Органические комплексы тиазиновых и акридиновых красителей с лекарственными препаратами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ
|
Понеделькина, Ирина Юрьевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Уфа
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2000
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.03
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
<°Г5 од
2 Я 43Г Ш
Академия наук Республики Башкортостан Уфимский научный центр Российской академии наук Институт нефтехимии и катализа
Па правах рукописи
Понеделькина Ирина Юрьевна
Органические комплексы тиазиновых и акридиновых красителей с лекарственными препаратами
02.00.03-0рганическая химия 03.00.04-Биохимпя
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Уфа-2000
Работа выполнена в Институте нефтехимии и катализа Академии наук Республики Башкортостан и Уфимского научного центра Российской академии наук
Научные руководители:
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор У.М.Джемилев
доктор биологических наук, профессор С.А. Башкатов
член-корр. АН РБ, доктор химических наук, профессор М.С. Мифтахов
доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Хавкии
Башкирский Государственный Медицинский Университет
Защита диссертации состоится !? 2000 г. в 14.00 часов
на заседании диссертационного совета Д.200.33.01 при Институте нефтехимии и катализа АН РБ и УНЦ РАН (450075, г. Уфа, проспект Октября, 141)
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института нефтехимии и катализа АН РБ и УНЦ РАН.
Автореферат разослан ¿июйя 2000 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук, профессор
Р2.?/, О
Р.Г. Булгаков
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Иммобилизация биологически активных органических соединений на поверхности различных биоматериалов при помощи кова-лентного или комплексного связывания с матрицей, чаще всего полимерной, является одним из современных и перспективных направлений при разработке лекарственных препаратов и изделий для медицины. При этом достигается снижение токсичности, увеличение длительности действия лекарственных средств, а также обеспечивается более эффективная их «доставка» к органам-мишеням.
Ковалентная связь между матрицей и биологически активным соединением осуществляется, как правило, с помощью различны^ сшивающих реагентов, например, диаминов, глутарового диальдегида, эпоксисоединений, карбодии-мидов и дигидразидов карбоновых кислот. Анализ химических методов и реагентов, применяющихся для модификации полимерной поверхности, показывает, что их набор является достаточно разнообразным, но практически неприемлемым для фиксации лекарственных веществ на поверхности живых тканей. По этой прй*шне представляется актуальным поиск и изучение свойств относительно безопасных для организма соединений из класса катионных красителей, при помощи которых возможно эффективное закрепление некоторых лекарственных препаратов на поверхности органов и тканей человека и животных.
В связи с этим целью настоящей работы является получение органических комплексов катионных красителей метиленового синего и 2-этокси-б,9-диаминоакридина (риванола или этакридина) с некоторыми лекарственными препаратами и разработка новых технологий их фиксации на поверхности разлитых биоматериалов.
Научная новизна. Получены органические комплексы красителей метиленового синего и этакридина с некоторыми биологически активными веществами, а именно: с антикоагулянтом гепарином, противовоспалительными препаратами - салицилатом натрия и ацетилсалициловой кислотой, а также с антибиотиками цефалоспоринового ряда. Изучены состав, структура и свойства этих комплексов, а также способы их фиксации на поверхности соединительной ткани человека и животных с целью создания эффективной локальной концентрации соответствующих лекарств в зоне хирургической операции.
Впервые получен и охарактеризован полимерный амид, синтезированный реакцией гепарина с 5-аминосалициловой кислотой, который обладает антикоа-гулянтным и противовоспалительным действием. Последний способен также образовывать прочные комплексы с катионными красителями.
Практическое значеине работы заключается в том, что на основе органических комплексов красителей метиленового синего (МС) и этакридина с различными лекарственными препаратами разработаны новые медицинские технологии в сосудистой и абдоминальной хирургии. Получен новый лекарственный препарат, синтезированный из гепарина и 5-аминосалициловой кислоты полимерный амид с антикоагулянтными и противовоспалительными свойствами. Разработаны методики фиксации лекарственных средств с помощью катионных красителей на поверхности соединительной ткани человека и животных.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на II Международном Конгрессе Северных стран и регионов (Кондопога, 1998), конференции «Современные проблемы естествознания на стыках наук» (Уфа, 1998), на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 1998), Международной конференции Int. Conf. on Natural Products and Physiologically Active Substances (Новосибирск, 1998), конференции «Лекарственные средства XXI века» (С.-Петербург, 1999), на III Ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева (Москва, 1999).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 6 тезисов докладов и 1 патент РФ. Получены положительные решения по 9 заявкам на патенты РФ.
Структура и объел! диссертации. Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста, состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы из 88 наименований и приложения. Работа содержит 7 таблиц, 4 схемы и 19 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Из литературы известно, что катионные красители тиазинового и акридинового ряда прочно и с высокой скоростью реагируют с элементами соединительной ткани человека и животных, особенно с сульфатированными полисахаридами из класса гликозаминогликанов. Это свойство красителей используется при гистологических исследованиях живой клетки и срезов тканей при выявлении кислых мукополисахаридов, нуклеиновых кислот и других компонентов живого организма. Хорошо изученными в этом отношении являются стабильные комплексы красителей с гепарином. Описаны также комплексы с переносом заряда, которые образует метиленовый синий с солями ароматических кислот, в том числе с салицилатом натрия. Устойчивость этих комплексов зависит от природы анионов, входящих в их состав.
Благодаря изученным свойствам, комплексы красителей с лекарственными веществами анионного типа могут выполнять направленное биологическое действие в местах их фиксации на поверхности природных или синтетических биоматериалов, например, в тканях кровеносных сосудов или мезотелия кишечника, хирургических нитях или искусственных сосудистых протезах.
Большинство тиазиновых и акридиновых красителей являются токсичными соединениями для человека и животных, поэтому для получения комплексов с биологически активными соединениями нами преимущественно были использованы малотоксичные метиленовый синий и 2-зтокси-6,9-диаминоакридина лактат. В настоящее время эти фармакопейные препараты ограниченно применяются в качестве бактериостатического и антисептического средств соответственно.
+
(CH3)2N
N(CH,)2cr
Метиленовый синий
^-орто1ром.=665 HM,
^мстахром.=570-600 HM
'ортохром." -метахром.'
Толупдиновый синий
^•oproipo4.=630 НИ,
*-метахпом.=480-540 ИМ
NH.
I.
(СН3)2М N(CH3)
Акридиновый оранжевый
метахрсчагич. max. метзхр. люм.—
N(CH3)2
Этакриднн (риванол) ^тзх.=415 нм
=465 им „о,,.=640 нм
с
МС относится к типу красителей, в водных растворах образующих агрегаты молекул в виде ди-, три-, тетра-... и мультимеров. У риванола, по структуре являющимся первичным амином, способность образовывать в водных растворах ассоциаты молекул отсутствует.
Предполагаемое строение димера метиленового синего
(показана одна из четырех резонансных структур, Bergmann К., 1963).
Получение органических комплексов красителей с лекарственными препаратами и изучение их свойств осуществляли в равновесных (при очень низких концентрациях красителей в водных растворах) и в неравновесных условиях, в том числе in situ на поверхности различных типов соединительной ткани человека.
Для получения комплексов с красителями нами были использованы лекарственные соединения, химические формулы и названия которых приводятся ниже.
COONa
бензоат натрия
Нестероидные протувовоспапительные препараты , COONa
салицилат натрия (Sal)
COOR
ацелизин-растворимая форма АСК, R - катионы глицина и лизина
0=1
?Н'о
Ан
N-N
Антибиотики к
-и^-сщ
С00№
ш
-Б-С^С-СН,
цефазолин (ЦФЗ)
о=9-м-т-Г > М—И
1 ХУ-сн,
NN
I
О о
о у
СООМа
N
I
сн.
цефог.еразон (ЦФП), цефобид
6. N30.
13Б- п-ин-сз-
МН,
солютизон (противотуберкулезный препарат)^)
Днтикоагулянт гепарин
ОБО,Н
н мнэо3н
1. Получение и спектрофотометрическое исследование комплексов метнленового синего и этакридина в равновесных условиях
Электронный спектр МС при его концентрации в водном растворе 1СГ4 м характеризуется наличием двух максимумов поглощения, а именно: при 600 им и 665 нм. Первый максимум принадлежит димерным молекулам МС, второй -мономерной форме красителя. Установлено, что при добавлении в раствор многократного избытка другого компонента, например, салицилата натрия или ацелизина (растворимого аспирина), пик поглощения димера МС заметно уменьшается, а максимум поглощения мономера соответственно увеличивается и сдвигается в длинноволновую область с 665 нм до 675-680 нм. Такая же картина наблюдается при взаимодействии МС с натриевыми солями цефазолина, цефоперазона и солютизона. Спектральные изменения свидетельствуют о сильном влиянии, оказываемом этими моноанионами на тс-электронную систему катиона МС, и образовании комплексов с переносом заряда. Увеличение ионной силы раствора с помощью ЫаС1 или N32804 приводит к прямо противоположным изменениям в спектре красителя. При этом возрастает доля
агрегированных молекул МС, максимум поглощения мономера в этих условиях полностью исчезает. В неравновесных условиях наблюдаемые изменения аналогичны "высаливанию" красителя из водных растворов в присутствии неорганических солей.
