Получение и свойства полимерных композиций и пленочных материалов на основе поливинилового спирта, содержащих протеазу С и полигексаметиленгуанидин тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ



На правах рукописи

11 Алешина Елена Юрьевна

ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ПОЛИМЕРНЫХ КОМПОЗИЦИЙ И ПЛЕНОЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА, СОДЕРЖАЩИХ ПРОТЕАЗУ С И ИОЛИГЕКСАМЕТИЛ ЕНГУАНИДИН

(02.00.06 - Высокомолекулярные соединения)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2003

Работа выполнена на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета имени А.Н. Косыгина

Научный руководитель: доктор химических наук

профессор Гальбрайх Л.С.

Официальные оппоненты: доктор химических наук

йрофессор Штильман М.И. доктор химических н&ук Кильдеева Н.Р.

Ведущая организация: Центр "Биоинженерия" АН РФ.

* ь - .

Защита состоится "_" :_2003 г. в_час_мин на заседании дис-

- сертационного совета Д 212.139.01 в Московском государственном текстильном университете им. А.Н. Косыгина по адресу: 119991, Москва, М. Калужская, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного текстильного университета им. А.Н. Косыгина

Автореферат разослан "_"_2003 года

Ученый секретарь диссертационного й совета _у?^С\ д.х.н. Зубкова Н.С.

¿сау

Актуальность проблемы. Стремительно растущий уровень медицинских технологий является движущей силой развития смежных отраслей науки и техники, в частности химии биополимеров. Успех многих хирургических операций, особенно заканчивающихся дерматопластикой, во многом зависит от послеоперационного ухода за раной, т.е. от качества перевязочных средств, функции которых в настоящее время значительно расширились и заключаются не только в защите раны от внешних воздействий. В связи с этим задача создания раневых покрытий, обладающих комбинированным лечебным действием, одним из наиболее перспективных типов которых являются покрытия на основе синтетических и натуральных полимеров, содержащие иммобилизованные ферменты и антимикробные или иные лекарственные вещества, уже на протяжении многих лет остается актуальной.

Сложность одновременной иммобилизации фермента и биологически активного вещества другой химической природы, в частности антимикробного, заключается в возможности инактивации протеазы. В этой связи большой интерес представляет использование мягких способов иммобилизации, к числу которых относятся комплексообразование с полиэлектролигами. Исследование закономерностей формирования структуры и взаимосвязи состава, структуры и свойств полимерных композиций, содержащих фермент и биологически активное вещество другого типа, позволит разработать способы получения полимерных материалов с комплексным биологическим действием и расширить арсенал имеющихся перевязочных средств.

Цель работы заключалась в разработке научных принципов создания пленочных материалов с протеолитическим и антимикробным действием и изучении физико-химических и медико-биологических свойств созданных раневых покрытий.

В соответствии с поставленной целью были поставлены следующие задачи:

• изучить процесс комплСКсообразования между протеолитическим ферментом протеазой С и полиэлектролитами (альгинатом натрия и солями полигексаме-тиленгуанидина) в водной среде;

• исследовать влияние степени ионизации и молекулярной массы полимерного антимикробного вещества, а также состава полимерной композиции на активность, стабильность и рН-оптимум протеолитического фермента;

• изучить влияние введения добавок биологически активных и модифицирующих веществ на реологические свойства формовочных композиций;

• изучить влияние состава формовочных растворов на специальные свойства поливинилспиртовых пленок, содержащих протеазу С, полимерное антимикробное вещество и модифицирующие добавки: кинетику десорбции антимикробного вещества и инактивации иммобилизованной протеазы С, устойчивость к стерилизации и физико-химические свойства;

• изучить медико-биологические свойства материалов с комплексной биологической активностью. ■

Научная новизна. В работе впервьк^ОС НАЦИОНАЛЬНА» | г*

Т ВНМИОТЕКА I

• сформулированы представления о закономерностях интерполимерной реакции в многокомпонентных водных растворах, содержащих биологически активные вещества различного строения, как реакции замещения, при протекании которой состав и свойства образующихся комплексов, содержащих про-теазу С, определяются степенью ионизации полимерного поликатиона, его молекулярной массой и соотношением компонентов;

• установлено влияние введения фермента, антимикробного вещества и сшивающего реагента на структуру растворов поливинилового спирта и, как следствие, на их вязкость и энергию активации вязкого течения, обусловленные особенностями конформации как индивидуальных компонентов, так и их комплексов и химическими реакциями, протекающими в системе;

• показана возможность регулирования показателей активности и стабильности иммобилизованной в поливинилспиртовой пленке протеазы С и кинетики десорбции биологически активных веществ за счет изменения состава формовочных композиций и структуры пленки;

• установлен колебательный характер кинетических кривых паропропускания через пленки, содержащие иммобилизованные биологически активные вещества, свидетельствующий о наличии в их структуре внутренних напряжений.

Практическая значимость. Показаны пути регулирования биологических (протеолитической и антимикробной активности) и физико-механических (степени набухания и паропроницаемости) свойств поливинилспиртовых пленочных материалов с пролонгированным действием. Полученные данные о способах получения и свойствах полимерных композиций, содержащих протеазу С и полиэлектролиты, являются основой для создания полимерных пленочных материалов медицинского назначения с заданным комплексом биологических свойств.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всероссийской научно-технической конференции молодых ученых "Современные проблемы аэрокосмической науки" (Жуковский, 1998 г.), 1-ой Всероссийской наручной конференции "Физико-химические процессы переработки полимеров" (Иваново, 1999 г.), Всероссийской научно-технической конференции "Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Москва, 1999, 2001 гг.), научной студенческой конференции "Актуальные проблемы разв1ггия текстильной промышленности" (Москва, 2000 г.), Международной конференции "Синергетика макромолекулярных иерархических структур" (Ташкент, 2000 г.), 2-ом Международном конгрессе "Молодежь и наука -третье тысячелетие"/ У8ТМ'02 (Москва, 2002 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой

литературы из 128 ссылок. Работа содержит 14 таблиц и 39 рисунков. * * *«

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании процесса образования и свойств интерполимерных комплексов полиэлектролитов (ПЭ) с ферментом в качестве компонентов полимерных систем были использованы:

• протеолитический фермент с коллагенолитической активностью протеаза С (ПР), представляющий собой комплекс протеаз с разными изоэлектрически-ми точками (ГОТ) от 4 до 10;

• полимерные антимикробные вещества (АМВ), перспективные с точки зрения пролонгированности антимикробного действия и низкой токсичности по сравнению с низкомолекулярными АМВ - соли полигексаметиленгуанидина (11ГМГ) - хлорид (ПГМГ(Х)) и фосфат (ПГМГ(Ф)); а в качестве низкомолекулярного лекарственного вещества - тетраборат натрия (ТБ);

• хорошо известные и используемые при получении медицинских средств полимеры - альгинат натрия (АЛГ) и поливиниловый спирт (ЛВС).

Взаимодействие фермента с ПЭ, имеющими в водных растворах различную степень ионизации (ИЭТ АЛГ рН 6,5, ПГМГ(Х) рН 6,7 и ПГМГ(Ф) рН 6,9), было изучено методами нефелометрии и потенциометрии. Показано, что при этом происходит изменение рН и мутности растворов, свидетельствующее о протекании в системе межмолекулярной реакции.

Данные нефелометрических исследований растворов, содержащих ПР и АЛГ или ПР и АМВ, свидетельствуют о разном характере протекания интерполимерной реакции (ИПР) и строении частиц комплекса, что объясняется разной природой ПЭ: в полимерной композиции с АЛГ наблюдается снижение интенсивности рассеянного светового потока вследствие компактизации частиц без фазового разделения системы; в композиции ПР и ПГМГ(Х)' происходит образование нерастворимого полиэлектролитного комплекса (ПЭК), при этом условия фазового разделения зависят от молекулярной массы (ММ) АМВ, степени ионизации поликатиона и состава композиции.

Реакции ПР с солями ПГМГ также протекают по-разному. При избытке в системе ПГМГ(Х) раствор полимерной композиции осветлялся до полного растворения осадка, а при избытке менее ионизированного ПГМГ(Ф) происходило фазовое разделение, что свидетельствует о лиофилизирующей роли первого и гидрофобизирующей второго. Полученные данные свидетельствуют о протекании в системе фермент - ПЭ конкурентных реакций, приводящих к образованию комплексов различного состава.

