Лектинсодержащие растения флоры Центральной Азии. Исследование лектинов Datura innoxia тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

од

^ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН - ШСТИТУТ"шЬоРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академика САДНКОВА А О

На правах рукописи

ЛЕВИТСКАЯ Софья Владимировна

УДК 547.962.5

ЛЕКТИНСОДЕРЖАЩИЕ РАСТЕНИЯ ФЛОРЫ ЦЕНТРАЛЬНОЙ АЗИИ. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКТИНОВ DATURA INNOXIA.

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Ташкент - 1995

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте химии растительных веществ АН РУз.

Научный руководитель:

доктор химических наук,

профессор

ЮНУСОВ т.е.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

ДАВРАНОВ К. Д.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник МАНГУТОВА ».С. '

6едуй<ая организация:

Ташкентский фармацевтический институт

З^цнта диссертации состоится

часов на заседании Специализированного

gU-£l995 г. ■ эвета Д 015.21.21 при Институте биоорганической химии им. акад. Садыкова A.C." АН РУз по адресу: 700НЗ, Ташкент, ул. X. Абдуллаева, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБОХ АН РУз.

Автореферат разослан

-¿2L-

1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор химических наук

ЗВа^оЦ

Н. И. Барам

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интерес к тшо исследования за иосшш -нее десятилетие резко возрос в силу ряда обстоятельств, одним из которых является возможность использования .пектинов п медицине для решения клинических проблем, а также в качестве инструментов для изучения механизмов патологических процессов. С другой стороны, лектины нашли применение при выделении и изучении углеводов, выполняющих высокоспециализированные Функции в организмах, гликопротеинов, участвующих в иммунном ответе, в межклеточных контактах. В связи с этим, актуальным является поиск новых источников лектинов с различной углеводной специфичностью.

Особый интерес представляют лектины семейства 5о1апасеае. Свойства лектинов картофеля, томата и дурмана обыкновенного хорошо изучены, однако, структура белковой части остается неизвестной. Неясна и их биологическая роль. Как в случае всех НГ<СР характеристика пептидного компонента представляет значительные трудности из-за атипичных структурных особенностей этого класса гликопротеинов.

Несмотря ма структурное сходство и аналогию в углеводной специфичности, лектины пасленовых совершенно по-разному проявляют биологическуа активность, будь то локализация и функции в растениях или взаимодействие с бактериальными клеткамш, ¡слетками крови, действие на иммунную систему.' В связи с этим лектины Бо1апасеав представляют большой интерес и могут служить удобными инструментами как для изучения биосинтеза и Функций Ш^Р, в частности нерастворимых гликопротеинов клеточной, стенки растений, так и для изучения механизма трансформации лимфоцитов и других этапов иммунного ответа. Для понимания лс различий механизмов действия данных лектинов, чрезвычайно актуальными становятся исследования тонких структурных особенностей их молекул. Это имеет важное практическое значение для получения препаратов иммуномодулирущо-го действия.

Цель работы состояла в анализе флоры Центральной Азии на содержание лектинов, поиске новых источников, изучении физико-хими- • ческих, биологических свойств л структурно/функциональных соотно-. шений' на примере модельного лектина из наиболее перспективного п практическом плане источника.

В процессе работы выполнялись задачи:

3. Скрининг растительных экстрактов с помощьв теста гемаггля-

- 4 -

ишацни. Определение углеводной специфичности.

2. Выделение и очистка лектина дурмана индейского, как обладающего наиболее выраженной активностью, представителя малоизученного семейства Solanaceae. Изучение его состава и физико-химических свойств. Изучение структурных особенностей молекулы лектина.

3. Изучение влияния различных факторов на стабильность и активность лечтинов Datura innoxia.

Научная ноьизна » практическая__значимость работы. Впервые

проведен анализ растений, произраставших на территории Центральной Азии, на содержание в них лектинов. Выявлены 23 не описанных ранее источника лектинов. Изучена их углеводная и иммуно/имичес-кая специфичность. Выявлены 4 высокоспецнфичных анти-ОШ) лектина и 1 анти-А. Для 4х видов определена углеиодная специфичность.

Впервые из семян Datura innoxia, семейство Solanaceae, выделены и очищены два новые лектина Ij и 1г. Изучены их состав и физико-химические параметры, а тан^ь ¿акторы, определяющие стабильность/активность молекул лектинов. Изучена надмолекулярная структура.

Из шрота при производстве скополамина из семян Datura innoxia впервые получен высокоактивный лектии, обладающий ачмуносупрес-сивными свойствами. Разработан способ его получения.

Апробация работа. ' Материалы диссертации докладывались на 'VIII Пндо-Советском Симпозиуме "Химия природных соединении" (Хайдарабад, Индия. 1986); на VII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, 1G87); на Всесоюзной конференции по лектинам (Тарту, 1988); на И Международном симпозиуме по лекти-наы IMTERLEC 11 (Таллинн. 1989); на 1 Международном симпозиума "Химия природных соединений" (Таикент, 1991), на IV Международно;.; си-шозиуме "Protein Structure Functlon Relationship" (Карачи, Пакистан, 1995)".

Пуияшащщ. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ в виде статей и тезисов.

Структура s; обг&н вайо'Ш. Диссертант и^локепа на 138 страницах ыааинописного текста н сосгоит из введения, аналитического обзора литературы, изложения и обсуйдашя результатов, собственник исследований, заклачения» эшюршватапыюй части, выводов, списка литературы .(180 псточпнхои) и пршдакаш. Дпссергация содорша 14 таблиц и 21 рисунков.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Скрининг лектинов в растениях ф-лоры Центральной Азии.