, При концентрации МС 10"5-1О"6 моль/л димер красителя в растворе практически отсутствует. В этом случае для определения констант устойчивости и состава комплексов МС с моноанионами нами был использован спектрофотометрический метод молярных отношений. По этому методу в мерных колбах приготавливали 7-8 растворов с постоянной концентрацией красителя и изменяющейся известной концентрацией второго реагента. Через определенное время после приготовления (10-15 минут) измеряли оптическую плотность растворов комплексов.
При постоянной концентрации МС, пренебрежении существования диме-ра МС в очень разбавленных растворах и в условиях большого избытка переменной концентрации второго реагента R спектральные изменения для раствора МС описываются следующим уравнением:
[MCI. 1 ,1.1
А -А„ Е, - Е0 (е, -£0)К [R]
где А и Ао - оптическая плотность растворов в присутствии и в отсутствие R; [МС]0 -начальная концентрация МС; Si и Ео- молярные экстинкции комплексов состава 1:1 и МС соответственно; К - константа устойчивости (Куст); [R] -концентрация второго реагента. Из графика зависимости [МС]о/А-Ао от 1/R по тангенсу угла наклона находили KVCT комплексов.
На рис. 1 показаны спектрачьные изменения растворов МС в присутствии возрастающих количеств антибиотика солютизона (S), на рис. 2 - график зависимости [МС]/А-Ао от обратной концентрации солютизона 1/[S] при 660 нм, по тангенсу угла которого рассчитывают К}гт.
X, нм
Рис.1. Спектральные изменения растворов метиленового синего в присутствии антибиотика солютизона, [МС] = 4.74 х
1 - [S] = 0; 2- [S] = 5.3x1 О^М; 3 - [S] = 1.3х10"3М; 4 - [S] = 5.3хЮ°М
о
5 -40
4
115), М"'
Рис.2. График зависимости [МС]/А-Ао от обратной концентрации антибиотика солютизона 1/[8] при 660 нм.
Для комплексов МС с салицилатами Куст можно оценить весьма приблизительно в 20-50 М"1, с антибиотиками цефазолином и цефоперазоном - 150+30 М*' и п=0.8. Для комплекса МС с солютизоном, имеющем в своем составе ароматическое кольцо и сульфатную группу, условная Куст найдена равной 650+25 М"' (в 0.033 М фосфатном буфере с рН=6.8, 1=20°С и [МС]=4.74х10"5М), сте-хиометрический коэффициент п равен 1.
Комплексы многих метахроматических красителей с гепарином, на диса-харидное звено которого приходится 5 сульфатных групп, являются хорошо изученными. Константы равновесия, найденные для реакции обмена ионов К'а+ в сульфатированной целлюлозе (модели гепарина) на катионы красителя МС+,
Целл-ОБС^а + МСС1 „ Целл-ОБОзМС +
находятся в пределах от 3000 до 5500 М'1 в зависимости от сульфатированности целлюлозы и температуры реакции. Эти значения говорят о прочной связи сульфатных групп полимера с молекулами красителя.
Рис.3. Спектральные изменения раствора комплекса метиленового синего с гепарином в присутствии сыворотки крови, [МС] = 10"5М:
1 - комплекс МС с гепарином, 2 - в присутствии 5% сыворотки крови, 3 •• в присутствии 10% сыворотки крови.
В задачу нашего исследования входило изучение стабильности гепариновых комплексов в различных условиях, в том числе в биологических средах, например, в присутствии сыворотки крови. Полученный в равновесных условиях комплекс MC-гепарин имеет максимум поглощения при 580 нм. Как показывают спектральные данные, при добавлении сыворотки крови, содержащей различные соли, наблюдается увеличение пика абсорбции мономерного MC по мере разрушения комплекса MC-гепарин с возрастанием концентрации сыворотки (рис.3, пики 2 и 3).
При взаимодействии гепарина с MC или риванолом в неравновесных условиях происходит осаждение полимера в виде комплексов, которые практически не растворяются ни в воде, ни в сыворотке крови. Только присутствие сильных кислот, например, HCl, способствует их разрушению и переводу гепарина в растворимое состояние.
Для спектрофотометрических исследований комплексных солей этакриднна, определения их состава и констант устойчивости метод молярных отношений оказался непригодным. При постоянной концентрации риванола и меняющейся концентрации второго реагента УФ-спектры в области от 200 до 450 нм имели аддитивный характер относительно оптических плотностей компонентов, входящих в эту систему. При 100-кратном увеличении концентрации второго реагента по отношению к риванолу ([Рив.] = 4x10'5 моль/л) в кювете наблюдатось выпадение осадка, который может формироваться либо при увеличении ионной силы раствора, либо в результате образования труднорастворимых в воде комплексных соединений этакриднна. Как показали наши дальнейшие исследования, при взаимодействии этакриднна лактата с лекарственными препаратами образуются малорастворимые комплексы зтакридина.
2. Получение комплексов красителей в неравновесных условиях. Установление состава н исследование свойств
Для установления состава органических комплексов этакриднна с лекарственными препаратами наиболее простым и быстрым является метод осади-тельного титрования, в ходе которого в присутствии флотационной добавки (CCL;) к водному раствору риванола по каплям приливали водный раствор второго реагента, то есть лекарственного препарата. Окончание титрования определяли по прекращению образования осадка. В результате этих экспериментов нами было определено, что во всех комплексах с изучаемыми соединениями (кроме гепарина) этакридин и второй компонент находятся в эквимолярном отношении друг к другу.
Этякрилина салипилат P-Sal)
Комплекс этакоидина с цефазолином (Э-ЦФЗ)
После выделения и очистки органических комплексных солей этакридина было проведено их исследование методом ИК-спектроскопии. По сравнению с индивидуальным этакридином, в спектрах изученных соединений появляются новые полосы поглощения, характерные для вторых компонентов комплексов.
Сравнение спектров ЯМР 13С этакридина и его комплексов с салицилатом натрия и дефазолином показывает, что сигналы атомов С(5) смещаются в более сильное поле (101.80 м.д в этакридине, 94.59 м.д. в Э-8а1 и 94.98 м.д. в Э-ЦФЗ). При этом перераспределение электронной плотности вследствие комплексооб-разования приводит к смещению химических сдвигов атомов С(6) в слабое поле (149.67 м.д. в этакридине, 154.15 м.д. в Э-8а1 и 154.87 м.д. в Э-ЦФЗ).
Учитывая, что комплексы этакридина с лекарственными препаратами будут применяться при хирургических операциях, их растворимость определяли следующим образом: готовили насыщенный раствор соединения при 37°С и физиологической концентрации ЫаС1, отбирали аликвоту, разбавляли ее в мерной посуде до известного объема, при котором становилось возможным фото-метрирование раствора. При расчетах пользовались калибровочным графиком зависимости оптической плотности растворов от концентрации этакридина при 415 нм. Определенные таким образом значения растворимости приводятся в таблице 1.
Таблица 1.
Растворимость комплексов этакридина состава 1:1 при 37°С в физиологическом растворе, моль/л
Лекарственный препарат Растворимость, моль/л
Бензоат натрия 5,8x10"4
Салицилат натрия г.ОхЮ-4
Ацелизин (соль АСК) 3,9x10"5
Цефазолин 2,4x10"4
Цефоперазон 1,9x10"4
Солютизон 2,5x10'5
Для получения в неравновесных условиях органических комплексов красителя МС с салицилатами нами была разработана методика, основанная на прибавлении к 0.4-0.5 М водному раствору салицилата натрия или ацелизина (растворимого аспирина) водного раствора красителя из расчета, чтобы в мольном отношении соблюдался небольшой недостаток красителя. Порядок сливания растворов являлся обязательным. Выпавшему осадку давали сформироваться на холоду, затем центрифугировали. Осадок промывали несколько раз холодной водой, затем растворяли в этаноле, осаждали и многократно промывали диэтиловым эфиром, очищая таким образом получившийся комплекс от избытка исходных салицилата натрия или АСК. Для предотвращения гидролиза АСК осадок комплекса МС-АСК высушивали без доступа влаги.
Аналогично получали комплексы красителей с антибиотиками цефазоли-ном, цефоперазоном и солютизоном. После многократного промывания ледяной водой осадки высушивали от воды сначала при комнатной температуре, затем при температуре 105°С до постоянного веса.
Окончание реакции обмена между красителем МС и соответствующим реагентом оценивали по отсутствию хлора в готовом препарате:
МС+С1" + 11С001Ча+-> ЛСООМС! + + СГ, где ЯСОО" - анион лекарственного соединения.
Органические комплексы МС с салицилатами и антибиотиками являются ограниченно растворимыми в воде соединениями. Для установления их состава оказалось возможным применить аналитический метод количественного определения МС, принятый Государственной Фармакопеей XI, который основан на реакции осаждения катиона МС бихроматом калия. В соответствии с этим методом точную навеску вещества растворяли в известном объеме воды, МС осаждали избытком раствора бихромата калия, осадок отфильтровывали, а избыток К2СГ2О7 определяли йодометрически. Данные реакции осуществляли по приведенной ниже схеме.
2 1*СООМС + К2Сг207 (МС)2Сг207^ + 2 ЯСООС!
избыток
К2Сг207 + Ш+7 Н2804 -» Сг2(804)3 + 3^ + 4 К2804 + 7 Н20 32 + 2 ¡Ча^Оз 2 КаЛ + N3,8405
Определение растворимости комплексных соединений по катиону МС проводили с помощью этих же реакций. Готовили насыщенный раствор комплексной соли, отбирали аликвоту этого раствора и титровали 0,1 н раствором К2СГ2О7. Избыток бихромата калия оттитровывали йодометрически.