В результате интерполимерного взаимодействия происходит изменение активности и стабильности фермента. При увеличении количества АЛГ в полимерной композиции свыше 0,1 % относительная активность (ОА) возрастает, а стабильность практически не изменяется. При этом снижение Кин свидетельствует о стабилизации фермента в результате ИПР.

В сочетании ПР с поликатионом получены композиции с разными активностью и стабильностью. О А фермента повышалась с увеличением ММ ПГМГ(Х), а в наибольшей степени снижалась в системе с ПГМГ(Ф) (рис.

Изучение процесса инактивации ПР позволило сделать вывод о наличии в иммобилизованной ПР лабильной и стабильной форм. Эффективная константа инактивации фермента в композициях с солями ПГМГ повышалась на порядок по сравнению с этим показателем нативной ПР. Однако при определенном составе композиции содержание стабильной формы фермента удавалось повысить до 100%; остаточная активность во многих случаях была выше на 9-58%, а содержание стабильной формы выше на 5-58%, чем нативного фермента.

Эффективная константа инактивации стабильной и лабильной форм (рис.2) зависела от состава композиции и ММ АМВ, однако четкой зависимости характеристик иммобилизованной ПР от молекулярной массы поликатиона установить не удалось.

120

40 н-,-,-■--,-—,

О 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Содержание ПР, %

Рис. 1. Зависимость ОА фермента от состава полимерной композиции ПР-соль ПГМГ. Содержание в полимерной композиции, %: соль ПГМГ-0,1. ПР-ПГМГ(Х) - (1-3), ПР-ПГМГ(Ф)-(4). ММ ПГМГ(Х), кДа: 5 (1), 10 (2), 15 (3).

3 -] 2 -1 0

О 0,2 0,4 0.6 0,8 1 Содержание ПР,%

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Содержание ПР, %

Рис. 2. Зависимость эффективной Кии стабильной (а) и лабильной (б) форм иммобилизованной ПР от состава полимерных композиций. Содержание в полимерной композиции ПГМГ(Х)-1%. ММ ПГМГ(Х), кДа: 5 (1), 10 (2), 15 (3).

Отмечено сохранение высокого уровня относительной и остаточной активности комплекса с ПГМГ(Х) с ММ 10 к Да во всем исследуемом интервале содержания ПР и при содержании ПР свыше 0,7% - для комплекса с ПГМГ(Х) с ММ 15 кДа и тенденция увеличения К», стабильной формы фермента с повы-

шением его содержания в растворе. Вероятно, в результате изменения состава композиции происходит перестройка ПЭК, уменьшение жесткости связывания макромолекул фермента и повышение их конформационной лабильности. Кинетика инактивации ПР в композициях, содержащих ПГМГ(Ф), описывается кривыми с максимумом, что может являться свидетельством перестройки комплексов, сопровождающейся конформационными изменениями и повышением активности. Следует отметить, что в этом случае состав композиции незначительно влияет на ОА и остаточную активность фермента, что, возможно, объясняется небольшим числом связей между белковой глобулой и компактной макромолекулой ПГМГ(Ф).

При исследовании зависимости активности композиций ПР-соль ПГМГ от рН было установлено кардинальное изменение профиля действия фермента. Нативная ПР проявляет активность в широком интервале рН с оптимумом действия в щелочной области (рН 10). В результате комплексообразования фермент в полимерных композициях различного состава имеет в различной степени выраженные максимумы действия в области рН 6,7 - 8 и 10. Характер выявленных зависимостей свидетельствует о разрушении исходного и образовании нового ферментного комплекса. В то же время характер рН зависимости относительной активности композиций с участием ПГМГ(Ф) позволил предположить, что ком-плексообразование в рассматриваемом интервале концентраций не сопровождается образованием сильно отличающихся по строению комплексов, которые не претерпевают значительных конформационных изменений в исследуемом интервале рН.

Введение в раствор ПР-соль ПГМГ альгината приводит к фазовому разделению системы с одновременным повышением активности фермента в 1,3-1,45 раз. При этом зависимость ОА от содержания полианиона носила полимодальный характер.

Остаточная активность ПР значительно повышалась практически во всех случаях, особенно высокий ее уровень достигался при использовании ПГМГ(Х) с минимальной ММ или ПГМГ(Ф).

Стабильность трехкомпонентных композиций по сравнению с не содержащими АЛГ возрастала. Зависимость КШ1 стабильной формы фермента от содержания в композиции АЛГ (рис. 3) свидетельствует о сложном характере превращений в многокомпонентной системе, в различной степени отражающихся на активности и стабильности. Если при использовании в композиции в качестве АМВ ГЕГМГ(Ф) введение АЛГ однозначно позволяет существенно повысить стабильность фермента, то зависимость стабильности ПР от содержания полианиона для системы, включающей ПГМГ(Х), описывается полимодальной кривой. Полученные данные позволяют, таким образом, определить количество АЛГ, которое следует ввести в композицию для максимальной стабилизации фермента.

**

О 0,005 0,06 0,1 0,2 Содержание АЛ Г, %

Рис. 3. Зависимость эффективной Кш стабильной формы иммобилизованной ПР от состава полимерных композиций ПР - соль ПГМГ-АЛГ. ПР-111 МГ(Х)-АЛГ (1-3), ПР-ПГМГ(Ф)-АЛГ (4). Содержание в полимерной композиции, %: ГТР-0,1, АМВ-0,1. ММ ПГМГ(Х), кДа: 5 (1), 10 (2), 15 (3).

Были исследованы реологические свойства ПВС формовочных растворов, содержащих ПР, АМВ и другие добавки. Введение в раствор ПВС полимеров, термодинамически совместимых с ним, разрушает структуру исходного раствора и приводит к образованию новой. Для систем с ПГМГ(Ф) область неньютоновского течения достигается при более низких градиентах скорости сдвига, чем с ПГМГ(Х). Это подтверждает образование различной структуры в системах, отличающихся качественным составом. При введении в водно-спиртовой раствор ПВС добавок протеазы С, соли ПГМГ и АЛГ происходило снижение начальной вязкости и Еа вязкого течения в результате пластифицирующего действия белка и соли ПГМГ, которые разрушают систему водородных связей между его макромолекулами и разрыхляют молекулярную упаковку ПВС.

Важной характеристикой биологически активных формовочных композиций является стабильность иммобилизованного в их структуре фермента. Было установлено, что после инкубации формовочных композиций, содержащих фермент и антимикробное вещество, при температуре 37 °С через 24 часа активность ферментов составляет 31-80% от исходной, что на 8-54% больше, чем в композиции, не содержащей ПВС.

Изучение реологических свойств формовочных композиций, содержащих фермент, полимерное антимикробное вещество в терапевтически достаточных количествах и модифицирующие добавки, показало их пригодность для дальнейшей переработки в пленочный материал.

Кинетика инактивации фермента в сформованных ПВС пленках в отличие от кинетики инактивации в полимерных композициях не могла быть описана характерными для инактивации ферментов экспоненциальными уравнениями вследствие сложности происходящих в системе процессов. Остаточная активность ПР, иммобилизованной в структуре ПВС пленок с ПГМГ(Х), сохраняется примерно на том же уровне, что и в полимерной композиции (40-65%), а в композиции с ПГМГ(Ф) повышается примерно в 2 раза (табл. 1).

При изучении степени набухания пленочных материалов разного состава

установлены существенные отличия, являющиеся следствием изменения соотношения областей с различной степенью упорядоченности. Степень набухания пленок, содержащих ПГМГ(Х), в зависимости от ММ АМВ составляет 600690%, что значительно превосходит этот показатель пленок, в состав которых включен ПГМГ(Ф), степень набухания которых 380%. Введение полисахарида несколько нивелирует эту разницу, и степень набухания составляет 510%. Наблюдаемый факт указывает на формирование различной структуры пленочных материалов, определяющую роль в котором играет тип АМВ.

