Хроматографическое исследование физико-химических процессов получения агара тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

рге од

СУХОВЕРХОВ Святослав Валерьевич

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПОЛУЧЕНИЯ АГАРА

Специальность 02.00.04 - физическая химия

Автореферат на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2000

Работа-выполнена в Тихоокеанском научно-исследовательском рыбохозяйственном центре (ТИНРО-центр), г. Владивосток.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Усов А. И.,

доктор технических наук Подкорытова А. В.

Официалыгые оппоненты: доктор химических наук Медков М.А.,

кандидат химических наук Ермак И.М. Ведущая организация - Институт физической химии РАН

Защита состоится 19 декабря 2000 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 002.06.10 в Президиуме Дальневосточного отделения РАН по адресу: 6У0022 Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, Институт химии ДВО РАН

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Дальневосточного отделения РАН, г. Владивосток-22, проспект 100-летия Владивостока, 159

Автореферат разослан "_"_: 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук

Блищенко Н.С.

А ¿Ый- 4г. Ц^Н П

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Агар и агароза - это гелеобразующие полисахариды, получаемые из некоторых видов красных водорослей и широко используемые в биохимии, иммунохимии, молекулярной биологии, микробиологии, а также в пищевой и фармацевтической промышленности. В России основным источником агара является красная водоросль ЛИп/еШа 1оЬис1иеп51з. Существуют технологии получения из А. ¡оЬисЫеп51з агара пищевого, микробиологического и особой очистки. Однако без дополнительной очистки эти препараты не пригодны для проведения электрофореза, иммунологических, вирусологических и биохимических исследований.

С 1992 г. в ТИНРО-центре была начата разработка технологии получения агарозы из А. 1оЬисЫею13. Необходимо было детально изучить процессы предварительной обработки водоросли, экстракции и очистки агара, так как они в основном определяют выход и качество продукта. Стандартные методы анализа агара по ГОСТу 26185-84 не подходили для таких исследований. В настоящее время для анализа смесей углеводов наиболее перспективным методом считается высокоэффективная эксклюзионная хроматография (ВЭЭХ). Поэтому для изучения основных физико-химических процессов, протекающих при предварительной обработке водоросли, экстракции и очистке агара решено было использовать ВЭЭХ.

Работа выполнялась в соответствии с планом НИР ТИНРО-центра по теме 3.3.2 "Разработка технологии получения пищевых, медицинских лечебно-профилактических и кормовых продуктов из водорослей ДВ морей" (№ гос. регистрации 01880073029).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: исследовать основные физико-химические процессы получения агара.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

♦ Подобрать условия хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов.

♦ Методом ВЭЭХ исследовать физико-химические процессы, протекающие при предварительной обработке, экстракции и очистке агара из красной водоросли А/щ/е1Иа 1оЬиск1еп51$.

♦ Методом ВЭЭХ изучить влияние условий экстракции на физико-химические свойства агара из красной водоросли йеПсИит атамИ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые методом ВЭЭХ исследованы основные физико-химические процессы, протекающие при предварительной обработки, экстракции и очистке агара из красной водоросли А. ¡оЬисЫет^з. Изучено влияние условий экстракции на физико-химические свойства агара из С. атапзи.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработана методика хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов, применимая для исследования и контроля физико-химических процессов получения агара. Разработан простой способ получения агарозы из красной водоросли А. шЬисМепзгя.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ:

♦ Методика хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов, применимая для исследования физико-химических процессов получения агара.

♦ Результаты исследования основных физико-химических процессов получения агара из А. 1оЬисЫепз1з,

♦ Результаты исследования влияния условий экстракции на физико-химические свойства агара из С. атати.

♦ Способ получения агарозы из А. ¡оЬисЫетгя.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационной работы докладывались на конференции молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование гидробионтов" (Владивосток, 1997), Региональной естественнонаучной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Владивосток, 1997), конференции молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробионтов" (Владивосток, 1999) и международной конференции молодых ученых "Проблемы экологии и рационального природопользования стран Азиатско-Тихоокеанского региона" (Владивосток, 1999).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, выводов, списка цитированной литературы и четырех приложений. Работа изложена на 129 страницах, иллюстрирована 34 рисунками и 14 таблицами. Список цитируемой литературы включает 198 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе 1 рассмотрен механизм эксклюзионного разделения и описаны основные типы сорбентов для эксклюзионной хроматографии, методы калибровки хроматографической системы и расчета молекулярно-массовых характеристик биополимеров. Обсуждены неэксклюзионные взаимодействия в системе полимер-сорбент-растворитель при анализе белков и полисахаридов методом ВЭЭХ.

Во второй части главы описан состав и строение агара и агарозы, рассмотрены основные методы их исследования. Показано, что основными показателями, характеризующими структуру агара и агарозы и определяющими их гелеобразующие свойства, являются общее содержание сульфата, моносахаридный состав, молярное отношение производных 3,6-ангидрогалактозы и галактозы (величина A/G) и молекулярная масса.

В третьей части главы рассмотрены технологии получения агара из А. tobuchiensis и G. amansii, а также способы получения агарозы. Агар из водорослей получают по разным технологическим схемам, включающим следующие основные операции: предварительная обработка водорослей; экстракция агара; очистка и обесцвечивание агарового экстракта; обезвоживание и сушка. Препараты агарозы, как правило, получают из агара удаляя осаждением или хроматографически сульфатированную фракцию (агаропектин) или химически модифицируя структуру агара.

В главе 2 описаны методы исследования физико-химических процессов получение агара из красных водорослей.

В экспериментах использовали красные водоросли Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsubara) Мак., собранные в заливе Петра Великого и заливе Измены (район Южно-Курильской гряды) и Gelidium amansii (Gelidium elegans) Kûtz., собранные в районах Киянг и Чечжу, побережье Республики Корея.

Агар из A. tobuchiensis получали по следующей технологической схеме: предварительная обработка 0,5-1,0 %-ной суспензией Са(ОН)2, первая экстракция водой, вторая и третья - водой с добавлением 4 % и 2 % СаО от массы водоросли, фильтрация и желирование экстрактов, промывание гелей экстрактов водой до

обесцвечивания, замораживание, размораживание, обезвоживание ацетоном или спиртом и досушивание на воздухе. Из первого экстракта получали фракцию агара 1, из второго и третьего экстракта - фракции 2 и 3. Для исследований брали растворы после предобработки водорослей, неочищенные агаровые экстракты, сточные воды после промывки гелей экстрактов, промытые гели экстрактов и очищенные полисахариды. При исследовании кинетики экстракции предварительную обработку водоросли проводили 0,5 %-ной суспензией Са(ОН)2, экстракции проводили водой и водой с добавлением 8 % СаО, температура 100 °С. Пробы экстрактов отбирали каждый час и анализировали ВЭЭХ.

Агар из G. amansii получали экстракцией водой, экстракцией водой с предварительной обработки водоросли 3 %-ным раствором Ыа2С03 и экстракцией 0,01 N раствором H2S04.

ВЭЖХ-анализ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-6A (Япония) с УФ-детектором SPD-6AV (длина волны 280 нм) и рефрактометрическим детектором RID-6A. Разделение проводили на колонках Shodex Asahipak GS-320, GS-S20, GS-620 и GS-710 (Showa Denko, Япония), термостатированных при температуре 45 °С. Элюент - дистиллированная вода, скорость элюирования 1 мл/мин.

При определении моносахаридного состава агар гидролизовали трифторуксусной кислотой в присутствии 4-метилморфолинборана. Смесь полученных полиолов ацетилировали уксусным ангидридом в пиридине и анализировали на газовом хроматографе Shimadzu GC-14A (Япония) с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой СВР1 (Shimadzu, Япония). Содержание сульфатов в агаре определяли по методу Доджсона. 13С ЯМР-спектры снимали для 1 %-ных растворов агара в D20 на спектрометре Bruker WM-250 (Германия) с рабочей частотой по углероду 62,9 МГц, внутренний стандарт -метанол (50,16 м. д.).

Глава 3 посвящена разработке методики хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов, исследованию физико-химических процессов, протекающих при получении агара из А. tobuchiensis, изучению влияния условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii и описанию способа получеши агарозы из А. tobuchiensis.

Разделение и идентификация смесей белков и полисахаридов методом ВЭЭХ. В хроматографической системе для разделения и идентификации белков и полисахаридов должны отсутствовать неэксклюзионные взаимодействия и должны быть: широкий диапазон разделения по молекулярным массам, универсальный детектор для количественного определения компонентов в пробе и селективный детектор для их идентификации.

Для предотвращения неэксклюзионных взаимодействий типа полимер-сорбент для разделения смесей белков и полисахаридов использовали колонки с гидрофильным полимерным сорбентом Shodex Asahipak GS. В качестве подвижной фазы использовали дистиллированную воду. В данных условиях взаимодействия типа полимер-растворитель практически не наблюдались. Для предотвращения возможных взаимодействий типа полимер-полимер при определении молекулярной массы образцы агаров растворяли в смеси диметилсульфоксид-вода (9:1), а колонки термостатировали при температуре 45 °С.

Диапазон разделения по молекулярным массам колонок Shodex Asahipak GS-320, GS-520, GS-620 и GS-710 достаточно узок (рис. 1). Поэтому для увеличения диапазона разделения колонки Shodex Asahipak GS-520 и GS-620 соединили последовательно. Данный бимодальный набор колонок имел диапазон разделения по молекулярным массам от 180 до 2000000 Да (рис. 1).

Для количественного определения белков и полисахаридов в пробе использовали рефрактометрический детектор. Это универсальный детектор, сигнал которого пропорционален концентрации вещества и практически не зависит от его природы и молекулярной массы. Для идентификации белковых компонентов в пробе использовали характерное поглощение при длине волны 280 им, обусловленное наличием ароматических аминокислот. Выбранный метод идентификации имеет недостаток: при длине волны 280 нм также имеют поглощение и некоторые другие ароматические соединения.

Выбранные условия анализа позволили значительно упростить пробоподготовку. Образцы природных или искусственных смесей белков и полисахаридов разводили дистиллированной водой до содержания сухих веществ в растворе 0,5-1.0 %, фильтровали через мембранный фильтр Kurabo 25А (Япония) с размером пор 0,45 мкм и анализировали ВЭЭХ.