На содержание лектинов нами проверено более 150 видов растопил следующих семейств: Craciferae, Leguminosas, Labialoe, Solanaceac, Liliacime. Исследовали экстракты или частично очищенные фракции с помощью реакции агглютинации нативных или модифицированных трипсином эритроцитов человека различных групп крови. Результата приведены в табл.1.

Гемагглгатиннрующая активность обнаружена в 23 не описанных ранее видах растений. В 12 случаях были получены экстракты с высоким титром агглютинации. С помощью частично гидролизованных трипсином эритроцитов удалось обнаружить лектины в 8 видах. Как и для других регионов, наибольпий процент выявленных лектинов принадлежал семейству Lcgvmnasze. Ни в одном из видов семейства луковичных гемагглэтинирующую активность не наблюдали. • В семенах lalv.s fronüosm и корнях Datura strcraoninn мы обнаружили высокос-пецифнчные антп-О(Н) лектины. Анти-(О)Н лектины семян Thermcpsis lanceolata и Ualiisoáenüron haícüsvúron выявлены нами на трипсини-знрованных эритроцитах,- Трипсшшзированнке эритроциты группу Л агглютинировались экстрактом семян 'J.cristatropis Iriphylla, семейство бобовых.

. При изучении углеводной специфичности, кроме набора, предложенного Луциком (1900), использовали производные углеводов, содержащие гидрофобные заместители, олигомеры с большим, чем 2 количеством остатков, полисахариды и углэводсодеркащие антибиотики. Специфичность установлена для четырех видов .(табл. 2). К сожаления, отсутствие сырьевой базц приведенных в табл. 2 видов растений ограничивает возможности их дальнеппего исследования с цельа внедрения в практику.

Таблица Я.

Иигибярование углевода;.!!! лектинной активности.

Вид растения Углеводы

L'i'i'.'n"i3 tal ifelina !,<jtb>jv'~'3 rnlkak Vicia ts.nni/olia „ Caravana bwUcat«nira Растворы Сахаров доба> ннругцей активности в D-глзкоза, D-наиноза, метил-й-О-глкко- и ¡лакнолир&чозидк, фруктоза П-ацотил-О-галактозашм 5ЛЯЛН к стандартному тесту генагГляти-коиэ'нюй к05щ8н?раЦ1Ш 0.2 М.

i_________„_________i

Таблица 1.

Новые виды лектинсодержащиг растений Центральной Азии.

Род

Вид

Тип эритроцитов ТитрНА"

Семейство Legminosao

Caragana lur'kcslanica Нога. 0, А, В 16

На l-modcndrcm îiatodeiulron Pall. 0* 2

La t hyrus latifolius 0, А, В 4,8,10

Lalhynis mulkak 0, А, В 8

Lot из frondоsus 0 0

Mcristotrapia triptiyLia А* 2

Onohriichin balciachuanica 0*. А*, в* 2

Oiytrapis Lrichocalycina 0*, к", в4 9

Jlwnvopsiu lancoolala 0* 2

Sophora alopacuroidcs 0, Л, в 2

Sop'wra alopacuroides (1.) 0, А, в 4

Vicia ravUonensis L. 0, А, в 4

Vicia tenui folia 0, А 4, 36, соотв.

Семейство Labiates

Dracocephaluv nodulasam Rupr. 0*. А*, в4 2

Ercmoalachyu mluccoloidcs о. А, В 2

Erenontac'iys Kaufmanniana RrI. 0, А, в 2

Origanum tyttanthun Gontscll. 0*. А", в* О

Salvia macro si pi ton 0*, А*. в* 2

Scutellaria adcuor,tenia о*. А*, в* 2

Семейство Cruciferae

Crambo iiotschyana Coiss 0, к, в 4

Goldbachia verrucosa ¡(от. 0, А, в 64

Lepiûium fcr/;anenss /torsh. 0, А 2

Stubendorffia Lipsîcyi U. Busch. 0, А, в 16

Stabviulorffia oriental is SchrenJc 0, Л, в 8

Семейство Solanaceas

Datura ifl'l'o rca 0, к, в 8

Ш l ura innoxia 0, ' А, в 512

Datura iimoxia (fl) А 2

Datura netel о. К в, 61

Balura slrœnonira 0, А. в 128

Datura slruao.'iitai (г) 0 2

" - гемаггла тпнцрующая активность,

* - трипешш эпрооанные зршрещиты.

Анализ!!рооап и образп;; семян, па ш:/: ''¡С; ■нем тех, что обоз-

начени: (1) - листья, (г) - iiOp:!!-!, (il) - М'0'i ■ы. (1 :г) - плод:

2. Выделение и очистка лектинов из семян Datura innoxia.

Изучение распределения активности по органам растения показало, что основная масса лектина сосредоточена в семенах, незначительная активность присутствует и в' цветках. Экстракт семян с одинаково высоким титром агглютинировал эритроциты человека различных групп крови: 0(Ш, А, В, АВ, ОМ, AN. Ингибиторный анализ не пасазал углеводной специфичности экстрактов даже при концентрации углеводов 0.6 М. В связи с этим, для выделения я очистки лектинов из семян Datura innoxia мы использовали конвенционные методы белковой химии.

Таблица 3.

Очистка лектинов из семян Datura iimasia.