Значения растворимости комплексных соединений МС приводятся в таблице 2.
Таблица 2.
Растворимость комплексов МС состава 1:1 при 37°С в физиологическом растворе, моль/л
Лекарственный препарат Растворимость, моль/л
Бензоат натрия хор. раств.
Салицилат натрия 1,2x10"3
Ацелизин (соль АСК) 5,0x10'3
Цефазолин 8,5x10"4
Цефоперазон 1,9x1с-4
Солютазон 1,5х10"5
Изучение в видимой области УФ-спектров комплексов МС показано, что замена СГ в молекуле МС на другой анион не влияет на способность красителя образовывать в водных средах ассоциаты: наряду с максимумом поглощения мономерной формы при 665 нм наблюдается второй пик при 600 нм, характерный для димера красителя ([ЯСООМС] > 10"5 моль/л). В коротковолновой области УФ-спектры комплексов МС имели аддитивный характер.
ИК-спектры, снятые как для индивидуального МС, так и для его комплексов с салицилатами и антибиотиками, являются не вполне разрешенными, тем не менее, в спектрах полученных комплексов хорошо видны изменения, вызванные наличием другого противоиона в молекуле МС.
3. Модификация гепарина 5-аминосалицнловой кислотой.
Как известно, модификация физиологически активных веществ обычно предпринимается в целях расширения спектра их терапевтического действия, для повышения тропности препарата к очагу поражения, т.е. в целях оптимального сочетания максимальной эффективности лекарства с минимальной величиной его побочного действия, а также для создания пролонгированных форм лекарственных препаратов. Например, на основе фермента химотрипсина (или урокиназы) и гепарина был получен комбинированный препарат с тромболити-ческими и антикоагулянтными свойствами (Торчилин В.П., 1988).
Низкая стабильность комплексов МС-АСК и МС-5а1 а также невозможность достаточно прочной фиксации их на поверхности кровеносных сосудов в гемодинамических условиях обусловили необходимость синтеза препаратов расширенного спектра действия, в котором противовоспалительные свойства салшщпатов совмещены с антикоагулянтными. Этот конъюгат должен образовывать такие же прочные связи с красителями, как гепарин.
В выбранных нами условиях ковалентно связать с гепарином оказалось возможным 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК), аминогруппа которой в присутствии водоотнимающих веществ может образовать относительно стабильную амидную связь с -СООН группами гепарина. Подобно другим сали-
цилатам, 5-АСК является ингибитором синтеза простагландинов и обладает противовоспалительной активностью.
Водорастворимый 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (КДИ) широко используют для образования амидной связи при взаимодействии соединений, содержащих карбоксильные и аминогруппы. Например, для создания пленок, предотвращающих послеоперационную адгезию тканей, с помощью КДИ проводят модификацию гиалуроновой кислоты гепарином или другими полианионными полисахаридами (Пат. иБ 5, 017, 229). Сведения о модификации гепарина низкомолекулярными соединениями с участием КДИ в литературе отсутствуют.
Реакции с участием КДИ относятся к сопряженным, и количество всех реагентов, включая КДИ, берутся эквивалентными числу реагирующих групп.
Синтез 5-АСК с гепарином проводили в две стадии. На первой стадии посредством КДИ осуществляли активацию карбоксильных групп гепарина, то есть к растворенному в воде (рН=4.75) гепарину прибавляли эквивалентное числу дисахаридных звеньев количество КДИ. При этом образуется 0-ацилмочевина. На втором этапе к суспендированной в нагретой до 40°С воде 5-АСК при рН=4.75 при интенсивном перемешивании по каплям прибавляли раствор гепарина с КДИ. По мере протекания реакции наблюдалось быстрое исчезновение кристаллов 5-АСК. По завершении реакции с целью удаления низкомолекулярных исходных соединений раствор гепарина диализовали против подкисленной дистиллированной воды в течение 24 часов и затем продукт дополнительно очищали на колонке с анионобменной ДЕАЕ-целлюлозой. После очистки на колонке полимер осаждали четырехкратным объемом этилового спирта, осадок центрифугировали, промывали спиртом, затем диэтиловым эфиром и высушивали в вакууме.
соон но.госн.
—о
+ п Т| Т + (снз)2м-(снг)3м=с=г«,ан5-нс1
соон
н оэо^н
Н МНЭОзН
Гепарин
5-АСК
1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид
он
N4
Модифицированный 5-АСК гепарин
Схема 1. Химическая модификация гепарина.
ИК-спектр продукта реакции отличается от спектра исходного гепарина прежде всего наличием интенсивных полос поглощения, характерных для валентных колебаний карбонильной группы замещенного амида с частотой 1680 см"1 и кислоты - 1745 см'1. Надо отметить, что полоса поглощения-СООН-группы в спектре самой 5-АСК проявляется очень слабо. Это связано с амфо-терностью 5-АСК и ее способностью образовывать внутреннюю соль, подобно аминокислотам. Появление пика поглощения свободной -СООН-группы в спектре модифицированного гепарина свидетельствует в пользу предполагаемой структуры, изображенной на схеме реакции. Электронный спектр продукта реакции в водном растворе характеризуется батохромным сдвигом максимума поглощения ароматической составляющей модифицированной молекулы полимера: Яашх=317 нм, в отличие от Х^ах 5-АСК, равной 304 нм. Гепарин в этой области спектра не поглощает.
Основные отличия в спектрах ЯМР 13С гепарина и полимерного амида, полученного из гепарина и 5-АСК, наблюдаются в области от 110 до 160 м.д. с появлением сигналов, относящихся к ароматическим атомам углерода. Следует отметить, что модифицированный гепарин в своем составе содержит остатки карбодиимида в виде О-ацила дизамещенной мочевины. На это указывают сигналы N-метильных групп 41.66 м.д.
Еще одним доказательством, подтвера<дающим модификацию гепарина, является цветная качественная реакция с FeCb на фенолы, в результате которой образуются комплексы фиолетового цвета. В кислой среде с рН=2-3 комплекс салициловой кислоты с FeCh имеет Яотах=520-525 нм, 5-АСК- FeCl3 - 10 нм, а продукт реакции гепарина с 5-АСК поглощает в более длинноволновой части спектра - при 550 нм.
В зависимости от времени проведения реакции можно получать гепарин с различной степенью замещения по карбоксильной группе, например, через 1 ч - 40%, 2ч- 65%, через 5 ч степень замещения достигает 94-97%. Количество 5-АСК, ковалентно связанной с полимером, определяли фотометрически при 304 нм после гидролиза точной навески продукта в 20% соляной кислоте.
Независимо от степени превращения карбоксильных групп гепарина, продукты реакции являются хорошо растворимыми в воде веществами, из которых можно изготовлять лекарственные пленки различного назначения. Обрабатывая пленки раствором FeCb, можно делать их нерастворимыми в воде.
4. Иммобилизация органических комплексов красителей с
лекарственными препаратами на поверхности биоматерналов.
Новые медицинские технологии
Многие лекарственные препараты по структуре являются соединениями анионного типа и поэтому не способны к прочному взаимодействию с белками и гликозаминогликанами соединительной ткани человека и животных. Создать за короткое время в зоне хирургической операции высокую концентрацию лекарственного препарата оказалось возможным с помощью катионных красителей, образующих связь как с элементами соединительной ткани, так и с соответствующим лекарством.
Нами была предложена оригинальная методика закрепления лекарственных комплексов in situ на поверхности органов и тканей, которая заключается в следующем: сначала поверхность биоматериала обрабатывают раствором красителя, затем наносят раствор лекарственного препарата. При нанесении на внутренние органы человека (сосуды, кишечник) лекарственных препаратор важной характеристикой образующихся комплексов является их стабильность и поверхностная концентрация в условиях формирования in situ. Поэтому для каждого комплексного соединения были разработаны способы его разрушения и перевода в состояние, приемлемое для количественного определения по соответствующей методике, а также проведена оценка стабильности комплексов приблизительно в тех условиях, в каких находится тот или иной орган человека.
4.1. Комплексы тиазиновых и акридиновых красителей с гепарином
Сильно склерозированные кровеносные сосуды человека (аорта, артерии) обычно подвергают операции эндартерэктомии. При этом удаляются атерома-тозные бляшки и внутренняя оболочка сосуда, то есть интима. Иногда, при сильном поражении склерозом, удаляется средняя часть сосуда, медия. Традиционной для такого рода операций является атромбогенная обработка внутренней поверхности сосуда раствором антикоагулянта гепарина, которая имеет весьма кратковременный эффект. В условиях кровотока гепарин быстро смывается с поверхности, и возникает опасность закупорки сосуда образующимся тромбом. В этих обстоятельствах нередко требуется повторное оперативное вмешательство.
Для предупреждения тромбозов реконструированных магистральных кровеносных сосудов нами был предложен способ формирования атромбоген-ной поверхности с помощью комплексов тиазиновых и акридиновых красителей с гепарином.
COO'Na Na'O.SOCH,
LNa+ H NHSO,"Na+
H OSOj Na"
Mtfcr
MC+CI" MC+Cf
MC+Cl"
?H f
ООН
MC CI MC+Cf OSO,H NHSO,H
Nh
Гепарин
1
Агрегированные молекулы MC
ООН Функциональные "группы
Л(олйагеи/и г^икст^ам^огд/кан^ с^еднгнитеЛьнсутками
Схема 2. Фиксация гепарина на поверхности соединительной ткани с помощью красителя МС.
