Полисахариды некоторых видов бурых водорослей

Меньшова, Роза Владимировна

Полисахариды некоторых видов бурых водорослей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Меньшова, Роза Владимировна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Владивосток МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Полисахариды некоторых видов бурых водорослей»

Автореферат диссертации на тему "Полисахариды некоторых видов бурых водорослей"

На правах рукописи

Меньшова Роза Владимировна

Полисахариды некоторых видов бурых водорослей

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 7 пг'.З 2Ш

Владивосток-2012

005047923

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреиедении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Звягинцева Татьяна Николаевна

Ковалев Николай Николаевич

доктор биологических наук, Дальневосточный федеральный университет, профессор кафедры биохимии, микробиологии и биотехнологии Школы естественных наук

Давыдова Виктория Николаевна

кандидат химических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, старший научный сотрудник

Федеральное государственное унитарное предприятие Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, г. Владивосток

Защита состоится «07» Февраля 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «26» декабря 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биологически активные полисахариды бурых водорослей представлены ламинаранами, фукоиданами и альгиновыми кислотами. Повышенный интерес к этим уникальным по структуре и свойствам соединениям объясняется наличием у них широкого спектра фармакологических свойств, низкой токсичностью для организма и возможностью получения на их основе лекарственных препаратов нового поколения.

Из полисахаридов бурых водорослей наиболее изучены альгиновые кислоты, которые давно и успешно используются в медицинской, фармацевтической и других отраслях промышленности. Другие, не менее ценные полисахариды - ламинараны и фукоиданы, в сравнении с альгиновыми кислотами являются малоисследованными. Изучение биологической активности полисахаридов бурых водорослей, в особенности фукоиданов, идет гораздо более быстрыми темпами, чем химические исследования этих соединений. Фукоиданы отличаются сложным и нерегулярным строением молекул, что создает трудности в их детальном структурном анализе. Структурное разнообразие фукоиданов до сих пор полностью не охарактеризовано.

Актуальным является исследование полисахаридного состава бурых водорослей с целью обнаружения новых перспективных источников биологически активных полисахаридов, установление характеристик структуры полисахаридов, прежде всего фукоиданов, что дополнит известные в настоящее время сведения об их строении. Изучение биологической, в частности противоопухолевой, активности полисахаридов и их производных с установленными характеристиками структуры позволит выявить взаимосвязь между структурой и биологическим действием.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН и при поддержке грантов РФФИ (проекты № 09-04-00761-а, № 12-04-00669-а) и ДВО РАН (проекты № 10-III-B-05-084, Ns 11-III-B-05-075, Na 12-III-A-05-057), а также программы «Молекулярная и клеточная биология».

Цель и задачи работы. Целью данной диссертационной работы является определение состава и характеристик структуры полисахаридов некоторых видов бурых водорослей и выявление взаимосвязи между особенностями структуры полисахаридов и проявляемым ими противоопухолевым действием.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) Выделить полисахариды из разных видов бурых водорослей, собранных в различных регионах; 2) Установить состав выделенных полисахаридов; 3) Определить характеристики структуры полисахаридов с использованием химических, физико-химических и ферментативных методов; 4) Исследовать противоопухолевую активность нативных полисахаридов и их производных; 5) Выявить взаимосвязь между характеристиками структуры и противоопухолевым действием полисахаридов и их производных.

Научная новизна работы. Из бурых водорослей Dictyopterís polypodioides, Padina pavonica, Sargassum sp. (Ливанская Республика) и Eisenia bicyclis (Республика Корея) выделены новые биологически активные полисахариды: альгинаты, ламинараны и фукоиданы. Из бурой водоросли Е. bicyclis впервые получен уникальный сильноразветвленный высокомолекулярный ламинаран, установлены основные фрагменты его структуры. Выявлена взаимосвязь между характеристиками структуры и противоопухолевым действием ламинарана и его производных. Из бурых водорослей Sargassum horneri, Costaría costata, Ecklonia cava и E. bicyclis (Республика Корея) выделены и охарактеризованы новые фукоиданы, различающиеся между собой по моносахаридному составу, степени сульфатирования и ацетилирования. Проведены исследования противоопухолевой активности фукоиданов in vitro и выявлена взаимосвязь менеду характеристиками их структуры и противоопухолевым действием.

Исследовано влияние предварительной обработки бурых водорослей на выходы и характеристики структуры фукоиданов из Fucus evanescens, Saccharine japónica и Sargassum oligocystum. Впервые показано, что обработка водорослей сверхкритическим

диоксидом углерода позволяет получить препараты фукоиданов в количествах, эквивалентных выходам при обработке органическими растворителями.

Проведено сравнение содержания и характеристик структуры фукоиданов разных видов бурых водорослей, собранных в различных регионах, которое расширяет и дополняет существующие сведения о фукоиданах водорослей.

Практическая значимость работы. Показано, что широко распространенные бурые водоросли D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp. (Ливанская Республика) являются перспективными источниками альгинатов, а также фукоиданов, проявляющих противоопухолевую активность. Бурая водоросль Е. bicyclis (Республика Корея) является источником альгинатов, фукоиданов и уникального высокомолекулярного ламинарана, производные которого обладают выраженным противоопухолевым действием. Показана перспективность использования фукоиданов из S. horneri, С. costata, Е. cava и Е. bicyclis (Республика Корея) для разработки средств профилактики и лечения онкологических заболеваний. Показано, что обработка водорослей F. evanescens, S. japónica и S. oligocystum сверхкритическим диоксидом углерода позволяет получить препараты фукоиданов в количествах, эквивалентных выходам при обработке органическими растворителями. При экстракции сверхкритическим диоксидом углерода с 5 % этанола в качестве сорастворителя происходит удаление гетерогенных низкосульфатированных фракций фукоиданов, что позволяет сократить число стадий очистки и получить более однородный по составу фукоидан.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Бурые водоросли D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp. (Ливанская Республика) и S. horneri, С. costata, Е. cava и Е. bicyclis (Республика Корея) являются перспективными источниками биологически активных полисахаридов.

2. Ламинаран из Е. bicyclis представляет собой уникальный сильноразветвленный высокомолекулярный (19-27 кДа) 1,3;1,6-р-0-глюкан с высоким содержанием 1,6-связанных остатков глюкозы. Уменьшение молекулярной массы нативного ламинарана до определенного предела (степень полимеризации 9-23), а также увеличение содержания 1,6-связанных остатков глюкозы способствуют возрастанию противоопухолевой активности по отношению к клеткам меланомы человека SK-MEL-28 и рака кишечника человека DLD-1.

3. Исследуемые фукоиданы эффективно ингибируют рост колоний клеток рака кишечника и меланомы человека. Наиболее эффективными противоопухолевыми агентами по отношению к клеткам рака кишечника человека DLD-1 являются фуканы и галактофуканы. Фукоиданы, содержащие рамнозу, в большей степени ингибируют рост колоний клеток меланомы человека SK-MEL-28. Степень сульфатирования не оказывает выраженного влияния на противоопухолевую активность.

4. Обработка бурых водорослей F. evanescens, S. japónica и S. oligocystum сверхкритическим диоксидом углерода позволяет получить препараты фукоиданов в количествах, эквивалентных выходам при обработке органическими растворителями.

5. Содержание и характеристики структуры фукоиданов значительно варьируют в зависимости от видовой принадлежности водоросли и условий ее произрастания.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2012; на 3rd Annual Korea-Russian Bio Joint Forum «The Natural Products Industrialization and Application», Gangneung, 2011; на V Меяедународном симпозиуме «Химия и химическое образование», Владивосток, 2011; на XIII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2010.

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ и 6 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН «22» ноября 2012 г.

Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературы по теме исследования, проведено планирование

экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Литературный обзор», «Результаты и их обсуждение», «Экспериментальная часть», «Выводы» и «Список литературы», включающий 244 наименования. Диссертация изложена на 135 страницах. Результаты представлены в 15 таблицах и иллюстрированы 17 рисунками.

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. проф. Звягинцевой Т.Н. Автор благодарит к.х.н. Ермакову С.П., к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Шевченко

H.М. и к.б.н. Кусайкина М.И. за консультации и помощь в работе, к.х.н. Исакова В.В. и д.х.н. Калиновского А.И. за получение ЯМР спектров, к.х.н. Анастюка С.Д. за получение масс-спектров, и всех сотрудников ЛХФ ТИБОХ ДВО РАН.

Сокращения и условные обозначения. DEAE - диэтиламиноэтил, Fue - фукоза, Gal - галактоза, Glc - глюкоза, Man - манноза, Rha - рамноза, Xyl - ксилоза, А - альгинат, Р - водорастворимые полисахариды, F - фукоидан, L - ламинаран, ИЭР - ионизация электрораспылением, МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, ЯМР - ядерный магнитный резонанс, COSY - корреляционная спектроскопия, TOCSY - тотальная корреляционная спектроскопия, HSQC -гетероядерная одноквантовая корреляция.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Состав и характеристики структуры полисахаридов бурых водорослей D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp. (Ливанская Республика)

Выделение полисахаридов (альгинатов, ламинаранов и фукоиданов) из бурых водорослей D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp., собранных у побережья Средиземного моря, проводили по модифицированной схеме комплексной переработки водорослей, разработанной в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН (рис. 1).

В результате экстракции обезжиренных водорослей D. polypodioides (Dp), P. pavonica (Pp) и Sargassum sp. (S) разбавленной кислотой были получены препараты водорастворимых полисахаридов (Р) DpP, РрР и SP. Для разделения нейтральных (ламинаранов) и заряженных (фукоиданов) полисахаридов, а также фракционирования фукоиданов использовали анионообменную хроматографию на Macro-Prep DEAE. Фракции ламинаранов (L) DpL, PpL элюировали водой и дополнительно очищали от следовых количеств низкосульфатированных фукоиданов с помощью гидрофобной хроматографии на Полихроме-1. Из D. polypodioides были выделены фракции фукоиданов (F) DpF1, DpF2, DpF3 и DpF4, из P. pavonica - PpF1, PpF2 и PpF3 и из Sargassum sp. - SF1, SF2, SF3 и SF4. Альгинаты (A) DpA, PpA и SA были получены щелочной экстракцией остатка водоросли после извлечения водорастворимых полисахаридов.

Выходы альгинатов DpA, PpA и SA составили 12.0, 12.5 и 13.0 % от веса обезжиренной водоросли. Содержание ламинаранов в D. polypodioides и P. pavonica незначительно (менее 0.1 % от веса обезжиренной водоросли), в водоросли Sargassum sp. ламинаран отсутствовал. Суммарные выходы фукоиданов для водорослей D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp. составили 0.2, 0.3 и 1.2 % соответственно от веса обезжиренной водоросли.

Для альгинатов DpA, PpA и SA получены типичные 13С ЯМР спектры, в которых присутствуют сигналы с химическими сдвигами 101.1 (С1), 70.9 (С2), 72.4 (СЗ), 79.0 (С4), 77.0 (С5) и 176.2 (С6) м.д., соответствующие 1,4-связанным остаткам p-D-маннуроновой кислоты, а также сигналы с химическими сдвигами 101.9 (С1), 66.0 (С2), 70.0 (СЗ), 80.9 (С4), 68.4 (С5) и 176.2 (С6) м.д., характерные для 1,4-связанных остатков a-L-гулуроновой кислоты. Соотношение остатков маннуроновой и гулуроновой кислот (M/G) для DpA, PpA и SA составляет 2.0, 1.3, и 1.5 соответственно.

Сухая водоросль

Обезжиренная водоросль

экстракция

(70 % С2Н5ОН, 23 "С, Ю да.) *

Экстракт

экстракция

(0.1 MHCl.pH 2.5, 6G "С, 2 х 2 ч)

Остаток водоросли

Экстракт

экстракция

(2 % ЫазСОз. 55 "С, 2 х 2 ч)

Экстракт

диализ, осаждение (96 % С2Н5ОН, 1:3)

Альгшсаты (А)

нейтрализация, Еиализ,

концентрирование, тофильная сушка

Водорастворимые полисахариды (Р)

анионо обменная хроматография (Macro-Prep DEAE)

Н20

гидрофобная хроматография (Полихром-1,15 % С2Н5ОН). концентрирование, лиофильнал сушка

Н3О -2 MNaCl диализ,

конценгрир ование, чк ли о фи льна я сушка

Фуконданы (F)

▼

Ламинараны (1.)

Рисунок 1 - Схема выделения полисахаридов (альгинатов, ламинаранов и фукоиданов) из бурых водорослей

В 13С ЯМР спектрах выделенных ламинаранов Ор1. и Рр1_ присутствуют интенсивные сигналы с химическими сдвигами 103.7 (С1), 74.1 (С2), 85.8 (СЗ), 69.4 (С4), 76.8 (С5) и 62.0 (С6) м.д., характерные для 1,3-связанных остатков р-й-глюкопиранозы, и пик малой интенсивности при 64.5 м.д., характерный для маннита. Кроме вышеперечисленных сигналов, в 13С ЯМР спектре ламинарана Ор1. имеются дополнительные сигналы малой интенсивности 93.1 и 97.0 м.д., соответствующие С1 а-и р-о-глюкозы на восстанавливающих концах молекул ламинарана, что свидетельствует о низкой молекулярной массе полисахарида. В С ЯМР спектре ламинарана Рр1_ помимо сигналов, соответствующих 1,3-связанным остаткам р-й-глюкопиранозы, присутствуют также сигналы малой интенсивности с химическими сдвигами 104.3 (С1), 74.6 (С2), 75.8 (СЗ), 70.8 (С4), 77.2 (С5) и 70.1 (С6) м.д., характерные для 1,6-связанных остатков р-о-глюкопиранозы, соотношение связей 1,3:1,6 составляет 5:1.

Анализ моносахаридного состава выделенных фукоиданов показал, что все они являются сульфатированными гетерополисахаридами (табл. 1). Основным моносахаридным остатком практически всех фукоиданов является фукоза, исключение составляет высокосульфатированный гетерогенный полисахарид РрРЗ с высоким содержанием галактозы.

Как и для многих фукоиданов из других бурых водорослей, "С ЯМР спектры полученных нами фукоиданов являются сложными и малоинформативными для анализа структуры. Тем не менее, в них можно выделить группы сигналов в аномерной области (96-104 м.д.), а также типичные для сы-фукопиранозидов сигналы в области высокочастотных полей (16.5-16.9 м.д.). Сигналы 21-22 м.д. (СН3) и 175-176 м.д. (С=0) в ,3С ЯМР спектрах фракций РрРЗ, ОрР4, РрР1, РрР2, РрРЗ, ЗР1 и БР4 свидетельствуют о наличии ацетильных групп.