мин.

Рис. 1. Калибровочные кривые для колонок Shodex Asahipak GS-320, GS-520, GS-620, GS-710 и бимодального набора колонок Shodex Asahipak GS-520 + GS-620

Исследование основных физико-химических процессов получения агара из A. tobuchiensis. Полисахариды находящиеся в тканях водоросли связаны с белками, катионами металлов, а так же внутри- и межцепными взаимодействиями. Чтобы экстрагировать полисахарид из водоросли необходимо разрушить эти связи. Для облегчения извлечения из водоросли агара, уменьшения содержания в экстрактах неагаровых примесей и повышения гелеобразующих свойств агара в проводят предварительную обработку водоросли горячей суспензией Са(ОН)2.

Для изучения процесса предварительной обработки A. tobuchiensis использовали разработанную нами методику ВЭЭХ. Хроматографическое исследование показало, что в состав растворов после предобработки водоросли входят белковые примеси, низкомолекулярные вещества и незначительное количество агаровой фракции (рис. 2). Агаровая фракция выходит первой и практически не имеет поглощения при 280 им. Затем несколькими пиками выходят белковые примеси, они имеют интенсивное поглощение при 280 нм. Последними выходят низкомолекулярные примеси, не имеющие поглощения при 280 нм. Низкомолекулярные примеси представляют собой неразделенную смесь низкомолекулярных Сахаров и растворимых минеральных веществ.

Рис. 2. Хроматограмма раствора после предобработки А. 1оЬисЫепз15

Основным компонентом раствора после предобработки являются белковые вещества, их концентрация составляет 4,89-31,48 г/л, или 62,4-76,9 % от массы сухих веществ. Содержание низкомолекулярных примесей в растворе после предобработки составляет только 12,0-13,6 % от массы сухих веществ, а содержание агаровой фракции - 12,5-24,0 % (табл. 1).

Таблица 1

Состав растворов после предварительной обработки А. юЬисЫеп515

Условия предобработки Агаровая фракция Белковые примеси Низкомолекулярные примеси

г/л %* г/л %* г/л %*

0.5 % р-р Са(ОН)2, 100"С,1 ч 1,88+0,02 24,0 4,89+0,02 62,4 1,07±0,02 13,6

0,5 % р-р Са(ОН)2, 110°С,2ч 4,58+0,02 11,2 31,48+0,02 76,9 4,89±0,02 11,9

1 % р-р Са(ОН)2, 110 "С, 2 ч 5,05+0,02 12,5 30,57+0,02 75,5 4,86+0,02 12,0

* Содержание, % от массы сухих веществ в растворе после предобработки

Таким образом, установлено, что при предварительной обработке водоросли под действием Са(ОН)2 и температуры происходит разрушение внутри-и межмолекулярных связей белков и полисахаридов в тканях водоросли и начинается их диффузия в раствор. Содержание белковых веществ, низкомолекулярных примесей и агаровой фракции в растворе после предобработки водоросли зависит от температуры и продолжительности процесса.

После предварительной обработки водоросли промывают водой и проводят трехкратную экстракцию. Хроматографическое исследование первого, второго и третьего экстрактов из А. юЬиск1еп515 показало, что они содержат агаровую фракцию, загрязненную белковыми и низкомолекулярными примесями (рис. 3).

Рис. 3. Хроматограмма третьего экстракта из А. 1оЬис1иеп.ч13

Наиболее загрязнен примесями первый экстракт из А. 1оЬисЫет15, во втором и третьем экстракте содержание примесей значительно снижается (табл. 2).

Процесс экстрагирования агара из тканей водоросли состоит из двух сопряженно развивающихся стадий: разрушения внутри- и межмолекулярных связей белков и полисахаридов в тканях водоросли и молекулярной диффузии растворимого агара из сырья в экстрагент. Разработанная нами методика ВЭЭХ

была использована для исследования влияния СаО на кинетику экстракции агара и белковых примесей из А. 1оЬисШеШв (рис. 4).

Таблица 2

Состав неочищенных экстрактов из А. ¡оЬисЫетгя

Экстракт Агаровая Белковые Низкомолекулярные

фракция примеси примеси

г/л %* г/л %* г/л %*

1 10,99- 30,1-30,3 23,18- 63,3-63,5 2,32- 6,2-6,4

12,42+0,02 25,92+0,02 2,60±0,02

2 11,54- 39,4-47,8 14,29- 46,3-50,9 1,81- 5,9-9,6

14,76+0,02 14,89+0,02 2,82+0,02

3 15,55- 45,1-49,7 16,56- 45,7-50,0 1,63- 4,5-4,9

17,98+0,02 17,23+0,02 1,70±0,02

* Содержание, % от массы сухих веществ в экстракте

14 12

к ю

1 8

я £

5 б

X О

* 4 2

0

" Экстракция водой • Экстракция водой + СаО

2 3 4 5 Время, ч

14 12

-5 10

б

——— Экстракция водой /

/

—

— — --------

12 3 4 5 6 Время, ч

Рис. 4. Кинетические кривые экстракции агара (а) и белковых примесей (б) из А. Н)Ьис1иепш

а

7

Кинетические кривые экстракции агара из А. ¡оЬисЫепзгз практически не меняются при добавлении 8 % СаО от массы водоросли в экстракционную среду (рис. 4а). Следовательно, процесс экстракции агара лимитирует стадия молекулярной диффузии агара из сырья в экстрагент. При добавлении СаО кинетическая кривая экстракции белка из водоросли изменяется (рис. 46), это

свидетельствует о том, что процесс экстракции белковых примесей лимитирует стадия разрушения внутри- и межмолекулярных связей.

При исследовании влияния СаО на кинетику экстракции агара и белковых примесей из А. 1оЬиЫиепз1з было отмечено, что в процессе экстракции происходит деструкция молекул агара. Установлено, что при экстракции водой процесс деструкции полисахарида начинается через 6 ч после начала экстракции, а при добавлении СаО деструкция начинается уже через 2 ч и протекает со значительно большей скоростью.

Для очистки от неагаровых примесей гели экстрактов из А. 1оЪисЫет1$ многократно промывали водопроводной водой до обесцвечивания, а затем дополнительно настаивали в дистиллированной воде. Хроматографическое исследование показало, что промывные воды содержат белковые, низкомолекулярные примеси, а также сульфатированные молекулы агара (агаропектин), хорошо растворимые в холодной воде (рис. 5).

Белковые примеси

Промывка 1 Промывка 2

Промывка 3

Промывка диет, водой

Агаровая фракция

10

Время, мин.

, Ничкомолекулярные " примеси

/ \,

Рис. 5. Хроматограммы промывных вод после очистки геля третьего экстракта из А. ¡оЬисМежз

Неочищенные гели экстрактов представляют собой трехмерную сетчатую структуру, построенную из молекул агара, внутри которой находятся молекулы белковых примесей, катионы металлов и не участвующие в построении сетчатой структуры сульфатированные молекулы агара и продукты его деструкции. При промывании водой за счет диффузии происходит ионный и молекулярный обмен

между гелем и водой. В определенный момент устанавливается равновесие между содержанием неагаровых примесей в геле и воде. Поэтому для удаления всех неагаровых примесей из геля проводят многократную замену воды. При промывке гелей экстрактов содержание белковых примесей в промывных водах снижается в 22-27 раз, низкомолекулярных примесей - в 2-4 раза, а сульфатированных компонентов агаровой фракции - в 2-5 раз (рис. 6).

4 3,5 3

¡2.5

о. н

<и 2

я

х

5 1,5 I

0,5 О

•—*"*•" Агаровая фракция

/ к ... -Низ комоле кулярн ые при меси

\ а

\

\

\

... \

....... ....... ...... .....

4 3,5 3

I2'5 I 2

5 '.5 1

0,5 О

■т..... 1 .....1 1

Агаровая фракция -

\ омолек 11 е при* ее и

б

\

\

\

I

4 5 6 Промывка

I

4 5 Промывка

3

6

7

к

4 3.5 3 2,5

<ч

I ^

я

X

° г ч 1

0,5

О

11111

овая фракция овые примеси омолекуляриые примеси

В

\

\

...уу-ч.'

Рис 6. Динамика изменения состава промывных вод после очистки гелей первого (а), второго (б) и третьего (в) экстрактов

1 2 3,4 5 6 7 8 Промывка

Хроматографическое исследование промытых до обесцвечивания гелей экстрактов показало, что они содержат только агаровую фракцию, белковые и низкомолекулярные примеси не обнаружены. Концентрация агара в промытом геле первого и второго экстрактов составляет 9 г/л, в геле третьего экстракта - 11 г/л.

После обезвоживания и сушки из первого экстракта получали фракцию агара 1, из второго - фракцию 2 и из третьего — фракцию 3. Полученные фракции

агара различаются по физико-химическим показателям (табл. 3).

Таблица 3

Физико-химические показатели агаров и агароз

Образец Выход, Содержание, % Прочность, tjacm»

% золы сульфатов г/см' °с "С

Фракция агара 1 7,2-7,5 0,7-0,8 0,5-0,6 600-700* 35,5-38,0 92,0-93,0

Фракция агара 2 2,7-2,9 0,4 -0,5 0,3-0,4 900-1000* 35,5-37,0 85,0-89,0

Фракция агара 3 1,3-1,4 0,3-0,6 0,3-0,4 700-800* 35,5-36,5 85,0-89,0

Агар микробиологический - < 1,5 - >500* 30-37 >80

Агар особой очистки - < 1,0 - > 500* 30-37 >80

Агароза Sigma - <0,5 <0,25 > 1000** 36+1,5 88+1,5

Агароза Pharmacia - - <0,45 > 1200*** 40-43 90

* 0,85 %-ный гель ** 1 %-ный гель *** 1,5 %-ный гель

Вторая и третья фракции агара из А. юЬисЫею!! содержат меньше золы и сульфатов, имеют более высокую прочность гелей, чем первая фракция. Снижение содержания сульфатов во второй и третьей фракциях агара объясняется тем, что вторую и третью экстракции проводят с добавлением СаО, а в щелочной среде происходит отщепление сульфатных групп из 6 положения 4-связанных остатков а-Ь-галактопиранозы с образованием остатков 3,6-ангидро-а-Ь-галактопиранозы. В результате повышается регулярность структуры и улучшаются гелеобразующие свойства агара. Однако для агара из А. ¡оЬисШеп$15 добиться содержания

12

сульфатных групп меньше 0,2-0,3 % невозможно - эти остаточные сульфатные группы локализованы в положении 2 4-связанных остатков 3,6-ангидро-а-Ь-галактопиранозы и при щелочной обработке не отщепляются.

