Полимерные раневые покрытия с ферментативным и антимикробным действием тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

/

ЮДАНОВА Татьяна Николаевна

ПОЛИМЕРНЫЕ РАНЕВЫЕ ПОКРЫТИЯ С ФЕРМЕНТАТИВНЫМ И АНТИМИКРОБНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

(02.00.06 - Высокомолекулярные соединения)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета имени А.Н. Косыгина

Научный консультант: доктор химических наук

профессор Л.С.Гальбрайх

Официальные оппоненты: доктор химических наук

профессор А.Е.Васильев

доктор химических наук профессор М.И.Штильман

доктор химических наук ст.н.с. К.К.Бабиевский

Ведущая организация: Центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится "_"_2004 г. в_час_мин на заседании диссертационного совета Д 212.139.01 в Московском государственном текстильном университете им. А.Н. Косыгина по адресу: 119991, Москва, М. Калужская, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного текстильного университета им. А.Н. Косыгина.

Автореферат разослан "_"_2004 года.

Ученый секретарь диссертационного 0 С/

совета _¿^■^^у д.х.н. Н.С.Зубкова

Введение

Интенсивное развитие химии медико-биологических полимеров обусловлено непрерывно растущим уровнем медицинских технологий и возникающей в связи с этим необходимостью создания изделий и средств на основе синтетических и натуральных полимеров для восстановления и обеспечения нормальной жизнедеятельности организма.

Актуальность разработки и совершенствования раневых покрытий диктуется задачами современной реконструктивной хирургии и низкой эффективностью традиционных перевязочных средств. Кроме того, развитие концепции процесса ранозаживления предъявляет новые требования к раневым покрытиям, функции которых в настоящее время значительно расширились и заключаются не только в защите раны от внешних воздействий, но и в создании оптимальных условий для заживления. К числу перспективных перевязочных средств относятся материалы, обладающие комбинированным лечебным действием, в частности ферментативным и антимикробным. Целесообразность применения покрытий с таким комплексом свойств в первой фазе раневого процесса является патогенетически обоснованной. Введение в состав материалов про-теолитических ферментов с коллагенолитической активностью позволит применять их и на стадии рубцевания.

Сложность получения лекарственных композиций, содержащих одновременно фермент и антимикробное вещество, заключается в возможной инактивации протеазы. Это связано с высокой реакционной способностью антимикробных веществ по отношению к белкам. Таким образом, становится очевидным, что фермент должен быть защищен от прямого воздействия на него антимикробного вещества. Для этого есть два пути: первый - получение материала с комбинированным биологическим действием по двухстадийному способу, когда сначала проводится иммобилизация фермента с целью его стабилизации, а затем - антимикробного вещества. Второй - подбор таких компонентов, которые позволили бы создать кинетически устойчивую систему, содержащую фермент и антимикробное вещество, и затем использовать ее для иммобилизации на материалах различного типа.

При получении раневых покрытий необходимо принимать во внимание, что в отличие от биоактивных материалов иного назначения раневые покрытия - это одноразовые средства с коротким сроком эксплуатации, поэтому их биологическая активность должна максимально реализовываться при наложении на рану. В связи с этим большой интерес представляет разработка таких методов иммобилизации биологически активных веществ, которые позволили бы за счет регулирования состава полимерной системы и характера взаимодействий между ее компонентами направленно изменять свойства раневых покрытий и за счет этого расширить арсенал имеющихся перевязочных средств.

Цель работы заключается в научном обосновании принципов получения волокнистых и пленочных материалов медицинского назначения, одновременно содержащих иммобилизованные фермент и антимикробное вещество, а так-

же в характеристике особенностей

и медико-биологических свойств разработанных раневых покрытий с пролонгированным комплексным биологическим действием.

В связи с этим были поставлены задачи:

1. Провести сравнительное изучение иммобилизации протеолитических ферментов - медицинских субстанций и антимикробных веществ на модифицированных полимерных носителях, а также специфической активности, стабильности и физико-химических свойств полученных материалов.

2. Изучить закономерности получения полимерных композиций с комбинированной биологической активностью, их иммобилизации в структуре волокнистых и пленочных материалов и влияния условий получения на специфические свойства.

3. Изучить микробиологические и медико-биологические свойства материалов с комплексной биологической активностью.

Научная новизна работы. Разработаны принципы совместной иммобилизации ферментов - медицинских субстанций и антимикробных веществ в структуре волокнистых и пленочных материалов, использование которых позволяет получать полимерные раневые покрытия с прогнозируемым уровнем комбинированного биологического действия.

Показана возможность регулирования состава, структуры, активности и стабильности комплексов ферментов с нерастворимыми (модифицированными волокнистыми материалами) и растворимыми полиэлектролитами путем изменения заряда, степени ионизации и количества ионогенных групп полиэлектролита, введения в молекулу полиэлектролита гидрофобных заместителей или образования межмолекулярных химических связей.

Установлена зависимость фармакокинетических свойств волокнистых и пленочных материалов, содержащих одновременно иммобилизованные фермент и антимикробное вещество, от характера химических и нехимических взаимодействий, реализуемых в многокомпонентной полимерной системе и определяющих надмолекулярную структуру полимерных материалов.

Показано, что формирование структуры композиционного соединения на волокнистой основе можно контролировать, изменяя состав полимерной системы, используемой при иммобилизации: содержание полимерных компонентов, химическую природу волокнистой матрицы и антимикробного вещества, заряд полиэлектролита и степень его ионизации, тип сшивающих реагентов, молекулярную массу антимикробного вещества.

Сформулированы представления о формировании межфазных адсорбционных слоев в многокомпонентной полимерной системе на основе поливинилового спирта, содержащей фермент и антимикробный поликатион, и показана возможность влияния на структурообразование путем изменения степени ионизации поликатиона, введения полимерного противоиона и сшивающего реагента.

Установлено радиопротекторное действие полимера-носителя в отношении иммобилизованного фермента, обусловленное эстафетным механизмом пе-

редачи свободного радикала с облученной макромолекулы иммобилизованного белка на полимер-носитель.

На защиту выносятся:

научно-обоснованные принципы получения волокнистых и пленочных материалов с прогнозируемым уровнем ферментативной и антимикробной активности;

совокупность закономерностей и обобщений, расширяющих область знаний о модификации ферментов (трипсина, тсррилитина, коллитина, протеазы С, лизоцима) и свойствах их иммобилизованных форм;

разработанные методы совместной иммобилизации ферментов и антимикробных веществ в структуре волокнистых и пленочных материалов

Практическая значимость диссертационной работы.

Впервые получены полимерные раневые покрытия, содержащие соиммо-билизованные протеолитический фермент и высокомолекулярное антимикробное вещество.

Разработаны научные и технологические основы создания волокнистых и пленочных материалов с ферментативным и антимикробным действием.

Получено разрешение МЗ РФ на промышленное производство волокнистых раневых покрытий, содержащих трипсин и хлоргексидин или мочевину, разработанных совместно с ВНИИТГП (ВНИИТМ).

Совместно с Московским научно-исследовательским онкологическим институтом им. П.А.Герцена разработано универсальное пленочное покрытие, содержащее лизоцим и хлоргексидин, для профилактики воспалительных процессов и лечения обширных ран различной этиологии.

Личный вклад автора заключается в постановке целей и задач исследований, теоретическом и методическом обосновании путей их решения, непосредственном выполнении исследований, обобщении результатов, организации проведения медико-биологических испытаний.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на Третьей Всероссийской Каргинской конференции "Полимеры-2004" (Москва), II международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003), I-IV международных конференциях "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов " (Москва, 1992, 1995, 1998. 2001). Всероссийских научно-технических конференциях "Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Москва, 1998. 1999, 2001. 2003), Всероссийской конференции "Проблемы медицинской этимологии" (Москва. 2002). Международных конференциях "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" (Москва-Щелково, 1999, 2001), Международных симпозиумах по химическим волокнам (Калинин, 1986, Тверь 1986), Международной конференции "Synergetic of mac-romolecular hierarchic structures" (Ташкент, 2000), 1 Всероссийской научной конференции "Физико-химия процессов переработки полимеров" (Иваново. 1999), Международном симпозиуме "Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов" (Минск, 1998), Международной конференции "Некоторые проблемы химии и физики полисахаридов" (Ташкент, 1997), I Международной научно-

технической конференции "Актуальные проблемы химии и химической технологии" (Иваново, 1997), Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидро-бионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты" (Владивосток, 1991), European symposium on carbohydrate chemistry (Edinburgh, Scotland, 1991), Всесоюзной научной конференции "Проблемы модификации природных и синтетических волокнообразующих полимеров" (Москва, 1991), Республиканской научно-практической конференции "Синтез и применение энтеросорбептоз" (Конаково, 1990). VI Всесоюзной конференции по физике и химии целлюлозы (Минск, 1990), Всесоюзной конференции "Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицинской и микробиологической промышленности" (Ташкент, 1989), I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), 2-й Всесоюзной конференции "Интерполимерные комплексы" (Рига, 1989), I Всесоюзной конференции "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов" (Москва. 1989), V и VI Всесоюзных симпозиумах "Инженерная эн-зимология" (Олайне, 1985, Вильнюс, 1988), VII Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Минск. 1985), IV Московской конференции по органической химии и технологии (Москва, 1985).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 52 статьи, 43 тезисов докладов, получены 3 авторских свидетельства СССР и 1 патент РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, заключения, библиографии (316 наименований) и приложения, включающего акты об испытаниях. Основной текст диссертации изложен на 328 страницах, включает 120 рисунков и 76 таблиц.

Работа выполнена на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета в рамках совместных исследований с Государственным научным центром ТУНП Антибиотики", Охтинским НПО "Пластполимер", Всероссийским научно-исследовательским институтом полимерных волокон, Институтом элементоорганических соединений РАН, Институтом синтетических полимерных материалов РАН, МГУ им. М.В.Ломоносова (Биофак), Московской медицинской академией им. И.М.Сеченова, НИИ лазерной хирургии, Московским научно-исследовательским онкологическим институтом им. П.А.Герцена в соответствии с программой ОЦ 015, Государственной научно-технической программой "Новейшие методы биоинженерии" по направлению "Инженерная энзимоло-гия", Межвузовской научной программой "Университеты России".

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование последовательной иммобилизации ферментов и антимикробных веществ на волокнистых материалах

С целью получения биологически активных волокнистых материалов с комплексной биологической активностью исследованы закономерности иммобилизации протеолитических ферментов на полимерах, содержащих ионизующиеся группы, и их стабильность к действию антимикробных веществ.

Объектами исследований являлись ферменты - медицинские субстанции террилитин (ТЕР) с изоэлектрической точкой (ИЭТ) 4,6, трипсин (ТР), колли-тин (КОЛ), лизоцим (ЛИЗ) с ИЭТ 10-10,5 и протеаза С (ПР), состоящая из нескольких ферментов, которые имеют сильно отличающиеся ИЭТ (от 4 до 10,5) и разные рН оптимумы. В качестве полимерных носителей использованы целлюлозные материалы, модифицированные прививкой ионогенных полимеров -привитые сополимеры целлюлозы и полиакриловой (Цел-прив-ПАК) или по-лиметакриловой кислот, сополимера акриловой кислоты и метиленбисакриламида, натриевой соди полистиролсульфокислоты, сополимера натриевой соли полистиросульфокислоты и ^№'-метиленбисакриламида, полидиметилдиаллиламмоний хлорида (Цел-прив-ПДАХ).

Установлено, что реакция комплексообразования ферментов с нерастворимыми полиэлектролитами протекает в широком интервале рН, даже когда макромолекулы белка и полимера-носителя имеют одинаковый заряд. Максимальная относительная активность иммобилизованного фермента (ОА - активность по отношению к нативному ферменту) достигается в определенных условиях для каждого из исследуемых ферментов. Так, оптимальное значение ком-плексообразования при иммобилизации на привитом сополимере целлюлозы и полиакриловой кислоты составляет для ТЕР 4,0, для ТР, КОЛ, ЛИЗ - 8,5, ПР -8,0.

Кинетика интерполимерной реакции ферментов с нерастворимыми ПЭ во многом определяется поведением белков в растворе. Так, склонность трипсина и коллитина к ассоциации приводит к кооперативному взаимодействию, которое описывается кинетическими кривыми с максимумом. И, напротив, для ферментов с невысокой степенью ассоциации (ТЕР и ЛИЗ) кооперативность при комплексообразовании отсутствует. В результате разрушения присоединенных ассоциатов происходит изменение состава комплексов и активности иммобилизованных ферментов. Активность может изменяться даже после достижения равновесного состава, что свидетельствует о протекании характерных для полиэлектролитных комплексов (ПЭК) процессов обмена.

Установлено, что на кинетику интерполимерных реакций влияет структура привитых цепей. При этом зависимость количества связанного с ионогенной матрицей фермента и его активности от степени ионизации индивидуальна. Наличие сшивок в привитых цепях приводит к уменьшению количества связанных ТР, КОЛ и ПР при одновременном повышении относительной активности иммобилизованных КОЛ и ПР. По-видимому, в результате пространственных затруднений белковые макромолекулы сорбируются на поверхности привитого слоя, что обеспечивает большую доступность активных центров фермента и, следовательно, более высокую относительную активность.

Количество и относительная активность иммобилизованного фермента снижается в результате реализации гидрофобных взаимодействий с активным центром фермента. Этот эффект проявляется при сравнении иммобилизации ТР на привитых сополимерах целлюлозы и полиметакриловой и полиакриловой кислот. Преобладание гидрофобного отталкивания над электростатическим

взаимодействием макромолекул, приводящее к появлению длительного индукционного периода, имеет место и при наличии в привитых цепях ароматического заместителя с сильными кислотными свойствами (привитой сополимер целлюлозы и натриевой соли полистиролсульфокислоты).

Одним из способов влияния на активность и стабильность иммобилизованного фермента является использование полиэлектролитов противоположного типа. При комплексообразовании белков с поликатионами меняется тип функциональных групп макромолекул белка, участвующих в реакции, и электростатическое окружение белковой глобулы. Оптимальными условиями иммобилизации ТР и ТЕР на Цел-прив-ПДАХ являются рН реакционной среды, когда макромолекулы ферментов имеют одноименный заряд с полимером-носителем (для ТР 8,5, ТЕР 4,1). В таких условиях комплексообразование может происходить в результате перезарядки части групп белка вследствие воздействия электростатического поля ионогенной матрицы, а также в результате образования водородных связей.

Значения констант стабилизации к^ (отношение констант инактивации

нативного и иммобилизованного фермента) ферментов, иммобилизованных на привитых сополимерах целлюлозы с ионогенными группами, говорят как о стабилизирующем так и о дестабилизирующем эффекте

иммобилизации (табл. 1, 2). Состав и свойства образуемых соединений, а также степень стабилизации фермента в значительной мере зависят от условий проведения интерполимерной реакции (продолжительности реакции, концентрации фермента в растворе), а также от строения и состава полимерного носителя (характера ионогенных групп, степени ионизации привитых цепей, наличия сшивок и гидрофобных заместителей), которые определяют структуру образуемых комплексов и конформационную устойчивость белковой глобулы.

Для изучения влияния удаленности иммобилизованной белковой глобулы от основной цепи полимера и типа химической связи на активность фермента была исследована иммобилизация ТЕР путем образования шиффовых оснований. При взаимодействии ТЕР с диальдегидцеллюлозой (ДАЦ) в оптимальных условиях количество иммобилизованного белка составляет менее 40% от введенного в реакцию при относительной активности не более 26%. Наряду с сильным снижением активности иммобилизованного террилитина отмечается термостабилизация, которая выражается в появлении стабильной формы фермента и снижении эффективной константы инактивации в 3,5-4,5 раза. Невысокие значения относительной активности иммобилизованного на ДАЦ фермента, вероятно, обусловлены значительным снижением конформационной подвижности макромолекул ТЕР, а также экранированием активного центра.

Сшивка фермента глутаровым альдегидом (ГА) на немодифицированных целлюлозном и поликапроамидном волокнистых материалах (ЦВМ и ПКАМ) позволяет регулировать удаленность белковой глобулы от полимерного носителя и ее конформационную подвижность. Образуемая композиционная система представляет собой псевдо-взаимопроникающую полимерную сетку, фиксированную в структуре носителя, как показали РЖ-спектры, за счет ковалентных

связей. Жесткость связывания иммобилизованного фермента зависит от концентрации ГА и белка в реакционной среде. Кинетические характеристики инактивации ковалентно иммобилизованного на немодифицированных волокнистых матрицах говорят об отсутствии заметной стабилизации террилитина по сравнению с нативным ферментом.

Таблица 1

Влияние )СЛОвий реакции на состав ферментсодержащих материалов и свойства

иммобилизованных ферментов

Фер мен г Полимер-носитель Концентрация белка в растворе, мг/мл Продолжительность реакции, ч Содер жа- ние белка, мг/г Активность, Е/г ^ИН) ч1 ^стаб Ег, кДж/ моль Тот, °с рНопТ

ПР Цел- прив- ПАК 0,6 2,0 0,35 0.06 0,13 1,2 23 65 10.0

1,0 0.5 1,2 0.2 0.31 0.5 37 60 10.0

1,0 3,0 0,60 0,1 0.24 0,7 43 60 10,0

нативная ПР 0.16 - 44 50 10,0

кол Цсл- прив- ПАК 0,25 2,0 0.6 0,06 0.08 2.6 24 1 55 7.6

1.00 2.0 3.0 0,25 0.13 1,5 24 | 55 7,6

2,00 2.0 4.5 0.15 0.30 0.7 32 1 55 7.6

нативный КОЛ 0,21 - 58 60 7,6

ТЕР Цел- прив- ПДАХ 1,0 2,0 1,8 0,20 0.13 1,4 27 40 6,5

3,0 1,0 1,2 0,29 0,19 1 16 40 6.5

2.0 2,1 0.23 0,15 1.2 - 40 6,5

5.0 2.0 2,5 0.25 0,16 1,1 17 40 6.5

нативный ТЕР 0,18 - 42 50 7.5

ТР Цел- прив- ПДАХ 0,2 2 1,6 0,06 - - 28 50 8,0

1,0 0,25 2,7 0,17 0,18 2,6 - - -

2 1,8 0,09 0,17 2,5 23 45 8.0

нативный ТР 0,46 - 33 | 50 7,6

Условия инактивации: рН 7,6,37 °С.

Таблица 2

Влияние условий реакции на состав Цел-прив-ПАК-ТЕР и свойства иммобилизованного террилитина

№ СОЕ, Содер Актив- Содержа- кнн , ч Ег, Топт» рНопт

п. ммоль'г жа- ность ние ста- лабиль ста- кСт кДж/ "С

п. ние мате- бильной ной биль- моль

белка. риала, формы, % формы ной

мг/г Е/г формы

1 0.9 1.0 0,43 18 0,99 4.3-10"1 5,1 99.8 50 8.0

2 0,9 0,6 0,26 43 0.69 3,7-10° 6,0 64.3 50 8.0

3 0,4 1.2 0,54 7 2,30 8.5-10""1 2.6 78,7 50 8.0

4 0,4 0,8 0,35 14 1,73 8.5-10° 2,6 72,9 50 8.0

5 нативный ТЕР - 2,2-10'2 - 42,4 50 7.5

Условия инактивации: рН 7,6,37 °С,

Исследования рН и температурного профилей действия иммобилизованных ферментов показали неизменность характера зависимостей (сохранение колоколообразного вида), что свидетельствует о сохранении конформации белковой глобулы. В то же время наблюдается изменение оптимальной температуры катализа, а также энергии активации гидролиза казеина (Ег), что может быть связано с диффузионным фактором и экранированием активного центра фермента в результате химического связывания с нерастворимым полужесткоцеи-ным полимером. Оптимум рН действия в зависимости от природы фермента или остается без изменений, или меняется в соответствии с электростатической моделью (сдвигается в кислую или щелочную область при иммобилизации на поликатионе или на полианионе соответственно). Однако для ТР, связанного в комплекс с одноименно заряженной матрицей - Цел-прив-ПДАХ, установлен сдвиг рН в щелочную область, что может быть вызвано необходимостью де-протонирования активного центра, который содержит карбоксильную группу.