Таблица 1 - Характеристика фукоиданов из бурых водорослей О. ро/урос№ойез, Р. рауопюа и Эагдаззит ер. *

Водоросль, фракция фукоидана Элюент [NaCI], M Выход, Содержание, %*** Моносахаридный состав, моль/моль Fue

сульфаты | полифенолы Fue I Gal | Man | Xyl | Rha | Glc

D. polypodioides

DpF1 0-0.3 следы 5.8 0 1.0 0.3 0.3 0.2 0.2 0.3

DpF2 0.4-0.7 0.1 12.7 0 1.0 0.1 0.3 0.4 0.2 0.1

DpF3 0.7-0.8 следы 13.1 0 1.0 0.2 0.3 0.2 0.2 0.1

DpF4 0.9-1.0 0.1 13.4 0 1.0 0.8 0.1 0.2 0.3 0.2

P. pavonica

PpF1 0.5-0.9 0.2 4.4 0.3 1.0 0.4 0.4 0.1 0.4 0.2

PpF2 0.9-1.3 0.1 14.9 1.1 1.0 0.6 0.4 0.1 0.4 0.2

PpF3 1.3-1.7 следы 17.9 1.5 1.0 1.4 0.2 0.1 0.3 0.3

Sargassum sp.

SF1 0.1-0.2 0.1 6.2 1.8 1.0 0.4 0.3 0.2 0.2 0.1

SF2 0.5-0.8 0.4 19.6 4.9 1.0 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1

SF3 0.9-1.0 0.3 23.3 7.6 1.0 0.4 0.1 0.1 0.1 0.1

SF4 1.2-1.4 0.4 28.8 6.0 1.0 0.3 0.1 0.1 0.1 0.1

* - вещества белковой природы, определенные методом Брэдфорд, отсутствовали во всех фракциях

** - % от веса обезжиренной водоросли *** - % от навески

Проведено исследование противоопухолевого действия фукоиданов бурых водорослей Средиземного моря О. ро1уросИо1с!е$, Р. рачоп'юа и ЗагдаББит эр. на клетки меланомы человека Р?РМ1-7951 (рис. 2). Ингибирование роста колоний клеток ВРМ1-7951 высокосульфатированными фракциями фукоиданов ОрР4 и РрРЗ (200 мкг/мл) составило 44 и 51 % соответственно. Фукоидан из Эагдаззит эр. БР4 проявил более слабое ингибирование - 28 %.

Рисунок 2 - Ингибирующее действие фукоиданов (ОрР4, РрРЗ и БР4) на рост колоний клеток меланомы человека Р?РМ1-7951

Приведены усредненные результаты 3 независимых экспериментов. ' - различия достоверны при р < 0.05 по сравнению с контролем; " - различия достоверны при р < 0.005 по сравнению с контролем.

2. Состав и характеристики структуры полисахаридов бурой водоросли Е. ЫсусИв (Республика Корея)

2.1. Полисахаридный состав бурой водоросли Е. ЫсусИв

Из бурой водоросли В. ЫсусИв (ЕЬ), собранной у побережья Японского моря, по модифицированной схеме выделения полисахаридов (рис. 3) были получены алыинаты, ламинараны и фукоиданы.

rfl

гЬ

Контроль DpF4 PpF3 SF4

Сухая водоросль

I экстракция (70 % С^ОН, 23 °С, 10 да.)

Обезжиренная водор осль Экстракт

I экстракция (0.1 М НС 1, pH 2.5, 60 °С, 2 х 2 ч)

Остаток водоросли

^ экстракция (2% Na3COj, 55 °С, 2 х 2 ч) Экстракт

диализ, осаждение ^

1р (96% СзНЬОН, 1:3) ш

ЕЬА

Экстракт

нейтрализация, концентрирование, осаждение (96 % CjH^OH, 1:2)

Iii О, гидрофобная хроматография (Полихром-1, 15 % CjHjOH), а ни оно обменная хроматография (Macro-Prep DEAE, Н3 О) концентрирование, лиофильная сушка

анионообменная хроматография (DE АЕ-целлюлоза)

0 5 MNaCl, диализ, концентрирование, ли офилъная сушка

lEbL

lEbFl

1.0 М NaCl, диализ, концентрирование, лиофилшая сушка

LEbF2

1.5 MNaCl, диализ, концентрирование, лиофильная сушка

1ЕЫГЗ

2EbL

Н30, ги^>офо6ная хроматография (Потихром-1,15 % CjHjOH), анионообменная хроматография CMacro-Prep DEAE, Б,0) концентрирование, лиофильная сушкг

0 5 М NaCl, диализ, концентрирование, лиофильная сушка

2ЕЬГ1

Супернатанг

концентрирование, осаждяше (96 % C2HsOH, 1:4)

Супер нат ант

анионообменная хроматография (DEAE-целлюлоз а)

1.0 М NaCl, диализ, конц ентрир овани е, лиофильная сушка

1 5 MNaCl,диализ, концентриров ание, лиофильная сушка

ZEbF2

2EbF3

Рисунок 3 - Схема выделения полисахаридов (альгинатов, ламинаранов и фукоиданов) из бурой водоросли Е. bicyclis

Водорастворимые полисахариды (Р) экстрагировали из обезжиренных водорослей разбавленной кислотой и фракционировали с помощью дробного осаждения полисахаридов из экстракта 2-мя, а затем 4-мя объемами 96 %-го этанола. Выходы и моносахаридный состав полученных фракций 1ЕЬР и 2ЕЬР представлены в табл. 2.

Таблица 2 - Характеристика фракций водорастворимых полисахаридов (1ЕЬР* и 2ЕЬР**), полученных из бурой водоросли Е. ЫсусНв

Фракция Экстракт: этанол Выход, %*" Моносахаридный состав, мол. %

ас Рис Мап Ху1 РЬа

1 ЕЬР 1:2 1.0 91.3 3.5 1.7 1.6 0.6 1.4

2 ЕЬР 1:4 2.1 85.9 10.5 2.3 0.9 0.6 0.4

* - фракция, полученная осаждением 2-мя объемами этанола ** - фракция, полученная осаждением 4-мя объемами этанола *** - % от веса обезжиренной водоросли

Анализ моносахаридного состава 1 ЕЬР и 2ЕЬР показал, что обе фракции содержат глюкозу, фукозу, галактозу, маннозу, ксилозу и рамнозу. Значительное содержание глюкозы указывает на наличие ламинаранов, а содержание фукозы и других моносахаридных остатков - на наличие фукоиданов. В первой фракции содержание глюкозы выше, а фукозы ниже, чем во второй.

Для разделения нейтральных и заряженных полисахаридов, а также фракционирования фукоиданов (Р) использовали анионообменную хроматографию на ОЕАЕ-целлюлозе. Для получения высокоочищенных препаратов ламинаранов (I.) 1ЕЫ и 2ЕЫ- фракции, элюированные с ОЕАЕ-целлюлозы водой, дополнительно очищали от следовых количеств фукоиданов с помощью гидрофобной хроматографии на Полихроме-1, а от пигментов - ионообменной хроматографией на Масго-Ргер ОЕАЕ. После фракционирования фукоиданов на ОЕАЕ-целлюлозе ступенчатым градиентом №С1 получили фракции 1ЕЬР1, 1ЕЬР2, 1ЕЬРЗ, 2ЕЬР1, 2ЕЬР2 и 2ЕЬРЗ. Фракция альгината (А) ЕЬА была получена щелочной экстракцией остатка водоросли после извлечения водорастворимых полисахаридов.

Выходы полисахаридов, выделенных из Е. ЫсусНв, составили от веса обезжиренной водоросли: альгината ЕЬА - 15.8 %; ламинаранов 1ЕЫ. и 2ЕЫ. - 0.6 и 0.8 % соответственно; фукоиданов 1ЕЬР1, 1ЕЬР2, 1ЕЬРЗ, 2ЕЬР1, 2ЕЬР2 и 2ЕЬРЗ - 0.1, 0.2, 0.1, 0.1, 0.2 и 0.8 % соответственно.

2.2. Характеристики структуры полисахаридов бурой водоросли Е. ЫсусПв

Были изучены характеристики структуры полисахаридов из Е. ЫсусИз. Альгинат ЕЬА имеет С ЯМР спектр, в котором присутствуют интенсивные сигналы с химическими сдвигами 101.1 (С1), 70.9 (С2), 72.4 (СЗ), 79.0 (С4), 77.0 (С5) и 176.2 (С6) м.д., соответствующие 1,4-связанным остаткам р-о-маннуроновой кислоты, а также менее интенсивные сигналы с химическими сдвигами 101.9 (С1), 66.0 (С2), 70.0 (СЗ), 80.9 (С4), 68.4 (С5) и 176.2 (С6) м.д., характерные для 1,4-связанных остатков а-1_-гулуроновой кислоты. Соотношение остатков маннуроновой и гулуроновой кислот (М/в) составляет 2.2.

"С ЯМР спектры ламинаранов 1ЕЫ. (рис. 4) и 2ЕЫ. практически идентичны и включают сигналы, характерные для остатков глюкопиранозы, замещенной по положениям 3 и/или 6, и сигнал малой интенсивности с химическим сдвигом 64.5 м.д., характерный для маннита.

В спектре идентифицированы интенсивные сигналы с химическими сдвигами 103.7 (С 1), 74.1 (С2), 85.8 (СЗ), 69.4 (С4), 76.8 (С5) и 62.0 (С6) м.д., соответствующие 1,3-связанным остаткам (З-о-глюкозы, менее интенсивные сигналы с химическими сдвигами 104.3 (С1), 74.6 (С2), 75.8 (СЗ), 70.8 (С4), 76.2 (С5) и 70.1 (С6) м.д., характерные для несвязанных остатков Р-о-глюкозы, а также сигналы 86.6 (СЗ) и 76.0 (С5) м.д., характерные для 1,3,6-связанных остатков р-й-глюкозы. Наличие группы сигналов различной

интенсивности в области 103.7-104.3 м.д., характерных для аномерных атомов углерода, свидетельствует о присутствии в молекулах ламинарана остатков глюкопиранозы, различающихся типом связи и наличием/отсутствием гликозильных заместителей по положениям 3 и/или 6 и соответственно о сложном строении полисахаридов. Кроме того, в "С ЯМР спектре 2ЕЫ. имеются сигналы небольшой интенсивности, соответствующие С1 а- (93.1 м.д.) и 3- (97.0 м.д.) э-глюкозы на восстанавливающих концах молекул ламинарана, что, вместе с сигналом, соответствующим манниту, свидетельствует о низкой молекулярной массе полисахарида.

С6

1.3

С2 С4

1.Í С4 1.3

сз сз

1,3,6 1,3

JLJ

ии

Рисунок 4-13С ЯМР спектр ламинарана 1ЕЬЬ, выделенного из бурой ^^ водоросли Е. ЫсусНв

CNmcastiiUani)

Интервал молекулярных масс ламинарана 1ЕЫ. по данным гель-проникающей хроматографии составляет 19-27 кДа, а ламинарана 2ЕЫ. - 2.5-5.5 кДа. Фракция 1ЕЫ обладает молекулярной массой, значительно превышающей традиционную для ламинаранов (3-6 кДа). Соотношение связей 1,3:1,6 в ламинаранах 1ЕЫ. и 2 ЕЫ. составляет для обеих фракций 1.5:1.

Фукоиданы, выделенные из 1ЕЬР и 2ЕЬР, представляют собой сульфатированные гетерополисахариды (табл. 3).

Таблица 3 - Характеристика фукоиданов из бурой водоросли Е. ЫсусНэ

Фракция фукоидана Элюент [NaCI], М Выход, %** Содержание, %"* Моносахаридный состав, моль/моль Fue

сульфаты | полифенолы Fue | Gal I Man | Xyl | Rha | Glc

Осаждение полисахаридов двумя объемами этанола

1EbF1 0.5 0.1 5.0 0.6 1.0 0.3 0.2 0.1 0.3 0.2

1EbF2 1.0 0.2 21.7 0.5 1.0 0.3 0.1 0 0 0.1

1 EbF3 1.5 0.1 22.2 0.1 1.0 0.3 0.1 0.1 0 0.1

Осанедение полисахаридов четырьмя объемами этанола

2EbF1 0.5 0.1 1.5 0.1 1.0 0 0.7 0.5 0 0.5

2EbF2 1.0 0.2 9.5 0 1.0 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1

2EbF3 1.5 0.8 15.0 0 1.0 0.2 0 0 0 0.1

* - вещества белковой природы, определенные методом Брэдфорд, отсутствовали во всех фракциях.

" - % от веса обезжиренной водоросли. ***-% от навески.

Анализ моносахаридного состава исследуемых фукоиданов показал, что их основным моносахаридным остатком является фукоза. Практически все фукоиданы содержат галактозу, кроме низкосульфатированного полисахарида 2ЕЬР1. Наиболее гетерогенными и низкосульфатированными являются фракции 1ЕЬР1, 2ЕЬР1 и 2ЕЬР2. Фукоиданы 1ЕЬР2, 2ЕЬР2 и 2ЕЬРЗ представляют собой сульфатированные галактофуканы, содержащие небольшие количества маннозы, ксилозы и глюкозы.

У исследуемых в данной работе фукоиданов из Е. ЫсусИэ, как и у многих других природных фукоиданов водорослей, очень сложные 13С ЯМР спектры, которые невозможно интерпретировать полностью. Они содержат интенсивные сигналы в аномерной области (96-104 м.д.), а также типичные для сы-фукопиранозидов сигналы в области высокочастотных полей (16.5-16.9 м.д.). Сигналы 21-22 м.д. (СН3) и 175-176 м.д. (С=0) свидетельствуют о наличии ацетильных групп, а сигналы 61-62 м.д. - о наличии незамещенных по положению 6 остатков галактозы, глюкозы или маннозы.

2.3. Структура необычного ламинарана, выделенного из Е. bicyclis

Ламинаран 1 EbL, выделенный нами из Е. bicyclis, представляет собой 1,3;1,6-ß-D-глюкан уникальной структуры с высоким содержанием 1,6-связанных остатков глюкозы (около 30 %), а также высокой молекулярной массой (19-27 кДа). Как правило, большинство известных ламинаранов имеют молекулярную массу 3-6 кДа и содержание 1,6-связанных остатков глюкозы около 10 %. В литературе отсутствуют данные о выделении из Е. bicyclis, равно как и из других бурых водорослей, ламинаранов с подобными характеристиками структуры. Таким образом, изучение структуры и биологических свойств ламинарана 1 EbL, выделенного нами из Е. bicyclis, представляет безусловный интерес.

Ламинаран 1 EbL (далее - EbL) был изучен с помощью одно- и двумерной ЯМР спектроскопии (1Н, 13С, COSY, TOCSY, HSQC). В результате проведенных исследований в аномерной области 'Н ЯМР спектра EbL были выделены 4 группы сигналов, соответствующие следующим фрагментам структуры: —>3)-ß-D-Glcp-(1 —>3)- и/или —+3,—>6)-ß-D-Glcp-{1—+3)- (4.77 м.д.); -^6)-ß-D-Glcp-(1->3)- и/или ß-D-Glcp-(1->3)- (4.72 м.д.); —»3)-ß-D-Glcp-(1 -»6)- и/или ->3,->6)-ß-D-Glcp-(1-»6)- (4.55 м.д.) и ->6)-ß-D-Glcp-(1—»6)- и/или ß-D-Glcp-(1->6)- (4.52 М.Д.).