I--1-i--i---1--!----1

I Стадия I Общий I Выход, I НА0би I НАУД I Степень I очистки I белок, мг I % I титр 1титр/мг1 очистки

I_i_i_i_i_i_

4000

I Сырой экстракт

I Фракционирование

I СКН4 )2 S04. 45 %

I 1. Осадок

! 2. Супернатант

I Гель-хроматография

I i. Ij 267.2

I 2. I, 115.2

ICO 256 0.064

1

1157 2343

30 888 0.768 12

6.7 400 1.3 28

2,9 240 2.1 32. Б

I Степень очистки выракеиа отношение!.! удельной активности I (НА/Д) определенной Фракции к !1АУЯ исходного экстракта.

Так:ш образом, списанный svíq способ выделения позволил получить двз формы лектина дурмрна имдоЛского I] и 12. очищенные з 20 и 32.5 pasa, соответственно, п составляло ~7% - (I,) и ~ 3% (12) Бкстрагируемого белка. Обцеэ содерг.ание лектина в сенеках составляло 0. 5%.

3 • Обг'яп хярзктернс/шз юттлюп }>at urg i ""gata.

Лвктшм дурмлпа индейского оказались глнкопротеингни, содер-гагдми сшяе 50зС уггг.подоп. Наличие в беляке углеводов я столь

Таблица d.

Физико-химическая характеристика лектинов Datura innoxia.

(-!-1-1

I I II I I2 I

I-1_1-1

I l.lir определено гель- 150 300 I

I хроматографией, kD I

I 2.Mr определено SDS-элект- I

I рофорезом no taeracili, kD 66 68 I

I З.Мг определено седимен- I

I тационнш анализом, kD 77 85.5 I

I 4.Коэффициент седиыента- I

I ции, S d.3 d. 3 I

I 5. Изоточка pi 3.9 6.0 I

I 6.Содержание углеводов, % 66 54 I

I 7. Нентральшэ. сахара I

I L-Ага: L-Fuic:D-Xyl: G: 1:2:1:2:2 1:0:2:1:1:3 I

I :D-Man:D-Gal:D-Glc I

I 8.АмиНосахара 0 0 I

I 9. Содержание Zn, % O.Oá 0.04 I

110.H-концевая Alt PCA PCA* I

111. Свободные SH-rpyrinu, ¡.i -1 1 I

I_:_:___l-

97. 4 MI) ■ $6. ú • 4Í.0

2?. О

10. i

ц. п Рис.1. Днск-электро$орез по LaeuMi' а) I]; б) 12; в) реперы, значительной количество не могло на отразиться па их поведение при гель-хроматографии, ионообменной хроматографии, диас-злекто-рофореао и изоэластрофокусированшг. Раскоддшия результатов, полученных-данными изтодаш следует, по-ввдкцзиу, »третировать.

имея в виду сказанное выше. Наиболее вероятными величинами молекулярной массы мономеров лектинов представляются средние значения при определении диск-электрофорезом по Laemmli и ультрацонтрн-фугированием.

Таблица 5.

Аминокислотный состав лектинов Datura innoxia

АН остаток I), моль'/3 I2, мольХ ¡

Asp 14.7 (15) 20.7 (21) j

Thr 12.1 (12) 15.2 (15) 1

Ser 25.3 (25) . • 28. 7 (29) 1

Glu 17.9 (18) 15.2 (15) 1

Pro 11.7 (12) 32.3 (32) 1

Gly 23.8 (24) 29. 1 (29) Î

Ala 8.1 (8) 15. 6 (15) 1

Cys* ■ 23.2 (23) 23.3 (23) 1

Val 3.0 (3) 7.0 (7) 1

îîel 1.3 (1) 2. 1 (2) !

Ile ' 1.9 (2) i. 8 (5) ]

Leu 3.3 . (3) 3.4 . (8) j

Туг 4.4 (4) 5.9 (6) 1

Phe i.8 (2) 4.3 (4) 1

¡Üs 1.2 (1) ' 2. i (2) 1

Lys«* 3. i (3) 7.7 (8) 1

Огп»** • + +

Arß 7.4 (7) 10.9 (11) !

Hyp • 18. ¡I (IB) 6LG (GU 1

Тгр**** n t . (7) o O. (3) 1

* - определено как Cys 1\,

** - определено без учета Огп,

*** - определено качественно,

*«■»*- определено спектрсфотометрнчески.

Из результатов Анализа аминокислотного состава лектинов Ualnhn innoxia стаду эт. что, несмотря па разницу в соотношениях амтгашелопш остаткоэ, оба лсктина отличают одни и то го харак-тсрияе особенности. Прзядо всего, это нгишчио, причем в значительной гошчсстве, окешфодннз. В Ц оксиЪролина 18 моль,-', а в 12 - 64. Стоп» вуссиоэ сояср*мя:2 сискпрогжн'д иэгестнэ и яг;л других лэ'.гпкюп ссгепства ппслсноеух - лэнттюв картофеля, дуршвни-

ка, томата, а также для гликопротеинов растительных клеточных стенок. Далее, для лектинов дурмана индейского характерно низкое содержание ароматических аминокислот и высокое - цкетеииа, глицина, серима, треонина, аспарагиновой и глутаминовой кислот. В отличие от других лектинов из семейства Solanaceac в исследуемых ноли лектинах обнаружен орнитин, кроме того , в отличие от лекти-иа картофеля присутствует Фснилаланин.