Сохранение активности иммобилизованных ферментов после обработки материалов антимикробным веществом (хлоргексидина биглюконатом (ХГБГ), гентамицина сульфатом (ГМС), фурагином) или мочевиной свидетельствует о повышении их устойчивости к действию денатурирующих факторов.

В результате микробиологических и медико-биологических испытаний установлены зависимости биологической активности in vitro от содержания антимикробного вещества и некролитического действия in vivo от ферментативной активности материала. В эксперименте на животных обнаружено увеличение сроков заживления гнойных ран при использовании материалов с высокой протеолитической активностью, что может быть вызвано глубоким гидролизом тканей, приводящим к торможению регенерации. На основании полученных данных определены оптимальные количества иммобилизованных биологически активных веществ, необходимые для достижения эффективного терапевтического действия.

Результаты исследования интерполимерных реакций ферментов с нерастворимыми полиэлектролитами позволили обоснованно подойти к созданию растворимых полимерных композиций и показали пути регулирования свойств ферментов, связанных в комплекс.

Совместная иммобилизация ферментов и антимикробных веществ на немодифицированных волокнистых материалах

Композиции ферментов с растворимыми полиэлектролитами представляют интерес с точки зрения больших возможностей регулирования их структуры и свойств путем варьирования состава в широком диапазоне концентраций. Кроме того, стабилизация конформации связанного в комплекс фермента создает благоприятные условия для введения в состав композиции биологически активного вещества другого типа и последующего использования для иммобилизации на немодифицированных волокнистых материалах.

Для получения полимерных систем с ферментами использовали полиэлектролиты, обеспечивающие, с одной стороны, лечебные свойства материа-

лов, а с другой - пролонгированное действие в результате различного рода взаимодействий, реализуемых в полимерной композиции. К их числу относятся производные полисахаридов, стимулирующие процесс регенерации - альгинат натрия (АЛГ), карбоксиметилхитин (КМХТ), карбоксиметилхитозан, сульфат хитозана. Значительный интерес представляют полимерные антимикробные вещества катионного типа - соли полигексаметиленгуанидина (ПГМГ) - гидрохлорид (ПГМГ(Х)) и фосфат (ПГМГ(Ф)) и полиэтиленимин (ПЭИ). Использование амфифильного полимера - поливинилового спирта (ПВС) обусловлено его пленкообразующими свойствами, а также наличием в макромолекуле значительного количества гидроксильных групп, способных участвовать в образовании ковалентных и водородных связей.

Методом нефелометрии установлено, что интерполимерные реакции с ферментами протекают независимо от заряда полиэлектролитов, что подтверждено данными по изменению активности и стабильности ферментов в зависимости от состава полимерных композиций - содержания полимерных компонентов, типа полиэлектролита и антимикробного вещества, от добавок глюко-ната кальция, образующего межмолекулярные сшивки и в значительной степени влияющего на структуру интерполимерных комплексов.

Наибольший интерес с точки зрения стабилизирующего воздействия на фермент представляют антимикробные поликатионы (табл. 3, рис. 1). Комплек-сообразование ферментов с солями ПГМГ стабилизирует фермент в различной степени в зависимости от молекулярной массы (ММ) вешества и состава полимерной композиции как при рН выше ИЭТ (ТЕР), так и ниже (ТР). Введение в полимерную систему третьего полиэлектролита - альгината натрия приводит к наибольшей стабилизации ферментов в растворе вследствие перестройки ПЭК, приводящей к формированию структур, более термодинамически выгодных для фермента.

Таблица 3

Влияние состава полимерной композиции, содержащей террилитин, ПГМГ(Х) _и альгинат натрия, на свойства фермента__

№ п.п. Содержание в полимерной композиции. мг/мл Молекулярная масса ПГМГ(Х), кДа ОА, % Содержание лабильной формы. % к„„ (37 °С). ч"

АЛГ ПГМГ(Х) лабильной стабильной

1 - 1.0 5 61 100 0.042 -

2 - 3,0 105 - - -

3 - 5,0 78 27 0,80 0,54-10"'

4 - 1.0 10 84 20 0.80 0.36-10"'

5 - 3,0 110 - - -

6 - 6.0 93 40 0.92 0.4-10"'

7 - 1,0 15 99 54 0,60 0,2-10"'

8 - 3,0 119 - - -

9 - 5.0 100 26 1,4 0.66-10"'

10 5,0 1,0 185 10 0.3 0.6-10"*

11 нативный ТЕР 100 100 0.69

Содержание ТЕР в полимерной композиции 1,0 мг/мл (по белку).

Уровень достигаемой стабильности зависит от природы фермента. Кинетика инактивации трипсина в полимерных композициях с солями ПГМГ разного состава описывается полимодальными кривыми (рис. 1). Поскольку для растворимых ПЭК характерны непрерывно происходящие процессы обмена цепями, вероятно, процессы перестройки ПЭК доминируют над процессами инактивации. Изменение структуры приводит к изменению активности комплекса. При этом, чем меньше молекулярная масса поликатиона, тем быстрее достигается равновесное состояние комплекса со стабильной активностью, что объясняется большей кинетической подвижностью молекул с короткой цепью.

Рис. 1. Кинетика инактивации на-тивного трипсина и трипсина в полимерных композициях с солью ПГМГ. Нативный трипсин (5). Содержание, мг/мл: трипсин 1,0; соль ПГМГ 1,0. ПГМГ(Х) (1, 3, 4). ПГМГ(Ф) (2). ММ соли ПГМГ, кДа:10(1,2),5(3), 15(4).37°С.

Изменение электростатического окружения белковой глобулы, как правило, приводит к сдвигу рН-оптимума действия фермента. Исследование зависимости активности протеазы С в композиции с солью ПГМГ показало существенное изменение рН-профиля действия фермента, выразившееся в появлении нескольких ярко выраженных максимумов, соотносящихся с оптимумами действия составляющих протеазу С ферментов. Разный характер зависимостей, установленных для композиций с разным типом соли ПГМГ и ММ (рис. 2), свидетельствует о разрушении нативного ферментного комплекса в результате ИПР замещения и образовании комплексов с отличающими структурами.

Рис. 2. рН-Профил.. ферментативной активности протеазы С в полимерных композициях с ПГМГ(Х) (в), ПГМГ(Ф) (г). Содержание, мг/мл: соль ПГМГ 10,0; протеаза С 0,5 (1). 4.0 (2). 7,0 (3). ММ антимикробных вешеств 10 кДа.

Комплексообразование с ПЭИ приводит к существенной дестабилизации террилитина и стабилизации коллитина, стабильность протеазы С и трипсина изменяются в меньшей степени. Наблюдаемая при этом активация трипсина и коллитина находится в соответствии с предположением о разрушении ассоциа-тов, сделанным на основании результатов нефелометрии, а активация протеазы С объясняется возможным разрушением нативного комплекса.

Дополнительное введение в полимерную композицию поливинилового спирта повышает термостабильность ферментов за счет образования системы водородных связей с комплексами.

Кинетически устойчивые полимерные композиции, содержащие фермент, антимикробное вещество, полиэлектролит и модифицирующие добавки, были иммобилизованы на волокнистых материалах с сильно отличающимися характеристиками гидрофильности и удельной поверхности: целлюлозном волокнистом материале и полиэфирной трикотажной атравматичной сетке (ПЭМ). Это обуславливает разницу в смачивании поверхности, установлении контакта с компонентами полимерной системы и в механизме формирования физической и химической структуры композиционной системы.

В результате реализации химических взаимодействий, обусловленных природой компонентов, входящих в состав композиции, формируется композиционное соединение. Электронная микроскопия показала изменение морфологии поверхности целлюлозных волокон, что свидетельствует об объемном модифицировании матрицы, а также образование между элементарными волокнами тонкой полимерной пленки. При использовании полиэфирных материалов происходит в основном поверхностная модификация волокна: вокруг элементарных волокон образуется слой ПВС пленки, причем отсутствие микрорельефа и низкая удельная внутренняя поверхность синтетического волокна не могут обеспечить высокой прочности адгезионной связи, что проявляется в дефектности композиционного слоя.

Модифицирование поверхности полиэфирного волокна приводит к увеличению примерно в 2 раза сорбции паров воды материалами, содержащими биологически активную полимерную композицию, по сравнению с исходным носителем. В случае целлюлозного волокна наблюдается тенденция к некоторому ее снижению, что объясняется незначительным уменьшением внутренней удельной поверхности волокна в результате включения в его структуру наполнителя.

Регулируя толщину и структуру композиционного слоя, можно влиять на фармакокинетические свойства материалов. Удобным инструментом для этого является варьирование состава полимерной системы: содержания в композиции полимерных компонентов, химической природы полиэлектролитов, АМВ, и полимерного носителя, добавок сшивающих агентов. При наличии в составе полимерной композиции только поливинилового спирта, белок полностью де-сорбирустся из материала в течение 10 мин; увеличение концентрации ПВС в 2,5 раза увеличивает продолжительность десорбции в 4 раза, а дополнительное введение в композицию альгината - в 12 раз вследствие увеличения роли диффузионного фактора.

Следует отметить, что в результате иммобилизации ферментсодержащей композиции на волокнистых материалах относительная активность фермента отличается от значений, которые были получены при исследовании растворов полимерных композиций, что свидетельствует о влиянии волокнистой матрицы, а также о формировании комплексов иной структуры. При этом природа волокнистого материала существенно влияет на свойства иммобилизованного фермента и на фармакокинетические свойства модифицированных материалов. Полиэфирные материалы, содержащие иммобилизованный фермент, как правило, проявляют более высокую относительную активность (в 1,5-2 раза) (табл. 4), что объясняется разницей в распределении композиционного слоя, а следовательно, снижением роли диффузионного фактора и большей доступностью активного центра фермента в модельных условиях.

Таблица 4

Влияние состава полимерной композиции и типа волокнистого материала

на свойства трипсина, иммобилизованного совместно с антимикробным веществом

Материал Содержание в композиции , % ОА, % Остаточная активность , % Содержание лабильной формы, % кин лабильной формы, ч'1 Тот* °С Ег, кДж/ моль рНопт

полисахарид глюко-нат кальция

ЦВМ АЛГ - во 35 60 0.34 70 83.4 8.5

кмхт - 68 35 40 0.48 70 82,9 10.0

АЛГ 0,04 60 38 45 0.69 50 72,8 9.5

кмхт 0,04 40 37 40 0.92 - - -

пэм АЛГ - 100 37 50 0.19 37 58,9 8.5

кмхт - 80 38 30 0.46 37 72.4 9.0

АЛГ 0,04 68 40 30 0.20 - - -

кмхт 0,04 58 38 30 0.79 - - -

Содержание полисахарида 0,1%; ТР 0,1%, 1ШС 1,0%, пефлоксацин 0,1%. "Условия инактивации: 37 °С, 24 ч, 0.85% КаС1.

Введение в состав системы глюконата кальция и/или антимикробного вещества, образующих химические связи с макромолекулярными компонентами композиции, по-разному влияет на относительную активность иммобилизованных ферментов. Это может объясняться различной структурой комплексов ферментов с полисахаридами и их расположением в композиционном слое в результате модифицирования низкомолекулярными реагентами, что определяет степень экранирования активного центра фермента.

Исследование кинетики инактивации иммобилизованных ферментов позволило выявить различные механизмы каталитического действия фсрмснтсо-держащих материалов. Раздельный анализ активности модельной среды и инкубированных материалов, содержащих комплекс трипсина с полисахаридом, показал первоначальное увеличение активности модельной среды до величины, которая затем в течение последующих 20 ч практически не изменяется и в зависимости от состава композиционного слоя составляет 3,6-32% от общей активности, проявляемой исходным ферментсодержащим материалом, которая не

выше величины относительной активности иммобилизованного фермента. Это говорит о том, что активность материала реализуется как в результате десорбции фермента в модельную среду, так и при непосредственном контакте с субстратом.

В других ферментсодержащих системах уровень проявляемой активности может быть выше исходной относительной активности. В частности, активность модельной среды при инкубации волокнистых материалов, содержащих ПР, альгинат натрия и АМВ, превышает показатель относительной активности в 2-4 раза в зависимости от состава полимерной композиции. Кинетические исследования показали, что относительная активность иммобилизованной ПР и активность модельной среды, обусловленная действием десорбированной из материала ПР, уменьшается с увеличением содержания альгината и дополнительным введением в композицию глюконата кальция. Это свидетельствует о диффузионных ограничениях, связанных со структурой композиционного слоя. На уровень активности модельной среды, как и кинетику десорбции низкомолекулярных антимикробных веществ влияет не только химическая природа волокнистой матрицы, но и тип антимикробного вещества, что обуславливает возможность его участия в образовании химических связей с компонентами полимерной системы и в формировании структуры композиционного слоя. Использование в композиции пефлоксацина и гентамицина сульфата вместо хлор-гексидина биглюконата позволяет получать материалы с более высоким уровнем проявляемой протеолитической и коллагенолитической активности, количеством выделенного антимикробного вещества и устойчивости к стерилизации. При наличии в составе материала глюконата кальция показатели десорбции антимикробного вещества увеличиваются, что можно объяснить "выталкиванием" низкомолекулярного вещества в результате уменьшения свободного объема в полимерном слое из-за имеющихся сшивок и низкими диффузионными затруднениями.

Использование в полимерной композиции антимикробного вещества по-ликатионного типа должно привести к изменению структуры образуемых комплексов, композиционного слоя и, следовательно, фармакокинетических свойств материалов. Установлено, что иммобилизация на волокнистых материалах комплекса ТР с ПГМГ(Х) оказывает на фермент сильное активирующее и стабилизирующее действие (табл. 5). При этом наблюдается обратная зависимость активности трипсина от ММ ПГМГ(Х) в случае иммобилизации на ПЭМ и отсутствие таковой - на ЦВМ, что свидетельствует об определяющем вкладе в диффузионный фактор составляющей, связанной с волокнистой матрицей. Увеличение активности ТР свыше 100% может объясняться благоприятным для ферментативного катализа пространственным размещением комплексов в композиционном слое. Поскольку волокна имеют отрицательный -потенциал, то, вероятно, при иммобилизации комплексов макромолекулы поликатионного антимикробного вещества ориентированы к поверхности волокна, а макромолекулы белка оказываются обращенными во внешнюю среду, что обеспечивает большую доступность активных центров фермента.

Таблица 5

Влияние состава полимерной композиции и типа волокнистого материала на свойства _ трипсина, иммобилизованного совместно с солью ПГМГ _

Волокнистый носитель Содержание в полимерной композиции. % ОА. % Остаточная активность через 24 часа (37 °С), % Ег, кДж/моль

ТР ПГМГ(Ф) ПГМГ(Х) ММ, кДа

ЦВМ 0,1 0,1 - - 95 68 45

ПЭМ 0.1 - - 117 55 39

ЦВМ - 5 0,1 155 99 -

ПЭМ - 180 I 59 -

ЦВМ - 10 0.1 144 82 34

ПЭМ - 133 55 39

ЦВМ - 10 1,0 77 61 -

ПЭМ - 101 90 -

ЦВМ - 15 0,1 143 . 76 -

ПЭМ - 95 55 -

Химическая природа фермента влияет как на относительную активность иммобилизованного фермента, так и на кинетику инактивации. При иммобилизации ПР в составе комплекса с ПГМГ(Х) относительная активность составляет 35-77%, однако в большинстве случаев при инкубации в модельной среде происходит более полное проявление активности фермента, и суммарная активность модельной среды и материала после инкубации превышает исходную (табл. 6).

Таблица 6

Влияние состава полимерной композиции и типа волокнистого материала на свойства протеазы С, иммобилизованной совместно с ПГМГ(Х)

Материал Содержание в полимерной композиции, % ОА, % Остаточная активность",

% от исходной % от натив-ной (сумм.)

ПР ПГМГ(Х) ПВС материала модельной среды

ЦВМ 0,22 2,6 0,8 35 52 183 82

ПЭМ 41 44 151 80

ЦВМ 0,13 2,6 0,8 60 27 65 55

ПЭМ 65 33 1 94 83

ЦВМ 0,13 1,4 0,8 56 41 150 107

ПЭМ 68 44 105 101

ЦВМ 0,2 55 30 82 62

ПЭМ 66 24 105 85

ЦВМ 0,18 2,0 0 70 11 24 25

ПЭМ 75 5 18 17

ЦВМ 0,5 66 43 20 42

ПЭМ 77 23 77 77

ЦВМ 1,0 53 31 118 79

ПЭМ 73 22 70 67

Условия инкубации: 37 °С, физраешир, 24 ч, модуль 30.

Особенность кинетики десорбции полимерного антимикробного вещества состоит в зависимости показателей процесса от степени ионизации соли ПГМГ и ее молекулярной массы при сохранении установленных закономерностей влияния химической природы волокнистой матрицы. Установлено, что полностью десорбируется ПГМГ(Ф), неионизованные макромолекулы которого имеют компактную конформацию, вследствие чего снижается электростатическое взаимодействие с белковыми макромолекулами и влияние диффузионного фактора.

Значительное снижение константы инактивации ферментов, за исключением ТЕР, происходит в результате иммобилизации на волокнистых материалах в составе комплекса с ПЭИ. Эффект стабилизации уменьшается в ряду кол-литин > трипсин > протеаза С > террилитин. Наблюдаемая при этом активация иммобилизованного трипсина объясняется разрушением ассоциатов фермента, а протеазы С - изменением рН-профиля действия: оптимальное значение рН катализа иммобилизованным ферментом составляет 7,0 (против 10,0 для натив-ного).

Комплексы ферментов с поликатионными антимикробными веществами представляют интерес для ковалентной иммобилизации на немодифицирован-ных волокнистых материалах с использованием глутарового альдегида, который, как показали УФ- и ИК-исследования, может взаимодействовать со всеми компонентами системы, включая полимерный носитель. Ковалентная иммобилизация комплекса ПР с поликатионом на волокнистых носителях приводит к повышению относительной активности и стабильности фермента, причем при использовании ПЭИ достигаются более высокие показатели, особенно по остаточной активности и при иммобилизации на поликапроамидном материале (табл. 7).

Таблица 7

Влияние состава полимерной композиции и типа волокнистого материала на свойства протеазы С. ковалентно иммобилизованной в комплексе с поликатионным АМВ

"1

№ п.п.

