Лектины: разработка методов выделения, первичная структурная характеристика и углеводная специфичность тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

л

, Российская Академия Наук

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Рапопорт Евгения Марковна

На правах рукописи УДК547.911:577.112.353

Лектины: разработка методов выделения, первичная структурная характеристика и углеводная специфичность.

Специальность 02 00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных соединений.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических нау(с

Москва 1997

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители: доктор химических наук, проф. В.П. Зубов ;

доктор химических наук Н.В. Бовин.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Л.Д. Румш;

кандидат химических наук Н.Д. Габриэлян

Ведущая организация: Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (МИТХТ)

Зашита состоится 16 апреля 1997 года в ]0°° часов на заседании Специализированного совета Д.002.35.01 при Институте

биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганическои

химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

'

Автореферат разослан - / марта 1997 г. Ученый секретарь

специализированного совета ,

ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН кандидат химических наук I /

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важнейшими процессами, обеспечивающими функционирование биологических систем и их взаимодействие с внешним миром, являются специфические процессы узнавания друг друга молекулами и клетками. Лектины, взаимодействуя с гликоконъюгатами, принимают непосредственное участие в разнообразных процессах меж- и внутриклеточного узнавания. Интерес к эндогенным лектинам связан с их способностью активировать систему комплемента, инактивировать бактерии и вирусы, регулировать процесс клеточной адгезии при воспалительных процессах и метастазировании. Наиболее полно охарактеризованы галектины, выделенные из почек, печени и головного мозга животных, а также коллектины гепатоцитов. О лектинах, циркулирующих в крови, данных мало. Структура определена только для маннансвязывающих лектинов, сывороточного амилоидного компонента Р, С-реактивного белка и селектиков, а их биологическая роль в организме человека выяснена лишь частично. Для всех этих лектинов так и не определена клетка-мишень и не выявлен специфический рецептор. Практически ничего не известно о галактозоспецифических лектинах сыворотки крови, хотя мембраносвязанные и внутриклеточные лектины этой специфичности распространены широко. В связи с этим представляет большой интерес поиск, выделение и изучение углеводной специфичности, а в последующем - биологической функции этих лектинов.

Для изучения структуры необходимо работать с лектинами высокой степени чистоты. Выделение лектинов сопряжено с рядом трудностей, так как они, как правило, являются гидрофобными белками, лабильны, быстро теряют свою активность, концентрация их в организме невелика.

Целью данной работы являлась разработка эффективного способа выделения лектинов из различных источников с использованием композиционных сорбентов на основе макропористого стекла с привитой полиакриламидной фазой, поиск и выделение лектинов из сыворотки крови человека, определение углеводной специфичности и первичных структурных характеристик полученных белков.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований разработана методология выделения и очистки лектинов с помощью композиционных сорбентов на основе макропористого стекла с полиакриламидной привитой фазой. На примере лектина из Bacillus subtilis и лектина из Misgurmis fossilis показано, что данная схема может быть применена при выделении лектинов из различных

источников. Выделены два ранее не известных лектина из сыворотки крови человека, определена их углеводная специфичность, аминокислотный и углеводный составы, N-концевая аминокислотная последовательность.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований докладывались на б конференциях. По материалам работы опубликовано 4 статьи.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, список сокращений, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список цитируемой литературы. Библиография включает 183 источника, работа проиллюстрирована 42 рисунками и 21 таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Сравнительная характеристика композиционных сорбентов на основе макропористого стекла с коммерческими аналогами и применение их для выделения лектинов из различных источников.

Получение высокоочищенных лектинов является необходимым этапом в определении их структуры и биологической функции.

Как указано в обзоре литературы, традиционными методами очистки лектинов

являются аффинная хроматография на сефарозе 4В с использованием в качестве лигандов

гликопротеинов или углеводов в сочетании с ИОХ и ГФ, при этом может происходить

частичная или полная потеря активности очищенного препарата в условиях высокой ионной

силы, сочетающаяся с низким выходом лектинов вследствие неспецифической сорбции.

Поэтому правильно подобранный тип хроматографии, сокращение числа стадий и наличие

сорбентов, обладающих как высокой селективностью, так и низкой неспецифической

сорбцией, имеют решающее значение при разработке эффективных методов выделения и

очистки лектинов. Перспективными в этом отношении являются композиционные сорбенты

на основе макропористого стекла с полиакриламидной привитой фазой, протяженные

сегменты которых ("петли" и "хвосты") способны играть роль гибких спейсеров,

облегчающих взаимодействие белковых сорбатов с комплементарными группами

поверхностной фазы (А.Е. Иванов и др., 1992). В данной работе была исследована

возможность применения аффинной и гидрофобной хроматографии на композиционных

сорбентах для выделения пектинов. В качестве объекта исследования был выбран лектин из

МС-ПА - макропористое стекло с полакриламноными привитыми фаими; ГА • гсмагглютинирующая активность; РГА - реакция гемагглютинации; СЛ - сывороточные лектины; ЭФ в ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле; ГХ - гидрофобная хроматография; ГФ - гель-фильтрация; PBS - фосфатно-солевой буфер; ИОХ - ионообменная хроматография; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография.

сапрофитных бактерий Bacillus siibtilis. Способность этого рода бактерий к продуцированию внеклеточных лектинов была обнаружена в институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины.

Для выделения сиалосвязывающего бактериального лектина были синтезированы два аффинных сорбента, один - на основе MC, а другой - на основе коммерческой активированной матрицы Аффи-геля 102. В качестве лиганда для получения сорбентов был выбран фетуин - гликопротеин, содержащий N- и О-сиалированные углеводные цепи. Аффинная хроматография экстракта лектина на фетуин-МС-ПА и фетуин-Аффи-геле-102 приведена на рис. 1.

Рис. 1. Аффинная хроматография экстракта бактериального лектина на фетуин-Аффи-геле 102 (а) и фетуин-МС-ПА (б) на колонке 1x9 см; элюцию проводили буфером, содержащим 75 мМ Трис-HCl (рН 8), 50 мМ ЭДТА, в градиенте концентрации NaCI со скоростью 60 мл/ч; - поглощение при А/ 280 нм; ■-■ - суммарный титр в РГА.

