Фуколектин икры окуня: олигосахаридная специфичность и экспресс-анализ углеводных антигенов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Прайзель, Оксана Юрьевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2003
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
ПРАЙЗЕЛЬ ОКСАНА ЮРЬЕВНА
ФУКОЛЕКТИН ИКРЫ ОКУНЯ: ОЛИГОСАХАРИДНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗ УГЛЕВОДНЫХ
АНТИГЕНОВ
Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА-2003 г.
Работа выполнена на кафедре Химии и технологии тонких органических соединений Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в Институте элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН
Научные руководители:
член-корреспондент РАН, профессор Евстигнеева Рима Порфирьевна доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
доктор химических наук, профессор Ведущая организация
Синицин Аркадий Пантелеймонович Варламов Валерий Петрович Институт биохимии РАН им. Баха
Защита диссертации состоится »рх/уЦрл 2003 г. в 15.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова (119831, Москва, М. Пироговская, 1) Автореферат разослан « 5 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,
старший научный сотрудник /Лютик А.И./
-А
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Лектины как цито- и гистохимические реагенты широко используются при изучении структуры гликопротеинов клеточной поверхности. Перспективным направлением является применение меченых лектинов в исследовании стадий трансформации мембранных и секреторных гликоконъюгатов при патологических процессах, в том числе злокачественных. В этом плане наиболее ценными гистохимическими реагентами на углеводные детерминанты являются узкоселективные лектины, специфичные к терминальному углеводу. Особенно редко встречаются углеводсвязывающие белки, специфичные к фукозе. a-L-фукоза является важным компонентом секреторных гликоконъюгатов, а также определяет фенотип многих клеточных популяций человека. Поскольку этот моносахарид входит в состав ряда антигенных детерминант, включая групповые вещества крови, трансформация которых ассоциируется с патологическими преобразованиями в клетке, и канцероэмбриональных антигенов, проявляющихся при различных онкологических заболеваниях, то исследование олигосахаридной специфичности новых фуколектинов представляет особый интерес для применения их в патоморфологической диагностике.
Ряд хорошо изученных фуколектинов широко используется в цито- и гистохимических исследованиях. Ими являются препараты семян растений Ulex europaeus и Lotus tetragonolobus, гриба пецицы оранжевой Aleuria aurantia и плазмы морского угря Anguilla anguilla. Поиск новых селективных фукозоспецифичных реагентов остается актуальной проблемой.
Одним из доступных источников фуколектинов является икра некоторых видов рыб. В частности, икра окуня содержит фукоЛектин, олигосахаридная специфичность которого не изучена. Исследование специфичности данного лекгина представлялось актуальным, так как это позволило определить перспективы его применения в качестве диагностического и прогностического маркера.
Диссертационная работа выполнена в рамках программ научных исследований Министерства образования РФ, проводимых в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова на кафедре Химии и технологии тонких органических соединений по теме № 1Б-4-865 «Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины», при поддержке грантов РФФИ № 00-03-32872а, «Ведущие научные школы» № 00-15-97866, и
научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», подпрограмма № 203 «Химия и химические продукты», раздел научно-технической подпрограммы 05 «Биотехнология», проект № 203. 05.04.002.
Цель работы
- Установление олигосахаридной специфичности фуколектина икры окуня.
- Получение диагностических реагентов на основе меченых производных лектина икры окуня.
- Применение фуколектина икры окуня в экспресс-анализе углеводных антигенных детерминант нетоксичного гликопротеина яда вьетнамского скорпиона.
Научная новизна работы
Для исследования специфичности лектина икры окуня разработан оригинальный твердофазный метод экспресс-анализа олигосахаридной специфичности фуколектинов с применением наночастиц коллоидного золота. Известно, что конъюгаты наночастиц коллоидного золота с биоспецифическими зондами широко используются в методах твердофазного анализа, однако для исследования специфичности лектинов данный подход не применялся. В настоящей работе отработаны методические приемы для получения новых маркеров наночастиц коллоидного золота на основе гликоконъюгатов, содержащих важные углеводные антигенные детерминанты, что позволило проводить прямую визуализацию продукта взаимодействия с пектином. Получены перспективные биоспецифические зонды на основе фукозосодержащих углеводных опухолевоассоциированных антигенов, которые успешно могут быть применены для экспресс-анализа неизученных фуколекганов.
Применение данного метода позволило определить уникальную углеводную специфичность фуколектина икры окуня, что было подтверждено исследованием биоспецифических реакций лектина известными методами анализа.
В данной работе установлено, что фукозоспецифичный лектин икры окуня является перспективным прогностическим и диагностическим реагентом, дополняющим существующие цито- и гистохимические зонды на основе известных фуколектинов.
Конъюгацией лекгана икры окуня с индикаторной меткой получены диагностические реагенты с новой олигосахаридной специфичностью.
Показано успешное применение меченого лектина икры окуня в анализе углеводных антигенных детерминант гликопротеинов.
Практическая значимость
Применение фукозоспецифичных лектинов обеспечивает получение надежной информации о составе и свойствах гликоконъюгатов клеток и тканей, а также об их структурном изменении в соответствии с характером и выраженностью многих патологических процессов. Это позволяет улучшить раннюю диагностику важнейших заболеваний человека, понимание механизмов заболеваний, а в ряде случаев - прогнозирования течения болезни и эффективности ее лечения. Меченые производные фуколектина икры окуня, специфически связывающие Н-детерминанту, присоединенную к углеводной последовательности тип 1 (Fucal-2Gal[Jl-3GlcNAc), в том числе в составе групповых веществ крови и дифукозилированных структур, и Leb-детерминанту (Fucal -2Galp 1-3 [Fuca 1 -4]GlcNAcp), являющуюся
биоспецифическим маркером клеток рака толстой кишки являются перспективными цито- и гистохимическими реагентами для применения их в патоморфологической диагностике.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на конкурсе молодых ученых ИНЭОС РАН им. Несмеянова (2001), на международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии». (2001, Москва-Тверь), на XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биолопш и биотехнологии». (2002, Москва), на 20"°й международной конференции «Interlec 20» (2002, Копенгаген), на III съезде биохимического общества (2002, Санкт-Петербург).
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 157 источников. Работа иллюстрирована 16 рисунками и содержит 1 схему и 17 таблиц.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Предметом исследования в настоящей работе являлся фуколектин икры окуня Perca fluviatilis, полученный аффинной хроматографией на иммобилизованном муцине кисты яичника человека группы крови Н(0) фирмой "Лектинотест" (Украина).
При электрофорезе в ПААГ в присутствии fi-меркаптоэтанола была обнаружена одна зона с молекулярной массой 13 кДа.
Для изучения углеводной специфичности лектина проводили исследование связывания лектина с конъюгатами, содержащими
олигосахаридные детерминанты, с применением различных методов анализа.
Диссертационная работа включала следующие этапы:
- Синтез конъюгатов на основе олигосахаридов, содержащих антигенные детерминанты
- Получение меченых производных гликоконъюгатов олигосахаридов
- Исследование специфичности лектина икры окуня методом дот-блот анализа
- Исследование специфичности лектина икры окуня методом преципитации высокомолекулярных гликоконъюгатов
- Исследование специфичности лектина икры окуня методом агглютинации наночастиц коллоидного золота, конъюгированных с углеводными лигандами
- Получение диагностических реагентов на основе лектина икры окуня
- Применение меченого лектина икры окуня в анализе углеводных антигенных детерминант неизученного гликопротеина.
1. СТРУКТУРА ГЖКОКОНЪЮГАТОВ, ИССЛЕДОВАННЫХ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ПЕКТИНОМ ИКРЫ ОКУНЯ Для исследования олигосахаридной специфичности лектина икры окуня использовали синтетические и природные гликопротеины. Синтетические гликопротеины, или неогликопротеины получали на основе олигосахаридных детерминант. Поскольку лектин икры окуня был первоначально охарактеризован как фукозоспецифичный, в работе использовали только фукогликоконъюгаты, либо их нефукозилированные предшественники. Три-, тетра-, пента- и гексасахаридные детерминанты были получены в чистом виде из грудного молока человека, которое, в отличие от молока других млекопитающих, является богатым источником сложных фукозосодержащих олигосахаридов. Дисахаридные фуколиганды были получены синтетическим путем.
Очищенные природные гликопротеины: Н-муцин кисты яичника человека и групповые вещества слизистой оболочки свиньи, обогащенные, соответственно А (йаМАса 1 -3 [Тиса 1 -2]Оа1) и В (Са1а1-3[Риса1-2](Ы) антигенами, использовали для исследования взаимодействия лектина икры окуня с антигенами групп крови.
Структуры гликоконъюгатов, исследованных на взаимодействие с лектином икры окуня представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Структуры гликоконъюгатов, исследованных на взаимодействие с пектином икры окуня
Структура гликоконъюгата Обозна чение Антигенная детерминанта
Оа1(Я-40с - БСА Ьас - БСА углеводная последовательность тип 6
Рисо1-2Са1- БСА 2'-РО -БСА Н-дисахарид
Гпса1-2Са1р1-401с - БСА 2'-РЬ -БСА Н тип 6-трисахарид
С»1р1-ЗС1сКАср1-ЗОаЩ1-401с - БСА ьыт- БСА Ьес-тетрасахарид
Гиса1-2Са1р 1 -3 й1сЫ Аср 1 -3 ваф 1 -401с - БСА ЬОТРI -БСА Нтип 1-пентасахарид
Са1р1-3[Риса1-4]С^Аср1-30а1р1-401с - БСА П -БСА Ье'-пентасахарид
Са1р1-4[Риса1-3]С1сЯАср1-30а1р1-401с - БСА ШЕТ Ш -БСА Ье*-нентасахарид
Гиса1-2Са1р1-3[Киса1-4]С^Аср1-30а1р1-401с - БСА 1Ж>1-БСА Ьеь-гексасахарид
Киса1 -2Са1р 1 -401сЫАсР 1 -Зваф 1 -3 ОаГЫАса-5ег/ТЬг - Я Вй-Н Н-антиген в составе муцина кисты яичника
СаИЧАса 1 -3 [Риса1-2] ва1р 1 -401сЫ Аср 1 -ЗОа1р1-ЗОа1КАса-8ег/ТЬг - Я ВСт-А А-антиген в составе муцина слизистой свиньи
Са1о1-3[Кисо1-21Са1р 1-401сЫАср 1 -ЗОафЬ ЗйаШАса -вег/ТЬг- Я Вй-В В-антиген в составе муцина слизистой свиньи
Я - остаток муцина.