Характер замещения моносахаридных остатков в полисахариде был установлен методом метилирования. С помощью ГЖХ-МС в виде ацетатов частично метилированных полиолов были идентифицированы 2,3,4,6-TeTpa-OMe-Glc; 2,4,6-три-OMe-GIc; 2,3,4-Tpn-OMe-Glc и 2,4-ди-ОМе-&с, соответствующие концевым невосстанавливающим, 1,3-, 1,6- и 1,3,6-связанным остаткам глюкозы, в соотношении 1:2.8:1.2:0.8. Наличие довольно большого количества невосстанавливающих концов, а также «точек ветвления» говорит о высокой разветвленное™ полисахарида. Деградация по Смиту ламинарана EbL приводила к его деполимеризации, из чего следует, что остатки 1,6-связанной глюкозы входят в основную цепь ламинарана. Продукты деградации по Смиту были разделены на три олигосахаридные фракции EbLdSI, EbLdS2 и EbLdS3 методом гель-фильтрации (рис. 5).

ort,,, 2

EbLdS2 EbUS3

40 V, »1.1

Рисунок 5 - Гель-фильтрация (Biogel Р-2) ламинарана EbL и продуктов его деградации по Смиту

Фракции EbLdSI, EbLdS2 и EbLdS3 были изучены с помощью ЯМР спектроскопии и МАЛДЙ масс-спектрометрии. Масс-спектры фракций EbLdSI и EbLdS2 показали, что значения степени полимеризации составляющих их олигосахаридов находятся в интервалах 7-18 и 5-9 соответственно. Интересно, что в 1Н ЯМР спектрах сравнительно высокомолекулярных фракций EbLdSI и EbLdS2 помимо сигналов, характерных для С1 1,3-связанной p-D-глюкозы (4.7-4.8 м.д), имеются также сигналы малой интенсивности 4.52 (С1) и 4.22 (С6) м.д., свидетельствующие о наличии 1,6-связанных остатков глюкозы (соотношение связей 1,3:1,6 = 4:1). Мы предположили, что в ламинаране имеются 1,6-связанные остатки глюкозы в недоступных для деградации по Смиту фрагментах. Возможно, некоторые остатки глюкозы в ламинаране гликозилированы по положению 6 не единичными остатками глюкозы, а остатками ламинариолигосахаридов, что обеспечивает недоступность подобной конструкции для реагента. В 'Н ЯМР спектре наиболее низкомолекулярной фракции EbLdS3 присутствуют только сигналы, характерные для 1,3-связанных остатков глюкозы (4.7-4.8 м.д.), а масс-спектр содержит сигналы mlz [M + glycerolf в интервале 439.3-763.5, свидетельствующие о наличии олигосахаридов со степенью полимеризации 2-4, имеющих на восстанавливающем конце остаток глицерина. Эти данные позволили предположить, что протяженность участков, построенных из остатков 1,3-связанной глюкозы без разветвлений или с разветвлениями в виде одного остатка глюкозы по положению 6, составляет не более четырех остатков глюкозы.

Было проведено изучение динамики накопления продуктов гидролиза ламинарана EbL, катализируемого ферментами различного типа действия: эндо-1,3-р-о-глюканазой LIV из Pseudocardium sacchalinensis и экзо-1,3-р-р-глюканазой из Chaetomium indicum. Ламинаран из Saccharina cichorioides (ScL) с установленными характеристиками структуры (соотношение связей 1,3:1,6 = 9:1; 1,6-связанные остатки глюкозы находятся в виде единичных ответвлений от основной цепи, состоящей из 1,3-связанных остатков глюкозы) был использован в качестве образца сравнения. Графики зависимости степени гидролиза обоих ламинаранов от времени действия эндо- и экзоглюканаз представлены на рис. 6 (а и б).

% ПЕДрОЛШЯ

100 -| 80

Рисунок 6 -Накопление продуктов гидролиза ламинаранов ScL и EbL эндо- (а) и экзо-1,3-P-D-глюканазами (б) во времени

+ 100 мtл фермента

ScL 3 ScL 2 _

2 3

Время, ч

+ 100 МКЛ фермента

, ScL

0 1 2 3 4 5 23 24

Время, ч

Накопление восстанавливающих Сахаров в процессе ферментативного гидролиза обычно пропорционально времени реакции до того момента, когда скорость замедляется в силу исчезновения субстрата. Кривые накопления продуктов реакции, образующихся из ламинарана вс!. под действием эндо- и экзо-1,3-Р-о-глюканаз, состоят из трех участков (рис. 6). Первый участок (1) отражает прямо пропорциональную зависимость накопления продуктов от времени реакции, на втором участке (2) в результате исчезновения субстрата скорость накопления продуктов реакции начинает равномерно убывать и выходит на плато (участок 3).

При действии как эндо-, так и экзо-1,3-Р-э-глюканаз на ламинаран ЕЫ кривые накопления продуктов ферментативного гидролиза ломимо вышеописанных трех участков имеют отчетливо выраженные лаг-периоды (0), свидетельствующие о преобладании в структуре ламинарана участков, труднодоступных для ферментов из-за разветвлений и включений достаточно большого количества остатков 1,6-связанной глюкозы в цепь полисахарида, а также сосредоточении 1,6-связанных остатков глюкозы на невосстанавливающих концах молекул, что затрудняет протекание ферментативной реакции.

Степень исчерпывающего гидролиза ламинаранов ЕЫ. и Эс1- эндо-1,3-р-о-глюканазой составила 25.2 и 62.2 %, экзо-1,3-р-о-глюканазой - 42.8 и 74.1 % соответственно.

Для препаративного получения продуктов ферментативного гидролиза ламинаран ЕЫ инкубировали с эндо- (получили смесь олигосахаридов ЕЫепс1о), а также экзо-1,3-Р-О-глюканазой (ЕЫехо' и ЕЫехо). Фракции ЕЫепс)о, ЕЫехо' и ЕЫехо были получены при степени гидролиза ламинарана 25.2, 18.7 и 42.8 % соответственно. Продукты ферментативного гидролиза (ЕЫеп(1о и ЕЫехо) были разделены на Вюде1 Р-2. В результате были получены препараты глюкоолигосахаридов ЕЫепсЫ, ЕЫепс1о2, ЕЫ_епс1оЗ, ЕЫепсЫ и ЕЫехо1, ЕЫехо2, ЕЫехоЗ, ЕЫехо4, ЕЫехо5, различающиеся по степени полимеризации и соотношению связей 1,3:1,6. Из фракции ЕЫехо' хроматографией на Вюде! Р-2 была выделена наиболее высокомолекулярная фракция ЕЫехо'1. Характеристики ламинариолигосахаридов представлены в табл. 4.

Таблица 4 - Характеристика продуктов ферментативного гидролиза ламинарана

Фракция Выход, %* Степень полимеризации олигосахаридов** Соотношение связей 1,3:1,6"*

Эндоглюканаза

ЕЫепс1о1 37.0 01сэ- С1с2з 1:1

ЕЫепс!о2 14.2 Э1с4- С1с12 0.9:1

ЕЫепс)оЗ 17.8 С1с2-С1с3 1:1

ЕЫепсЫ 6.1 &с -

Экзоглюканаза

ЕЫехо'1 - С1с9- С1с2з 1.4:1

ЕЫехо1 18.7 С1с<— С1с12 0.6:1

ЕЫехо2 6.3 С1с4 0.5:1

ЕЫехоЗ 4.7 в1сз 0.6:1

ЕЫехо4 10.3 ас2 0:1

ЕЫехо5 34.7 С1с -

* - % от навески исходного ламинарана ЕЫ

** - определено методом МАЛДИ масс-спектрометрии

*** - определено методом 1Н ЯМР спектроскопии

Фракция EbLendo3, содержащая трисахарид и следовые количества дисахарида, была изучена с помощью одно- и двумерной ЯМР спектроскопии (1Н, "С, COSY, TOCSY, HSQC). Анализ показал, что трисахарид имеет структуру ß-D-Glcp-(1-»6)-ß-D-Glcp-(1->3)-D-Glc. Выход фракции EbLendo4, содержащей глюкозу, составил 6.1 % от исходного ламинарана EbL. Согласно специфичности фермента, представлялось возможным оценить количество глюкозы, составляющей блоки из 1,3-связанных остатков без разветвлений по положению 6 со степенью полимеризации более чем 2. Таким образом, исходя из степени гидролиза ламинарана эндоглюканазой - 25.2 %, большинство 1,3-связанных блоков, доступных для действия фермента, представляет собой дисахаридные звенья. Об этом также говорит небольшое количество дисахарида среди продуктов реакции и результаты деградации ламинарана EbL по Смиту.

'Ни С ЯМР спектры фракции EbLexo4 соответствуют спектрам гентиобиозы. В 1Н и 13С ЯМР спектрах фракции EbLexo3 присутствуют сигналы, характерные для гентиотриозы и трисахарида со структурой ß-D-Glcp-(1->3)-ß-D-Glcp-(1-»6)-D-Glc в соотношении 0.3:0.7. Фракция EbLexo2 по данным ЯМР спектроскопии представляет собой смесь тетрасахаридов. Тандемный масс-спектр иона [Glc4+Na]* с m/z 689.2 из этой фракции, полученный ИЭР масс-спектрометрией в режиме МС/МС, указывает на присутствие гентиотетраозы среди тетрасахаридов фракции EbLexo2. Набор олигосахаридов, полученных из EbL после гидролиза экзоглюканазой, предполагает структурное разнообразие различных фрагментов в исходном ламинаране. Известно, что в результате гидролиза ламинарана из S. cichorioides, содержащего цепь из 1,3-связанной глюкозы с единичными ответвлениями по положению 6 в виде остатков глюкозы, экзоглюканазой из Eulota maakii из разветвлений образуется гентиобиоза. Таким образом, мы можем предположить, что продукты гидролиза ламинарана EbL экзоглюканазой из С. indicum, содержащие только 1,6-связанные остатки глюкозы: гентиобиоза, гентиотриоза, гентиотетраоза - образуются из фрагментов, находящихся в разветвлениях, а продукты, содержащие 1,3-связанную глюкозу на невосстанавливающем конце: ß-D-Glcp-(1->3)-ß-D-Glcp-(1-*6)-D-Glc; ß-D-Glcp-(1-*3)-ß-D-Glcp-(1->6)-ß-d-Glcp-(1 —>6)-d-GIc - возникают из фрагментов цепи ламинарана.

Ламинаран EbL содержит около 18 % (табл. 4) участков, включающих фрагмент структуры -»3)-ß-D-Glcp-(1->6)-ß-D-Glcp-(1->3)-ß-D-Glcp-(1->, различные варианты которых представлены на рис. 7 (а, б, в).

-»■3)-ß-D-Glci>-(l_v iJ-ß-D-GlciJ-tl-»- 3)-P-d-G1cp-(1 [-»-3)-P-D-Gl4v(l-». J>

а x = 2-4 r

-*. 3)-ß-D-Gkp-(l 3)-P-D-Glcp-(l ^ 3)-|i-D-GlcHl l-*- 6)-ß-D-GIcHl "*■> 3)-N>-GlyKl

P-D-Glcp-(1 6 у =1-3 Д

-»■3)-P-D-Glcp-(l ■*• 3)-p-D-Glc^-(l ■*

-»3)-ß-D-Glcf-(]->-3)-ß-D-Glc;-(l-»- 6)

6) + t P-D-Glcp-(1 [-»• 6)-p-D-Glc/)-(l ],

♦ 3)-ß-D-Glv-(l в e

z = l-3

Рисунок 7 - Фрагменты структуры ламинарана EbL

Ламинаран EbL отличается высоким содержанием 1,6-связанных остатков глюкозы (соотношение связей 1,3:1,6 = 1.5:1), которые находятся как в ответвлениях, так и в основной цепи ламинарана. Протяженность участков, построенных из остатков 1,3-связанной глюкозы, составляет не более четырех остатков (рис. 7 г), большинство 1,3-связанных блоков представляют собой дисахаридные звенья. 1,6-Связанные остатки глюкозы, предположительно, сосредоточены на невосстанавливающих концах молекул. Длина 1,6-связанных блоков не превышает три остатка глюкозы (рис. 7 д). Анализ результатов исследования показал, что в ответвлениях по положению 6 могут

находиться как единичные остатки глюкозы, так и остатки ламинариолигосахаридов (рис. 7 в), а также гентиобиозы и гентиотриозы (рис. 7 е).

2.4. Противоопухолевая активность ламинарана и продуктов его ферментативного гидролиза

Противоопухолевое действие исходного ламинарана ЕЫ. и олигосахаридов, полученных ферментативным гидролизом - ЕЫепс1о1, ЕЫ_епс1о2, ЕЫ.ехо'1 и ЕЫехо1, в концентрации 100 мкг/мл было изучено на клетках меланомы человека БК-МЕЬ28 и рака кишечника человека 01_0-1. Было показано, что все препараты более эффективно действуют на клетки рака кишечника человека 010-1, чем на клетки меланомы человека 5К-МЕ1.-28. Общие закономерности сохранялись в обоих случаях (рис. 8).

Ингибирование роста колоний клеток меланомы 5К-МЕ1_-28 и рака кишечника человека 01.0-1 высокомолекулярным ламинараном ЕЫ составило 15 и 38 % соответственно. Фракции олигосахаридов ЕЫ_епс1о1 и ЕЫ.ехо'1, обогащенные 1,6-связанными остатками глюкозы и характеризующиеся интервалом степени полимеризации 9-23, в сравнении с ЕЫ- показывают более высокое противоопухолевое действие по отношению к обоим типам клеток. Дальнейшее уменьшение молекулярной массы до 4-13 остатков глюкозы (фракции ЕЫ_епс1о2 и ЕЫ.ехо1) приводит к снижению активности. Сравнение действия препаратов ЕЫепс!о1 и ЕЫехо'1, а также ЕЫ_епс1о2 и ЕЫ_ехо1, характеризующихся сходным интервалом молекулярных масс и различным соотношением связей 1,3:1,6 (табл. 4), показывает возрастание противоопухолевой активности с увеличением количества 1,6-связанных остатков глюкозы.

85 %

50 % f

fi rfi

Контроль

£L

EbUndol EbLendo2 EbLexo'l EbLtxol

Контроль EbL EbLendol EbLendo2 EbLexo'l EbLexol

Рисунок 8 -

Ингибирующее действие фракций EbL, EbLendol, EbLendo2, EbLexo'1 и EbLexol на рост колоний клеток меланомы человека SK-MEL-28 (а) и рака кишечника человека DLD-1 (б)

Приведены усредненные результаты 3 независимых экспериментов. " - различия достоверны при р<0.05 по сравнению с контролем; " - различия достоверны при р < 0.005 по сравнению с контролем.

Таким образом, была выявлена взаимосвязь между противоопухолевым действием ламинариолиго- и полисахаридов, выделенных из бурой водоросли £. ЫсусНз и характеристиками их структуры. Уменьшение молекулярной массы нативного ламинарана, а также увеличение содержания 1,6-связанных остатков глюкозы способствует возрастанию противоопухолевой активности. Исходя из этих результатов, самым перспективным противоопухолевым агентом является полученный гидролизом ламинарана из Е. ЫсусНз эндоглюканазой препарат EbLendo1. Он представляет собой

смесь олигосахаридов со степенью полимеризации в интервале 9-23 и соотношением связей 1,3:1,6 =1:1.