В таблице приведены значения содержания триптофана, определенные титрованием с N-бромсукцинимидом. После гидролиза метан-сульфокислотой мы определили в 1[ 2.3 М триптофана, а в 12 - 1.5 М. Liu (1972) показал, что высокий выход Тгр получается в гидроли-затах гликопротеинов, содержащих до 35% гексоз. В присутствии пентоз, по-видимому, триптофан подвергается деструкции в большей степени. Allen и Neubörger (1979) после кислотного гидролиза лек-тина картофеля получили выходы триптофана до 25%.

N-концевые аминокислоты лектинов определяли дансильньм методом. В обоих случаях М-концсвыс ампчокнелоты оказались блокированными. Применив метод Качазг.'.Л J. и Itano H.A. (1972) для раскрытия пирролидонового кольца, в обоих случаях в результате 8-часового метанолиза выявлялись глутаминовая кислота и глицин. Поскольку связь X-Gly сисоколабильна в описываемых условиях, мы считаем N-кснцевой аминокислотой и Ij. и 1г - пироглутамииовув кислоту (PCА).

Лектины дурмана индейского имеют необычные спектры КД. с Xmln при 203 пи и x^aK - при 222 тез (рис.2), в них отсутствуют типичные для a-спирали и 2-структур максимума в области 200 ran. Качественно КД-спектры лектинов Ij и I- похожи на 1(Д-спектры поли-оксипролина, показывание наличие кон£ормацнн полипролина II (РР II - лововрасаящал спираль с тремя остатками на полный виток и высотой вага 0.0,1 гея). Пан известно, отрицательный эффект Коттона при 200 Щ прояэдяат и кои$ормацин неупорядоченного гслубка. Однако, дагпше структуры могло различить по величине отрицательного максимума. Таким образом, несмотря на иеопредолеииости допущений при сравнении с описываемы!«! в литературе спектрами, пуино признать, что вероятность существования лектинов дурмана индейского в кощюрмацнн FP II очень велика.

Присутствие yrv.c-ведои печ^лдиваот ограничения па расчет элементов вторичной структуру. Поэтому остается сравнивать КД-снект -Р" образцов лектинов, подвергайся резюгквзд л::аь

качественно.

Таким образом, лектины дурмана индейского - обогащенные ок-сипролином гликопротеииы, содержащие свыше 50% углеводов, по-видимому, можно считать изолектинами, близкими по составу, которые имеют молекулярную массу 150 kD I, и 300 kD í¡, являются arpera-ЦИОН1П.ШИ системами с массами мономеров приближенно 70 kD.

Рис. 2. Спектры кругового дихроизма I¡ (1) и 1г (2).

При 503-электрофорезе в 7.5%-ноы полиакриламидном геле, рН 8.3, оба лектина мигрировали широкой полосой с приблизительно одинаковой подвижностью. Причем, обе полосы давали положительное окрашивание как на белки, так и на углеводы. После восстановлении р -меркагггоэтанолом (5%) при 100°С в течение 3-5 мин. при ЕОй-электрофорезо в 7.5%-ном ПААР, рН 8.3, в присутствии 2.5% £03, мы наблюдали по три белковые-полосы ( Рис. 3). Подвижности полученных белковых зон соответствовали молекулярным массам 27 кП, 13 кБ, 10 кй для I) ( Рис. 3 б); н 28 к0, 13.5 к0, 11 кП для 12 ( Рис. 3 в ), что было определено с помощью реперных белков. Параллельные гели окрашивали на углеводы. В обоих случаях проявились по одной полосе, которые совпадали с основными ( по массе }

f Рис. 3. Гель-электорфореэ

лектииов Catara limas in

(7.5% ПААГ, 2.5% SDS, рН 0.3):

_ а) интактнне, гомогенные Тг и 1г;

— б) и в) - восстановленные I¡ и

__!■>, соответстпенио.

о б 3

белковыми зонами с меньший подви^ностяьн. Длп разделения и виде-

линия субъединиц в гомогенном виде нативные лектины восстанавливали в различных условиях, и, затем, разделяли гель-фильтрацией. Как видно из рисунков, после восстановления как I]_ так и 12 , при гель-хроматографии в разных условиях мы получали по 2 (3) Фракции. Для препаративного разделения использовали колонку (1.8 х 57 см) с сефадексон С-75. Калибровали ее с помощь» декстрана (2 млн); гемоглобина (67 кО); овальбумина (45 кО); пепсина (35 кО); трипсина (24 кй); цитохрома (13 кО).

60 юо у;«,?

Рис. 4. Гель-хроматография восстановленного ^ на колонке (0.7x29 см) с сефадексон С-75.

>0 100 (/ МП

Рис. 5. Гель-хроматография восстановленного 12 на ко-

(0.7x29 сгл) с сефадексон С-75.