Неогликопротеины были синтезированы конъюгацией олигосахаридов с деглшеозилированным бычьим сывороточным альбумином (БСА) методом восстановительного аминирования с различной степенью гликозилирования (схема 1). Были получены конъюгаты со степенью гликозилирования 5, 8, 24 и 30 моль олигосахарида на моль белка.
Схема 1
сн3он
>1ч«вн,ач уЛ °ч н,н * -* ~
сн2он
иг4
ч он ко^
вел
он
он
[•ш—вел
ко
При исследовании связывания лекгина с неогликопротеином 2ТЬ-БСА, содержащим различные количества трисахарида (рис.1.), было
обнаружено, что при гликозилировании 8 моль олигосахарида на моль белка достигается уровень взаимодействия, достаточный для анализа связывания (рис.2).
50 100 150 2'а-БСА (мкг)
>-■ 5 моль 2Т1_ на 1 моль БСА
■ - 8 моль 2Т1- на 1 моль БСА
24 моль 2Т1. на 1 моль БСА • 30 моль 2Т1. на 1 моль БСА
200
Рис.1. Взаимодействие лектина икры окуня с неогликопротеинами 2ТЬБСА различной степени гликозилирования.
Рис.2. Влияние степени гликозилирования неогликопротеина 2Т1_-БСА на связывание лектина икры окуня.
2. ИССЛЕДОВАНИЕ ОЛИГОСАХАРИДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЛЕКТИНА ИКРЫ ОКУНЯ МЕТОДОМ ДОТ-БЛОТ АНАЛИЗА С ДЕТЕКЦИЕЙ КОМПЛЕКСАМИ НАНОЧАСТИЦ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА Чувствительность и воспроизводимость анализа с использованием наночастиц коллоидного золота определяется количеством сорбированного лиганда и рН раствора коллоида. В таблице 2 представлены экспериментально подобранные оптимальные значения количества конъюгированного неогликопротеина и рН раствора коллоида, необходимые для образования стабильного комплекса с частицами коллоидного золота диаметром 17-20 нм.
Таблица 2.
Условия образования стабильного комплекса неогликопротеин -коллоидное золото
Наименование рН Количество лиганда (мкг) на 10 мл
лиганда адсорбции раствора
БСА
гликозилированный 6,5-7,0 600
Анализ специфичности проводили сорбцией лектина на поливинилидендифторидной мембране (ПВДФ) с прокрашиванием мечеными неогликопротеинами. Из полученных данных следует, что лектин взаимодействует с олигосахаридными структурами, содержащими дисахарид Риса1-20а1 (Н-антиген).
Существует несколько типов углеводных цепей, несущих Н антиген, среди них основными являются углеводные последовательности тип 1 (ваф 1 -ЗОкНАс-Я), или лакто-Ы-биоза, тип 2 (0а1р1-401сКАс-К), или Ы-ацетиллактозамин, тип 3/4 (Оа1р1-ЗОаШАса/рЫ?.), а также тип 6 (Оа1В1-4Ст1с-Я). Лектин икры окуня проявлял наиболее сильное взаимодействие с пентасахаридом Ь№Р I ( Н тип 1- антиген). В гексасахариде ЬКБ I ( Ьеь - антиген ) появление второй фукозы при ИсКАс лакто-М-биозы I уменьшало связывание в несколько раз по сравнению с Ь№Р I. Лектин не взаимодействовал с нефукозилированными олигосахаридами - Яактозой и тетрасахаридом Ь№Г (Ьес - антиген), а также с Ьеа- и Ье*-антигенами, содержащими БисаМ и Риса1-3, соответственно. Данные блотшнга лектина икры окуня были обработаны с использованием программы "УМеосЬш^отей- БогЬШ™ (рис. 3).
На основании данных дот-блот анализа было сделано предположение о специфическом распознавании лектином дисахаридной детерминанты Риса1-20а1 (Н-антиген). Необходимо было изучить возможность взаимодействия лектина окуня с другими Риса1-2йа1 содержащими антигенами - А и В.
Интенсивность окрашивания
123 123 123 123
Рис.3. Результаты обработки данных блоттинга лектина икры окуня с использованием программы \Лс1еос)еп8Коте1г ЭогЬА! ™. Окрашивание: а - 1-ЫРР 1-БСА-Аи17, б - 2'-РЬБСА-Аи17, в - 2ТС-БСА-Аи17, г - 1-БСА-Аи17. Концентрация нанесенного лектина (мкг): 1-1,2-5,3-10.
количество добавленного гликолротеина (мкг)
Рис.4. Взаимодействие лектина икры окуня с антигенами групп крови и с неогликопротеинами, содержащими Н-антиген
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ОЛИГОСАХАРИДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЛЕКТИНА ИКРЫ ОКУНЯ МЕТОДОМ ПРЕЦИПИТАЦИИ
Оценку связывания лектина икры окуня ,с синтетическими и природными гликопротеинами, содержащими дисахаридную Риса1-20а1 детерминанту проводили методом преципитации, использующим мультивалентность лектина и его способность осаждать высокомолекулярные гликоконъюгаты, определяя зависимость количества осажденного белка от количества добавленного гликопротеина (рис. 4).
Результаты анализа показали, что лектин икры окуня также связывается с А- и В - антигенами, в которых дисахарид Риса1-2Са1 экранирован присоединенными моносахаридами. Из антигенов групп крови самое сильное взаимодействие наблюдалось для муцина кисты яичника с групповой специфичностью «Н» (ВО-Н). Присоединение остатков Ы-ацетилгалактозамина (ВО-А) или галактозы (Вв-В) а1-3 гликозидной связью к Н - антигену уменьшало степень взаимодействия с лектином.
Полученные данные подтвердили, что исследуемый лектин селективно связывает аРис1-20а1 эпитоп независимо от несущей последовательности, включая дифукозилированные структуры и антигены групп крови.
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ОЛИГОСАХАРИДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЛЕКТИНА ИКРЫ ОКУНЯ МЕТОДОМ АГГЛЮТИНАЦИИ КОМПЛЕКСОВ НАНОЧАСТИЦ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА Изучение взаимодействия лектина икры окуня с олигосахаридами, содержащими Н-дисахарилную детерминанту и с антигенами групп крови проводили методом преципитации природных и синтетических гликопротеинов, сорбированных на наночастицах золотого коллоида, как модели клеток. Условия взаимодействия коллоида с муцином кисты яичника человека и муцинами слизистой оболочки свиньи представлены в таблице 3. Количественное определение связывания осуществляли с помощью спектрофотометрического измерения интенсивности окрашивания раствора с использованием серии растворов с разведением лектина от 10 до 100 мкМ (рис.5).
Таблица 3.
Условия образования стабильных комплексов муцинов с коллоидным золотом.
Наименование лиганда рН адсорбции Количество лиганда (мкг) на 10 мл коллоида
Муцин кисты яичника человека 7,5 400
Муцин слизистой оболочки свиньи 6,5 500
Достаточно высокую аффинность лектин проявлял по отношению к 2ТЬ (Н тип 6 - антиген), но самое сильное взаимодействие наблюдалось с пентасахаридом Ь№Р I (Н тип 1 - антиген), в то время как, 2ТО связывалась с пектином гораздо слабее, что свидетельствует о влиянии типа несущей последовательности. Присоединение аОаШАс к Н - антигену значительно сильнее влияло на аффинность лектина, чем добавление аОа1.
Н-антиген является одним из наиболее важных и распространенных фукоантигенов, экспрессия которого строго контролируется на генетическом уровне и зависит от типа ткани и клеток. Экспрессия Н-антигена на секреторных гликоконъюгатах и клетках одних органов необходима для их нормального функционирования, однако увеличение количества Риса1-20а1 эпитопов на других мембранных и секреторных гликоконъюгатах может свидетельствовать о патологическом преобразовании клетки. Так, увеличение экспрессии Н - антигена эпителиальными клетками толстой кишки является признаком начальных стадий раковой трансформации. Поэтому для ранней диагностики ряда заболеваний могут быть полезны реагенты, селективно распознающие Риса1-20а1 детерминанту.
0.75 0.95 1.15 1.35 1.55 1.75 1.95 2.15 логарифм концентрации добавленного лектина икры окуня,
мкм
Рис.5. Изменение оптического поглощения при агглютинации комплексов гликоконъюгат-наночастицы коллоидного золота пектином икры окуня.
На основании литературных данных был проведен сравнительный анализ олигосахаридной специфичности фуколектина икры окуня с олигосахаридной специфичностью известных анти-Н лектинов. Практически все изученные анти-Н лектины обладают специфичностью на углеводный фрагмент Биса I -20а1(31-401сНАс/01с-11, т.е. на Н тип 2/6 антиген.
Лектин икры окуня, специфически связывая Н тип 1 и Ьеь антигены, отличается по своей олигосахаридной специфичности от известных фуколектинов (таблица 4). В отличие от лектина икры окуня, ни один из них не диференцирует Н тип 1 и Ьеь - антигены от Ьеа- и Ьех-антигенов, и а 1-2 связанную фукозу независимо от несущей последовательности, в том числе в составе дифукозилированных структур и антигенов групп крови.
В этом плане лектин икры окуня может стать перспективным гистохимическим реагентом для изучения многих морфологических явлений. Было показано, что гликопротеины головного мозга содержат Риса1-20а1 эпитоп, который, является определяющим в функционировании нейронов, включая явление формирования долгосрочной памяти. Кроме того, Н-антиген является предшественником антигенов групп крови А и В. Очевидно, антигены групп крови экспрессируются на секреторных гликополимерах и мембранных гликоконъюгатах различных тканей, и развитие патологического процесса сопровождается изменением их экспрессии, чаще всего снятием галактозы с В - антигена и К-ацетилгалактозамина с А - антигена и трансформации их в Н эпитоп, что наблюдается при злокачественных новообразованиях толстой кишки.