Как видно из результатов хроматографии на фетуин-Аффи-геле 102, наблюдается равномерное распределение активного материала во фракциях, элюирующихся в свободном объеме и градиенте концентрации №С1, в то время как при хроматографии на фетуин-МС-ПА активная фракция элюируется в начале градиента ЫаС1 (рис. 16, фракция 2). Такое различие в разрешающей способности сорбентов, по-видимому, связано не только с взаимодействием лектина с иммобилизованным лигандом, но и с полисахаридной матрицей Аффи-геля. В случае МС-ПА, благодаря полимерному покрытию, обеспечивается полная изоляция кремнеземной матрицы, в результате чего не происходит ее связывание с лектином, и тем самым уменьшается неспецифическое взаимодействие, т.е. увеличивается селективность и разрешающая способность сорбента. Однако, анализ фракции, обладающей ГА, методом ВЭЖХ (рис. 2) показал наличие примесных белков, несмотря на то, что

б)1-

Рис. 2. ВЭЖХ бактериального лектина на колонке Си (4x250мм) а) экстракта; б) фракции 2, полученной при аффинной хроматографии на фетуин-МС-ПА; элюцию проводили в градиенте концентраций ТФУ и ацетонитрила со скоростью 60 мл/ч; стрелкой указана фракция бактериального лектина, проявляющая ГА; — - профиль градиента ТФУ -ацетонитрил (0 - 90%).

В связи с этим была исследована возможность применения другого типа хроматографии для выделения этого лектина. Так как большинство лектинов проявляют гидрофобные свойства, был выбран метод гидрофобной хроматографии. В качестве сорбента был использован бутил-МС-ПА, способ получения которого был разработан ранее в лаборатории «Полимеры для биологии» ИБХ РАН (Иванов А.Е. и др., 1990).

Исследование гидрофобных свойств бутил-МС-ПА в сравнении с аналогичной характеристикой коммерческого аналога Вту1-Тоуореаг1 (Т050Н, Япония) на примере дипептида Тгр-Тгр и лизоцима (Мг 14 кДа) показало, что бутил-МС-ПА характеризуется меньшим удерживанием и меньшей площадью контакта с сорбатом. Это обстоятельство было использовано для повышения селективности отделения бактериального лектина от примесей. ГХ проводилась на бутил-МС-ПА и В1Пу1-Тоуореаг1. Результаты хроматографии представлены на рис. 3.

4

номер фракции

еч с* сч п п но мл р фракции

Рис. 3. ГХ бактериального лектина на Вшу1-Тоуореаг1 (а) и бутил-МС-ПА (б) на колонке размером 1x9 см. Элюцию проводили в градиенте концентрации (МН^СЬ (60% от насыщения - 0) и этиленгликоля (0 - 60%) в 0,01 М Ка2НРО< (рН 6,8) со скоростью 60 мл/ч; - А/280 нм; ■-■ - суммарный титр в РГА.

При ГХ на Ви1у1-Тоуореаг1 наблюдалось равномерное распределение активного материала во фракциях, элюирующихся в свободном объеме (фракция 1), в градиенте концентрации сульфата аммония (фракции 2 и 3) и в 0,01М №¡№0.1, рН 6,8 (рис. За), в то время как при ГХ на бутил-МС-ПА активная фракция элюировалась в градиенте сульфата аммония 20-0% (рис. 36). Применение ступенчатого градиента позволило повысить разрешающую способность сорбента, при этом лектин элюировался в 0,01 М №2НР04 (рис. 4, фракция 4), а фракции, содержащие примесные белки, - в стартовом буфере и ступенчатом градиенте (фракции 1,2 и 3, рис. 4).

номер фракции

Рис. 4. ГХ бактериального лектина на бутил-МС-ПА (колонка 1,0x21 см): Элюцию проводили в ступенчатом градиенте концентрации (КН^БО., и в 0,01 М ИагНРО^ (рН 6,8) со скоростью 60 мл/ч; - поглощение при А/ 280 нм; Ш-Ш - суммарный титр в РГА.

Анализ полученной фракции методом высокоэффективной гель-фильтрации показал, что при ГХ наблюдается высокая степень очистки препарата: за одну стадию удается отделить 90% примесей с сохранением активности препарата по сравнению с исходным. Кроме того, высокоэффективная гель-фильтрация позволила определить молекулярную массу лектина, которая составила 90 кДа (рис. 5).

а>

время удерживания, ьмн

0,1

0,09

0,08

0,07

2 X 0.06

о 0,05

0.04

0,03

0.02

0,01

0

Р) й м ю

время удерживания, мын

б)--------------

Рис. 5 Высокоэффективная гель-фильтрация экстракта (а) и фракции 4 после хроматографии на бутил-МС-ПА (б) на колонке TSK гель G2000SW (7.5x600 мм. Швеция) Элюиию проводили в 0,01 М PBS (рН 7,3), содержащим 0,2 М NaCI со скоростью 30 мл/ч Стрелками указаны времена удерживания белков с известной молекулярной массой (кДа)

Анализ полученного лектина ЭФ в ПААГ в восстанавливающих условиях в присутствии и отсутствии 2-меркаптоэтанола показал, что бактериальный лектин представляет собой олигомер, состоящий из двух ассоциированных субъединиц с

молекулярной массой 45 кДа (рис. 6)

Рис. 6. ЭФ в ПААГ (4-30%) в присутствии 505 и 2-меркаптоэтанола; I - стандартная смесь низкомолекулярных белков с известной молекулярной массой; 2 - экстракт бактериального лектина до нанесения на колонку; 3 - фракция 3 после хроматографии на бутил-МС-ПА. 4 - фракция 4 после хроматографии на бутил-МС-ПА.