Таблица 1

Влияние состава формовочных композиций на свойства ПР, _иммобилизованной в структуре ПВС пленки_

№ п.п. 'Содержание в формовочной композиции, % О А, % Остаточная активность, % от введенной

ПР АМВ АЛГ ТБ, • 10"3

1 од - - - 93 56

2 0,07 ПГМГ(Х) 0,1 ММ 15 кДа - - 91 28

3 0,07 1 - 108 37

4 0,07 - 0,7 96 15

5 од ПГМГ(Х) 0,15 ММЮкДа - 0,7 69 40

6 0,1 - 1,3 73 32

7 0,1 2 0,7 87 22

8 0,1 ПГМЦФ) 0,1 - - 36 25

9 0,1 1 74 31

10 0,1 - 1,3 33 22

11 0,1 1 0,7, 51 87

*Содержание в формовочной композиции, %: ПВС-9, этанол-10.

Результаты исследований реологических характеристик дают основание полагать, что наличие разупорядоченных областей в структуре пленки с участием ПГМГ(Х), несмотря на ее большую равномерность, облегчает диффузию воды и приводит к увеличению степени набухания пленки по сравнению с пленкой, в составе которой находятся глобулярные макромолекулы ПГМГ(Ф), в меньшей степени разрушающие систему межмолекулярных связей. Введение ТБ в композицию, содержащую ПР и 111 МГ(Х), приводит к некоторому снижению степени набухания вследствие образования межмолекулярных сшивок.

Полученные пленки существенно различались по кинетике десорбции антимикробного вещества. Для установления максимально возможного количества выделяемого вещества с целью создания высокого градиента концентраций использовали динамическую модель. Повышение температуры с 15 до 37 °С также способствовало выделению полимерного АМВ: количество десорбиро-ванного вещества увеличивалось в 10 раз при прочих равных условиях. Согласно полученным данным (рис. 4), кинетика десорбции различных АМВ определяется как их ММ и особенностями конформации макромолекул, так и разме-

рами образующихся в системе комплексов и изменениями в структуре пленкообразующего полимера в результате протекания химических реакций.

Данные о влиянии состава композиции на десорбцию из пленок антимикробных веществ хорошо коррелируют с результатами анализа антимикробной активности, согласно которым пленки с ПГМГ(Ф) обладают более высокой активностью, а введение АЛГ приводит к снижению активности как тех так и других пленок в 2 раза.

Рис. 4. Кинетика десорбции АМВ из ПВС пленок разного состава. Содержание

в формовочной композиции, %: ПР-0,1; АМВ-0,1; АЛГ-1,0 (3,4); ТБ-0 (1,5,7), 0,710"3 (4, 6, 8), 1,310"3 (2). ММ ПГМГ(Х), кДа: 10 (7,8), 15 (5,6). ПГМГ(Ф)-(1-

Структура пленок разного состава была изучена методом электронной микроскопии. Пленка, содержащая протеазу С и ПГМГ(Х), в основном однородная и не имеет структурных особенностей за исключением небольшого количества выходящих на поверхность частиц сферической формы размером 5-10 мкм. В поверхностном слое пленки с ПГМГ(Ф) находятся скопления частиц комплекса разной формы размером 5-50 мкм и более, в различной степени погруженных в пленку. При включении в состав пленки АЛГ происходят значительные изменения ее структуры: в результате ИПР происходит перестройка комплекса, сопровождающаяся уменьшением размера частиц и появлением довольно крупных пор, неравномерно расположенных по площади, размером 5 -20 мкм.

При исследовании паропроницаемости пленок разного состава в условиях недостатка воды для всех пленок был обнаружен колебательный характер кинетических кривых изменения скорости паропропускания. Однако вид кривой и амплетуда колебаний зависели от характера добавок, введенных в пленку. Заметные отличия наблюдаются на начальном участке кривых: для ПВС пленки скорость паропропускания в этом интервале постепенно растет, д ля пленки, содержащей полимерные добавки, снижается. Очевидно, это связано с накоплением воды в аморфных областях полимера, сопровождающимся закрытием

0 1 2 3 4 5 Циклы десорбции (¡)

4).

пор. Это приводит к возрастанию внутренних напряжений, которые система снимает раскрытием пор, что на графиках выражается скачком скорости паро-пропускания.

Для пленок, содержащих АМВ и АЛГ, наблюдалось увеличение амплитуды колебаний скорости, что может являться результатом возрастания доли аморфных областей и образования более крупных пор. Наиболее существенное увеличение амплитуды обнаружено для пленок, содержащих ТБ (рис. 5). Очевидно, внутри- или межмолекулярные связи, образованные с участием ТБ, а также АЛГ и ПВС, создают дополнительные напряжения в пленке. Но поскольку связи являются термолабильными, то в результате их разрыва в условиях испытаний, скорее всего, и появляются резкие скачки на кинетических кривых ДАУ/Дт-т.

Время, мин

Рис. 5. Изменение скорости пропускания паров воды ПВС пленками, содержащими тетраборат натрия. 1-пленка 2; 2-пленка 4; З-пленка 10. Номера пленок соответствуют номерам табл. 1.

Релаксация внутренних напряжений в присутствии избытка воды приведет к исчезновению осциллирующего характера кинетических кривых.

Таким образом, колебательный характер процесса паропропускания является результатом наличия внутренних напряжений в пленках, что в конечном итоге выражается в нерегулярном процессе открытия и коллапса пор.

Было исследовано влияние иммобилизации ферментов в структуре полимерных матриц на положение температурного и рН-профиля действия. Согласно полученным данным, ойгимум ОА иммобилизованной протеазы С смещается из щелочной области в нейтральную. Однако фермент, включенный в структуру пленки и входящий в состав полимерных композиций, имеет разные рН-профили действия, что объясняется изменением состава формовочной композиции в процессе формования в результате испарения растворителя, а значит, и строения образующихся ферментсодержащих комплексов.

Значение оптимума активности фермента, иммобилизованного совместно с солями ПГМГ, определяется типом модифицирующих добавок, составом де-сорбируемых из матрицы комплексов, структурой полимерного носителя, а также доступностью активных центров фермента, связанного в комплекс и прочно фиксированного в структуре, пленки. ^

Протеаза С, иммобилизованная совместно в ПГМГ(Х), проявляет макси-

мальную активность при рН 8 (рис. 6), а иммобилизованного с ПГМГ(Ф) - в более широком интервале рН 7-8. В целом, сдвиг оптимума действия иммобилизованной протеазы С в нейтральную область, близкую к физиологическим значениям и рН гнойной раны, является положительным фактом.

Температурный оптимум действия иммобилизованной ПР увеличивается на 8-18 °С по сравнению с нативной лишь в случае совместной иммобилизации с ПГМГ(Ф), что, возможно, является результатом иммобилизации нерастворимых комплексов фермента в более плотной структуре пленки. В этом случае необходимая кинетическая гибкость макромолекул ПР и диффузия частиц комплекса в среду, содержащую субстрат, реализуется при более высокой температуре.

а б

рН рН

Рис. 6. рН-Профиль ферментативной активности ПВС пленок разного состава. Содержание в формовочной композиции, %: ПР-0,1; а) Ш МГ(Х)-0,1; 'АЛГ-1,0 (1,3); ТБ-0,310'3 (2,3), б)ПГМГ(Ф)-0,1; АЛГ-1,0 (1,2), 0 (3,4); ТБ-1,З Ю'3 (2,4). ММ ПГМГ(Х)-15 кДа.

Важной характеристикой материалов медицинского назначения является ,

их устойчивость к стерилизации. Установлено, что после стерилизации пленок, сбдержащих ПР и АМВ, ионизирующим излучением и последующем хранении в течение 2 лет при комнатной температуре активность в зависимости от со- |

става сохраняется на уровне 70- 80 %.

Выводы

С целью разработки принципов получения полимерных пленочных материалов с ферментативным и антимикробным действием исследовано влияние взаимодействия полимерных биологически активных веществ на структуру образующихся комплексов, формовочных композиций, структуру и фармакокине-тические свойства поливинилспиртовых пленок.

1. Методом нефелометрии и потенциометрии установлено протекание интерполимерной реакции в водных растворах, содержащих протеазу С, полигек-саметиленгуанидин гидрохлорид или полигексаметиленгуанидин фосфат и альгинат натрия и высказано предположение о протекании в многокомпо-

нентной полимерной композиции реакции замещения, обусловленной способностью полиэлектролитов участвовать в реакциях ионного переноса.