Согласно калибровочной кривой, высокомолекулярные фракции I! и 12 соответствовали молекулярный массам 52 КО и 71 кО, соответственно, а низкогалекулярные -5.5 1;0 и 6.0 КО. Объединенные фракции диализоаапп и сушили лиофильно. Полученные таким образом образцы не обладали гемаггяотннируюацш актнонрстыо. Их N-концевые аминокислоты не выявлялась, тшо;е как и исходных белках. По-видимому, Фракции, полученные гелъ-хроштографиеп. соответствует субъелшшцам при диск-одсктрофороза. Разницу в значениях ьолоку-лярных масс мо^но объяснить различны« шслздоа углеводной части при определении описанными иэтсдаш. Если это верно, лек'шны дурмана индейского состоят из 2-х основных и одноГ; минорной суишдп-ннц, свяэшиш дисульфид!¡иг.:!! связями, восстановление которых требует гостких 'у<;лоаиИ. Большие (по иассе) субг-единицы глнкозилнро-ваны. "

Альтернатншшн подходом при изучении структуры лектгаюв дурная з индейского разделений субщщииц натиыЬх лектинэс было их предварительное деглнкозилпрование. Лектины дурмана индейского, ц и являатся гликопротеинами, гликозипиропанншн в очень ви-сокой степени. Исходя из аминокислотного и углеводного состава, прадполоанть наличие о лаптопах связей ПуР-Ага, Бег-С-а1, £ег-/*у1, О-гликозидныо мег.:ду остатками шиосахаридеи. Устойчи-

оость их различна, поэтому для получения дегликозилированных производных мы варьировали условия расщепления. Щелочным гидролизом, гидролизом щавелевой и серной кислотами достичь полного деглико-зилированин лектинов при сохранении пептидных связей не удалось.

Лектины Datura innoxia дегликозилировали трифторметансульАо-новой кислотой (TFMS) по методу Edge (1981) при комнатной температуре в течение 1 часа и при 0° С, 3 часа. Продукты очищали экстракцией реагентов, диализом и гель-фильтрацией. Полноту реакции контролировали диск-электрофорезои по отсутствию окрашивания на углеводы и ТСХ. Об отсутствии расщепления пептидных связей судили по результатам диск-элс-ктрафореза, ТСХ на целлюлозе и определением Н-концевых аминокислот. После метанолиза дегликозилированных производных в условиях раскрытия пирролидонового цикла, идентифицировали Glu, как и в случае нативных лектинов. Анализ аминокислотного состава не показал потерь при обработке TFMS, по сравнений с исходным белком. Таким образом, было показано, что TFMS эффективно расщепляет гликозидные связи в лектинах Дурмана . индейского. Подобраны условия дегликозилирования, при которых лектины сохраняют гемагглютинирующу» активность (0" С, 3 часа). Выход реакции дегликозилирования составил 17%, что, учитывая содержание углеводов в исходном белке (84%), является удовлетворительным.

Спектр КД дегликозилнрованного лектина имел те же полосы поглощения, что и КД-спектр нативного, однако, меньшей интенсивности (Рис. 5).

Рнс.6. КД-спектр деглшсозилированного лектина.

Гелъ-олсктрофорезам, ТСХ и определением Н-концевсй аминокислоты было показано отсутствие деградации при дегликоэилировании. Следовательно, иабладаепое различие в спектрах натишюго и дегликозилированиого лелегина отражает различил в конфорнацни полипептида, возиаа-ю, вследствие частичкой денатурации деглшеозилнро-

ьанного образца. Это может означать, что углеводы имеют значение для нативной конформацин белкового компонента.

Поскольку в лектино дурмана индейского имеется значительное количество цистеина (цистина), дегликозилированный лектин Дурмана индейского ^ восстанавливали дитиотреитолоы по Клеланду и кар-бокснметил! фовали. Карбоисшетилированши лектин хронатографиро-вали на колонке с сефадексом С-75 в ФБС, рН 7.0,(Ряс.7).

Д

но

у'° 1 ^ Рис. 7. Гель-хроматография

КЬЮТ г на колонке (2.0 х 57 см) с сефадексом С-75 б ФБС,

¿О ' АО ¡/7"-» РЧ 1.2.

В результате гель-хроматографии получили две фракции КМ1 и КМП. Гемагглютпннрующеп активностью полученные производные на обладали. Как КМ1, так и 11!,III при УФ-спектроскопин показали характерные для белкой полосы поглощения. Н-концевые аминокислоты не выявлялись в обеих фракциях. На пластинках с целлшюзон 1Ш1

КМП - одним бистробегущнм пятном

проявлялся (Рис. 8).

пятном на старте,

Рис. 8.Тонкослойная хроматография на пластинках (6x9 сы) с целлюлозой в системе п-Ви:СН3С00Н:Ру:Но0. 1-1!, 2 - 01!,

•3 - КШ, 4 - КШ.

1 2 ' 3 4

При диск-электрофорезе б 7.5%-ком и 15Х-ком полиакриламидном геле, рН 0.3, с 0.1% 808, белковые полосы К1П и КМН углеводны':.! красителей не проявлялись (Рис. 9).

Рис. 9. БВЗ-элактрофороз в 15','¡¡-нам ПААГ, р!1 8.3,

а) проявлание бел1сов,

б) проявление углеводов.

1 - 1!. 2 - Ш1(

, , , * -з * 3 - КШ, í - КШ1.

По результатам диск-злоктрофореза с маркерными белками оце-

miniI молекулярную массу восстановленного лектина KHI - 21 KD

Для получения дополнительной информации о структуре полипе!' ■ тидов КМ! и KMII сравнивали фрагменты ферментативного расщепления. Карбоксимотилированый деглнкозшшрованинй лещин НЖ)1( гид ролизовали трипсином в соотношении белок/фермент (50/1) в N-otî'-i морфолинацетатном буфере, pH 8.3, при 37° С. Для того, чтобы по лучить небольшой набор крупных пептидов, применили конденсачп?! 1,2-циклогександионом по остаткам Arg. Продукты расщепления трипсином по остаткам Lys (0TFLy3) анализировали методами ТСХ на целлюлозе, ТСХ дансилпроизводных и методом пептидных карт.