Таблица 4.
Сравнение антигенной специфичности лектина икры окуня и других фуколектинов.
Лектин Антиген
Нтип 1 Н тип 2/6 Ье" Ьех Ье иу
Регса Аш>ШЧШ ++ -/+ - - + н.о.
Шех еигораеш I - ++ - - +/- ++
ЬоШ ¡еГгаеопоЬЬт - ++ - + - ++
АпкиШа апеиШа ++ ++ + - ++ +
А1еигю аитапйа + ++ + ++ ++ ++
СаШЫа ¡епиЩога + ++ - + - -
Сп//оша ¡¡рШ/оНа IV - - - - ++ ++
Примечания:
<++> - сильное взаимодействие <+> - слабое взаимодействие <-> - нет взаимодействия н.о. - не определено
Кроме того, лектин икры окуня проявляет достаточно высокое сродство к Ьеь - антигену, являющемуся биоспецифическим маркером клеток рака толстой кишки. Известные анти-Н лектины не дифференцируют Ьеь - антиген от Ье" - антигена, считающегося специфическим маркером метастатических клеток печени, и Ьеа -антигена, играющего важную роль в связывании ряда патогенных микроорганизмов с эпителиальными клетками человека. В этом плане лектин икры окуня является перспективным диагностическим и прогностическим гистохимическим маркером. Используя данный лектин в наборе с другими селективными фуколектинами можно получать информацию о клеточной поверхности и структуре гликопротеинов в тканях различных органов, а также исследовать стадии трансформации клеточных мембран и секреторных гликоконъюгатов при различных преобразованиях организма, в том числе злокачественных.
5. ПОЛУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ - МЕЧЕНЫХ
ПРОИЗВОДНЫХ ЛЕКТИНА ИКРЫ ОКУНЯ Лектины, обладающие сродством к сложным олигосахаридным структурам, как цито-, гисто- и биохимические реагенты широко используются в изучении структуры гликопротеинов. Разработан ряд методов анализа, основанных на применении лектинов, конъюгированных с индикаторной меткой. Это гистохимические методы, а также другие гетерофазные системы анализа, такие, как метод обнаружения углеводных антигенов на блотах - после электрофоретического разделения и переноса из геля на матрицу типа нитроцеллюлозы или поливинилидендифторидной мембраны.
Перспективным направлением является применение меченых лектинов в исследовании трансформации гликоконъюгатов при патологических процессах. Лектин икры окуня, селективно распознающий Н тип 1 антиген и онкофетальный Ьеь - антиген, дифференцируя их от Ьеа - и Ьех - антигенов может быть использован в проведении такого рода анализов. Для этой цели нами были изготовлены конъюгаты лектина икры окуня с биотином и с наночастицами коллоидного золота различного диаметра (таблица 5.).
Таблица 5.
Условия образования стабильных комплексов лектина икры окуня с коллоидным золотом
Размер наночастиц. рН адсорбции Количество лиганда (мкг)
коллоидного на 10 мл раствора
золота
37 - 40 нм 7,8 44
17-20 нм 7,8 500
Таблица 6.
Олигосахаридная специфичность лектинов, использованных для анализа
№ Наименование лектина Обозна чение Олигосахаридная специфичность
1 лектин окуня PFL N- ,0-ЦеПИ, Нтип1 Fuml-2GaI()l-30lcNAc
2 лектин аспарагуса LTA N-, О-Цепи, Нтип2 Fucal-2Gaipi-4GlcN,\c
3 лектин коры бобовника аиагиролистного LABA N-, О-Цепи, Нтип2 Fucal-2Gal|il-4GlcNAc
4 конканавалин А Con А олигоманнозидные и комплексные N-цепи
5 лектин подснежника GNA олигоманнозидные N-цепи aManl-2,3,6
6 лектин чечевицы LL N-цепи
7 лектин дурмана DSA GlcNAcpi-40'cNAc N-ЦеПИ Galp 1 -4GlcN Ас
8 агглютинин пшеницы WGA-I сиалированные O/N цепи, дегалактозилированные N-цепи, олигомеры хитина, полилактозаминные цепи.
9 агглютинин пшеницы сукцинилирован ный suc-WGA-I блокируется взаимодействие с сиалоолигосахаридами
10 лектин сои SBA О-ЦеПИ, GalNAcal -30а1(3
11 лектин арахиса PNA О-цепи, Т антиген Galp 1 -3GaíNAcaI-0-Thr(Ser)
12 агглютинин хлебного дерева AIA О-цепи, Т антиген Galp I -3GalNAca 1 -0-Thr(Ser)
13 лектин виноградной улитки HPL О-цепи, Т антиген А антиген Fucal-2[al-30alNAc]Gaipi-3/4GlcNAc антиген Форсмана GaIN Асо 1 -3GalNAc01 -3Gata 1 -3Gal31 -40lcN Ас
14 лектин купены многоцветковой РМА сиалоолигосахариды
15 лектин бузины черной SNL N-цепи 2-6 сиалоолигосахариды
Конъюгат лектина с биотином получали методом активированных эфиров. Для выявления локализации биотинилированного лектина используют высокое сродство биотина к гликопротеину яичного белка авидину или его дегликозилированному аналогу стрептавидину (К=10'15). Взаимодействие со (стрепт)авидиновым конъюгатом типа (стрепт)авидин - флуоресцеин или (стрепт)авидин - пероксидаза обеспечивает достаточно высокую чувствительность определения.
Для получения конъюгата лектина икры окуня с наночастицами коллоидного золота проводили его комплексообразование с частицами коллоида диаметром 17-20 нм и 37-40 нм.
6. ПРИМЕНЕНИЕ МЕЧЕНОГО ЛЕКТИНА ИКРЫ ОКУНЯ ДЛЯ ЭКСПРЕСС -АНАЛИЗА УГЛЕВОДНЫХ АНТИГЕНОВ ГЛИКОПРОТЕИНОВ.
Конъюгат лектина икры окуня в наборе с мечеными лектинами различной олигосахаридной специфичности использовали для исследования углеводных антигенов нового гликопротеина (таблица 6). Объектом исследования являлась высокомолекулярная фракция белков яда вьетнамского скорпиона, не проявляющая острой токсичности на лабораторных мышах.
6.1 Выявление наличия сложных углеводов и гликоконъюгатов в смеси белков яда вьетнамского скорпиона.
Присутствие углеводсодержащей фракции в смеси белков яда скорпиона было обнаружено проявлением на взаимодействие с маннозоспецифичным лектином семян канавалии (Con А) методом дот - блот анализа. Процедуру обнаружения локализации лектина на мембране проводили с помощью пероксидазы хрена. Благодаря поливалентности, Con А может связываться с маннозосодержащими гликопротеинами и затем с пероксидазой, которая вследствие высокого содержания маннозных цепей обладает сродством к лектину. Наблюдалось четкое связывание фракции белков яда скорпиона с лектином канавалии.
Проводили электрофорез смеси белков в пластине ПААГ в денатурирующих условиях в присутствии ДДС-Na. Для прокрашивания
белковых зон использовали краситель Кумасси G-250 в хлорной кислоте. Наблюдали наличие двух главных зон с молекулярными массами 48 и 72 кДа (рис.6).
Известно, что применение ДДС-Na-электрофореза для исследования гликопротеинов, особенно при высокой степени гликозилирования, часто сопровождается определенными трудностями. Так, при прокрашивании гликопротеинов на белки, часть полос либо не проявляется, либо получаются размытыми и не
alA;-W u 78 кЛа ■Г '.'"*
ш' 67 кДа
4L
НВ9 45 к Па
F
а б в г д
Рис 6. Электрофорез белков яда в ПААГ в присутствии ДДС-Ыа. Окрашивание Кумасси й 250. (а) смесь белков яда, 5мкг,(б)овальбумин, в)овотрансферрин,
(г)фосфорилаза,
(д)бычий сывороточный альбумин, 5мкг.
четкими. Поэтому для достоверного проявления белковых полос в геле использовали несколько методик с различными красителями: кумасси, коллоидное серебро, амидо-черный. Присутствие других прокрашиваемых полос при действии коллоидного серебра, является указанием на наличие детектируемых количеств минорных белков в смеси. Кроме того, если при прокрашивании Кумасси в-250 в районе с молекулярными массами 48 кДа и 72 кДа наблюдались одиночные полосы, то при прокрашивании коллоидным серебром и амидо-черным были видны по две рядом расположенные полосы.
Углеводсодержащая фракция в смеси белков яда скорпиона выявляли проявлением диальдегидных групп, образованных после окисления вицинальных диолов и гидроксильных групп углеводов под действием йодной кислоты после электрофоретического разделения смеси. Для выявления диальдегидных групп использовали ШИК -реакцию: реактив Шиффа - йодная кислота. Наблюдалась окрашенная зона в районе 42 кДа, что является экспериментальным указанием на то, что в смеси содержится гликопротеин. ШИК - реакция не является абсолютно достоверным подтверждением присутствия углеводов. В этом плане высокая аффинность и селективность лектинов к углеводам является существенным преимуществом при использовании их в качестве меченых реагентов. Окрашивание полос после разделения белковой смеси с помощью пектинового метода не только является достоверным свидетельством наличия углеводных составляющих но и дает информацию о строении углеводных компонентов биополимеров.
Поэтому для подтверждения наличия гликозилированного биополимера в смеси яда вьетнамского скорпиона мы использовали лектиновый метод анализа.
Исследование белков яда скорпиона проводили с применением набора лектинов различной углеводной специфичности. Из лектинов со специфичностью к 1<Г-гликанам использовали лектин семян канавалии мечевидной, специфичный на разветвленные Ы-гликаны и олигоманнозные цепи, агглютинин завязи пшеницы I, имеющий сродство к сиалированным К-гликанам, лектин бузины черной, проявляющий высокую аффинность к а.2-6 сиалосодержащим Ы-гликанам. Из лектинов, специфичных к О-гликанам, использовали лектин сои, распознающий концевой моносахарид ваМАс в О-гликанах. Фуколектин икры окуня использовали для выявления наличия Н -антигена.