2. Показана зависимость процесса комплексообразования в исследуемой полимерной системе от степени ионизации антимикробного поликатиона.

3. Установлена зависимость относительной активности, стабильности и рН-профиля действия протеазы С, связанной в комплекс с антимикробным поликатионом, от типа соли полигексаметилекгуанидина, а также от состава полимерной композиции. Использование в составе композиции полигекса-метиленгуанидин гидрохлорида с молекулярной массой 10 кДа или полигек-саметиленгуанидин фосфата, а также введение наряду с полимерным антимикробным веществом альгината натрия позволяет получать биологически активные композиции с относительной активностью фермента не ниже 60% и с высоким уровнем стабильности.

4. Исследование реологических свойств формовочных композиций различного состава показало, что полимерные добавки (протеаза С, полигексаметилен-гуанидин гидрохлорид или полигексаметиленгуанидин фосфат, альгинат натрия) в растворе поливинилового спирта снижают его вязкость и энергию активации вязкого течения.

5. Установлена существенная зависимость активности, стабильности и кинети-' ки десорбции антимикробного вещества из пленок, содержащих комплекс

биологически активных веществ, от типа Антимикробного вещества и модифицирующих добавок. Снижение молекулярной массы, степени ионизации, введение тетрабората натрия приводит к увеличению количества десорбиро-ванного антимикробного вещества (с 10 до 100%). Дополнительное введение альгината или альгината и тетрабората натрия снижает количество десорби-рованного полимерного антимикробного вещества независимо от его типа.

6. Установлено изменение рН-профиля и сдвиг рН-оптимума действия иммобилизованной в структуре поливинилспиртовых пленок протеазы С в область более низких значений (рН 7-8,5) в результате комплексообразования фермента с поликатионным антимикробным веществом.

7. Разработан метод получения поливинилспиртового пленочного покрытия с пролонгированным биологическим действием, содержащего полимерные биологически активные вещества - фермент и антимикробное вещество и модифицирующие добавки - полисахарид и/или низкомолекулярный сшивающий реагент, с высокой стабильностью к радиационной стерилизации и последующему хранению в течение 2 лет.

8. Установлена возможность изменения в широких пределах фармакокинетиче-ских свойств (активности, стабильности и количества десорбированного антимикробного вещества) путем варьирования состава формовочной композиции, типа и молекулярной массы- антимикробного вещества и модифицирующей добавки, что создает предпосылки для получения поливинилспиртовых пленок, содержащих комплекс биологически активных веществ, в качестве раневых покрытий пролонгированного лечебного действия. Р*

9. В ходе медико-биологических испытаний in vitro показана зависимость антимикробной активности поливинилспиртовых пленочных материалов, содержащих протеазу С, соль полигексаметиленгуанидина и модифицирующие добавки, которая удовлетворительно коррелирует с кинетикой десорбции антимикробного вещества.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Скокова И.Ф., Талаленкова О.С., Алешина Е.Ю., Елфимова Г.С., Петрова Н.Е. Разработка биологически активных материалов различного назначения // Тез. докл. Всерос. конф. "Современные проблемы аэрокосмической науки" - Жуковский, 1998. - С. 95-96.

2. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Гальбрайх JI.C., Елфимова Г.С., Петрова Н.Е., Алешина Е.Ю. Свойства композиций, содержащих биологически активные вещества, и полимерных материалов, полученных на их основе // Хим. волокна. -1999. - № 4. - С. 32-38.

3. Skokova I.F., Yudanova T.N., Gal'braikh L.S., Elfimova G. S., Petrova N.V., Aleshina E.Yu. Properties of composites containing biologicaly active substances and the polymeric materials prepared from them // Fibre Chemistry. - 1999. - V. 31, №4,- P. 283-290.

4. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Алешина Е.Ю. Поливинилспиртовые покрытия, наполненные биологически активными веществами // Тез. докл. 1 Все, рос. науч. конф. "Физико-химические процессы переработки полимеров" -

. Иваново, 1999.-С.41.

5. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Алешина Е.Ю. Биологически активные пленочные материалы: особенности получения и свойства // Тез. докл. науч. студ. конф. "Актуальные проблемы развития текстильной промышленности" г Москва, 2000. - С. 34-35.

6. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Алешина Е.Ю., Гальбрайх U.C. Поливинилспиртовые пленочные материалы, содержащие биополимеры: получение и

\ свойства // Хим. волокна. - 2000. - № 5. - С. 39-43.

7. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Алешина Е.Ю., Гальбрайх JI.C. Полифункциональные биологически активные поливинилспиртовые пленочные материалы // Хим. волокна. - 2001. - № 1. - С. 19-22.

8. Алешина Е. Ю., Юданова Т.Н., Скокова И.Ф. Пленочные покрытия, содержащие полимерное антимикробное вещество // Тез. докл. Всерос. науч.-тех. конф. "Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Текстиль-99) - Москва, 2000. - С. 135-136.

9. Алешина Е. Ю., Юданова Т.Н., Скокова И.Ф. Получение и свойства формовочных растворов на основе поливинилового спирта, содержащих протеазу С и полигексаметиленгуанидин // Тез. докл. Всерос. науч.-тех. конф. "Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Текстиль - 2001) - Москва, 2002. - С.151.

10. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Алешина Е. Ю., Петрова Н.Е., Гальбрайх Л.С. Влияние структуры многокомпонентных полимерных растворов на свойства биологически активных пленок // Тез докл. Междунар. конф. "Синергетика макромолекулярных иерархических структур" - Ташкент, 2000. - С.58-59.

11. Алешина Е.Ю., Юданова Т.Н., Скокова И.Ф. Получение и свойства формовочных растворов на основе поливинилового спирта, содержащих протеазу С и полигексаметиленгуанидин // Хим. волокна. - 2001. - № 6. - С. 4-6.

12. Юданова Т.Н., Алешина Е.Ю., Саенко М.С., Гальбрайх Л.С. Надмолекулярная структура и свойства поливинилспиртовых пленок, содержащих комплекс биологически активных веществ // Хим. волокна. - 2003. - № 1. - С. 2427.

13. Алешина Е.Ю., Юданова Т.Н. Фармакокинетические свойства поливинилспиртовых пленок, содержащих протеазу С и полимерное антимикробное вещество // Тез. докл. 2-го Междунар. конг. "Молодежь и наука - третье ты-сячелетие'УУ8ТМ'02 - Москва, 2002. - С. 86.

Р 1 6 О 0 7

(£007

ИД №01809 от 17.05.2000

Подписано в печать 21.10.03 Сдано в производство 21.10.03 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ. Усл.печ.л. 1,0 Уч.-изд.л. 0,75 Заказ 460 Тираж 80

Электронный набор МГТУ, 119991, ул. Малая Калужская, 1

1 стр.

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Методы иммобилизации белковых веществ на полимерах-носителях для получения эффективных терапевтических систем.

1.2. Получение и свойства полимерных покрытий, содержащих иммобилизованные антимикробные вещества или ферменты, для хирургии и терапии.

1.3. Полиэлектролитные комплексы с участием белков.

2. Методический раздел.

3. Основные результаты и их обсуждение. * 3.1. Исследование взаимодействия между протеолитическим ферментом протеазой С, альгинатом натрия и антимикробным поликатионом в водных растворах.

3.2. Изучение взаимосвязи состава и свойств формовочных композиций на основе поливинилового спирта, содержащих биологически активные вещества и модифицирующие добавки.

3.3. Исследование влияния состава формовочных композиций на свойства поливинилспиртовых пленочных материалов, содержащих совместно иммобилизованные протеазу С, антимикробный поликатион и модифицирующие добавки.

-* Выводы.