В последнем случае хроматографировали в системе n-Bu:Py:CH3C00H:H20, а электрофорез проводили при pH 6.5 р РУВ при 800 - 1000 V в течение 4.0 - 60 мин. Пластинки проявляли нин-гидрин-коллидиновой смесью. Результаты приведены на Рис.10.

Рлекг'рафорсз а

S

Рис.10. Пептидные карты: а) полный триптичеекпй гидролиз KMX ; б) ограниченный тркптический гидролиз КИ1 по остаткам bvs; в) полный триптичеекпй гидролиз KMII.

liait видно 15з пептидных карт, в 0TTLysKMI имеются кислые, основные и 2 нейтральных, основных по содержанию ппептида. При бумажной хроматографии ОТ-глдролисата в системе БУВП проявлялись два Флуорсскаиин положительных п 4 тшгидрин положительных пятна. Вторую фракцию, полученную восстановительным карбоксиметилирова-Ь'иеп деглпкезилировгкного л&стина Ш!П тсдае расщепляли трппен-Пептидная карта приведена на рпс.Юв.

. Из полученных результатов следует, что, s отличие от .пектинов картофеля и Datum atrarmivn, ncv:miv' Dnlnra intwxia обладают субгодиничиой структурой. Субъеднпнцы связаны ковапентпо -посредством дисульфи.щш связен. Не исключается возможность су-;;;естпсг?-?1!ип многочисленных внутримолекулярных дисульфид! шх мостков.

- 16 -

5. Изучение влияния различных факторов на активность лектинов дурмана индейского.

При отсутствии токсичности, лектины Datura innoxia проявляют иммуносупрессивные свойства гуморального типа. С высоким титром (НАУД - 0.1 мкг/мл) агглютинируют лейкоциты и эритроциты человека различных групп крови: 0(Н), А, В, АВ. ОМ, AN. С меньшим титром лектины дурмана агглютинируют эритроциты лабораторных животных. В связи с отсутствием групповой специфичности возникал вопрос, оказывают ли они воздействие на фосфолипиды мембран, лияенные гли-копротеинов (мембраны без рецепторов). Опыты на искусственных фосфолипидных мембранах показали, что на проводимость по натрию лектины дурмана не влияют.

Для понимания механизма проявления лектинами физиологической активности необходимо выявить молекулы-мишени. Важной характеристикой лектинов, в связи с этим, является их углеводная специфичность. Для определения углеводной специфичности мы расширили набор углеводов, предложенный Луциком II, Д. и сотр. (1980). В инги-биторннй анализ были включены олиго- и полисахариды, глпкопептиды и гликопротеины. Реакция гемагглютинацин ингибировалась только при добавлении смсси хитоолигосаларидов и овальбумина. Инкубация с тетрахитобиозидом при молярном соотношении углевода к лектину 300/1 сникала титр гемагглятинпрующей активности (НА) только в 2-4 раза. Таким образом, по степени ингибировапия производными хитина, It н 12 в значительной степени отличаются от других лектинов семейства 5о1алассае. Взаимодействие с оаальбумином (Ova) имеет слолнпй характер, зависящий от исходных концентраций овальбумина. При концентрации Ova 50 мг/ыл титр ИЛ снижался со значения 2" 11 в контроле до значения При этом соотнесение ''■0 v а /Ц, о с составляло 230/1.

Лектины дурмана индейского оказались устойчивыми к действие высоких температур, рН среду, различии;: протсаз: трипенна, пепсина, проназы. пектофозтидипа (табл. 6). Вксош стабильность молекул лектинов дурмана обаспочйваотсл с еднон сторож,; наличием большого количества дисульф'.ццшк' связей, с'другой стсрош - углеводным компонентом, когдал!, по-ьнд::;:ому, значительно ргсгшостра-нен на поверхности кодеку;:.:. ■

На рис.11 и 12 приэедопу Щг-спжры лгктинов, тсриэстахирозач-ных при сисоких тешоратура::. При чеглгсратуриой депатургцпм при 75° С происходит увс/шсипз ?.«ц:пмуш sljeicra Коттона и укзиыетше

Таблица 6.

Влияние различных факторов на гемагглютинирущую активность лектинов Datura innoxia.

Обработка лектинов % от HAsoinp.

50°С, 30 мин. 100

60°С, 30 мин. ; 100

70°С, 15 мин. 100

75°С, 5 мин. 50

80°С, 5 мин. 50

100° С, 1 мин. 25

100°С, 5 мин. 0

2 < рН < 9 100

проназа, 0.2%,

37° С 2 часа 100

трипсин 100'

пепсин 100

пектофоэтидин 100

2 М мочевина 100

Иа^ЗЛТА 100

- Б + Б - 0

. ТРМЗ 100

1__1

максимума при тех же длинах волн, что и исходных белков. Значительное уменьшение максимума в области 220 г® происходит в результате 5-минутного кипячения, что сопровождается полной потерей активности. Наблюдаемая устойчивость полнпролин-П конформации полной денатурации при 75° С описана такие для гликопротеина клеточной стенки моркови и синтетического поли(НуР).-

Для проявления лектииаш 11 и 1г связывающих свойств существенными могут быть следующие структурные особенности. Может иметь значение наличие углеводов, в молекулах лектинов, а также высокое содержание оксипролина и цистеина, наличие триптофана. Из того Факта, что деглшгазилнрованные лектины обладали НА, следует, что углеводы не участвуют в связывающей активности лектинов гп у-Ш'о. Что касается цистеина. то, та; ¡сак при инкубации- с тиольнш реагентом НА не изменялась, следовательно, свободные БН-группы не входят в состав связывающего сайта. Производные лектинов, полученные восстановительным карбокскметилироваииеы, не обладали ге-

[.(агглютинирующей активностью. Таким образом, можно предположить, что наиболее существенным фактором стабильности/активности молекул лектинов Datura innoxia являются дисульфидные связи.