В качестве индикаторной метки предварительно в лектины вводили наночастицы коллоидного золота. Условия сорбции лектинов на наночастицах подбирали экспериментально (таблица 7).
Таблица 7.
Условия образования стабильных комплексов лектинов с наночасгицами коллоидного золота диаметром 17-20 нм
Лектин рН адсорбции Количество лектина (мкг) на 10 мл коллоида.
Соп А 8,1 275
9 500
втчь 7,5 500
вВА 6,5 500
В качестве матрицы для электрофоретического переноса белков из геля использовали нитроцеллюлозную мембрану. При прокрашивании мембраны лектинами меченными частицами коллоидного золота диаметром 17-20 нм детектировалась одна полоса с молекулярной массой 42 кДа, что подтверждает результаты анализа с ШИК - реакцией. Лектиновый анализ показал наличие как И-, так и О-связанных гликанов. Наблюдалось сильное взаимодействие с лектином канавалии, в то время как связывание с агглютинином завязи пшеницы отсутствовало. Это можно объяснить тем, что лектин канавалии имеет более широкую специфичность. Окрашенная полоса наблюдалась при действии лектина сои, связывающего О-гликаны, содержащие концевой Ы-ацетилгалактозамин. Гликоконъюгат яда скорпиона проявлял сродство к фуколектину икры окуня, на основании чего можно сделать вывод о наличии Риса1-2Са! детерминанты в углеводных структурах биополимера.
Связывание с сиалоспецифичным лектином бузины черной отсутствовало, что было также подтверждено негативным анализом на сиаловые кислоты.
6.2. Очистка гликопротеина яда вьетнамского скорпиона методом ВЭЖХ.
Очистка фракции белков яда с целью получения индивидуального гликопротеина производилась методом ВЭЖХ на двух колонках Шгорас ТвКОЗОООЗ'МЗ. Смесь содержала один мажорный и несколько минорных пиков. Площадь хроматографического пика соответствующего главному компоненту, равнялась 60% от суммы площадей всех пиков. Для дальнейших исследований были отобраны основные пики, лиофилизованы и исследованы на содержание углеводов
методом Дюбуа. Наличие углеводов было обнаружено в главном компоненте смеси с содержанием 10-15 %.
6.3. Определение молекулярной массы гликопротеина яда вьетнамского скорпиона.
Молекулярная масса гликопротеина была определена методами ДДС-На-электрофореза и гельпроникающей хроматограф ии. Для определения молекулярной массы гликопротеина яда вьетнамского скорпиона методом ДДС-Ка-электрофореза в качестве стандартов использовали модельные гликопротеины с известными молекулярными массами: гликозилированный бычий сывороточный альбумин (67 кДа), альбумин куриного яйца (45 кДа), овомукоид (27 кДа). По результатам ДДС-Ка-электрофореза молекулярная масса гликопротеина была оценена как 42 кДа.
Молекулярный вес гликопротеина, также был исследован методом гель-проникающей ВЭЖХ на колонке ТЖ вЗОООЗМУ (300x7.5мм), элюцию проводили 100 мМ ЫаН2Р04 при рН 7. Для калибровки использовали следующие белки-свидетели: овотрансферрин (78 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), альбумин куриного яйца (45 кДа), карбоангидраза (30 кДа), соевый ингибитор трипсина (20 кДа), миоглобин (17.2 кДа), лизоцим куриный (14.3 кДа).
Результаты полученные с помощью ДДС-Ыа- электрофореза и гельпроникающей хроматографии, практически совпадают. Выделенный гликопротеин проявлялся в виде одной полосы в геле и одного пика на профиле элюции, что может служить критерием чистоты белка. Молекулярная масса гликопротеина яда вьетнамского скорпиона была оценена как 40 - 42 кДа. Характеристику выделенного гликопротеина целесообразно было дополнить анализом аминокислотного состава. Это, также, может быть полезно для подтверждения наличия в первичной аминокислотной последовательности потенциальных сайтов гликозилирования. Результаты исследования аминокислотного состава представлены в таблице 8.
Из представленных данных видно, что первичная последовательность содержит сайты как для О-, так и для гликозилирования.
Таблица 8.
Аминокислотный состав гликопротеина яда вьетнамского
скорпиона %
аминокислота содержание
AsxfD+N) 8.3
Thr 4.7
Ser 12.6
Glx(E+Q) 13.3
Pro -
Gly 16.2
Ala 8.9
Val 4.S
Met -
De 4.1
Leu 4.9
Tyr 1.8
, Phe 2.7
Hb 4.2
Lys 8.4
Arg 2.6
Trp 2.8
6.4. Экспресс-анализ углеводных детерминант гликопротеина яда вьетнамского скорпиона методом дот-блот анализа с детекцией пектинами мечеными наночастицами коллоидного золота.
Для анализа углеводных антигенных детерминант гликопротеина яда скорпиона были получены комплексы лектинов с коллоидным золотом диаметром 17-20 нм (таблица 9). Для анализа углеводных антигенных детерминант гликопротеина яда вьетнамского скорпиона было отобрано 15 лектинов с различной олигосахаридной специфичностью, в том числе фукозоспецифичный лектин икры окуня, проявляющий высокое сродство к Н тип 1 - антигену и фуколектины аспарагуса и бобовника анагиролистного связывающие Н тип 2 -антиген (таблица 6).
Таблица 9.
Условия образования стабильных комплексов пектинов с наночастицами коллоидного золота диаметром 17 - 20 нм
Лектин рН адсорбции Количество лектина (мкг) на 10 мл коллоида
Р^ 6,2 300
А1А 7 200
1АВА 6-6,5 130
IX 7-7,5 450
вКА 6,8 500
1ЛА 6,2 600
suc-WGAI 5,6 450
РМА 6,7 - 7,0 700
БвА 8,0 700
НРЬ 7,0 650
Результаты исследования углеводов гликопротеина яда скорпиона методом дот - блот анализа на поливинилидендифторидной мембране с прокрашиванием комплексами лектин - коллоидное золото показали сильное связывание с лектинами специфически распознающими олигоманнозидные цепи (СопА, IX, ОКА), очень слабо гликопротеин взаимодействовал с группой лектинов, имеющих аффинность к К-цепям комплексного типа (\VXjA I, Бис-^'ОА I, ББА). Достаточно сильное сродство гликопротеин проявлял по отношению к лектинам специфичным к О-гликанам (БВА, РКА, А1А, НРЬ). Из этой группы лектинов самую высокую аффинность показал лектин виноградной улитки (НРЬ), который в отличие от лектинов сои, арахиса и хлебного дерева (ЭВА, РКА, АЛА) распознает фукозосодержащий А антиген в О-гликанах. Наряду с этим, с гликопротеином хорошо взаимодействовали фукозоспецифичные лектины - икры окуня, аспарагуса и бобовника анагиролистного, на основании чего можно сделать вывод о наличии фукозилированных олигосахаридов в гликопротеине яда скорпиона.
Таким образом из полученных результатов был сделан вывод, что V гликопротеин содержит несиалированные О-гликаны, в т.ч.
фукозилированные, и К-гликаны олигоманнозидного типа.
Для очищенного гликопротеина яда скорпиона был проведен анализ углеводного состава, который показал гликозилирование белка -15%. Из нейтральных моносахаридов были детектированы - манноза, галактоза и фукоза, из заряженных - К-ацетилглюкозамин и К-ацетилгалактозамин.
ВЫВОДЫ
1. Синтезированы конъюгаты наночастиц коллоидного золота на основе фукозосодержащих углеводных опухолевоассоциированных антигенов.
2. Разработан метод экспресс-анализа олигосахаридной специфичности фуколектинов.
3. Установлена уникальная углеводная специфичность фуколектина икры окуня, отличающая его от используемых в диагностике фуколектинов.
4. Получены новые диагностические реагенты на основе фуколектина икры окуня, специфически распознающие онкофетальные Н тип 1 и Ьеь - антигены, дифференцируя их от Ьех и Ьеа - антигенов.
5. Впервые выделен гликопротеин яда вьетнамского скорпиона с молекулярной , массой 42 кДа в котором детектированы несиалированные О-гликаны, в т.ч. фукозилированные, и Ы-гликаны олигоманнозидного типа.
Приношу благодарность всем сотрудникам Лаборатории Физиологически Активных Биополимеров ИНЭС РАН за неоценимую помощь в работе.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Пискарев В.Е., Прайзель О.Ю., Евстигнеева Р.П., Ямсков И.А. Изучение олигосахаридной специфичности фуколектина икры окуня с использованием комплексов неогликопротеин - коллоидное золото.// Прикл. Биохимия и микробиология.- 2003.- Т.39.- № .1,- С. 94-98.
2. Евстигнеева Р.П., Ямсков И.А., Прайзель О.Ю., Пискарев В.Е. Фуколектин икры окуня Perca fluviatilis конъюгированный с коллоидным золотом: новый гистохимический реагент.// Доклады Академии Наук.- 2003.- Т. 389.- №. 5.- С. 106-109.
3. Прайзель О.Ю., Пискарев В.Е., Ямсков И.А. Использование комплексов коллоидного золота в гликохимии. Материалы конференции "От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии." Москва-Тверь. 2001. С.26.
4. Piskarev V.E., Preisel O.Yu. Fine Oligosaccharide Specificity of Fucose -specific Perch Oocyte Lectin.The Proceedings of Twentieth International Lectin Meeting (Interlec 20). Ed. I. Bog - Hansen . Copenhagen. 2002. P. 127.
5.Прайзель О.Ю., Пискарев B.E., Ямсков И.А. Использование комплексов коллоидного золота для экспресс - анализа углеводных антигенов гликопротеинов и оценки углеводной специфичности лектинов. XIV Зимняя международная молодежная научная школа " Перспективные направления физико - химической биологии и биотехнологии". Москва. 2002. С. 82.