Стремительно растущий уровень медицинских технологий является движущей силой развития смежных отраслей науки и техники, в частности химии биополимеров. Успех многих хирургических операций, особенно заканчивающихся дерматопластикой, во многом зависит от послеоперационного ухода за раной, т.е. от качества перевязочных средств, функции которых в настоящее время значительно расширились и заключаются не только в защите раны от внешних воздействий. В связи с этим задача создания раневых покрытий, обладающих комбинированным лечебным действием, одним из наиболее перспективных типов которых являются покрытия на основе синтетических и натуральных полимеров, содержащие иммобилизованные ферменты и антимикробные или иные лекарственные вещества, уже на протяжении многих лет остается актуальной. Целесообразность создания покрытий с таким комплексом свойств является патогенетически обоснованной, т.к. в первой фазе раневого процесса необходимо подавление воспаления и очищение раны от некротических масс. Преимущества иммобилизованных форм ферментов над нативными известны, наиболее важные из них - повышение стабильности и уменьшение иммунологической и аллергической реакций организма за счет понижения способности модифицированного фермента стимулировать образование антител и реагировать с ними [1].

Сложность одновременной иммобилизации фермента и биологически активного вещества другой химической природы, в частности антимикробного, заключается в том, что она может привести к инактивации протеазы. В этой связи большой интерес представляет изучение возможности использования мягких способов иммобилизации, к числу которых относятся комплексообразование с полиэлектролитами. Исследование закономерностей формирования структуры и взаимосвязи состава, структуры и свойств полимерных композиций, содержащих фермент и биологически активное вещество другого типа, позволит разработать способы получения полимерных материалов с комплексным биологическим действием и расширить арсенал имеющихся перевязочных средств.

Цель работы заключалась в разработке научных принципов создания пленочных материалов с протеолитическим и антимикробным действием, а также в изучении физико-химических и медико-биологических свойств созданных раневых покрытий.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- изучить процесс комплексообразования между протеолитическим ферментом протеазой С и полиэлектролитами (альгинатом натрия и солями полигексаметиленгуанидина) в водной среде;

- исследовать влияние степени ионизации и молекулярной массы полимерного антимикробного вещества, а также состава полимерной композиции на активность, стабильность и рН-оптимум протеолитического фермента;

- изучить влияние введения добавок биологически активных и модифицирующих веществ на реологические свойства формовочных композиций;

- изучить влияние состава формовочных растворов на свойства поливинилспиртовых пленок, содержащих протеазу С, полимерное антимикробное вещество и модифицирующие добавки: кинетику десорбции антимикробного вещества, кинетику инактивации иммобилизованной протеазы С, устойчивость к стерилизации и физико-химические свойства;

- изучить медико-биологические свойства материалов с комплексной биологической активностью.

При выполнении экспериментальной части работы были использованы химические методы анализа, спектрофотометрия, нефелометрический метод, метод потенциометрического титрования, реологический метод, электронная сканирующая микроскопия и медико-биологические исследования.

Научная новизна. В работе впервые:

• сформулированы представления о закономерностях интерполимерной реакции в многокомпонентных водных растворах, содержащих биологически активные вещества различного строения, как реакции замещения, при протекании которой состав и свойства образующихся комплексов, содержащих протеазу С, определяется степенью ионизации полимерного поликатиона, его молекулярной массой и соотношением компонентов;

• установлено влияние введения фермента, антимикробных веществ и сшивающего реагента на структуру растворов поливинилового спирта и, как следствие, их вязкость и энергию активации вязкого течения, обусловленные особенностями конформации как индивидуальных компонентов, так и их комплексов и химическими реакциями, протекающими в системе;

• показана возможность регулирования показателей активности и стабильности иммобилизованной в поливинилспиртовой пленке протеазы С и кинетики десорбции антимикробного вещества за счет изменения состава формовочных композиций и структуры пленки;

• установлен колебательный характер кинетических кривых паропропускания через пленки, содержащие иммобилизованные биологически активные вещества, свидетельствующий о наличии в структуре пленки внутренних напряжений.

Практическая значимость: показаны пути регулирования биологических (протеолитической и антимикробной активности) и физико-механических степени набухания, паропроницаемости) свойств поливинилспиртовых пленочных материалов с пролонгированным действием. Полученные данные о способах получения и свойствах полимерных композиций, содержащих протеазу С и полиэлектролиты, являются основой для создания полимерных пленочных материалов медицинского назначения с заданным комплексом биологических свойств.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура диссертации: диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части и обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 128 ссылок. Работа содержит 14 таблиц и 39 рисунков.

Выводы

С целью разработки принципов получения полимерных пленочных материалов с ферментативным и антимикробным действием исследовано влияние взаимодействия полимерных биологически активных веществ на структуру образующихся комплексов, формовочных композиций, структуру и фармакокинетические свойства поливинилспиртовых пленок.

1. Методом нефелометрии и потенциометрии установлено протекание интерполимерной реакции в водных растворах, содержащих протеазу С, по-лигексаметиленгуанидин гидрохлорид или полигексаметиленгуанидин фосфат и альгинат натрия и высказано предположение о протекании в многокомпонентной полимерной композиции реакции замещения, обусловленной способностью полиэлектролитов участвовать в реакциях ионного переноса.

2. Показана зависимость процесса комплексообразования в исследуемой полимерной системе от степени ионизации антимикробного поликатиона.

3. Установлена зависимость относительной активности, стабильности и рН-профиля действия протеазы С, связанной в комплекс с антимикробным поликатионом, от типа соли полигексаметиленгуанидина, а также от состава полимерной композиции. Использование в составе композиции полигексаметиленгуанидин гидрохлорида с молекулярной массой 10 кДа или полигексаметиленгуанидин фосфата, а также введение наряду с полимерным антимикробным веществом альгината натрия позволяет получать биологически активные композиции с относительной активностью фермента не ниже 60% и с высоким уровнем стабильности.

4. Исследование реологических свойств формовочных композиций различного состава показало, что полимерные добавки (протеаза С, полигексаметиленгуанидин гидрохлорид или полигексаметиленгуанидин фосфат, альгинат натрия) в растворе поливинилового спирта снижают его вязкость и энергию активации вязкого течения.

5. Установлена существенная зависимость активности, стабильности и кинетики десорбции антимикробного вещества из пленок, содержащих комплекс биологически активных веществ, от типа антимикробного вещества и модифицирующих добавок. Снижение молекулярной массы, степени ионизации, введение тетрабората натрия приводит к увеличению количества десорбированного антимикробного вещества (с 10 до 100%). Дополнительное введение альгината или альгината и тетрабората натрия снижает количество десорбированного полимерного антимикробного вещества независимо от его типа.

6. Установлено изменение рН-профиля и сдвиг рН-оптимума действия иммобилизованной в структуре поливинилспиртовых пленок протеазы С в область более низких значений (рН 7-8,5) в результате комплексообразования фермента с поликатионным антимикробным веществом.

7. Разработан метод получения поливинилспиртового пленочного покрытия с пролонгированным биологическим действием, содержащего полимерные биологически активные вещества - фермент и антимикробное вещество и модифицирующие добавки - полисахарид и/или низкомолекулярный сшивающий реагент, с высокой стабильностью к радиационной стерилизации и последующему хранению в течение 2 лет.

8. Установлена возможность изменения в широких пределах фармакокинети-ческих свойств (активности, стабильности и количества десорбированного антимикробного вещества) путем варьирования состава формовочной композиции, типа и молекулярной массы антимикробного вещества и модифицирующей добавки, что создает предпосылки для получения поливинилспиртовых пленок, содержащих комплекс биологически активных веществ, в качестве раневых покрытий пролонгированного лечебного действия.

9. В ходе медико-биологических испытаний in vitro показана зависимость антимикробной активности поливинилспиртовых пленочных материалов, содержащих протеазу С, полигексаметиленгуанидин и модифицирующие добавки, от их состава, которая удовлетворительно коррелирует с кинетикой десорбции антимикробного вещества.

1. Платэ Н.А., Валуев Л.И. Проблемы создания биоспецифических синтетических полимеров для контакта с биологическими средами // ЖВХО им. Д.М.Менделеева. 1985. - Т. 30, № 4. - С. 402-410.

2. Иозеп А.А., Пассет Б.В. Модификация биологически активных веществ полисахаридами // Тез. докл. 2 Росс. нац. конгресса " Человек и лекарство " -М.: Фармединфо, 1996. С. 24.

3. Кричевский Г.Е., Савилова Л.Б., Олтаржевская Н.Д. и др. Новая технология получения текстильных материалов с пролонгированным лечебным действием // Текстильная химия. 1992. - № 1. - С. 91-100.

4. Введение в прикладную энзимологию. / Под ред. Березина И.В., Мартинека К.М. М.: Изд-во МГУ, 1982. - 384 с.