Материал

АМВ

Концентрация глутарового альдегида в растворе, %_

ОА,

%

Остаточная активность, %

ЦВМ

24

21

Ц-ПЭМ

0.1

14

24

ПКАМ

53

34

ЦВМ

49

21

Ц-ПЭМ

ПГМГ(Х)

0,1

47

19

ПКАМ

34

43

ЦВМ

36

53

Ц-ПЭМ

ПЭИ

0.1

36

57

ПКАМ

47

88

10

ЦВМ

34

27

11

Ц-ПЭМ

ПГМГ(Х)

1,0

33

39

12

ПКАМ

66

16

13

ЦВМ

25

52

14

Ц-ПЭМ

ПЭИ

1,0

31

31

15

ПКАМ

38

100

Концентрация в растворе протеазы С 0,1%; АМВ 1,0%.

Характеристики остаточной активности материалов хорошо коррелируют с данными по кинетике десорбции антимикробных веществ: наименьшее количество (0% ПЭИ и 31% ПГМГ(Х)) десорбируется из поликапроамидных материалов, причем максимально десорбируемое количество ПЭИ примерно в 20-50 раз меньше, чем ПГМГ(Х). Существенная разница кинетических характеристик десорбций антимикробных веществ объясняется различным типом химической связи между полимерной матрицей и композиционным составом. На ПКАМ полимерные антимикробные вещества прочно фиксируются азометиновой связью, более устойчивой по сравнению с полуацетальной, которая образуется при иммобилизации на ЦВМ и Ц-ПЭМ. Кроме того, поликапроамидный носитель имеет более высокое значение ¡^-потенциала, увеличивающее прочность адгезионной связи с поликатионами.

Существенные отличия фармакокинетичсских свойств материалов объясняются разной структурой композиционного соединения. Методом электронной микроскопии установлено, что независимо от типа волокнистой матрицы композиция, содержащая в своем составе ПЭИ, образует на поверхности волокна покрытие. Поверхность волокон после обработки композицией, содержащей ПГМГ(Х), не отличается от исходной, таким образом, можно говорить об иммобилизации в объеме волокна.

Наблюдаемый факт объясняется разницей скоростей химических реакций в полимерных системах, отличающихся типом полимерного антимикробного вещества, имеющих различные рН. В системе с ПЭИ в щелочной среде происходит прогрессирующее увеличение молекулярной массы ПЭИ, связанного в комплекс с протеазой С, и образование прочной сетки зацеплений протяженного адгезионного слоя с носителем за счет химических и электростатических связей. В результате этого становится невозможной диффузия компонентов в структуру волокна и на его поверхности образуется непрерывная фаза в виде сплошного покрытия. Иначе протекают процессы в системах с ПГМГ(Х): образование сшитого антимикробного полимера происходит в основном в структуре волокна.

Иммобилизация ферментов на волокнистых материалах в комплексе с поликатионом и ПВС приводит к изменению рН-профиля ферментативной активности, в некоторых случаях зависящему от химической природы волокнистой матрицы (рис. 3). Так, рН-оптимум трипсина, иммобилизованного совместно с солью ПГМГ на целлюлозном волокнистом материале не изменяется по сравнению с нативным ферментом, но значительно расширяется "колокол", что говорит о существенных диффузионных затруднениях и стабилизации конфор-мации, а на полиэфирном материале - сдвигается в кислую область на 0,6 ед. (рис. 3).

Оптимальное значение рН для иммобилизованной совместно с ПГМГ(Х) протеазы С независимо от типа материала сдвигается с 10 до 8 и может быть обусловлено разрушением комплекса нативного фермента. После иммобилизации в комплексе с ПЭИ рН-оптимум действия ПР сдвигается с 10 до 7, ТЕР - с 7,6 до 7 независимо от типа волокнистой матрицы, а ТР и КОЛ - на 0,5 ед. в кислую область в случае целлюлозного и на 1 ед. - полиэфирного материала.

Рис. 3. рН-Профиль действия трипсина, иммобилизованного на волокнистых материалах в комплексе с солью ПГМГ. ПГМГ(Х) (а), ПГМГ(Ф) (б). ЦВМ (1), ПЭМ (2). Композиционный состав: ПВС; ПР; соль ПГМГ.

В результате ковалентной иммобилизация комплекса ПР с поликатионом влияние природы волокнистой матрицы на рН-оптимум действия менее существенно и определяется типом антимикробного вещества: с ПГМГ(Х) оптимальное значение рН составляет 7, 8-8,0, а с ПЭИ - 6,5 и 8,0, что свидетельствует о разных структурах комплексов и прочности их связи с полимерной матрицей (рис. 4).

0 -р-1-1-1-1

5 6 7 8 9 10

рН рн

Рис.4. рН-Профиль активности протеазы С, иммобилизованной совместно с ПГМГ(Х) (а) или ПЭИ (б) на волокнистых материалах разного типа сшивкой глутаровым альдегидом. ЦВМ (4, 7), Ц-ПЭМ (5, 8), ПКАМ (6,9). Условия получения и свойства см. табл. 7 № п.п. 4-9.

Проведенные исследования показали возможность получения кинетически устойчивых полимерных композиций, что позволяет использовать их для последующей иммобилизации на волокнистых носителях с целью получения полимерных материалов с различным уровнем биологической активности.

5 7 9 11

Влияние добавок биополимеров и модифицирующих веществ на надмолекулярную структуру и фармакокинетические свойства биологически активных поливинилспиртовых пленок

В настоящее время пленочные материалы рассматриваются как наиболее перспективная альтернатива перевязочным средствам на текстильной основе.

Среди пленкообразующих полимеров огромные преимущества имеет ПВС -нетоксичный, биодеградируемый синтетический полимер. Возможное участие макромолекул ПВС в образовании как химических, так и нехимических связей при введении в раствор ПВС добавок различного типа (белков, полимерных антимикробных веществ и др.) позволит регулировать структуру формовочного раствора и свойства получаемой из него пленки.

Полимерные системы, содержащие ПВС, белок, ПГМГ(Х) и альгинат натрия, в некоторых случаях визуально однофазны (растворы прозрачны). Однако, поскольку исследуемые полимеры не являются взаимно растворимыми, то они рассматриваются как микрогетерогенные. Формовочные растворы, содержащие ПГМГ(Ф), представляют собой двухфазные кинетически устойчивые системы.

Реологические исследования показали, что структурно-механические свойства (начальная вязкость, энергия активации Еа вязкого течения) формовочных композиций зависят от типа и количества добавок. Полимерные системы с ПГМГ(Ф) имеют более низкую вязкость и энергию активации вязкого течения, чем с ПГМГ(Х). Это объясняется информационными отличиями макромолекул антимикробных веществ с разной степенью ионизации, влияющими на образование межфазных адсорбционных слоев. Макромолекулы ПГМГ(Ф), в отличие от ПГМГ(Х), участвуют в образовании лишь единичных контактов с сегментами макромолекул ПВС, при этом их можно рассматривать как вкрапления, находящиеся в дисперсионной среде.

Разница между реологическими характеристиками нивелируется добавлением в систему альгината, приводящего к перестройке ферментсодержащих комплексов, а также структуры формовочной композиции в результате возникновения иной системы водородных связей между макромолекулярными компонентами (ПВС, ферментом, солью ПГМГ, полисахаридом), уменьшения свободного объема и ограничения сегментальной подвижности.

Введение тетрабората натрия увеличивает начальную вязкость формовочных композиций вследствие образования хелатных соединений с макромолекулами ПВС, а значит, уменьшения сегментальной подвижности и свободного объема. В формовочных растворах, содержащих альгинат, образование сшивок с помощью тетрабората возможно как между одноименными макромолекулами (ПВС или альгината), так и между макромолекулами ПВС и альгината. В первом случае это приводит к усилению фазового разделения, а во втором - к увеличению сегментальной растворимости полимерных компонентов.

Вид кривых течения зависит от характера соли ПГМГ, входящей в формовочную композицию. Для систем с ПГМГ(Ф) область неньютоновского течения достигается при более низких напряжениях сдвига, чем с ПГМГ(Х), что свидетельствует о низкой степени структурирования полимерной системы.

Установлена стабильность формовочных композиций по вязкости и активности, что является необходимым условием для их последующей переработки в пленочный материал.

При формовании пленок методом полива на твердую подложку в результате испарения растворителя происходит формирование структуры в соответ-

ствии с межмолекулярными взаимодействиями и термодинамической совместимостью полимерных компонентов, которые определяются составом полимерной смеси. С помощью электронной микроскопии установлено, что пленки разного состава представляют собой гетерогенные системы с существенно различающимися поперечными срезами и поверхностью. Пленка, содержащая протеазу С и ПГМГ(Х), приобретает слоистую структуру с большими полостями с распределением частиц второй фазы по всему сечению с преобладанием в верхней части пленки. Такая структура подтверждает предположение об образовании макромолекулами ПГМГ(Х) протяженных граничных слоев в формовочном растворе.

Поперечный срез пленок с ПГМГ(Ф) характеризуется четким разделением на 2 слоя. Вследствие меньшей термодинамической совместимости ПГМГ(Ф) и ПВС и благодаря поверхностно-активным свойствам полимерных добавок и невысокой вязкости раствора происходит флотация частиц второй фазы и в пленке образуются 2 слоя: нижний - плотный, верхний - с полостями и частицами.

Наличие в составе формовочного раствора наряду с протеазой С и ПГМГ(Х) добавок альгината и тетрабората натрия приводит к формированию в пленке структуры с большим количеством смежных полостей и частичным сохранением горизонтальных слоев. По-видимому, граничные слои, образуемые макромолекулами ПГМГ(Х) в растворе полимеров, даже после введения модифицирующих веществ в некоторой степени сохраняются и препятствуют сшивке макромолекул, находящихся в соседних фазовых слоях. Вследствие этого сшивки происходят в основном между макромолекулами полисахарида, в результате чего в структуре пленки сохраняется многослойность.

В пленке с ПГМГ(Ф) при прочих равных условиях происходит формирование двух слоев без четкой границы раздела. Слои отличаются в основном распределением частиц, которые расположены преимущественно в верхнем слое с более рыхлой структурой, при наличии полостей (размером 0,2-1,5 мкм), выходящих на поверхность. Формирование такой структуры, по-видимому, становится возможным в результате образования сшивок между макромолекулами ПВС и альгината вследствие отсутствия граничного слоя, что приводит к увеличению сегментальной растворимости и формированию протяженной фазы.

Исследование влияния добавок полимерных компонентов на надмолекулярную структуру полимерной матрицы методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) показало изменение термодинамических характеристик ПВС пленок. Температура стеклования ПВС снижается незначительно (на 2 °С) при введении в состав пленки ПГМГ(Х) и существенно (на 19 °С) -ПГМГ(Ф). Введение наряду с ПГМГ(Ф) полужесткоцепного полимера (альги-ната) и сшивающего реагента (тетрабората натрия) повышает температуру стеклования на 11 °С. Добавки в формовочную композицию тетрабората натрия, образующего межмолекулярные сшивки хелатного типа, упорядочивают структуру аморфных областей, что отражается на повышении температуры стеклования ПВС пленок, особенно содержащей ПГМГ(Х), до 106 °С.

Температура плавления ПВС пленок, содержащих биологически активные добавки, не изменяется. В то же время энтальпия плавления наполненных ПВС пленок снижается по сравнению с исходным ПВС, что позволяет говорить о некоторой дефектности кристаллической структуры. В наименьшей степени по сравнению с исходной матрицей уменьшается теплота плавления пленки, содержащей протеазу С с ПГМГ(Ф), что подтверждает предположение о преимущественной локализации частиц комплекса в аморфных областях.

Таким образом, данные электронной микроскопии и ДСК удовлетворительно коррелируют с результатами реологических исследований формовочных растворов. Это позволяет говорить о пластифицирующем действии на ПВС биологически активных добавок и сформулировать особенности надмолекулярной структуры пленок разного состава. Пленки, содержащие поликомплекс протеазы С и ПГМГ(Х), имеют относительно однородную структуру с распределением частиц как в аморфных, так и в кристаллических областях, что увеличивает их дефектность по сравнению с исходной полимерной матрицей. Пленки, в состав которых входит комплекс с ПГМГ(Ф), характеризуются наибольшей нерегулярностью структуры: в них в значительной степени сохраняются кристаллические области, а аморфные области заполняются полимерными добавками.

Надмолекулярная структура полимера определяет такие свойства пленок как степень набухания и паропроницаемость, которые важны с практической точки зрения, поскольку адсорбция воды является необходимым условием проявления наполненными пленками биологической активности, а ее транспорт на поверхность — поддержания оптимальной влажности раны. Введение в состав ПВС пленки ПГМГ(Х) и увеличение его молекулярной массы приводит к повышению степени набухания вследствие образования дефектной структуры с большим количеством внутренних пор. Степень набухания пленок, содержащих ПГМГ(Ф), невысока, поскольку для них характерна более плотная структура. Полученные характеристики адсорбирующей способности пленок разного состава находятся в соответствии с типом структуры, которая была установлена методами электронной микроскопии и ДСК.

В условиях недостатка воды (влагопоглощение 22±2%) на всех кинетических кривых паропропускания можно выделить два участка: первый характеризуется минимальной величиной массы пропущенной воды (W) и свидетельствует о насыщении пленки водой, а второй - резким или монотонным увеличением W.

Установлен колебательный характер изменения скорости паропропуска-ния, который свидетельствует о наличии внутренних напряжений, возникающих в процессе формирования структуры пленок различного состава, уровень которых зависит от состава и структуры формовочной композиции и в условиях ограниченного влагопоглощения выражается в нерегулярном процессе открытия и коллапса пор. Это позволяет характеризовать ПВС пленки, содержащие фермент и антимикробное вещество, как "дышащие". Кинетические кривые удовлетворительно интерпретируются в соответствии со сформулированными представлениями о надмолекулярной структуре

биологически активных ПВС пленок разного состава.

Была изучена зависимость фармакокинетических свойств пленок от состава полимерных композиций, который определяет их структурные отличия. В модельных условиях инактивации при невысоком градиенте концентраций (модуль 10-30) важную роль играет диффузионный фактор. При наличии в полимерной матрице наряду с ферментом низкомолекулярного антимикробного вещества уровень проявляемой активности довольно высок (рис. 5а). Однако при увеличении в составе пленки содержания фермента в 3 раза или дополнительном введении альгината натрия (рис. 5в) структурирование полимерной системы возрастает и диффузионные ограничения увеличиваются. В то же время остаточная активность через 24 ч примерно одинакова.

Установлено, что инактивация иммобилизованной протеазы С в ряде случаев является кажущейся, т.к. при малом гидромодуле десорбция макромолекул затруднена, в пленке остается "скрытая" активность. В исследуемых системах только при большом гидромодуле достигается релаксация, которая приводит к более полному проявлению активности иммобилизованного фермента.

Степень десорбции из пленок антимикробных веществ зависит от типа вещества и условий десорбции. Так, из пленок, содержащих протеазу С, альги-нат и антимикробное вещество, десорбируется примерно 45% хлоргексидина биглюконата или 70% пефлоксацина. Разница в показателях объясняется химическим сродством антимикробных веществ к компонентам системы. Поэтому включение в состав пленок высокомолекулярного антимикробного вещества, а в некоторых случаях и противоиона приводит к изменению межмолекулярных взаимодействий и формированию различных надмолекулярных структур, о чем свидетельствуют изменения фармакокинетических свойств биологически активных пленок (табл. 8).

Таблица 8

Влияние состава формовочных композиций на свойства протеазы С, иммобилизованной _совместно с солью ПГМГ в структуре ПВС пленок _

№ п.п. Содержание в формовочной композиции", % ОА, % Остаточная активность , % от введенной

протеаза С АМВ АЛГ

1 0,07 ПГМГ(Х) ММ 15 кДа 0,1 - - 91 • 28

2 0,07 0,7 - 96 15

л .5 0,1 0,15 0,7 2.0 120 22

4 0,1 ПГМГ(Х) ММ 10 кДа 0.15 - - 98 80

5 0.1 0,7 - 69 40

6 0,1 0.7 2,0 87 22

7 0,1 ПГМГ(Ф) - - 36 25

8 0,1 0.7 0,5 31 59

9 0,1 0.7 1.0 51 87

Содержание в формовочной композиции ПВС 9%, этанол10%. "Условия инактивации: 0,9% КаС1, 37 °С, 24 ч, гидромод> ль 10.

Использование в составе пленки ПГМГ(Х) позволяет сохранить высокий уровень относительной активности иммобилизованного фермента, однако остаточная активность меньше, чем у нативной протеазы С. Причиной кажущейся инактивации фермента может быть прочность его иммобилизации в структуре пленки и низкая доступность для субстрата, поскольку, как было показано при изучении структуры пленки, частицы комплекса распределены во всем объеме пленочного материала и их диффузия из пленки при малом гидромодуле затруднена. Наиболее полное проявление активности наблюдается для пленок с ПГМГ(Ф), для которых характерны структуры с локализацией частиц комплекса в наружном слое, что снижает роль диффузионного фактора.

Установлен мультимодальный характер кинетических кривых инактивации пленок, дополнительно содержащих тетраборат натрия и/или альгинат натрия, что хорошо коррелирует с кинетическими кривыми паропропускания.

Кинетика десорбции полимерных антимикробных веществ из пленок лимитируется диффузионным фактором, уровень которого зависит от структуры пленок и молекулярной массы соли ПГМГ. ПГМГ(Ф) десорбируется из пленок значительно быстрее и в большем количестве, чем ПГМГ(Х): практически полностью (90%) в течение одного цикла десорбции благодаря локализации частиц комплекса в поверхностном слое пленки. Повышение температуры с 15 до 37 °С увеличивает скорость десорбции ПГМГ(Х) примерно на порядок при прочих равных условиях, а уменьшение ММ с 15 до 10 кДа - примерно в 3 раза.

Тетраборат натрия в отсутствие альгината "выталкивает" антимикробные вещества из пленок: при ММ 15 кДа количество десорбированного ПГМГ(Х) увеличивается незначительно (на 10-15%), а при ММ 10 кДа скорость десорбции ПГМГ(Х) увеличивается в 2-2,5 раза, обеспечивая полное выделение полимера в течение 2-3 циклов. При этом полная десорбция ПГМГ(Ф) происходит за один цикл.

Поскольку введение альгината натрия в формовочную композицию способствует образованию структур с более равномерным распределением частиц,

то это затрудняет десорбцию антимикробного вещества. Степень влияния зависит от типа соли ПГМГ и проявляется в меньшей степени при наличии в составе пленки ПГМГ(Ф).

Важная сторона оценки биологических свойств пленок, содержащих иммобилизованный фермент, — определение условий их эффективного действия, в частности оптимума рН и энергии активации ферментативного катализа. Существенные изменения рН и температурного профиля действия происходили лишь в результате соиммобилизации протеазы С и соли ПГМГ, что является следствием разрушения нативного ферментного комплекса в результате ИПР замещения. Протеаза С, иммобилизованная в структуре пленки совместно с ПГМГ(Х), проявляет максимум активности при рН 8,0, а с ПГМГ(Ф) - в интервале рН 7-8,5 (рис. 6). Характер кривых существенно зависит от типа соли ПГМГ. Это свидетельствует как о разной структуре образуемых ПЭК, так и о важной роли структуры пленок, которая обуславливает выделение в модельную среду биологически активных компонентов. Отличие полученных рН-профилей от установленных для водных растворов композиций может быть результатом дифференцирования комплексов разного состава по толщине пленки и их раздельной диффузией в модельную среду.