6. Прайзель О.Ю., Пискарев В.Е., Ямсков И.А. Выделение нового гликопротеина яда вьетнамского скорпиона Buthus occitanus sp. и первичная оценка структуры углеводов методом лектинового анализа. III Съезд биохимического общества. Санкт - Петербург. 2002. С. 510.
7. Oksana Yu. Preisel, Rima Р. Evstigneeva, Igor A. Yamskov,
and Alexander A. Shtil. Fucose Specific Lectins in Cancer Research and Diagnosis.// International Journal of Oncology.- 2003. in press.
8. Прайзель О.Ю., Евстигнеева Р.П., Ямсков И.А. Применение фукозоспецифичных лектинов в диагностике и изучении новообразований.// Биомедицинская химия.- 2003. в печати.
I
f
Подписано в печать 1.08.2003 г. Формат 60x90,1/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 440
Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Русаковская, д.1. т. 264-30-73 www.blok01centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, переплет диссертаций.
1 í
ч
I»
( j
l
L, 1
I i
í
,1
I f
l
I ,
)
»1 Ъ$~\ 3
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ.
Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Фукозоспецифичные лектины в диагностике и изучении новообразований.
1.1 Важная роль a-L-фукозы в патологических процессах.
1.1.1 Особенности динамики фукозилированных рецепторов лектинов на последовательных этапах онтогенеза.
1.1.2 Антигены групп крови, изменение их экспрессии, ассоциируемое с патологическими трансформациями клетки.
1.1.3 Фукоза в изучении заболеваний неопухолевой природы.
1.1.4 Проявление фукозосодержащих опухолевых углеводных антигенов на мембранах злокачественных клеток.
1.2 Фуколектины: распространение, выделение, строение и получение диагностических реагентов. Тонкая углеводная специфичность.
1.2.1 Скрининг организмов на присутствие фукозоспецифичных лектинов.
1.2.2 Методы определения локализации лектинов их выделение, получение диагностических реагентов.
1.2.3 Строение фукозоспецифичных лектинов и тонкая углеводная специфичность.
1.3 Фукозоспецифичные лектины в диагностике и изучении новообразований.
Глава II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
III. 1 Материалы.
III.2 Методы исследования.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ПВДФ - поливинилидендифторидная мембрана БСА - бычий сывороточный альбумин Glc - D-глюкоза Gal - D-галактоза
GalNAc - D-N-ацетилгалактозамин GlcNAc - D-N-ацетилглюкозамин Man - D-манноза
NeuNAc - N-ацетилнейраминовая кислота
Fuc - L-фукоза
Lac - лактоза
2'FL - 2'-фукозиллактоза
2'FG - 2'-фукозилгалактоза
LNT - лакто-И-тетраоза
LNFP I - лакто-Ы-фукопентаоза I
LNFP II - лакто-К-фукопентаоза II
LNFP III - лакто-ТЯ-фукопентаоза III
LND I - лакто-Ы-дифукогексаоза I
BG-H - Н-антиген в составе муцина кисты яичника
BG-A - А-антиген в составе муцина слизистой оболочки свиньи
BG-B - В-антиген в составе муцина слизистой оболочки свиньи
PFL - лектин икры окуня Perca fluviatilis
UEAI - лектин Ulex europaeus I
LTA A - лектин Lotus tetragonolobus A
AAL - лектин Aleuria aurantia
AAA - лектин Anguilla anguilla
GSL IV - лектин Griffonia simplicifolia IV
GTL - лектин Galactia tenuiflora
Con A - лектин семян канавалии
GNA - лектин подснежника
LL - лектин чечевицы
DSA - лектин дурмана
WGA-I - лектин пшеницы suc-WGA-I - лектин пшеницы сукцинилированный SBA - лектин сои PNA - лектин арахиса AIA - лектин хлебного дерева HPL - лектин виноградной улитки РМА - лектин купены многоцветковой SNL - лектин бузины черной LAL - лектин бобовника анагиролистного
Лектины как цито- и гистохимические реагенты широко используются в изучении структуры гликопротеинов клеточной поверхности. Перспективным направлением является применение меченых лектинов в исследовании стадий трансформации клеточных мембранных и секреторных гликоконъюгатов при патологических процессах, в том числе злокачественных [1]. В этом плане наиболее ценными гистохимическими реагентами на углеводные детерминанты являются узкоселективные лектины, специфичные к терминальному углеводу. Особенно редко встречаются углеводсвязывающие белки, специфичные к фукозе. a-L-фукоза является важным компонентом секреторных гликоконъюгатов, а также определяет фенотип многих клеточных популяций человека [2]. Поскольку этот моносахарид входит в состав многих антигенных детерминант, в том числе групповых веществ крови, трансформация которых ассоциируется с патологическими преобразованиями в клетке, и канцероэмбриональных антигенов, проявляющихся при различных онкологических заболеваниях, то исследование олигосахаридной специфичности новых фуколектинов представляет особый интерес для применения их в патоморфологической диагностике.
Ряд хорошо изученных фуколектинов широко используется в цито- и гистохимических исследованиях. Ими являются препараты семян растений Ulex europaeus и Lotus tetragonolobus, гриба пецицы оранжевой Aleuria aurantia и плазмы морского угря Anguilla anguilla. Поиск новых селективных фукозоспецифичных реагентов остается актуальной проблемой.
Одним из доступных источников фуколектинов является икра некоторых видов рыб. В частности, икра окуня содержит фуколектин, олигосахаридная специфичность которого не изучена. Исследование специфичности данного лектина представлялось актуальным, так как это позволило бы определить перспективы его применения в качестве диагностического и прогностического маркера.
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
ФУКОЗОСПЕЦИФИЧНЫЕ ЛЕКТИНЫ В ДИАГНОСТИКЕ И ИЗУЧЕНИИ
НОВООБРАЗОВАНИЙ
Характеристическим свойством большинства, а возможно и всех белков, является их способность специфично и обратимо связываться с различными лигандами [3].
Пектины - это группа белков не иммунного происхождения, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры.
Хотя вопрос о биологической роли лектинов в настоящее время окончательно не решен, по-видимому, специфическое лектин-углеводное узнавание является универсальным молекулярным механизмом, лежащим в основе взаимосвязи и функционирования всех живых систем - от вирусов до человека [4].
Разнообразные возможности практического использования лектинов до конца не изучены. Некоторые лектины специфически агглютинируют человеческие эритроциты разных групп крови. Они находят применение при быстром определении групповой специфичности [5,6,7]. Лектины, фиксированные на носителе, широко применяются при выделении и очистке гликопротеинов разного происхождения [8,9]. Многие лектины вызывают трансформацию человеческих лимфоцитов in vitro, что определяет их использование в клеточной иммунологии. Неоднократно описывались методы разделения В- и Т-лимфоцитов при помощи лектинов. Их, также, используют для идентификации бактерий и вирусов [10]. Доказана эффективность применения лектинов в качестве антимикробных агентов [11], в том числе против вируса иммунодефицита человека [12,13]. Так называемый дот-блот анализ гликоконъюгатов, использующий их сорбцию на инертных макропористых мембранах, позволяет достаточно быстро получить информацию о наличии тех или иных антигенных углеводных детерминант в составе биополимера. Этот метод широко используется для диагностики многих заболеваний, сопровождающихся изменением гликозилирования [14,15]. Лектины как гистохимические и цитохимические реагенты позволяют получать информацию о месте нахождения гликопротеинов в тканях и на поверхности клеток и дают представление о химической структуре выявляемых углеводных групп [16]. Меченые лектины применяются в изучении стадий изменения клеточных мембран и структуры секреторных гликоконъюгатов при патологических процессах[17,18], в том числе злокачественном росте [19,20,21].
Точность и объем информации о структуре углеводных групп зависят прежде всего от полноты изучения взаимодействия лектина с различными модельными гликопептидами установленной структуры.
Не для каждого чистого лектина изучена с достаточной полнотой тонкая углеводная специфичность. Это в значительной мере связано с ограниченной доступностью олигосахаридов с установленным строением, которые получают либо непосредственно из биологических источников, либо путем многостадийных синтезов.
Большой интерес представляют все виды лектинов, но с медицинской точки зрения первостепенное значение имеют лектины, специфичные к следующим углеводам: D-маннозе, D-галактозе, N-ацетил-О-галактозамину, Ы-ацетил-О-глюкозамину, D-сиаловой кислоте и L-фукозе [22-27].
ВЫВОДЫ р 1. Синтезированы конъюгаты наночастиц коллоидного золота на основе фукозосодержащих углеводных опухолевоассоциированных антигенов.
2. Разработан метод экспресс-анализа олигосахаридной специфичности фуколектинов.
3.Установлена уникальная углеводная специфичность фуколектина икры окуня, отличающая его от используемых в диагностике фуколектинов.
4. Получены новые диагностические реагенты на основе фуколектина икры i окуня, специфически распознающие онкофетальные Н тип 1 и Le b антигены, дифференцируя их от Lex и Lea - антигенов.
5. Впервые выделен нетоксичный гликопротеин яда вьетнамского скорпиона с молекулярной массой 42 кДа в котором детектированы несиалированные О-гликаны, в т.ч. фукозилированные, и N-гликаны олигоманнозидного типа.
1. A. Konno, Y. Hoshino, S. Terashima, R. Motoki, Т. Kawaguchi. Carbohydrate expression profile of colorectal cancer cells is relevant to metastatic pattern and prognosis.//Clin. Exp. Metastasis. 2002. V. 19. P. 61-70.
2. H. Franz/Advances in lectin research.//V.2,VEB Verlag und Gesundheit,Berlin 1989
3. R. Mollicone, A. Cailleau, A. Imberty, P. Gane, S. Perez, R.R. Oriol. Recognition of the blood group H type 2 trisaccharide epitope by 28 monoclonal antibodies and three lectins.//Glycoconj.J,1996.V.13.P.263-271.
4. L. Delbaere, M. Vandonselaar, L. Prasad. Molecular recognition of a humanblood group determinant by a plant lectin//Can.J.Chem,1990.V.68.P.l 1161121.