Аналогичные результаты были получены при выделении лектина из другого источника, икры вьюна (М/х^ипшх fo.ssih.4j. Таким образом, на примере бактериального лектина н лектина из икры М/хуигтк /оххШх было показано, что одна стадия хроматографии с использованием сорбентов на основе МС-ПА дает возможность получить препараты лектинов с достаточно высокой степенью очистки при сохраненни их ГА. Определение углеаоОшш специфичности бактериального лектина.

Выделенный препарат бактериального лектина был охарактеризован по углеводной специфичности, моносахаридному и аминокислотному составу

Углеводную специфичность бактериального лектина определяли методом ннгибирования ГА с использованием эритроцитов кролика.

Предварительные данные по определению углеводной специфичности лектина в экстракте культуральнон жидкости показали, что самым сильным ингибитором ГА из моносахаридов является Ыеи5Ас, поэтому для изучения более тонкой углеводной

специфичности были изучены ингибирующие свойства ряда производных Ыеи5Лс. Результаты приведены в табл.1.

Таблица 1 Углеводная специфичность бактериального лектина.

Ингибитор Минимальная концентрация углевода, требуемая для полного ингибирования ГА, мМ

Кеи5(СР3СО)а2Вп 5 (н и.)

Ыеи5МНга2Вп 2,5 (н.и.)

№и5АсР2Ме 1,5

Кеи5Ас 1.0

Ыеи5Аса2Ме 0,625

Кеи5Аса2Вп 0,39

4-ер!-№и5Аса2Вп 0,16

Ыеи5Ас1е1гаС1у*5 10,0

№и5Аса2-3<За1Р 1-О-СН-а 1,3

Производные сиалиллактозы

Ыеи5Аот2-ЗСа1р1-4С1с(т4*) 0,4

Ыеи5Аса2-60а1р1-401с(Ш4*) 0,05

■ Я - СН[(ОН)С[!2ОН]СН(ОН)СН(ОН)СН2М1-Р-С6М4-(СН2)^Н2 '[Меи5Аса1-ОСН2С6Н4-Ш(СО)СН2Ш(СО)(СН2)4СО—(-^СН2СО-)5—Ш-СН2]4С Ме = СН,, Вп = СН2С6Н5

н и. - отсутствие ингибирования при данной концентрации углевода

Как видно из таблицы 1, бактериальный лектин малочувствителен к конфигурации ; остатка Ыеи5Ас. Так, аффинность лектина к Р-производному Кеи5Ас в форме метилгликозида только в 2 раза ниже, чем к его а-изомеру (1,5 и 0,625 мМ, соответственно). I Ориентация ОН-группы в положении С-4 пиранозного кольца также мало влияет на ингибирование ГА лектина: аффинность бактериального лектина к неприродному 4-эпи-производному Иеи5Ас даже выше, чем к №и5а2Вп (табл. 1). В то же время олигосахаридная специфичность лектина связана с положением гликозидной связи, с помощью которой остаток Ыеи5Ас присоединен к следующему фрагменту Так, ингибируюшая активность 6'Б1аЬас в 8 раз выше, чем у 3'51аЬас (0,05 и 0,4 мМ, соответственно) и в 26 раз выше, чем у производного с раскрытым глюкозным звеном. Меи5Аса2-30а1р1-0-СН-Я.

Кроме того, было изучено ингибирование ГА лектина несколькими гликопротеинами, результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2. Ингибирование гемагглютииирующей активности бактериального лектина

гликопротеинами.

Гликопротеин Концентрация содержание Ыеи5Ас*

белка, мкг/мл Ыеи5Ас, мкг/мг белка цМ

Муцин из подчелюст- 2,0 37,5 2,5

ных желез овцы

Фетуин 125,0 40,0 17,0

с1|-к1!слый 250,0 90,0 75,0

гликопротеин

Фибриноген 60,0 (н.и.) 25,0 140,0

Асиалофетуин 1000,0 (н.и.) - -

н.и. - отсутствие ингибирования при данной концентрации гликопротеииа; 'содержание

Кеи5Ас определено по методу Уоррена.

Как видно из таблицы 2, ингибирующая активность гликопротеинов не пропорциональна содержанию в них ЫеиЗАс, поэтому можно предположить, что бактериальный лектин различает олигосахаридные структуры. Действительно, муцин из подчелюстных желез овцы, который содержит фрагмент Кеи5Аса2-6Са1КАс-Ю-5егЯЬг; значительно активнее фетуина и а^кислого гликопротеииа, содержащих фрагмент Ыеи5Аса2-ЗОа1. Эти данные согласуются с результатами ингибирования олигосахаридами, из которых также следует, что лектин проявляет большую чувствительность к Кеи5Аса2-бОа1, чем к №и5Аса2-30а1. В то же время фибриноген, содержащий фрагмент №и5Аса2-6Оа101-4О1сЫАс, не ингибирует гемагглютинацию эритроцитов бактериальным лектином. Это может быть связано как с меньшей чувствительностью лектина к сиалированной лактозаминовой структуре, чем к производным сиалиллактозы, так и с типом цепей. Иигибирующей активностью по отношению к бактериальному лектину обладают гликопротеины с О-гликозилированными цепями, в то время как гликопротеины, содержащие Ы-гликозилированные углеводные цепи, лектином не узнаются. Подобными свойствами обладает сиалосвязывающий лектин из змеи Сераеа Иог1епл1$, гемагглютинация эритроцитов которым ингибируется только гликопротеинами с О-гликозилированными цепями, содержащими как Кеи5Аса2-бОа1-, так и №и5Аса2-30а1 - фрагменты, в то же время гликопротеины с теми же фрагментами, но с №гликозилированными цепями совсем не проявляют ингибиторных свойств (Я. Вговвтег е1 а1., 1992).

2. Выделение и характеристика галактозосвязывающих лектинов из сыворотки кротi человека.

