Структурные аспекты углеводной специфичности лектинов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

Й'{: - ' - -АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ

ч . ? /. I. ^ ^

/

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА И

Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

РУЖЕЙНИКОВ СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

СТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ УГЛЕВОДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ

ЛЕКТИНОВ

Специальность 01.04.18 - Кристаллография, физика кристаллов

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-

математических наук

Научные руководители: доктор хим. наук В.З. Плетнев кандидат физ,- мат. наук И.Н. Цыганник

МОСКВА - 1999

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук В.Р. Мелик-Адамян кандидат физико-математических наук С В. Никонов

Ведущая организация:

Институт Молекулярной Генетики РАН

Защита диссертации состоится "_" __ 1999 г. в "_" на заседании

диссертационного совета Д.002.58.01 Института кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии им. A.B.Шубникова РАН.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук В.М.Каневский

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................4

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. ЛЕКТИНЫ, ИХ СТРУКТУРА И

ФУНКЦИЯ...................................................................................................7

§ 1. Классификация лектинов 7

§2. Краткая классификация углеводов 10

§ 3. Пространственная организация углеводных комплексов

лектинов 14 § 4. Закономерности стереохимии углеводсвязывающих

центров 42

§ 5 Постановка задачи диссертационной работы 44

ГЛАВА П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.......................................................47

§ 1. Получение кристаллических углеводных комплексов

лектина гороха 47

§ 2. Предварительные рентгеноструктурные исследования и

сбор данных 50

§ 3. Определение и кристаллографическое уточнение

пространственных структур 58

ГЛАВА Ш. РАЗРАБОТКА ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ......................71

§ 1. Анализ конформационных состояний аминокислотных

остатков 71

§ 2. Модификация метода Монте-Карло на базе программы

ХРЬОЯ 73

§ 3. Совмещение пространственных структур бежов 74

ГЛАВА IV. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСОВ ЛЕКТИНА ГОРОХА С Б-ГЛЮКОПИРАНОЗИДОМ И I)-МАННОПИРАНОЗИДОМ.......................................................................76

§ 1. Трехмерная структура белковой глобулы. 76

§ 2. Структура металлсвязывающего и

углеводсвязывающего центров 87

ГЛАВА V. МОДЕЛИРОВАНИЕ БЕЛОК-УГЛЕВОДНОГО

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ...............................................................................94

§ 1. Выбор силового поля и расчетной схемы белок-

углеводного взаимодействия 94 § 2. статистико-динамическая модель углеводного

связывания 99

§ 3. Направленные изменения углеводной специфичности 109

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ...........................................................116

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................117

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы резко возрос интерес к различным аспектам исследования и применения лектинов - белков, связывающих углеводы. Лектины обладают довольно широким спектром действия. Они присутствуют в любой живой системе на разных уровнях ее организации (молекулярном, мембранном, клеточном и органном). Лектины обнаружены в различных организмах, начиная от вирусов, бактерий и кончая организмом человека. Их функциональная роль остается пока недостаточно изученной. Однако способность лектинов связывать олигосахариды со значительной специфичностью определенно указывает на то, что лектины играют важную роль в процессах биологического распознавания [1]. Известно, что лектин-углеводные взаимодействия задействованы в таких процессах, как эндо- и фагоцитоз, очистка биологических систем от вредных и чужеродных агентов, хоминг клеток, компартментализация гликоконъюгатов в органеллах, морфогенез в процессе развития некоторых организмов и т.д. [2]. Если внутриклеточные лектины в определенной мере регулируют процессы транспорта и секреции гликоконъюгатов, то лектины внешних мембран клеток, по-видимому, широко участвуют в процессах гомеостаза всего организма: клиренса асиалогликопротеидов крови (лектин Эшвелла гепатоцитов), хоминга клеток крови (лектины эндотелия сосудов селезенки и других органов), устранения чужеродных или своих аномальных (раковых, незрелых или старых) клеток из русла крови (система лектинов печени, отличающихся от лектина Эшвелла). Лектины бобовых растений, в том числе и лектин гороха, включены в механизм симбиоза этих растений с азотфиксирующими бактериями [2-4]. Также известно, что лектины растений часто выступают в качестве защитных белков

растений [5] и могут применяться в медицине в качестве ингибиторов присоединения вирусов к клеткам [6].