5. K. Karhi, L. Andersson, P. Vuopio. Expression of blood group A antigens in human bone marrow cells.// Blood. 1981. V.57. P.147-151.
6. MM. Khin, JS. Hua, HC. Ng, T. Wadstrom, H.M. Bow. Agglutination of Helicobacter pylori coccoids by lectins.// World J Gastroenterol. 2000 V. 6. P. 202-209.
7. M.M. Cowan. Plant products as antimicrobial agents.//Clin. Microbiol Rev. I 1999. V.12. N.4. P.564-582.
8. E. De Clercq. Antiviral therapy for human immunodeficiency virus infections.// Clinical Microbiol Rev. 1995. V.8. N.2. P.200-239.
9. N. Sumar, KB. Bodman, TW. Rademacher, RA. Dwek, P. Williams , RB. I Parekh, J. Edge, GA. Rook, DA. Isenberg, FC. Hay. Analysis of glycosylationchanges in IgG using lectins.// J Immunol Methods. 1990. V. 131. P. 127-136.
10. W.Tang, A.Matsumoto, K.Shikata, F. Takeuchi, T. Konishi, M. Nakata, T. Mizuochi. Detection of disease-specific augmentation of abnormal immunoglobulin G in sera of patients with rheumatoid arthritis.//Glycoconjugate Journal. 1998. V.15. P.929-934.
11. DC. Poland, CG. Schalkwijk, CD. Stehouwer, CA. Koeleman, B. van het Hof, WD. van Dijk. Increased alpha3-fucosylation of alphal-acid glycoprotein in
12. Type I diabetic patients is related to vascular function.// Glycoconj J. 2001.1. V.18. P.261-268.
13. P.Vischer, W.Reutter. Different turnover of fucose residues in plasma membranes of rat liver and Morris hepatoma 7777.// Biochem. J. 1980. V.190.1.P.51-55.
14. T. Ohkura, T. Hada, K. Higashino, T. Ohue, N. Kochibe, N. Koide, K. Yamashita. Increase of fiicosylated serum cholinesterase in relation to high risk groups for hepatocellular carcinomas.// Cancer Res. 1994. V.54. N.l. P.55-61.
15. M. Liljeblad, I. Ryden, S. Ohlson, A. Lundblad, P. Pahlsson . A lectin immunosensor technique for determination of alpha(l)-acid glycoprotein fucosylation.// Anal. Biochem. 2001. V.288. P.216-224.
16. DJ. Moloney, AI. Lin, RS. Haltiwanger. The O-linked fucose glycosylation к pathway. Evidence for protein-specific elongation of o-linked fucose in
17. Chinese hamster ovary cells.// J. Biol. Chem. 1997. V.272. V. 19046-19050.
18. S. Schroter, P. Derr, HS. Conradt, M. Nimtz, G. Hale, C. Kirchhoff. Malespecific modification of human CD52.// J. Biol. Chem. 1999. V.274. P.29862-29873.
19. KH. Smalla, F. Angenstein, K. Richter, ED. Gundelfinger, S. Staak. Identification of fucose alpha(l-2) galactose epitope-containing glycoproteins from rat hippocampus.//Neuroreport. 1998. V.9. P.813-817.
20. J. Finne, ME. Breimer, GC. Hansson, KA. Karlsson, H. Leffler, JF. Vliegenthart , H. van Halbeek. Novel polyfucosylated N-linked glycopeptides
21. Ь with blood group A, H, X, and Y determinants from human small intestinalepithelial cells.//J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.5720-5735.
22. HM. Flowers. Chemistry and biochemistry of D- and L-fucose.// Adv.Carbohydr.Chem.Biochem. 1981. V.39. P.279-345.
23. A. Karsan, CJ. Cornejo, RK. Winn, BR. Schwartz, W. Way, N. Lannir, R. I Gershoni-Baruch, A. Etzioni, HD. Ochs, JM. Harlan. Leukocyte Adhesion
24. Deficiency Type П is a generalized defect of de novo GDP-fucose biosynthesis. Endothelial cell fucosylation is not required for neutrophil rolling on human nonlymphoid endothelium.// J. Clin. Invest. 1998. V.101. P.2438-2445.
25. W. Sasak, A. Quaroni, A. Herscovics. Changes in cell-surface fucose-containing glycopeptides and adhesion of cultured intestinal epithelial cells as a function of cell density.// Biochem. J. 1983. V.211. P.75-80.
26. P 32. M. Gacto. Loss of cell-population-density-dependent incorporation of fucoseinto the lipid fraction of cultured human tumour cells.// Biochem. J. 1978. V.172. P.181-184.
27. E. Mas, C. Crotte, D. Lecestre, JC. Michalski, MJ. Escribano, D. Lombardo, MO. Sadoulet. The oncofetal J28 epitope involves fucosylated O-linked oligosaccharide structures of the fetoacinar pancreatic protein.// Glycobiology. 1997. V.7. N.6. P.745-752.
28. E. Alonso, FJ. Saez, JF. Madrid, F. Hernandez. Lectin histochemistry shows t fucosylated glycoconjugates in the primordial germ cells of Xenopusembryos.//J. Histochem. Cytochem. 2003. V.51. P.239-243.
29. Н.Э. Нифаньтьев, Ю.Е. Цветков, А.С. Шашков, А.Б. Тузиков, И.Б. Масленников, И.С. Попова, Н.В. Бовин. Рецепторы селектинов. 1. Синтез тетрасахаридов SiaLe(a) и SiaLe(x) и их полимерных конъюгатов.// Биоорг.Хим. 1994. V. 20. N. 5. Р. 551-555.
30. ВА. Fenderson, ЕМ. Eddy, S. Hakomori. Glycoconjugate expression during embryogenesis and its biological significance.// Bioessays. 1990. V.12. P. 173
31. H. Lucas, S. Bercegeay, J. Le Pendu, M. Jean, S. Mirallie, P. Barriere. A fucose-containing epitope potentially involved in gamete interaction on the human zona pellucida.//Hum.Reprod. 1994. V.9. N.8. P.l532-1538.
32. D. Solter, BB. Knowles. Monoclonal antibody defining a stage-specific mouse embryonic antigen (SSEA-1).// Proc.Natl.Acad.Sci USA. 1978. V.75 . P.5565-5569.
33. S. Hakomori. Possible functions of tumor-associated carbohydrate antigens.// Cuxr.Opin.Immunol. 1991. V.3. P.646-653.
34. S. Hakomori. Antigen structure and genetig basis of histo-blood groups А,В and O: the changes associated with human cancer.// Biochimica Biophysica Acta. 1999. V.l 473.P.247-266.
35. AJ. Ligtenberg, EC. Veerman, AV. Nieuw Amerongen. A role for Lewis a antigens on salivary agglutinin in binding to Streptococcus mutans.// Antonie VanLeeuwenhock. 2000. V.77. N.l. P.21-30.
36. PJ. Giannasca, KT. Giannasca, AM. Leichtner, MR. Neutra Human intestinal M cells display the sialyl Lewis A antigen.// Infect. Immun. 1999. У .61. P.946-953.
37. T.Irimura, K.Denda, S. Iida, H. Takeuchi, K. Kato. Diverse Glycosylation of MUC1 and MUC2: Potential Significance in Tumor Immunity.// J.Biochem.1999. V.126. P.975-985.
38. T.Matsui. Y.Fujimura. S.Nishida, K. Titani. Human plasma alpha 2-macroglobulin and von Willebrand factor prossess linked ABO(H) blood group antigens in subjects with corresponding ABO phenotype.// Blood. 1993. V.82. N.2. P.663-668.
39. J. Madrid, O. Leis, L.Diaz-Flores, F. Hernandez. Secretion of fucosylated oligosaccharides related to the H antigen by human gastric cells.// Histochem.Cell.Biol. 1998. V.110. P.295-301.
40. E.Brinkman-vander Linden, E. vam Ommen, W. van Dijk. Glycosylation of alphal-acid glycoprotein in septic shock: changes in degree of branching and in expression of sialyl Lewis(x) groups.// Glycoconj.J. 1996. V.13. N.l. P.27-31.
41. R.Mollicone, T.Caillard, J.Pendu, A. Francois, N. Sansonetti, H. Villarroya, R. Oriol. Expression of ABH and X(LeX) antigens on platelets and lymphocytes.// Blood. 1988. V.71.P.1113-1119.
42. T. Feizi, R. Childs.Carbohydrate structures of glycoproteins and glycolipids as differentiation antigens, tumour-assosiated antigens and components of reseptor systems.// Trends in Biochem. 1985.V.10. P.26-29.
43. H. Yamashita, H. Kimoto, M. Hiemori, M. Okita, K. Suzuki, H. Tsuji. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay system for micro-detection of the wheat allergen,Tri a Bdl7k.// Biosci.Biotechnol.Biochem. 2001. V.65. N.12. P.2730-2734.
44. M. Fukuda, N. Hiraoka, JC. Yeh. C-type lectins and sialyl Lewis X » oligosaccharides. Versatile roles in cell-cell interaction.// J. Cell. Biol. 1999.1. V.147. P.467-470
45. A. Varki. Selectin ligands: Will the real ones please stand up?// J. Clin. Invest. 1997. V.99. P. 158-162
46. CL. Martens, SE. Cwirla, RY. Lee, E. Whitehorn, EY. Chen, A. Bakker, EL. Martin, C. Wagstrom, P. Gopalan, CW. Smith Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.// J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.2112921136
47. M. Hammel, G. Weitz-Schmidt, A. Krause, T. Moll, D. Vestweber, HG. Zerwes, R. Hallmann. Species-specific and conserved epitopes on mouse and human E-selectin important for leukocyte adhesion.// Exp. Cell. Res. 2001. V.269. P.266-274.
48. RT. Sawyer, RE. Garner, JA. Hudson. Effect of lectins on hepatic clearance I and killing of Candida albicans by the isolated perfused mouse liver.// Infect.1.mun. 1992. V.60. P. 1041-1046.