Вторым направлением данной работы было выделение и изучение лектинов из сыворотки крови человека. За последние 10 лет появились работы, посвященные выделению и изучению физико-химических свойств лектинов сыворотки крови. Интерес к этим лектинам вызван прежде всего их способностью активировать систему комплемента, обладать бактерицидным действием по отношению к некоторым видам болезнетворных бактерий, инактивировать действие вирусов гриппа А, В и вируса иммунодефицита, включаться в процесс клеточной адгезии при воспалительных процессах и онкологических заболеваниях. На основании предварительных данных (И В. Абраменко, Д.Ф. Глузман, Н.В. Бовин) в результате скрининга сыворотки крови человека с использованием синтетических олигосахаридных зондов было показано, что в крови присутствуют белки, связывающиеся с Gaipi-3G!cNAc (Lec)- и Fucal-2Gal (Нв)- дисахаридами, а также с маннозой. В связи с этим, первым этапом работы являлась идентификация этих лектинов.

Положительный опыт применения композиционных сорбентов на основе МС-ПА для выделения и очистки бактериального лектина и лектина из Misgurnus fossilis методом ГХ дал основание использовать бутил-МС-ПА для выделения лектинов из сыворотки крови. Однако, фракционирование сыворотки методом ГХ не дало положительных результатов из-за невозможности идентификации лектинов в РГА. Эти трудности связаны как с низким содержанием лектинов. так и со сложностью состава сыворотки крови. В связи с этим для выделения лектинов была выбрана аффинная хроматография на МС-ПА с иммобилизованными через полиакриламидный спейсер дисахаридами Lee и Н (Ье5-МС-ПА и Hdi-MC-ПА). Сыворотку крови группы О (I) наносили последовательно на колонку с Le'-MC-ПА и Hji-MC-ПА. Элюцию лектинов осуществляли 1,5% NHtOH в PBS, рН 9. Результаты хроматографии представлены на рис. 7.

номер фракции

Рис. 7. Аффинная хроматография сыворотки крови человека на колонках (1x9 см) Le'-MC-ПА и Нд-МС-ПА. Элюцию проводили в 1,5% NH.OH в PBS (рН 9) со скоростью 60 мл/ч; (•-•): 1 - фракция примесных белков; 2 - фракция, полученная при элюции 1,5%NH(0H в PBS (рН 9); - рехроматография фракции 2.

Для подтверждения специфичности связывания лектина с сорбентом, фракцию 2, полученную при хроматографии на Hj.-MC-ПА (рис. 7), после ультрафильтрации и ультрадиализа наносили на сорбенты МС-ГТА с другими углеводными лигандами (Le', Аш, Gala), а также лигандом, не содержащим углеводного фрагмента. Для сравнения аналогичные эксперименты проводили с использованием агарозной матрицы Аффи-геля 202, а также сополимера метакриламида с N'N'-метилен-бис-метакриламидом и аллилглицидиловым эфиром (Eupergit С 250 L). Для этого Н-дисахарид был иммобилизован на Аффи-геле 202 и Eupergit С 250 L. Количество лиганда, иммобилизованного на Аффи-геле 202 и Eupergit С 250 L, составляло 1,85 мкмоль на I мл сорбента, в то время как концентрация Н-дисахарида, иммобилизованного на МС-ПА, - 4 мкмоль на 1 мл сорбента. Результаты аффинной хроматографии фракции, обладающей ГА, с использованием этих сорбентов представлены в табл. 3.

Таблица 3 Подтверждение специфичности связывания лектина, полученного на Н^-МС-ПА. Н^-Аффи-геле 202 и Hd¡-Euperg¡t С 250 Ь с помощью аффинной хроматографии на различных МС-ПА сорбентах.

Сорбент На-МС-ПА НигАффи-гель 202 Нк-Еирегви С 250

Содержание белка во Содержание белка во Содержание белка во

фракции, элюруемой в фракции, элюруемой в фракции, элюруемой в

свободном 1,5% свободном 1.5% свободном 1,5%

объеме ИНаОН в объеме ЫН4ОН в ооъеме ЫН4ОН в

РВ5, рН 9 РВ5, рН 9 РВв, рН 9

% % %

1_еа-МС-ПА 100 0 100 0 100 0

Аы-МС-ПА 90,4 9,6 63 37 83 17

Са1а-МС-ПА 88 12 80 20 90 10

МС-ПА с 100 0 75 25 100 0

неуглеводным

лигандом

1_еа: ОаЩЫ

ЧС1сЫАс(3 Риса 1-4'

Как видно из таблицы 3, фракция 2, полученная при хроматографии с использованием всех трех матриц с лигандом Ни,, не связывается ни с Ье'-МС-ПА, ни с безуглеводным сорбентом; некоторое связывание с Оа1а-МС-ПА можно объяснить тем, что лектин, выделенный на сорбентах с Ни, в качестве лмганда, является галактозосвязываюшим лектином (см. «Углеводная специфичность СЛ1 и СЛ2»), А-трисахарид является производным Н-дисахарида, что. по-видимому, также сказалось на связывании лектина с А^-МС-ПА. Следует отметить, что наибольшая степень связывания с этими сорбентами наблюдается при хроматографии фракции, полученной при элюции с На-Аффи-геля 202, несмотря на то, что количество иммобилизованного на ней Н-дисахарида в 2 раза меньше, чем на МС-ПА. Данные результаты свидетельствуют о том, что наряду со специфической сорбцией лектина на Н-дисахариде, наблюдается также неспецифическая сорбция с полисахаридной матрицей. Для дальнейшего выделения и очистки лектинов были использованы Н- и Ье'-дисахариды, иммобилизованные на МС-ПА. Лектины, выделенные на Ье'-МС-ПА и Ни,-МС-ПА. были названы СЛ1 и СЛ2, соответственно Результаты хроматографии представлены в табл. 4.

Таблица 4. Аффинная хроматография лектиноа из сыворотки крови человека на колонках Ьес-МС-ПА и Н^-МС-ПА (аналитический вариант).