3. Характеристики структуры и противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей S. horneri, С. costata, Е. bicyclis и Е. cava (Республика Корея)

Выделение фукоиданов из бурых водорослей S. horneri, С. costata, Е. bicyclis и Е. cava, собранных у побережья Японского моря, проводили по схеме, представленной на рис. 1. Нами были получены следующие фракции фукоиданов: из S. horneri -ShF1, ShF2 и ShF3, С. costata - CcF, E. bicyclis - EbF, E. cava - EcF1 и EcF2.

По данным анализа моносахаридного состава (табл. 5) фукоидан ShF1 является сульфатированным фуканом, содержащим следовые количества галактозы и рамнозы, фукоидан ShF3 - сульфатированным рамнофуканом. Степень сульфатирования ShF1 и ShF3 составляет 14.9 и 16.9 % соответственно.

Таблица 5 - Характеристика фукоиданов из бурых водорослей S. hörnen, С. costata, Е. bicyclis и £. cava *

Водоросль, Элюент Выход, Сульфаты, Моносахаридный состав,

фракция [NaCI], M %** %*** моль/моль Fuc

фукоидана Fuc Gal Man Xyl Rha Glc

S. horneri

ShF1 0.5-1.0 1.5 14.9 1.0 0.1 0 0 0.1 0

ShF2 1.0-1.3 1.3 0 1.0 0 0 0 0.2 0

ShF3 1.3-1.7 0.3 16.9 1.0 0 0 0 0.5 0

С. costata

CcF 1.0-1.4 0.2 18.9 1.0 0.8 0 0.1 0.1 0

E. bicyclis

EbF 0.8-1.4 1.4 13.5 1.0 0.3 0.1 0.1 0 0

E. cava

EcF1 0.8-1.3 0.8 19.1 1.0 0.2 0.1 0 0.2 0

EcF2 1.3-1.4 0.2 22.2 1.0 0.3 0 0.1 0 0.4

* - вещества белковой природы, определенные методом Брэдфорд, и полифенолы отсутствовали во всех фракциях ** - % от веса высушенной водоросли *** - % от навески

В "С ЯМР спектрах фукоиданов 51^1 и БЬ^З присутствуют интенсивные сигналы в аномерной области, характерные для 1,3-связанных остатков фукозы (100.0-100.3 м.д.), и сигналы меньшей интенсивности, соответствующие остаткам 1,4-связанной фукозы (98.9-99.7 м.д.). Фукоидан 31^2 состоит в основном из фукозы и небольшого количества рамнозы. 13С ЯМР спектр БЬР2 содержит сигналы 99.1 и 94.8 м.д. приблизительно равной интенсивности, характерные для 1,3- и 1,4-связанных несульфатированных остатков фукозы (рис. 9). Отсутствие сульфатных групп у фукоидана 31^2, элюируемого высокими концентрациями ЫаС1, также подтверждается данными химического анализа. Причины сорбции его на ионообменнике не установлены.

Фукоиданы СсР и ЕЬР представляют собой сульфатированные (18.9 и 13.5 % соответственно) галактофуканы, содержащие минорные количества других моносахаридов. По данным "С ЯМР спектроскопии фукоидан СсР также содержит ацетильные группы (21.0 и 173.7 м.д.). Фукоиданы ЕсР1 и ЕсР2 являются рамногалактофуканом и галактоглюкофуканом, содержащими 19.1 и 22.2 % сульфатов соответственно.

№

Рисунок 9 - "С ЯМР спектр фукоидана ShF2, выделенного из бурой водоросли S. horneri

Противоопухолевое действие фукоиданов бурых водорослей S. horneri, С. costata, Е. cava и Е. bicyclis в концентрации 100 мкг/мл было изучено на клетках меланомы человека SK-MEL-28 (рис. 10 а) и рака кишечника человека DLD-1 (рис. 10 б).

Наиболее высокой противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака кишечника человека DLD-1 обладают фукоиданы ShF1, CcF, EcF1 и EbF (44, 55, 50 и 49 % соответственно). Ингибирование роста колоний клеток меланомы человека SK-MEL-28 этими же фукоиданами было не столь велико и составило 15, 20, 30 и 12 % соответственно. Фукоиданы ShF2, ShF3, несмотря на разную степень сульфатирования (табл. 5), показывают близкие значения противоопухолевой активности по отношению к обеим культурам клеток (31-32 %). Все остальные фукоиданы проявляют более высокое противоопухолевое действие на клетки рака кишечника человека DLD-1 в сравнении с клетками меланомы человека SK-MEL-28.

Исходя из характеристик структуры выделенных фукоиданов, можно выявить некоторую взаимосвязь между их структурой и противоопухолевыми свойствами. Наибольшим противоопухолевым действием на клетки рака кишечника человека DLD-1 обладают фукоиданы ShF1, EcF1, CcF и EbF, содержащие либо фукозу, либо фукозу и галактозу. Фукоиданы ShF2, ShF3 и EcF2, содержащие рамнозу, в большей степени ингибируют рост колоний клеток меланомы человека SK-MEL-28. Степень сульфатирования (0; 13.5-22.2 %) не оказывает выраженного влияния на проявление противоопухолевой активности по отношению к обеим культурам клеток.

» SK-MEL-28

_L I

Контроль ShFl

EbF DLD-1

гЬ

r+i

Рисунок 10 -Ингибирующее действие фукоиданов (БЬР1, 5ИР2, ЭИРЗ, ЕсР1, ЕсР2, Сер и ЕЬР) на рост колоний клеток меланомы человека SK-MEL-28 (а) и рака кишечника человека DLD-1 (6)

Приведены усредненные результаты 3 независимых экспериментов. ' - различия достоверны при р < 0.05 по сравнению с контролем.

Контроль ShFJ

4. Влияние предварительной обработки бурых водорослей F. evanescens,

5. japónica и S. oligocystum на выходы и характеристики структуры фукоиданов

Бурые водоросли F. evanescens, S. japónica (Японское море, Россия) и S. oligocystum (Южно-Китайское море, Социалистическая Республика Вьетнам) являются промысловыми видами и по имеющимся данным отличаются как составом низкомолекулярных веществ, так и содержанием и характеристиками структуры полисахаридов. Для экстракции низкомолекулярных веществ из F. evanescens (Fe), S. japónica (Sj) и S. oligocystum (So) были выбраны три метода. Первый метод был классическим и представлял собой обработку водорослей 70 %-ым водным этанолом (образцы 1Fe, 1Sj и 1So), второй включал в себя экстракцию сверхкритическим диоксидом углерода (образцы 2Fe, 2Sj и 2So), третий - экстракцию сверхкритическим диоксидом углерода с добавлением 5 % этанола в качестве сорастворителя (образцы 3Sj и 3So).

Фракции, содержащие водорастворимые полисахариды (Р) 1 FeP, 2FeP, 1SjP, 2SjP, 3SjP, 1SoP, 2SoP и 3SoP, были получены экстракцией разбавленной кислотой из высушенных после предобработки водорослей. Выделение и фракционирование фукоиданов (F) из полисахаридных препаратов проводили с помощью анионообменной хроматографии на Macro-Prep DEAE (рис. 11).

lFeF 2F(F

C(NnCI),

í л

1Fí ч Г

2 F« 7;

С (NaQ),

.M'j.W/l

V, мл

фракции. выделенные in водорослей, предварите - - по методу I . - по методу 2 . - по методу 3

Рисунок 11 - Ионообменная хроматография на Macro-Prep DEAE (СГ form, 8 х 2.5 см) водорастворимых полисахаридов из F. evanescens (a), S. japónica (б) и S. oligocystum (в)

Выход фракции фукоидана из F. evanescens 1FeF (5.1 %) был выше выхода аналогичной фракции 2FeF (3.0 %). Степени сульфатирования 1FeF и 2FeF имеют близкие значения (34.6 и 39.2 %). Изучение моносахаридного состава фракций показало, что препарат 1FeF представляет собой практически чистый фукан, в то время как препарат 2FeF содержит также небольшие количества галактозы и маннозы (табл. 6).

Фракции фукоиданов из S. japónica 1SjF1 и 2jF1 имеют невысокую степень сульфатирования (14.0 и 11.8 %), фракции 1SJF2 и 2SjF2 являются высокосульфатированными (26.3 и 27.0 %) полисахаридами. Интересно отметить, что из образца водоросли 3 Sj анионообменной хроматографией на Macro-Prep DEAE была получена только высокосульфатированная (27.3 %) фракция 3SjF2 (рис. 11). Проценты

выхода фракций 1Б)Р1 и 2Б]Р1 близки по значению (0.4 %), так же, как и выходы фракций 1 Б]Р2, 2Б}Р2 и ЗЭ]Р2 (1.3-1.4 %). Изучение моносахаридного состава низкосульфатированных фракций 13]П и 2^1 показало, что данные препараты являются гетерогенными фукоиданами, содержащими фукозу в качестве основного моносахаридного остатка, а также галактозу, маннозу, ксилозу и глюкозу. Высокосульфатированные фракции 1 23]Р2 и 33]Р2 представляют собой галактофуканы (Рис:Са1 = 1:0.4), причем препарат 25]Р2 содержит также небольшое количество маннозы (табл. 6).

Таблица 6 - Характеристика фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens, S. japónica и S. oligocystum*

Водоросль, фракция фукоидана Метод предобработки водорослей" Выход, Элюент [NaCI], М Содержание, % **** Моносахаридный состав, моль/моль Fue

сульфаты поли фенолы

Fue I Gal I Man I Xyl I Glc

F. evanescens

1FeF 1 5.1 0.3-1.9 34.6 0.5 1.0 0 0 0 0

2FeF 2 3.0 0.3-1.9 39.2 1.5 1.0 0.1 0.1 0 0

S. japónica

1SjF1 1 0.4 0.1-0.6 14.0 0 1.0 0.4 0.5 0.4 0.2

1SjF2 1 1.3 0.8-1.6 26.3 0.1 1.0 0.4 0 0 0

2SjF1 2 0.4 0.1-0.6 11.8 0.1 1.0 0.5 0.4 0.3 0.2

2SjF2 2 1.3 0.8-1.6 27.0 0.1 1.0 0.4 0.1 0 0

3S]F2 3 1.4 0.8-1.6 27.3 0.1 1.0 0.4 0 0 0

S. oligocystum

1SoF1 1 0.3 0.1-0.6 17.4 0.4 1.0 0.2 0.8 0.1 0.2

1SoF2 1 0.7 0.6-1.2 24.0 1.1 1.0 0.4 0.2 0.1 0.2

1SoF3 1 0.6 1.2-1.6 32.0 0.1 1.0 0.3 0 0 0

2SoF1 2 0.4 0.1-0.6 16.4 2.1 1.0 0.3 0.6 0.1 0.1

2SoF2 2 0.6 0.6-1.2 23.4 1.7 1.0 0.3 0.2 0.1 0.1

2SoF3 2 0.3 1.2-1.6 34.0 0.1 1.0 0.3 0.1 0 0

3SoF2 3 0.6 0.6-1.2 28.8 1.5 1.0 0.4 0.2 0.1 0.2

3SoF3 3 0.3 1.2-1.6 32.0 | 0.5 1.0 0.3 0 0 0

* - вещества белковой природы, определенные методом Брэдфорд, отсутствовали во всех фракциях

** - предварительная обработка водоросли 70 %-ым этанолом (1); сверхкритическим диоксидом углерода (2); сверхкритическим диоксидом углерода с добавлением 5 % этанола (3)

*** - % от веса обезжиренной водоросли **** - % от навески

Из образцов S. oligocystum 1So и 2So были выделены низкосульфатированные фракции - 1SoF1, 2SoF1 и по две высокосульфатированных - 1SoF2, 2SoF2 и 1SoF3, 2SoF3. Из 3So были получены только высокосульфатированные фракции 3SoF2 и 3SoF3, низкосульфатированная фракция отсутствовала, как и у S. japónica, обработанной таким же образом. Фракции фукоиданов 1SoF1 и 2SoF1 представляют собой гетерогенные полисахариды, основным моносахаридным остатком которых является фукоза. Выделенные фукоиданы содержат галактозу, маннозу, ксилозу и глюкозу в небольших количествах (табл. 6). Выходы (0.3 и 0.4 %) и степени сульфатирования (17.4 и 16.4 %) фукоиданов 1SoF1 и 2SoF1 близки по значениям.

Среднесульфатированные фракции 1SoF2, 2SoF2 и 3SoF2 (степени сульфатирования 22.4-28.8 %) также представляют собой гетерогенные полисахариды, основным моносахаридным остатком которых является фукоза. В отличие от предыдущих фракций, высокосульфатированные (32.0-34.0 %) фукоиданы 1SoF3, 2SoF3 и 3SoF3 являются галактофуканами (Fuc:Gal = 1:0.3), причем полисахаридный препарат 2SoF3 содержит также примесь маннозы (табл. 6). Проценты выхода среднесульфатированных фракций 1SoF2, 2SoF2 и 3SoF2 близки по значению (0.6-0.7 %), в то время как выход высокосульфатированной фракции 1SoF3 (0.6 %) превысил выходы 2SoF3 и 3SoF3 (0.3 %)•

Таким образом, можно сделать вывод, что использование перед выделением полисахаридов в качестве предварительной обработки бурых водорослей экстракции сверхкритическим диоксидом углерода позволяет получить препараты фукоиданов в количествах, эквивалентных выходам в случае стандартной обработки водорослей органическими растворителями. Следует отметить, что из водоросли, обработанной сверхкритическим диоксидом углерода с добавлением 5 % этанола, были получены только высокосульфатированные фракции фукоиданов, так как, по-видимому, извлечение гетерогенной по моносахаридному составу низкосульфатированной фракции происходит при экстракции сверхкритическим диоксидом углерода. Модификация схемы выделения фукоиданов, связанная с заменой экстракции органическими растворителями экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода с добавлением 5 % этанола, в подобных случаях позволит исключить стадию анионообменной хроматографии, что может сократить расходы на промышленное производство фукоиданов и упростить их стандартизацию.

5. Сравнение содержания и характеристик структуры фукоиданов разных видов бурых водорослей, собранных в различных регионах

В настоящей работе из 10 видов бурых водорослей порядков Dictyotales, Laminariales и Fucales, произрастающих в различных регионах, по общей схеме выделения (рис. 1) были получены 24 фракции фукоиданов, существенно различающиеся по содержанию их в водорослях и характеристикам структуры. Представляло интерес сравнение содержания и характеристик структуры фукоиданов в зависимости от порядка и места произрастания водорослей.