¿ í

iso А,пт

Рис.11. КД-спектры лектина термостатированного при: i -55° С (30 мин. ), 2 - 75° С

Рис.12. КД-спектры лектина 12, термостатированного при: 1 -

(30 мин. :

100° С. (бит. )

55° С (30 lililí.), 2 - 75° С (30 мин. ). 3 - 100° С, (5 мин. ).

В лектинах Datura Innoxia 2í% остатков триптофана селективно окисляется Н-бромсукцинныидом (NBS) в неденатурирующих условиях, что свидетельствует о том, что 1 или 2 остатка экспонированы на поверхности молекулы. При этом гемагглатпннрущая активность (НА) уменьшается на 50%. Когда била окислена половина триптофана, осталось лигль 30% НА0. При дальнейшем .добавлении окислителя гемагг-лятинирукцая активность продолжала быстро уменьшаться. Зависимость ^уменьшения AD - f(!.l 1ÍBS/ H белка) близка к линейной, следовательно, в данных условиях реагент специфичен триптофану. Резкое уменьшение НА при оттеши 21% 'Тгр позволяет предположить, что i (2) оста/гка суцоствзпш-! для взаимодействия и селективно окисляется ÜBS на начальна:-; стадиях. Количество остатков триптофана, участвующих в связывании с эритроцитами, определяли по методу Plts ¡¡ сотр. (1981) 110 графику ХНА00,гавизйся » f(n Тгра1ГКСЛев_ ,,0[0). Экстраполяция 1002-ной 1Ü к абсциссе показывает, что в связывании участыует i остаток/ i иолэкулу, что сондотельсьвует о возможном существен:¡ом значении одного остатка триптофана для проявления лектиноу активности.

Растительное сирьо для скрининга предоставлено сомешшм отдз-лои Ботанического сада A! i РУз и лабораторией ле!юрствашо-тейт-чшшх растений 11ХРВ АН РУо. Элементный состав определен в IÜU< ÁÜ РУз. Изучение влипни:; на БЛ:.1 проводилось п Институте Физиологии

АН РУз. Иммуносупрессивные свойства лектина Datura innoxia изучены научным сотрудником фармакологической лаборатории ИХРВ /II РУз к.н.н. Рахимовым А. Т.

ВЫВОДЫ.

1. На наличие лектинов проверено свыше 150 видов растений флоры Центральной Азии. Выявлено 23 новых источника, 4 оказались высокоспецифичными анти-О(Н), 1 - анти-А. Для 4х видов определена углеводная специфичность.

2. Из семян Datura innoxia, семейство Solanacaac, впервые выделены в гомогенном виде два новых лектина It и 12, составляющие в сумме 0.5% от массы семян. Показано, что лектины Datura innoxia являются высокоактивными гем- и лейкоагглютининами при минимальной концентрации 0.1 jig/ral.

3. Определены физико-химические характеристики лектинов. Установлено, что лектины являются гликопротеинаш, содержащими свыше 50% углеводов, обогащенными оксипролином и цистеином.

4. Показано, что лектины Ij и 12 обладают сложной надмолекулярной структурой (Mr 150 kD у It, 300 kD у I2), с массой мономеров 72 kD и 76 kD, соответственоо. .Молекулы лектинов состоят из Зх субъединиц, связанных дисульфиднши связями. Большие суб>с,ш'-ницы (с Mr 27 kD у It и 28 kD у I2) - глнкозилированы.

5. Установлено, что молекулы лектинов Datura innoxia являются термостабильныш, устойчивыми к действию рН среды, протеолизу.

6. Показано участке остатков Тгр в проявлении лектином активности и определяющее значение дисульфидных '-'вязей. Установлено, что углеводная часть не существенна для активности.

Основные положения диссертации опубликовали в следующих работах:

1. Левитская C.B., Асатов С. 11., Янусов Т.О. Новые виды лек-тинсодерааиих растений // Химия природ, соедин. — 1984. — N. 1С. 86-83.

2. Левитская С. В., Асатов С. И.Ю.чусоа Т. С. Выделение двух форм-лектина из ссияч Datura Innoxia // Xinum природ, сседпн,-1585. - U. Z - С. 256-259,

3.'- Левитская C.B., Янусов Т,С. Некоторые свойства двух лектинов из сг;.:яп Datura Innoxia // Химия природ, соедии., - 1905 - Н.8 - С. 816-847.

Í. Yuriusov -T.S., Lçvitskaya S.V. Datura Innoxia lectins //

Abstr. of VIII Indo-Soviet Symposium "Chemistry Natural Products" 1986, Dec. 8-12, India.

5. Юнусов Т.С.. Левитская С. В. Лектины Дурмана индейского // Материалы VII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов, 1987, 7-9 Okt., Тбилиси.

6. Юнусов Т.С., Левитская C.B. Лектины Datura Innoxia // В кн.: "Изучение и применение лектинов. T.I. Общие вопросы. Кипип и биохимия лектинов." / Уч. зап. Тартусского Ун-та 869. Труды по химии. - Тарту. - 1989.- С. 66-72.