Образец Сорбент Объем образца. Содержание белка в образцах. Выход по Степень очистки по Титр в РГА

мл мг/мл мг белку,% содержанию белка, кратность

Сыворот- 40.0» 2,9 116.0 100,0 64

ка крови Фракция СЛ1 Lec-MC-ITA 20,0 0.007 0.14 0,12 830 8

Фракция СЛ2 Нд-МС-ПА 15,0 0,008 0.12 0,1 1160 4

Рехромато графил

Фракция СЛ1 Lec-MC-riA 10,0 0,0028 0,028 0,02 4140 8

Фракция Нь-МС-ПА 9,0 0,002 0,018 0,02 6440 4

СЛ2

*4 мл сыворотки крови разбавляли в 10 раз PBS, pH 7,3.

Из приведенных данных следует, что двустадийная аффинная хроматография позволяет получить достаточно очищенные CJ11 и СЛ2 (степень очистки в случае СЛ1 составляет 4140 раз, в случае СЛ2 - 6440 раз), при этом выход по белку из 4 мл сыворотки крови составляет 0,028 мг и 0,018 мг, соответственно (7 и 4,5 мкг на 1 мл). Значительное снижение титра в РГА во фракциях СЛ1 и СЛ2 по сравнению с исходной сывороткой можно объяснить удалением в процессе очистки других компонентов сыворотки крови, обладающих, как и лектины, гемагглютинирующей активностью («естественных» антител к углеводам).

Анализ полученных препаратов СЛ1 и СЛ2 методом нативного электрофореза в блоке ПААГ показал, что молекулярный вес как СЛ1, так и СЛ2, составляет около 440 кДа (рис. 8).

а)

232-

ЧЧО-

67-

-/ 2

б)

Рис. 8. ЭФ в ПААГ (4-30%) в нативных условиях (а) СЛ1 (б) СЛ2: а)1 - стандартная смесь высокомолекулярных белков с известной молекулярной массой; 2 - CJ11 б) 1 - стандартная смесь высокомолекулярных белков с известной молекулярной массой; 2 - CJI2.

При электрофорезе в присутствии SDS в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях наблюдается одна и та же картина: основная зона в районе 67 кДа и минорные зоны в районе 50 и 28 кДа (рис. 9). Таким образом, на основании

полученных данных можно предположить, что СЛ1 и СЛ2 представляют собой олигомеры, состоящие из 6 субъединиц с молекулярной массой 67 кДа.

Рис. 9. ЭФ в ПААГ (4-30%) в присутствии БОБ и 2-меркаптоэтанола; 1- образец сыворотки крови до нанесения на колонку, 2 - фракция СЛ2 после рехроматографии на колонке Нл,-МС-ПА; 3 - фракция СЛ2 после хроматографии на колонке Н^-МС-ПА, 4 - фракция СЛ1 после хроматографии на колонке Ьес-МС-ПА; 5 - фракция СЛ1 после рехроматографии на колонке 1*ес-МС-ПА; 6 - стандартная смесь низкомолекулярных маркеров с известной молекулярной массой.

Н 2 14 56

-20/1

Углеводная специфичность CJI1 и CJJ2

Углеводную специфичность СЛ1 и СЛ2 определяли методом ингибирования гемагглютинирующей активности. При подборе оптимальных условий для проведения реакции ГА была исследована возможность использования эритроцитов из крови различных животных и человека. В результате были выбраны эритроциты кролика, т.к. они наиболее доступны и позволяют получить высокий титр в реакции ГА.

СЛ1 и СЛ2 не относятся ни к С-, ни к S-лектинам, так как введение ЭДТА в концентрации 0,025 М и 2-меркагтгоэтанола в концентрации 0,001 - 0,004 М не оказывало влияния на ГА лектинов.

Максимальную ингибирующую активность среди моносахаридов как для СЛ1, так и для CJI2 проявляют а- и ß-гликозиды GalNAc (табл. 5).

Таблица 5. Ингибирование гемагглютинации лектинов СЛ1 и СЛ2 моносахаридами и олигосахаридами.

Ингибитор* Минимальная концентрация углевода, требуемая для полного ингибирования РГА, мМ

СЛ1 СЛ2

GalNAca-sp 0,5 0,02

GalNAcß-sp 1,1 2

а-МапОМе н.и.(2)* н.и.(2)

Fuc 3 3

ß-GalOMe 16 125

Man 31 62,5

Glc н.и.(50) н.и.(50)

Galß l-3GalNAca-Np 0,02 0,06

Fucccl-3Galß-sp[ 0,04 н.и.(0,58)

6'SiaLac 0,1 0,2

Galal-3Galß-sp, (Bdi) 0,16 0,32

Fuca 1 -2Galß I -3 GlcN Acß-sp i (H (ти n 1)) 0,22 н.и.(0,78)

Fuca I -3 GIcNAcß-sp 0,22 н.и.(0,92)

GalNAcal-3 NGalß-sp (Am) Fuca 1-2' LacNAcß 0,40 0,46 0,78 0,22

GalNAcal-3GalNAc(l-5p (Fs) 0,4h 0.92

Gala lo 0.46 0.46

Galß-spi (В,,,)

Futa 1-2*

Galal-3GalNAcß-spi 0,46 0,46

Neu5Aca2-3Galßl-44 0.5S 0,58

GIcNAcß-sp (SiaLe")

Fucal-3/

Galß I-3GIcNAcß-sp (Le") 0.58 0.58 ;

3'SiaLac 0,72 O.SO

Fucocl-2Galßl-4GlcNAcß-spi(H (тип 2)) 0,78 H.H.(0.78)

Galß 1 -3Ga!NAca-Np (TF) 0,92 0.06

Galal-3GalNAca-sp (T.„.) 0,94 0.12

Fuca 1 -4GlcNAcß-sp и и.(0.94) ни.(0.46)

Galßl-3Galß-sp ни.(0,94) 0.24

Fucal-2Galß-sp(Hj,) и.и.(1,06) 0,05

Lac 9,00 2,00-

Lac - лактоза. Man - D-viaimoia, Fue - L-фуком, Gal - D-галактоза, Glc - D-глюкоза, sp=OCH:CH,CH,NHC'OCF-. spi=OCH;CH;t'H;NH._ Мр=4-нитрофенил;*н :i ( ) - отсутствие иигибнроваиня приданной концентрации чглевод ?..