5. Биополимеры / Пер. с яп. Т. Оои, Э. Ицука, С. Онари и др. : Под ред. Кор-шака В.В., Ямскова И.А. М.: Мир, 1988. - 544 с.

6. Николаев А.Ф., Мосягина Л.П. Поливиниловый спирт и сополимеры винилового спирта в медицине // Пластические массы. 2000. - № 3. -С. 34-42.

7. Полищук А.Я., Заиков Г.Е., Мадюскин Н.Н. Биоразлагаемые полимеры и их применение в современной медицине // Пластические массы. -2000. № 2. - С. 28-33.

8. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Вирник А.Д. и др. Непрерывные способы иммобилизации террилитина на целлюлозных волокнистых материалах // Биотехнология. 1985. - № 6. - С. 98-102.

9. Юданова Т.Н., Высоцкая Е.П., Семенов В.И. и др. Целлюлозные биосорбенты // Тез. докл. республиканской науч.-практ. конф. "Синтез и применение энтеросорбентов" Конаково, 1990. - С. 35.

10. Elcin J. Murat, Sacar Mehmet. Acrylamid grafted poly (ethylene Terepthalate) fibers activated by glytaraldehyde as support for urease // Appl. Biochem. and Biotechnol. a. 1996. - V. 60, № 1. - P. 19-32.

11. Володькин Д.В, Балабушевич Н.Г., Сухорукое Г.Б., Ларионова Н.И. Иммобилизация протеиназ в полиэлектролитные микрочастицы // Тез. докл. и стендовых сообщений V Симпозиума "Химия протеолитических ферментов" -М.,2002.-С. 119.

12. Plate N., Valuev L., Valuev J. Polymeric Carriers: a Breakthrough in Pharmacopeia // Jornals of Jornals: Rev. glob. Sci. Acbiev. 1997. - № 1. - P. 3740.

13. Бронин А.С., Кудрявцева Н.Е. и др. Новый метод включения протеолитических ферментов в гидрогели И Тез. докл. 3 Симпозиума "Химия протеолитических ферментов"- М., 1993. С. 117.

14. Марквичева Е.Н., Купцова С.В., Струкова С.М. и др. Иммобилизованные в гидрогели протеиназы для биотехнологии и медицины // Тез. докл. и стендовых сообщений V Симпозиума "Химия протеолитических ферментов" М., 2002. - С. 42.

15. Kato К., Furukawa М., Kanzaki Y. et al. Lysocym loading in phosphate-carrying hydrogels at high density and the controlled relase of lysocyme // Jap. J. Polym. Sci. and Technol. 1998. - V. 55, - № 6. - P. 353-358.

16. Артюхов A.A., Козлов B.C., Штильман М.И., Тсатсакис A.M. Эпоксидсо-держащие полимерные носители для иммобилизации белков // Материалы 1-го Междунар. Конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития" - М., 2002. - С. 454.

17. Ни Z.B., Wang С.J., Nelson K.D., Eberhart R.C. Controlled release from a composite silicone/hydrogel membrane // Asaio Journal. - 2000. - V. 46, - № 4. - P. 431-434.

18. Пат. 2157243 РФ, МКИ6 A 61 L 15/22. Гидрогелевая композиция и перевязочные средства из нее для лечения ран различной этиологии / Валуев Л.И., Сытов Г.А., Адамян А.А., Добыш С.В. и др.; Опубл. 10.10.2000, Бюл. № 28.

19. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. Спб.: Гиппократ, 1993. - 264 с.

20. Комиссарова А.Л., Скокова И.Ф., Вирник А.Д. и др. Получение пористого материала на основе альгиновой кислоты, содержащего иммобилизованный террилитин // Антибиотики и химиотерапия. 1988. - № 10. - С. 735-739.

21. Вихорева Г.А., Хомяков К.П., Гальбрайх Л.С. и др. Иммобилизация протеолитических ферментов в пленках и губках карбоксиметилхитина // Хим. волокна. 1995. - № 5. - С. 34-37.

22. Биологически активные вещества в растворах / Под ред. Кутепова А.Н. -М.: Наука, 2001. С. 389-393.

23. Petach Helen Н., Henderson William, Olsen Gregory M. P(CH2OH)3 a new coupling reagent for the covalent immobilization of enzymes // Y. Chem. Soc. Chem. Commun. -1994. -№ 18. - P. 2181-2182.

24. Choi Y.S., Hong S.R., Lee Y.M., Song K.W. at al. Study on Gelatin -containing artificial scin I- preparation and characterizations of novel Gelatin -Alginate sponge //Biomaterials. - 1999. - V. 20, № 5. - P. 409-417.

25. Беидикене В., Юодка Б. Иммобилизация сериновых протеаз на магнитных носителях // Тез. докл. 3 Симпозиума "Химия протеолитических ферментов" -М., 1993.-С. 119.

26. Howell Nazlin К., Yeboah Nana A. et al. Studies on the electrostatic interactions of lysozyme with a- lactalbumin and P- lactalbumin // Int. J.Food Sci. and Technol. 1995. - V. 30, № 6. - P. 813-824.

27. Yamaoka Т., Takebe Y. Surface modification of poly (1-lactic acid) filme with, bioactive materials by a novel directed alkaline treatment process // Jap. J. Polym. Sci. and Technol. -1998. V. 55, № 6. - P. 328-333.

28. Пат. 275662 Словакия, МКИ5 С 12 N 11/04. Носитель для стабилизации ферментов и способ его получения / Кунак Людовит, Матусова Анжелла; Опубл. 1992.

29. Аксенова Н.И., Харенко А.В., Кеменова В.А. Гранулирование композиционного полимерного носителя КПН-2 в "псевдоожиженном слое" // Тез. докл. 2 Росс. нац. конгресса "Человек и лекарство" М.: Фармединфо, 1996. - С. 25.

30. Мороз Н.А., Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И., Кильдеева Н.Р. и др. Локальные антипротеиназные пролонгированные системы // Тез. докл. и стендовых сообщений IV Симпозиума "Химия протеолитических ферментов." -М.: 1997. С. 122.

31. Вирник А.Д., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б. и др. Иммобилизация ферментов в структуре волокон и пленок в процессе их формования // Биотехнология. 1987. - Т. 3, № 5. - С. 602-611.

32. Гидрофильные полимеры медицинского назначения: Сб. науч. тр. / Под ред. Розенберга М.Э. Л.: ОНПО "Пластполимер", 1989. - 84 с.

33. Ухарцева И.Ю. Влияние температурных воздействий на структуру и физико-механические свойства наполненных гелей поливинилового спирта // Пластические массы. 2002. - № 8. - С. 15-17.

34. Хомяков К.П., Кильдеева Н.Р., Богомольный В .Я. и др. Терриплен фер-ментсодержащая пленка из поливинилового спирта для лечения гнойных ран // Гидрофильные полимеры мед. назначения. - Л., - 1989. - С. 49-53.

35. Беляцкая О.Н.,Булатинкова Л.И., Быкова Л.В. Влияние температурно-временных воздействий на процесс модификации поливинилового спирта // Пластические массы. 1995. -№ 6. - С. 16-18.

36. Заявка 717689 Франция, МКИ6 А61К9/70, 31/565. Трансдермальная матрица для экстрогенов и/или прогестагенов на основе сополимеров стирол -изопрен стирол / Мидлер Кпауль, Ларсон Ларент, Майер Давель; Опубл. 1995.

37. Пат. 1674552 РФ, МКИ6 С 08 L 29/04. Пленочная антимикробная композиция / Паутов В.Д., Ануфриева Е.В., Краковяк М.Г., Лущик В.Б. и др.; Опубл. 20.05.96, Бюл. № 14.

38. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н. и др. Получение пленок с комбинированным биологическим действием и применение их для лечения гнойных и ожоговых ран // Прикл. биохим. и микробиол. 1997. - Т. 33, № 4. - С. 428-433.

39. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н. Разработка волокнистых материалов с комбинированным биологическим действием на основе полиэлектролитных комплексов // Хим. волокна. 1995. - № 5. - С. 10-21.