Непременным условием для образования атромбогенной поверхности является способность молекул красителей к самоассоциации. Агрегированные молекулы красителя, частично связанные с поверхностью живой ткани, имеют
возможность';дЬполнительно присоединять другие молекулы с отрицательным зарядом (схема 2), причем константы ассоциации красителей и константы устойчивости (равновесия) для образующихся комплексов с гепарином должны быть приблизительно одного порядка. По литературным данным Кдамер. для МС оцениваются в пределах 2000-5900 М"1, для акридинового оранжевого (АО) -1.5x104 М"1, а Кравн. для равновесной реакции обмена ионов Na+ в сульфатиро-ванной целлюлозе, как модели гепарина, на катионы МС имеют значения от 3000 до 5500 М"1 в зависимости от сульфатированности целлюлозы и температуры (Lawton J.B., 1977).
Полученные результаты позволили установить, что количество связанного гепарина зависит от типа и структуры красителя,'а также времени его контакта с поверхностью тканей (табл.3). Наряду с МС и риванолом в таблицу включены и другие метахроматические красители: акридиновый оранжевый (АО) и толуидиновый синий (ТС). Как известно, красители, имеющие вторичные аминогруппы, в водных растворах ассоциируют сильнее по сравнению с содержащими только первичные аминогруппы (Акбарова Д.М., 1969). Количество иммобилизованного, на поверхности тканей гепарина непосредственно зависит от этого свойства красителей. У риванола способность к ассоциации вы-рщкена очень слабо, и далее в экспериментах по фиксации гепарина in vivo его не применяли и не изучали.
Таблица 3.
Зависимость поверхностной концентрации гепарина (мкг/см2) от типа красителя (1% -ный раствор) и времени его контакта с поверхностью медни кровеносного сосуда*1
Время контакта красителя с поверхностью,мин. Концентрация гепарина, миг/см2
МС ТС АО Риванол
1 27,3+6,4 25,0+6,4 36,9+9,6 6,2±3,8
3 б0,0±7,8 57,5+5,8 62,9+7,8 16,4+2,6
' 5 78,7±7,2 88,3+8,0 90,1+7,1 16,4±3,0
10 101,0+5,1 97,1 ±5,0 | 109,0±8,2 20,5±2,6
Примечание. Время обработки раствором гепарина (5000 МЕ/мл)-5 мин., время промывания водой-10 мин при 37°С.
Через 24 часа отмывания проточной водой фрагменты кровеносных сосудов,- обработанных предварительно красителями, содержали гепарин в количестве, достаточном для проявления тромборезистентных свойств - 5-30 мкг/см2. Эксперименты, выполненные на беспородных собаках, показали, что в гемодинамических условиях комплекс МС-гепарин удерживается в стенке сосуда не менее 5-6 суток и эффективно предотвращает тромбообразование после
*Во всех таблицах результаты рассчитаны на основании не менее б определений в одном опыте.
операций эндартерэ:ктомии, то есть удаления склерозированной внутренней оболочки (интимы) сосудов.
Новая технология иммобилизации гепарина с помощью красителей была использована при разработке способа профилактики послеоперационной спаечной болезни брюшины. Традиционное применение гепарина в этих целях требует многократного внутрибрюшинного введения малых доз препарата, а использование МС для фиксации гепарина позволяет проводить всего одну обработку мезотелия кишечника. Результаты, приведенные в табл. 4, показывают, что количество связанного с поверхностью мезотелия гепарина пропорционально времени экспозиции с красителем.
Эффективность применения комплекса МС-гепарин подтверждали доклинические испытания и морфологические исследования состояния брюшины при создании модели спаечной болезни на собаках.
Таблица 4.
Концентрация гепарина (мкг/см2) на поверхности мезотелия в зависимости от времени экспозиции с 1%-ным раствором МС и времени промывания физиологическим раствором
Концентрация гепарина, мкг/см2
Время обработки при времени при времени
МС промывания промывания
5 минут 24 часа
15 сек. 10,6±4,2 0
30 сек. 11,8±4,2 0
1 мин. 12,1±4,0 5,6+2,3
2 мин. 21,6+3,8 10,0+2,9
5 мин. 47,9+4,0 14,0±2,5
По данным Lawton J.B. (1977г.), при взаимодействии МС с реакционно-способными группами гепарина в водных растворах происходит обмен ионов Na+ на катионы красителя, по размеру гидратированного радиуса очень близких к радиусу Na+. По сути, происходит модификация карбоксильных и сульфатных групп гепарина гидрофобными молекулами красителя. При сравнении констант равновесия для реакций обмена Na+ при СОСГ и SCV-группах, значения которых оцениваются в 400-900 М"' для карбоксильных и 3000-5500 М-1 для суль-фогрупп очевидно, что с катионами МС в первую очередь будут реагировать сульфогруппы, ответственные за антикоагулянтную активность гепарина. В то же время известно, что удаление 33% сульфатных групп в молекуле гепарина приводит к полной потере антикоагулянтных свойств. В связи с этим необходимо было выяснить, как влияет такая модификация гепарина на его антикоа-гулянтные и тромболитические свойства. Коагулограммы нативной крови, снятые в присутствии комплексов краситель-гепарин на поверхности медии кровеносного сосуда, показали, что в тех условиях, в каких формируются на поверхности сосудистой стенки комплексы МС или риванола с гепарином, полисахарид не теряет своих антикоагулянтных свойств.
4.2. Комплексы мёшленового синего с салицилатамн
Вне сферы действия иммобилизованного в стенке кровеносного сосуда гепарина остается такой процесс в приповерхностном слое, как агрегация тромбоцитов.
Антиагрегантные свойства АСК (аспирина) известны в течение почти 20 лет. По сей день не прекращаются исследования по выяснению механизмов воздействия' АСК на агрегацию тромбоцитов. Неоднозначность физиологического действия АСК отмечается во многих публикациях. Тем не менее, имея в виду работу по местному применению микросуспензии АСК в качестве антиаг-реганта для покрытия изнутри дакронового сосудистого протеза [55], нами было предложено закреплять АСК в виде комплекса с красителем МС в сосудистой стенке (медии). Коагулограммы крови не выявили антиагрегантного действия АСК, по крайней мере, при тех ее концентрациях, которые создаются на поверхности сосудов посредством комплексообразования с красителями (табл.5). Но поскольку при реконструктивных операциях частым осложнением является асептическое воспаление, нередко приводящее к реокклюзиям (повторному сужению) сосудов, возникает необходимость сформировать в зоне реконструкции лекарственный комплекс с противовоспалительным действием.
При фиксации салицилатов посредством МС на поверхности сосудистых тканей способность красителя ассоциировать не имеет такого значения, как при иммобилизации гепарина, так как салицилатам свойственно разрушать агрегаты молекул красителя при Сса.„щ»Смс- Это свойство иллюстрируется электронными спектрами МС в присутствии салицилата на!рия или ацелизина.
Таблица 5.
Концентрация АСК в тканях, обработанных .МС и ацелизином
Вид кадаверной ткани Время отмыва- [АСК],
ния, мин. мкг/см2
Аорта, медия, обработанная 0 420+10
ацелизином (без МС) 5 49±9
Аорта, медия 0 370+10
5 210±8
Аорта, адвентиция 0 290+8
5 210+8
Вена, наружная поверхность 0 550±10
5 260+6
Вена, внутренняя поверхность 1 85+6
5 65±6
Примечание. Время экспозиции тканей с 1% раствором МС - 8 мин., с ацелизином -10 мин.
Прочность комплексов МС с салицилатамн является невысокой: Куст для них можно оценить фотометрически приблизительно в 20-50 М"1. Из данных по растворимости и результатов количественного определения АСК в составе комплекса на поверхности различных сосудистых тканей также видно, что МС-АСК обладает низкой стабильностью' (табл.2, 5).
Как нами было показано, комплексы МС с салнцилатами сохраняют свойства самого МС, поэтому они могут быть использованы для формирования на поверхности соединительной ткани тройного комплекса МС-АСК(СК)-гепарин. При огромной разнице констант устойчивости: Куст МС-АСК«Крав„ МС-гепарин, изменение последовательности обработки поверхности стандартными растворами лекарственных препаратов (сначала МС, затем гепарин и аце-лизин) приводит к уменьшению концентраций и гепарина, и АСК (табл.6). По данным спектрофотометрических исследований, уменьшение количества поверхностно-связанного антикоагулянта происходит по причине того, что сали-цилаты при большом избытке разрушают комплексы МС с гепарином.
Таблица 6.
Концентрация АСК и гепарина на поверхности различных тканей кровеносных сосудов
Вид кадаверной Последова- Время от- [АСК], [гепарин],
ткани тельность мывания, м кг/см* м кг/см*
нанесения мин.
Аорта, медия, Ацелизин 0 420±10 -
склерозированная 5 49±9 -
Аорта, медия, не МС- 0 200±10 155,2+8,0
склерозированная ацелизин- 5 110±9 50,3±8,1
гепарин 20 60±9 37,8+9,5
Аорта, медия, не МС-гепарин- 0 125±7 20,1+5,2
склерозированная ацелизин 5 63±9 6,3+2,5
20 35+8 8,3+3,0
Аорта, медия, МС- 0 480±9 344,0+5,0
склерозированная ацелизин- 240±11 202,2±5,4
гепарин 10-15 не опред. 101,0+5,1
Вена, внутренняя МС- 1 85+6 55,4+7,4
поверхность ацелизин- 5 65+6 36,9±9,0
гепарин 15 54±7 35,8±9,0
Примечание. Время экспозиции с 1%-ным р-ром МС - 8 мин., 10%-ным р-ром ацелизина - 8-10 мин., с раствором гепарином - 5 мин.