Полученные данные позволяют отнести СЛ1 и СЛ2 к галактозосвязываюшим лектинам

Для изучения оолее детальной специфичности СЛ1 и СЛ2 было исследовано ингибированне реакции гемагглютинацни эритроцитов лектинами с помощью олигосахаридов, содержащих как внутренние, так и терминальные фрагменты Gal- и GalNAc, типичные для олигосахарианых цепей гликопротеинов и гликолипидов человека, а том числе антигенных детерминант крови О'ш.'осихаршниш атцт/шчпоапь (\71.

Ингибированне |'ГА рядом Gal-солержащпх олш осачарндов покачало, чго С'Л I проявляет высокую аффинность к (З-Gal и P-GalN.Ac-производным (табл 5) Так. ингибированне В-дпсдчаридом (Galal-SGaiP) было в 100 раз выше, чем P-GalOMe Введение еще одного моносахаридного остатка в положение 2 галактозного звена (В-трисахарид, табл. 5) приводит к снижению активности в 3 раза по сравнению с В-дисахарндом (0,46 и 0,16 мМ, соответственно, табл. 5) Взаимодействие СЛ1 с 6'-

сиалиллактозой в 7 раз выше, чем с З'-сиалиллактозой и в 90 раз выше, чем с незамещенной лактозой. ГА лектина ннгибируется низкими концентрациями трисахаридов Н (тип 1) и Н (тип 2), причем внутренние их фрагменты Gaipi-3GlcNAcP и Gaipi-4GlcNAcP сохраняют высокую активность, а терминальный Н-дисахарид (Fucal-2Gal) заметно менее активен. CJI1 проявляет также высокую активность по отношению к дисахариду, не содержащему ни Gal, ни GalNAc, а именно, Fucal-3GlcNAcP (0,22 мМ). Самым сильным ингибитором РГА для сывороточного лектина CJI1 является дисахарид Gaipi-3GalNAca в форме 4-нитрофенилгликозида. Взаимодействие СЛ1 с дисахаридом Lec, используемым в качестве лиганда для выделения лектина, примерно в 30 раз ниже, чем с GaipI-3GalNAca.

Олигосахаридная специфичность CJI2.

Специфичность СЛ2 охарактеризована с помощью того же набора олигосахаридов, что и СЛ1 (табл. 5). Доминантным моносахаридным остатком, также как в случае СЛ1, является GalNAca. Любые более сложные из изученных производных GalNAca были менее активны. В ряду наиболее сильных ингибиторов находятся два производных галактозы. Н-дисахарид и б'-сиалиллактоза (0,05 и 0,2 мМ, соответственно) и два производных GalNAca -дисахариды TF и ТШ1 (0,06 и 0,12 мМ, соответственно). Производные фукозы - дисахариды Fucal-3GlcNAcP и Fucal-3Galp, активные в отношении СЛ1, не проявляют ингибируюшего эффекта по отношению к СЛ2.

Кроме того, было исследовано ингнбирование РГА природными гликопротеинами и их олигосахариднымн цепями. Максимальным ингибируюшим действием на гемагглютинирующую активность лектина СЛ1 обладает фибриноген (0,5 мг/мл), что в 2 раза больше, чем для фетуина. ai-Кислый гликопротеин в концентрации I мг/мл не обладает гемагглютинируюшей активностью по отношению к СЛ1. Пул углеводных цепей фибриногена ингибирует гемагглютинацию эритроцитов СЛ1 в концентрации 0,125 мг/мл, что в 2 раза выше по сравнению с концентрацией ингибирования пулом углеводных цепей ai-кислого гликопротенна и фетуина. По-видимому, СЛ1 узнает терминальный дисахарид Neu5Aca2-6Gaip, что согласуется с данными по определению углеводной специфичности лектина с помощью индивидуальных олигосахаридов, среди которых б'-сиалиллактоза является одним из сильнейших ингибиторов. Иначе выглядят данные, полученные для СЛ2. в изученном ряду заметной ннгибируюшеи активностью не обладал ни один гликопротеин.

Препаративный вариант выделения пектинов СЛ1 и СЛ2 из сыворотки крови.

С целью определения первичной аминокислотной структуры СЛ1 и СЛ2 была разработана препаративная схема их получения. Для препаративного выделения СЛ1 и СЛ2 при масштабировании в 125 раз (500 мл сыворотки крови вместо 4 мл в аналитическом варианте) был выбран метод трехстадийной аффинной хроматографии в сочетании с изоэлектрофокусированием в градиенте плотности сахарозы. На первом этапе с целью обеспечения наиболее полного извлечения лектинов из сыворотки крови была применена аффинная хроматография на СаМАса-МС-ПА, так как по данным определения углеводной специфичности СЛ2 проявляет наибольшую аффинность по отношению к ОаШАса (табл. 5). Схема выделения СЛ1 и СЛ2 представлена на рис. 10. Рис. 10. Схема выделения СЛ1 и СЛ2 (препаративный вариант).

Сыворотка крови

4.

Оа1ЫАса-МС-ПА

I

Фракция 1 Фракция 2

I ;

Ье'-МС-ПА Н,,-МС-ПА

I I

Фракция 1 Фракция 2 Фракция 1 Фракция 2

-I I

Ье'-МС-ПА Щ-МС-ПА

! 4

СЛ1 СЛ2

I 4-

Изоэлектрофокусирование в градиенте плотности сахарозы Графики элюций при аффинной хроматографии приведены на рис. 11.

номер фракции

Рис. 11. Аффинная хроматография сыворотки крови человека на колонках GalNAca-MC-ПА (3x12 см) (•-•) и хроматография фракции 1 на Le'-MC-ПА (3x5 см) (■-■) и фракции 2 на Hdi-MC-ПА (3x10 см)(А-А). Элюшио проводили в 1,5% NHiOH в PBS (рН 9) со скоростью 180 мл/ч.