40. Suzuki Y., Tanihara М., Nishimura Y., suzuki К. et al. A novel wound dressing with an antibiotic delivery system stimulated by microbial infection //

41. Asaio Journal. 1997. - V. 43, № 5. - P. M854-M857.

42. Пат. 2174847 РФ, МКИ6 A 61 L 15/44. Повязка для лечения ран / Чиссов В.И., Решетов И.В., Юданова Т.Н., Скокова И.Ф.; Опубл. 20.10.2001, Бюл. № 29.

43. Вирник А.Д., Гостищев B.K., Кильдеева H.P. и др. Получение пленок и волокон, содержащих протеолитические ферменты // Прикладная биохимия и микробиология. 1987. - Т. 23. - С. 78-83.

44. Пат. 2180856 РФ, МКИ6 А 61 L 15/28. Средство для лечения ран / Гаври-люк Б.К., Гаврилюк И.Б.; Опубл. 27.03.2002, Бюл. № 9.

45. Пат. 2193896 РФ, МКИ6 А 61 L 15/28. Покрытие для ран / Гаврилкж Б.К., Гаврилюк В.Б.; Опубл. 10.02.2002, Бюл. № 34.

46. Пат. 2127609 РФ, МКИ6 А 61 L 15/38. Перевязочный материал / Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В., Медушева Е.О., Филатов В.Н. и др.; Опубл. 20.03.99,Бюл. №8.

47. Ларионова А. С., Журавлева Е. М., Кильдеева Н.Р. и др. Ферментсодер-жащие высоконабухающие хитозановые пленки // Материалы 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана" М. - Щелково: Центр "Биоинженерия" РАН - ВНИРО, 1999. - С. 273-276.

48. Кильдеева Н.Р., Вихорева Г.А., Ларионова А.С., Гальбрайх Л.С. Перспективы использования хитозана для создания терапевтических систем // Тез. докл. Междунар. конф. "Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов" Минск, 1998. - С. 14.

49. Mi F.L., Wu Y.B., Shyu S.S., Schoung J.Y. et al. Control of wound infections using a bilayer chitosan wound dressing with sustainable antibiotic delivery // Journal of Biomedical Materials Research. 2002. - V. 9, № 3. - P. 438-449.

50. Loke W.K., Lau S.K., Yong L.L., Khor E. et al. Wound dressing with sustained antimicrobial capability // Journal of Biomedical Materials Research. 2000. - V. 53, №1.- P. 8-17.

51. Kim H.J., Lee H.C., Oh J.S., Shin B.A. et al. Polyelectrolyte complex composed of Chitosan and sodium Alginate for wound dressing application // Journal of Biomaterials Science- Polymer Egition. 1999. - V. 10, № 5. - P. 543-556.

52. Wang L.H., Khor E., Wee A., Lim L.Y. Chitosan- Alginate PEC membrane as a wound dressing assessment of incisional wound healing // Journal of Biomedical Materials Research. 2002. - V. 63,№ 5. - P. 610-618.

53. Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И. и др. Пролонгированные лекарственные средства различного назначения, содержащие белковый ингибитор протеаз //

54. Тез. докл. 2 Росс. нац. конгресса "Человек и лекарство" М.: Фармединфо, 1996.-С. 24.

55. Панкрашева Т.А., Ерофеева Л.Н. К вопросу о более широком использовании производных целлюлозы в производстве лекарственных средств // Тез. докл. 2 Росс. нац. конгресса "Человек и лекарство" М.: Фармединфо, 1996. -С. 33.

56. Кильдеева Н.Р., Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф. и др. Иммобилизация модифицированного а-химотрипсина в структуре пленок из триацетата целлюлозы // Биохимия. 1980. - Т. 45. - С. 433-437.

57. Пат. 2158112 РФ, МКИ6 А 61 L 15/38. Способ кожной пластики / Дуван-ский В.А., Рыльцев В.В., Толстых М.П., Филатов В.Н. и др. Опубл. 27.10.2000, Бюл. № 14.

58. Пат. 2099095 РФ, МКИ6 А 61 L 15/38. Способ получения перевязочного материала для лечения рубцов / Стекольников Л.И., Корнилова Е.Г.; Опубл. 20.10.97, Бюл. № 35.

59. Пат. 2142818 РФ, МКИ6 А 61 L 15/32. Способ получения перевязочных материалов "Салфеток Филатова-Рыльцева" / Филатов В.Н., Рыльцев В.В.; Опубл. 20.12.99, Бюл. № 35.

60. Пат. 2062113 РФ, МКИ6 А 61 L 15/38. Способ получения перевязочных материалов / Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Гостищев В.К., Ханин А.Г., Качу-рина Н.В.; Опубл. 20.06.96, Бюл. № 17.

61. Пат. 2055600 РФ, МКИ6 А 61 L 15/44. Способ получения перевязочного материала для лечения ран и ожогов / Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Брейтман Р.Ш.; Опубл. 10.03.96, Бюл. № 7.

62. Пат. 2154497 РФ, МКИ6 А 61 L 15/32. Средство для лечения ран / Адамян А.А., Голованова П.М., Добыш С.В., Кочергина Л.Д. и др.; Опубл. 20.08.2000, Бюл. №23.

63. Пат. 2143925 РФ, МКИ6 А 61 L 15/32. Ранозаживляющее покрытие / ЛукмановаК.А., Алсынбаев М.М., Истранов Л.П., Истранова Е.В. и др.; Опубл. 10.01.2000, Бюл. № 1.

64. Пат. 2127128 РФ, МКИ6 Д 61 L 15/32. Способ получения раневого покрытия "Дигистол" / Истранов Л.П., Абоянц Р.К., Соловьева Н.И., Шехтер А.Б.; Опубл. 10.03.99,Бюл. № 7.

65. Grzybowski J., Kolodziej W., Trafiiy E.A., Struzyna J. New antiinfective collagen dressing containing antibiotics // Journal of Biomedical Materials Research. 1997. - V. 36, № 2. - P. 163-166.

66. Пат. 2031661 РФ, МКИ6 А 61 L 15/22. Средство для лечения ран и оказания первой медицинской помощи / Адамян А.А., Полевов В.Н., Килимчук Л.Е., Добыш С.В. и др.; Опубл. 27.03.97, Бюл. № 9.

67. Пат. 2120306 РФ, МКИ6 А 61 L 15/22. Средство для лечения ран и ожогов / Беленькая В.Г., Полевов В.Н., Адамян А.А., Сахарова В.И. и др.; Опубл. 20.10.98, Бюл. №29.

68. Чухаджян А.Г., Чухаджян Г.А. и др. Синтетическое пленочное покрытие "Диплен" // Тез. докл. II Междунар. конф. "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантантов" М., 1995. - С. 144-146.

69. Васильев А.Е., Платэ Н.А. Трасдермальные терапевтические системы: от замысла до завода // Тез. докл. 9 Всес. науч. симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения" Звенигород, 1991. - С. 4.

70. Чудина О.Д., Парий И.В., Степанова Ж.В. Лекарственный пластырь с си-лафунгином длительного непрерывного действия // Тез. докл. 9 Всес. науч.симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения" Звенигород, 1991. -С. 70.

71. Tsunoda М., Sato Н., Yamada К., Noguchi Н. Preparation of a new wound dressing composed of a polyurethane film which is impregnated silver sulfur diazine, and nonwoven fabric // Nippon Kagaku Kaishi. 1998. - № 3.1. P. 767-773.

72. Васильев A.E., Давыдов А.Б. Макромолекулярные терапевтические системы: проблемы и перспективы //ЖВХО им. Д.И. Менделеева. 1985. - Т. 30, № 4. - С. 395-402.

73. Пат. 1080447 РФ, МКИ5 С 08 L 29/04. Антимикробный пленочный материал / Богомольный В .Я., Афиногенов Г.Е., Соловский М.В., Войтко Н.П. и др.; Опубл. 20. 05. 95, Бюл. № 14.

74. Пат. 2191034 РФ, МКИ7 А 61 L 15/20. Гелеобразная лекарственная форма / Самченко Ю.М., Ульберг З.Р., Комарский С.А.; Опубл. 20.10 2002, Бюл. № 29.

75. Пат. 2093190 РФ, МКИ6 А 61 L 15/22. Перевязочный материал / Алэн Гийеме (Франция), Филипп Жанод (Франция); Опубл. 20.10.97, Бюл. № 29.