рН рН

Рис. 6. рН-Профиль ферментативной активности протеазы С, иммобилизованной совместно с солью ПГМГ в ПВС пленках различного состава. Содержание в формовочной композиции, % : протеаза С 0,1; соль ПГМГ 0,1; ПГМГ(Х) (а) ММ 15 кДа; ПГМГ(Ф) (б):_

а б

№ кривой АЛГ тетраборат натрия № кривой АЛГ тетраборат натрия

1 1 0 1 1 -

2 0 0.3 10° 2 1 0,3-10"'

3 1 0,3-10° 3 0 -

4 0 0.3 •10-'

рН-Профиль активности террилитина, иммобилизованного совместно с ПГМГ(Х) в структуре пленки, не претерпевает существенных изменений, за исключением состава, содержащего альгинат. В этом случае расширяется интер-

вал проявления высокого уровня активности, что может быть связано с информационными изменениями белковой глобулы, связанной в комплекс.

В результате совместной иммобилизации с поликатионным антимикробным веществом в структуре пленки существенно изменяются физико-химические свойства протеазы С, что обусловлено разрушением ее нативного комплекса (табл. 9). Увеличение эффективной энергии активации гидролиза для иммобилизованного террилитина, подтверждает лимитирующую роль диффузионного фактора в ферментативном катализе.

Таблица 9

Физико-химические свойства протеазы С и террилитина. иммобилизованных в структуре

ЛВС пленки совместно с солью ПГМГ

Содержание в формовочной композиции", % рН оптимум Температурный оптимум, °С Ег казеина, кДж/моль

фермент АМВ альгинат Ка2В407, •ю-3

протеаза С 0,1 ПГМГ(Х) 0,1 ММ 15 кДа 1.0 - 8,0 50 27

- 0.3 8,0 50 27

1,0 0.3 8,0 50 27

ПГМГ(Ф) 0,1 1.0 - 8,5 60 15

- 1.3 7.0-8.5 70 23

1.0 0.7 8.0 70 26

нативная протеаза С 10.3 52 44

террилитин 0,5 (0,1 по белку) - - - 7.6 37 52

ПГМГ(Х) 0,5 ММ 5 кДа - - 7,6 37 45

0,5 - 7,6 37 52

ПГМГ(Х) 0,5 ММ 15 кДа - - 7,6 37 70

0,5 - 7,6 40 61

нативный террилитин 7.6 50 42

'Содержание в формовочной композиции ПВС 9-10%, этанол-10%.

Исследование воздействия ионизирующего облучения на биологическую активность полимерных материалов

С целью выяснения возможности радиационной стерилизации материалов, содержащих фермент и антимикробное вещество, было исследовано влияние дозы ионизирующего облучения на биологическую активность этих материалов, а также кинетика радиационно-химических процессов.

На основании данных о зависимости содержания свободных радикалов в нативном террилитине от дозы облучения установлено преобладание в облученном белке процессов рекомбинации образующихся радикалов, что приводит к резкому снижению активности нативного террилитина. Инактивация террилитина с увеличением дозы облучения до 100 кГр происходит по экспоненциальному закону А=100еОЛ21> (Б - доза облучения), в то время как активность иммобилизованного террилитина снижается на 0-10% в зависимости от способа иммобилизации.

Форма сигналов ЭПР ферментсодержащих целлюлозных материалов идентична форме сигналов полимеров-носителей и не изменяется при увеличе-

нии дозы облучения, меняется лишь их интенсивность. Анализ зависимости интенсивности сигналов ЭПР от дозы облучения позволяет предположить, что иммобилизация фермента предотвращает радиационно-химическую деструкцию белка за счет миграции свободной валентности на полимер-носитель по эстафетно-диффузионному механизму. При этом общее количество свободных радикалов полимерного материала может уменьшаться за счет рекомбинации мигрировавшего с белковой молекулы радикального центра с соседним макрорадикалом полимера-носителя (в случае ДАЦ и Цел-прив-ПАК, содержащих террилитин), но может также и увеличиваться при невысоких скоростях миграции и рекомбинации (в случае целлюлозы, содержащей сшитый глутаровым альдегидом террилитин).

Установлено, что кинетика гибели радикалов как полимеров-носителей, так и ферментсодержащих целлюлозных материалов полихроматична. Гибель радикалов террилитина и трипсина, как и других белков, описывается уравнением реакции первого порядка, константа скорости гибели радикалов в натив-ном террилитине равна 1,4-Ю"3 ч"1 (20 °С), в трипсине -1,3-10"4 ч'1 при 4 °С и увеличивается до

Исследование активности нативных и иммобилизованных ферментов, подвергнутых облучению стерилизующей дозой - 25 кГр, показало ее зависимость от природы белка, способа иммобилизации и типа полимерного носителя.

Полное сохранение активности террилитина, ковалентно иммобилизованного на поликапроамидном материале, объясняется быстрыми свободнора-дикальными превращениями в данном объекте, не приводящими к изменениям белковой молекулы, а наибольшее снижение активности на целлюлозном материале - напротив, возможной модификацией иммобилизованного фермента вследствие низких скоростей миграции свободной валентности на полимер-носитель.

Установлено, что повышение температуры хранения облученных фер-ментсодержащих материалов с 4 до 20 °С, приводящее к ускорению радиацион-но-химических процессов, способствует меньшей инактивации иммобилизованных ферментов.

Высокую стабильность при хранении после облучения сохраняют иммобилизованные совместно с антимикробным веществом в структуре ПВС пленки террилитин и протеаза С. Следует отметить наличие колебательного характера изменения активности протеазы С, иммобилизованной совместно с полимерным антимикробным веществом. Существенное повышение активности наблюдается, если в состав пленки входит соль ПГМГ с молекулярной массой 10 кДа и тетраборат натрия.

Методом ДСК показано изменение термодинамических характеристик стерильной ПВС пленки, содержащей протеазу С и ПГМГ(Х), что свидетельствует о структурных изменениях полимерной матрицы, а также незавершенности радиационно-химических и релаксационных процессов в надмолекулярной структуре полимерных пленок.

Проведенные исследования показали, что фермент, иммобилизованный в структуре полимерного материала, благодаря участию макромолекул полимер-

ного носителя в радиационно-химических процессах оказывается защищенным от инактивирующего воздействия ионизирующего излучения. Это делает возможным использовать для стерилизации ферментов, иммобилизованных совме-стио с антимикробным веществом в структуре волокнистых и пленочных материалов, ионизирующее облучение в необходимой дозе - 20±5 кГр.

ВЫВОДЫ

С целью разработки принципов получения волокнистых и пленочных раневых покрытий с ферментативным и антимикробным действием проведены систематические исследования влияния взаимодействия полимерных компонентов в системах, содержащих биологически активные вещества, на структуру и фармакокинетические свойства полимерных материалов.

1. В результате исследования интерполимерных реакций ферментов с нерастворимыми полиэлектролитами (модифицированными волокнистыми материалами на основе привитых сополимеров целлюлозы, содержащих ионизующиеся группы анионного или катионного типа), и растворимыми полиэлектролитами анионного, катионного и амфотерного типов установлена зависимость состава и свойств комплексов от типа полииона, степени ионизации и количества ионогенных групп полиэлектролита, присутствия в молекуле полиэлектролита гидрофобных заместителей или межмолекулярных сшивок. Установлены индивидуальные зависимости свойств ферментов от перечисленных факторов.

2. Установлено влияние состава многокомпонентных полимерных композиций, используемых для совместной иммобилизации на немодифицированных волокнистых материалах фермента и антимикробного вещества, и химической природы волокнистого носителя на структуру композиционного материала и кинетические характеристики инактивации и десорбции антимикробных веществ. Показано, что эта структура зависит от типа химической связи между ферментсодержащим комплексом и полимерной матрицей, от содержания полимерных компонентов, типа ионогенных групп и степени ионизации полиэлектролита, химической природы антимикробного вещества, наличия сшивающих реагентов, молекулярной массы антимикробного вещества.

3. На основании результатов исследования реологических свойств полимерных композиций на основе поливинилового спирта, содержащих фермент, антимикробное вещество поликатионного типа и другие добавки, а также изучения термодинамических характеристик полимерных пленок сформулированы представления о формировании межфазных адсорбционных слоев и структуро-образовании в многокомпонентной полимерной системе, содержащей несколько полиэлектролитов. Показано определяющее влияние степени ионизации антимикробного поликатиона на формирование структуры полимерной пленки и возможность ее дополнительного регулирования путем введения полимерного противоиона и сшивающего реагента. Установлена взаимосвязь между надмолекулярной структурой биологически активного пленочного материала и кинетическими характеристиками инактивации фермента и десорбции антимикробного вещества.

4. Определено влияние иммобилизации ферментов путем комплексообра-зования с полиэлектролитами анионного и катионного типа и ковалентного присоединения индивидуально или в составе комплекса на температурную зависимость и рН-профиль действия, свидетельствующее о сохранении конфор-мации белковой глобулы и каталитического действия в физиологической среде. Установлено кардинальное изменение рН-профиля действия полиферментного комплекса протеачы С в результате комплексообразования с поликатионными антимикробными веществами.

5. Показана возможность стерилизации полимерных покрытий с ферментативным и антимикробным действием ионизирующим облучением. На основании результатов исследования зависимости активности ферментов, иммобилизованных в структуре волокнистых и пленочных материалов, от дозы ионизирующего облучения и кинетики гибели макрорадикалов предложен механизм радиопротекторного действия полимерной матрицы, заключающийся в эстафетном механизме передачи свободного радикала с облученной макромолекулы иммобилизованного белка на полимер-носитель. Показано влияние способа иммобилизации ферментов на их стабильность к стерилизации и последующему хранению.

7. В ходе микробиологических и медико-биологических испытаний на животных раневых покрытий волокнистого и пленочного типа с ферментативным и антимикробным действием установлена зависимость специфической активности материалов от содержания биологически активных веществ и показана эффективность материалов при лечении гнойных ран.

8. На основании результатов исследований разработаны принципы создания полимерных раневых покрытий с прогнозируемым уровнем антимикробной и ферментативной активности активности путем регулирования структуры композиционных материалов волокнистого типа и наполненных полимерных пленок.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Власов Л.Г., Вирник АД. Непрерывные способы иммобилизации террилитина на целлюлозных волокнистых материалах / Биотехнология, 1985, №6, с.98-102.

2. А.с. №1184296, Вирник А.Д., Пененжик М.А.. Скокова И.Ф.. Яглом Д.Л., Юданова Т.Н., Иванова Н.В., Писманник К.Д., Гомозова Р.П., Пустовойт Н.Н. Способ антимикробной отделю! целлюлозосодержащего текстильного материала, приор. 29.12.1983, опубл. 08.06.85.

3. А.с. №1320931, Вирник АД., Власов Л.Г., Гостищев В.К., Раззаков О.Н., Рыльцев В.В., Самойлова Т.Н., Скокова И.Ф., Толстых П.И., Юданова Т.Н. Способ получения материала для покрытия ран, приор. 26.07.1985 (не п>бл.).

4. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Власов Л.Г., Вирник АД. Получение модифицированного целлюлозного волокнистого материала, содержащего иммобилизованный протеолитический фермент террилитин / Известия вузов. Технология текстильной пром-сти, 1986, №3, с.75-77.

5. Л.с. №1376641, Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н. Способ получения ферментсодержащего целлюлозного волокнистого материала, приор. 17.07.1986, опубл. 22.10.87.

6. Толстых П.И., Гостищев В.К., Ханин А.Г., Юданова Т.Н. и др. Экспериментальное обоснование применения террилитина, иммобилизованного на волокнистых целлюлозных материалах, для лечения гнойных ран в клинике / Ж>рнал эксп. и клин, медицины АН Армянской ССР, 1987, т.27, №4, с.340-346.

7. Юданова Т.П., Скокова И.Ф., Довбий Е.В., Калашник А.Т. Исследование стабильности террилитина, химически связанного с полимером, к действию у-облучения / Известия вузов. Химия и хим. технология, 1987, т.ЗО, №1, с.117-118.

8. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Довбий Е.В. и др. Действие гамма-облучения на террилитин, иммобилизованный на целлюлозных волокнистых материалах / Антибиотики и химиотерапия, 1988, т.ЗЗ, №8, с.578-581.

9. Юданова Т.Н., Кукушкина Н.Н., Скокова И.Ф. и др. Получение альб) минсодер-жашего целлюлозного волокнистого материала / Известия вузов. Химия и хим. технология, 1990, т.ЗЗ, №1, с.107-110.

10. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Довбий Е.В. и др. Стабильность ферментсодержа-щих волокнистых материалов при хранении после гамма-стерилизации / Известия вузов. Химия и хим. технология, 1991. т.34, №7, с. 100-103.

11. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Вирник А.Д. Исследование свойств ферментсодер-жащих волокнистых материалов медицинского назначения / Известия вузов. Химия и хим. технология, 1992, т.35, №9, с.95-99.

12. Virnik A.D., Skokova I.F., Yudanova T.N. et al. Immobilization of enzymes on grafted cellulose copolymers containing ionizable groups / Cellulose Chemistry and Technology, 1993, v.27, p.477-488.

13. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Иванова М.В., Юданова Т.Н. Интерполиэлектролит-ная реакция - метод получения ферментсодержаших волокнистых материалов с регулируемым составом и евойавами / Текст ильная химия, 1994, № 1, с.5-20.

14. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н. Разработка волокнистых материалов с комбинированным биологическим действием на основе полиэлектролитных комплексов / Хим. волокна, 1995, №5, с. 10-21.

15. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н. и др. Получение волокнистых материалов, содержащих одновременно иммобилизованный протеолитический фермент и антимикробное вещество, и исследование их свойств / Прикладная биохимия и микробиология, 1996, т.32, №6, с.615-619.

16. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Вирник А.Д. Получение ферментсодержащих целлюлозных волокнистых материалов на основе привитых сополимеров, содержащих сульфогруппы / Хим. волокна, 1997, №1, с.10-13.

17. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Вирник А.Д. Исследование иммобилизации протео-литических ферментов на привитых сополимерах целлюлозы различного строения / Прикладная биохимия и микробиология, 1997, т.ЗЗ, № 1, с.38-42.

18. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Хомяков К.П., Трусова СП., Богомольный В Л., Толстых П.И., Гостишев В.К., Дадашов А.И. Получение пленок с комбинированным биологическим действием и исследование их свойств / Прикладная биохимия и микробиология, 1997, т.ЗЗ, №4, с.428-432.

19. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Давыдова О.В., Гальбрайх Л.С. Получение модифицированных волокнистых материалов, содержащих биологически активные вещества /Хим. волокна, 1997, №6, с. 15-21.

20. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Князева О.Н., Вирник А.Д. Исследование свойств протеаз, иммобилизованных на привитых сополимерах целлюлозы, содержащих четвертичные аммониевые группы / Известия вузов. Химия и хим. технология, 1997, т.40, №6, с.64-67.

21. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Суркова Г.В., Вирник А.Д. Получение полимерных материалов медицинского назначения, обладающих комбинированным биологическим действием, и изучение их свойств / Известия вузов. Химия и хим. техноло-1ия, 1998,т.41,№2,с.77-80.

22. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Бобкова Т.В., Вирник А.Д. Получение полимерных материалов, обладающих пролонгированным комбинированным биологическим действием / Известия вузов. Химия и хим. технология, 1998, т.41, №1. с.106-110.

23. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Высоцкая Е.П., Иванова М.В., Юданова Т.Н. Исследование совместной иммобилизации протеолитического и бактериолитического ферментов и свойств полученных материалов / Прикладная биохимия и микробиология, 1998, т.34, №2, с.157-160.

24. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Богданова И.В., Петрова Н.Е., Гальбрайх Л.С. Пленочные материалы с контролируемым выделением биологически активных веществ / Хим. волокна, 1998, №5, с.44-48.

25. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Дронова М.В., Гальбрайх Л.С. Текстильные материалы медицинского назначения с комбинированным биологическим действием: получение и свойства / Текстильная химия, 1998, №1(13), с.96-102.

26. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Вирник А.Д. Совместная иммобилизация протеоли-тического фермента протеазы С и антимикробного вещества на немодифициро-ванных полимерах / Прикладная биохимия и микробиология, 1998, т.34, №4, с.419-425.

27. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Хомяков К.П., Гостищев В.К., Толстых П.И., Арутюнян Б.Н., Дадашов А.И. Получение волокнистых материалов, содержащих иммобилизованный протеолитический фермент и мочевину / Прикладная биохимия и микробиология, 1999, т.35, №1, с.72-74.

28. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Варламова Е.А., Гальбрайх Л.С. Получение волокнистых материалов, содержащих полимерное антимикробное вещество / Хим. волокна, 1999,№1,с.30-33.

29. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Гаврикова Л.И., Гальбрайх Л.С. Получение текстильных материалов с комбинированным биологическим действием / Хим. волокна, 1999, №2, с.8-11.

30. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Гальбрайх Л.С, Елфимова Г.С., Петрова Н.В., Алешина Е.Ю. Свойства композиций, содержащих биологически активные вещества, и полимерных материалов, полученных на их основе / Хим. волокна, 1999, №4, с.32-38.

31. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Алешина Е.Ю., Гальбрайх Л.С. Поливинилспирто-вые пленочные материалы, содержащие биополимеры: получение и свойства / Хим. волокна, 2000, №5, с.39-43.

32. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Гальбрайх Л.С. Получение биологически активных волокнистых материалов с заданными свойствами /Хим. волокна,2000,№6,с.21-24.

33. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Талаленкова О.С., Гальбрайх Л.С. Волокнистые материалы с комбинированным ферментативным действием: получение и свойства / Хим. технология, 2000, №7, с.38-41.

34. Патент РФ 2174847, Чиссов В.И., Решегов И Юда|Ив»-^.5Ск|к(0кф

Повязка для лечения ран, приор. 01.03.2000, опубл. 20.10.2001.

35. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Алешина Е.Ю., Гальбрайх Л.С. Полифункциональные биологически активные поливинилспиртовые пленочные материалы / Хим. волокна, 2001, № 1, с. 19-22.

36. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Петрова Н.Е. Получение поливинилспиртовых пленочных покрытий с комбинированным лечебным действием / Хим. технология, 2001,Лг«2,с.40-44.

37. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Бочкарева О.Н., Гальбрайх Л.С. Фармакокинетиче-скис свойства волокнистых материалов, модифицированных соиммобилизацией биологически активных веществ различного типа / Хим. волокна,2001,№4,с.35-39.

38. Алешина Е.Ю., Юданова Т.Н., Скокова И.Ф. Получение и свойства формовочных растворов на основе поливинилового спирта, содержащих протеазу С и полигексаметиленгуанидин / Хим. волокна, 2001, №6, с. 4-6.

39. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Мартынова СБ. Получение волокнистых материалов, содержащих биологически активный комплекс протеаза-полиэтиленимин, и их свойства / Хим. волокна, 2002, №2, с.44-46.

40. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Божьева М.В., Гальбрайх Л.С. Получение и свойства лечебных перевязочных средств с комбинированным действием / Хим. технология, 2002, №12, с.30-33.

41. Юданова Т.Н., Алешина Е.Ю., Саенко М.С., Гальбрайх Л.С. Надмолекулярная структура и свойства поливинилспиртовых пленок, содержащих комплекс биологически активных веществ / Хим. волокна, 2003, № 1, с.24-27.

42. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Талаленкова О.С., Гальбрайх Л.С. Получение и свойства биферментных полимерных композиций / Антибиотики и химиотерапия. 2003, т.48, №4, с. 7-10.

43. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Мартынова СБ. Получение и иммобилизация комплекса протеаза — полиэтиленимин на волокнистых материалах / Хим. технология, 2003, №4, с.23-26.

44. Юданова Т.Н., Алешина Е.Ю., Лизунова А.А., Крестьянова И.Н., Гальбрайх Л.С Свойства протеазы С в комплексе с полигексаметиленгуанидином / Химико-фарм. журнал, 2003, т.37, №11, с.41-44.

45. Юданова Т.Н., Алешина Е.Ю., Гальбрайх Л.С, Крестьянова И.Н. Фармакокинети-ческие свойства пленок с комбинированным биологическим действием" / Химико-фарм. журнал, 2003, т.37, №11, с.26-28.

ИД №01809 от 17.05.2000

Подписано в печать 27.04.04 Сдано в производство 28.04.04 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ. Усл.печ.л. 2,0 Уч.-изд.л. 1,75 Заказ 218 Тираж 100

Электронный набор МГТУ, 119991, ул. Малая Калужская, 1

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

Полимерные системы медико-биологического назначения

1.1. Современные раневые покрытия: принципы получения, свойства

1.1.1. Раневые покрытия с антимикробным действием.

1.1.2. Раневые покрытия с иммобилизованными ферментами.

1.1.3. Раневые покрытия с комбинированным биологическим действием.

1.2. Полиэлектролитные комплексы с участием белков.

Глава 2. Материалы и методы.

Основные результаты и их обсуждение.

Глава 3. Исследование последовательной иммобилизации ферментов и антимикробных веществ на волокнистых материалах.

3.1. Комплексообразование ферментов с привитыми сополимерами целлюлозы ионогенного типа.

3.2. Ковалентная иммобилизация террилитина на волокнистых носителях.

3.3. Влияние антимикробных веществ на биологическую активность волокнистых материалов, содержащих иммобилизованные протеоли-тические ферменты.

3.4. Медико-биологические исследования материалов с ферментативной и антимикробной активностью.

Глава 4. Совместная иммобилизация ферментов и антимикробных веществ на немодифицированных волокнистых материалах.

4.1. Получение и свойства интерполимерных комплексов протеолити-ческих ферментов с растворимыми полиэлектролитами.

4.2. Влияние условий иммобилизации полимерных композиций с ком

• плексной биологической активностью на структуру и фармакокинетические свойства модифицированных волокнистых материалов.

Глава 5. Влияние добавок биополимеров и модифицирующих веществ на надмолекулярную структуру и фармакокинетические свойства биологически активных поливинилспиртовых пленок.

Глава 6. Исследование воздействия ионизирующего облучения на биологическую активность полимерных материалов.

Выводы.

Интенсивное развитие химии медико-биологических полимеров обусловлено непрерывно растущим уровнем медицинских технологий и возникающей в связи с этим необходимостью создания изделий и средств на основе синтетических и натуральных полимеров для восстановления и обеспечения нормальной жизнедеятельности организма [1,2].

Актуальность разработки и совершенствования раневых покрытий диктуется задачами современной реконструктивной хирургии и низкой эффективностью традиционных перевязочных средств. Кроме того, развитие концепции процесса ранозаживления предъявляет новые требования к ране* вым покрытиям, функции которых в настоящее время значительно расширились и заключаются не только в защите раны от внешних воздействий, но и в создании оптимальных условий для заживления [3-5]. К числу перспективных перевязочных средств относятся материалы, обладающие комбинированным лечебным действием, в частности ферментативным и антимикробным. Целесообразность применения покрытий с таким комплексом свойств является патогенетически обоснованной, т.к. в первой фазе раневого процесса необходимо подавление воспаления и очищение раны от некротических масс [3,6]. Введение в состав материалов протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью позволит применять их и на стадии формирования рубца [6]. Преимущества иммобилизованных форм ферментов над нативными известны, наиболее важные из них — повышение стабильности и уменьшение иммунологической и аллергической реакций организма за счет понижения способности модифицированного фермента стимулировать образование антител и реагировать с ними [7].

Сложность получения лекарственных композиций, содержащих одновременно фермент и антимикробное вещество, заключается в возможной инактивации протеазы. Это связано с высокой реакционной способностью антимикробных веществ по отношению к белкам. Таким образом, становится очевидным, что фермент должен быть защищен от прямого воздействия на него антимикробного вещества. Для этого есть два пути: первый — получение материала с комбинированным биологическим действием по двухста-дийному способу, когда сначала проводится иммобилизация фермента с целью его стабилизации, а затем - антимикробного вещества. Второй - подбор таких компонентов, которые позволили бы создать кинетически устойчивую систему, содержащую фермент и антимикробное вещество, и затем исполь-' зовать ее для иммобилизации на материалах различного типа.

Специфика раневых покрытий с биологическим действием состоит в том, что в отличие от других материалов для наружного применения в медицинской практике, например антимикробных тканей, они являются средствами одноразового использования с коротким сроком эксплуатации, поэтому их биологическая активность должна максимально реализовываться при наложении на рану. В связи с этим большой интерес представляет разработка таких методов иммобилизации ферментов и антимикробных веществ, которые позволили бы получать обратимые в физиологических средах соединения, а за счет регулирования состава полимерной системы и характера взаимодействий между ее компонентами направленно изменять свойства раневых покрытий и благодаря этому расширить арсенал имеющихся перевязочных средств.

Цель работы заключается в научном обосновании принципов получения волокнистых и пленочных материалов медицинского назначения, одновременно содержащих иммобилизованные фермент и антимикробное вещество, а также в характеристике особенностей фармакокинетических, физико-химических и медико-биологических свойств разработанных раневых покрытий с пролонгированным комплексным биологическим действием.

В связи с этим были поставлены задачи: 1. Провести сравнительное изучение иммобилизации протеолитических ферментов и антимикробных веществ на модифицированных полимерных фицированных полимерных носителях, а также специфической активности, стабильности и физико-химических свойств полученных материалов.

2. Изучить закономерности получения полимерных композиций с комбинированной биологической активностью, их иммобилизации в структуре волокнистых и пленочных материалов и влияния условий получения на специфические свойства.

3. Изучить микробиологические и медико-биологические свойства материалов с комплексной биологической активностью.

Научная новизна работы. Разработаны принципы совместной иммобилизации ферментов - медицинских субстанций и антимикробных веществ в структуре волокнистых и пленочных материалов, использование которых позволяет получать полимерные раневые покрытия с прогнозируемым уровнем комбинированного биологического действия.

Показана возможность регулирования состава, структуры, активности и стабильности комплексов ферментов с нерастворимыми (модифицированг ными волокнистыми материалами) и растворимыми полиэлектролитами путем изменения заряда, степени ионизации и количества ионогенных групп полиэлектролита, введения в молекулу полиэлектролита гидрофобных заместителей или образования межмолекулярных химических связей.

Установлена зависимость фармакокинетических свойств волокнистых и пленочных материалов, содержащих одновременно иммобилизованные фермент и антимикробное вещество, от характера химических и нехимических взаимодействий, реализуемых в многокомпонентной полимерной системе и определяющих надмолекулярную структуру полимерных материалов.

Показано, что формирование структуры композиционного соединения на волокнистой основе можно контролировать, изменяя состав полимерной системы, используемой при иммобилизации: содержание полимерных компонентов, химическую природу волокнистой матрицы и антимикробного вещества, заряд полиэлектролита и степень его ионизации, тип сшивающих реагентов, молекулярную массу антимикробного вещества.

Сформулированы представления о формировании межфазных адсорбционных слоев в многокомпонентной полимерной системе на основе поливинилового спирта, содержащей фермент и антимикробный поликатион, и показана возможность влияния на структурообразование путем изменения степени ионизации поликатиона, введения полимерного противоиона и сшивающего реагента.

Установлено радиопротекторное действие полимера-носителя в отношении иммобилизованного фермента, обусловленное эстафетным механизмом передачи свободного радикала с облученной макромолекулы иммобилизованного белка на полимер-носитель.

На защиту выносятся: научно-обоснованные принципы получения волокнистых и пленочных материалов с прогнозируемым уровнем ферментативной и антимикробной активности; совокупность закономерностей и обобщений, расширяющих область знаний о модификации ферментов (трипсина, террилитина, коллитина, про-теазы С, лизоцима) и свойствах их иммобилизованных форм; разработанные методы совместной иммобилизации ферментов и антимикробных веществ в структуре волокнистых и пленочных материалов.

Практическая значимость диссертационной работы.

Впервые получены полимерные раневые покрытия, содержащие со-иммобилизованные протеолитический фермент и высокомолекулярное антимикробное вещество.

Разработаны научные и технологические основы создания волокнистых и пленочных материалов с ферментативным и антимикробным действием.

Получено разрешение МЗ РФ на промышленное производство волокнистых раневых покрытий, содержащих фермент и хлоргексидина биглкжо-нат или мочевину, разработанных совместно с ВНИИТГП (ВНИИТМ).

Совместно с Московским научно-исследовательским онкологическим институтом им. П.А.Герцена разработано универсальное пленочное покрытие, содержащее лизоцим и хлоргексидина биглюконат, для профилактики воспалительных процессов и лечения обширных ран различной этиологии.

Личный вклад автора заключается в постановке целей и задач исследований, теоретическом и методическом обосновании путей их решения, непосредственном выполнении исследований, обобщении результатов, организации проведения медико-биологических испытаний.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на Третьей Всероссийской Каргинской конференции "По-лимеры-2004" (Москва), II международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003), I-IV международных конференциях "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов " (Москва, 1992, 1995, 1998, 2001), Всероссийских научно-технических конференциях "Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Москва, 1998, 1999, 2001, 2003), Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии" (Москва, 2002), Международных конференциях "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" (Москва-Щелково, 1999, 2001), Международных симпозиумах по химическим волокнам (Калинин 1986, Тверь 2000), Международной конференции "Synergetic of macromolecular hiérarchie structures" (Ташкент, 2000), I Всероссийской научной конференции "Физико-химия процессов переработки полимеров" (Иваново, 1999), Международном симпозиуме "Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов" (Минск, 1998), Международной конференции "Некоторые проблемы химии и физики полисахаридов" (Ташкент, 1997), I Международной научно-технической конференции "Актуальные проблемы химии и химической технологии" (Иваново, 1997), Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов — новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты" (Владивосток, 1991), European symposium on carbohydrate chemistry (Edinburgh, Scotland, 1991), Всесоюзной научной конференции "Проблемы модификации природных и синтетических волокнообразующих полимеров" (Москва, 1991), Республиканской научно-практической конференции "Синтез и применение энтеросорбентов" (Конаково, 1990), VI Всесоюзной конференции по физике и химии целлюлозы (Минск, 1990), Всесоюзной конференции "Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицинской и микробиологической промышленности" (Ташкент, 1989), I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), 2-й Всесоюзной конференции "Интерполимерные комплексы" (Рига, 1989), I Всесоюзной конференции "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов" (Москва, 1989), V и VI Всесоюзных симпозиумах "Инженерная энзимоло-гия" (Олайне, 1985, Вильнюс, 1988), VII Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Минск, 1985), IV Московской конференции по органической химии и технологии (Москва, 1985).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 52 статьи, 43 тезисов докладов, получены 3 авторских свидетельства СССР и 1 патент РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, заключения, библиографии (316 наименований) и приложения, включающего акты об испытаниях. Основной текст диссертации изложен на 328 страницах, включает 120 рисунков и 76 таблиц.

ВЫВОДЫ

С целью разработки принципов получения волокнистых и пленочных раневых покрытий с ферментативным и антимикробным действием проведены систематические исследования влияния взаимодействия полимерных компонентов в системах, содержащих биологически активные вещества, на структуру и фармакокинетические свойства полимерных материалов.

1. В результате исследования интерполимерных реакций ферментов с нерастворимыми полиэлектролитами (модифицированными волокнистыми материалами на основе привитых сополимеров целлюлозы, содержащих ионизующиеся группы анионного или катионного типа), и растворимыми полиэлектролитами анионного, катионного и амфотерного типов установлена зависимость состава и свойств комплексов от типа полииона, степени ионизации и количества ионогенных групп полиэлектролита, присутствия в молекуле полиэлектролита гидрофобных заместителей или межмолекулярных сшивок. Установлены индивидуальные зависимости свойств ферментов от перечисленных факторов.

2. Установлено влияние состава многокомпонентных полимерных композиций, используемых для совместной иммобилизации на немодифицированных волокнистых материалах фермента и антимикробного вещества, и химической природы волокнистого носителя на структуру композиционного материала и кинетические характеристики инактивации и десорбции антимикробных веществ. Показано, что эта структура зависит от типа химической связи между ферментсодержащим комплексом и полимерной матрицей, содержания полимерных компонентов, типа ионогенных групп и степени ионизации полиэлектролита, химической природы антимикробного вещества, наличия сшивающих реагентов, молекулярной массы антимикробного вещества.

3. На основании результатов исследования реологических свойств полимерных композиций на основе поливинилового спирта, содержащих фермент, антимикробное вещество поликатионного типа и другие добавки, а также изучения термодинамических характеристик полимерных пленок сформулированы представления о формировании межфазных адсорбционных слоев и структурообразовании в многокомпонентной полимерной системе, содержащей несколько полиэлектролитов. Показано определяющее влияние степени ионизации антимикробного поликатиона на формирование структуры полимерной пленки и возможность ее дополнительного регулирования путем введения полимерного противоиона и сшивающего реагента. Установлена взаимосвязь между надмолекулярной структурой биологически активного пленочного материала и кинетическими характеристиками инактивации фермента и десорбции антимикробного вещества.

4. Определено влияние иммобилизации ферментов путем комплексо-образования с полиэлектролитами анионного и катионного типа и ковалент-ного присоединения индивидуально или в составе комплекса на температурную зависимость и рН-профиль действия, свидетельствующее о сохранении конформации белковой глобулы и каталитического действия в физиологической среде. Установлено кардинальное изменение рН-профиля действия полиферментного комплекса протеазы С в результате комплексообразования с поликатионными антимикробными веществами.

5. Показана возможность стерилизации полимерных покрытий с ферментативным и антимикробным действием ионизирующим облучением. На основании результатов исследования зависимости активности ферментов, иммобилизованных в структуре волокнистых и пленочных материалов, от дозы ионизирующего облучения и кинетики гибели макрорадикалов предложен механизм радиопротекторного действия полимерной матрицы, заключающийся в эстафетном механизме передачи свободного радикала с облученной макромолекулы иммобилизованного белка на полимер-носитель. Показано влияние способа иммобилизации ферментов на их стабильность к стерилизации и последующему хранению.

7. В ходе микробиологических и медико-биологических испытаний на животных раневых покрытий волокнистого и пленочного типа с ферментативным и антимикробным действием установлена зависимость специфической активности материалов от содержания биологически активных веществ и показана эффективность материалов при лечении гнойных ран.

8. На основании результатов исследований разработаны принципы создания полимерных раневых покрытий с прогнозируемым уровнем антимикробной и ферментативной активности активности путем регулирования структуры композиционных материалов волокнистого типа и наполненных полимерных пленок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С целью получения полимерных раневых покрытий с ферментативным и антимикробным действием исследованы многокомпонентные полимерные системы, содержащие наряду с патогенетически обоснованным комплексом лекарственных веществ полимеры и модифицирующие вещества, использование которых целесообразно как с медико-биологической, так и с химической точек зрения. В таких системах каждый компонент, с одной стороны, выполняет функцию биологически активного вещества и, с другой стороны, позволяет регулировать структуру и свойства получаемых материалов за счет реализации системы внутри- и межмолекулярных взаимодействий.

Установлено, что эффективным способом стабилизации протеолитиче-ских ферментов к действию денатурирующих факторов (температуры и химических соединений, в том числе антимикробных веществ) является ком-плексообразование с полиэлектролитами. Возможность создания кинетически стабильных композиций, содержащих антимикробное вещество и комплекс фермента с полимером ионогенного типа или комплекс фермента с по-ликатионным антимикробным веществом, можно рассматривать как основу разработки технологичных способов получения полимерных материалов для комбинированной терапии ран.

В ходе исследований показаны пути регулирования кинетики десорбции антимикробных веществ из волокнистых и пленочных материалов с комбинированной биологической активностью. Это позволит контролировать не только антимикробное действие раневых покрытий, но и их цитотоксич-ность. В частности, в работе показано, что полиэтиленимин, даже не десор-бируясь из полимерного материала, in vitro оказывает антибактериальную защиту поверхности, на которой он находится. Таким образом, прочно фиксируя эффективное, но, возможно, цитотоксичное вещество в структуре полимерного материала, можно существенно снизить цитотоксичность материала и одновременно обеспечить деконтаминацию раны. При этом важно, что такое полимерное раневое покрытие является самодезинфицирующимся и, кроме того, выполняет роль антимикробного барьера от окружающей среды.

Установлено, что пленочные материалы на основе поливинилового спирта, содержащего биологически активный комплекс и модифицирующие добавки, обладают паропроницаемостью. Колебательный характер паропро-пускания, обусловленный открытием и коллапсом пор вследствие наличия в пленке внутренних напряжений, позволяет характеризовать такие пленки как "дышащие", что создает благоприятные условия (поддержание оптимальной влажности) для ранозаживления.

Важным этапом при разработке полимеров медицинского назначения является определение способа стерилизации и изучение его воздействия на стабильность полимера. Исследования биологической активности материалов после радиационного облучения и последующего хранения в течение 2-х лет в различных условиях показали возможность использования дозы 20±5 кГр для стерилизации волокнистых и пленочных материалов, содержащих фермент и антимикробное вещество.

Биологическая активность материалов с комплексным биологическим действием показана в ходе микробиологических и медико-биологических испытаний при лечении гнойных и ожоговых экспериментальных ран животных (Приложения 1-4, 8, 9).

На основании результатов экспериментальных исследований разработаны технологичные способы получения раневых покрытий волокнистого и пленочного типа с прогнозируемым уровнем комбинированного пролонгированного биологического действия.

Совместно с ВНИИТГП (ныне ВНИИТМ) разработаны два раневых покрытия на основе окисленного целлюлозного волокнистого материала, содержащих иммобилизованный трипсин и мочевину или хлоргексидина биг-люконат. Перевязочные средства прошли технические и последующие испытания, включая клинические испытания в НИИ лазерной медицины МЗ РФ, Институте хирургии им.А.В.Вишневского, Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, Российском государственном медицинском университете (Приложения 10-17), в соответствии с ГОСТ 15.013 и рекомендованы Комиссией по инструментам, аппаратам и приборам, применяемым в медицине, Комитета по новой медицинской технике к постановке на промышленное производство и к применению в медицинской практике (Приложения 18, 19).

Совместно с Московским научно-исследовательским онкологическим институтом им. А.П.Герцена разработано универсальное пленочное покрытие с комплексным биологическим действием. Проведены токсикологические испытания полимерной пленки, содержащей фермент и антимикробное вещество, показавшие отсутствие местнораздражающего, сенсибилизирующего и токсического действия (Приложение 20). Медико-биологические испытания разработанного раневого покрытия продемонстрировали эффективность его применения при лечении чистых и особенно инфицированных ран, так как оно полностью подавляет гнойно-воспалительный процесс (Приложение 21).