Результаты проведенных нами исследований показали, что фукоиданы из бурых водорослей порядка Dictyotales (D. polypodioides, P. pavonica) представляют собой гетерогенные сульфатированные полисахариды. Некоторые из фракций фукоиданов содержат также ацетильные группы. Фукоиданы, выделенные из водорослей порядка Laminariales (С. costata, Е. bicyclis, Е. cava, S. japónica), являются сульфатированными галактофуканами, содержащими минорные количества других моносахаридов. Фукоидан из С. costata сульфатирован и ацетилирован. Из бурой водоросли F. evanescens (порядок Fucales, семейство Fucaceae) выделен сульфатированный фукан, а из водорослей того же порядка семейства Sargassaceae - полисахариды различной структуры: фукан, рамнофуканы, галактофуканы, а также гетерогенные полисахариды.

Исследование содержания фукоиданов в зависимости от систематического положения водорослей показало, что наибольшее количество фукоиданов продуцируют водоросли порядка Fucales (1.0-5.1 % от веса обезжиренной водоросли). Количество фукоидана в водорослях порядка Laminariales варьирует в пределах 0.2-1.7 % от веса обезжиренной водоросли. Самые низкие выходы фукоиданов (0.2-0.3 % от веса обезжиренной водоросли) наблюдаются у водорослей порядка Dictyotales, произрастающих в теплом Средиземном море.

Можно отметить, что водоросли одного и того же порядка, собранные в Японском море (Россия, Республика Корея), синтезируют фукоиданы с большими выходами, чем водоросли Средиземного (Ливанская республика) и Южно-Китайского (Социалистическая Республика Вьетнам) морей.

Таким образом, содержание и характеристики структуры выделенных фукоиданов варьируют в зависимости от видовой принадлежности водоросли и условий ее произрастания. Проведенные нами исследования расширяют и дополняют

существующие сведения о характеристиках структуры фукоиданов водорослей разных порядков.

ВЫВОДЫ

1. Определен полисахаридный состав бурых водорослей Dictyopteris polypodioides, Padina pavonica, Sargassum sp. и Eisenia bicyclis. Показано, что основная часть полисахаридов представлена альгинатами (12-16 % от веса обезжиренной водоросли). Ламинаран из D. polypodioides представляет собой 1,3-р-о-глюкан, ламинаран из P. pavonica- 1,3;1,6-(5-о-глюкан (1,3:1,6 = 5:1), ламинаран из £. bicyclis - смесь высоко- и низкомолекулярного 1,3;1,6-Р-о-глюканов (1,3:1,6 = 1.5:1). В Sargassum sp. ламинаран отсутствовал. Фукоиданы исследуемых водорослей являются сульфатированными, некоторые - сульфатированными и ацетилированными гетерополисахаридами.

2. Впервые выделен уникальный высокомолекулярный (19-27 кДа) сильноразветвленный ламинаран из Е. bicyclis. Основная цепь ламинарана состоит из 1,3- и 1,6-связанных остатков P-D-глюкозы: протяженность участков, построенных из 1,3-связанных остатков глюкозы, составляет не более четырех, а из 1,6- - не более трех моносахаридов. Основная часть 1,6-связанных остатков глюкозы сосредоточена на невосстанавливающих концах молекул. В ответвлениях по положению 6 находятся остатки глюкозы, гентиобиозы, гентиотриозы и ламинариолигосахаридов.

3. Показано, что уменьшение молекулярной массы нативного ламинарана из Е. bicyclis до определенного предела (степень полимеризации 9-23), а также увеличение содержания 1,6-связанных остатков P-D-глюкозы (1,3:1,6 = 1:1) приводят к возрастанию противоопухолевой активности по отношению к клеткам меланомы человека SK-MEL-28 и рака кишечника человека DLD-1.

4. В составе фукоидана из Sargassum horneri обнаружены сульфатированный фукан, несульфатированный и сульфатированный рамнофуканы. Фукоиданы из Costaría costata и Е. bicyclis представлены сульфатированными галактофуканами. Фукоидан из С. costata ацетилирован. Фукоидан из Ecklonia cava состоит из сульфатированных рамногалакто- и галактоглюкофуканов.

5. Изучение противоопухолевой активности фукоиданов из S. horneri, С. costata, Е. cava и Е. bicyclis показало, что наиболее эффективными по отношению к клеткам меланомы человека SK-MEL-28 являются фукоиданы, содержащие рамнозу, к клеткам рака кишечника человека DLD-1 - фуканы и галактофуканы. Степень сульфатирования не оказывает выраженного влияния на противоопухолевую активность.

6. Впервые использована предварительная обработка Fucus evanescens, Saccharina japónica и S. oligocystum сверхкритическим диоксидом углерода. Получены препараты фукоиданов в количествах, эквивалентных выходам при обработке органическими растворителями. При экстракции сверхкритическим диоксидом углерода с 5 % этанола в качестве сорастворителя происходит удаление гетерогенных низкосульфатированных фракций фукоиданов, что позволяет сократить число стадий очистки.

7. В работе охарактеризованы фукоиданы 10 видов бурых водорослей, собранных в различных регионах. Показано, что фукоиданы исследуемых водорослей порядка Dictyotales представляют собой гетерогенные полисахариды, Laminariales -галактофуканы, Fucales - полисахариды различного строения: от фуканов до гетерогенных полисахаридов. Наибольшее количество фукоиданов продуцируют водоросли порядка Fucales, среднее - Laminariales, наименьшее - Dictyotales. Содержание фукоиданов уменьшается, а гетерогенность моносахаридного состава возрастает с повышением температуры среды обитания водорослей.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Ermakova S., Sokolova (Menshova) R., Kim S.M., Urn B.H., Isakov V., Zvyagintseva T. Fucoidans from brown seaweeds Ecklonia cava, Sargassum horneri, Costaria costata: structural characteristics and anticancer activity II Appl. Biochem. Biotech. - 2011. - Vol. 164. -P. 841-850.

2. Соколова (Меньшова) P.В., Ермакова С.П., Awada S.M., Звягинцева Т.Н., Hussein К.М. Состав, структурные характеристики и противоопухолевые свойства полисахаридов бурых водорослей Dictyopteris polypodioides и Sargassum sp. (Ливан) // Химия природ, соедин. - 2011. - Т. 47. - С. 297-303.

3. Меньшова Р.В., Ермакова С.П., Rachidi S.M., Al-Hajje А.Н., Звягинцева Т.Н., Hussein К.М. Сезонные изменения состава, структурных характеристик и противоопухолевые свойства полисахаридов Padina pavonlca (Ливан) в зависимости от состава // Химия природ, соедин. - 2011. - Т. 47. - С. 764-769.

4. Меньшова Р.В., Лепёшкин Ф.Д., Ермакова С.П., Покровский О.И., Звягинцева Т.Н. Влияние условий предварительной обработки бурых водорослей сверхкритическими флюидами на выход и структурные характеристики фукоиданов // Химия природ, соедин. - 2012. - Т. 48. - С. 823-826.

5. Соколова (Меньшова) Р.В., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Полисахариды бурых водорослей Sargassum sp. и Dictyopteris polipodioides Средиземного моря // Тез. докл. XIII Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток.-2010.-С. 19.

6. Соколова (Меньшова) Р.В., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Бурые водоросли побережья Ливана (Sargassum sp., Dictyopteris polipodioides, Padina pavonica) как источник биологически активных полисахаридов // Тез. докл. V Международного симпозиума «Химия и химическое образование». Владивосток. - 2011. - С. 44-46.

7. Соколова (Меньшова) Р.В., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Биологически активные полисахариды бурых водорослей Средиземного моря Dictyopteris polipodioides, Padina pavonica и Sargassum sp. (Ливан) // Тез. докл. IV Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». Южно-Сахалинск. -2011. - С. 140-141.

8. Sokolova (Menshova) R., Vishchuk О., Ermakova S., Zvyagintseva T. Brown algae as source of sulphated polysaccharides with anticancer activity // Abstracts of the 3rd Annual Korea-Russian Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application. Gangneung. - 2011. - P. 333.

9. Меньшова P.B., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Состав и структурные характеристики полисахаридов бурой водоросли Eisenia bicyclis (Ю. Корея) // Тез. докл. XIV Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. - 2012. - С. 38.

10. Ermakova S., Menshova R., Vishchuk О., Um B.H., Zvyagintseva Т. Brown algae of the Republic of Korea coasts are a source of biological active substances // Abstracts of the 4th Annual Korea-Russia Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology». Novosibirsk.-2012.-P. 31.

Соискатель

Меньшова P.В.

Меньшова Роза Владимировна

Полисахариды некоторых видов бурых водорослей

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 20.12.2012 г. Формат 60x84 1/16. Усл. п. л. 1,43. Тираж 120 экз. Заказ 779 Отпечатано в Типографии ИД ДВФУ 630990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Меньшова, Роза Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Альгиновые кислоты.

2.1.1. Общие сведения.

2.1.2. Характеристики структуры.

2.1.3. Методы выделения.

2.1.4. Методы установления структуры.

2.1.5. Биологическая активность.

2.2. Ламинараны.

2.2.1. Общие сведения.

2.2.2. Характеристики структуры.

2.2.3. Методы выделения.

2.2.4. Методы установления структуры.

2.2.5. Биологическая активность.

2.3. Фуко и даны.

2.3.1. Общие сведения.

2.3.2. Характеристики структуры.

2.3.3. Методы выделения.

2.3.4. Методы установления структуры.

2.3.5. Биологическая активность.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Состав и характеристики структуры полисахаридов бурых водорослей ¡)1с1уор1еп.^ ро1уросИо1с1еь, Райта раготса и Хаг^ан.чит эр., произрастающих у берегов Ливанской Республики.

3.1.1. Полисахаридный состав бурых водорослей О. ро1уросИо1<Зе$,

Р. раготса и Заг^аььит зр.

3.1.2. Характеристики структуры полисахаридов бурых водорослей О. ро1уросИо'кЗе.н, Р. раготса и $а

§а.$$ит эр. Противоопухолевая активность фукоиданов.

3.2. Состав и характеристики структуры полисахаридов бурой водоросли Eisenia bicyclis, произрастающей у берегов Республики Корея.

3.2.1. Полисахаридный состав бурой водоросли Е. bicyclis.

3.2.2. Характеристики структуры полисахаридов бурой водоросли

Е. bicyclis.

3.2.3. Структура ламинарана.

3.2.3.1. Исследование структуры ламинарана классическими химическими методами.

3.2.3.2. Ферментативная трансформация ламинарана.

3.2.3.3. Противоопухолевая активность ламинарана и продуктов его ферментативного гидролиза.

3.3 Характеристики структуры и противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей Surgassum horncri, Costaría cosíala, Eisenia bicyclis и Ecklonia cava, произрастающих у берегов Республики Корея.

3.4. Влияние предварительной обработки бурых водорослей Fucus eranescens, Saccharina japónica и Sargassuni oligocystum на выходы и характеристики структуры фукоиданов.

3.5. Сравнение содержания и характеристик структуры фукоиданов разных видов бурых водорослей, собранных в различных регионах.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Материалы.

4.2. Оборудование.

4.3. Методы.

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Полисахариды некоторых видов бурых водорослей"

Биологически активные полисахариды бурых водорослей представлены ламинаранами, фукоиданами и альгиновыми кислотами. Повышенный интерес к этим уникальным по структуре и свойствам соединениям объясняется наличием у них широкого спектра фармакологических свойств, низкой токсичностью для организма и возможностью получения на их основе лекарственных препаратов нового поколения.

Из полисахаридов бурых водорослей наиболее изучены альгиновые кислоты, которые давно и успешно используются в медицинской, фармацевтической и других отраслях промышленности. Другие, не менее ценные полисахариды -ламинараны и фукоиданы, в сравнении с альгиновыми кислотами являются малоисследованными. Изучение биологической активности полисахаридов бурых водорослей, в особенности фукоиданов, идет гораздо более быстрыми темпами, чем химические исследования этих соединений. Фукоиданы отличаются сложным и нерегулярным строением молекул, что создает трудности в их детальном структурном анализе. Структурное разнообразие фукоиданов до сих пор полностью не охарактеризовано.

Целью данной диссертационной работы является определение состава и характеристик структуры полисахаридов некоторых видов бурых водорослей и выявление взаимосвязи между особенностями структуры полисахаридов и проявляемым ими противоопухолевым действием.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Морские водоросли - древнейшие фотосинтезирующие организмы, составляющие многочисленную группу в царстве растений. Водоросли являются главными продуцентами органических веществ в водной среде. Около 80 % всех органических веществ, ежегодно создающихся на Земле, приходится на долю водорослей и других водных растений.

К отделу бурых водорослей (РЬаеорИу1а) относятся многоклеточные растения, общим внешним признаком которых служит желтовато-бурая окраска их слоевищ, вызванная наличием у них большого количества желтых и бурых пигментов. Бурые водоросли широко распространены во всех морях нашей планеты, их запасы исчисляются сотнями миллионов тонн. Они являются одними из наиболее урожайных и экологически устойчивых растений на Земле и издавна используются в быту и промышленности благодаря своим ценным пищевым и лечебным свойствам. Бурые водоросли служат сырьем для получения различных лечебно-профилактических препаратов, поскольку содержат целый ряд веществ, обладающих спектром биологической активности, таких как полисахариды, маннит, витамины, макро- и микроэлементы, полифенолы, йодсодержащие органические соединения и полиненасыщенные жирные кислоты.

Одними из наиболее ценных биологически активных веществ бурых водорослей являются полисахариды: альгиновые кислоты, ламинараны и фукоиданы. Эти соединения чрезвычайно перспективны для создания лекарственных препаратов на их основе, гак как наряду с широким спектром биологической активности обладают низкой токсичностью для организма.

В настоящее время изучается иммуностимулирующая, радиопротекторная, противоопухолевая, противовоспалительная, антивирусная, антикоагулянтная, гиполипидемическая, антиоксидантная, антиадгезивная, контрацептивная активность полисахаридов бурых водорослей. С другой стороны, растет количество публикаций, посвященных структуре этих полисахаридов, и делаются все более успешные попытки связать их биологическую активность с определенными характеристиками структуры.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

5. ВЫВОДЫ

1. Определен полисахаридный состав бурых водорослей Dictyopieris poiypodioides, Padina pavonica, Sargassum sp. и Eisenia bicyclis. Показано, что основная часть полисахаридов представлена альгинатами (12-16 % от веса обезжиренной водоросли). Ламинаран из D. poiypodioides представляет собой 1,3-Р-О-глюкан, ламинаран из P. pavonica - 1,3;1,6-р-0-глюкан (1,3:1,6 = 5:1), ламинаран из Е. bicyclis - смесь высоко- и низко молекулярного 1,3;1,6-Р-0-глюканов (1,3:1,6 = 1.5:1). В Sargassum sp. ламинаран отсутствовал. Фукоиданы исследуемых водорослей являются сульфатированными, некоторые - сульфатированными и ацетилированными гетерополисахаридами.

4. В составе фукоидана из Sargassum horneri обнаружены сульфатированный фукан, несульфатированный и сульфатированный рамнофуканы. Фукоиданы из Costana costata и Е. bicyclis представлены сульфатированными галактофуканами. Фукоидан из С. costata ацетилирован. Фукоидан из Ecklonia cava состоит из сульфатированных рамногалакто- и галактоглюкофуканов.