Результаты хроматографии представлены в табл. 6.

Таблица 6. Аффинная хроматография и изоэлектрофокусирование СЛ1 и СЛ2 (препаративный вариант).

Образец Сорбент Объем образца, мл Содержание белка в образце Выход по белку, % Степень очистки по солержанию белка, кратность

мг/мл мг

Сыворотка крови Фракция 1 Фракция 2 ОаПЧАса-МС-ПА 500 1000 250 7,63 3,8 0,06 3815 3800 15 100 99,6 0,4 254

Ье'-МС-ПА

Фракция 2 22 0,04 0,88 0,02 4330

На-МС-ПА

Фракция 2 20 0,03 0,6 0,02 6360

Рехроматография фракции 2

СЛ1 Ьес-МПС б 0,06 0,36 0,01 10600

СЛ2 Кь-МПС 8 0,03 0,24 0,006 15900

Изоэлектрофокусирование СЛ1 и СЛ2

СЛ1 СЛ2 4 4 0,05 0,03 0,2 0,12 0,005 0,003 19070 38150

Использование изоэлектрофокусирования позволило отделить минорные примеси, включая сывороточный альбумин.

При определении значений изоэлектрической точки лектинов методом изоэлектрофокусирования в геле и хроматофокусированием наблюдалась одна и та же картина, при этом значение изоэлектрических точек (ИЭТ) СЛ1 и СЛ2 составляло 6,14 - б, 17 (рис. 12).

номер фракции

Рис. 12. Хроматофокусирование СЛ1 (СЛ2) на колонке с сорбентом РВЕ 9.4 (0,9x20 см), элюцию проводили смесью полибуферов РВ 7.4 и 9.6 в соотношении 7:3 со скоростью 30 мл/ч : 1 - фракция СЛ1 (ИЭТ 6,14) или СЛ2 (ИЭТ 6,17); 2 - фракция сывороточного альбумина (ИЭТ 4,8); 3 - фракция, полученная при регенерации колонки 1М ЫаС1; •-• -

поглощение при А/280 нм; ■-■ - рН.

Определение углеводного и аминокислотного составов, Ы-концевой аминокислотной последовательности СЛ1 и СЛ2.

По данным определения углеводного состава СЛ1 и СЛ2 являются гликопротеннами, содержащими 7 и 5,7% углеводов, соответственно Углеводный состав СЛ1 и СЛ2 приведен в табл. 7.

Таблица 7. Моносахаридный состав СЛ1 и СЛ2 (моль на 3 моля маннозы).

Углевод Содержание углеводов СЛ1 СЛ2

Gai 2,9 2,2

Мап 3,0 3,0

GlcNAc 4,0 2,7

GaINAc 1,0 0,5

Fuc 0,3 0.1

Содержание Neu5Ac в СЛ1 и СЛ2 составляет 2%.

Сопоставление результатов анализа углеводного состава и величины молекулярной массы белка позволили предположить, что углеводная часть СЛ1 представлена одной двухантенной N- и одной О-гликозидными цепями, а СЛ2 - одно- или двухантенной N-гликозидной цепью.

Аминокислотный состав СЛ1 и СЛ2 приведен в табл. 8.

Таблица 8. Аминокислотный состав СЛ1 и СЛ2.

АК* Молярное содержание AK, %

СЛ1 СЛ2

Asp 6,3 10.5

Thr 10,6 6,05

Ser 4,8 6,6

Glu 12,8 11,8

Gly 11,4 11,8

Pro 11,8 4.3

Ala 7,5 10,1

Val 6,4 8,5

lie 3,3 4,9

Leu 7,5 9,2

His 17,6 4,9

Lys 6 4,9

Туг 3 1,9

Met 1,2 не определено

Arg 6,5 6,7

Phe не определено 4,5

т-3-

аминокислотныи остаток

Согласно данным аминокислотного анализа СЛ1 и СЛ2 должны обладать сильными гидрофобными свойствами, так как содержат значительное количество остатков Leu, Val и Ala, а СЛ1 еще и Pro. Соотношение кислых и основных аминокислотных остатков составляет примерно 1:1, что подтверждается значениями изоэлектрических точек СЛ1 и СЛ2, определенными методами хроматофокусирования и изоэлектрофокусировання в ПААГ.

N-концевую аминокислотную последовательность СЛ1 и СЛ2 определяли автоматическим методом Эдмана после Western-блоттинга СЛ1 и СЛ2 на мембрану «Иммобилон». Сравнение N-концевой аминокислотной последовательности с имеющимися структурами в банках данных по структуре белков и пептидов (REL с1995 по июль!996) показало, что СЛ1 гомологичен сывороточному альбумину человека. N-концевая аминокислотная последовательность СЛ1 по сравнению с альбумином человека представлена на рис. 13.

1 20

СЛ1: КЕ PXSEVAFVFHDLGEXHFX

I 20

альбумин из сыворотки крови человека: DAHKSEVAHRFKDLGEENFK

Рис. 13. N-концевая аминокислотная последовательность СЛ1 и альбумина из сыворотки крови человека. Гомологичные участки выделены.

Несмотря на высокую гомологию с альбумином, различие в аминокислотном составе, физико-химических свойствах и специфичности дает основание считать их разными

белками.

При сравнении N-концевой аминокислотной последовательности СЛ2 с последовательностью белков из банка данных (PIR 1995) было показано, что СЛ2 близок к сывороточному амилоидному компоненту Р (SAP), наибольшая гомология наблюдается на участке 1 - 10 АК. N-концевая аминокислотная последовательность СЛ2 по сравнению с SAP из сыворотки крови человека приведена на рис. 14.

1 21 (СЛ2) GTDLSGQVFVFPPERVQXDVD

1 21 (SAP) HTDLSGKVFVEPRESVT DVNL Н

Рис. 14. N-концевая аминокислотная последовательность СЛ2 и SAP из сыворотки крови человека. Гомологичные участки выделены

Так как поиск по банку данных не выявил полной идентичности полученных лектинов ни с одним известным белком, то можно заключить, что СЛ1 и СЛ2 являются новыми лектинами, выделенными из сыворотки крови человека. Несмотря на значительное сходство в физико-химических свойствах, СЛ1 и СЛ2 различаются по аминокислотной последовательности и олигосахаридной специфичности, что позволяет сделать вывод об их различии.