Методом ВЭЭХ исследовали молекулярно-массовое распределение первой, второй и третьей фракций агара из А. юЬисМетгх (табл. 4). Все фракции агара из А. юЬисЫепзгз полидисперсные и незначительно различаются молекулярно-массовым распределением. Молекулярно-массовое распределение фракций агара из А. 1оЬисЫеп$1$ показывает, что в процессе экстракции деструкция агара идет посередине полимерной цепи, а не только с восстанавливающего конца, как описано в литературе.

Таблица 4

Молекулярно-массовое распределение фракций агара из А. 1оЬисЫепх1х

Фракция агара М,, кДа % Мт кДа %

1 1872+93 91,2 981+49 8,8

2 1792+90 87,8 956+48 12,2

3 1790+90 85,7 965+48 14,3

По физико-химическим показателям все полученные фракции агара из А. юЬисЫеп51$ превосходят микробиологический агар, агар особой очистки и приближаются к коммерческим агарозам (табл. 3). Ранее критерием деления полисахаридных фракций на агар и агарозу считали содержание сульфатов менее 0,6 %. По этому критерию к агарозе можно отнести все фракции агара. Однако в настоящее время требования к агарозе ужесточились и содержание сульфатов должно быть не более 0,3 %. По данному критерию к агарозе можно отнести только вторую и третью фракции агара из А. ¡оЬисЫетгя. Для подтверждения этого предположения определили показатели, характеризующие структуру полисахарида, моносахаридный состав и молярное отношение производных 3,6-ангидрогалактозы и галактозы.

Методом полного восстановительного гидролиза в сочетании с ГЖХ-анализом было установлено, что в состав фракций агара из А. 1оЬисЫет1$ кроме О-галактозы и 3,6-ангидро-Ь-гапактозы входит 2-0-метил-3,6-ангидро-Ь-галактоза

(табл. 5). Однако эта особенность структуры агара из А. юЬисЫеюй не оказывает отрицательного влияния на практически важные свойства препарата.

Таблица 5

Моносахаридный состав фракций агара из А. 1оЬисЫею15

Фракция 2-0-Me-3.6-.4g, 3,6-Ag. Gai. Молярное отношение

агара %* %* %* A/G

1 5,6 32,2 50,9 0,82 : 1

2 8Д 32,2 46,9 0,95 : 1

3 9,4 29,3 Al,7 0,90 : 1

* Считая на ангидрозвено

Молярное отношение производных 3,6-ангидрогалактозы и галактозы (величина A/G) является показателем, который характеризует регулярность структуры полисахарида. Для идеальной агарозы величина AJG = 1:1, а для реальных полисахаридов всегда несколько меньше !. Для первой фракции агара величина A/G = 0,82:1, это свидетельствует о том, что по регулярности структуры данный полисахарид значительно отличается от агарозы. Для второй и третьей фракции агара из A. tobuchiensis величина A/G составляет 0,95:1 и 0,90:1, это подтверждает предположение о том, что вторая и третья фракции агара по регулярности структуры приближаются к агарозе (табл. 5).

Окончательно регулярность структуры второй и третьей фракции агара из А. tobuchiensis была подтверждена методом |3С ЯМР-спектроскопии. Полученные 13С ЯМР-спектры второй и третей фракции агара из A. tobuchiensis соответствовали спектру агарозы, частично метоксилированной по 2 положению 3,6-ангидро-Ь-галактозы.

Исследование влияния условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii. Технология получения агара из G. amansii значительно отличается от технологии получения агара из A. tobuchiensis. Это связано с различиями в химическом составе красных водорослей A. tobuchiensis и G. amansii. Красная водоросль G. amansii содержит в 2,6-2,8 раза больше агара и в 1,8-1,9 раза меньше азотистых веществ, чем красная водоросль A. tobuchiensis. Поэтому в технологии получения агара из G. amansii, как правило, отсутствует стадия

предварительной обработки и экстракция агара проводится в более мягких условиях.

Разработанная нами методика ВЭЭХ для исследования основных технологических процессов получения агара из А. 1оЬисМет1з была использована при исследовании влияния условий процесса экстракции на физико-химические свойства агара из й. атап$и. Экстракцию агара из О. ататИ проводили водой, водой с предварительной обработки 3 %-ным раствором Ка2С03 и 0,01 N раствором Н2504.

Хроматографическое исследование показало, что при экстракции водой экстракт содержит агаровую фракцию и белковые примеси (рис. 7). Содержание агара в экстракте из обесцвеченной водоросли в 1,4 раза больше, чем из необесцвеченной водоросли (табл. 6).

Таблица 6

Состав неочищенных агаровых экстрактов из С. атапзИ

Место Метод Содержание, г/л

сбора водоросли экстракции Агаровая фракция Белковые примеси Низкомолекулярная фракция агара

Водой 5,33+0,02 2,67+0,02 -

Чечжу Водой с предобработкой раствором Ыа2С01 12,60+0,02 - -

0,01 N раствором НгЭОл 8,52+0,02 3,01+0,02 3,60+0,02

Водой 7,70+0,02 2,62+0,02 -

Киямг* Водой с предобработкой раствором Ыа2С01 13,89+0,02 - -

0,01 N раствором Н^СЬ 16,66+0,02 4,72+0,02 10,78+0,02

"Водоросль предварительно обесцвечена на солнце

Если перед экстракцией агара из й. атаки провести предварительную обработку водоросли раствором \'а2С03, то в раствор после предобработки переходит основная часть белковых примесей (рис. 8), а экстракт содержит только агаровую фракцию (рис. 9).

Агаровая

фракция Белковые

Рис. 7. Хроматограмма водного экстракта из С. атапъи (водоросль собрана в районе Киянг и обесцвечена на солнце)

Ка.СО,

1-<-1-&-1*8--Л-1*5"

Время, мин.

Рис. 8. Хроматограмма раствора Ыа2С03 после предобработки й. атапзи (водоросль собрана в районе Киянг и обесцвечена на солнце)

Агаровая фракция

Рис. 9. Хроматограмма водного экстракта из & атаюи после предобработки раствором Ка2С03 (водоросль собрана в районе Киянг и обесцвечена на солнце)

Содержание агара в водном экстракте из & атапзИ после предварительной обработки раствором Ыа2С03 увеличивается в 1,8-2,4 раза (табл. 6). При этом содержание агара в экстракте из обесцвеченной водоросли только в 1,1 раза выше, чем в экстракте из необесцвеченной водоросли. При экстракции 0,01 N раствором IЬЙСЬ экстракт из С. аташИ содержит высокомолекулярную фракцию агара, белковые примеси, а также низкомолекулярную фракцию агара, появившуюся в результате кислотной деструкция агара (рис. 10).

Агаровая фракция

Рис. 10. Хроматограмма экстракта из (7. атапзи 0,01 N раствором Н2304 (водоросль собрана в районе Киянг и обесцвечена на солнце)

Содержание агара в экстракте из обесцвеченной водоросли в 2 раза выше, чем в экстракте из не обесцвеченной водоросли. При этом содержание низкомолекулярной фракции агара в экстракте из обесцвеченной водоросли также в 3 раза выше, чем в экстракте из не обесцвеченной водоросли (табл. 6).

Условия экстракции значительно влияют на выход и физико-химические свойства агара из б. атапзИ (табл. 7). Минимальный выход агара из б. отатИ наблюдается при экстракции водой без предварительной обработки. Предварительная обработка О. атати раствором К'а2С03 повышает выход агара в 1,1-1,2 раза и улучшает гелеобразуюшие свойства в 1,3-1,4 раза. Максимальный выход агара из О. атати наблюдается при экстракции 0,01 N раствором Н2304. Однако экстракция в кислой среде значительно снижает гелеобразуюшие свойства вплоть до их полного исчезновения для агара из обесцвеченной водоросли.

' Таблица 7

Физико-химическая характеристика агара из О. ататИ

Место сбора водоросли Метод экстракции Выход, , ■% Содержание, % Прочность 1,5 %-ного геля, г/см"

Зола Сульфаты

Чечжу Водой 21,3 3,2 0,4 1460

Водой с предобработкой раствором Ыа2СОз 25,6 2,8 0,4 2030

0,01 N раствором Н250.| 29,6 3,0 0,3 760

Киянг * Водой 24,6 2,8 0,3 1340

Водой с предобработкой раствором №2СО) 27,3 3,8 0,4 1750

0,01 N раствором Н2504 28,6 2,1 0,4 <100

* Водоросль предварительно обесцвечена на солнце

Исследование молекулярно-массового распределения агаров из (7. ата/ии показало, что предварительная обработка водоросли 3 %-ным раствором Ка2С03 практически не влияет на молекулярную массу агара, а при экстракции в кислой среде образуется до 41,8 % низкомолекулярной фракции агара (рис. 11, табл. 8).

Таблица 8

Молекулярло-массовое распределение агаров из С. атаюИ

Место Метод М„ % М,„ % М„, %

сбора экстракции кДа "Да «Да

водоросли

Водой 1531 100 - - - -

Чечжу Водой с предобработкой раствором Ыа2ССЬ 1563 100 - - - -

0,01 N раствором Н2504 1610 78,5 1143 7,2 611 14,3

Водой 1510 100 - - - -

Киянг* Водой с предобработкой раствором Ыа2СОз 1495 100 - - -

0,01 N раствором Н^СЬ 1618 47,7 1017 10,5 41 41,8

♦Водоросль предварительно обесцвечена на солнце

/ - агар получен экстракцией водой.

2 - агар получен экстракцией водой после предварительной обработки водоросли

раствором А'а:СОз.

3 - агар получен экстракцией 0,01 N раствором

Рис 11. Хроматограммы агаров из С. атапзи (водоросль собрана в районе Киянг и обесцвечена на солнце).