Лектины широко используются как молекулярные инструменты для исследования гликопротеинов и углеводов. Особое внимание уделяется применению лектинов в исследовании и очистке белков крови, рецепторов, гормонов. Такие лектины, как конканавалин А, фитогемагглютинин из семян фасоли, агглютинин из зародышей пшеницы, лектины чечевицы, клещевины, арахиса, сои, лотуса, улекса европейского, клубней картофеля, улитки и некоторые другие уже стали коммерческими препаратами. В медицине лектины нашли применение в качестве компонентов лекарственных препаратов для лечения опухолей, воспалительных процессов и т.д.

Изучение молекулярных основ белок-углеводного взаимодействия невозможно без знания пространственной структуры белков и их комплексов с углеводами. За последнее время установлены пространственные структуры целого ряда лектинов и их углеводных комплексов. Прогресс в таких исследованиях стимулировал развитие в других областях молекулярной биологии и молекулярной генетики. На основе структурных данных широким фронтом ведутся работы по белковой инженерии с целью более детального понимания механизма функционирования белков, а также получения белков с новыми полезными свойствами. Наличие детальной информации о пространственной организации углеводсвязывающих центров открывает также возможности синтеза соответствующих ингибиторов.

Цель диссертационной работы - установление пространственной структуры комплексов лектина гороха в двух изоформах с глюкозой и маннозой при атомном уровне разрешения, выявление механизма углеводного связывания белком и его специфичности.

Диссертация состоит из пяти глав. Первая глава представляет собой литературный обзор по некоторым наиболее интересным структурам лектинов, решенным на текущий момент. Во второй главе представлена экспериментальная часть работы. В третьей главе обсуждаются разработанные программы. Четвертая глава посвящена описанию и анализу пространственной структуры комплексов лектина гороха с различными углеводами. Пятая глава описывает предложенную модель взаимодействия белка с углеводом. Представлено обобщение на случай связывания белком других углеводов, проведён анализ и сопоставление с данными независимых биохимических исследований по связыванию лектином углеводов.

Результатом работы является детальный анализ структур комплексов растительного лектина с глюкозой и маннозой, а также впервые предложена модель связывания углеводов на основе статистических закономерностей взаимодействия лектина с углеводом. Полученные структурные данные позволили теоретически промоделировать некоторые точечные мутации в активном центре лектина и оценить их предполагаемое влияние на углеводную специфичность. Результаты проведенных исследований предоставляют обширный структурный и теоретический базис для белково-инженерных работ по целенаправленному изменению свойств лектина гороха и других гомологичных белков.

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям работы, доктору хим. наук В.З. Плетневу и кандидату физ,- мат. наук И.Н. Цыганнику за творческое руководство и постоянное внимание к работе, а также сотруднику лаборатории рентгеноструктурного анализа Института биоорганической химии И.Ю. Михайловой за помощь в подготовке кристаллических объектов и обсуждение результатов.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. ЛЕКТИНЫ, ИХ СТРУКТУРА И

ФУНКЦИЯ

§ 1. Классификация лектинов

Согласно общепризнанному определению лектинов, данному Коцоуреком и Хожейши [7, 8], лектины - это белки неиммунной природы, способные специфично и обратимо связываться с углеводами и углеводными частями гликоконъюгатов без нарушения ковалентной структуры любых из узнаваемых гликозильных лигандов.

Известны различные классификации лектинов, в основе которых лежат следующие принципы.

1. Соотношение белка и углеводов в молекуле лектина

а) Не содержащие углеводов белки (агглютинин из зародышей пшеницы, конканавалин А, лектины арахиса, гороха, а также полученные генно-инженерным путем из кишечной палочки).

б) Гликопротеины (подавляющее большинство лектинов, очищенных из эукариотов ). Обычно содержание углеводов составляет до 15% по весу.

в) Протеогликаны ( лектин клубней картофеля и другие). Содержание углеводов превышает 50-60% по весу.

2. Биологическая активность

• гемагглютинины

• лейкоагглютинины

• митогены

• бласттрансформанты

• фузогены

• токсины

• половые агглютинины

• адгезины

• лектины-ферменты (бифункциональные, ферменты углеводного обмена

с независимым расположением каталитических и лектиновых участков связывания углеводов) [2] и т.д.