1. Платэ H.A., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры.- М.: Химия, 1986.

2. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. ч.1. Полимерные имплантаты. М., 2003.

3. Назаренко Г.И., Сугурова И.Ю., Глянцев С.П. Рана. Повязка. Больной. -М.: Медицина, 2002. 472 с.

4. Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов // Материалы II межд. конф. М.: МЗ РФ, 1995. - 376 с.

5. Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов // Материалы IV межд. конф. М.: МЗ РФ, 2001.- 350 с.

6. Биологически активные перевязочные средства в комплексном лечении гнойно-некротических ран / Под ред. В.Д.Федорова, И.М.Чижа.- М.: МЗ РФ, 2000. 36 с.

7. Химическая энзимология / Под ред. И.В.Березина, К.Мартинека. М.: МГУ, 1983.-278 с.

8. Добыш C.B. Разработка и изучение нового поколения перевязочных средств на основе модифицированных полимерных материалов: Дис. д-ра техн. наук в форме науч. докл. -М., 1999.- 68 с.

9. Qin Y.M. Advanced wound dressings // J. of the Textile Institute.- 2001,-V.92.- №1.- P.127-138.

10. Hansson C. Interactive dressings a practical guide to their use in older patients //Drugs & Aging.- 1997,- V.ll.- №4.- P.271-284.

11. Eich D., Stadler R. Differetiated local therapy of chronic wounds with modern wound dressings // Vasa-J. of Vascular Diseases.- 1999.- V. 28.- №1.- P.3-9.

12. Раны и раневая инфекция / Под ред. М.И.Кузина, Б.М.Костюченок. М.: Медицина, 1981.-688 с.

13. Кравков Н.П. Основы фармакологии. M.-JL: Государственное издательство, 1928.- Т.1.- С. 387 с.

14. Новое в области получения антимикробных волокнистых материалов и их использование. М.: ЦНИИТЭИлегпром, 1980,- 56 с.

15. Вирник АД. Антимикробные целлюлозные волокнистые материалы // Итоги науки и техники. Химия и технология высокомолекулярных соединений. -М.: ВИНИТИ, 1986,- Т.21.- С.35-96.

16. Вирник А.Д. Химия медицинских волокон и тканей: успехи и проблемы // Журн. Всесоюз. хим. общества им. Д.И.Менделеева.- 1985.- Т.ЗО.- №4,- С. 447-454.

17. Вольф Л.А., Емец JI.B., Костров Ю.А. и др. Волокна с особыми свойствами. М.: Химия, 1980. - 240 с.

18. Антимикробные материалы в медицине / Под ред. Л.А.Ильина. M.: Meдицина, 1987.

19. Tereschenko L.Y., Shamolina I.I. The use of cellulases to improve the sorption properties of cellulosic wound dressings // J. of the Textile Institute.- 1998,- V. 89,-№3,-P. 570-578.

20. Edwards J.V., Batiste S.L., Gibbins E.M., Goheen S.C. Synthesis and activity of NH2-terminal and COOH-Terminal elastase recognition sequences on cotton // J. of Peptide Research.- 1999,- V.54.- № 6.- P. 536-543.

21. Капуцкий Ф.Н., Юркштович Т.JI. Лекарственные препараты на основе производных целлюлозы. Минск: Университетское, 1989.- 111 с.

22. Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов // Тез. докл. межд. симп. Минск: НИИ ФХП, 1998. - 100 с.

23. Пат. RU 98105384, А 61 L 15/38. Способ получения атравматичной антимикробной салфетки / Холоденко Б.Л.; Опубл. 10.01.2000.

24. Медушева Е.О., Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В. Особенности иммобилизации лизоцима на целлюлозном носителе // Хим. волокна.- 1992.- №3,- С.38-40

25. Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов // Материалы I всесоюз. конф. М.: МЗ СССР, 1989.288 с.

26. Скокова И.Ф., Вирник А.Д., Плоткина Н.С. и др. Получение антимикробных текстильных материалов на основе привитого сополимера целлюлозы и полиакриловой кислоты // Текст, пром-сть.- 1977.- №8.- С. 66-70.

27. Virnik A.D., Penenzhik М.А., Ryshkina I.S. et al. Study of the interpolyelectrolyte reactions between cellulose graft copolymers containing acidic groups and antimicrobial polycations // Cell. Chem. and Tech.- 1996.-V.30.- №1-2.- P.39-47.

28. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. С-Пб.: Гиппократ, 1993.-264 с.

29. Пат. RU 2048817, А 61 L 15/20. Способ получения материала для лечения ожогов и гнойно-некротических ран / Стекольникова Л.И., Корнилова Е.Г.; Опубл. 27.11.95, Бюл. №33.

30. Калинина Т.Н., Хацкевич Г.А., Хохлова В.А., Штягина Л.М. Анестезирующие материалы на основе поливинилспиртового волокна // Хим. волокна.- 1992,-№5-С. 10-12.

31. Piacquadio D., Nelson D.B. Alginates a New dressing alternative // J. of Dermatologic Surgery and Oncology.- 1992.- V.18.- №11.- P.992-995.

32. Doyle J.W., Roth N.P., Smith R.M. et al. Effect of calcium alginate on cellular wound healing processes modeled in vitro // J. of Biomedical Materials Reseasch.-1996.- V.32.- №4.- P.561-568.

33. Suzuki Y., Nishimura Y., Tanihara M. et al. Evaluation of a novel alginate gel dressing. Cytotoxicity to fibroblasts in vitro and foreign body reaction in pig skin in vivo // J. of Biomedical Materials Research.- 1998.- V. 39.- №2,- P. 317-322.

34. Suzuki Y., Tanihara M., Nishimura Y. et al. In vivo evaluation of a novel alginate dressing// J. of Biomedical Materials Research.- 1999.- V. 48,- № 4.-p. 522-527.

35. Thomas A., Harding K.G., Moore K. Alginates from wound dressings activate human macrophages to secrete tumor-necrosis-factor-alpha // Biomaterials.-2000.- V. 21.-№17,-P. 1797-1802.

36. Lansdown A.B.G. Calcium a potential central regulator in wound-healing in the skin // Wound Repair and Regeneration.- 2002.- V. 10.- № 5- P. 271-285.

37. Пат. RU 2170590, A 61 L 15/38. Способ получения альгинатного материала, обладающего ранозаживляющим действием / Бронштейн Б.Ю., Комиссарова А.Л., Якубович B.C.; Опубл. 20.07.2001.

38. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т. 1, 2. Харьков: Торсинг, 1997.

39. Хохлова В.А., Калинина Т.Н., Илларионова Е.Л., Чуфаровская Т.Н. Получение биологически активных волокон на основе карбоксилсодержащих природных полимеров // Тез. докл. межд. конф. по хим. волокнам "Химво-локна-2000".- Тверь, 2000.

40. Васильев М.П., Вольф Л.А. Биологически активные коллагеновые волокна и волокнистые материалы / Хим. волокна,- 1990.- №6.- С.39-41.

41. Tanaka М., NakakitaN., Kuroyanagi Y. Allogeneic cultured dermal substitute composed of spongy collagen containing fibroblasts evaluation in animal test // J. of Biomaterials Science Polymer Edition.-1999.- V. 10.- № 4.- P. 433-453.

42. Grzybowski J., Kolodziej W., Trafny E.A., Struzyna J. New antiinfective collagen dressing containing antibiotics // J. of Biomedical Materials Research.-1997.- V. 36.-№2,- P. 163-166.

43. Пат. RU 2118176, A 61 L 15/32. Способ получения коллагеновых пластин / Истранов Л.П., Абоянц Р.К., Истранова Е.В., опубл. 27.08.1998, Бюл.№24.

44. Matsuda К., Suzuki S., Isshiki N. et al. Evalution of bilayer artificial skin capable of sustained-release of an antibiotic // Biomaterials.- 1992.- V.13.- №2.-P.l 19-122.

45. Chekmareva I. A. Experimental study of reparative regeneration processes in the wound treated with bioactive dressings // Bulletin of Experimental Biology and Medicine.-2002.- V. 133.-№2,-P. 192-195.

46. PCT WO 00/16817 (Korea), A 61 L 15/28. Dermal scaffold using neutralized chitosan sponge or neutralized chitosan/collagen mixed sponge / Son Y.S., Youn Y.H., Hong S.I. et al; Опубл. 30.03.2000.

47. Пат. RU 2154497, A 61 L 15/32. Перевязочный материал / Адамян A.A., Голованова П.М., Добыш C.B.; Опубл. 20.10.1997, Бюл.№29.

48. Пат. RU 2071788, А 61 L 15/32. Средство для лечения ран Адамян А.А., Добыш С.В., Поликахина Г.В. и др.; Опубл. 20.01.1997, Бюл.№2.

49. PCT WO 98/19718 (US), А 61 L 15/28. Chemical modification of biomedical materials with genipin Lin C.K., Sung H.W. // Опубл. 14.05.1998.

50. Пат. RU 2104038, А 61 L 15/20. Средство для лечения ран / Адамян А.А., Голованова П.М., Добыш C.B. и др.; Опубл. 10.02.1998, Бюл.№4.

51. Zhong S.P., Campoccia D., Doherty P.J. et al. Biodégradation of hyaluronic acid derivatives by hyaluronidase // Biomaterials.- 1994,- V. 15,- № 5.- P. 359365.

52. Ruizcardona L., Sanzgiri Y.D., Benedetti L.M. et al. Application of benzyl hyaluronate membranes as potential wound dressing evalution of water-vapor and gas permeabilities // Biomaterials.- 1996,- V. 17.- № 16.- P. 1639-1643.

53. Choi Y.S., Hong S.R., Lee Y.M. et al. Studies on gelatin-containing artificial skin. II. Preparation and characterization of cross-linked gelatin-hyaluronate sponge // J. of Biomedical Materials Research.- 1999,- V. 48.- № 5.- P. 631639.

54. Tomihata K., Burczak K., Shiraki K., Irada Y. Cross-linking and biodégradation of native and denatured collagen // ACS Symposium Series.- 1994.- V.540.-P.275-286.

55. Hong S.R., Lee S.J., Shim J.W. et al. Study on gelatin-containing artificial skin. IV. A comparative study on the effect of antibiotic and EGF on cell proliferation during epidermal healing // Biomaterials.- 2001.- V. 22.- № 20.- P. 2777-2783.

56. Ulubayram K., Cakar A.N., Korkusuz P. et al. EGF containing gelatin based wound dressings // Biomaterials.- 2001.- V. 22,- № 11.- P. 1345-1356.

57. Tucci M.G., Ricotti G., Mattiolibelmonte M. et al. Chitosan and gelatin as engineered dressing for wound repair // J. of Bioactive and Compatible Polymers.- 2001,- V. 16,- № 2,- P. 145-157.

58. Choi Y.S., Hong S.R., Lee Y.M. et al. Study on gelatin-containing artificial skin. I. Preparation and characteristics of novel gelatin-alginate sponge // Biomaterials.- 1999,- V.20.- № 5.- P. 409-417.

59. Draye J.P., Delaey В., Vandevoorde A. et al. In vitro and in vivo biocompatibility of dextran dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel films // Biomaterials.- 1998.- V. 19.-№18.-P. 1677-1687.

60. Кричевский Г.Е., Савилова Л.Б., Олтаржевская Н.Д. и др. Новая технология получения текстильных материалов с пролонгированным лечебным действием // Текстильная химия.- 1992.- №1,- С.91-100.

61. Олтаржевская Н.Д. Теоретические основы и технология получения текстильных медицинских материалов с заданными свойствами: Автореф. дис. д-ратехн.наук.- С.-Пб., 1994.- 44 с.

62. Савилова Л.Б. Применение технологии печатания и аппретирования для получения медицинских повязок пролонгированного лечебного действия: Автореф. дис. канд. техн. наук.- С.-Пб., 1993,- 30 с.

63. Ротфельд М.В. Разработка технологии создания самофиксирующегося текстильного материала пролонгированного лечебного действия: Автореф. дис. канд. техн. наук.- М., 1996,- 16 с.

64. Моисеева А.А. Разработка технологии получения текстильных лечебных материалов с адгезионными свойствами: Автореф. дис. канд. техн. наук.-М., 1998,- 34 с.

65. Коровина М.А. Разработка технологии получения лечебных текстильных материалов для хирургии и онкологии: Автореф. дис. канд. техн. наук.-М., 2000.- 32 с.

66. Пат. RU 2101033,А61 L 15/22. Перевязочный материал с пролонгированным лечебным действием / Васильева Т.С., Субботко О.А.; Опубл. 10.01.98, Бюл. №1.

67. Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов // Материалы III межд. конф. М.: МЗ РФ, 1998.- 368 с.

68. Пат. RU 2114639, А 61 L 15/44. Ранозаживляющий препарат и хирургическая ранозаживляющая салфетка / Икоев Т.М., Синицына Н.И., Лебедев А.П.; Опубл. 10.07.98, Бюл. №19.

69. An environment for healing: the role of occlusion / Ed. by T.J.Ryan. London, The Royal Society of Medicine, 1985. - 158 p.

70. Beyond occlusion: wound care proceedings / Ed. by T.J.Ryan. London, The Royal Society of Medicine Services, 1988. - 141 p.

71. Кивман Г.Я., Ляшенко Ю.В., Рабинович Э.З., Флейдерман Л.И. Гидроколлоидные покрытия новое поколение средств для лечения ран и ожогов // Хим.-фарм. журнал.- 1994.- Т.28.- №9.

72. Пат. RU 2191034, А 61 L 15/20. Гелеобразная лекарственная форма / Сам-ченко Ю.М., Ульберг З.Р., Комарский СЛ.; Опубл. 20.10.2002, Бюл.№29.

73. Пат. RU 2157243, А 61 L 15/22. Гидрогелевая композиция и перевязочные средства из нее для лечения ран различной этиологии / Валуев Л.И., Сы-тов Г.А., Адамян А.А.и др.; Опубл. 10.10.2000, Бюл. №28.

74. Пат. RU 2093190, А 61 L 15/22. Перевязочный материал / Гийеме А., Жа-нод Ф.; Опубл. 20.10.1997, Бюл.№29.

75. Yoshii F., Makuuchi К., Darwis D. et al. Heat-resistance poly(vinyl alcohol) hydrogel // Radiation Physics and Chemistry.- 1995,- V.46.- №2,- P. 169-174.

76. Kao F.J., Manivannan G., Sawan S.P. UV curable bioadhesives copolymers of N-vinyl pyrrolidone // J. of Biomedical Materials Research.- 1997.- V. 38.-№3.- P. 191-196.

77. Higa O.Z., Rogero S.O., Machado L.D.B. et al. Biocompatibility study for PVP wound dressing obtained in different conditions // Radiation Physics and Chemistry.- 1999.- V. 55.- № 5-6.- P. 705-707.

78. Rosiak J.M., Olejniczak J. Medical application of radiation formed hydrogels // Radiation Physics and Chemistry.- 1993.- V.42.- №4-6.- P.903-906.

79. Yoshii F., Zhanshan Y., Isobe K. et al. Electron beam cross-linked PEO and PEO PVA hydrogels for wound dressing // Radiation Physics and Chemistry.-1999.-V. 55.-№2.-P. 133-138.

80. Razzak M.T., Zainuddin Erizal Dewi S.P., Lely H., Taty E. Sukirno The characterization of dressing component materials and radiation formation of PVA-PVP hydrogel // Radiation Physics and Chemistry.- 1999.- V. 55,- № 2.-P. 153-165.

81. Wu N.H., Bao B.R., Yoshii F., Makuuchi K. Irradiation of cross-linked, poly(vinyl alcohol) blended hydrogel for wound dressing // J. of Radioanalytical and Nuclear Chemistry.- 2001,- V. 250.- № 2.- P. 391-395.

82. Hilmy N., Darwis D., Hardiningsih L. Poly(N-vinylpyrrolidone) hydrogels. 2. Hydrogel composites as wound dressing for tropical environment // Radiation Physics and Chemistry.- 1993.- V.42.- №4-6.- P.911-914.

83. Suzuki Y., Tanihara M., Nishimura Y. et al. A novel wound dressing with an antibiotic delivery system stimulated by microbial infection // Asaio J.- 1997.-V. 43.-№5.-P. 854-857.

84. Gayet J.C., Fortier G. High water-content BSA-PEG hydrogel for controlled-release device evalution of the drug-release properties // J. of Controlled Release.- 1996,- V.38.- №2-3,- P.177-184.

85. Пат. RU 2180856, A 61 L 15/28. Средство для лечения ран / Гаврилюк Б.К., ГаврилюкИ.Б.; Опубл. 27.03.2002, Бюл.№9.

86. Пат. RU 2194535, А 61 L 15/28. Средство для лечения ран / Гаврилюк Б.К., ГаврилюкИ.Б.; Опубл. 20.12.2002, Бюл.№35.

87. Пат. RU 2193896, А 61 L 15/28. Покрытие для ран / Гаврилюк Б.К., Гаврилюк В.Б.; Опубл. 10.12.2002, Бюл.№34.

88. Пат. RU 2115436, А 61 L 15/28. Средство для лечения ран / Адамян А.А., Кузнецова В.А., Розенберг М.Э. и др.; Опубл. 20.07.1998, Бюл.№20.

89. Kobayashi Н., Hyon S.H., Ikada Y. Water-curable and biodegradable prepolymers // J. of Biomedical Materials Research.- 1991.- V.25.- №12.-P.1481-1494.

90. Пат. RU 2120306, A 61 L 15/28. Средство для лечения ран и ожогов / Беленькая Б.Г., Полевов В.Н., Адамян А.А., Сахарова В.И. и др.; Опубл. 20.10.1998, Бюл.№29.

91. Пат. RU 2031661, А 61 L 15/28. Средство для лечения ран и оказания первой медицинской помощи / Адамян А.А., Полевов В.Н., Килимчук JI.E. и др.; Опубл. 20.03.1999, Бюл.№8.

92. Богомольный В .Я., Бодунова E.JI., Афиногенов Г.Е. и др. Антисептические поливинилспиртовые пленки для закрытия ран и ожогов / Гидрофильные полимеры медицинского назначения: Сб. науч. тр. Д.: ОНПО "Пластполимер", 1989.- С. 42-49.

93. Богомольный В.Я., Даурова Т.Т., Афиногенов Г.Е. и др. Антимикробныепленки на основе поливинилового спирта / Тез докл. VI всесоюз. симп. "Синтетические полимеры медицинского назначения".- Алма-Ата, 1983.-С. 111-113.

94. Пат. SU 1080447, С 08 L 29/04, А 61 К 7/40. Антимикробный пленочный материал / Богомольный В.Я., Афиногенов Г.Е., Соловский М.В. и др.; Опубл. 20.05.1995, Бюл.№14.

95. Пат. SU 1674552, С 08 L 29/04, А 61 L 15/22 Пленочная антимикробная композиция / Паутов В.Д., Ануфриева Е.В., Краковяк М.Г. и др.; Опубл. 20.05.1996, Бюл.№14.

96. Пат. RU 2184571, А 61 L 15/44. Препарат пролонгированного антимикробного действия / Островидова Г.У., Показеев Д.Н., Ли Чул-Тэ; Опубл. 10.07.2002, Бюл.№19.