Согласно литературным данным, лектины сыворотки крови - коллектмны, С-реактивный белок, сывороточный амилоидный компонент Р, проявляют иммуномодуляторную активность при воспалительных процессах. Некоторая гомология СЛ1 и СЛ2 с белками острой фазы позволяет предположить, что они принадлежат к этой группе сывороточных белков и могут также обладать иммуномодуляторной активностью Поэтому дальнейшее изучение этих лектинов, в том числе их биологической функции, представляет большой интерес. Предварительные данные по выделению этих лектинов из сыворотки крови больных атеросклерозом (гиперхолестеринэмия) свидетельствуют о том, что содержание СЛ1 и СЛ2 в сыворотке таких больных в 10 раз меньше, чем у здоровых людей. Получение антител к этим лектинам позволит провести в дальнейшем скрининг крови пациентов с различными заболеваниями, найти клетки, в которых они синтезируются и выявить роль СЛ1 и СЛ2 в организме человека. В дальнейшем представляется необходимым также выяснить, представлена ли эта группа лектинов только двумя белками, или является семейством белков.

ВЫВОДЫ.

1. Проведено исследование разрешающей способности сорбентов на основе макропористого стекла с привитым полиакриламидом (МС-ПА) по сравнению с коммерческими сорбентами на основе агарозы и других полимерных матриц. Показано, что сорбенты на основе МС-ПА обладают лучшей разрешающей способностью и селективностью и могут быть применены для выделения лектинов из многокомпонентной смеси.

2. Из экстракта культуральной жидкости Bacillus subtitis выделен новый сиалосвязывающий лектин. Показано, что наиболее сильными ингибиторами гемагглютинирующей активности лектина являются б'-сиалиллактоза и Neu5Aca2Bn.

3. Из сыворотки крови человека выделено два ранее не изученных лектина, СЛ1 и СЛ2, разработан аналитический и препаративный вариант их выделения. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности показал, что СЛ1 имеет гомологию с альбумином сыворотки крови человека, а СЛ2 - с сывороточным амилоидным компонентом Р.

4. Оба лектина относятся к группе Gal/GalNAc-связывающих, но различаются между собой по взаимодействию с олигосахаридами. СЛ1 проявляет максимальную активность по отношению к дисахариду Gaipi-3GalNAc, а СЛ2 - к GalNAca и его производным, а также к дисахариду Fucal-2Gal.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Zhigis L.S., Ivanov А.Е., Rapoport Е.М.. Kovalenko E.A., Getman E.I., Zubov V.P., Purification of sialic acid binding protein from saprophytic bacteria by hydrophobic-interaction chromatography on Butyl-Toyopearl and polymer-coated porous glass, Biotechnology Techniques, 1993, vol. 7, p. 667 -670.

2. Ivanov A.E. Rapoport E.M., Belov S.V., Zhigis L.S., Inorganic support coated with N-substituted polyacrylamides for hydrophobic-interaction chromatography of proteins, 5"1 Symp. of European Soc. for Biochromatography, Nancy, France, 1994, 17- 19 May, p. 2.

3. Zhigis L.S., Rapoport E.M., Nasonov V.V., Kovalenko E.A.,Getman E.I., Ivanov A.E., Zubov V.P., Purification and characterization of sialic acid binding protein from saprophytic bacteria, Intern.conference «Biology and chemistry of sialic acids», Moscow, 1994, October 2-7, p. 108.

4. Ivanov A.E. Zhigis L.S., Rapoport E.M., Lisyutina O.E., Zubov V.P., Characterization of weak hydrophobic composite sorbents and their application to the isolation of bacterial lectin. J of Chromatography B, 1995, vol. 664, p. 219 - 223

5. Rapoport E.M, Zhigis L.S , Bovin N.V., Zubov V.P., Purification and characterization of lectin from Misgunms fos.silis, 3th Intern.Symp. on Bioorganic Chemistry, Dagomys, Russia. 1995. September 17-23, p. 103

6. Rapoport E.M., Ivanov A.E., Zhigis L.S., Kovalenko E A.. Getman E.I., Bovin N.V., Zubov V P.. Purification of lectin from Misgurnus fossilis by hydrophobic-interaction and size-exclusion chromatography, Intern.J.Bio-Chromat., 1996, vol. 2, p. 17-24.

7. Жигис Л.С., Рапопорт E.M., Иванов A.E., Зубов В.П., Бовин Н.В., Гидрофобная хроматография - перспективный метод для выделения лектинов из различных источников, 7-ой Всероссийский симпозиум по Молекулярной жидкостной хроматографии, 1996, Москва, с. 77.

8. Иванов А.Е., Жигис Л.С., Рапопорт Е.М., Зубов В.П., Особенности сорбции и хроматографии белков на кремнеземных сорбентах с N-алкилполнакриламидными привитыми фазами, 7-ой Всероссийский симпозиум по Молекулярной жидкостной хроматографии, 1996, Москва, с. 61.

9 Рапопорт Е.М., Жигис Л.С., Корчагина Е.Ю., Овчинникова Т.В., Зубов В.П., Бовин Н.В Выделение и характеристика галактозосвязывающих лектинов из сыворотки крови человек Биоорган.химия, 1996, т. 22, с. 353 - 357.

10. Rapoport Е.М., Zhigis L.S., Korchagina E.Yu., Ovchinnikova T V . Zubov V P., Bovin N.V.. Isolation and characterization of galactose-binding lectin from human serum, Xth Anniversary Meeting of the European Society for Bio-Chromatography, Paris. France, 1996, 13 - 15 May, p. 34.

Отпечатано на полиграфическом участке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Печать офсетная. Усл.п.л 2,75. Тираж 100 экз. Заказ N2109.