Получение' агарозы из А. 1оЬисИ1еп.<;1.ч. На основании результатов исследования физико-химических процессов получения агара разработан способ получения агарозы из А. ¡оЬисЫеппв (рис. 12). Для получения агарозы из А. 1оЬисЫеп515 предварительную обработку водорослей проводят 0,5-1,0 %-ной суспензией Са(ОН): для облегчения экстракции агара и удаления части белковых и низкомолекулярных примесей. После предобработки раствор сливают, промывают водоросли водой и проводят три последовательные экстракции. Первую экстракцию проводят водой, и полученный экстракт отправляют на производство агара. Вторую и третью экстракции проводят водой с добавлением 4 и 2 % СаО от массы водорослей для щелочной модификации полисахарида, и получают экстракты агарозы.

Гели второго и третьего экстрактов для удаления белковых примесей, продуктов деструкции агара, минеральных веществ и сульфатированной фракции агара промывают водой до обесцвечивания, а затем дополнительно настаивают в дистиллированной воде. Очищенные гели экстрактов обезвоживают прессованием

или замораживанием-размораживанием с последующей обработкой спиртом, гранулируют и сушат.

анфельция

агароза

Рис. 12. Схема получения агарозы из А. юЬисЫепз1в

Образцы агарозы, полученные из A. tobuchiensis данным способом, были проанализированы в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (г. Москва). По заключению ИОХ РАН образцы агарозы из A. tobuchiensis соответствуют требованиям, предъявляемым к агарозе для хроматографии и электрофореза, и рекомендуются для использования в качестве полноценного заменителя импортных препаратов агарозы типа А-9793 фирмы "Sigma".

В ЦЛ ОАО "Красфарма" (г. Красноярск) были проведены испытания образцов агарозы из A. tobuchiensis на возможность использования в селекции продуцента пенициллина. Получено положительное заключение о возможности использования агарозы из A. tobuchiensis для селекции продуцента пенициллина.

ВЫВОДЫ

1. Методом ВЭЭХ исследованы основные физико-химические процессы, протекающие при получении агара из красных водорослей A. tobuchiensis и G.

amansii.

2. Разработана методика хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов, применимая для исследования физико-химических процессов получения агара. Показано, что применение ВЭЭХ позволяет глубоко понять и эффективно контролировать основные процессы технологии получения агара из красных водорослей.

3. Исследован процесс предварительной обработки A. tobuchiensis. Установлено, что в процессе предварительной обработки водоросли под действием Са(ОН)2 и температуры происходит разрушение внутри- и межмолекулярных связей белков и полисахаридов в тканях водоросли и начинается их диффузия в раствор.

4. Исследован процесс экстракции агара из A. tobuchiensis. Установлено, что в процессе экстракции происходит окончательное разрушение внутри- и межмолекулярных связей белков и полисахаридов в тканях водоросли и идет их молекулярная диффузия из сырья в экстрагент. Лимитирующей стадией процесса экстракции агара является молекулярная диффузия, а процесс экстракции белковых примесей лимитирует стадия разрушения внутри- и межмолекулярных связей.

5. Исследован процесс очистки агара из A. tobuchiensis. Установлено, что при промывании водой гелей экстрактов за счет диффузии происходит удаление белковых и низкомолекулярных примесей, а также сульфатрованной фракции агара (агаропектина).

6. Исследованы физико-химические свойства и структура фракций агара из A. tobuchiensis. Установлено, что из первого экстракта получается фракция агара, а из второго и третьего экстрактов - фракции агарозы.

7. Методом ВЭЭХ исследовано влияние условий экстракции на физико-химические свойства агара G. amansii. Установлено, что при предварительной обработке водоросли раствором Na2C03 происходит удаление белковых примесей, повышается выход и улучшаются гелеобразующие свойства агара. При экстракции 0,01 N раствором H2S04 происходит деструкция агара, что приводит к снижению гелеобразующих свойств вплоть до их полного исчезновения.

8. На основании полученных данных разработан способ получения агарозы из A. tobuchiensis.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Суховерхов C.B., Подкорытова A.B. Использование высокоэффективной эксклюзионной хроматографии для определения молекулярной массы полисахаридов морских водорослей // Тез. докл. юбилейной науч. конф. "Рыбохозяйственные исследования океана". Владивосток, 1996. С. 57-58.

2. Суховерхов C.B., Долгов Д.А. Применение высокоэффективной эксклюзионной хроматографии в технологии агара // Тез. докл. конф. молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование гидробионтов". Владивосток, 1997. С. 151-152.

3. Суховерхов C.B., Долгов Д.А. Исследование мономерного состава и молекулярно-массового распределения агаров из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis // Тез. докл. Региональной естественнонаучной конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. Владивосток, 1997. С. 35.

4. Суховерхов C.B., Усов А.И., Подкорытова A.B., Кадникова И.А. Хроматографическое исследование агаровых экстрактов из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis // Биоорган, химия. 1999. Т. 25, № 3. С. 211-215.

5. Суховерхов C.B., Кадникова И.А., Кушева O.A., Подкорытова A.B. Обоснование технологии получения агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis II Известия ТИНРО. 1999. Т. 125. С. 282-286.

6. Суховерхов C.B. Исследование процессов предварительной обработки, экстракции и очистки агара из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis II Тез. докл. конф. молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробионтов". Владивосток, 1999. С. 220-222.

7. Суховерхов C.B., Кадникова И.А., Подкорытова A.B., Юн Х.-Д. Влияние условии экстрагирования на качество агара из красной водоросли Celidium amansii II Тез. докл. конф. молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробионтов". Владивосток, 1999. С. 222-224.

8. Суховерхов C.B., Кадникова И. А., Подкорытова A.B. Разработка технологии получения высокоочищенного агара и агарозы // Мат-лы докл. Второго международного симпозиума "Ресурсосберегающие технологии в аквакультуре". Адлер, 1999. С. 246-247.

9. Суховерхов C.B. Получение высокоочищенного агара и агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis II Тез. докл. международной конф. молодых ученых "Проблемы экологии и рационального природопользования стран Азиатско-Тихоокеанского региона". Владивосток. 1999. С. 184-186.

10. Суховерхов C.B., Кадникова И.А., Подкорытова A.B. Получение агара и агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis II Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36, № 2. С. 238-240.

11 .Суховерхов C.B. Современные методы исследования и контроля технологии получения полисахаридов // Тез. докл. Международной научно-практической конф. "Человек-Экология-Культура на пороге XXI века". Находка, 2000. 1 часть. С. 44-45.

12. Суховерхов C.B., Кадникова И.А. Исследование кинетики экстракции агара из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis II Тез. докл. Международной научно-практической конф. "Человек-Экология-Культура на пороге XXI века". Находка, 2000. 1-я часть. С. 24-26.

13. Суховерхов C.B. Современные методы контроля основных процессов технологии получения агара и агарозы // Сборник тез. докл. научно-технического симпозиума "Современные средства воспроизводства и использования водных биоресурсов. 7-я Международная выставка Инрыбпром-2000". Санкт-Петербург, 2000. Т. 3. С. 127-128.

14. Суховерхов C.B., Кадпикова И.А., Долгов Д.А., Подкорытова A.B.

«

Технология получения агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis и сорбентов для хроматографии на ее основе // Сборник тез. докл. научно-технического симпозиума "Современные средства воспроизводства и использования водных биоресурсов. 7-я Международная выставка Инрыбпром-2000"'. Санкт-Петербург, 2000. Т. 3. С. 125-127.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Высокоэффективная эксклюзионная хроматография биополимеров

1.1.1. Механизм эксклюзионного разделения

1.1.2. Сорбенты для эксклюзионной хроматографии 10 1.1.3. Неэксклюзионные взаимодействия при анализе белков и полисахаридов

1.1.3.1. Ионные эффекты

1.1.3.2. Гидрофобные взаимодействия

1.1.3.3. Адсорбция

1.1.3.4. Внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия

1.1.4. Калибровка хроматографической системы и расчет молекулярно-массовых характеристик

1.1.4.1. Калибровка колонок по коммерческим стандартам полисахаридов

1.1.4.2. Калибровка колонок по узким фракциям данного полисахарида

1.1.4.3. Калибровка колонок по полидисперсным образцам данного полисахарида

1.1.4.4. "Универсальная" калибровка

1.2. Строение агара и агарозы

1.3. Методы исследования строения агара и агарозы 30 1.3.1. Химические методы

1.3.2. Спектральные методы

1.4. Производство агара и агарозы

1.4.1. Технология получения агара из A. tobuchiensis

1.4.2. Технология получения агара из G. amansii

1.4.3. Способы получения агарозы

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Получение агара из A. tobuchiensis

2.1.2. Получение агара из G. amansii

2.2. Методы исследования

2.2.1. Источники случайных и систематических ошибок в хроматографическом анализе и методы их устранения

2.2.2. Методика исследования основных физико-химических процессов получения агара

2.2.3. Определение молекулярной массы полисахаридов

2.2.4. Определение структуры полисахаридов

2.2.5. Физико-химическая характеристика полисахаридов

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Разделение и идентификация смесей белков и полисахаридов методом ВЭЭХ 54 3.2 Исследование основных физико-химических процессов получения агара из A. tobuchiensis

3.2.1. Исследование процесса предварительной обработки водоросли

3.2.2. Исследование процесса экстракции агара

3.2.3. Исследование процесса очистки гелей экстрактов

3.2.4. Физико-химическая характеристика фракций агара из A. tobuchiensis IS

3.3. Исследование влияния условий экстракции на физикохимические свойства агара из G. amansii

3.4. Получение агарозы из A. tobuchiensis 92 Выводы 95 Список литературы 97 Приложения

Актуальность проблемы. Агар и агароза - это гелеобразующие полисахаридные препараты, получаемые из некоторых видов красных водорослей относящихся к родам Gelidium, Gracilaria, Pterocladia и Ahnfeltia [16]. Агар и агарозу широко используют в биохимии, иммунохимии, молекулярной биологии, микробиологии, производстве сорбентов для аффинной, ионообменной и эксклюзионной хроматографии, а также в пищевой и фармацевтической промышленности.

В России основным источником агара являются красные водоросли Ahnfeltia plicata, произрастающая в Белом море, и Ahnfeltia tobuchiensis, произрастающая в дальневосточных морях [2, 7, 8]. Существуют технологии получения из A. tobuchiensis агара пищевого, микробиологического и особой очистки. Однако, без дополнительной очистки эти препараты не пригодны для проведения электрофореза, иммунологических, вирусологических и биохимических исследований. Потребности в высокоочищенном агаре и агарозе удовлетворяются за счет импорта.