97. Пат. RU 2107516, А 61 L 15/44. Повязка для лечения ран и способ ее получения / Акимова А.Я., Чигирь А.Н., Солодовник В.Д.; Опубл. 27.03.98, Бюл.№9.

98. Sandford Р.А., Steinnes A. Biomedical applications of high-purity chitosan -physical, chemical and bioactive properties // ACS Symposium Series.- 1991.-V.467.- P.430-445

99. Biagini G., Bertani A., Muzzarelli R. etc. Wound management with N-carboxybutyl chitosan // Biomaterials.-1991.- V.12.- №3.- P.281-286.

100. Muzzarelli R. Depolymerization of methyl pyrrolidinone chitosan by lysozyme // Carbohydrate Polymers.- 1992- V.19.- №1.- P. 29-34.

101. Muzzarelli R.A.A. Human enzymatic-activities related to the therapeutic administration of chitin derivatives // Cellular and molecular life sciences.-1997,-V. 53.-№2.-P. 131-140.

102. Paul W., Sharma C.P. Chitosan, a drug carrier for the 21st century A review // STP Pharma Sciences.- 2000,- V. 10,- № 1.- P. 5-22.

103. PCT WO 01/24840 A 1, A 61 L 15/28. Wound care device / Nielsen В.; Опубл. 12.04.2001.

104. Hirano S., Nakahira T., Nakagawa M., Kim S.К. The Preparation and applications of functional fibers from crab shell chitin // J. of Biotechnology.-1999.- V. 70.- № 1-3.- P. 373-377.

105. Wang L.H., KhorE., Wee A., Lim L.Y. Chitosan-alginate PEC membrane as a wound dressing assessment of incisional wound healing // J. of Biomedical Materials Research.- 2002.- V. 63.- № 5.- P. 610-618.

106. PCT WO 01/41820 Al (GB), A 61 L 15/28. Flexible chitosan film for wound dressings / Kordestani S.S.; Опубл. 14.06.2001.

107. Mi F.L., Shyu S.S., Wu Y.B. et al. Fabrication and characterization of a sponge-like asymmetric chitosan membrane as a wound dressing // Biomaterials.- 2001.- V. 22.- № 2.- P. 165-173.

108. Nho Y.C., Park K.R. Preparation and properties of PVA/PVP hydrogels containing chitosan by radiation // J. of Applied Polymer Science.- 2002.- V.85.- №8,- P. 1787-1794.

109. Ishihara M., Ono K., Sato M. et al. Acceleration of wound contraction and healing with a photocrosslinkable chitosan hydrogel // Wound Repair and Regeneration.- 2001,- V. 9.- № 6,- P. 513-521.

110. Ishihara M., Nakanishi K., Ono K. et al. Photocrosslinkable chitosan as a dressing for wound occlusion and accelerator in healing-process // Biomaterials.- 2002.- V. 23.- № 3,- P. 833-840.

111. PCT WO 97/03708 (FR), A 61 L 15/28. Chitin gel dressing for chronic wounds, particularly sloughs / Domard A., Grandmontagne В., Karibian T. et al.; Опубл. 06.02.1997.

112. Kim H.J., Lee H.C., Oh J.S. et al. Polyelectrolyte complex composed of chitosan and sodium alginate for wound dressing application // J. of Biomaterials Science-Polymer Edition.- 1999,- V. 10,- № 5.- P. 543-556.

113. Loke W.K., Lau S.K., Yong L.L. et al. Wound dressing with sustained antimicrobial capability // J. of Biomedical materials research.- 2000.- V. 53.-№ 1.- P.8-17.

114. Mi F.L., Wu Y.B., Shyu S.S. et al. Control of wound infections using a bilayer chitosan wound dressing with sustainable antibiotic delivery // J. of Biomedical Materials Research.- 2002.- V. 59,- № 3.- P.438-449.

115. Hinrichs W.L.J., Lommen E.J.C.M.P., Wildevuur C.R.H., Feijen J. Fabrication and characterization of an asymmetric polyurethane membrane for use as a wound dressing // J. of Applied Biomaterials.- 1992.- V. 3, 4.- P.287-303.

116. Pavlova M., Draganova M. Biocompatible and biodegradable polyurethane polymers // Biomaterials.- 1993,- V.14.- №13.- P. 1024-1029.

117. Matsuda K., Suzuki S., Isshiki N., Ikada Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin // Biomaterials.- 1993.- V.14.- №13.- P.1030-1035.

118. Tsunoda M., Kobayashi T. Preparation of a polyurethane film having high water vapor-permeability and its physicochemical properties // Nippon Kagaku Kaishi.- 1998.-№11.- P.761-766.

119. Grzybowski J., Oldak E., Antosbielska M. et al. New cytokine dressings. I. Kinetics of the in vitro RHg-CSF, Rhgm-CSF, and Rhegf release from the dressings // International J. of Pharmaceutics.- 1999.- V. 184.- № 2.- P.173-178.

120. Bense C.A., Woodhouse K.A. Plasmin degradation of fibrin coatings on synthetic polymer substrates // J. of Biomedical Materials Research.- 1999.- V. 46,-№3.-P. 305-314.

121. Tsunoda M., Sato H., Yamada K., Noguchi H. Preparation of a new wound dressing composed of a polyurethane film which is impregnated silver sulfur diazine, and a nonwoven fabric // Nippon Kagaku Kaishi.- 1998.- № 11,- P.767.773.

122. Hu Z.B., Wang C.J., Nelson K.D., Eberhart R.C. Controlled-release from a composite silicone/hydrogel membrane // Asaio J.- 2000.- V. 46,- № 4.- P. 431-434.

123. Маркин B.C., Иорданский A.A., Фельдштейн M.M. и др. Диффузионная модель подачи лекарственных веществ из гидрофильных матриц транс-дермальных терапевтических систем через полимерную мембрану // Хим.-фарм. журнал,- 1994.- Т.28.- №10,- С.38-45.

124. Пат. RU 2106154, А 61 L 15/32. Мензул В.А. / Перевязочный материал; Опубл. 10.03.98, Бюл.№7.

125. Штильман М.И. Реакции в системе белок полимерный носитель, используемые при иммобилизации ферментов // Успехи химии.- 1979,- № 11.-С.2061-2086.

126. Введение в прикладную энзимологию / Под ред. И.В.Березина, К.Мартинека. М.: МГУ, 1982.- 384 с.

127. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука, 1984.- 261 с.

128. Березин И.В., Клячко H.JI., Левашов A.B. и др. Иммобилизованные ферменты. Биотехнология. М.: Высшая школа, 1987.- 159 с.

129. Мартинек К., Березин И.В. Стабилизация ферментов ключевой фактор при внедрении биокатализа в практику // Успехи химии,- 1980.- №5,-С.737-770.

130. Глянцев С.П. Разработка современных ферментсодержащих перевязочных средств и совершенствование методов их применения в комплексном лечении гнойных ран: Автореф. дис. д-ра мед. наук.- М., 1993,- 41 с.

131. Вирник А.Д., Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р. и др. Получение волокнистых материалов, содержащих иммобилизованные ферменты.- М.: НИИТЭХИМ, 1985.- 59 с.

132. Вирник А.Д., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б. и др. Иммобилизация ферментов в структуре волокон и пленок в процессе их формования. I. Иммобилизация ^модифицированных ферментов // Биотехнология.- 1987.-Т.З.- №5.- С.602-611.

133. Вирник А.Д., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б. и др. Иммобилизация ферментов в структуре волокон и пленок в процессе их формования. II. Иммобилизация модифицированных ферментов // Биотехнология.- 1988,-Т.4.- №1.- С.91-96.

134. Новые разработки в области текстильных изделий медицинского назначения // Сб. науч. тр. ВНИИТГП / Под ред. В.Н.Филатова. -М.: ЦНИИТЭИ-легпром, 1989.- 82 с.

135. Белов A.A., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние текстильных носителей на свойства иммобилизованного трипсина // Хим. волокна.-1992,- №3.- С.33-34.

136. Рыльцев В.В., Филатов В.Н. Свойства и применение протеолитических систем, иммобилизованных на текстильных матрицах // Тез. докл. IV сим-поз. "Химия протеолитических ферментов".- М.: ИБХ РАН, 1997.- С. 145.

137. Рыльцев В.В. Биологически активные текстильные материалы // Тез. докл. всесоюз. науч. конф. "Проблемы модификации природных и синтетических волокнообразующих полимеров".- М.: МТИ, 1991.- С. 23-24.

138. Штягина JIM., Спесивцев Ю.А., Кугушев Ф.Х. и др. Иммобилизованнная гиалуронидаза для лечения больных острым гнойным лактационным маститом // Тез. докл. IV всесоюз. симп. "Инженерная энзимология".- Киев, 1983.-С.102.

139. Белов A.A., Рыльцев В.В., Филатов В.Н. Изучение свойств и иммобилизация на текстильных носителях полиферментных препаратов // Тез. докл. IV симпоз. "Химия протеолитических ферментов".- М.: ИБХ РАН, 1997.-С. 147.

140. Пат. RU 2099095, А 61 L 15/38. Способ получения перевязочного материала для лечения рубцов / Стекольников Л.И., Корнилова Е.Г.; Опубл. 20.12.1997, Бюл.№ 35.

141. Хорунжина С.И., Хохлова В.А., Котецкий В.В., Вольф Л.А. Исследование процесса сорбции трипсина карбоксилсодержащим поливинилспиртовыми волокнами//Журн. прикл. химии.- 1977.-№1.- С.195-196.

142. Хорунжина С.И., Шамолина И.И., Хохлова В.А., Вольф Л.А. Иммобилизация папаина на волокнистом полимере из поливинилового спирта // Прикл. биохимимя и микробиология.- 1978.- Т. 14.- №1.- С. 11-14.

143. Хорунжина С.И. Получение и исследование ферментсодержащих волокон: Автореф. дис. канд. техн. наук. Л., 1977.- 22 с.

144. Вольф Л.А., Шамолина И.Н., Хохлова В.А. Получение, свойства и применение волокон с ферментативной активностью // Хим. волокна.- 1979.-№4.- С.3-8.

145. Степанова Л.С. Разработка методов иммобилизации ферментов на химических волокнах и исследование свойств иммобилизованнных ферментов: Автореф. дис. канд. техн. наук. Л., 1979. - 24 с.

146. Вольф Л.А., Хохлова В.А. Ферментативные волокна для пищевой промышленности и медицины / Получение и применение волокон со специфическими свойствами: Сб. Мытищи, 1980,- С.91-101.

147. Хохлова В.А., Шамолина И.И., Калинина Т.Н., Вольф Л.А. Некоторые аспекты получения и использования ферментсодержащих волокон / Препринты III межд. симпоз. по хим. волокнам. Калинин, 1981.- Т.5.- С.209-215.

148. Клибанов A.M., Самохин Г.П., Мартинек К., Березин И.В. Механохимия каталитических систем. Регулирование механическим воздействием активности а-химотрипсина, химически присоединенного к капроновой нити // Докл. АН СССР.- 1974.- Т.218,- С.715-718.

149. Платэ H.A., Валуев Л.И., Егоров Н.С., Аль-Нури М.А. Ковалентное связывание ацилированного трипсина с полимерными носителями // Прикл. биохимия и микробиология.-1977,- Т.13.- №5.- С.673-676.

150. Платэ H.A., Валуев Л.И., Чупов В.В. Иммобилизация протеолитических ферментов на полиэтилене, полипропилене и лавсане // Высокомол. соед.-1980.- Т.22 А,- №9.- С.1363-1366.

151. Комиссарова А.Л., Якубович B.C., Толстых П.И. и др. Получение пористого материала на основе альгиновой кислоты, содержащей иммобилизованный террилитин // Антибиотики и химиотерапия.- 1988.- №10.- С. 735739.

152. Кильдеева Н.Р., Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф., Вирник А.Д. Иммобилизация модифицированного а-химотрипсина в структуре пленок из триацетата целлюлозы//Биохимия,- 1980,- Т.45.- №3,- С. 569-574.

153. Вирник А.Д., Гостищев В.К., Кильдеева Н.Р. и др. Получение пленок и волокон, содержащих протеолитические ферменты // Прикл. биохимия и микробиология.- 1987,- Т.23.-№1.- С.78-83.

154. Кильдеева Н.Р. Научные основы получения волокнистых и пленочных биокатализаторов из белоксодержащих формовочных дисперсий: Авто-реф. дисс. д-ра хим. наук.- М., 1998.- 36 с.

155. Хомяков К.П., Кильдеева Н.Р., Богомольный В.Я. и др. Терриплен фер-ментсодержащая пленка из поливинилового спирта для лечения гнойных ран / Гидрофильные полимеры медицинского назначения: Сб. науч. тр. -Л.: ОНПО "Пластполимер", 1989,- С. 49-53.

156. Новые достижения в исследовании хитина и хитозана // Мат. VI межд. конф,- М.: ВНИРО, 2001,- С. 124-262.

157. Вихорева Г.А., Хомяков К.П., Сахаров И.Ю., Гальбрайх Л.С. Иммобилизация протеолитических ферментов в пленках и губках карбоксиметилхи-тина//Хим. волокна,- 1995.- №5.- С.34-37.

158. Ларионова А.С. Разработка биологически активных многокомпонентных пленочных материалов для медицинских целей: Автореф. дисс. канд. хим.наук.- М., 2000,- 16 с.

159. Кильдеева Н.Р., Бабак В.Г., Меркович Е.А. и др. Включение ферментов в оболочки из ПАВ-полиэлектролитных комплексов на основе хитозана // Мат. VI межд. конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана".- М.: ВНИРО, 2001.- С. 350-352.

160. Дадашов А.И. Комплексное лечение ожоговых ран с применением новых биоактивных покрытий и их сочетание с инфракрасным излучением: Автореф. дис. канд. мед. наук.- М, 1994. 29 с.

161. Пат. Яи 2127609, А 61 Ь 15/38. Перевязочный материал / Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В., Медушева Е.О. и др.; Опубл. 20.03.1999, Бюл.№8.

162. Медушева Е.О., Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В. и др. Иммобилизованная ли-зоамидаза эффективная биологическая альтернатива при лечении гнойных ран мягких тканей // Тез. докл. IV симпоз. "Химия протеолитических ферментов".- М.: ИБХ РАН, 1997.- С. 148.

163. Пат. ЬШ 2055600, А 61 Ь 15/44. Способ получения перевязочного материала для лечения ран и ожогов / Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Брейтман Р.Ш.; Опубл. 10.03.1996, Бюл.№7.

164. Пат. RU 2142818, А 61 L 15/32. Способ получения перевязочных материалов "Салфетки Филатова-Рыльцева" / Филатов В.Н., Рыльцев В.В.; Опубл.2012.1999, Бюл.№35.

165. Пат. RU 2062113, А 61 L 15/38. Способ получения перевязочных материалов / Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Гостищев В.К. и др.; Опубл. 20.06.1996, Бюл.№ 17.

166. Игнатюк Т.Е., Медушева Е.О., Белов A.A. и др. Перевязочные материалы с металлокомплексами на основе иммобилизованного трипсина // Тез. докл. IV симпоз. "Химия протеолитических ферментов".- М.: ИБХ РАН, 1997.- С. 146.

167. Пат. RU 2149648, А 61 L 15/32. Способ получения перевязочного материала / Дуванский В.А., Калинин М.Р., Промоненков В.К. и др.; Опубл.2705.2000.

168. RU 2158112, МКИ А 61 L 15/28. Способ кожной пластики / Дуванский

169. B.А., Рыльцев В.В., Толстых М.П., Филатов В.Н. и др. Опубл. 27.10.2000.

170. Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов // Тез. докл. межд. симпоз. Минск: НИИ ФХП, 1998,- С. 53-54, 60-62.

171. Пат. RU 2127128, А 61 L 15/32. Способ получения раневого покрытия "Дигестол" / Истранов Л.П., Абоянц Р.К., Соловьева Н.И., Шехтер А.Б.; Опубл. 10.03.1999, Бюл. № 7.

172. Кабанов В.А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов // Высокомол. соед.-1994.- Т.36.- №2.- С.183-197.

173. Изумрудов В.А., Лим С.Х. Контролируемые фазовые разделения в растворах комплексов полиметакрилатного аниона и глобулярных белков // Высокомол. соед.- 2002 А.- Т.44.- №5,- С.793-801.

174. Зезин А.Б., Кабанов В.А. Новый класс комплексных водорастворимых полиэлектролитов // Успехи химии.- 1982.- Т.50,- №9,- С.1447-1483.

175. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Равновесие интерполиэлектролитных реакций и явление молекулярного "узнавания" в растворах интерполиэлектролитных комплексов // Успехи химии.- 1991,- Т.60.- №7.1. C.1570-1595.

176. Кабанов В.А., Зезин А.Б., Изумрудов В.А. Синтетические полиэлектролиты как регуляторы ферментативных реакций // Итоги науки и техники.

177. Биотехнология / Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. М.: Высшая школа, 1987. - Т.4.- С.159-192.

178. Бектуров Е.А., Кудайбергенов С.Е., Рафиков С.Р. Свойства растворов и комплексообразование амфотерных полиэлектролитов // Успехи химии,-1991,- Т.60.-№4,- С.835-851.

179. Изумрудов В.А., Касаикин В.А., Ермакова Л.Н., Зезин А.Б. Исследование водорастворимых полиэлектролитных комплексов неэквимольного состава // Высокомол. соед,- 1978.- Т. 20 А.- №2,- С.400-406.

180. Харенко O.A., Харенко A.B., Калюжная Р.И. и др. Нестехиометричные полиэлектролитные комплексы новые водорастворимые макромолекуляр-ные соединения // Высокомол. соед.- 1979.- Т.21 А.- №12.- С.2719-2725.

181. Howell N.K., Yeboah N.A., Lewis David F.V. Studies on the electrostatic interactions of lysozyme with a-lactalbumin and ß-lactalbumin // Int. J. Food Sei. and Technol.- 1995.- V.30.- №6.- P.813-824.

182. Скобелева В.Б. Взаимодействие сетчатых полиэлектролитов с белками: активированный транспорт белков и коллапс геля: Автореф. дис. канд. хим. наук.- М.: МГУ, 1997.- 20 с.

183. Мустафин Р.И. Создание и исследование пролонгированных лекарственных форм на основе интерполимерных комплексов. Автореф. дис. канд. фарм. наук.- М.: Моск. мед. акад. им. И.М.Сеченова,1991.- 23 с.

184. Вайнерман Е.С. Исследование взаимодействия некоторых белков и кислых полисахаридов в водной среде: Автореф. дис. канд. хим. наук.- М.: ИЭС АН СССР, 1973.-27 с.

185. Изумрудов В.А., Касаикин В.А., Ермакова Л.Н. и др. Изучение строения водорастворимых комплексов бычьего сывороточного альбумина с поли-4-винил-Ы-этилпиридинийбромидом методом светорассеяния // Высокомол. соед.- 1981.- Т.23 А.-№6,- С.1365-1373.

186. Izumrudov V.A. Competitive reactions in solutions of protein-polyelectrolyte complexes //Ber. Bunsenges. Phys. Chem.- 1996.- V.100.- №6.- P.1017-1023.