Как следует из результатов, приведенных в табл.6, прочность связывания АСК и гепарина, и, следовательно, их концентрации зависят не только от последовательности обработки, но и от типа и структуры поверхности живых тканей.
Проведенные на собаках испытания по обработке венозных аутотранс-плантатов и паравазальной клетчатки (адветиции) кровеносных сосудов препаратами МС-АСК-гепарин показали, что такой лекарственный комплекс стабилизирует тканевый гомеостаз в области анастомоза, и это в последующем может значительно снизить количество рестенозов и реокклюзий кровеносных сосудов в послеоперационном периоде.
4.3. Органические комплексы метиленового синего с цефалоспорыновыми антибиотиками
Антибиотики цефалоспоринового ряда по структуре относятся к бета-лактамным соединениям, в основе строения которых лежит 7-аминоцефалоспориновая кислота. Они обладают широким спектром антибактериального действия. Как правило, представители этой группы антибиотиков используются в виде кислот или растворимых в воде Кта солей, например, цефа-золина (ЦФ) или цефоперазона (ЦП).
Как установлено бактериологическими исследованиями, комплексы МС-ЦФ и МС-ЦП сохраняют все бактерицидные свойства, присущие цефалоспори-нам, и могут быть использованы для получения антимикробных материалов различного назначения.
Достаточно низкая растворимость комплексов МС-цефалоспорины была использована при разработке способа антибактериальной защиты анастомозов при резекциях кишечника. Обработка мезотелия кишечника в области хирургического шва антибиотиком после предварительного прокрашивания МС позволила сформировать на поверхности тканей бактерицидный комплекс с пролонгированным действием (табл.5).
Таблица 5.
Концентрация цефазолина на поверхности мезотелия в зависимости от врем< ни экспозиции с 1% раствором метиленового синего и времени отмывания физиологическим раствором
Время экспозиции Время отмывания Концентрация Контр, опыт
с МС, мин. физраств., мин. ЦФ, мг/см2 без обработки МС
0,5 1 1,79+0,28 -
1 1 2,96+0,18 -
2 1 3,37±0,18 0,15±0.05
5 1 4,85+0,16 -
2 5 3,16+0,16 0,07±0,02
2 15 1,08+0,10 0,05±0,02
2 60 0,13+0,05 0,01+0,005
5 24 часа 0,05+0,02 0
Примечание. Время обработки стандартным раствором цефазолина 3-7 минут.
Эффективность метода фиксации цефазолина посредством красителя в условиях бактериальной зараженности была подтверждена результатами под-
счета колониеобразующих единиц (КОЕ) при выполнении экспериментов на собаках. Степень обсемененности зоны анастомоза без обработки составляла ] 47+5,1 КОЕ, после обработки растворами МС и цефазолина - 126±5,1; 51±0,6; 9+3 КОЕ через 2, 12, и 24 часа соответственно.
4.4. Применение органических комплексов этакрндина с салнцилатами и цефалоспоринами
Методом осадительного титрования установлено, что со многими одноосновными кислотами, в том числе с салицилатами и цефалоспоринами, этак-ридин образует комплексы 1:1. Все они являются плохо растворимыми в воде веществами, и принцип иммобилизации лекарственных препаратов посредством этого красителя основан на низкой растворимости получаемых соединений.
Обычно этакрндина лактат используется в качестве антисептика местного действия. По этой причине нами были разработаны рекомендации в отношении возможного применения его комплексов с лекарственными препаратами для тех условий, когда практически исключается попадание красителя в кровь, например, для фиксации АСК в паравазальной клетчатке кровеносных сосудов. Количество АСК, связанной с поверхностью тканей при помощи риванола, более чем в 2 раза выше, чем при использовании МС, т.е зависит от прочности (растворимости) комплексов красителей.
Комплексы красителей с антибиотиками из класса цефалоспоринов могут быть использованы для получения материалов с антимикробными свойствами. Образование нерастворимых красителей непосредственно на волокне широко применяется при крашении диазосоединениями. Аналогичный принцип был нами положен в основу закрепления антибиотиков с помощью риванола или МС в материале сосудистых протезов из фторлон-лавсана или хирургических нитей из шелка и капрона: материал сначала окрашивати риванолом или МС, затем пропитывали водным раствором цефазолина или цефоперазона. При использовании протезов или нитей определяющими факторами поступления антибиотика в окружающие ткани являлись растворимость образующихся комплексов и вид материала.
На основании проведенных исследовании можно сделать заключение, что комплексообразование катионных красителей тиазинового и акридинового ряда с некоторыми физиологически активными соединениями анионного характера может применяться не только для их иммобилизации на поверхности соединительной ткани человека и животных, но и для обеспечения пролонгированного действия этих веществ непосредственно в зоне хирургической операции.
Конструирование биологически активных соединений на основе полисахарида гепарина, сульфогруппы которого образуют наиболее стабильные комплексы с красителями, является перспективным направлением в создании специальных лекарственных средств, предназначенных для фиксации на поверхности различных биоматериалов.
22
Выводы:
1. Получены органические комплексы состава 1:1 красителей метиленового синего и 2-этокси-6,9-диаминоакридина (этакридина) с бензоатом натрия, салицилатами и антибиотиками цефазолином, цефоперазоном и солютизо-ном, изучены их физико-химические свойства.
2. Определены значения растворимости полученных комплексов метиленового синего и этакридина с лекарственными препаратами в физиологическом растворе при 37°С.
3. Независимо от природы аниона, входящего в состав комплексов с метилено-вым синим, полученные соединения имеют свойство образовывать в водных растворах ассоциаты. Спектрофотометрически оценены значения константы устойчивости комплексов метиленового синего с салицилатами, антибиотиками цефазолином и солютизоном.
4. Осуществлена схема химической модификации гепарина 5-аминосалициловой кислотой. Показано, что реакция между аминогруппами 5-АСК и карбоксильными группами полисахарида с участием водорастворимого 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида происходит с образованием амидной связи и высокой степенью превращения карбоксильных групп гепарина. Установлена структура полученного соединения.
5. Найдено, что количество гепарина, комплексно связанного с тиазиновыми или акридиновыми красителями и поверхностью биоматериала, зависит от агрегационных свойств красителей, вида биоматериала и пропорционально времени контакта красителей с поверхностью.
6. Синтезированные в данной диссертационной работе органические комплексы тиазиновых и акридиновых красителей с лекарственными препаратами успешно прошли фармакологические и клинические испытания и используются
- для формирования антитромбогенной поверхности биоматсриапов (кровеносных сосудов и аутотрансплантатов) с целью предупреждения ранних тромбозов эндартерэктомированных артерий;
- в ангиохирургии - для профилактики асептического воспаления в зоне хирургической операции. Тройной комплекс метиленовый синий-ацетилсалициловая кислота-гепарин - для предупреждения реокклюзий (сужений) при операциях на магистральных сосудах;
- в абдоминальной хирургии - для профилактики спаечной болезни брюшины и антибактериальной защиты анастомозов при резекциях кишечника, для обработки плевральной полости;
- при создании хирургических материалов с антимикробными свойствами.
Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:
1. Понеделькина И.Ю., Карабанов Ю.Р., Башкатов С.А., Вахитов В.А., Джеми-лев У.М., Давлетов Э.Г., Гатауллин Н.Г., Костромина Л.Е., Ижбульдин Р.И., Камалов А.Р., Чемерис A.B., Щекин C.B. Способ формирования гепарннизи-рованной поверхности // Патент РФ № 2137507.
2. Понеделькина И.Ю., Карабанов Ю.Р., Башкатэв С.А., Джемилев У.М., Вахи-тов В. А., Давлетов Э.Г., Гатауллин Н.Г., Костромина Л.Е., Ижбульдин Р.И., Чемерис A.B., Щекин C.B. Способ формирования атромбогенной (гепарини-зированной) поверхности // Заявка N 98103929. Положит, реш. от 16.02.98.
3. Понеделькина И.Ю., Карабанов Ю.Р., Башкатов С.А., Джемилев У.М., Вахи-тов В.А., Давлетов Э.Г., Гатауллин Н.Г., Камалов А.Р., Костромина Л.Е., Ижбульдин Р.И., Чемерис A.B., Щекин C.B. Способ формирования антикоа-гулянтной поверхности // Заявка N 98107384. Положит, реш. от 04.04.98.
4. Понеделькина И.Ю., Сибагатуллин Н.Г., Гатауллин Н.Г., Башкатов С.А., Ва-хитов В.А., Джемилев У.М., Давлетов Э.Г., Костромина Л.Е., Ижбульдин Р.И., Камалов А.Р., Чемерис A.B. Протезы кровеносных сосудов // Заявка N 98109421. Положит, реш. от 18.05.98.
5. Понеделькина И.Ю., Сибагатуллин Н.Г., Гатауллин Н.Г., Кайдаш А.Н., Башкатов С.А., Вахитов В.А., Джемилев У.М., Давлетов Э.Г., Костромина Л.Е., Галяутдинов P.P., Камалов А.Р., Чемерис A.B. Способ получения материалов с антимикробными свойствами // Заявка N 98119761. Положит, реш. от 02.11.98.