49. S. Das, M. Ramm, H. Kochanowski, S. Basu. Structural studies of the side chain of outer membrane lipopolysaccharide from Pseudomonas syringae pv. coriandricola W-43.// J. Bacteriol. 1994. V.176. P.6550-6557.
50. SI. Yokota, KI. Amano, Y. Shibata, M. Nakajima, M. Suzuki, S. Hayashi, N. Fujii, T. Yokochi. Two distinct antigenic types of the polysaccharide chains of
51. Helicobacter pylori lipopolysaccharides characterized by reactivity with serafrom humans with natural infection.// Infect. Immun. 2000. V.68. P.151-159.
52. SO. Hynes, S. Hirmo, T. Wadstrom, AP. Moran. Differentiation of Helicobacter pylori isolates based on lectin binding of cell extracts in an agglutination assay.//J. Clin. Microbiol. 1999. V.37. P. 1994-1998.
53. K. Andrianopoulos, L. Wang, PR. Reeves. Identification of the fucose synthetase gene in the colanic acid gene cluster of Escherichia coli K-12.// J. Bacteriol. 1998. V.180. P.998-1001.
54. P 64. BJ. Cameron, LJ. Douglas. Blood group glycolipids as epithelial cell receptorsfor Candida albicans.// Infect. Immun. 1996. V.64. P.891-896.
55. S. Kirkeby, D. Мое, ТС. Bog-Hansen. Fucose expression in skeletal muscle: a lectin histochemical study.//Histochem J. 1993. V.25. P.619-627.
56. A. Konno, Y. Hoshino, S. Terashima, R. Motoki, T. Kawaguchi. Carbohydrate expression profile of colorectal cancer cells is relevant to metastatic pattern and prognosis.// Clin. Exp. Metastasis. 2002. V.19. P.61-70.
57. F. Davey, M. Elghetany, A. Kurec. Immunophenotyping of hematologic neoplasms in paraffin-embedded tissue sections.// Am. Clin. Phatol. 1990. N.93. P.517-526.
58. T. Uchiyama, T. Ishikawa, A. Imura. Adhesion properties of adult T cell leukemia cells.// Leuk Lymphoma. 1995. V.16. P.407-412.
59. MH. Ravindranath, AA. Amiri, PM. Bauer, MC. Kelley, R. Essner, DL. Morton. Endothelial-selectin ligands sialyl Lewis(x) and sialyl Lewis(a) are differentiation antigens immunogenic in human melanoma.// Cancer. 1997. V.79. P.1686-1697.
60. S. Albelda. Role of cell adhesion molecules in tumor progression and metastasis.// England, Academic Press. 1994. P.71-88.
61. C. Ohyama, S. Tsuboi, M. Fukuda. Dual roles of sialyl Lewis X oligosaccharides in tumor metastasis and rejection by natural killer cells.// EMBO J. 1999. У.18. P.1516-1525.
62. JI. Ogawa, H. Inoue, S. Koide. alpha-2,3-Sialyltransferase type 3N and alpha-1,3-fucosyltransferase type VII are related to sialyl Lewis(x) synthesis and patient survival from lung carcinoma.// Cancer. 1997. V.79. P.1678-1685.
63. P. Trail, D. Willner, S. Lasch. Cure of xenografted human carcinimas by BR96 doxorubicin immunoconjugates.// Science. 1993. N.261. P.212-215.
64. CB. Siegall. Targeted therapy of carcinomas using BR96 sFv-PE40, a single-chain immunotoxin that binds to the Le(y) antigen.// Semin. Cancer. Biol. 1995. V.6. P.289-295.
65. R. Loris, H. De Greve, MH. Dao-Thi, J. Messens, A. Imberty, L. Wyns. Structural basis of carbohydrate recognition by lectin II from Ulex europaeus, aprotein with a promiscuous carbohydrate-binding site.// J. Mol. Biol. 2000.1. V.301. P.987-1002.
66. DE Brooks, TJ. Trust. Enhancement of bacterial adhesion by shear forces: characterization of the haemagglutination induced by Aeromonas salmonicida strain 438.// J. Gen. Microbiol. 1983. V.129. P.3661-3669.
67. DM. Quinn, CY. Wong, HM. Atkinson, RL. Flower. Isolation of carbohydrate-reactive outer membrane proteins of Aeromonas hydrophila.// Infect. Immun. 1993. V.61.P.371-377.
68. J. Vadivelu, SD. Puthucheary, M. Phipps, YW. Chee. Possible virulencefactors involved in bacteraemia caused by Aeromonas hydrophila.// J. Med. Microbiol. 1995. V.42. P.171-174.
69. B. Lerrer, N. Gilboa-Garber. Interactions of Pseudomonas aeruginosa PA-IIL lectin with quail egg white glycoproteins.// Can. J. Microbiol. 2001. V.47. P.1095-1100.
70. P. von Bismarck, R. Schneppenheim, U. Schumacher. Successful treatment of Pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution—acase report on a lectin based therapeutic principle.// Klin. Padiatr. 2001. V.213. P.285-287.
71. N. Gilboa-Garber, DJ. Katcoff, NC. Garber. Identification and characterization of pseudomonas aeruginosa PA-IIL lectin gene and protein compared to PAIL.// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. V.29. P.53-57.
72. JP. Wisniewski, M. Monsigny, FM. Delmotte. Purification of an alpha-L-fucoside-binding protein from Rhizobium lupini.// Biochimie. 1994. V.76. P.121-128.
73. FD. Tosh, LJ. Douglas. Characterization of a fucoside-binding adhesin of Candida albicans.// Infect. Immun. 1992. V.60. P.4734-4739.
74. JR. Wang, MW. Stinson. Streptococcal M6 protein binds to fucose-containing glycoproteins on cultured human epithelial cells.// Infect Immun. 1994. V.62. P. 1268-1274.
75. M. Soell, F. Holveck, M. Scholler, RD. Wachsmann, JP. Klein. Binding of Streptococcus mutans SR protein to human monocytes: production of tumor necrosis factor, interleukin 1, and interleukin 6.// Infect. Immun. 1994. V.62. P.1805-1812.
76. I. Matsui, K. Oishi. Carbohydrate-binding properties of L-fucose, D-mannose-specific lectin (SFL 100-2) particles produced by Streptomyces sp.// J. Biochem. (Tokyo). 1986. V.100. P.115-121.
77. T. Kameyama, K. Oishi, K. Aida. Stereochemical structure recognized by the L-fucose-specific hemagglutinin produced by Streptomyces sp.// Biochim. Biophys. Acta. 1979. V.587. P.407-414.
78. N. Kochibe, K. Furukawa. Purification and properties of a novel fucose-specific hemagglutinin of Aleuria aurantia.// Biochemistry. 1980. V.19. P.2841-2846.
79. S. Ogawa, Y. Otta, A. Ando, Y. Nagata. A lectin from an ascomycete mushroom, Melastiza chateri: n synthesis of the lrctin in mycelial isolate.// Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. V.65. N.3. P.686-689.
80. B.A. Антонюк. Очистка и первичная характеристика L-фукозоспецифичного лектина Peziza badia Merat.// Биохимия. 1997. Т.62. С. 841-844.
81. U. Spohr, О. Hindsgaul, R. Lemieux. The binding of the Lewis В and Yhuman blood group determinants by the lectin IV of Criffonia simplicifolia.// Can. J. Chem. 1985. V.63. P.2644-2650.
82. R. Cromer, U. Spohr , DP. Khare, J. Le Pendu, RU. Lemieux. Molecular recognition XII . The binding of the H human blood group determinants and congeners by a lectin of Galactia tenuiflora.// Can. J. Chem. 1992. V.70. P.1511-1522.
83. M. Д. Луцик , В. А. Антонюк . Новый фукозоспецифичный лектин из * коры бобовника золотой дождь (Laburnum anagyroides medik): очистка,свойства и иммунохимическая специфичность.// Биохимия. 1982. V.47. Р.1710-1715.
84. Е. Zenteno, Н. Debray, J. Montreuil. Purification and partial characterization of two lectins from the cactus Machaerocereus eruca.// FEBS Lett. 1988. V.238. P.95-100.
85. E. Zenteno, L. Vazquez, R. Chavez, F. Cordoba, JM. Wieruszeski, J. Montreuil, H. Debray. Specificity of the isolectins from the plant cactus
86. Machaerocereus eruca for oligosaccharides from porcine stomach mucin.// Glycoconj. J. 1995. V.12. P.699-706.
87. M. Lalaurie, J. Berlan, M. Janicot. Sambucus ebulus L. lectin: detection of H character of newborn red cells.// С R Seances Soc Biol. Fil. 1981. V.175. P.490-495.
88. MH. Du, U. Spohr, RU. Lemieux. The recognition of three different epitopes for the H-type 2 human blood group determinant by lectins of Ulex europaeus, Galactia tenuiflora and Psophocarpus tetragonolobus (winged bean).
89. Glycoconj. J. 1994. V.ll. P.443-461.
90. S. Ogata , Y. Kamachi, Y. Arita, M. Sato, T. Muramatsu. A re-examination of t the isolectin components of the isolectin components of the fucose — bindingproteins of Lotus tetragonolobus.// Carbohydrate Res. 1985. V. 144. P. 297304.
91. L. Yan, PP. Wilkins, G. Alvarez-Manilla, SI. Do, DF. Smith, RD. Cummings.1.mobilized Lotus tetragonolobus agglutinin binds oligosaccharides containing the Le(x) determinant.// Glycoconj. J. 1997. V.14. P.45-55.
92. T. Haselhorst, T. Weimar, T. Peters. Molecular recognition of sialyl Lewis(x) and related saccharides by two lectins.// J. Am. Chem. Soc. 2001. V.123. P.10705-10714.
93. Y. Oda, K. Minami, S. Ichida, S. Aonuma. A new agglutinin from the Tulipa gesneriana bulbs.// Eur. J. Biochem. 1987. V.165. P.297-302.
94. K. Yamamoto, Y. Konami, T. Osawa, T. Irimura. Carbohydrate-binding peptides from several anti-H(O) lectins.// J. Biochem. (Tokyo). 1992. V.lll. P.436-439.