187. Изумрудов B.A., Зезин А.Б., Кабанов B.A. Макромолекулярный обмен в растворах комплексов глобулярных белков с неприродными полиэлектролитами // Докл. АН СССР,- 1984.- Т. 275.- №5.- С.1120-1123.

188. Бектуров Е.А. Интерполимерные комплексы сополимеров // Тез. докл. 2-й всесоюз. конф. "Интерполимерные комплексы".- Рига, 1989.- С.147-150.

189. Изумрудов В.А. Зезин А.Б., Кабанов В.А. Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов глобулярных белков с полиэлектролитами // Докл. АН СССР.- 1986.- Т.291.- №5.- С.1150-1154.

190. Мишаева Р.Н., Кузнецова Н.П., Самсонов Г.В. Кооперативное взаимодействие белков с карбоксильными сетчатыми полиэлектролитами // Тез. докл. 2-й всесоюз. конф. "Интерполимерные комплексы".- Рига, 1989.-С.131-134.

191. Gao J., Dubin P., Munoberac В. Capillary electrophoresis and dynamic light scattering studies of structure and finding characteristics of protein-polyelectrolyte complexes // J. Phys. Chem. В.- 1998.- V.102.- P.5529-5535.

192. Дубинина Н.И. Исследование взаимодействия белков с карбоксильными катионитами: Автореф. дис. канд. хим. наук.- М.: Ин-т антибиотиков, 1980.- 23 с.

193. Bull H.B. Absorbed monolayers of egg albumin // Arch. Biochem. Biophys.-1957- V.68.- P.102-111.

194. Любинский Г.В. Взаимосвязь между оптимальными pH иммобилизации белков и их изоэлектрическими точками // Украинский биохим. журнал,-1984.- Т.56.- №4.- С.390-394.

195. Измайлова В.Н., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах.- М.: Наука, 1974,- 268 с.

196. Дмитренко Л.В., Генеди А.Ш., Самсонов Г.В. Влияние ассоциации на ионный обмен органических ионов // Коллоидный журн.- 1970.- Т.32.-№1.- С.37-40.

197. Дмитренко Л.В., Липинская Н.Д., Самсонов Г.В. Взаимодействие ионов тетрациклина и окситетрациклина с ионитами при повышенных концентрациях // Коллоидный журн.- 1971.- Т.33,- №5.- С.670-673.

198. Морозова А.Д., Дмитренко Л.В., Самсонов Г.В. Изотермы с максимумом и кооперативные процессы при сорбции // Изв. АН СССР. Сер. Химическая,-1974,-№1.-С.30-35.

199. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: Фаир-Пресс, 1999. - 720 с.

200. Марголин А.Л., Шерстюк С.Ф., Изумрудов В.А. и др. Белок-белковые взаимодействия в системах, содержащих синтетические полиэлектролиты //Докл. АН СССР.- 1985.- Т.284.- №4.- С.997-1001.

201. Кольцова C.B., Глинкина М.В., Илларионова Н.Г., Самсонов Г.В. Образование водорастворимых комплексов в системе трипсин-полиметакриловая кислота // Молекулярная биология.-1971.- Т.5.- С.225-231.

202. Кольцова C.B., Гликина М.В., Самсонов Г.В. Осаждение трипсина поли-метакриловой кислотой // Изв. АН СССР. Сер. Химическая.- 1970,- Т.8.-С.1895-1896.

203. Кольцова C.B., Илларионова Н.Г., Панарин Е.Ф. и др. Растворимые комплексы трипсина с синтетическими полиоснованиями // Изв. АН СССР. Сер. Химическая.- 1975,- №3.- С.643-649.

204. Кольцова C.B., Самсонов Г.В. Кинетика тепловой денатурации трипсина в комплексе с поли-4(5)винилимидазолом // Изв. АН СССР. Сер. Химическая.-1976, №1, с.168-171.

205. Алиновская В.А., Юркштович Т.Л., Капуцкий Ф.Н. Влияние типа ионо-генной группы модифицированной целлюлозы на взаимодействие ее с ферментами // Тез. докл. 2-й всесоюз. конф. "Интерполимерные комплексы".-Рига, 1989.- С.357-359.

206. Валуева Т.А., Мосолов В.В., Маклакова И.А. Свойства физиологически активных веществ, иммобилизованных на синтетических полимерах // Тез. докл. V всесоюз. симпоз. "Синтетические полимеры медицинского назначения".- Рига, 1981,- С.253-254.

207. Валуева Т.А., Валуев Л.И., Ванчугова Л.В. и др. О регулировании оптимума pH действия иммобилизованных белков // Прикп. биохимия и микробиология,- 1982.- Т. 18,- С. 346-351.

208. Levin Y., Pecht M., Goldstein L., Katchalski E. A waterinsoluble polyanionic derivative of trypsin. Preparation and properties // Biochemistry.- 1964.- V.3.-P.1905-1913.

209. Кольцова C.B. Растворимые комплексы трипсина с синтетическими полиэлектролитами: Автореф. дис. канд. хим. наук,- Л., 1973.- 20 с.

210. Солдадзе K.M., Копылова-Валова В.Д. Комплексообразующие иониты. -М.: Химия, 1980.- С. 105-106.

211. Хомяков К.П. Исследование в области синтеза производных декстрана: Дис. канд. хим. наук. М., 1967. - 187 с.

212. Lowry О.Н., Rosebrogh N.J., Randal R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent.-J.Biol.Chem.-1951.- V.193.- P.265-275.

213. Васильева Р.П., Евтихов Н.П., Богород Г.В. Соотношение величин активности протеиназ, полученных двумя способами измерения // Микробиол. пром-сть.- 1976,-№4.- С.23-26.

214. Mandl I., M'Clennan J.D., Howes E.L. Isolation and Characterisation of proteinase and collagenase from Cl.Hystolicum // J. Clin. Invest.-1953.-V.32.-P.1323-1329.

215. Кравченко H.A., Клеопина Г.В., Каверзнева Е.Д. Поиски активного центра лизоцима методом карбоксиметилирования // Биохимия.- 1965.- Т.30.-№4,- С.713-720.

216. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики,- М.: МГУ, 1976,- 320 с.

217. Практикум по высокомолекулярным соединениям / Под ред. Кабанова

218. B.А.-М.: Химия, 1985. 223 с.

219. Рабек Я. Экспериментальные методы в химии полимеров. М.: Мир, 1983.-480 с.

220. Hantgan R., Hermans J. Assembly of fibrin. A light scattering // J. Biol. Chem.-1979,- V.254.- №22,- P. 11272-11281.

221. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determination by do-decyl sylfate-polyacryl-amide gel electrophoresis // J. Biol. Chem.- 1969.-V.244.- №16.- P. 4406-4412.

222. Молин Ю.Н., Чибрикин B.H., Шабалкин В.А., Шувалов В.Ф. Точность измерения концентрации парамагнитных частиц методом ЭПР // Заводск. лаборатория.- 1966.- №8,- С.933-943.

223. Методические указания по лабораторной оценке антимикробной активности текстильных материалов, содержащих антимикробные препараты МЗ РФ. -М.: МЗ РФ, 1984.

224. Государственная фармакопея СССР, XI изд., вып. 2.- Москва , 1990.1. C.210-225.

225. Роговин З.А., Гальбрайх JI.C. Химические превращения и модификация целлюлозы,- М.: Химия, 1979.- 208 с.

226. Кричевский Т.Е., Корчагин М.В., Сенахов А.В. Химическая технология текстильных материалов. -М.: Легпромбытиздат, 1985.- 640 с.

227. Роговин З.А. Основы химии и технологии химических волокон.- М.: Химия, 1974.-Т.1.-517 с.

228. Заиков Г.Е., Иорданский А.А., Маркин B.C. Диффузия электролитов в полимерах.- М.: Химия, 1984.- 240 с.

229. Крестьянова И.Н., Васильева Л.И., Бартошевич Ю.Э. и др. Изоэлектриче-ское фокусирование препарата протеолитических ферментов из Strepto-myces 771 // Прикл. биохимия и микробиология.- 1983.- Т.19.- №2.- С.217-225.

230. Крестьянова И.Н., Луканин А.В., Писарев В.В. Протеаза "С" медицинская субстанция // Мат. 1-й межд. конгресса "Биотехнология - состояние и перспективы развития".- М.: ЗАО "ПИК "Максима", 2002.- С.69.

231. Белов А.А. Текстильные материалы, содержащие различные протеолити-ческие комплексы // Тез. докл. V симпоз. "Химия протеолитических ферментов".- М.: ИБХ РАН, 2002.- С.132.

232. Прокопенко Л.Г., Хмелевская И.Г., Чалый Г.А. и др. Ферментная иммуно-модуляция.- Курск, 1999.- 152 с.

233. Кравченко Н.А. Химическое и энзимологическое изучение лизоцима.- М., 1976.- 85 с.

234. Панарин Е.Ф., Копейкин В.В. Биологическая активность синтетических полиэлектролитных комплексов ионогенных поверхностно-активных веществ // Высокомол. соед.- 2002,- Т.44 С,- №12.- С.2340-2351.

235. Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н. Химическая модификация как метод получения стабилизированных форм биокатализаторов // Итоги науки и техники. Биотехнология. Иммобилизация и стабилизация биокатализаторов. М.: ВИНИТИ, 1986,- Т.5.- С. 5-49.

236. Кабанов В.А., Топчиев Д.А. Полимеризация ионизующихся мономеров. -М.: Наука, 1975.-223 с.

237. Эльцефон Б.С. Гидрогели интерполиэлектролитных комплексов медицинского назначения: Дис. д-ра хим.наук в форме науч. докл.- М., 1990. -51 с.

238. Белами Л.Д. Инфракрасные спектры сложных молекул / Под ред. Ю.А.Пентина.- М.: Издатинлит,1963.- 590 с.

239. Белами Л.Д. Новые данные по ИК-спектрам сложных молекул / Под ред. Ю.А.Пентина.- М.: Мир, 1971,- 318 с.

240. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. Практическое руководство / Под ред. А.А.Мальцева.- М.: Мир, 1965.216 с.

241. Жбанков Р.Г. Инфракрасные спектры целлюлозы и ее производных.-Минск: Наука и техника, 1964.- 341 с.

242. Измайлова В.Н., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах. -М.: Наука, 1974.- 268 с.

243. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971.- 404 с.

244. Жуковский В.А. Полипропиленовые хирургические нити с комплексной биологической активностью // Хим. волокна.- 1996.- №6,- С.12-16.

245. Днепровский A.C., Темникова Т.И. Теоретические основы органической химии. Л.: Химия, 1979,- 520 с.

246. Линденбаум Г.М. Исследование химической модификации некоторых протеолитических ферментов водорастворимыми декстранами: Дис. канд. хим. наук. Л.: ЛГУ, 1978.- 198 с.

247. Waif D.R., Agayn V.I. The chemistry of enzyme and protein immobilization with glutaraldehyde / TRAC: Trends Anal. Chem.- 1994,- V.13.- № 2.- P.425-430.

248. Богачева Т.И., Миргородская О.А., Москвичев Б.В. Некоторые особенности взаимодействия трипсина с глутаровым альдегидом в растворе // Прикл. биохимия и микробиология.- 1976.- Т.12.- №3.- С.428-431.

249. Кузнецова Н.П., Самсонов Г.В. Исследование поликонденсации биополимеров // Высокомол. соед. 1985,- Т.27 А.- №12.- С.2611-2614.

250. Richards F.M., Knowless J.R. Glutaraldehyde as a protein cross-linking reagent //J. Mol. Biol.- 1968.- V.37.-№l.-P.231-233.

251. Margel S., Rembaum A. Synthesis and characterization of poly(glutaraldehyde). A potential reagent for protein immobilization and cell separation // Macro-molecules.- 1980.- V.13.- №1.- P. 19-24.

252. Кузнецова Н.П., Самсонов Г.В. Кинетические исследования поликонденсации биополимеров // Высокомол. соед.- 1986.- Т.28 А,- №3.- С.643-648.

253. Acharya A.S., Suseman L.G., Manning J.M. Schiff base adducts of glyceralde-hyde with hemoglobin // J.Biological Chem.- 1983,- V.258.- №4.- P.2296-2302.

254. Hopwood D., Allen C.R., McCabe M. The reactions between glutaraldehyde and various proteins. An investigation of their kinetics // Histochemical J. -1970.- V.2.- №2,- P.137-150.

255. Payne J.W. Polymerization of proteins with glutaralaldehyde // Biochem. J.-1973.- V.135.- №4.- P.867-873.

256. Кричевский Г.Е. Диффузия и сорбция в процессах крашения и печатания.-М.: Легкая индустрия, 1981. 208 с.

257. Каргина О.В., Комарова О.П., Бондаренко Г.Н. О строении трехкомпо-нентного интерполимерного комплекса // Высокомол. соед.- 2002.- Т.44 Б.-№12.- С.2232-2235.

258. Подколзин A.A., Гуревич К.Г. Действие биологически активных веществ в малых дозах. М.: КМК, 2002,- 170 с.

259. Пономаренко М.Н. Синтез и исследование антибиотик- и фермент-полисахаридных конъюгатов: Автореф. дис. канд. фарм. наук.- С-Пб., 1998.- 26 с.

260. Экологически безопасные полимерные биоциды. Материалы и технологии. -М.: ИЭТП, 2000.- Вып.1.-105 с.

261. Баркова Н.П., Богачук Г.П. Поиск и комплексные исследования перспективных антисептиков // Тез докл. II Росс. нац. конгр. "Человек и лекарство". -М.: Фармединфо, 1995. -С.178.

262. Рабинович И.М. Применение полимеров в медицине.- JL: Медицина, 1972.

263. Николаев А.Ф., Мосягина Л.П. Поливиниловый спирт и сополимеры винилового спирта в медицине // Пласт, массы.- 2000.- №3,- С.34-42.

264. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров и свойства макромолекул,- Л., Наука, 1986,- 288 с.

265. Щукин Е.Д., Перцов A.B., Амелина Е.А. Коллоидная химия. М.: МГУ, 1982.-348 с.

266. Харенко O.A., Изумрудов В.А., Харенко А.В и др. Процессы ассоциации -диссоциации в растворах нестехиометричных полиэлектролитных комплексов // Высокомол. соед.- 1980.- Т.22 А.- №1.- С.218-223.

267. Щипунов Ю.А., Конева Е.Л., Постнова И.В. Гомогенные альгинатные гели: фазовое поведение и реологические свойства // Высокомол. соед,-2002,- Т.44 А.- №7.- С.1201-1211.

268. Чистякова Л.А., Кравченко H.A. О механизме активации лизоцима солями //Биохимия.- 1972.- Т.37.-№6,- С.1126-1132.

269. Сорокина Е.М., Ефремова Н.В., Топчиева И.Н. Нековалентные комплексы а-химотрипсина с полиалкиленоксидами / Тез.докл. IV симпоз. "Химия протеолитических ферментов".- М.: ИБХ РАН, 1997.- С. 120.

270. Турманидзе Ц.С., Квеситадзе Г.И., Миканадзе Ю.С. и др. Выделение и физико-химические свойства стафилококковой гиалуронидазы // Прикл. биохимия и микробиология.- 1996.- Т.32.- №5.- С.519-523.

271. Пучкова Н.Г., Некрасов A.B. Иммобилизация ферментов на физиологически активных полимерах / Тез. докл. VI всесоюз. симпоз. "Синтетические полимеры медицинского назначения".- Алма-Ата: Наука, 1983.- С. 101102.

272. Липатов Ю.С., Сергеева Л.М. Взаимопроникающие полимерные сетки.-Киев: Наукова думка, 1979.-160 с.

273. Берлин A.A., Басин В.Е. Основы адгезии полимеров. М.: Химия, 1974.392 с.

274. Перепелкин К.Е., Теплоухова М.В. и др. Кинетика сорбции десорбции влаги химическими и натуральными волокнами и нитями // Хим. волокна.-1995. -№4. -С.23-26.

275. Дрейнер Н., Смит Г. Прикладной регрессионный анализ,- М.: Статистика, 1973.-392 с.

276. Блинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. М.: Высшая школа, 1984.- 256 с.

277. Полимеры в фармации / Под ред. А.И.Тенцовой, М.Т.Алюшина.- М.: Медицина, 1985.

278. Pao Ч.Н.Р. Электронные спектры в химии. М.: Мир, 1964.-264 с.

279. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М.: Мир, 1976.- 541 с.

280. Целлюлоза и ее производные / Под ред. Н.Байклза и Л.Сегала. Пер. под ред. З.А.Роговина.- М.: Мир, 1974.- Т.1.- 500 с.

281. Липатов Ю.С. Физико-химические основы наполнения полимеров.- М.: Химия, 1991.

282. Кулезнев В.Н. Смеси полимеров. М.: Химия, 1980.- 304 с.

283. Многокомпонентные полимерные системы / Под ред. Р.Ф.Голда.- М.: Химия, 1974.

284. Власов C.B., Калинчев Э.Л., Кандырин Л.Б. и др. Основы технологии переработки пластмасс / Под ред. Кулезнева В.Н., Гусева В.К. М.: Химия, 1995,- 526 с.

285. Кильдеева Н.Р., Трусова С.П., Пилевская Н.С., Вирник А.Д. Свойства композиций на основе поливинилового спирта, содержащих биологически активные вещества, и пленок из них // Хим. волокна.- 1994.- №2.- С.23-24.

286. Мидлман С. Течение полимеров / Пер. Ю.Н.Панова под ред. А.Я.Малкина. -М.: Мир, 1971.-259 с.

287. Агеев Е.П., Секачева Н.В. Автоколебательный режим проницаемости и селективности асимметричной мебраны из поливинилтриметилсилоксана //Высокомол. соед,- 1985.- Т. 27 Б,- №3,- С.163-164.

288. Сапежинский И.И. Биополимеры. Кинетика радиационных и фотохимических превращений. М.: Наука, 1988.- 216 с.

289. Тимофеев-Ресовский Н.В., Савич A.B., Шальнов М.И. Введение в молекулярную радиобиологию,- М.: Медицина, 1981.- 320 с.

290. Вирник Р.Б., Рыльцев В.В., Власов Л.Г., Довбий Е.В., Калашник А.Т. Действие у-облучения на трипсин, иммобилизованный на диальдегидцеллю-лозе // Прикл. биохимия и микробиология. 1983,- Т. 19,- №4.- С.533-536.

291. Рыльцев В.В., Вирник Р.Б., Довбий Е.В., Филатов В.Н. Превращение свободных радикалов в у-облученных ферментах при длительном хранении // Радиобиология,- 1988,- Т.38,- №5.- С.584-587.

292. Ершов Б.Г., Исакова О.В. Образование и термические превращения радикалов в у-облученной целлюлозе // Изв. АН СССР. Сер. Химическая,-1984.-№6.- С.1276-1280.

293. Ершов Б.Г., Исакова О.В., Матюшкина Е.П., Самуйлова С.Д. Механизм радиационно-химических превращений целлюлозы // Химия высоких энергий,- 1986.- Т.20.- №12.- С. 142.

294. Эмануэль Н.М., Бучаченко A.A. Химическая физика старения и стабилизации полимеров,- М.: Наука,- 1982.- С.89, 101.

295. Миланчук В.К., Клиншпонт Э.Р., Пшежецкий С.Я. Макрорадикалы.- М.: Химия, 1980.

296. Программное обеспечение 1. Microsoft Excell, сер. №33697-ОЕМ-0028056-60567.