В ряде публикаций [9-12] была эмпирически показана возможность

13 получения из A. tobuchiensis не только агара, но и агарозы. Методами С ЯМР-спектроскопии и рентген-дифракционного анализа было доказано, что полисахарид из A. tobuchiensis лишь незначительно отклоняется от структуры истинной агарозы [10, 12, 13]. Основываясь на этих данных, с 1992 г. в ТИНРО-центре была начата разработка технологии получения агарозы из А. tobuchiensis. Для разработки данной технологии потребовалось исследовать процессы предварительной обработки водоросли, экстракции и очистки агара, так как они, в основном, определяют выход и качество продукта. Однако стандартные методы анализа агара [2, 14, 15] не подходили для таких исследований.

Проблема анализа состава углеводов в продукции на разных стадиях технологического процесса является актуальной не только в агаровом производстве, но и в других отраслях пищевой промышленности [16-19]. В настоящее время для анализа и разделения смесей углеводов наиболее перспективной считается высокоэффективная эксклюзионная хроматография (ВЭЭХ) [18-23]. Поэтому для изучения основных физико-химических процессов, протекающих при предварительной обработки водоросли, экстракции и очистки агара решено было использовать метод ВЭЭХ.

Цель работы: исследовать основные физико-химические процессы получения агара.

Основные задачи работы:

Подобрать условия хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов.

Методом ВЭЭХ исследовать физико-химические процессы, протекающие при предварительной обработки, экстракции и очистки агара из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis.

Методом ВЭЭХ изучить влияние условий экстракции на физико-химические свойства агара из красной водоросли Gelidium amansii. Научная новизна. Впервые методом ВЭЭХ исследованы основные физико-химические процессы, протекающие при предварительной обработки, экстракции и очистке агара из красной водоросли A. tobuchiensis. Изучено влияние условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii.

Практическая значимость работы. Разработана методика хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов, применимая для исследования и контроля физико-химических процессов получения агара. Разработан простой и недорогой способ получения агарозы из красной водоросли A. tobuchiensis.

На защиту выносятся:

Методика хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов, применимая для исследования физико-химических процессов получения агара.

Результаты исследования основных физико-химических процессов получения агара из A. tobuchiensis.

Результаты исследования влияния условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii.

Способ получения агарозы из A. tobuchiensis.

Выводы

1. Методом ВЭЭХ исследованы основные физико-химические процессы, протекающие при получении агара из красных водорослей А. tobuchiensis и G. amansii.

2. Разработана методика хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов, применимая для исследования физико-химических процессов получения агара. Показано, что применение ВЭЭХ позволяет глубоко понять и эффективно контролировать основные процессы технологии получения агара из красных водорослей.

3. Исследован процесс предварительной обработки A. tobuchiensis. Установлено, что в процессе предварительной обработки водоросли под действием Са(ОН)2 и температуры происходит разрушение внутри- и межмолекулярных связей белков и полисахаридов в тканях водоросли и начинается их диффузия в раствор.

4. Исследован процесс экстракции агара из A. tobuchiensis. Установлено, что в процессе экстракции происходит окончательное разрушение внутри- и межмолекулярных связей белков и полисахаридов в тканях водоросли и идет их молекулярная диффузия из сырья в экстрагент. Лимитирующей стадией процесса экстракции агара является молекулярная диффузия, а процесс экстракции белковых примесей лимитирует стадия разрушения внутри- и межмолекулярных связей.

5. Исследован процесс очистки агара из A. tobuchiensis. Установлено, что при промывании водой гелей экстрактов за счет диффузии происходит удаление белковых и низкомолекулярных примесей, а также сульфатрованной фракции агара (агаропектина).

6. Исследованы физико-химические свойства и структура фракций агара из A. tobuchiensis. Установлено, что из первого экстракта получается фракция агара, а из второго и третьего экстрактов - фракции агарозы.

7. Методом ВЭЭХ исследовано влияние условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii. Установлено, что при предварительной обработке водоросли раствором ИагСОз происходит удаление белковых примесей, повышается выход и улучшаются гелеобразующие свойства агара. При экстракции 0,01 N раствором H2SO4 происходит деструкция агара, что приводит к снижению гелеобразующих свойств вплоть до их полного исчезновения.

8. На основании полученных данных разработан способ получения агарозы из A. tobuchiensis.

1. Кизеветтер И.В. Технология дальневосточного агара // Известия ТИНРО. 1952. Т. 36.-310 С.

2. Кизеветтер И.В., Грюнер B.C., Евтушенко Л.А Переработка морских водорослей и других промысловых водных растений. М.: Пищевая промышленность, 1967. - 416 С.

3. Возжинская В.Б., Цапко А.С., Блинова Е.И., Калугина А.А., Петров Ю.Е. Промысловые водоросли СССР: Справочник. М.: Пищевая промышленность, 1971. С. 172-189.

4. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. М.: Пищевая промышленность, 1972. -336 С.

5. Зайцев В.П., Ажгихин КС., Ганделъ В.Г. Комплексное использование морских организмов. -М.: Пищевая промышленность, 1980. С. 26-38.

6. Богданов В. Д., Сафронова Т. М. Структурообразователи и рыбные композиции. М.: ВНИРО, 1993. С. 34-38.

7. Кизеветтер И.В. Промысел и обработка морских растений в Приморье. Владивосток: Дальневосточное книжное издательство, 1966. С. 72-85.

8. Арзамасцев И. С. Атлас промысловых морских беспозвоночных, водорослей и трав Приморского края. Владивосток: Арт-Пилот, 1997. -52 С.

9. Коллист А., Парцис А., Пюсса Г. Выделение, характеристика и использование полисахаридов агароносных водорослей // Изв. АН ЭССР. Сер. Химия. 1980. Т. 29. № 2. С. 123-150.

10. Труус К, Вялимяэ Т. , Вахер М., Коллист А. Выделение, характеристика и использование полисахаридов агароносныхводорослей. 13С ЯМР- спектроскопия агарозных носителей // Изв. АН ЭССР. Химия. 1988. Т. 37. №3. С. 190-194.

11. Труус К. Исследование строения и модификации агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis: Автореф. дис. . канд. хим. наук. М., 1994.- 26 С.

12. Aabloo A., Haav A., Tipp Н., Truus К. Agaroosi rontgenograafilisest uurimisest // Eesti Fiiusikka Seltsi Aastaraamat 1989/90. Tartu: Eesti Futisikka Selts, 1991. P. 89-97.

13. Головин A.H. Контроль производства продукции из морских водорослей и трав. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. 156 С.

14. ГОСТ 26185-84. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки. Методы анализа. Взамен ГОСТ 13929-68, ГОСТ 1393068, ГОСТ 22455-77, ГОСТ 6730-75, ГОСТ 16280-70; Введ. с 7.05.84. -54 С.

15. Нифантъева JI.B. Хроматографическое определение основных компонентов пищевых продуктов. В кн.: Методы анализа пищевых продуктов: Проблемы аналитической химии. Т. VIII. - М.: Наука, 1988. С. 92-104.

16. Попадич И. А., Маслова Л.Г. Некоторые аспекты применения физических и физико-химических методов для анализа пищевыхпродуктов. В кн.: Методы анализа пищевых продуктов: Проблемы аналитической химии. Т. VIII. - М.: Наука, 1988. С. 9-14.

17. Рудаков О.Б., Полянский К.К. Современная жидкостная хроматография углеводов // Молочная промышленность. 1999. № 4. С. 25-27.

18. Рудаков О.Б., Соколов М.И., Болдырев С.Ю., Шестаков А.С. Гель-проникающая хроматография смесей олиго-, ди- и моносахаридов // Изв. вузов. Пищевая технология. 1999. № 5. С. 92-94.

19. Honda S. Review. High performance liquid chromatography of mono- and oligosaccharides// Anal. Biochem. 1984. V. 140. P. 1-47.

20. Членов М.А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в разработке медицинских препаратов на основе биополимеров: Автореф. дис. .докт. хим. наук. М., 1991. - 48 С.

21. Rochas С., Lahaye М. Average molecular weight and molecular weight distribution of agarose and agarose-type polysaccharides // Carbohyd. Polymers. 1989. V. 10. P. 289-298.

22. Murano E., Brandolin C., Zanetti F., Paoletti S., Rizzo R. Characterization of an agar fraction extracted from Gracilaria dura (Gracilariales, Rhodophyta) // Hydrobiologia. 1990. V. 204/205. P. 567-571.

23. Murano E., Toffanin R., Pedersini C., Carabot-Cuervo A., Blunden G., Rizzo R. Structure and properties of agar from two unexploited agarophytes from Venezuela//Hydrobiologia. 1996. V. 326/327. P. 497-500.

24. Sousa-Pinto /., Murano E., Coelho S., Felga A., Pereira R. The effect of light on growth and agar content of Gelidium pulchellum (Gelidiaceae, Rhodophyta) in culture //Hydrobiologia. 1999. V. 398/399. P. 329-338.

25. Членов M.A., Малолетнева О.Ю., Гаврилова Е.Ф., Коротаев Г.К. Применение ВЭЖХ для анализа альгинов // Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Научно-технические проблемы марикультуры в стране". -Владивосток, 1989. С. 216-217.

26. Martinsen A., Skjak-Brcek, Sm ids rod О., Zanetti F., Paoletti S. Comparison of different methods for determination of molecular weight and molecular weight distribution of alginates // Carbohydr. Polym. 1991. V. 15. P. 171193.

27. Barth H.G. High-performance gel permeation chromatography of pectins // J. Liq. Chromatogr. 1980. V. 3. № Ю. P. 1481-1496.

28. Ekstrom L., Kuiviner J. Molecular weight distribution and hydrolysis behavior of carrageenans// Carbohydr. Res. 1983. V. 116. P. 89-94.

29. Ekstrom L. Molecular weight distribution and the behavior of kappa-carrageenans // Carbohydr. Res. 1985. V. 135. P. 283-285.

30. Lecacheux D., Panaras R., Brigand G., Martin G. Molecular weight distribution of carrageenans by size exclusion chromatography and low angle laser light scattering // Carbohydr. Polym. 1985. V. 5. P. 423-440.