5. Изучение противоопухолевой активности фукоиданов из S. horneri, С. cosíala, Е. cava и Е. bicyclis показало, что наиболее эффективными по отношению к клеткам меланомы человека SK-MEL-28 являются фукоиданы, содержащие рамнозу, к клеткам рака кишечника человека DLD-1 - фуканы и галактофуканы. Степень сульфатирования не оказывает выраженного влияния на противоопухолевую активность.

7. В работе охарактеризованы фукоиданы 10 видов бурых водорослей, собранных в различных регионах. Показано, что фукоиданы исследуемых водорослей порядка Dictyotales представляют собой гетерогенные полисахариды, Latninariales - галактофуканы, Fucales - полисахариды различного строения: от фуканов до гетерогенных полисахаридов. Наибольшее количество фукоиданов продуцируют водоросли порядка Fucales, среднее - Laminariales, наименьшее - Dictyotales. Содержание фукоиданов уменьшается, а гетерогенность моносахаридного состава возрастает с повышением температуры среды обитания водорослей.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Меньшова, Роза Владимировна, Владивосток

1. Усов А.И. Альгиновые кислоты и альгииаты: методы анализа, определения состава и установления строения // Усп. химии. 1999. - Т. 68. - С. 10511061.

2. Stanford Е.С. On Algin: A new substance obtained from some of the commoner species of marine algae // Chem. News. 1883. - Vol. 47. - P. 254-257.

3. Percival E., McDowell R.H. Algal walls: composition and biosynthesis. In Encyclopedia of plant physiology. Berlin: Springer- Verlag. - 1981. - P. 277.

4. Painter T.J. Algal polysaccharides. In The polysaccharides. N.Y: Acad. Press. -1983. - P. 195.

5. Bird G.M., Haas P. On the nature of the cell wall constituents of Laminaria sp. Mannuronic acid // Biochem. J. 1981. - Vol. 7. - P. 403-410.

6. Haug A., Smidsrod O. Strontium, calcium and magnesium in brown algae // Nature. 1967. - Vol. 215. - P. 1167-1168.

7. Draget K.I., Smidsrod O., Skjak-Braek G. Alginates from algae. In Polysaccharides and polyamides in the food industiy. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. - 2005. - P. 1-30.

8. Monis E.R., Rees D.A., Thom D. Characterization of alginate composition and block-structure by circular dichroism // Carbohyd. Res. 1980. - Vol. 81. - P. 305-314.

9. Haug A., Larsen В., Smidsrod O. Studies on the sequence of uronic acid // Acta Chem. Scand. 1967. - Vol. 21. - P. 691-704.

10. Haug A., Larsen В., Smidsrod O. Uronic acid sequence in alginate from different sources // Carbohyd. Res. 1974. - Vol. 32. - P. 217-225.

11. Grasdalen H., Larsen В., Smidsrod O. A P.M.R. study of the composition and sequence of uronate residues in alginates // Carbohyd. Res. 1979. - Vol. 68. - P. 23-31.

12. Gacesa P. Alginate // Carbohyd. Polym. 1988. - Vol. 1. - P. 3-18.

13. Skjak-Braek G. Alginates: biosynthesis and some structure-function relationships relevant to biomedical and biotechnological application // Biochem. Plant Polysacch. 1992. - Vol. 20. - P. 27-33.

14. Fujihara M., Nagumo T. An influence of the structure of alginate on the chemotactic activity of macrophages and the antitumor activity // Carbohyd. Res. 1993. - Vol. 243. - P. 343-347.

15. Evans L.V., Holligan M.S. Localization of alginic acid and sulphated polysaccharides in Dictyola II New Phytol. 1972. - Vol. 71. - P. 1161-1172.

16. Chapman V.J., Chapman D.J. Seaweeds and their uses. London: Chapman and Hall. - 1980.-334 p.

17. Nagaoka M., Shibata H., Kimura-Takagi I. Hashimoto S., Kimura K., Makino T., Aiyama R., Ueyama S., Yokokura T. Structural study of fucoidan from Cladosiphon okaimiramis Tokida // Glycoconjugate J. 1999. - Vol. 16. - P. 1926.

18. Mian A.J. Percival E. Carbohydrates of the brown seaweeds Himanthalia lorea, Bifurcaria bifurcata, and Padina pavunia. Part I. Extraction and fractionation // Carohydr. Res. 1973. - Vol. 26. - P. 133-137.

19. Drummond D.W., Hirst E.L., Percival E. The constitution of alginic acid // J. Chem. Soc. 1962. - P. 1208-1216.

20. Lee J.B., Takeshita A., Hayashi K., Hayashi T. Structures and antiviral activities of polysaccharides from Sargassum trichophyllum I I Carbohyd. Polym. 2011. -Vol. 86. - P. 995- 999.

21. Haug A., Larsen B. Quantitative determination of the uronic acid composition of alginates//Acta Chem. Scand. 1961. - Vol. 16. - P. 1908-1918.

22. Kennedy J.F., Robertson S.M., Stacey M. Structural identification of isomeric O-trimethylsilyl derivatives of some hexuronic acids // Carbohyd. Res. 1977. -Vol. 57. - P. 205-214.

23. Haug A., Larsen B., Smidsrod O. A study of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis // Acta Chem. Scand. 1966. - Vol. 20. - P. 183-190.

24. Heyraud A., Leonard C. Structural characterization of alginates by liquid chromatographies // Food Hydrocolloid. 1990. - Vol. 4. - P. 59-68.

25. Shimokawa T., Yoshida S., Kusakabe I., Takeuchi T., Murata K. Isolation and quantification of alginate-derived oligouronic acids by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis // Carbohyd. Res. 1997. - Vol. 299. - P. 95-98.

26. Mackie W. Semi-quantitative estimation of the composition of alginates by infrared spectroscopy // Carbohyd. Res. 1971. - Vol. 20. - P. 413-415.

27. Leal D., Matsuhiro B., Rossi M., Caruso F. FT-IR spectra of alginic acid block fractions in three species of brown seaweeds // Carbohyd. Res. 2008. - Vol. 343. -P. 308-316.

28. Grasdalen H. Larsen B„ Smidsrod O. 13C-N.M.R. studies of monomelic composition and sequence in alginate // Carbohyd. Res. 1981. - Vol. 89. - P. 179-191.

29. Grasdalen H. High-field, 'H-N.M.R. spectroscopy of alginate: sequential structure and linkage conformations // Carbohyd. Res. 1983. - Vol. 118. - P. 255-260.

30. Sperger D.M., Fu S., Block L.H., Munson E.J. Analysis of composition, molecular weight, and water content variations in sodium alginate using solid-state NMR spectroscopy // J. Pharm. Sci. 2011. - Vol. 100. - P. 3441-3452.

31. Aarstad O.A., Tondervik A., Sletta H., Skjak-Braek G. Alginate sequencing: an analysis of block distribution in alginates using specific alginate degrading enzymes // Biomacromolecules. 2012. - Vol. 13. - P. 106-116.

32. Thiang Y.W., Preston L.A., Schiller N.L. Alginate lyase: review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and applications // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - P. 289-340.

33. Sousa A.P.A., Torres M.R., Pessoa C. Moraes M.O., Rocha-Filho F.D., Alves A.P.N.N., Costa-Lotufo L.V. In vivo growth-inhibition of sarcoma 180 tumor byalginates from brown seaweed Sargassum vulgare // Carbohyd. Polym. 2007. -Vol. 69. - P. 7-13.

34. Smit A.J., Fujihara M., Naguino T. Effect of the content of D-mannuronic acid and L-guluronic acid blocks in alginates on antitumor activity // Carbohyd. Res. -1992. Vol. 224. - P. 343-347.

35. Sen M. Effects of molecular weight and ratio of guluronic acid to mannuronic acid on the antioxidant properties of sodium alginate fractions prepared by radiation-induced degradation // Appl. Radiat. Isotopes. 2011. - Vol. 69. - P. 126-129.

36. Mao W.J., Li B.F., Gu Q.Q., Fang Y.C., Xing H.T. Preliminary studies on the chemical characterization and antihyperlipidemic activity of polysaccharide from the brown alga Sargassum fusiforme I I Hydrobiologia. 2004. - Vol. 512. - P. 63-66.

37. Josef E., Zilberman M., Bianco-Peled H. Composite alginate hydrogels: An innovative approach for the controlled release of hydrophobic drugs // Acta Biomater. 2010. - Vol. 6. - P. 4642-4649.

38. Подкорытова A.B., Аминина H.M., Левачев M.M., Мирошниченко В.А. Функциональные свойства альгинатов и их использование в лечебно-профилактическом питании // Вопр. питания. 1998. - Т. 3. - С. 26-29.

39. Draget K.I., Skjak-Braek G., Smidsrod O. Alginic acid gels: the effect of alginate chemical composition and molecular weight // Carbohyd. Polym. 1994. - Vol. 25. - P. 31-38.

40. Коротаев Г.К., Членов M.A., Кирьянов А.В. Модифицированный альгинат кальция высокоэффективное средство выведения радиоактивного стронция // Радиобиология. - 1992. - Т. 32. - С. 126-129.

41. Skjak-Braek G., Espevik Т. Application of alginate gels in biotechnology and biomedicine // Carbohyd. Eur. 1996. - Vol. 14. - P. 19-25

42. Rioux L.E., Turgeon S.L., Beaulieu M. Effect of season on the composition of bioactive polysaccharides from the brown seaweed Saccharina longicruris И Phytochemistry. 2009. - Vol. 70. - P. 1069-1075.

43. Iwao Т., Kurashima A., Maegawa M. Effect of seasonal changes in the photosynthates mannitol and laminaran on maturation of Ecklonia cava

44. Phaeophyceae, Laminariales) in Nishiki Bay, central Japan // Phycol. Res. -2008.-Vol. 56.-P. 1-6.

45. Skriptsova A.V., Shevchenko N.M., Tarbeeva D.V., Zvyagintseva T.N. Comparative study of polysaccharides from reproductive and sterile tissues of five brown seaweeds // Mar. Biotechnol. 2012. - Vol. 14. - P. 304-311.

46. Schmiedeberg J.E.O. Tagblatt der 58. Versammlung deutscher naturforscher und bei Eugleninen // OsteiT. Bot. Z. 1885. - Vol. 99. - P. 413-420.

47. Black W.A.P. The seasonal variation in weight and chemical composition of the common British Laminariaceae // J. Mar. Biol. Assoc. UK 1950. - Vol. 29. - P. 45-72.

48. Шевченко H.M., Анастюк С.Д., Герасименко Н.И., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Звягинцева Т.Н. Полисахаридный и липидный состав бурой водоросли Laminaria gurjanovae II Биоорган, химия. 2007. - Т. 33. - С. 96-107.

49. Nelson Т.Е., Lewis В.A. Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran // Carbohyd. Res. 1974. - Vol. 33. - P. 63-74.

50. Звягинцева Т.Н., Широкова Н.И., Елякова Л.А. Структура ламинаранов из некоторых бурых водорослей // Биоорган, химия. 1994. - Т. 20. - С. 13491358.

51. Percival Е., McDowell R.H. Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides. -N.Y.-L.: Acad. Press. 1967. - P. 53-71.

52. Chattopadhyay N., Ghosh Т., Sinha S., Chattopadhyay K., Karmakar P., Ray B. Polysaccharides from Turbinaria с о no ides: Structural features and antioxidant capacity // Food Chem. 2010. - Vol. 118. - P. 823-829.

53. Имбс Т.И., Шевченко Н.М., Суховерхов С.В., Семенова Т.Л., Скрипцова А.В., Звягинцева Т.Н. Сезонные изменения состава и структурные характеристики полисахаридов бурой водоросли Costaria costaia // Химия природ, соедин. 2009. - Т. 45. - С. 661-665.

54. Maeda М., Nishizawa К. Fine structure of laminaran of Eisenia bicyclis II J. Biochem. 1968. - Vol. 63. - P. 199-206.

55. Usui Т., Toriyama Т., Mizuno T. Structural investigation of laminaran of Eisenia bicyclis IIAgr. Biol. Chem. 1979. - Vol. 43. - P. 603-611.

56. Maeda M., Nishizawa К. Laminaran from Ishige okamurai II Carbohyd. Res. -1968. Vol. 7. - P. 97-99.

57. Уеов A.M., Чижов А.О. Полисахариды водорослей. XL. Углеводный состав бурой водоросли Chorda fihtm И Биоорган, химия. 1989. - Т. 15. - С. 208216.

58. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Facus evanescens C. Ag // Carbohyd. Res. 2002. - Vol. 337. - P. 719-730.

59. Ponce N.M.A., Pujol C.A., Damonte E.B. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies // Carbohyd. Res. 2003. - Vol. 338. - P. 153-165.

60. Bilan М.1., Grachev A. A., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L. // Carbohyd. Res. 2006. -Vol. 341. - P. 238-245.

61. Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., Haslam S.M., McDowell R.A., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Khatuntseva E.A., Usov A.I. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filiim II Carbohyd. Res. 1999. - Vol. 320. - P. 108-119.

62. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.В., Isakov V.V., Scobun A.S., Sundukova E.V., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds // Carbohyd. Res. 1999. - Vol. 322. - P. 32-39.

63. Hakomori S. A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfinyl carbanion in dimethyl sulfoxide // J. Biochem. 1964. - Vol. 55. - P. 205-208.

64. Kuhn R., Trischmann H., Low I. Permethylation of sugars and glucosides // Angew. Chem. 1955. -Vol. 67. - P. 32.

65. Cuicani I., Kerek F. A simple and rapid method for the permetylation of carbohydrates // Carbohyd. Res. 1984. - Vol. 131. - P. 209-217.

66. Bjomdal H., Hellerquist C.G., Lindberg В., Svensson S. Gas-liquid chromatography and mass spectrometry in methylation analysis of polysaccharides // Angew. Chem. 1970. - Vol. 9. - P. 610-619.

67. Звягинцева Т.Н., Елякова JI.А, Исаков В.В. Ферментативное превращение ламинаранов в 1—>3;1—»б-Р-о-глюканы, обладающие иммуностимулирующим действием // Биоорган, химия. 1995. - Т. 21. - С. 218-225.

68. Kim Y.T., Kim Е.Н., Cheong С., Williams D.L., Kim C.W., Lim, S.T. Structural characterization of p-D-(l—>3,1—^-linked glucans using NMR spectroscopy // Carbohyd. Res. 2000. - Vol. 328. - P. 331-341.

69. Read S.M., Currie G., Bacic A. Analysis of the structural heterogeneity of laminarin by electrospray-ionisation-mass spectrometry // Carbohyd. Res. 1996. -Vol. 281.-P. 187-201.

70. Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., Reason A.J., Haslam S.M., McDowell R.A., Chizhov O.S., Usov A.I. Structural analysis of laminarans by MALDI and FAB mass spectrometry // Carbohyd. Res. 1998. - Vol. 310. - P. 203-210.

71. Хорлин А.Я. Структура и функции активных центров ферментов. М.: Наука. - 1974. - С. 39-69.

72. Pang Z., Otaka К., Maoka Т., Hidaka К., Ishijima S., Oda M., Ohnishi M. Structure of p-glucan oligomer from laminarin and its effect of human monocytes to inhibit the proliferation of U937 cells // Biosci. Biotech. Bioch. 2005. - Vol. 69. - P. 553-558.