7. Levitskaya S.V., Yunusov T.S. Datura innoxia lectins // in: "Book oí Abstr. IflTERLEC 11, 1989, June 4-5", Tallinn.

8. Левитская С.В., Юнусов Т.С. Изучение доступности остатков триптофана в молекулах лектинов Datura innoxia при химической модификации // Докл. АН РУз. Деп. в УзНТИ H 2140 - Уз94.-1994.

9. Левитская С.В., Юнусов Т.С. Изучение структуры лектинов Datura innoxia.I. Влияние различных факторов на активность лектинов. - 173/94. У ПС

10. Левитская C.B., Юнусов Т.С. Изучение структуры лектинов Datura innoxia.II. Дегликозилировапие трифторметансульфоновой кислотой. - 174/94. ХпС

Худоса.

С. В. Левитская

"Парказий Осий флорасининг лектип тутувчи усишпислари.

Datura innoxia лектинларинп урганил".

Марказий Осиё флорасПнинг беа оиласига маисуб уснмликлар лек-тинлари кенг кула:,¡да илк бор урганилган. Аввал ыаълуы булмаган 23 та тур топилиб, уларнинг 4 тасида ута ыа^сус антн-ОШ) лектинлар борлнги анш^панган. Углэводларга хослилик I та тур учун курсатпл-гаи.

Solanaceae оиласига ыансуб булган Datura InnoxiaimiHr уругидан mue бор Ij са lo лектинлари аг.ратиб олингзн. Лектинларнинг тарки-бн, физик-кимбвий тапс»;|/ларп, тузилишининг уз ига хослиги ва тузи-лияи билан 'фаоллиги орасидаш узаро ботаник ургаиилгал. Уларнинг таркибнда углеводлар нш-рюри 50% дач куплиги $амда ИуР ва Cys ларникг ппкдори сезиларли дараадда эканлигн ашкланган. Datura innoxia лектинларн ыураккаб юцоримолекуляр тузилишга ¿калиги, Il muir Ür 1Б0 l;D га са 12 нинг Mr 300 1;D га ца тегипли разгаща уларнинг шиомерлзрн ыассалари 72 UD га ва 76 UD га тент-

лиги анш^ланган. Solanaceae лектинларидан фар^н D. lnnoxla лек-тинлари суббирлик тузилииига зга зканлиги ани^ланган. Лектинлар-нннг ыолэнулалари Mr 27 kD. 13 liD ва 10 kD (Ij); 28 kD, 13.5 kD ва 11 kD (I2) булган икки асосий ва бир оз ми^дордаги суббирлик-лардан иборат. Лектинлар суббирликлари бир-биридан углеводлар ши$дордаги билан фар^ цилади. D. lnnoxla лектинларинилг богловчи-лик фаоллиги намобн булиаига углевод ^исмининг таъсири йу1£лиги курсатилган. Лектин молекулалари щори здарорат, мух4итнинг рН и. денатурловчи агентлар ва протеазалар таъсирига чидамлидир. Оксид-ланиш-^айтарилии шароитида лектинлар уз фаоллигини йу^отади. D.1ппох1анинг лектинлари нома^сус таъсирли (НАУД 0.1 икг/мл) Bijopn фаолликка зга булган лейко- ва геымагглютннинлардирлар. Улар за-рарспз булиб, гуморал типидаги иммуносупресснв хоссасини памоён ¡^нладнлар.

Чимкент химфармзаводида олинаднган D.lnnoxlann чнциндиларидан лектин препарат« олишнннг уч боа^ичли цулай усу ли иилаб чи^илган. Уибу манба уруридаги оцрил мшуюрининг сезиларли даракадалиги 1£айта палаш кароёнида унга бар^арорлик бахп этгани туфайли му^им а^амият касб этади.

Siiunn^ry.

S.V. Leyitskaya .

Lectin containing plants of Central Asian flora.

Investigation of lectins ircm Datura lnnoxla.

For the first time the search for lectins within a wide range of Central Asian plants of five families has been conducted. Lectins were determined in 23 new species, 'among them 4 ones are anti-O(H) lectins. The carbohydrate specificity has been determined for 4 species.

Two lectins - It and I2 have been isolated from the seeds of Datura innoxia, family Solanaceae, for. the first time. Both lectins are glycoproteins containing more than 50% of carboliydates. a great deal of ajaount of HyP and Cys. Lectins are characterized by complex nralecular structures with Mr 1Б0 kD (I1) end E00 kD (I2), and lir for monomers 72 kD end 76 kD, respectively. Lectins are composed oJ three subunlts with Mr 27 kD, 13 kD and 10 kD (1^ and 20 kD, 13.5 kD and И kD (1Й). The major nubunits are associated Tilth carbohydrates. Lectins I, end I2 are highly thermostable and resistant to етушо digestion. However,

they easely lose hemagglutination activity under oxidatlng-reducing conditions. ' Lectins deglycosilated with trifluororaethanesulfonic acid possessed of activity. Datura lnnoxia lectins agglutinate human erythrocytes of various types as well as leukocytes at 0. i jig/al and posessed Imaunosuppresive ability.

A simple three stage procedure of lectin purification frota the waste of Datura innoxia seeds has been developed.

Tmiofp.iif' "ff if tj/t IC.IIiCrfiil *fJ'31i» AH Pt'Cn y fi.'Illhll, i'.'lCcMtCT.m.

700170. TaaiKCiir, np. M. TopuKoro, 79.