31. Singh S., Jacobsson S. Kinetics of acid hydrolysis of k-carrageenan as determined by molecular weight (SEC-LALLS-RI), gel breaking strength, and viscosity measurements // Carbohydr. Polym. 1994. V. 23. P. 89-103.

32. Singh S.K., Shen B.C., Chon S.T., Fan L.T. Acid hydrolysis of k-carrageenan in a batch reactor: stochastic simulation of change of molecular weight distribution with time // Biotech. Prog. 1994. V. 10. P. 389-397.

33. Суховерхое С.В., Кадникова И.А. Использование УФ-спектроскопии и эксклюзионной ВЭЖХ для исследования свойств каррагинана // Тез. докл. конф. молодых ученых "Биоресурсы морских и пресноводных экосистем". Владивосток, 1995. С. 120-121.

34. Naohara J., Manabe М. Molecular mass and solubility changes in pectins during storage of satsuma mandarin fruits (Citrus unshiu Marc.) // J. Food Sci. 1994. V. 59. № 3. P. 578-580.

35. Стыскин E. JI., Ициксон JI. Б., Брауде Е. В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. -288 С.

36. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. - 252 С.

37. Томашек В. Гель-хроматография. В кн.: Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам: Пер. с англ. / Под ред. О. Микеша. - М.: Мир, 1982. Ч. 1. С.339-391.

38. Уотерфилд М.Д. Разделение смесей белков и пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии В кн.: Практическая химия белка: Пер. с англ. / Под ред. А. Дарбре. - М.: Мир, 1989. С. 197222.

39. Скоупс Р. Методы очистки белков. Пер. с англ. М.: Мир, 1985. 358 С.

40. Porath J., Flodin P. Gel filtration: A method for desalting and group separation//Nature. 1959. V. 183. P. 1657-1659.

41. Flodin P. Dextran gels and their application in gel filtration. Pharmacia. Uppsala. 1961.

42. Flodin P., Porath J. Molecular sieve process. In book: Chromatography. / Ed. Heftmann - New York, 1961. P. 328.

43. Porath J. Cross-linked dextrans as molecular sieves // Adv. Prot. Chem. 1962. V. 17. P. 209.

44. Barth H.G. A practical approach to steric exclusion chromatography of water-soluble polymers // J. Chromatogr. Sci. 1980. V. 18. № 9. P. 409-429.

45. Andersson Т., et al. Agarose-based media for high-resolution gel filtration of biopolymers // J. Chrom. 1985. V. 326. P. 33-44.

46. Коликов B.M., Мчедлишвили Б.В. Хроматография биополимеров на макропористых кремнеземах. JL: Наука, 1986. - 190 С.

47. Лисичкин Г.В., Кудрявцев Г.В., Сердан А.А., Староверов С.М., Юффа А.Я. Модифицированные кремнезёмы в сорбции, катализе и хроматографии. / под ред. Г.В. Лисичкина М.: Химия, 1986. - 248 С.

48. Энгельгард X., Мюллер X., Шён У. Хроматографическая колонка. В кн.: Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Пер. с англ. / под ред. А Хеншен, К.-П. Хупе, Ф. Лотшпайх, В. Вёльтер -М.: Мир, 1988. С. 22-99.

49. Barth H.G., Regnier F.E. High-performance gel permeation chromatography of water-soluble cellulosics // J. Chromatogr. 1980. Vol. 192. P. 275-293.

50. Тенников М.Б., Нефедов П.П., Лазарева М.А., Френкель С.Я. О едином механизме жидкостной хроматографии макромолекул на пористых сорбентах//Высокомол. соед. 1977. Т. А19. № 3. С. 657-660.

51. Нефедов П.П., Лавренко П.Н. Транспортные методы в аналитической химии полимеров Л.: Химия, 1979. - 232 С.

52. Pfannkoch Е., Ln К.С., Regnier F.E., Barth H.G. Characterization of some commercial high performance size-exclusion chromatography columns for water-soluble polymers //J. Chromatogr. Sci. 1980. V. 18. P. 430-441.

53. Лотшпайх Ф., Хеншен А. Аминокислоты, пептиды, белки В кн.: Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Пер. с англ. / под ред. А Хеншен, К.-П. Хупе, Ф. Лотшпайх, В. Вёльтер - М.: Мир, 1988. С. 171-260.

54. Stenlund В. Polyelectrolyte effects in gel chromatography // Adv. Chromatogr. 1976. V. 14. P. 37-74.

55. Schmidt D.E., Giese Jr. R.W., Connor D., Karger B.L. High-performance liquid chromatography of proteins on a diol-bonded silica gel stationary phase // Anal. Chem. 1980. V. 52. P. 177-182.

56. Mizutani Т., Mizutani A. Estimation of adsorbtion of drugs and proteins on glass surfaces with controlled pore glass // J. Pharm. Sci. 1978. V. 67. P. 1102-1105.

57. Беленький Б. Г., Вшенчик Л. 3. Хроматография полимеров. М.: Химия, 1978. - 344 С.

58. Cooper A.R., Matzinger D.P. Aqueous GPC: the effect of solvent ionic strength//J. Appl. Polym. Sci. 1979. V. 23. P. 419-427.

59. Domard A., Rinaudo M., Rochas C. Application of GPC to poly electrolytes: salt rejection mechanism and molecular weight distribution // J. Polym. Sci., Polym. Phys. Ed. 1979. V. 17. P. 673-681.

60. Griffiths A.J., Kennedy J.F. Biotechnology of polysaccharides. In book: Carbohydrate chemistry. / Ed. J.F. Kennedy - Oxford: Clarendon Press, 1988. P. 595-635.

61. Беленький Б.Г., Ганкина Э.С., Мальцев В.Г. Капиллярная жидкостная хроматография. Л.: Наука, 1987. С. 172-178.

62. Садлсет А. Взаимодействие воды с углеводами. В кн.: Вода в пищевых продуктах. Пер. с англ. / под ред. Дакуорта Р.Б. - М.: Пищевая промышленность, 1980. С. 32-44.

63. Усов A.M. Полисахариды красных морских водорослей. В кн.: Прогресс химии углеводов. - М.: Наука, 1985. С.77-96.

64. Березин И.В., Савин Ю.В. Основы биохимии. М.: Изд-во МГУ, 1990. -254 С.

65. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: Теория, методы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 1986. С.164-166.

66. Маршелл Р. К., Инглис А. С. Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей. В кн.: Практическая химия белка. Пер. с англ. / Под ред. А. Дарбре. - М.: Мир, 1989. С. 15-81.

67. Моравец Г. Макромолекулы в растворе. Пер. с англ. М.: Мир, 1967. 398 С.

68. Прузик 3. Белки. В кн.: Жидкостная колоночная хроматография. Пер. с англ. / Под ред. Дейла 3., Мацека К., Янака Я. - М.: Мир, 1978. Том 2. С.421-462.

69. Каменская Э.В., Султыгова З.Х. Дифференциация и анализ полисахаридов, белков и их компонентов в фруктово-ягодных соках. -В кн.: Методы анализа пищевых продуктов: Проблемы аналитической химии. Т. VIII. М.: Наука, 1988. С. 86-91.

70. Каменская Э.В., Захарова Е.В. Гибридные методы анализа высокомолекулярных веществ в пищевых жидкостях. В кн.: Методы анализа пищевых продуктов: Проблемы аналитической химии. Т. VIII. -М: Наука, 1988. С. 125-132.

71. Шатенштейн А.И., Вырский Ю.П., Правикова Н.А., Алиханов П.П., Жданова К.И., Изюмников A.JI. Практическое руководство по определению молекулярных весов и молекулярно-весового распределения полимеров. -М.: Химия, 1964. 188 С.

72. Хувинк Р., Ставерман А. Химия и технология полимеров: В 2-х т. Пер. с нем. Л.: Химия, 1965. Т. I. С. 342-390.

73. Кочетков Н.К, Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А., Усов А.И., Чижов О.С., Шибаев В.Н. Химия углеводов. М.: Химия, 1967. С. 513-516.

74. Захарченко В.Н. Коллоидная химия. М.: Высш. шк., 1989. С. 211-214.

75. Гааль Э., Медъеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. - 448 С.

76. Чапек К., Станек Я. Полисахариды. В кн.: Жидкостная колоночная хроматография. Пер. с англ. / Под ред. 3. Дейла, К. Мащека, Я. Янака. - М.: Мир, 1978. Т. 2. С. 129-135.

77. Членов М.А., Титова Е.В., Кудряшов Л.И., Peuiemoe А.С. Применение высокоэффективной эксюпозионной хроматографии для характеристики препаратов декстрана // Хим.-фарм. журн. 1985. № 7. С. 876-880.

78. Телкова Т.Н., Членов М.А., Малолетнева О.Ю., Петров П.Т., Домбровский В.А. Определение молекулярно-массовых характеристик оксиэтилированного крахмала с помощью высокоэффективной эксклюзионной хроматографии // Хим.-фарм. журн. 1987. № 11. С. 1384-1388.

79. Chaplin R.P., Ching W. Accurate calibration of a gel-permeation chromatograph by use of broad molecular weight distribution standards // J. Macromol. Sci.-Chem. 1980. V. A14. № 2. P. 257-263.

80. Yau W., Kirkland J., Bly D. Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. New York: J. Wiley and Sons, 1979. - 476 P.

81. Грюнер В. С. Агар, его применение и производство. М., Д.: Госторгиздат, 1931. -24 С.

82. Рапопорт A.JI. Товароведение пищевых продуктов применяемых в кондитерском производстве. Л.: Пищепромиздат, 1936. С. 510-529.

83. Чэпмен В. Морские водоросли и их использование. Пер. с англ. М.: И.-Л., 1953. С. 81-110.

84. Lewis G., Stanley N., Guist G. Commercial production and application of algal hydrocolloids. In book: Algae and human affairs. /Ed. C. Lemby. -Seattle: University of Washington, 1988. P. 206-232.

85. Neuberg C., Ohle H. Uber einen schwefelgehalt des agars // Biochem. Z. 1921. V. 125. P. 311.

86. Fairbrother F., Mastin H. The swelling of agar-agar // J. Chem. Soc. 1923. V. 123. P. 1412-1424.

87. Araki С. Agar-agar. III. Acetylation of the agar-like substance of Gelidium amansii (L.) //J. Chem. Soc. Japan. 1937. V. 58. P. 1338-1350.