6. Понеделькина И.Ю., Сибагатуллин Н.Г., Гатауллин Н.Г., Кайдаш А.Н., Башкатов С.А., Вахитов В.А., Джемилев У.М., Давлетов Э.Г., Костромина Л.Е., Чемерис A.B. Органические комплексы цефалоспориновых антибиотиков, обладающие антимикробными свойствами // Заявка N 99103949. Положит, реш. от23.02.99.
7. Хасанов А.Г., Понеделькина И.Ю., Кунафин М.С.,Абдуллин У.М., Башкатов С.А., Джемилев У.М., Тимербулатов В.М., Каланов Р.Г., Талипов P.M. Способ профилактики спаечной болезни брюшины // Заявка N 99106107. Положит. реш. от 22.03.99.
8. Кунафин М.С., Понеделькина И.Ю., Абдуллин У.М., Башкатов С.А., Джемилев У.М., Хасанов А.Г., Тимербулатов В.М., Каюмов Ф.А., Каланов Р.Г., Юлдашев С.М Способ антибактериальной защиты анастомозов при резекциях кишечника // Заявка №99110963. Положит, реш. от 20.05.99.
9. Карабанов Ю.Р., Камалов А.Р., Понеделькина И.Ю., Башкатов С.А., Джемилев У.М., Плечев В.В., Гатауллин Н.Г., Пучков A.A., Рахматуллин A.C., Ижбульдин Р.И., Еникеев Д.А., Шумкин A.M. Способ профилактики асептического воспаления при операциях на магистральных сосудах // Заявка
№99113894. Положит, реш. от 07.07.99
10.Карабанов Ю.Р., Камалов А.Р., Понеделькина И.Ю., Башкатов С.А., Джемилев У.М., Плечев В.В., Гатауллин Н.Г., Латыпов Р.Ш., Рахматуллин A.C., Ижбульдин Р.И., Еникеев Д.А., Щекин C.B. Способ профилактики реокклю-зий при операциях на магистральных сосудах // Заявка №99113891. Положит. реш. от 07.07.99.
11.Карабанов Ю.Р., Гатауллин Н.Г., Ижбульдин Р.И., Понеделькина И.Ю., Камалов А.Р., Рахматуллин A.C., Пучков A.A., Фихтер A.M. Интраоперацион-ная атромбогенная обработка артерий в зоне эндатерэктомии // Хирургия от младенчества до старости. II Междунар. Конгресс Северных стран и регионов, Кондопога, 1998.-С. 20-21.
12.Понеделькина И.Ю., Башкатов С.А., Карабанов Ю.Р., Ижбульдин Р.И., Джемилев У.М. Формирование атромбогенных поверхностей с помощью красителей фенотиазинового ряда//Тез. докл. конф. «Современные проблемы естествознания на стыках наук.» Уфа, 1998.-Т.2.-С.76-78
13.Джемилев У.М., Понеделькина И.Ю., Башкатов С.А.,Карабанов Ю.Р., Сиба-гатуллин Н.Г. Природные биополимеры-гликозаминогликаны в новых медицинских технологиях // Тез. докл., XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, М.: Химия живого., 1998.-С.43
14.Ponedel'kina I.Yu., Bashkatov S.A., Sibagatullin N.G., Dzhemilev U.M. The use of phenothiazine and acridine derivatives for drugs immobilization. Abstr. of paper // Int.Conf. on Natural Products and Physiologically Active Substances. Novosibirsk, 1998.-P.139
15.Понеделькина И.Ю., Башкатов СЛ., Браженко А.В. Получение атромбогенных поверхностей с применением красителей фенотиазинового ряда // Тез. докл. конф. «Лекарственные средства XXI века.»-С.-Петербург, апр. 1999 г.
16.Камалов А.Р., Сибагатуллин Н.Г., Понеделькина И.Ю. Способ снижения хирургической пористости сосудистых эксплантатов // Тез. докл. конф. III Ежегодная Сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева-Москва, 1999 г.
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.1. Свойства и применение тиазиновых красителей.
1.1.1. Физико-химические свойства тиазиновых красителей в водных растворах.
1.1.2. Комплексы тиазиновых красителей с биомолекулами и «органическими анионами»
1.2. Акридиновые красители, свойства и применение
1.3. Модификация поверхности биологических и синтетических полимерных материалов
1.3.1. Способы повышения тромборезистентности материалов
1.3.2. Способы модификации биоматериалов с помощью антимикробных препаратов.
Глава 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
2.1. Получение и спектрофотометрическое исследование комплексов метиленового синего и этакридина в равновесных условиях
2.2. Получение комплексов красителей в неравновесных условиях. Установление состава и исследование свойств.
2.3. Модификация гепарина 5-аминосалициловой кислотой
2.4. Иммобилизация комплексов красителей с лекарственными препаратами на поверхности биологических тканей. Новые медицинские технологии
2.4.1. Комплексы тиазиновых и акридиновых красителей с гепарином
2.4.2. Комплексы метиленового синего с салицилатами
2.4.3. Органические комплексы метиленового синего с цефалоспориновыми антибиотиками.
2.4.4. Применение комплексов этакридина с салицилатами и цефалоспоринами.
Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Количественное определение гепарина, комплексно связанного с красителем и поверхностью соединительной ткани
3.2. Количественное определение салициловой и ацетилсалициловой кислот в составе комплексов
3.3. Формирование комплексов красителей с лекарственными препаратами на поверхности биологических тканей
3.4. Получение материалов с антимикробными свойствами
3.5. Определение состава и растворимости комплексов этакридина
3.6. Определение антибиотика цефазолина в составе комплексов с красителями
ВЫВОДЫ
Актуальность темы. Иммобилизация биологически активных органических соединений на поверхности различных биоматериалов при помощи ковалентного или комплексного связывания с матрицей, чаще всего полимерной, является одним из современных и перспективных направлений при разработке лекарственных препаратов и изделий для медицины. При этом достигается снижение токсичности, увеличение длительности действия лекарственных средств, а также обеспечивается более эффективная их «доставка» к органам-мишеням.
Ковалентная связь между матрицей и биологически активным соединением осуществляется, как правило, с помощью различных сшивающих реагентов, например, диаминов, глутарового диальдегида, эпоксисоединений, карбодиимидов и дигидразидов карбоновых кислот. Анализ химических методов и реагентов, применяющихся для модификации полимерной поверхности, показывает, что их набор является достаточно разнообразным, но практически неприемлемым для фиксации лекарственных веществ на поверхности живых тканей. По этой причине представляется актуальным поиск и изучение свойств относительно безопасных для организма соединений из класса катионных красителей, при помощи которых возможно эффективное закрепление некоторых лекарственных препаратов на поверхности органов и тканей человека и животных.
В связи с этим целью настоящей работы является получение органических комплексов катионных красителей метилецового синего и 2-этокси-6,9-диаминоакридина (риванола или этакридина) с некоторыми лекарственными препаратами и разработка новых технологий их фиксации на поверхности различных биоматериалов.
Научная новизна. Получены органические комплексы красителей метиленового синего и этакридина с некоторыми биологически активными 5 веществами, а именно: с антикоагулянтом гепарином, противовоспалительными препаратами - салицилатом натрия и ацетилсалициловой кислотой, а также с антибиотиками цефалоспоринового ряда. Изучены состав, структура и свойства этих комплексов, а также способы их фиксации на поверхности соединительной ткани человека и животных с целью создания эффективной локальной концентрации соответствующих лекарств в зоне хирургической операции.
Впервые получен и охарактеризован полимерный амид, синтезированный реакцией гепарина с 5-аминосалициловой кислотой, который обладает антикоагулянтным и противовоспалительным действием. Последний способен также образовывать прочные комплексы с катионными красителями.
Практическое значение работы заключается в том, что на основе органических комплексов красителей метиленового синего (МС) и этакридина с различными лекарственными препаратами разработаны Новые медицинские технологии в сосудистой и абдоминальной хирургии. Получен новый лекарственный препарат, синтезированный из гепарина и 5-аминосалициловой кислоты полимерный амид с антикоагулянтными и противовоспалительными свойствами. Разработаны методики фиксации лекарственных средств с помощью катионных красителей на поверхности соединительной ткани человека и животных.
ВЫВОДЫ
1. Получены органические комплексы состава 1:1 красителей метиленового синего и 2-этокси-6,9-диаминоакридина (этакридина) с бензоатом натрия, салицилатами и антибиотиками цефазолином, цефоперазоном и солютизоном, изучены их физико-химические свойства.
2. Определены значения растворимости полученных комплексов метиленового синего и этакридина с лекарственными препаратами в физиологическом растворе при 37°С.
3. Независимо от природы аниона, входящего в состав комплексов с метиленовым синим, полученные соединения имеют свойство образовывать в водных растворах ассоциаты. Спектрофотометрически оценены значения константы устойчивости комплексов метиленового синего с салицилатами, антибиотиками цефазолином и солютизоном.
4. Осуществлена схема химической модификации гепарина 5-аминосалициловой кислотой. Показано, что реакция между аминогруппами 5-АСК и карбоксильными группами полисахарида с участием водорастворимого 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида происходит с образованием амидной связи и высокой степенью превращения карбоксильных групп гепарина. Установлена структура полученного соединения.
5. Найдено, что количество гепарина, комплексно связанного с тиазиновыми или акридиновыми красителями и поверхностью биоматериала, зависит от агрегационных свойств красителей, вида биоматериала и пропорционально времени контакта красителей с поверхностью.