95. Y. Konami, K. Yamamoto, T. Osawa. Purification and characterization ofcarbohydrate-binding peptides from Lotus tetragonolobus and Ulex europeusseed lectins using affinity chromatography.// J. Chromatogr. 1992. V.597. » P.213-219.
96. Y. Konami, K. Yamamoto, T. Tsuji, I. Matsumoto, T. Osawa. Purification and characterization of two types of Cytisus multiflorus hemagglutinin by affinity chromatography.//J. Pharmacobiodyn. 1983. V.6. P.737-747.
97. Y. Konami, T. Tsuji, S. Toyoshima, I. Matsumoto, T. Osawa. Sugar binding specificities of anti-H(O) lectins disclosed by use of fucose-containing human milk oligosaccharides as binding inhibitors.// Chem. Pharm. Bull. (Tokyo).1989. Y.37. P.729-731.
98. Y. Konami, K. Yamamoto, T. Osawa, T. Irimura. Correlation between carbohydrate-binding specificity and amino acid sequence of carbohydrate-binding regions of Cytisus-type anti-H(O) lectins.// FEBS Lett. 1992. V.304. P.129-135.
99. D. Sudakevitz, N. Gilboa-Garber, C. Levene, R. Sela, L. Bhattacharyya. Erythrina lectins detect the H/HI blood groups.// Zentralbl. Bakteriol. 1991. V.275. P.343-350.
100. E. Moreno, S. Teneberg, R. Ada, N. Sharon, KA. Karlsson, J. Angstrom.
101. J. Schrevel, M. Philippe, F. Bernard, M. Monsigny. Surface Plasmodium p sugar-binding components evidenced by fluorescent neoglycoproteins.// Biol.
102. Cell. 1986. V.56. P.49-55.
103. B. Veau, J. Guillot, M. Damez, M. Dusser, G. Konska, B. Botton. Purification and characterization of an anti-(A+B) specific lectin from the mushroom Hygrophorus hypothejus.// Biochim. Biophys. Acta. 1999. V.1428. P.39-44.
104. GA. Amirante, V. Basso. Analytical study of lectins in Squilla mantis L. (Crustacea stomatopoda) using monoclonal antibodies.// Dev. Сотр. Immunol.1984. V.8. P.721-726.
105. JC. Pendland, DG. Boucias. Hemagglutinin activity in the hemolymph of Anticarsia gemmatalis larvae infected with the fungus Nomuraea rileyi.// Dev. Сотр. Immunol. 1985. V.9. P.21-30.
106. SE. Baldus, J. Thiele, YO. Park, FG. Hanisch, J. Bara, R. Fischer.
107. A. Rrajhanzl, V. Horejsi, J. Kocourek. Studies on lectins. XLII. Isolation, partial characterization and comparison of lectins from the roe of five fish species.// Biochim. Biophys. Acta. 1978. V.532. P.215-224.
108. A. Krajhanzl, J. Kocourek. "Lectins, Biology, Biochemistry, Clinical.Biochemistry" Bog-Hansen, Т.; van Driessche, E.; eds. 1986. 5. 257.
109. JA. Topliss, DJ. Rogers. An anti-fucose agglutinin in the ova of Dicentrarchus labrax.//Med. Lab. Sci. 1985. V.42. P.199-200.
110. MA. Lehrman, RS. Haltiwanger, RL. Hill. The binding of fucose-containing glycoproteins by hepatic lectins. The binding specificity of the rat liver fucose lectin.//J. Biol. Chem. 1986. V.261. P.7426-7432.
111. B. Condaminet, J. Peguet-Navarro, PD. Stahl, C. Dalbiez-Gauthier, D. Schmitt, O. Berthier-Vergnes. Human epidermal Langerhans cells express the mannose-fucose binding receptor.// Eur. J. Immunol. 1998. V.28. P.3541-3551.
112. RW. Loveless, T. Feizi, RA. Childs, T. Mizuochi, MS. Stoll, RG. Oldroyd, PJ. Lachmann. Bovine serum conglutinin is a lectin which binds non-reducing terminal N-acetylglucosamine, mannose and fucose residues.// Biochem. J. 1989. V.258. P.109-113.
113. N. Kochibe, K. Furukawa. Purification and properties of a novel fucose-specific hemagglutinin of Aleuria aurantia.// Biochemistry. 1980. V.19. P.2841-2846.
114. S. Ogawa, Y. Otta, A. Ando, Y. Nagata. A lectin from an ascomycete mushroom, Melastiza chateri: no synthesis of the lectin in mycelial isolate.// Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. V.65. P.686-689.
115. JF. Hainfeld, RD. Powell. New frontiers in gold labeling.// J. Histochem. Cytochem. 2000. V.48. P.471-480.
116. M. Bendayan, Worth its weight in gold.// Science. 2001. Y.291. P.1363-1365.
117. ME. Pereira, EC. Kisailus, F. Gruezo, EA. Kabat. Immunochemical studies on the combining site of the blood group H-specific lectin 1 from Ulex europeus seeds.//Arch. Biochem. Biophys. 1978. V.185. P.108-115.
118. B.E. Пискарев, О.Ю. Прайзель, Р.П. Евстигнеева, И.А. Ямсков. Изучение олигосахаридной специфичности фуколектина икры окуня с использованием комплексов неогликопротеин — коллоидное золото.// Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т.39. № .1. С.94-98.
119. Р.П. Евстигнеева, И.А. Ямсков, О.Ю. Прайзель, В.Е. Пискарев . Фуколектин икры окуня Perca fluviatilis конъюгированный с коллоидным золотом: новый гистохимический реагент.// ДАН. 2003. Т.389. №.5. С. 106109.
120. F. Quondamatteo, W. Gotz, U. Lubben, R. Herken. Changes in lectin binding sites during early human liver development.// Histochem. Cell Biol. 1997. V.107. P.223-228.
121. G. Szumanska, J. Krzywicka. Changes in the distribution of sugar receptors in the brain of Mongolian hamster induced by 5-minute-long ischaemia.// Folia Neuropathol. 2001.V.39. P.81-90.
122. M. Andersson, E. Sevelius. Abnormal microheterogeneity of haptoglobin in serum from dogs with various diseases.// Vet. Rec. 2001. V.148. P.14-17.
123. L. Elias, DE. Van Epps. Analysis of myelomonocytic leukemic differentiation by a cell surface marker panel including a fucose-binding lectin from Lotus tetragonolobus.// Blood. 1984. V.63. P.1285-1290.
124. R. Delwel, I. Touw, F. Bot, B. Lowenberg. Fucose binding lectin for characterizing acute myeloid leukemia progenitor cells.// Blood. 1986. V.68. P.41-45.
125. B.M. Лахтин. Лектины в исследовании белков и углеводов // ВИНИТИ / Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. 1987. Т.2. С.290.
126. MN. Fukuda, С. Ohyama, К. Lowitz, О. Matsuo, R. Pasqualini, Е. Ruoslahti, М. Fukuda. A peptide mimic of E-selectin ligand inhibits sialyl Lewis X-dependent lung colonization of tumor cells.// Cancer Res. 2000. V.60. P.450-456.
127. S. Kirkeby, D. Мое, ТС. Bog-Hansen. Fucose expression in skeletal muscle: a lectin histochemical study.// Histochem. J. 1993. V.25. P.619-627.
128. Y. Takano, Y. Teranishi, S. Terashima, R. Motoki, T. Kawaguchi. Lymph node metastasis-related carbohydrate epitopes of gastric cancer with submucosal invasion.// Surg Today. 2000. V.30. P. 1073-1082.
129. CJ. Jackson, PK. Garbett, B. Nissen, L. Schrieber. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium.// J. Cell Sci. 1990. V.96. P.257-262.
130. DF. Gomez, H. Yoshiji, JC. Kim, UP. Thorgeirsson. Ulex europaeus I lectin induces activation of matrix-metalloproteinase-2 in endothelial cells.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V.216. P. 177-182.
131. SS. Spicer, BA. Schulte. Identification of cell surface constituents.// Lab Invest. 1982. V.47. P.2-4.
132. E. Boye, Y. Yu, G. Paranya, JB. Mulliken, BR. Olsen, J. Bischoff. Clonality and altered behavior of endothelial cells from hemangiomas.// J. Clin. Invest. 2001. V. 107. P.745-752.
133. RT. Allison . Lectins in diagnostic histopathology: a review.// Med. Lab. Sci. 1986. V.43. P.369-376.
134. R. Roy, E. Katzenellenbogen, HJ. Jennings. Improved procedures for the conjugation of oligosaccharides to protein by reductive amination.// Can. J. Biochem. Cell Biol. 1984. V.62. P.270-275.
135. Om Bahl. Sinthesis of 2'-fucosilgalactose.// Meth. Enzimol. 1972. V.28. P.738-743.
136. M. Dubois, KA Gibs, JK Hamilton, DA Roberts and F Smith: Colorimetric methods for the determination of sugars and related substances.// Anal. Chem. 1956. V.28. P.350-352.
137. J. Roth. Application of lectin—gold complexes for electron microscopic localization of glycoconjugates on thin sections.// J. Histochem. Cytochem. 1983. V.31.P.987-999.
138. M. Horisberger, J. Rosset. Colloidal gold, a useful marker for transmission and scanning electron microscopy.// J. Histochem. Cytochem. 1977. V.25. P.295-305.
139. V. Kaushal, LD. Barnes. Effect of zwitterionic buffers on measurement of small masses of protein with bicinchoninic acid.// Anal. Biochem. 1986. V.157. P.291-294.
140. H. Schagger, H. Aquila, G. Von Jagow. Coomassie blue-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for direct visualization of polypeptides during electrophoresis.// Anal. Biochem. 1988. V.173. P.201-205.
141. CR. Merril, ML. Dunau, D. Goldman. A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide gels.// Anal. Biochem. 1981. V.l 10. P.201-207.
142. RF. Lane, EJ. Tripp. Basic fuchsin and the preparation of Schiffs reagent.// Med. Lab. Technol. 1971. V.28. P.26-34.