88. Hands S., Peat S. Isolation of an anhydro-/-galactose derivative from agar // Nature. 1938. V. 142. P. 797.

89. Araki C. Isolation to agarobiose // J. Chem. Soc. Japan. 1944. V. 65. P. 533.

90. Hirase S. Studies on the chemical constitution of agar-agar. XIX. Pyruvic acid as a constituent of agar-agar. I. Identification and estimation of pyruvic acid in the hydrolysate of agar // Bull. Chem. Soc. Japan. 1957. № 1. P. 68.

91. Бемиллер Дж. H. Агар: Приготовление агара и агарозы; метанолиз; меркаптолиз. В кн.: Методы химии углеводов: Пер. с англ. / Под ред. Н.К. Кочеткова - М.: Мир, 1967. С. 314-317.

92. Rees D.A. Structure, conformation and mechanism in the formation of polysaccharide gels and networks // Advances in Carbohyd. Chem Biochem. 1969. V. 24. P. 267-315.

93. Izumi K. A new method for fractionation of agar // Agr. Biol. Chem. 1970. V. 34. P. 1739-1740.

94. Duckworth M., Yaphe W. The structure of agar. Part I. Fractionation of a complex mixture of polysaccharides // Carbohydr. Res. 1971. V. 16. P. 189198.

95. Young K., Duckworth M., Yaphe W. The structure of agar. III. Pyruvic acid, a common feature of agars from different agarophytes // Carbohydr. Res. 1971. V. 16. P. 446-448.

96. Izumi K. Chemical heterogeneity of the agar from Gelidium amansii // Carbohyd. Res. 1971. V. 17. P. 227-230.

97. Araki C. Structure of the agarose constituent of agar-agar I I Bull. Chem. Soc. Japan. 1956. V. 29. P. 543-544.

98. Araki С. Some recent studies of the polysaccharides of agarophytes. In book: Proceedings of the fifth international seaweed symposium - Oxford-London-New York-Paris: Pergamon Press, 1966. P. 3-17.

99. Falshaw R., Furneaux R.H., Pickering T.D., Stevenson D.E. Agars from three Fijian Gracilaria species // Bot. Mar. 1999. V. 42. P. 51-59.

100. Ng Ying Kin N. M. K, Yaphe W. Properties of agar: Parameters affecting gel-formation and the agarose-iodine reaction I I Carbohydr. Res. 1972. V. 25. P. 379-385.

101. Иванова E. Г. Новые полисахариды группы агара из красных водорослей Японского моря: Автореф. дис. . канд. хим. наук. М., 1986. - 23 С.

102. Lahaye М., Rochas С., Yaphe W. A new procedure for determining the heterogeneity of agar polymers in cell walls of Gracilaria spp. (Gracilariaceae, Rhodophyta) // Can. J. Bot. 1986. V. 64. P. 579-585.

103. Furneaux R. H., Miller I. J., Stevenson Т. T. Agaroid from New Zealand of the Gracilariaceae (Gracilariales, Rhodophyta) a novel dimethylated agar // Hydrobiologia. 1990. V. 204/205. P. 645-654.

104. Nelson W.A., Knight G.A., Falshaw R. A new agarophyte, Curdiea balthazar sp. nov. (Gracilariales, Rhodophyta), from the Tree Kigs Islands, northern New Zealand//Hydrobiologia. 1999. V. 398/399. P. 57-63.

105. Anderson N. S., Dolan Т. C. S., Lcrwson C. J., Penman A., Rees D. A. Carrageenans. V. The masked repeating structures of X- and ц-carrageenans // Carbohydr. Res. 1968. V. 7. P. 468-473.

106. Cote G. L., HanisakM. D. Production and properties of native agars from Gracilaria tikvahiae and other red algae // Bot. Mar. 1986. V. 29. P. 359366.

107. Rees D. A. Estimation of the relative amounts of isomeric sulphate esters in some sulphated polysaccharides // J. Chem. Soc. 1961. P. 5168-5171.

108. Rees D. A. Enzymatic synthesis of 3:6-anhydro-L-galactose within porphyran from L-galactose 6-sulfate units // Biochem. J. 1961. V. 81. P. 347-352.

109. Furneaux R. H., Stevenson Т. T. The xylogalactan sulfate from Chondria macrocarpa (Ceramiales, Rhodophyta) // Hydrobiologia. 1990. V. 204/205. P. 615-620.

110. Усов A.M., Кочетков Н.К. Полисахариды водорослей. II. Полисахариды красной водоросли Odonthalia corymbifera (Gmel.) J. Ag. Выделение б-О-метил-О-галактозы // Журн. общ. химии. 1968. Т. 38. №2. С. 234-238.

111. Кочетков Н.К., Усов A.M., Мирошникова JI.M. Полисахариды водорослей. V. Дальнейшее изучение состава и строения сульфатированного полисахарида из Laingia pacifica Yamada // Журн. общ. химии. 1970. Т. 40. № 11. С. 2473-2478.

112. Усов A.M., Мирошникова Л.М., Кочетков Н.К. Полисахариды водорослей. IX. Сольволитическое десульфатирование полисахарида из красной водоросли Laingia pacifica Yamada // Журн. общ. химии. 1972. Т. 42. №4. С. 945-949.

113. Усов A.M., Адамянг/ КС. Сольволитическое десульфатирование декстрансульфата//Биоорган, химия. 1975. Т. 1. № 5. С. 659-664.

114. Кочетков Н.К, Усов A.M., Мирошникова JI.M. Полисахариды водорослей. XI. Изучение полисахарида из Laingia pacifica Yamada методом метилирования // Журн. общ. химии. 1972. Т. 42. № 10. С. 2309-2315.

115. Барбакадзе В.В., Усов А.И. Полисахариды водорослей. XXVI. Метилирование и периодатное окисление полисахарида из красной водоросли Grateloupia divaricata Okam. // Биоорган, химия. 1978, Т. 4. №8. С. 1100-1106.

116. Усов А.И., Рехтер М.А., Кочетков Н.К. Полисахариды водорослей. III. Выделение и предварительное изучение ^-полисахарида из Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. // Журн. общ. химии. 1969. Т. 39. № 4. С. 905-911.

117. Усов А.И, Мироишикова Л.И., Кочетков Н.К Полисахариды водорослей. X. Периодатное окисление полисахарида из Laingia pacifica Yamada //Журн. общ. химии. 1972. Т. 42. № 7. С. 1623-1630.

118. Dodgson K.S. Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymic and non-enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters // Biochem. J. 1961. V. 78. P. 312-319.

119. Усов А.И, Рехтер M.A., Кочетков Н.К. Полисахариды водорослей. VI. Изучение х-полисахарида из Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. // Журн. общ. химии. 1970. Т. 40. № 12. С. 2732-2737.

120. Усов А.И, Козлова Е.Г. Полисахариды водорослей. Изучение одонталана сульфатированного полисахарида из красной водоросли Odonthalia corymbifera (Gmel.) J. Ag. // Биоорган, химия. 1975. Т. 1. № 7. С. 912-918.

121. Кочетков Н.К, Усов А.И, Мироишикова Л.И. Полисахариды водорослей. IV. Фракционирование и метанолиз сульфатированного полисахарида из Laingia pacifica Yamada II Журн. общ. химии. 1970. Т. 40. №11. С. 2469-2473.

122. Chizhov O.S., Zolotarev B.M., Usov A.I., Rechter M.A., Kochetkov N.K. Mass-spectrometric characterization of 3,6-anhydro-galactose derivatives // Carbohydr. Res. 1971. V. 16. №1. P. 29-38.

123. Чижов О.С., Шаткое А.С. Масс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия в установлении структуры полисахаридов. В кн.: Прогресс химии углеводов. М.: Наука, 1985. С. 30-54.

124. Yaphe W., Arsenault G.P. Improved resorcinol reagent for the determination of fructose and 3,6-angydrogalactose in polysaccharides 11 Anal. Biochem. 1965. V. 13. №1. P. 143-148.

125. Оводов Ю.С. Газожидкостная хроматография углеводов: Обзор. -Владивосток, 1970. 120 С.

126. Elkin Yu.N. Gas chromatographic separation of the methyl ether methylglycopyranoside series hexose, 6-deoxyhexose and pentose acetates // J. Chromatogr. 1979. V. 180 P. 163-169.

127. Kanan R., Seng P.N., Debuch H. Evaluation of a gas chromatigraphic method for the quantitative estimation of hexoses from neutral glycolipids // J. Chromatogr. 1974. V. 92. P. 95-103.

128. Mollion J., Andriantsiferana M., Sekkal M. A study of the phycocolloids from Gelidium madagascariense and Eucheuma denticulatum (Rhodophyta) collected on south coasts of Madagascar // Hydrobiologia. 1990. V. 204/205. P. 655-659.

129. Stevenson T.T., Furneaux R.H. Chemical method for the analysis of sulphated galactans from red algae // Carbohydr. Res. 1991. V. 210. P. 277298.

130. Seymour F.R., Chen E.C.M., Bishop S.H. Identification of aldoses by use of their peracetylated aldononitrile derivatives: A GLS-MS approach // Carbohydr. Res. 1979. V. 73. P. 19-45.

131. Jankowski К., Gaudin D. Critical examination of the use of gas chromatography-mass spectrometry in the identification of persillyated saccharides //Biomedical Mass Spectrometry. 1978. V. 5. № 5. P. 371-372.

132. Cahour A., Hartmann L. Study of neutral and aminomonosaccharides by gas-liquid differential chromatography: Application to three reference glycoproteins//J. Chromatogr. 1978. V. 152. P. 475-486.

133. Iverson J.L., Bueno M.P. Evaluation of high pressure liquid chromatography and gas-liquid chromatography for quantitative determination of sugars in foods //J. Assoc. Anal. Chem. 1981. V. 64. № 1. P. 139-143.

134. Arakawa Y., Imanari Т., Tamura Z. Determination of neutral and amino sugars in glycoproteins by gas chromatography // Chem. Pharm. Bull. 1976. V. 24. № 9. P. 2032-2037.

135. Gerwig G.J., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G. Determination of the D and L configuration of neutral monosaccharides by high-resolution capillary GLC // Carbohyd. Res. 1978. V. 62. P. 349-357.