3. Происхождение

• из растений, животных, микроорганизмов и т.д.

• из органов, тканей, клеток

• внутри- и внеклеточные

• связанные и не связанные с мембранами клеток.

4. Валентность и число субъединиц (валентность - число связывающих углеводы участков на молекулу лектина). Практически все лектины относятся к олигомерным белкам (чаще всего к тетрамерам, реже - к димерам). Большинство лектинов являются поливалентными, за исключением растительных и бактериальных токсинов.

5. Специфичность к моно- и дисахаридам

Одна из наиболее часто используемых классификаций подобного типа была предложена Голдштейном и соавт. [9, 10]. При этом неингибируемые моносахаридами лектины обычно объединяют в одну отдельную группу [11].

Сходную классификации можно найти у других авторов [12, 13]. Так, например, в работе [14] предложено 9 групп лектинов, разделенных по специфичности к следующим моносахаридам: L-фукозе; И-ацетил-О-глюкозамину; Т^-ацетил-Б-галактозамину; D-галактозе; К-ацетил-Б-галактозамину и D-галактозе; D-глюкозе; Р-

И-ацетил-Б-глюкозамидинам; Б-маннозе, Б-глюкозе и И-ацетилглюкозамину; 14-ацетилнейраминовой кислоте.

Эти классификации являются условными, поскольку не учитывают тонкой специфичности лектинов (способности помимо моносахаридов различать некоторые олигосахаридные структуры), а также не позволяет классифицировать лектины, узнающие исключительно олигосахаридные структуры.

6. Специфичность к олигосахаридам.

Наиболее известна классификация лектинов по специфичности к олигосахаридам. В работе [15] предложено делить лектины по способности ингибироваться моносахаридами (изолектины) и олигосахаридами (энд о лектины). В свою очередь, изолектины подразделяются далее на облигатные (ингибируются только моносахаридами) и факультативные (ингибируются также и олигосахаридами). Эндолектины подразделяются на гомотипические (ингибируются олигосахаридами, построенными из одного типа моносахарида) и гетеротипические (ингибируются олигосахаридами, построенными из различающихся моносахаридных звеньев).

Существует также множество классификаций, охватывающих более частные случаи. Так, в работе [16] предложено разделять лектины по узнаванию внутренних участков углеводных цепей. Большое количество работ [17-25] посвящено классификации лектинов по их узнаванию Азп-связанных олигосахаридов в зависимости от числа антенн и кластерного расположения концевых остатков в антеннах. В работе [26] приведена достаточно подробная общая схема фракционирования Ави-связанных олигосахаридов с помощью комбинированной хроматографии на иммобилизованных лектинах.

§ 2. Краткая классификация углеводов

Углеводы можно считать основой существования большинства организмов. Центральное место углеводы занимают в метаболизме зелёных растений и других фотосинтезирующих организмов Образующиеся в процессе фотосинтеза крахмал и другие углеводы являются главным источником энергии и углерода для животных и микроорганизмов. Нерастворимые полимеры углеводов выполняют функции структурных и опорных элементов в клеточных стенках бактерий и растений, а также в соединительной ткани и оболочках клеток животных. Углеводы других клеток придают биологическую специфичность их поверхности [2, 27].

Большинство моносахаридов имеют эмпирическую формулу (СН20)п, где п больше или равно 3. Они представляют собой неразветвлённую цепочку углеродных атомов, соединённых одинарными связями. Один из атомов углерода связан двойной связью с атомом кислорода, образуя карбонильную группу; ко всем остальным углеродным атомам присоединены гидроксильные группы. Если карбонильная группа расположена на конце цепочки, то моносахарид является альдегидом и носит название альдозы. Если карбонильная группа расположена в любом другом положении, то моносахарид является кетоном и носит название кетозы. Моносахариды с п=4,5,6,7 называются соответственно тетрозами, пентозами, гексозами и гептозами. Наиболее широко распространены в природе гексозы, а именно, альдогексоза Б-глюкоза и кетогексоза О-фруктоза (рис.1). Альдопентозы Э-рибоза и 2-дезокси-Б-рибоза входят в состав нуклеиновых кислот. Все моносахариды имеют один или несколько асимметрических атомов углерода и, следовательно, могут встречаться в виде оптически активных изомеров. Все изомеры разбивают на две группы- О-ряд и Ь-ряд.