76. Пат. 2115436 РФ, МКИ6 А 61 L 15/24. Средство для лечения ран / Адамян

77. A.А., Кузнецова В.А., Розенберг М.Э., Добыш С.В., Кочергина Л.Д. и др.; Опубл. 20.07.98, Бюл. № 20.

78. Пат. 1126131 Япония / Такахара Хидэаки. Фиксация ферментов на полимерной пленке; № 52-139777(1977) / РЖ Биохим., 1979.

79. Пат. 2106154 РФ, МКИ6 А 61 L 15/32. Перевязочный материал / Мензул

80. B.А.; Опубл. 10.03.98, Бюл. № 7.

81. Gao J., Dubin P., Muhoberac В. Capillary electrophoresis and Dynamic light Scattering studies of Structure and binding Characteristics of Protein-Polyelectrolyte Complexes // J. Phys. Chem. B. 1998. - № 102 - P. 5529-5535.

82. Кабанов B.A., Зезин А.Б., Изумрудов B.A. Синтетические полиэлектролиты как регуляторы ферментативных реакций // Итоги науки и техники в кн.: Биотехнология / Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. М.: Высшая школа. - 1987.-Т. 4.-С. 159-192.

83. Зезин А.Б., Кабанов В.А. Новый класс комплексных водорастворимых полиэлектролитов // Успехи химии. 1982. - № 9. - С. 1447-1483.

84. Izumrudov V.A. Completitive eactions in solutions of protein-polyelectrolyte complexes //Ber. Dunsenges. Phys. Chem. 1996.- V. 100, № 6. - P. 1017-1023.

85. Изумрудов B.A., Лим C.X. Контролируемые фазовые разделения в растворах комплексов полиметакрилатного аниона и глобулярных белков // Высокомолекулярные соединения. Сер. А. 2002. - Т. 44, № 5. - С. 793-801.

86. Howell N.K., Yeboah N.A., Levis F.V. Studies on the electrostatic interactions of lysozyme with a-lactalbumin and P-lactalbumin // Int.y. Food Sci. and Technol. -1995. V. 30, № 6. - P. 813-824.

87. Бессмертная Л.Я., Козлов Л.В., Антонов B.K. Причины изменения стабильности а-химотрипсина при модифицировании полиэлектролитами // Биохимия. 1977. - Т. 42, - вып. 10. - С. 1825-1834.

88. Yamauchi Т., Wang N., Shimomura M., Miyauchi S. Covalent immobilization of glucose oxidase on cation- and anion- exchange resins // Jap.J. Polym. Sci. and Technol.- 1998. V. 55, № 7. - P. 373-377.

89. Кольцова C.B., Глинкина M.B., Самсонов Г.В. Осаждение трипсина по-лиметакриловой кислотой // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1975. - Т. 8. - С. 18951896.

90. Кольцова С.В., Илларионова Н.Г., Панарин Е.Ф., Рудковская Т.Ф., Самсонов Г.В. Растворимые комплексы трипсина с синтетическими полиоснованиями // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1975. - № 3. - С. 643-649.

91. Кабанов В.А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов // Высокомолекулярные соединения. 1994. - Т. 36, № 2. - С. 183.

92. Стрельцова З.А. Свойства белков в комплексе с кислыми полисахаридами и другими полиэлектролитами / Автореф. дис. канд. хим. наук М.: 1975. - 22 с.

93. Панарин Е.Ф., Копейкин В.В. Биологическая активность синтетических полиэлектролитных комплексов ионогенных поверхностно-активных веществ // Высокомолекулярные соединения. Сер. С. 2002. - Т. 44, № 12. - С. 23402351.

94. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н. Интерполиэлектролитная реакция — метод получения ферментсодержащих волокнистых материалов с регулируемым составом и свойствами // Текстильная химия. 1994. - № 1. -С. 5-20.

95. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н. Получение ферментсодержащих целлюлозных волокнистых материалов на основе привитых сополимеров, содержащих сульфогруппы // Хим. волокна. -1997. -№ 1. С. 10-13.

96. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н. Разработка волокнистыхматериалов с комбинированным биологическим действием на основе полиэлектролитных комплексов // Хим. волокна. -1995. № 5. - С. 10-20.

97. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз // Прикл. биохомия и микробиология. 1971. - Т. 7, № 2. - С. 225-227.

98. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: МГУ, 1976. 320 с.

99. Mandl I., M'Cleman J.D., Howes E.L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase from CI. Hystolicum // J. Clin. Invest. 1953. - V. 32. -P. 1323-1329.

100. Рабинович И.М. Применение полимеров в медицине. Ленинград: Медицина, 1972. - 197 с.

101. Практикум по высокомолекулярным соединениям / Под ред. Кабанова В .А. М.: Химия, 1985. - 223 с.

102. Методические указания к лабораторным работам по курсу "Химия и фи-зико-химия полимеров" / Под ред. Л.С. Гальбрайха М.: МТИ, 1990. - С. 3135.

103. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Харьков: Торсинг, 1997. -Т. 2. - 592 с.

104. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. М.: Фармединфо, 1995. - С. 178.

105. Экологически безопасные полимерные биоциды / Под ред. Гембицкого П.А. М.: ИЭТП, 2000. - 104 с.

106. Измайлова В.Н., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах. М.: Наука, 1974. - 268 с.

107. Кабанов В.А., Зезин А.Б., Изумрудов В.А. Синтетические полиэлектролиты как регуляторы ферментативных реакций. В кн. Итоги науки и техники. Биотехнология / Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. М.: Высшая школа, 1987.-Т. 4.-С. 159-192.

108. Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н. Химическая модификация как метод получения стабилизированных форм биокатализаторов. В кн. Итоги науки и техники. Биотехнология. Иммобилизация и стабилизация биокатализаторов. -М.: ВИНИТИ, 1986. Т. 5. - С. 5-49.

109. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров и свойства макромолекул. Л.: Наука, 1986. - 288 с.

110. Крестьянова И.Н., Луканин А.В., Писарев В.В. Протеаза С медицинская субстанция // Материалы 1-го Междунар. Конгресса "Биотехнология - состояние и перспективы развития" - М., 2002. - С. 69.

111. Харенко О.А., Харенко А.В., Калюжная Р.И. и др. Нестехиометричные полиэлектролитные комплексы новые водорастворимые макромолекуляр-ные соединения // Высокомолекулярные соединения. Сер. А. -1979. - Т. 21, № 12.-С. 2719-2725.

112. Изумрудов В.А., Коробко Т.А., Платонова О.А. Особенности комплексо-образования и конкурентных реакций в растворах полианионов, олигокатио-нов и анионов поверхностно-активного вещества // Вестник МГУ. Сер. хим. -1994. Т. 35, № 4. - С. 375-381.

113. Харенко О.А., Изумрудов В.А., Харенко А.В. и др. Процессы ассоциации диссоциации в растворах нестехиометричных полиэлектролитных комплексов // Высокомолекулярные соединения. Сер. А. - 1980. - Т. 22, № 1.- С. 218223.

114. Кулезнев В.Н., Шершнев В.А. Химия и физика полимеров. М.: Высшая школа, 1988.-312 с.

115. Кильдеева Н.Р., Трусова С.П., Пилевская Н.С., Вирник А.Д. Свойства композиций на основе поливинилового спирта, содержащих биологически активные вещества, и пленок из них // Хим. волокна. 1994. - № 2. - С. 23-24.

116. Назаренко Г.И., Сугурова И.Ю., Глянцев С.П. Рана. Повязка. Больной. Руководство для врачей и медсестер. М.: Медицина, 2002. - 472 с.

117. Полимеры в фармации / Под ред. Тенцовой А.И., Алюшина М.Т. М.: Медицина, 1985. - 256 с.

118. Блинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. М.: Высшая школа, 1984. - 256 с.

119. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. М.: Гранд, 1999. - С. 230-280.

120. Новое в области получения антимикробных волокнистых материалов и их использования. М.: ЦНИИТЭИлегпром, 1980. - 56 с.

121. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Равновесие интерполимерных реакций и явления молекулярного "узнавания" в растворах интерполиэлек-тролитных комплексов // Успехи химии. 1991. - Т. 60, № 7. - С. 1570-1595.