136. Чармс Ш. Углеводы. В. кн.: Хроматография: Практическое приложение метода. Пер. с англ. / Под ред. Э. Хефтмана. - М.: Мир, 1986. Ч. 2. С. 5-87.

137. Усов А.И., Элашвили М.Я. Количественное определение производных 3,6-ангидрогалактозы и специфическое расщепление галактанов красных водорослей в условиях восстановительного гидролиза // Биоорган, химия. 1991. Т. 17. № 6. С. 839-848.

138. Usov A.I. A new chemical tool for characterization and partial depolymerization of red algal galactans // Hydrobiologia. 1993. V. 260/261. P. 641-645.

139. Garegg P.J., Lindberg В., Konradsson P., Kvanstrom I. Hydrolysis of glycosides under reducing conditions I I Carbohyd. Res. 1988. V. 176. P. 145-148.

140. Rochas С., Lahaye М., Yaphe W. Sulfate content of carrageenan and agar determined by infrared spectroscopy // Bot. Mar. 1986. V. 24. P. 99-108.

141. Fostier A.H., Kornprobst J.M., Combaut G. Chemical composition and rheological properties of carrageenans from two Senegalese Soleriaceae Anatheca montagnei Schmitz and Meristotheca senegalensis Feldmann // Bot. Mar. 1992. V. 35. P. 351-355.

142. Usov A.I., Ivanova E.G., Sashkov A.S. Polysaccharides of algae. XXXIII. Isolation and 13C-NMR spectral stady of some new gel-forming polysaccharides from Japan sea red seaweeds // Bot. Mar. 1983. V. 26. P. 285-294.

143. Usov A.I. NMR spectroscopy of red seaweed polysaccharides: agars, carrageenans andxylans //Bot. Mar. 1984. V. 27. P. 189-202.

144. Lahaye M., Yaphe W., Rochas C. 13C NMR spectral analysis of sulfated and desulfated polysaccharides of the agar type I I Carbohydr. Res. 1985. V. 143. P. 240-245.

145. Chiles T.C., Bird K.T., Koehn F.E. Influence of nitrogen availability on agar-polysaccharides from Gracilaria verrucosa strain G-16: structural analysis by NMR spectroscopy II J. Appl. Phycol. 1989. V. 1. P. 53-58.

146. Rochas С., Lahaye M. Solid state I3C NMR spectroscopy of red seaweeds, agars and carrageenans // Carbohydr. Polym. 1989. V. 10. P. 189-204.

147. Gordon-Mills E., Tate M., Hounslow A. Use of solid and gel state 13C NMR spectroscopy for differentiation between agarophytes and carrageenophytes //Hydrobiologia. 1990. V. 204/205. P. 629-636.

148. Lloyd A.G., Dodgson K.S., Price R.G., Rose F.A. Infrared studies on sulphate esters. I. Polysaccharide sulphates //Biochim. Biophys. Acta. 1961. V. 46. №1. P. 108-115.

149. Яроцкий С.В., Шашков А.С., Усов А.И. Анализ спектров 13С-ЯМР некоторых галактанов красных водорослей // Биоорган, химия. 1977. Т. 3. № 8. С. 1135-1137.

150. Шашков А.С., Усов А.И., Яроцкий С.В. Полисахариды водорослей.

151. XXIV. Применение спектроскопии 13С-ЯМР для анализа структуры полисахаридов группы агара // Биоорган, химия. 1978. Т. 4. № 1. С. 7481.

152. Яроцкий С.В., Шашков А.С., Усов А.И. Полисахариды водорослей.1 ^

153. XXV. Применение спектроскопии С-ЯМР для анализа структуры полисахаридов типа х-каррагинана // Биоорган, химия. 1978. Т. 4. № 5. С. 745-751.

154. Usov A.I., Yarotsky S. V., Shashkov A.S. 13C NMR spectroscopy of red algal galactans //Biopolymers. 1980. V. 19. № 5. P. 977-990.

155. Falshaw R., Furneaux R.H. Carrageenan from the tetrasporic stage of Gigartina decipiens (Gigartinaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Res. 1994. V. 252. P. 171-182.

156. Miller I .J., Falshaw R., Furneaux R.H. Structural analysis of the polysaccharide from Pachymenia lusoria (Cryptonemiaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Res. 1995. V. 268. P. 219-232.

157. Miller I.J. The structure of a pyruvylated carrageenan extracted from Stenogramme interrupta as determined by 13C NMR spectroscopy // Bot. mar. 1998. V. 41. P. 305-315.

158. Miller I.J. Further evaluation of the structure of the polysaccharide from Plocamium costatum with the use of set theory // Hydrobiologia. 1999. V. 398/399. P. 385-389.

159. Трейман И. Проблема Дальневосточного агар-агара. Применение и физико-химические свойства агар-агара // Вестник Дальневосточного филиала Академии наук СССР. 1933. № 1-3. С. 109-114.

160. Зинова Е.С. Морская капуста (Laminaria) и другие водоросли, имеющие промысловое значение // Известия ТОНПС. 1928. Т. 1. Вып. 1. С. 77-142.

161. Кинтаро-Кимура Обработка рыбы и других водных промысловых. -M.-JL: Пищепромиздат, 1939. Часть 1. С. 172-190.

162. Тапикава И. Продукты морского промысла Японии: Пер. с англ. М.: Пищевая промышленность, 1975. С.169-177.

163. Кизеветтер К.В., Суховеева М.В., Шмелькова Л.П. Промысловые водоросли и травы дальневосточных морей. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. С. 58-94.

164. Микулич Д.В., Красилъникова С.В., Дырикова С.Г. Исследование состава сточных вод производства студнеобразователей и возможныенаправления снижения их загрязнённости // Биотехнология. 1997. №2. С. 53-58.

165. ГОСТ 16280-88. Агар пищевой. Технические условия. Взамен ГОСТ 16280-70; Введ. С 01.01.90 - 7 С.

166. ГОСТ 17206-96. Агар микробиологический. Технические условия. -Взамен ГОСТ 17206-84; Введ. с 01.01.98. 9 С.

167. ТУ 9284-095-00472012-97. Агар особой очистки. Технические условия. Взамен ТУ 15-01-469-86; Введ. с 01.04.97. - 8 С.

168. Уитон Ф.У., Лосон Т.Б. Производство продуктов питания из океанических ресурсов. Пер. с англ. М.: Агропромиздат, 1989. Т. 2. С. 351-353.

169. Durrant N., Sanford В. Phycocolloids // Fish. Ind. Res. 1970. Vol. 6. № 1. P. 15-51.

170. Hjerten S. Some new methods for preparation of agarose // J. Chromatogr. 1971. V. 16. P. 73-80.

171. Russell В., Mead Т.Н., Poison A. A method of preparing agarose // Biochim. Biophys. Acta. 1964. V. 86. P. 169.

172. Tagawa Sh. Chemical studies on manufacture of agar-agar // The Journal of the Shimonoski University of Fisheries. 1968. V. 17. № 2. P. 1-52.

173. Guiseley K.B., Kirkpatrick F.H., Provonchee R.B., Dumais M.M., Nochumson S. A further fractionation of agarose // Hydrobiologia. 1993. V. 260/261. P. 505-511.

174. Чарыков A.K. Математическая обработка результатов химического анализа. JL: Изд-во Ленингр. ун-та, 1977. - 120 С.

175. Суховерхое С.В., Усов А.И., Подкорытова А.В., Кадникова И.А. Хроматографическое исследование агаровых экстрактов из краснойводоросли Ahnfeltia tobuchiensis II Биоорган. Химия. 1999. Т. 25. № 3. С. 211-215.

176. Хупе К.-Л., Розинг Г., Шренкер X. Аппаратура. В кн.: Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Пер. с англ. / под ред. А Хеншен, К.-П. Хупе, Ф. Лотшпайх, В. Вёльтер - М.: Мир, 1988. С. 100-170.

177. Трубицына Е.С., Власова Е.Г., Клячко Ю.А. Современные методы определения белка в соках, молоке и других пищевых продуктах. В кн.: Методы анализа пищевых продуктов: Проблемы аналитической химии. Т. VIII. - М.: Наука, 1988. С. 216-226.

178. Дарбре А. Аналитические методы. В кн.: Практическая химия белка. Пер. с англ. / Под ред. А. Дарбре. - М.: Мир, 1989. С. 243-333.

179. Суховерхое С.В., Долгов Д.А. Применение высокоэффективной эксклюзионной хроматографии в технологии агара // Тез. докл. конф. молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование гидробионтов". Владивосток, 1997. С. 151-152.

180. Суховерхое С.В., Кадникова И.А., Kyuieea О.А., Подкорытова А.В. Обоснование технологии получения агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis II Известия ТИНРО. 1999. Т. 125. С. 282-286.

181. Суховерхое С.В. Современные методы исследования и контроля технологии получения полисахаридов // Тез. докл. Международной научно-практической конф. "Человек-Экология-Культура на пороге XXI века". Находка, 2000. 1 часть. С. 44-45.

182. Суховерхое С.В., Кадникова И.А., Подкорытова А.В. Получение агара и агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis II Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 2. С. 238-240.

183. Судъина Е.Г., Шнюкова Е.И., Костлан Н.В., Мушак П.А., Тупик Н.Д. Биохимия синезеленых водорослей. Киев: Наукова думка, 1978. -246 С.

184. Суховерхое С.В., Кадникова И.А., Подкорытова А.В. Разработка технологии получения высокоочищенного агара и агарозы // Материалы докл. Второго международного симпозиума

185. Ресурсосберегающие технологии в аквакультуре". Адлер, 1999. С. 246-247.

186. Суховерхое С.В., Кадникова И. А. Исследование кинетики экстракции агара из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis П Тез. докл. Международной научно-практической конф. "Человек-Экология-Культура на пороге XXI века". Находка, 2000. 1 часть. С. 24-26.

187. Труус К.Э., Вялимяэ Т.К. , Вахер М.Э., Коллист А.П. 13С ЯМР-спектроскопия агарозной матрицы из разных коммерческих препаратов носителей // Тез. докл. VIII Всесоюзн. конф. "Химия и биохимия углеводов". Тбилиси, 1987 г.-Пущино, 1987. С. 105-106.