6. Синтезированные в данной диссертационной работе органические комплексы тиазиновых и акридиновых красителей с лекарственными препаратами успешно прошли фармакологические и ^клинические испытания и используются
1. Граменицкий Е.М. Прижизненная окраска клеток и тканей - JL: Гос. изд. мед. лит., 1963. - 151 С.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства Харьков: Торсинг, 1997. - Т. 1.543 С.-Т. 2.-590 С.
3. Ашмарин П.А. Метиленовый синий как аналог окислительного фермента //Рус. физиолог, журнал. 1921. -№ 4. - С. 171-191.
4. Сазыкин Ю.О. О взаимодействии антибиотиков неомициновой группы с метиленовой синью и о невозможности использования метода Тунберга для изучения действия неомицинов на дегидразы бактерий / Антибиотики. 1959.-Т. 4,-№4.-С. 96-99.
5. Колодин A.B. О сочетанном влиянии пенициллина и метиленовой синьки на стафилококковые инфекции / Современные методы исследований. Вып. 1,-Томск, 1968,- С. 109-119.
6. Гавва Л.Н., Игнатов В.В., Панасенко В.И. Влияние метиленового синего на поверхностные структуры клеток золотистого стафилококка / В кн. Стафилококковые инфекции и персистенция микроорганизмов. М. -1980.-С. 7-8.
7. Лесовой В. С. Чувствительность возбудителей некоторых глубоких микозов к метиленовому синему / Тр. Волгогр. мед. инст. 1971. - Т. 24. - С. 601-602.
8. Досычев Е.А., Меркулова Т.Б. Об эффективности лечения чешуйчатого лишая хлористым аммонием и метиленовой синью // Врачебное дело. -1973.-№1,-С. 121-123.
9. Бункус P.M. О фотодинамическом действии метиленовой сини на токсины возбудителей газовой гангрены / Тр. Иркутск, инст. эпидемиологии и гигиены. Иркутск, 1960. - № 5. - С. 163-167.
10. Блинова М.И. Инактивация вируса клещевого энцефалита фото динамическим действием метиленового синего // Вопросы вирусологии. 1962. - № 1.-С. 59-62.
11. Корецкая JI.C. Фото динамическое действие метиленовой сини на патогенные бактерии кишечной группы, измененные под влиянием бактериофага / Тез. докл. I научн. конф. Таджик, биохим. общ. Душанбе, 1962. -С.11-13.
12. Munns R.K., Holland D.C., Roybal J.E. et al. Liquid chromatografic determination of methylene blue and its metabolites in milk // J. AO AC Int. 1992. -V.75.-№5.-P. 796-800.
13. Jlynna X. Основы гистохимии M.: Мир, 1980. - 343 С.
14. Кононский А.И. Гистохимия Киев: Вища школа, 1976. - 278 С.
15. Bergmann К., O'Konski С.Т. A spectroscopic study of methylene blue monomer, dimer, and complexes with montmorillonite // J. Phys. Chem. 1963. - V. 67.-N10.-P. 2169-2177.
16. Mukeree P., Ghosh A.K. The "isoextraction" method and the study of the self-association of methylene blue in aqueous solution // JACS. 1970. - V. 92. - N 22. - P. 6403-6407.
17. Ghosh A.K., Mukeree P. Multiple association equilibria in the self association of methylene blue and other dyes // JACS. 1970. - V. 92. - N 22. - P. 64086412.
18. Ghosh A.K., Mukeree P. Ionic strength effects on the activity coefficient of methylene blue and its self-association // JACS. 1970. - V. 92. - N 22. - P. 6413-6415.
19. Mukeree P., Ghosh A.K. Thermodynamic aspects of the self-association and hydrophobic bonding of methylene blue. A model system for stacking interactions // JACS. 1970. - V. 92. - N 22. - P. 6419-6424.
20. Акбарова Д.М., Левшин JI.B. Влияние структуры молекул красителей на спектроскопические проявления их ассоциации // Ж. прикл. спектроскопии. 1969. - Т. 10. -№ 2. - С. 269-275.
21. Looyahdeh F., Moore J.S., Phillips G.O. Polyanions and their complexes. Part 9. Binding affinities of inorganic ions to heparin // J. Chem. Soc. Perkin II. -1974.-P. 1468-1471.
22. Lawton J.B., Phillips G.O. Polyanions and their complexes. Part 10. Mechanism of dye binding to chemically different sites // J. Chem. Soc. Perkin II. -1977.-P. 38-44.
23. Smith P.K., Mallia A.K., Hermanson G.T. Colorimetric method for the assay of heparin content in immobilizied heparin preparations // Anal. Biochem. -1980.-V. 109.-P. 466-473.
24. Яжебински Дж., Тонска С. О некоторых комплексных соединениях гепарина. IV. Гравиметрическое и колориметрическое определения мукополи-сахарида в виде комплексов с некоторыми красителями // Acta pol. pharm. 1986. - Т. 43. - № 5. - С. 454-460.
25. Enescu М., Lindqvist L. Excited state deactivation mechanism in methylene blue - nucleotide complexes: A picosecond trasient absorption study // J. Phys. Chem. - 1995. - V. 99.-N 20. - P. 8405-8411.
26. Tuite E., Kelly J.M. Beddard G.S., Reid G.S. Femtosecond deactivation of thionine singlet states by mononucleotides and polynucleotides // Chem. Phys. Lett. 1994. - V. 226. - N 5-6. - P. 517-524.
27. Bellin J.S., Yankus C.A. Effects of photodynamic degradation on the viscosity of deoxyribonucleic acid // Biochim. et biophys. acta. 1966. - V. 112. - N 2. -P. 363-371.
28. Jockusch S., Lee D., Turro N.J., Leonard E.F. Photoinduced inactivation of viruses: adsorbtion of methylene blue, thionine and thiopyronine on Qp bacteriophage // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1996. - V. 93. - N 15. - P. 7446-7451.
29. Saitow F. Nakaoka G. Photodynamic action of methylene blue on the Paramecium membrane // Photochem. And Photobiol. 1996. - V.63. - N 6. - P. 868873.
30. Способ получения лекарственного препарата для фотохимиотерапевтиче-ского лечения опухолей мочевого пузыря / Пат. ГДР N 272033.
31. Способ получения лекарственных средств для тепловой обработки опухолевых тканей / Пат. ГДР 259351.32. Яп. заявка 3.1 146829.
32. Tuite Е., Norden В. Sequence specific interactions of methylene blue with polynucleotides and DNA. A spectroscopic study // J. Amer. Chem. Soc. -1994. - V. 116. - N 17. - P. 7548-7556.
33. Fujimoto B.S., Clendenning J.B., Delrow J.J. et al. Fluorecence and photo-bleaching studies of methylene blue binding to DNA // J. Phys. Chem. 1994. -V.98.-N. 26.-P. 6633-6643.
34. Touitou E., Fishen P. Prevention of molecular self-association by sodium salicylate: effect on methylene blue. // J. Pharm. Sci. 1986. - V.75.-N. 4.
35. Hamai S. Complex formation in cationic dye-organic anion systems in aqueuos solutions // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1985. - V. 58. - N 7. - P. 2099-2106
36. Зеленин A.B. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой. -М.:Наука. 1971. - С. 231.
37. Diakun G.P., Edwards Н.Е., Allen J.C., Phillips G.O., Cundall R.B. A simple purpose-built fluorimeter for the titrimetric assay of glycosaminoglycans // Anal. Biochem. 1979. - V. 94. - P. 378-382.
38. Хачатуров E.H., Смирнова E.A. Применение риванола-БОг для цитофлуорометрии ДНК // Изв. АН СССР, сер. биол. 1966. - N 6. - С. 900-904.
39. Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови М.: Медицина. - 1983. - 224 С.
40. Тукачинский С.Е., Моисеева В.П. Связывание риванола с сывороточными белками // Биохимия. 1961. - Т. 26. -N 1. - С. 120-125.
41. Шараев П.Н., Иванов В.Г. и др. Биохимические методы анализа показателей обмена биополимеров соединительной ткани // Инф. письмо. Ижевск,-1980.-С. 15.
42. Tatibouet A, Demeunynsk M., Lhomme J. Synthesis of polyfunkctionalezed Troger's Base analogs derived from ethacridine (6,9-diamino-2-ethoxyacridine) // Synth. Commun. 1996. - V. 26. -N 23. - P. 4375-4395.
43. Бармин Д.А., Гончаренко С.Б., Сернов JI.H. Антигипоксическая активность производных 9-аминоакридина. Тез. докл. // 3 Рос. нац. конгресс «Человек и лекарство». Москва, 1996. - Сборник докл. - С. 9.
44. Carrington S., Qarawi М.А., Moss S., Pouton C.W., Blagbrough I.S. // 9-Aminoacridine-spermine conjugates are cytotoxic against murine melanoma cells // J. Pharm. and Pharmacol. 1997. - V. 49. - N 4 - C. 102.
45. Лакин K.M. Современные антитромботические средства (обзор) // Хим,-фарм. журн. 1985. - № 10 - С. 1180-1192.
46. Kitamoto G., Tomita М., Kiyama S. et al. Antithrombotic mechanisms of urokinase immobilized polyurethane // Thromb. Haemostasis. 1991. - V. 65. - N l.-P. 73-75.50. PCT 90 00,343.51. PCT 89 10,377.
