеводных остатков и их соотношение во фракциях Ы- и С-РАВ ламинаранов из I. НурегЪогеа, I. с1сНог1о1йез и С!г. /Пит (анализ методой метилирования, ГЕ ацетатов частично метилированных альдитолов).

Ь.курегЪогеа Ь.с1сТюПо1с1аз СТг. ftlш Згено' М С-РАВ Ы ' ' й-РАВ М С-РАВ

-1)Мап-о1 0.5 нет 0.2 следы 0.0?. нет

-1)Хап-о1(6- нет следы нет 0.09 нет

Ис(1- 1.0. 1.0 1.0 1.0 11о ' 1.0

-3)С1с(1- 12.8 6.2 8.2 5.8 1.8 2.4

-б)С1с(1- кет' нет 0.4" 0.7 1.8 1.8

-£)-6)С-1с(1- 0.5 0.3, 0.8 0.6 0.7 0.5

с помощью метода метилирования. Полученные данные приведены в тзол.4; из них следует, что М- и G-цепи ламинэрана Chorda film, имеют очень сходное строение, тогда как для препаратов из двух еидов ламинарии эти цепи несколько различаются по степени ра'зветвленности. Распространение предложенного метода на другие ламинараны представляет несомненный интерес для выяснения закономерностей их биосинтеза..

1 ч

5.Структура и спектроскопия С ЯМР олиго-р-Б-глюкопиранозидов

маннита.

По существующим представлениям, биосинтез ламинаранов в клетках бурых водорослей идет за счет последовательного наращивания глюкано-вой цепи, в частности, переноса звеньев глюкозы от нуклеотида-пред-иественвика на.маянит или'маннит-содержащий олигосахарид. Если эта гипотеза Берна, то в олигосахаридной фракции биомассы водоросли должны присутствовать олигоглшозиды маннита, соответствующие фрагментам ее ламинэрана.

Глюкозиды маннита 3-7 были выделены методом ВЗлЯ из олигоса-харид-содеркащих фракций бурой водоросли Chorda filwi после их предварительной очистки. Состав олигосахаридов 3-7 был определен по данным гщцхзлиза (анализ ГЯХ в виде ацетатов альдитолов); положение меж~ мономерных связей установлено с помощью метода метилирования (анализ ГКК в Биде ацетатов частично метилированных альдитолов). Для метилированных -производных олигосахаридов 3, 5 и б получены масс-спектры; они аналогичны описанным в литературе масс-спектрам гликспиравс^пл-альдитолов с соответствующим расположением гликозидккх связен.

Надежное доказательство структуры указанных олигосахаридов представляет "С ЯМР-спектроскспия. Отнесение сигналов ь спектрах "С соединен.^ 3-7 (табл. 5) было выполнено с использованием лит .-г о: у:. -них аналогиД. Положение сигнала С-1 глюкозы ; 104.0 - Ю4.;. -,::

кгзнвает, что гее е^ -остатки представляю? собсй с-гл*Т'г:г:v:.: •

звенья. Отнесение сигналов С-б концевого ЗЕена глюкозы (ок.62.О м.д.) . и С-б маннита в 3, 5 и 7. (около 64,5 м.д.) очевидно; сигналы концевого звена глюкозы можно выделить, используя спектр метил-р-Б-глюкопира-нозида. Симметрия-молекулы 4.позволила.отнести сигнал С-1 р-(1-1)-глюкозилированного маннита (73.09 м.д.). Следует отметить слабополь-ный сдвиг сигнала'С-б (+7.8 м.д.) и сильнопольный (-1.0 м.д.) сигнала С-5.3БеньеЕ G2 и G3 (соединения 5, 6 и 7) по сравнению с G и G1, вызванный а- и р-эффектами гликозилирования соответственно.

Олигоглюкозиды маннита 3-7 /с надежно установленной структурой были использованы в качестве свидетелей при изучении состава олигоса-харидов во фракциях низкомолекулярных веществ нескольких видов бурых водорослей. Анализ проведен с использованием углеводного анализатора; разделение Сахаров на колонке со специальной анионообменной смолой в борзтном буфере позволяет проводить такой анализ без предварительной счистки фракций от неуглеводных примесей, а цветная реакция с фенолом' .и серной кислотой - определять вез углеводы, кроме альдитолов. Маннит Е биомассе водорослей и их фракциях определен методом ГКХ б виде гек-саацетата (табл. б). Сравнение состава олигосахариднкх фракций различных бурых водорослей и структуры соответствующих ламинаранов, выделенных- из тех же образцов, показывает, что однозначной корреляции ■ между ними нет. Так, если для С. fllvm есть практически полное соответствие выделенных олигосахар::;.ов и структурных элементов ламинара-на, то для других ооразцов это не наблюдается, что отчетливо видно на примере представителей'рода Су at азе ira, ламинараны которых не содержат маннита, тогда как в их биомассе присутствуют и'незамещенный маннит, и 5, б случае C.barbata - также 3 и 6, а в случае C.crinlta - 7. Гаки/ осразом, механизм биосинтеза ламинараноЕ является более сложным, чем представлялось ранее. ■ ■ -

Таблица 5.

13,

Спектрл С-ЯМР р-П-глпкопиранозидов 0-маннита 3-7.

Соединение Углеводный остаток с- -1 С- -2 . С- -3 С- ■4 С- ■5 С- -6

3 в 104. .14 74, .50 76, .93 70. ,37 77. 19 62. .01

М 73. .06 70, .96 70, .96 70. ,37 72. 15 64. ,49

д й 104. ,17 . 74 .52 76, .92 70: :23 77. 19 62. .03

м 73. ,09 ' 70, .99 70 .99 70. .99 70. 99 73. ,09

5 •01 ' "04. .08* 74, .44 76, .93 70. ,32 77. 19 62, .00

С2 104. .21 * 74, .38 ' 76, .81 70. 43 76. 19 69, .82

м 73. ,26' 70 .97 70, .90 70. .72 72. 12 64. .49

6 104. ,162 74 .45 76, .92 70. 24 77. 16 62. .02

вг 104. ,053 74 .36 76, .81 70. ,733 76. 18 69, .82

с 104. .16* 74 .45 76 .92 70. 243 77. ,16 62 .02

м 73. • С.С. ЛО .98 70 .98 70. ,983 70. ,98 73 .06

7 01 104, .15 74 .41 76 .93 70. ,34 77. ,17 62 .01

02 104. .15 74 .34 76 .82 70. ,45Ч 76. ,17 69 ■ 87:

03 104. .15 .74 .34 76 .82 70. ,69Ч 76. .17 70 .04!

м 73, .22 70 .98- 70 .90 70. ,77 72, .15 .47

Ме-|3-В-01ср 104. .59 74 .77 77 .25 71. ,04 77, .25 - о 3(1 .15

Маннит 64. .52 72 .12 '70 .57 70. .57 72, .12

1»а»з> 1»«б возможно обратное отнесение.

Таблица б

Углеводный состав низконолекулярнш; фракций из нескольких видов бурых водорослей.

Водоросль Сое, Маннит Глюкоза Сахароза динения 3 . 4 5 6 7

1 .Спогаа. /Пип -н- сл. - ++ + + +

2. ЗрЬазгэ ТгЬс'Ша + - ' + сл. - г+ - +

сНиагЬсаТа 1

+++ + сл. + - + - -

СЬСПСГ1С10£3

4-.¿1аг1с апдизТа ++ + + + - + - сл.

• •+ •- - . - -+ - +

сэгщзгсИапа

¿.Зузтсее1га + сл. + + - + + . -

l-.zrta.za

7.0ij3T.QF.sira + + + - сл. + сл.

сг'.г.'Ла

+:ирисутствует; сл.: следы; -: отсутствует

ВЫВОДЫ

1 .Г/ооЕедеко структурное исследование ламинараков из семи видов бурш: водорослей. Б одной из них - СПсгва /Пит. - найден лзмпнзрак необычного строения, содерказий разветвленные молекулы с ¡э-(1-2;- и Р-('-¿)-связямк мевду остатка" т. I—глюкоппранозн. М-цепи этого лами-нарана имеют в своем составе как р-(1-1 )-моно-, так и (3-(>-1 ),&-( 1-6) сно-гликозилироЕанные остатки маннита. Ламинараны из прочих видов водорослей сходны мевду собой и содернат цеш: из р-('-3'^-связанных остатков глхкопкранозы с небольшим количеством (1-6)-связей к разветвлений.

Ирздлогйк новый метод разделения М- к С—цепей ламинараков, основанный на восстановительном амиыгоовании С-цепей по реакция о

2-аминопйридином и диметиламин-бораном с последующим разделением на катионите сферой S-1000. Проведена раздельная структурная харак-. теристика М- и G-цепей для трех образцов ламинаранов, показавшая структурную близость М- и G-цепей.

3. Из олигосахаридной фракции водоросли Chorda, film выделено пять олиго-р-Б-глюкопиранозидов маннита, которые по своему строению соответствуют фрагментам структуры М-цепей ее ламинарана. Отдельные представители этого набора олигрсахаридов обнаружены и в других водорослях, хотя в этих случаях прямой корреляции между структурами олигосахаридов и ламинаранов не наблюдалось.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Усов A.M., Чижов А.О. Полисахариды водорослей. 40. Углеводный состав бурой водоросли Chorda film. // Биоорган, химия.

т

Т. 15.(1939) N2.С. 208-216.

2. Усов А.И., Чижов А.О. Полисахариды водорослей. 47. Новые данные о структуре ламинарана из Chorda fllmiL.) Lam. и резервных глюканов из некоторых других бурых водорослей. // Изв. АН., сер. хим., 439&, //АР-//^.

3. Усов А.И., Чижов А.О. Использование восстановительного амини-рования для разделения М- и G-цепей ламинаранов. // Изв. АН., сер. хим., (О, с. ft-4847.

■4. Усов А.Й., Чинов А.О. Структура и спектры 13С ЯМР олиго-(3-В-глю-копиранозидов маннита из бурой водоросли Chorda film (L. )Lain. // Изб. АН., сер. хим.. -mi. WO, с. У«?'//- /¿'¿¿J,