73. Sova V.V., Zvyagintseva T.N., Svetasheva T.G., Burtseva Yu.V., Elyakova L.A. Comparative characterization of hydrolysis and transglycosylation catalyzed by P-1,3-glucanases from various sources // Biochemistry. 1997. - Vol. 62. - P. 1113-1118.

74. Klarzynski О., Plesse В., Joubett J.M., Yvin J.C., Kopp M. Kloareg В., Fritig B. Linear P-1,3 glueans are elicitors of defense responses in tobacco // Plant Physiol. 2000. - Vol. 124. - P. 1027-1037.

75. Seljelid R., Bogwald J., Lundwall A. Glycan stimulation of macrophages in vitro //Exp. Cell Res. 1981.-Vol. 131.-P. 121-129.

76. Colwell R.R. Biotechnology of marine polysaccharides. Washington. - N.Y. -L. - 1985.-P. 363-376.

77. Weijian X., Weng Y., Qionghua C. Prevention and treatment of alloxan-induced diabetes in mice by the polysaccharides from Laminaria japonica and Hericinm erinaceus II Zhongguo Yaoke Daxue Xuebao. 1989. - Vol. 20. - P. 378-380.

78. Звягинцева Т.Н., Беседнова H.H. Елякова JI. А. Структура и иммунотропное действие 1,3;1,6-3-0-глюканов. Владивосток: Дальнаука. - 2002. - 160 с.

79. Reunov A.V. Lapshina L.A., Nagorskaya V.P., Elyakova L.A. Effect of 1,3; 1,6-0-D-glucan on infection of detached tobacco leaves with tobacco mosaic virus // J. Phytopathol. 1996. - Vol. 144. - P. 247-249.

80. Усов А.И., Билан М.И. Фукоиданы сульфатированные полисахариды бурых водорослей // Усп. химии. - 2009. - Т. 78. - С. 846-862.

81. Mabeau S., Kloareg В., Joseleau J.P. Fractionation and analysis of fucans from brown algae // Phytochemistiy. 1990. - Vol. 29. - P. 2441-2445.

82. Hu J.F., Geng M.Y., Zhang J.Т., Jiang H.D. An in vivo study of the structure-activity relations of sulfated polysaccharide from brown algae to its antioxidant effect 11 J. Asian Nat. Prod. Rep. 2001. - Vol. 3. - P. 353-358.

83. Xue C.H., Fang Y„ Lin H„ Chen L., Li Z.J., Deng D., Lu C.X. Chemical characters and antioxidative properties of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica // J. Appl. Phycol. 2001. - Vol. 13. - P. 67-70.

84. Holtkamp A. Isolation, characterization, modification and application of fucoidan from Fucus vesiculosas: PhD Thesis. Germany. - 2009. - 179 p.

85. Kylin H. Zur biochemie der Meersalgen // Z. Phys. Chem. 1913. - Vol. 83. - P. 171-197.

86. Bisgrove S.R., Kropf D.L. Cell wall deposition during morphogenesis in fucoid algae // Planta. 2001. - Vol. 212. - P. 648-658.

87. Уеов А.И. Смирнова Г.П., Билан М.И., Шашков А.С. Полисахариды водорослей 53. Бурая водоросль Laminaria sacharina (L.) Lam. как источник фукоидана // Биоорган, химия. 1998. - Т. 24. - С. 437-445.

88. Duarte М.Е., Cardoso М.А., Noseda M.D., Cerezo A.S. Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassvm stenophyllum II Carbohyd. Res. -2001.-Vol. 333.-P. 281-293.

89. Percival E., Rahman M.A., Weigel H. Chemistry of the polysaccharides of the brown seaweed Dictyopteris plagiogramma II Phytochemistry. 1981. - Vol. 20. -P. 1579-1582.

90. Hussein M.M.D., Fouad S.T., Abdel-Fattah A.F. Structural features of a sulphated, fucose-containing polysaccharide from the brown seaweed Dictyota dichotoma II Carbohyd. Res. 1979. - Vol. 72. - P. 177-181.

91. Abdel-Fattah A.F., Hussein M.M.D., Fouad S.T. Carbohydrates of the brown seaweed Dictyota dichotoma II Phytochemistiy. 1978. - Vol. 17. - P. 741-743.

92. Albuquerque I.R., Queiroz K.C., Alves L.G., Santos E.A., Leite E.L., Rocha H.A. Heterofucans from Dictyota menstrualis have anticoagulant activity // Braz. J. Med. Biol. Res. 2004. - Vol. 37. - P. 167-171.

93. Hussein M.M.D., Abdel-Aziz A., Salem H.M. Some structural features of a new sulphated heteropolysaccharide from Padina pavonia II Phytochemistry. 1980. -Vol. 19.-P. 2133-2135.

94. Karmakar P., Ghosh Т., Sinha S., Saha S., Mandal P., Ghosal P.K., Ray B. Polysaccharides from the brown seaweed Padina tetrastromatica: characterization of a sulfated fucan // Carbohyd. Polym. 2009. - Vol. 78. - P. 416-421.

95. Rao N.V.S.A.V.P., Sastry K.V., Rao E.V. Carbohydrates of Padina tetrastromatica II Phytochemishy. 1984. - Vol. 23. - P. 2531-2533.

96. Adhikari U., Mateu C.G., Chattopadhyay K., Pujol C.A., Damonte E.B., Ray B. Structure and antiviral activity of sulfated fucans from Stoechosperimim marginatum II Phytochemistry. 2006. - Vol. 67. - P. 2474-2482.

97. Percival Е. Glucoroxylofucan, a cell-wall component of Ascophyllnm nodosum II Carbohyd. Res. 1968. - Vol. 7. - P. 272-283.

98. Foley S.A., Mulloy В., Tuohy M.G. An unfractionated fucoidan from Ascophyllnm nodosum: Extraction, characterization, and apoptotic effects in vitro 1П. Nat. Prod. -2011,- Vol. 74.-P. 1851-1861.

99. Marais M.F., Joseleau J.P. A fucoidan fraction from Ascophyllnm nodosum II Carbohyd. Res. 2001. - Vol. 336. - P. 155-159.

100. Chevolot L., Mulloy В., Ratiskol J., Foucault A., Colliec-Jouault S. A disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae // Carbohyd. Res. 2001. - Vol. 330. - P. 529-535.

101. Medcalf D.G., Schneider T.L. Bamett R.W. Structural features of a novel glucuronogalactofucan from Ascophyllnm nodosum И Carbohyd. Res. 1978. -Vol. 66. - P. 167-171.

102. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. I I Carbohyd. Res. 2004. - Vol. 339. - P. 511-517.

103. Вищук О.С., Ермакова С.П., Тин Ф.Д., Шевченко Н.М., Ли Б.М., Звягинцева Т.Н. Противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей // Тихоок. мед. журн. 2009. - Т. 3. - С. 92-95.

104. Nishino Т., Nishioka С., Ura Н., Nagumo Т. Isolation and partial characterization of a novel amino sugar-containing fucan sulfate from commercial Fucus vesiculosus fucoidan // Carbohyd. Res. 1994. - Vol. 255. - P. 213-224.

105. Patankar M.S., Oehninger S., Bamett Т., Williams R.L., Clark G.F. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 21770-21776.

106. Anno K., Terahata H., Hayashi Y. Isolation and purification of fucoidin from brown seaweed Pelvetia wrightii II Agr. Biol. Chem. 1966. - Vol. 30. - P. 495499.

107. Costa L.S., Fidelis G.P., Telles C.B.S. Dantas-Santos N., Camara R.B.G., Cordeiro S.L., Costa M.S.S.P., Almeida-Lima J., Melo-Silveira R.F., Oliveira

108. R.M., Albuquerque I.R.L., Andrade G.P.V., Rocha H.A.O. Antioxidant and antiproliferative activities of heterofucans from the seaweed Sargassum ftlipendula II Mar. Drugs. 2011. - Vol. 9. - P. 952-966.

109. Li B., Wei X.J., Sun J.L., Xu S.Y. Structural investigation of a fucoidan containing a fucose-free core from the brown seaweed Hizikia fusiforme II Carbohyd. Res. 2006. - Vol. 341.-P. 1135-1146.

110. Preeprame S., Hayashi K., Lee J.B., Sankawa U., Hayashi T. A novel antivirally active fucan sulfate derived from an edible brown alga, Sargassum humeri II Chem. Pharm. Bull. 2001. - Vol. 49. - P. 484-485.

111. Wei X.L., Wang C.Y., Liu B„ Fang Y.C., Gu Q.Q., Zhang S.S., Kang K. Isolation and composition analysis of fucoidan from algae Sargassum pallidum II Chin. Trad. Herb. Drugs. 2007. - Vol. 38. - P. 11-14.

112. Thuy T.T.T., Van T.T.T., Hidekazu Y., Hiroshi U. Fucoidan from Vietnam Sargassum swartzii: isolation, characterization and complexation with bovine serum albumin // Asian J. Chem. 2012. - Vol. 24. - P. 3367-3370.

113. Sinha S., Astani A., Ghosh, T., Schnitzler P., Ray B. Polysaccharides from Sargassum (enerrimum: Structural features, chemical modification and anti-viral activity // Phytochemistry. 2010. - Vol. 71. - P. 235-242.

114. El-Sayed M.M. The polysaccharides of the brown seaweed Turbinaria murrayana 11 Carbohyd. Res. 1982. - Vol. 110. - P. 277-282.

115. Usov A.I., Smimova G.P., Klochkova N.G. Polysaccharides of Algae: 58. The polysaccharide composition of the Pacific brown alga Alaria fistulosa P. et R. (Alariaceae, Laminariales) // Russ. Chem. Bull. 2005. - Vol. 54. - P. 12821286.

116. Vishchuk O.S., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. Sulfated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida: Isolation, structural characteristics, and antitumor activity // Carbohyd. Res. 2011. - Vol. 346. - P. 2769-2776.

117. Skriptsova A.V., Shevchenko N.M., Zvyagintseva T.N., Imbs T.I. Monthly changes in the content and monosaccharide composition of fucoidan from Undaria pinnatifida (Laminariales, Phaeophyta) // J. Appl. Phycol. 2010. - Vol. 22. - P. 79-86.

118. Lee J.B., Hayashi K., Hashimoto M., Nakano T., Hayashi T. Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu) // Chem. Pharm. Bull.- 2004. Vol. 52. - P. 1091-1094.

119. Katsube T., Yamasaki Y., Iwamoto M., Oka S. Hyaluronidase-inhibiting polysaccharide isolated and purified from hot water extract of sporophyll of Undaria pinnatifida II Food Sci. Technol. Res. 2003. - Vol. 9. - P. 25-29.

120. Usui T. Asari K., Mizuno T. Isolation of highly purified «fucoidan» from Eisenia bicyclis and its anticoagulant and antitumor activities // Agr. Biol. Chem. 1980. -Vol. 44.-P. 1965-1966.

121. Chandia N.P., Matsuhiro B. Characterization of a fucoidan from Lessonia vadosa (Phaeophyta) and its anticoagulant and elicitor properties // Int. J. Biol. Macromol.- 2008. Vol. 42. - P. 235-240.

122. Teraya T., Takeda S., Tamaki Y., Tako M. Fucoidan isolated from Laminaria angustata var. longissima induced macrophage activation // Biosci. Biotech. Bioch. 2010. - Vol. 74. - P. 1960-1962.

123. Yoon S.J., Pyun Y.R., Hwang J.K., Mourao P.A.S. A sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides has mainly heparin cofactor II-dependent anticoagulant activity // Carbohyd. Res. 2007. - Vol. 342. - P. 2326-2330.

124. Wang J., Zhang Q., Zhang Z., Zhang H. Niu X. Structural studies on a novel fucogalactan sulfate extracted from the brown seaweed Laminaria japonica II Int. J. Biol. Macromol. 2010. - Vol. 47. - P. 126-131.

125. Wang J., Zhang Q., Zhang Z., Song H., Li P. Potential antioxidant and anticoagulant capacity of low molecular weight fucoidan fractions extracted from Laminaria japonica II Int. J. Biol. Macromol. 2010. - Vol. 46. - P. 6-12.

126. Wang J., Zhang Q., Zhang Z., Li Z. Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted from Laminaria japonica II Int. J. Biol. Macromol. 2008. - Vol. 42.-P. 127-132.

127. Bandyopadhyay S.S., Navid M.H., Ghosh T., Schnitzler P., Ray B. Structural features and in vitro antiviral activities of sulfated polysaccharides from Sphacelaria indica II Phytochemistiy. 2011. - Vol. 72. - P. 276-283.

128. Descamps V., Colin S., Lahaye M., Jam M., Richard C., Potin P., Barbeyron T., Yvin J.C., Kloareg B. Isolation and culture of a marine bacterium degrading the sulfated fucans from marine brown algae // Mar. Biotechnol. 2006. - Vol. 8. - P. 27-39.

129. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Nazarenko E.L., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Structural analysis of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass spectrometry // Carbohyd. Res. 2009. - Vol. 344. - P. 779-787.

130. Nishino T., Nagumo T., Kiyohara H., Yamada H. Structural characterization of a new anticoagulant fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome II Carbohyd. Res. 1991. - Vol. 211. - P. 77-90.

131. Honya M., Mori H., Aiizai M., Araki Y., Nishizawa K. Monthly changes in the content of fucans, their constituent sugars and sulphate in cultured Laminaria japonica II Hydrobiologia. 1999. - Vol. 398. - P. 411-416.

132. Sakai Т. Kimura H., Kojima K., Shimanaka K., Ikai K., Kato I. Marine bacterial sulfated fucoglucuronoinannan (SFGM) lyase digests brown algal SFGM into trisaccharides // Mar. Biotechnol. 2003. - Vol. 5. - P. 70-78.

133. Слонекер Д. Методы исследования углеводов. М.: Мир. - 1967. - С. 3711. J / J .

134. Blumenkrantz N., Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids // Anal. Biochem. 1973. - Vol. 54. - P. 484-489.

135. Hestrin S. The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine, and its analytical application // J. Biol. Chem. 1949. - Vol. 180. -P. 249-261.

136. Anderson N.S., Dolan T.C.S., Penman A., Rees D.A., Mueller G.P., Standoff

137. D.J., Stanley N.F. Carrageenans. IV. Variations in the structure and gel properties of carrageenan, and the characterization of sulphate esters by infrared spectroscopy // J. Chem. Soc. 1968. - Vol. C. - P. 602-606.

138. Usov A.I., Adamyants K.S., Miroshnikova L.I., Shaposhnikova A.A., Kochetkov N.K. Solvolytic desulphation of sulphated carbohydrates // Carbohyd. Res. 1971. -Vol. 18.-P. 336-338.

139. Daniel R., Chevolot L., Carrascal M., Tissot В., Mourao P.A.S., Abian J. Electrospray ionization mass spectrometry of oligosaccharides derived from fucoidan of Ascophyllum nodosum II Carbohyd. Res. 2007. - Vol. 342. - P. 826-834.

140. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Ermakova S.P., Vishchuk O.S., Nazarenko

141. Springer G.F., Wurzel H.A., McNeal G.M., Ansell Jr.N.J., Doughty M.F. Isolation of anticoagulant fractions from crude fucoidin // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1957. Vol. 94. - P. 404-409.

142. Capila I., Linhardt R.J. Heparin-protein interactions // Angew. Chem. 2002. -Vol. 41. - P. 391-412.

143. Chevolot L., Foucault A., Chaubet F., Kervarec N., Sinquin C., Fisher A.M., Boisson-Vidal C. Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity // Carbohyd. Res. 1999. - Vol. 319. - P. 154-165.

144. Haroun-Bouhedja F., Ellouali M., Sinquin C. Boisson-Vidal C. Relationship between sulfate groups and biological activities of fucans // Braz. J. Med. Biol. -2000. Vol. 100. - P. 453-459.

145. Nishino Т., Nagumo Т. Sugar constituents and blood anticoagulant activities of fucose-containing sulfated polysaccharides in nine brown seaweeds species // Nippon Nogeik. Kaishi. - 1987. - Vol. 61. - P. 361-363.

146. Ушакова Н.А., Морозевич Г.Е., Устюжанина Н.Е., Билан М.И., Усов А.И., Нифантьев Н.Э., Преображенская М.Е. Антикоагулянтная активность фукоиданов из бурых водорослей // Биомед. химия. 2006. - Т. 54. - С. 597606.

147. Li В., Zhao R.X., Wei X.J. Anticoagulant activity of fucoidan from Hizikia fusiforme // Agio Food Industry Hi-Tech. 2008. - Vol. 19. - P. 22-24.

148. Nishino Т., Nagumo T. Change in the anticoagulant activity and composition of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kitrome during refrigerated storage of the fronds // Bot. Mar. 1991. - Vol. 34. - P. 387-389.

149. Li В., Lu F., Wei X., Zhao R. Fucoidan: Structure and bioactivity // Molecules. -2008. Vol. 13. - P. 1671- 1695.

150. Запорожец T.C., Беседнова H.H., Лоенко Ю.Н. Антибактериальная и иммуномодулирующая активность фукоидана// Антибиот. химиотер. 1995. -Т. 40. - С. 9-13.

151. Кузнецова Т. А., Беседнова Н.Н., Урванцева A.M., Бакунина И.Ю., Звягинцева Т.Н., Дрозд Н.Н., Макаров В.А. Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов из бурых водорослей // Вест. ДВО РАН. -2006. Т. 6. - С. 105-110.

152. Wang W.T., Zhou J.H. Xing S.T., Guan H.S. Immunomodulating action of marine algaesulfated polysaccharides on normal and immunosuppressed mice // Chin. J. Pharm. Toxicol. 1994. - Vol. 8. - P. 199-202.

153. Wu X.W., Yang M.L., Huang X.L., Yan J., Luo Q. Effect of Laminaria japonica polysaccharides on radioprotection and splenic lymphocyte apoptosis // Med. J. Wuhan. Univ. 2004. - Vol. 25. - P. 239-241.

154. Shan B.E., Yoshida Y., Kuroda E., Yamashita U. Immunomodulating activity of seaweed extract on human lymphocytes in vitro II Int. J. Immunopharmacol.1999. Vol. 21. - P. 59-70.

155. Maruyama H., Tamauchi H., Hashimoto M., Nakano T. Antitumor activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from sporophyll of Undaria pmnatijida II In Vivo. 2003. - Vol. 17. - P. 245-249.

156. Aisa Y. Miyakawa Y. Nakazato Т., Shibata H., Saito K., Ikeda Y., Kizaki M. Fucoidan induces apoptosis of human HS-sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways // Am. J. Hematol. 2005. -Vol. 78. - P. 7-14.

157. Philchenkov A., Zavelevich M. Imbs Т. Zvyagintseva Т., Zaporozhets T. Sensitization of human malignant lymphoid cells to etoposide by fucoidan, a brown seaweed polysaccharide // Exp. Oncology. 2007. - Vol. 29. - P. 181-185.

158. Koyanagi S., i atiigavva N., Nakagavva H., Soeda S., Shimeno H. Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and antitumor activities // Biochem. Pharmacol. 2003. - Vol. 65. - P. 173-179.

159. Suzuki Y., Yamamoto I.U., Umezawa I. Antitumor effect of seaweed: partial purification and the antitumor effect of polysaccharides from Lammaria angustata Kjellman var. longissima Miyabe Chemotherapy. 1980. - Vol. 28. - P. 165170.

160. Yamamoto I. Takahashi M. Tamura E. Mamyama I. Antitumor activity of crude extracts from edible marine algae against L-1210 leukemia // Bot. Mar. 1982. -Vol. 25. - P. 455-457.

161. Zhuang C.„ Itoh H.„ Mizuno T., Ito H. Antitumor active fucoidan from the brown seaweed. Umitoranoo {Sargassum thtmbergn) // Biosci. Biotech. Bioch. 1995. -Vol. 59. - P. 563-567.

162. Teas J. Harbison M.L., Gelman R.S. Dietary seaweed {Lammaria) and mammary carcinogenesis in rats // Cancer Res. 1984. - Vol. 44. - P. - 2758- 2761.

163. Zhang Z., Teruya K., Eto H, Shirahata S. Fucoidan extract induces apoptosis in MCF-7 cells via a mechanism involving the ROS-dependent JNK activation and mitochondria-mediated pathways // PLoS One. 2011. - Vol. 6. - P. e27441.

164. Boo H.J., Hyun J.H., Kim S.C., Kang J.I., Kim M.K., Kim S.Y., Cho H„ Yoo E.S. Kang H.K. Fucoidan from Undaria pmnatifida induces apoptosis in A549 human lung carcinoma cells // Phytother. Res. 2011. - Vol. 25. - P. 1082-1086.

165. Jiao G. Yu G., Zhang J., Ewart H.S. Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae // Mar. Drugs. 2011. - Vol. 9. - P. 196-223.

166. Coombe D.R., Parish C.R., Ramshaw I.A., Snowden J.M. Analysis of the inhibition of tumour metastasis by sulphated polysaccharides // Int. J. Cancer. -1987. Vol. 39. - P. 82-88.

167. Roszkowski W., Beuth J., Ко H.L., Uhlenbmck G., Pulverer G. Blocking of lectin-like adhesion molecules on pulmonary cells inhibits lung sarcoma L-l colonization in BALB/c-mice // Experientia. 1989. - Vol. 45. - P. 584-588.

168. Hemmingson J.A., Falshaw R., Fumeaux R.H., Thompson K. Structure and antiviral activity of the galactofucan sulfates extracted from lindaría pinnatifida (Phaeophyta) // J. Appl. Phycol. 2006. - Vol. 18. - P. 185-193.

169. Mandal P., Mateu C.G., Chattopadhyay K., Pujol C.A., Damonte E.B., Ray B. Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica II Antivir. Chem. Chemoth. 2007. - Vol. 18. - P. 153-162.

170. Hoshino Т., Hayashi Т., Hayashi K., Hamada J., Lee J.B., Sankawa U. An antivirally active sulfated polysaccharide from Sargassnm horneri (Turner) C. Agardh // Biol. Pharm. Bull. 1998. - Vol. 21. - P. 730-734.

171. Hidari K.I.P.J., Takahashi N., Arihara M., Nagaoka M., Morita K., Suzuki T. Structure and anti-dengue vims activity of sulfated polysaccharide from a marine alga // Biochem. Bioph. Res. Com. 2008. - Vol. 376. - P. 91-94.

172. Shibata H., Kimura-Takagi I., Nagaoka M., Hashimoto S., Sawada H., Ueyama S., Yokokura T. Inhibitory effect of Cladosiphon fucoidan on the adhesion of Helicobacter pylori to human gastric cells // J. Nutr. Sei. Vitaminol. 1999. -Vol. 45. - P. 325-336.

173. Shibata H., Kimura-Takagi I., Nagaoka M., Hashimoto S., Aiyama R., Iha M., Ueyama S., Yokokura T. Properties of fucoidan from Cladosiphon okamuramis Tokida in gastric mucosal protection // Biofactors. 2000. - Vol. 11. - P. 235245.

174. Maruyama H., Tanaka M., Hashimoto M., Inoue M., Sasahara T. The suppressive effect of Mekabu fucoidan on an attachment of Cryptosporidium pan-am oocysts to the intestinal epithelial cells in neonatal mice // Life Sei. 2007. - Vol. 80. - P. 775-781.

175. Chen J.H., Lim J.D., Sohn E.H., Choi Y.S., Han E.T. Growth-inhibitory effect of a fucoidan from brown seaweed Undaria pinnatijida on Plasmodium parasites // Parasitol. Res. 2009. - Vol. 104. - P. 245-250.

176. Макаренкова И.Д. Компанец Г.Г., Запорожец Т.С. Ингибирование адгезии патогенных микроорганизмов на эукариотических клетках // Журн. микробиол. 2006. - Т. 3. - С. 121-125.

177. Li D.Y., Xu R.Y., Zhou W.Z., Sheng X.B., Yang A.Y., Cheng J.L. Effects of fucoidan extracted from brown seaweed on lipid peroxidation in mice // Acta Nutrim. Sin. 2002. - Vol. 24. - P. 389-392.

178. Ruperez P., Ahrazem O., Leal J.A. Potential antioxidant capacity of sulfated polysaccharides from the edible marine brown seaweed Fucus vesicalosis II J. Agr. Food Chem. 2002. - Vol. 50. - P. 840-845.

179. Zhao X. Xue C.H., Cai Y.P., Wang D.F., Fang Y. The study of antioxidant activities of fucoidan from Laminaria japonica II High Tech. Lett. 2005. - Vol. 11. - P. 91-94.

180. Micheline R.S., Cybelle M., Celina G.D., Fernando F.S., Hugo O.R., Edda L. Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds // J. Appl. Phycol. 2007. - Vol. 19. - P. 153-160.

181. Oehninger S., Clark G.F., Acosta A.A., Hodgen G.D. Nature of the inhibitory effect of complex saccharide mojeties on the tight binding of human spermatozoa to the human zona pellucida // Fertil. Steril. 1991. - Vol. 55. - P. 165-169.

182. Ушакова Н.А., Преображенская М.Е., Нифантьев Н.Э., Усов А.И., Почечуева Т.В., Галанина О.Е., Бовин Н.В. Ингибиторная активность мономерных и полимерных лигандов селектинов /V Вопр. мед. химии. 1999. - Т. 45. - С. 375-383.

183. Blondin C., Fischer E., Boisson-Vidal C., Kazatchkine M.D., Jozefonvicz J. Inhibition of complement activation by natural sulfated polysaccharides (fucans) from brown seaweed // Mol. Immunol. 1994. - Vol. 31. - P. 247-253.

184. Karmakar P., Pujol C.A., Damonte E.B., Ghosh T., Ray B. Polysaccharides from Padina tetrastromatica: Structural features, chemical modification and antiviral activity // Carbohyd. Polym. 2010. - Vol. 80. - P. 513-520.

185. Hussein M.M.D., Abdel-Aziz A. Salem H.M. Sulphated heteropolysaccharides from Padinapavonia II Phytochemistry. 1980. - Vol. 19. - P. 2131-2132.

186. De Zoysa M., Nikapitiya C., Jeon Y.J. Jee Y., Lee J. Anticoagulant activity of sulfated polysaccharide isolated from fermented brown seaweed Sargassnm fulvellum II J. Appl. Phycol. 2008. - Vol. 20. - P. 67-74.

187. Patent WO 2005/014657. Method of processing seaweed / Shevchenko N., lmbs T., Urvantseva A., Kusaykin M., Komienko V., Zvyagintseva T., Elyakova L. -2005.

188. Bradford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

189. Mohsen M.S., Asker S.F., Mohamed F.M.A., Osama H.E.S. Chemical structure and antiviral activity of water-soluble sulfated polysaccharides from Sargassnm lalifolium J. Appl. Sci. Res. 2007. - Vol. 3. - P. 1178-1185.

190. Moon H.J., Lee S.H., Ku M.J., Yu B.C., Jeon M.J., Jeong S.H., Stonik V.A., Zvyagintseva T.N., Ennakova S.P., Lee Y.H. Fucoidan inhibits UVB-induced

191. MMP-1 promoter expression and down regulation of type I procollagen synthesis in human skin fibroblasts // Eur. J. Dermatol. 2009. - Vol. 19. - P. 129-134.

192. Nelson N.J. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of sugars // J. Biol. Chem. 1944. - Vol. 153. - P. 375-381.

193. Безукладников П.В., Елякова JI.А., Звягинцева Т.Н., Миргородская О.А. Изучение реакций, катализируемых карбогидразами, с помощью масс-спектрометрии ЭРИАД // Химия природ, соедин. 1989. - Т.1. - С 54-59.

194. Nanjo F., Usui Т., Suzuki T. Mode of Action of an exo-p-(l-3)-D-glucanase on the laminaran from Hisenia bicyclis // Agr. Biol. Chem. 1984. - Vol. 48. - P. 15231532.

195. Tissot В., Salpin J.Y., Martinez M., Gaigeot M.P., Daniel R. Differentiation of the fucoidan sulfated L-fucose isomers constituents by CE-ESIMS and molecular modeling // Carbohyd. Res. 2006. - Vol. 341. - P. 598-609.

196. Широкова Н.И., Елякова Л.А. Механизм действия и специфичность экзо-Р-1,3-глюканазы из моллюска Eulota maakii II Биохимия. 1983. - Т. 48. - С. 83-91.

197. Hyun J., Kim S„ Kang J., Kim M„ Boo H., Kwon J., Koh Y., Hyun J., Park D., Yoo E., Kang H. Apoptosis inducing activity of fucoidan in HCT-15 colon carcinoma cells // Biol. Pharm. Bull. 2009. - Vol. 32 - P. 1760-1764.

198. Kim E., Park S., Lee J., Park J. Fucoidan present in brown algae induces apoptosis of human colon cancer cells // BMC Gastroenterol. 2010. - Vol. 10. - P. 96-107.

199. Delattre L. Pharmaceutical applications of supercritical carbon dioxide // Ann. Pharm. Fr. 2007. - Vol. 65. - P. 58-67.

200. Kaiser C.S., Rompp H., Schmidt P.C. Pharmaceutical applications of supercritical carbon dioxide // Pharmazie. 2001. - Vol. 56. - P. 907-926.

201. Sova V. V., Elyakova L.A., Vaskovcky V.E. Purification and some properties of P-(1—o)-glucan glucanohydrolase from the crystalline style of bivalvia, Spisula sctchalinemis II Biochim. Biophys. Acta. 1970. - Vol. 212. - P. 111-115.241.242.243.244.

202. Singleton V.L., Rossi J.A. Colorimetry of totalphenolics with phospho-molybdic-phosphotungstic acid reagents // Am. J. Enol. Viticult. 1965. - Vol. 16. - P. 144-158.

203. Dodgson K.S., Price R.G. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides // Biochem. J. 1962. - Vol. 84. - P. 106