н

н

с=о

н—с—он

н—с—он

0=0

но—с—н

но—с—н

н—с—он

н—с—он

н—с—он

н—с—он

сн2он

сн2он

Рис. 1. линейная форма наиболее распространенных в природе гексоз. Слева направо - Б-глюкоза, О-фрукгоза.

Каждому изомеру одного ряда соответствует изомер другого ряда, являющийся его зеркальным отражением. Изомеры Ь-ряда редко встречаются в природе. Практически все возможные изомеры Б-альдоз обнаружены в природе. Наиболее важные из них изображены на рис. 2. Это пентозы рибоза, арабиноза, ксилоза, ликсоза, а также гексозы глюкоза, манноза, и галактоза. Среди Б-кетоз, названия которых образуются путём введения суффикса -ул- в название соответствующей альдозы, наиболее важными в биологическом отношении являются кетопентозы Б-рибулоза, кетогептоза Б-седогептулоза и кегексоза Б-фруктоза, являющаяся кето-аналогом Б-глюкозы, но имеющая своё нетривиальное название. Два сахара, различающиеся по конфигурации вокруг только одного атома углерода, называются эпимерами. Так, Б-глюкоза и Б-манноза - эпимеры относительно 2-го углеродного атома, а Б-глюкоза и Б-галактоза - эпимеры относительно 4-го атома.

Моносахариды с п большим или равным 5 в растворах существуют обычно в виде замкнутых циклических структур, причём карбонильная группа находится не в свободном состоянии, а образует ковалентную связь с одной из гидроксильных групп при углеродном атоме основной цепи сахара (рис. 3).

н

I

с=о

I

н-с-он

I

снрн

с=о

I

-он

н-с-

I

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о I

но-с-н

[

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о

I

н-с-он

I

н-с-он

I

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о

I

но-с-н

I

н-с-он

1

н-с-он I

снрн

н

I

с=о I

н-с-он I

но-с-н

I

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о но-с-н

I

но-с-н

I

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о

I

н-с-он I

н-с-он

I

н-с-он

I

н-с-он I

снрн

н

I

с=о

I

но-с-н

I

н-с-он

I

н-с-он

I

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о I

н-с-он

I

но-с-н

I

н-с-он

I

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о

I

но-с-н

I

но-с-н

I

-он

н-с-

I

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о I

н-с-он

I

н-с-он

I

но-с-н

I

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о

I

но-с-н

I

н-с-он

I

но-с-н I

н-с-он

I

снрн

н

I

с=о

I

н-с-он

I

-н -он

но-с-

i

но-с-

i

н-с-он

i

снрн

н

I

с=о I

но-с-н

I

но-с-н

I

но-с-н

I

-он

н-с-

I

снрн

Рис. 2. Семейство Б-ал ьдоз, содержащих от трех до шести атомов углерода. Слева направо, сверху вниз - Б-глицероальдещц, Б-эритроза, Б-трсоза, Б-рибоза, Б-арабиноза, Б-ксилоза, Б-ликсоза, Б-аллоза, Б-альтроза, Б-глюкоза, Б-манноза, Б-гулоза, Б-идоза, Б-галакгоза, Б-талоза.

При замыкании цепочки в кольцо из-за асимметрии атома С1 могут образовываться два стереоизомера, обозначаемые а и р. Такие изомеры называются аномерами, а новый асимметрический углеродный атом - аномерным углеродом. Образующаяся циклическая форма может быть шестичленной и пятичленной. В первом случае она носит название пиранозы из-за сходства с пираном, во втором случае - фуранозы из-за сходства с фураном. В растворе воды при температуре 25° С стереоизомеры Б-глюкозы образуют равновесную смесь, состоящую примерно на 1/3 из а-Б-глюкопиранозы и на 2/3 из Р-Б-глюкопиранозы. Равновесная смесь стереоизомеров Б-маннозы состоит из 66% ос-Б-маннопиранозы и 33% Р-Б-маннопиранозы. Фуранозная и линейная формы для Б-маннозы и Б-глюкозы в растворе встречаются в очень незначите