47. Барбараш Л.С., Барбараш Н.А., Журавлева И.Ю. Биопротезы клапанов сердца Кемерово, 1995. - 399 С.
48. Лакин К.М., Балуда В.П. Фармакологическая регуляция жидкого состояния крови / Актуальные проблемы гемостазиологии. М.: Наука, 1981. - С. 456-460.
49. Новикова С.П., Немец Е.А., Беломестная З.М. Способ повышения тромборезистентности полимерных материалов / А. С. 1391652 (СССР).
50. Allen В.Т., Sparks R.E. // J. Surg. Res. 1984. - V. 36. -N 1. - P. 80-88.
51. Ленковски Ф., Нейринк Н.Г., Глезер С.В. Применение ацетилсалициловой кислоты при ИБС. // Терапевтич. Архив. 1996. -N. 8. - С. 79-83.
52. Бычков С.М. Новые данные о гепарине (обзор) // Вопр. мед. химии. -1981. Т. 27. - N 6. - С. 726-735.
53. Панов В.П., Овсепян A.M. Физико-химическое изучение гепарина (обзор) // Хим.-фарм. журнал. 1979. - N 12. - С. 72-86.
54. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры М.: Химия.-1986.-293 С.
55. Валуев Л.И. Гепаринсодержащие полимерные материалы // Итоги науки и техники. Сер.: Химия и технология высокомолекулярных соединений. -М.: ВИНИТИ, 1981.-Т. 16.-С. 168-210.
56. Жозефович М., Жозефович Ж. Гепаринсодержащие и гепариноподобные полимеры // Журн. Всесоз. хим. общ. им. Д.И. Менделеева. 1985. - Т. XXX,-N4.-С. 410-419.
57. Davidson G.W.R., Peppas N.A., Tornhill J.A., Ash S.R. Assesment of biomaterials as components of a reciprocating dialyser during canine dialysis // Biomaterials. 1984. - V. 5. - N 4. - P. 227-233.
58. Neenan T.X., Allock H.R. Synthesis of the polyorganophosphazene with heparin // Biomaterials. 1982. - V. 3. - N 2. - P. 78-80.
59. Basmadjian D., Sefton M.V. Relationship between release rate and surface concentration for heparinized materials // J. Biomed. Mater. Res. 1983. - V. 17. - N 3. - P. 509-518.
60. Cholakis X., Sefton M.V. Chemical fixation of heparin in heparin-PVA complex // Amer. Chem. Soc. Polym. Preprints. 1983. - V. 24. - N 1. - P. 15-19.
61. Evangelista R.A., Sefton M.V. Coating of two polyetherpolyurethanes and polyethylene with a heparin-poly(vinylalconol). // Biomaterials. 1986. - V. 7. -Nl.-P. 206-211.
62. Labbare D., Lindon J., Silane J.W. et al. Synthesis and properties of covalently bound heparin surfaces // Adv. Biomater. 1982. - V. 3. - P. 475-480.
63. Tanzawa H., Mori Y., Harumiya N. Et al. Preparation and evaluation of a new athrombogenic heparinized hydrofilic polymer for use in cardiovascular system // ASAIO Trans. 1973. - V. 19. - P. 188-194.
64. Полимеры медицинского назначения / Под. ред. Сэноо Манабу (пер. с яп.). М.: Медицина. - 1981. - 248 С.
65. Larm О., Larsson R., Olsson P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified, reducing therminal residue //Biomater. Med. Dev. Artif. Organs. -1983. - V. 11. -P. 161.71.PCT91 09,113.
66. Venkataramani E.S., Senatore F., Feola M., et al. Nonthrombogenic small-caliber human umbilical vein vascular prosthesis // Surgery. 1986. - V. 6.-P. 735-741.
67. Антушев А.Ф. Профилактика инфицирования сосудистых протезов и тромбоза эндартерэктомированных артерий /Дисс. на соискание уч. степени канд. мед. наук. 1985.
68. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры С-Петербург: Гиппократ. - 1993. - 261 С.
69. Лебедев JT.B., Плоткин JI.JL, Смирнов А.Д. Протезы кровеносных сосудов- Л.: Медицина. 1975. - 159 С.
70. Schieholz J., Jansen В., Steinhauser Н. et al. Drug release from antibiotic-containing polyurethanes // New Polym. Mater. -1991. V. 3. - N 1 - P. 61-72.
71. Абакголат, ТУ-42-7424-02-093.
72. Смолянская A.3., Дронова O.M., Жуковский В.А. Исследование in vitro активности хирургических шовных материалов, содержащих цефалоспориновые антибиотики // Антибиотики и химиотерапия. 1994. -Т. 39.-N5.-С. 45-48.
73. Вирник А.Д., Пененжик М.А., Кондрашова Г.С. Новое в области получения антимикробных волокнистых материалов и их использование.- М.: ЦНИИТЭИЛегпром. 1980. - 56 С.
74. Брюсов П.Г., Иноятов И.М., Переходов С.Н. Профилактика несостоятельности сигморектальных анастомозов после передней резекции прямой кишки по поводу рака // Хирургия. -1996. N 2.-С. 45-48.
75. Коренман И.М. Новые титриметрические методы. М.: Химия. - 1983. -173 С.
76. Carbohydrate analysis. A practical approach / Edited by M.F. Chaplin & J.F Kennedy. ILR Press, Oxford, 1986. - 228 P.
77. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. Л.: Химия, 1986. - 432 С.
78. Fukusawa М., Girdis W., di Zerega G.S. // Int. J. Fertil.-1991.-V. 36.-T. 5.-P. 296-301.
79. Торчилин В.П., Максименко А.В., Клибанов А.Л., Паписов А.В. Новые подходы к использованию полимеров в качестве носителей терапевтических и диагностических функций / Сб. Полимеры медицинского назначения,- М.: ИНХС АН СССР. 1988. - С. 95-110,
80. Benedetti L.M., Торр Е.М., Stella V.J. Microspheres of hyaluronic acid esters fabrication methods and in vitro hydrocortizone release // J. Conrolled Release. - 1990. - V. 13. -N 1. - P. 33-41.
81. Preparation of water-insoluble derivatives of hyaluronic acid as surgical aids and drug delivery systems. US 5, 017, 229.1. Больница. скорой.медицинской помощи г.Уфы.иаз5»як« учреждения)1. АКТоб использовании предложения
82. Название предложения . .".СПО.С.О.б. антжб.акте.ржальн ОЙзадиты. анастомоз ©в. при. ре зе кдаях. кшечнжа".свидетельство о приоритете Ш9110963 от 2.0б.99г.
83. Авторы .Р^нафин. М.С.У,.Понеде лжща.И.Ю. . Абдуллжн.У.М,
84. Башнатов С.А., Джемилвв У.М., Хасанов А.Г., Тимербуашов- Ъ'М ' "Калашё' "Р ;т," квшюж '«VÄ;.:.
85. Использовано с «. .9.».CftffißHW. 19 99 г.
86. Предложение использовадо в ходе оперативноголвченш ЯЗ больных» у которых потребовалась,ре зе*щш. тонкого. и. то лотов? о. кщечнжа. с.положительным результатом. Случаев несостоятельности, других осложнений не отмечен Руководитель учреждения:
87. Главный врач: к.адд.мед.науд.йщааме тов Г.Ш*
88. Заведующий подразделением.аб ломинальнои. хирургии профе ссор. Р.М.Гаршюв1.1. Больница. .скороймедицинйкоё. помоди г .Уфыказвавие учреждения)1. АКТоб использовании предложения
89. Название предложения . ,"СпрООб. профИЛакТЖЖ. СПаечНШболезни брюшины", свидетельство о приоритете & 99106107 от 5.04.1999г.
90. Авторы МГС.Л ПонеделБкина И.Ю., Хасанов А.Г.,
91. Абдуллин У.М., Вашкатов С.А., Джемилав У.М.,
92. Тишр^латов • В-.М-." у • -Каланов- Р.37.- у • -Талинов • Р'.М.
93. Использовано с «.4.».СвЯ-^РЯ.19 99 г.
94. Заведующий подразделением:абдошншшной. хирургиипрофессор Р.М.Г^РШОВ5. .
95. Реквизиты учреждения: Республика Башкортостан, г.Уфа, улица Шафиева>2 городская клиническая больница №6,отделение хирургия сосудов1. АКТоб использовании изобретения2 мая 2000 года"
96. Регистрационный номер 99113894 от 07.07.99
97. Название изобретения: Способ профилактики асептического воспаления при операциях на магистральных сосудах.
98. Иатользовано с 25 января 1996 г. в отделении хирургии сосудов в соответствии с описанием изобретения.Л
99. Руководитель учреждения л ^ Р.Г. Ахметгареев
100. Зав. отделением , //¿¿^ ' ' Р.Ш Лагьшов
101. Городская клиническая больница №6 (предприятие, учреждение)1. АКТ ВНЕДРЕНИЯ7».июня 2000 г.
102. Регистрациошшй номер Госкомизобретений заявки на патент: 98119761, положительное решение от 02.11.1998г.1. Название предложения:
103. Способ получения материала с антимикробными свойствами
104. Шовные материалы с антимикробными свойствами, полученные по разработанной методике, использованы в отделении гнойной хирургии ГКБ №6 города Уфы при экстренних операциях на органах брюшной полости у 7 больных с «1» апреля 2000 года.
105. Заместитель главного врача по хирургии: ГКБ №6
106. Заведующий отделением гнойной хирургии:
