Свойства белок-липидных ассоциатов в жидких фазах и на межфазных поверхностях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

На правах рукописи

0050494Э*

Левачев Сергей Михайлович

Свойства белок-липндных ассоциатов в жидких фазах и на межфазных поверхностях

Специальности: 02.00.11 - коллоидная химия и 02.00.06 - высокомолекулярные

соединения.

Автореферат

диссертации на сопсканне ученой степени доктора химических наук

МОСКВА 2013

7 ФЕВ т

005049452

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, химический факультет, кафедра «коллоидной химии».

Официальные оппоненты:

Зезин Александр Борисович

член-корр. РАН. доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой высокомолекулярных соединений химического факультета ФГБОУ В! Ю Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова;

Швеи Виталии Иванович академик РАМН, доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой биотехнологии и бнонанотехнологин ФГБОУ ВПО Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В.Ломоносова (МИТХТ);

Мусабеков Куанышбек Битуович доктор химических наук, профессор кафедры аналитической, коллоидной химии и технологии редких элементов Казахский национальный университет имени аль-Фараби.

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева.

Защита состоится «28 » февраля 2013 г. в 15-00 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.04 в ФГБОУ ВПО Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д. 86, аудитория М119.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «28 » января 2013 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 212.120.04 доктор химических наук, профессор

Грицкова И.А.

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Работа является развитием коллоидной химии высокомолекулярных соединений, основы которой заложены в трудах П.А.Ребиндера и В.Н.Измайловой, особенно того ее раздела, в котором выяснялась взаимосвязь объемных и поверхностных свойств низко- и высокомолекулярных поверхностно-активных веществ (ПАВ).

Одной из актуальных проблем коллоидной химии белка является установление фундаментальных закономерностей, характеризующих особенности поведения нанодисперсных систем при их модификации. Это важно потому, что поверхностная активность и реологические свойства белков на границах раздела фаз лежат в основе получения устойчивых дисперсных систем. Особый интерес представляет модификация белковых макромолекул липидами, поскольку ассоциация этих природных веществ открывает возможность широкого варьирования их гидрофильно-олеофильного соотношения, что позволит расширить область практического использования таких систем.

В данной работе исследовалась закономерности образования, взаимосвязь объемных и поверхностных свойств белок-липидных ассоциатов для создания физико-химической модели образования лиофильных нанодисперсных супрамолекулярных систем, основанных на белках различной природы (глобулярных, фибриллярных и гибкоцепных полипептидах) и полярных липидах (фосфатидилхолинах и холестерине). Цель работы

Комплексное изучение объемных и поверхностных свойств белок-липидных ассоциатов с целью создания методологии управления устойчивостью дисперсных систем, стабилизированных белок-липидными ассоциатами с широким спектром гидрофильно-олеофильного соотношения.

Научная новизна

Систематические исследования многофазных систем, содержащих белки различной природы (глобулярные, фибриллярные и гибкоцепной полипептид) и липиды (фосфотидилхолин и холестерик) позволили впервые дать комплексную оценку процессов образования белок-липидных ассоциатов, отличающихся от известных стехиометрических комплексов белок-ПАВ. Методами динамического светорассеяния, радиоактивных индикаторов, дифференциальной калориметрии и ИК-спектроскопии показано, что эти ассоциаты характеризуются широким распределением по размерам и соотношению компонентов.

Показано, что природа белковых макромолекул, а именно, содержание вторичных структур (а-спиралей, Р-складок и неупорядоченных участков), конформационное состояние макромолекул в целом, подвижность сегментов полимерных цепей, и липидов, отличающихся химическим составом полярной части и наличием сопряженных л-структур в гидрофобной части определяют состав и свойства образующихся ассоциатов.

Установлена связь между образованием ассоциатов белок-липид, конформационным состоянием полимерной макромолекулы и термодинамическими характеристиками структурных переходов полипептидно? цепи.

Проведено комплексное исследование кинетики изменения межфазногс натяжения на границе водный раствор белка - толуольный раствор липида i показано, что степень его изменения зависит от природы белка. В отличие о-стехиометрических комплексов белок-ПАВ, белок-липидные ассоциаты имею-переменный состав, достигающий стационарных значений при выдерживанш системы во времени.

По изменению параметров изотерм 2D пленок, сформированных из белок липидных ассоциатов при варьировании природы белка и липида, показано, чт при увеличении двумерного давления потеря устойчивости 2D пленок може быть вызвана фазовыми переходами в смешанных слоях и изменением состав белок-липидных ассоциатов. Впервые определены реологические параметр!

межфазных адсорбционных слоев (МАС) белок-липидных ассоциатов методами Ребиндера-Трапезникова и осциллирующей капли и показано, что введение в систему липидов приводит к снижению значений реологических параметров МАС.

Впервые предложен новый подход к рассмотрению влияния процесса ассоциации белковых и липидных молекул на их эмульгирующую способность и устойчивость образующихся эмульсий. Он состоит в комплексной оценке изменения термодинамических характеристик МАС и реологических параметров структур, формируемых белок-липидными ассоциатами на границе раздела фаз.

Систематизированы уже имеющиеся знания в области образования белок-липидных ассоциатов и предложены новые подходы к управлению свойствами многофазных систем, содержащих белки и липиды различной природы.

Показаны перспективные пути создания и использования новых ПАВ с широко варьируемым гидрофильно-олеофильным соотношением из природных источников (белки и липиды). Практическая значимость

Разработана методология создания диагностических тест-систем, термоустойчивых капсул и формирования защитных пленочных покрытий на поверхности мехового полуфабриката на основе использованием белок-липидных ассоциатов. Полученные в работе новые результаты по управлению коллоидно-химических свойств белковых систем послужили основой для расширения курса лекций по «Коллоидной химии» в МГУ имени М.В.Ломоносова, а также, курса лекций «Технология синтеза полимеров для медицины» в МИТХТ имени М.В.Ломоносова. Автор защищает:

• Результаты комплексного изучения объемных свойств растворов белков и белок-липидных ассоциатов.

• Характеристические свойства белок-липидных ассоциатов и их отличия от традиционных белок-ПАВ комплексов.

• Влияние природы белка на строение и свойства белок-липидных ассоциатов.

• Кинетические закономерности изменения поверхностных свойств белков и белок-липидных ассоциатов в зависимости от их химического состава.

• Новые подходы к созданию эффективных высокомолекулярных ПАВ на основе белок-липидных ассоциатов.

• Результаты изучения свойств 2D пленок, формированных из белков и белок-липидных ассоциатов на границе водной субфазы.

• Закономерности влияния строения белка и белок-липидных ассоциатов на их эмульгирующую способность, устойчивость эмульсий и реологические свойства, полученных предельно концентрированных эмульсий.

• Новые подходы к созданию диагностических тест-систем, термоустойчивых капсул и формированию защитных пленочных покрытий на поверхности мехового полуфабриката.

Приоритет результатов. Все полученные автором научные результаты, вынесенные на защиту, получены впервые. Апробация работы.

Результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях: Коллоидназ химия в решении проблем охраны окружающей среды, Минск, 1994; 11 Международная конференция «Поверхностные силы», Москва, 1996-Международной конференции по коллоидной химии и физико-химическоГ механике, Москва, 1998; Поверхностно-активные вещества и препараты на и; основе. X конференция, Белгород 2000, 10 International Conference on Colloid an< Interface Science. 2000. Bristol, UK.; "Коллоидная химия и физико-химическая механика природных дисперсных систем" (комплекс научных мероприятий стра] СНГ), Одесса, 2001; 21-25 симпозиума по реологии Реология, 2002-2009' Международная конференция по поверхностным силам, 2002;XVII Europiai chemistry at interfaces conference (ECIC-XVII). 2005. Loughborough university, UK Применение поверхностно-активных веществ в пищевой промышленности

Материалы научной сессии РАН. Мурманск, 2008; "Реология и физико-химическая механика гетерофазных систем", 2009, Звенигород; Поверхностно-активные вещества в технологических процессах. Научного совета по физической химии РАН. 2010 г., Москва.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 74 работ, в том числе: 50 статей в журналах рекомендованных ВАК, 24 статьи в других журналах и тезисов докладов на международных и российских конференциях.

Личное участие автора является основополагающим на всех стадиях работы и состояло в формировании научного направления, постановке задач и целей исследования, разработке экспериментальных и теоретических подходов при выполнении эксперимента и формировании выводов.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результаты и их обсуждение, выводов, библиографии и приложения. Содержание работы изложено на 253 страницах, содержит 64 рисунка и 33 таблицы. Библиография включает 341 наименований литературных источников.

Литературный обзор посвящен систематизации существующих данных по физико-химическим закономерностям взаимодействия белков и липидов. Рассмотрены закономерности изменения обьемных и поверхностных свойств белков различной природы (глобулярных и фибриллярных) и желатина, как представителя природных полипептпдных макромолекул. Особое внимание в анализе литературных источноков уделено вопросу управлению устойчивости дисперсных систем, стабилизированных белками и липидами.

В разделе «экспериментальная часть» приведены характеристики использованных в работе белков и липидов. Особое место занимает описание метода получения кератина из природного сырья, использованного для приготовления образцов кератина, исследованных в работе. Подробно описаны методики проведения исследования обьемных и поверхностных свойств белков и белок- липидных ассоциатов.

Раздел «результаты и их обсуждение» состоит из четырех глав. В первой главе рассмотрены результаты, полученные при исследовании ассоциации белка (глобулярных, фибриллярных и гибкоцепного полипептида) с липидами в водной и органической фазах. Вторая глава посвящена обсуждению результатов исследованию свойств белков и белок-липидных ассоциатов на различных границах раздела фаз: вода-углеводород, вода-воздух и вода-полистирол. В третьей главе рассмотрена эмульгирующая способность белок-липидных ассоциатов, влияние химического состава белок-липидных ассоциатов на устойчивость образующихся эмульсий и реологические свойства получаемых предельно концентрированных эмульсий. В четвертой главе обобщены новые подходы к созданию тест-систем и термоустойчивых капсул, основанные на использовании белок-липидных ассоциатов. Основное содержание работы.

1. Литературный обзор. В литературном обзоре проведен анализ имеющейся информации по вопросу взаимодействия водорастворимых белков и полипептидов с полярными липидами. В научной литературе особое место занимает обсуждение проблемы транспорта липидов в кровеносной системе генетически предназначенными белковыми системами, представляющими класс белков сыворотки крови, разделяемых на виды: липопротеиновые комплексы высокой, средней и низкой плотности. Данный вид комплексов белок-липид построен по принципу солюбилизации маслорастворимых компонентов в водном растворе белковых макромолекул, причем, образуются стехиометрические комплексы, состав которых варьируется в зависимости от многих характеристик живого объекта. Определяющим фактором в образовании и устойчивости этих комплексов является выполнение генетически запрограммированной структуры белковой части комплекса. Нарушение в процессе синтеза белков, входящих в состав липопротеиновых комплексов, вызывает патологические изменения в липидном обмене живого организма. Полученные экспериментальные результаты, описывающие свойства липопротеиновых комплексов, дают основание для рассмотрения гидрофобных взаимодействий в системе белок-

липид-вода, как основного движущего фактора образования устойчивых липопротеиновых комплексов.

Взаимодействие водорастворимых белков и полипептидов с надмолекулярными образованиями липидов (мембранами и липосомами) занимает второе место в научной литературе. В этом контексте взаимодействий между липидами и белком особое внимание уделяется электростатическим взаимодействиям между полярными частями липидов и макромолекулами белка. Следовательно, в этих работах особый интерес уделяется исследованию влияния рН среды на свойства образующихся систем.

Существующие исследования показывают, что совместное использование белков и липидов в процессах регулирования коллоидных свойств различных дисперсных систем позволяет получить значительные положительные результаты, основанные на синергетическом действии компонентов. Также отмечается, что эффективность смесей белков и липидов, например, в процессе управления устойчивостью эмульсионных систем может достигаться в узком диапазоне значений концентраций компонентов в контактирующих фазах.

Анализ закономерностей взаимовлияния компонентов в таких многофазных системах чрезвычайно сложен. Эти сложности обусловлены необходимостью учета взаимосвязи обьемных и поверхностных свойств образующихся белок-липидных ассоциатов. Кроме того, образующиеся ассоциаты отличаются от традиционно изучаемых стехиометрических комплексов белок-низкомолекулярное водорастворимое ПАВ, переменным составом. Определяющими факторами при образовании таких ассоциатов, повидимому, будут природа белка, строение липидной молекулы и ионная сила раствора. Это и определило выбор объектов исследования: белки (глобулярные — бычий сывороточный альбумин (БСА), химотрипсин (ХТ), фибриллярные - коллаген, кератин, гибкоцепной полипептид - желатин), липиды (фосфатидилхолины -яичный лецитин, холестерин) и буферные системы различной молярности.

Представленный выбор обьектов исследований позволит оценить вклад как гидрофобных, так и электростатических взаимодействий при образовании белок-

липидных ассоциатов, и сформулировать принципы регулирования их свойств для обеспечения оптимальной устойчивости дисперсных систем. Таким образом, полученные результаты позволят создать новый вид ПАВ с регулируемым гидрофильно-олеофильным соотношением и определить их применения. Под таким углом зрения белок-липидные системы в литературе не рассматриваются.

Обзор литературных данных показал актуальность представленной работы, основанной на системном исследовании изменения свойств исходных молекул белка и липидов в обьеме контактирующих водной и масляной фаз в связи с необходимостью создания методологии управления устойчивости дисперсных систем, стабилизированных белок-липидными ассоциатами с широким спектром гидрофильно-олеофильного соотношения. Образующиеся ассоциаты белка и липида будут определять возможность регулирования их поверхностно-активных свойств (адсорбция, межфазное натяжение, реологические свойства MAC). В свою очередь, изменение поверхностно-активных свойств при переходе от индивидуальных макромолекул белка к их ассоциатам с липидами, позволит регулировать устойчивость разнообразных дисперсных систем. 2. Методы и объекты исследования. Поставленные в диссертации задачи потребовали использование комплекса физико-химических методов исследования дисперсных систем: метод динамического светорассеяния; метод дифференциальной сканирующей калориметрии; метода радиоактивных индикаторов; метод ИК-спектроскопии; метод эллипсометрии; метод Вильгельми; метод осциллирующей капли; метод Ленгмюра; метод микроскопии под углами Брюстера; метод сканирующей электронной микроскопии; метод атомно-силовой микроскопии; метод Ребиндера-Трапезникова;

микроинтерференционный метод; метод определения устойчивости эмульсий; метод иммунологического анализа. Обьктами исследования являлись коммерческие образцы: бычий сывороточный альбумин (Serva); химотрипсин (Sigma); яичный лецитин (Sigma); холестерин (Sigma); желатин марки «Фото А» (Казанский желатиновый завод); полученные и аттестованные в работе образцы: коллаген (Мг=300 кДа); кератин (Мг=28 кДа); полистирольные микросферы (d=l,2

мкм); а также, толуол (ХЧ), вода (бидистиллят), соли (ацетат натрия, сульфат аммония) (ЧДА), кислоты (соляная, уксусная)(ХЧ), гидрокснд натрия (Ч).

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Объемные свойства растворов белок-липидных ассоциатов.

Для того, чтобы ответить на вопрос о характере взаимодействия белков и липидов в объеме водного раствора белка и углеводородного раствора липида был проведен комплекс физико-химических исследований. Во-первых, впервые было изучено изменение размера рассеивающих свет частиц в водной и углеводородной фазах в зависимости от природы белка и липида. Эти результаты весьма важны для установления количественных характеристик превращения исходных макромолекул белка в их ассоциаты с липидами. Во-вторых, определение термодинамических параметров конформационных превращений белковых полипептидных цепей позволяет судить об интенсивности межмолекулярных белок-липидных взаимодействий в образующихся ассоциатах. В-третьих, использование радиоактивных индикаторов открывает пути определения химического состава образующихся белок-липидных ассоциатов.

3.1.1. Закономерности агрегации макромолекул белков в водной фазе

при образовании ассоциатов с липидами.

Методом динамического светорассеивания изучены закономерности изменения размера рассеивающих частиц в водных растворах белков глобулярных (БСА, химотрипсина), фибриллярных (коллагена, кератина) и гибкоцепного полипептида (желатина) при солюбилизации толуольного раствора липидов (лецитина, холестерина). Обнаружено, что происходит увеличение размера рассеивающих частиц при контакте водного раствора белка с толуольным раствором липидов, определяемое массопереносом компонентов из одной фазы в другую. При этом из систем, характеризующихся наличием одного пика с узким распределением рассеивающих частиц по размерам, происходит образование систем с широким распределением частиц по размерам. Изменения параметров распределения частиц по размерам происходит во времени. Период

достижения стационарных значений зависит от химического состава исследуемой системы.

Образование ассоциатов макромолекул белка и липидов, солюбилизировавших толуол было обнаружено по закономерностям изменения параметров распределения частиц по размерам (изменение размера, число пиков, ширина пиков, время достижения стационарных значений), рисунки 1-3. Рассмотренные параметры распределения частиц зависели от природы белка, липида, концентрации компонентов и ионной силы раствора (ионная сила раствора изменялась при изменении молярности ацетатного буфера при постоянном значении рН=6,2). Появление нескольких пиков на гистограммах распределения частиц по размерам и общее изменение параметров полученных распределений во времени определяется как химическим составом компонентов системы, так и временем контакта водного и толуольного растворов.

Наибольшие изменения в системе происходят при введении лецитина, липида, структура которого позволяет реализовывать как гидрофобные, так и полярные взаимодействия (ион-ионные, водородные). Для холестерина, характеризующегося преимущественно способностью реализации гидрофобных взаимодействий, изменения параметров распределения частиц по размерам при переходе от систем, в которых происходила солюбилизация чистого толуола, к системам, содержащих липид, минимальны.

Максимальные изменения параметров распределения частиц по размерам обнаружены в растворах желатина. Для этого полипептида обнаружено полимодальное распределение частиц по размерам с большой полушириной пиков. В растворах глобулярных белков при солюбилизации раствора липидов появляется второй пик, положение и ширина которого зависит от химического строения белка, липида и ионной силы раствора. Фибриллярные белки образуют крупные частицы, которые, вероятно, можно отнести к микрокаплям толуольного раствора липида. Такие микрокапли в системах, содержащих фибриллярные белки, иммобилизировали не более 5% белка от общего его содержания в растворе.

Таким образом, систематические исследования многофазных систем, содержащих такие белки как БСА, ХТ, коллаген, кератин, желатин и липиды -лецитин, холестерин, позволили доказать образование лиофильных нанодисперсных супрамолекулярных ассоциатов. В отличие от комплексов, обнаруженные объекты имеют переменный состав, достигающий стационарных значений при выдерживании системы во времени.

-----Г 25 |

Рис. 1. Распределение рассеивающих частиц: а — в растворе БСА, б - БСА-лецитин ассоциатов, в - БСА-холестерин ассоциатов, по размерам в водном растворе. С(БСА)=4,2-10"6 М, С(лецитина)= 1,3-10"3 М, С(холестерина)=2,6-10"3М, рН=6,2, Т=293.

Рис. 2. Распределение рассеивающих частиц: а — в растворе ХТ, б - ХТ-лецитин ассоциатов, в - ХТ-холестерин ассоциатов, по размерам в водном растворе. С(ХТ)= 3,4-10"5 М, С(лецитина)= 1,3-10" 3 М, С(холестерина)=2,6-10"3 М , рН=6,2, Т=293.

Рис. 3. Распределение рассеивающих частиц: а - в растворе желатина, б — желатин-лецитин ассоциатов, в - желатин-холестерин ассоциатов, по размерам в водном растворе. со(желатин)=0,1%, С(лецитина)= 1,3-10"3 М, С(холестерина)=2,6-10"3 М , рН=6,2, Т=293.

3.1.2. Закономерности изменения размера рассеивающих частиц в толуольных растворах липидов при солюбилизации белков и желатина

При установлении контакта между водным раствором белка и толуольным раствором липидов наблюдается процесс массопереноса компонентов как из углеводородной фазы в водную, так и в обратном направлении. Прежде всего, происходит солюбилизация воды в мицеллах липидов. Солюбилизирующая способность лецитиновых мицелл превосходит способность холестериновых. Наибольшие изменения в распределении частиц по размерам наблюдаются в системах, содержащих глобулярные белки, рисунки 4-6. Образуются крупные частицы, содержание которых достигает 8%, при концентрации буфера 1М.

а б

Рис. 4. Распределение рассеивающих частиц по размерам в: а - толуоле, б -толуольном растворе лецитина, С(лецитина)= 1,3-10"3 М, контактировавшего с водным раствором БСА, С(БСА)=4,2-10"6М рН=6,2, Т=293.

/

1 1

а б

Рис. 5 Распределение рассеивающих частиц по размерам в: а — толуоле, б толуольном растворе лецитина, С(лецитина)= 1,3-10"3 М, контактировавшего водным раствором ХТ, С(ХТ)= 3,4-10'5 М рН=6,2, Т=293.

Рис. 6. Распределение рассеивающих частиц по размерам в: а — толуоле, б толуольном растворе лецитина, С(лецитина)= 1,3-10"3 М, контактировавшего водным раствором желатина, со(желатин)=0,1%, рН=6,2, Т=293.

3.1.3. Изменение параметров конформационных переходов макромолекул белков и желатины в водных растворах при образовании ассоциатов с липидами.

Методом дифференциальной сканирующей калориметрии изучено влияние ассоциации полимеров с липидами на параметры конформационных переходов макромолекул (температура перехода, энтальпия перехода). Образование ассоциатов приводит к повышениюю температур конформационного перехода и увеличению энтальпии процесса. Наибольшие изменения происходят при солюбилизации лецитина глобулярными белками. Температура конформационного перехода повышается на 5-7К, в зависимости от природы белка и ионной силы раствора. Для желатина изменение температуры конформационного перехода составляет 7-8К, в зависимости от ионной силы раствора.

Исследование систем, содержащих белки, желатин и липиды, показало, что в контактирующих друг с другом водной и толуольной фазах происходит образование ассоциатов переменного состава, состоящих из полимерных макромолекул белка и молекул липида. Причем, образовавшиеся ассоциаты в водной фазе солюбилизируют толуол, и наоборот, ассоциаты в толуольном растворе солюбилизируют воду. Лецитин обладает более высокой способностью к ассоциации с исследованными белками, чем холестерин. Это связано с возможностью реализации не только гидрофобных взаимодействий, но и полярных связей, а также, большей гидрофильной частью молекулы липида, позволяющей минимизировать рост свободной энергии системы при связывании гидрофобного компонента преимущественно гидрофильной макромолекулой. Максимальной способности к ассоциации с липидами обладают глобулярные белки. Вероятно, это связано с тем, что глобулярные белки исходно имеют гидрофобные области на поверхности макромолекулы, определенные их третичной структурой. Для гибкоцепного полипептида при взаимодействии с липидами возможно образование внутримакромолекулярных мицелл липидов. Наименее выгодным процессом является образование ассоциатов фибриллярных

белков с липидами, вследствие существования данных белков в виде анизотропных дисперсных частиц, характеризующихся максимальной гидрофильностью поверхности.

На основании полученных результатов была предложена модель строения образующихся белок-липидных ассоциатов, рисунок 7. Образующийся ассоциат состоит из нескольких белковых макромолекул, встроенных в липидную жидкокристаллическую структуру, солюбилизировавшую как воду, так и неполярную фазу, в данной работе — толуол. Таким образом, липидный компонент ассоциата может быть разделен на три части: взаимодействующий с белковой молекулой, образующий поверхностный слой ассоциата и образующий ядро ассоциата.

Поверхностный слой ассоциата, образованный белковыми молекулами и ориентированным слоем липидов

Ядро ассоциата, содержащее

жидкокристаллическую фазу липидов, солюбилизировавшую воду и углеводород.

Рис. 7. Схема строения белок-липидного ассоциата в водной фазе.

3.2. Поверхностные свойства белок-липидных ассоциатов.

Анализ литературных данных, число которых весьма немногочисленно, показал, что поверхностные свойства систем, в которых одновременно находятся белки и липиды, объясняют образованием полислойных структур, построенных из белков и липидов. Существенный вклад в развитие этих представлений может внести рассмотрение в качестве элемента структуры, образующейся на межфазной границе, белок-липидного ассоциата. В связи с этим необходимо дальнейшее целенаправленное проведение исследований поверхностных свойств белок-липидных ассоциатов. Важным аспектом этих исследований является

выбор поверхностно-активных компонентов, отличающихся химическим строением.

3.2.1. Изотермы поверхностного натяжения растворов белков и ассоциатов белк-липид.

Изучены кинетические закономерности снижения поверхностного и межфазного натяжения в системах, содержащих белки и белок липидные ассоциаты. Показано, что образование ассоциатов приводит к сокращению времени достижения стационарных значений поверхностного и межфазного натяжения. Эти изменения коррелируют со способностью компонентов к ассоциации. Максимальные изменения обнаружены для систем, содержащих глобулярные белки и лецитин. Для фибриллярных белков предварительное введение в систему липидов не приводит к изменению кинетических параметров снижения поверхностного и межфазного натяжения.

Для систем, содержащих БСА, введение лецитина приводит к снижению времен релаксации межфазного натяжения с 128 минут в отсутствие лецитина до 84 минут при концентрации лецитин 1.3-10"4 М, 34 минут - лецитин 1.3-10"3 М. В случае ХТ данное изменение составляет от 105 минут до 67 минут -концентрация лецитина 1.3-10"4Ми28 минут - концентрация лецитина 1.3-10^ М.

Введение холестерина в систему приводит к аналогичным изменениям, но абсолютные значения снижения времен релаксаций характеризуются более низкими величинами. Для БСА - 96 минут при концентрации холестерина 2.6-10"4 М, 73 минут концентрации холестерина 2.6-10"4 М. Для ХТ - 84 минут при концентрации холестерина 2.6-10"4 М, 45 минут концентрации холестерина составляла - 2.6-10"4 М.

Для желатина, гибкоцепного полипептида, введение липидов в меньшей степени меняет параметры кинетических кривых снижения межфазного натяжения, относительно глобулярных белков. Значения времен релаксации для раствора желатины составляет 75 минут для систем, содержащих лецитин — 38 минут, холестерин - 49 минут в случае желатина концентрация липида не

оказывает существенного влияния на значения времен релаксации межфазного натяжения.

Обнаруженные различия в характере влияния природы макромолекулы на образование белок-липидных ассоциатов объясняются различиями в структуре ассоциатов.

Максимальное снижение поверхностного натяжения, на 32 мДж/м2, наблюдается в растворах ХТ и 30 мДж/м2 - БСА, глобулярных белков наблюдается снижаются при их ассоциации с лецитином, рисунки 8 и 9. Значительное изменение межфазного натяжение наблюдается во всем исследованном диапазоне концентраций белка при введении в толуольный раствор лецитина. Холестерин оказывает значимое изменение значений определяемого параметра только в интервале концентраций белка 10 "7 - 10 ^М. Эта область концентраций белка соответствует выходу изотерм межфазного натяжения на границе водный раствор белка — толуольный раствор липида на стационарные значения. Такое поведение белок-липидных ассоциатов на межфазной границе свидетельствует о том, что, кроме изменения гидрофильно-олеофильного соотношения поверхности отдельных ассоциатов, важным фактором, влияющим на способность достижения минимальных значений межфазного натяжения, является способность образовывать на межфазной границе полислойные структуры.

Рис.8. Снижение межфазного натяжения на границе водный раствор БСА — толуольный раствор липида, рН=6.2, Т= 293К:

1 - БСА, молярность буфера 0.01-0.1 М;

2 - БСА, молярность буфера 1.0 М;

3 - БСА - холестерин 2.6-10"4 М, 2.6-10"3 М, молярность

буфера 0.01-0.1 М;

4 - БСА - лецитин 1.3-10"4 М, молярность буфера 0.01-0.1М;

5 - БСА - лецитин 1.3-10"3 М, молярность буфера 0.01-0.1М;

35 30 " 25 -20 15 "

110 1-10 110 1-10

1-Ю"9 МО"8 МО"7 МО"6 МО"5 МО4 МО"3

Рис.9. Снижение межфазного натяжения на границе водный раствор ХТ - толуольный раствор липида, рН=6.2, Т= 293К:

1 - ХТ, молярность буфера 0.01-0.1 М;

2 - ХТ, молярность буфера 1.0 М;

3 - ХТ - холестерин 2.6-10"4 М, 2.6-10"3 М, молярность

буфера 0.01-1.0 М;

4 - ХТ - лецитин 1.3-10"4 М, молярность буфера 0.01-1.0 М;

5 - ХТ - лецитин 1.3-10"3 М, молярность буфера 0.01-1М;

35 30 -25 " 20 " 15 10

5 -

Дет, мДяс/м

Рис.10 Снижение межфазного натяжения на границе водный раствор желатина — толуольный раствор липида, рН=6.2,1=20°С: 1-желатин; 2 — желатин - холестерин 2.6-10"4 М, 2.6-10"3 М, 3 - желатин -лецитин 1.3-10"3 М, Т= 293К.

О 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Межфазное натяжение демонстрирует синергетический эффект от ассоциации глобулярных белков с лецитином. Обнаружены условия достижения ультранизких значений межфазного натяжения.

Для желатина, рисунок 10, изменения межфазного натяжения наблюдаются при более высоких концентрациях высокомолекулярного вещества, чем для глобулярных белков. Это связано с высокой гидрофильностью макромолекулы гибкоцепного полипептида относительно глобул макромолекул БСА и ХТ,

имеющих мозаичную топологию с разделенными гидрофильными и гидрофобными областями. Но, для желатина при введении лецитина наблюдается максимальное снижение межфазного натяжения, составляющее, 17 мДж/м2.

Для желатина минимальное значение межфазного натяжения при образовании ассоциатов с липидами составляет 3 мДж/м2, что значительно выше, чем для глобулярных белков.

Фибриллярные белки характеризуются аддитивным снижением межфазного натяжения при введении липидов в толуольный раствор. Значения межфазного натяжения в этих системах определяется наличием двух поверхностно-активных веществ.

3.3. Изотермы двумерного давления 2D пленок, сформированных

из белков и белок липидных ассоциатов.

Метод Ленгмюра традиционно используется для получения изотерм двумерного давления 2D пленок, сформированных из ПАВ, нерастворимых в субфазе. На рисунке 11 представлены изотермы двумерного давления 2D пленок лецитина и холестерина, сформированных на водной субфазе. Полученные результаты показывают, что изученные липиды обладают высокой поверхностной активностью на границе вода-воздух. Использование лецитина при формировании 2D пленки позволяет достичь значений двумерного давления на 16 мН-м"1 больше, чем в случае холестерина. Причем, максимальные значения двумерного давления, соответствующие двумерному давлению коллапса 2D пленок, достигается при площадях, близких к площади сечения молекулы лецитина и значительно меньших для холестерина. Следовательно, в случае холестерина реализуются

*| Я, нДж/м1

возможности формирования полислойных структур, вероятно, имеющих жидкокристаллическое состояние.

Рис.11. Изотермы двумерного давления 2D пленок, сформированных на поверхности водной субфазы из: 1 - холестерин, 2 - лецитин. рН=6,2, Т= 293К.

20 40 60 S0 100 120 А, А/молекула

Исследование 20 пленок, сформированных из белков и белок-липидных ассоциатов на водной субфазе, были начаты с определения условий получения устойчивых пленок. В белковых системах основным процессом, приводящим к разрушению формирующейся 2Б пленки, является десорбция высокомолекулярного компонента с межфазной границы в обьем водной субфазы. Поведение белков при формировании 2Т> пленки зависит от их химического строения. Так, пленки, сформированные из фибриллярных белков (коллаген и кератин) отличаются высокой устойчивостью. Такое поведение изученных фибриллярных белков объясняется их низкой растворимостью в водной фазе. Другим фактором, обеспечивающим устойчивость получаемых 2Б пленок, является адсорбция макромолекул на поверхности раздела фаз, характеризующаяся многоточечным механизмом. Это приводит к значительному смещению адсорбционно-десорбционного равновесия в сторону иммобилизованного полимера в адсорбционном слое. Последней особенности поверхностных свойств высокомолекулярных ПАВ недостаточно для обеспечения высокой устойчивости 2П пленки в случае глобулярных белков и желатина, гибкоцепного полипептида.

На рисунке 12 представлены изменения двумерного давления Ю пленок, сформированных из БСА и БСА-лецитин ассоциатов. Исследования поведения 2В пленок в режиме циклически повторяющихся режимов сжатия и растяжения показало, что для глобулярных белков возможна потеря устойчивости пленки в состоянии максимального сжатия, то есть, в области значений площадей, приходящихся на одну молекулу, соответствующих коллапсу 2Т> пленки. В этом состоянии наблюдается падение значения двумерного давления во времени выдерживания пленки в максимально сжатом состоянии. Такое поведение системы объясняется десорбцией макромолекул белка (БСА, ХТ) из 2Б пленки в обьем водной фазы. Выдерживание пленки в состоянии, характеризующимся достижением значений двумерного давления, равного 0,9 величины давления коллапса, показало, что в этих условиях пленки устойчивы. Таким образом, коллапс 21) пленки глобулярных белков может рассматриваться в качестве

«спускового механизма», запускающего процесс десорбции макромолекул из пленки в водную субфазу. При этом, значение двумерного давления падает на 25% и при повторном сжатии характеристики изотерм двумерного давления не восстанавливают первоначальные значения.

Рис. 12. Зависимость двумерного давления 2Б пленок,

сформированных из БСА - 1 и БСА-липидных ассоциатов - 2 в циклическом режиме сжатия-растяжения. рН=6,2, Т= 293К.

85 2485 2570 2655

сжатие выдерживание растяжение сжатие

Введение в систему липидов приводит к получению устойчивых 20 пленок, таким образом, белок-липидные ассоциаты, образованные глобулярными белками приобретают, новые свойства. Это отличие в поведении белок-липидных ассоциатов глобулярных белков открывают новые возможности процесса молекулярного дизайна в белковых системах.

На рисунке 13 представлены изотермы двумерного давления 2Т> пленок, сформированных из БСА и его ассоциатов с лецитином и холестерином. Введение в систему липидов приводит к изменению параметров изотерм 20 пленок, сформированных из БСА. Увеличение содержания холестерина от 2.6-10"4 до 2.6-10'3 М и введение лецитина любой концентрации приводит к исчезновению перегиба на изотерме двумерного давления, соответствующего фазовому переходу в 2Б пленке БСА. Кроме этого, переход к белок липидным ассоциатам приводит к значительному росту значений двумерного давления коллапса пленки и площатей, приходящихся на одну молекулу, при которых начинается регистрация двумерного давления.

18 24 30

А, ны /молекула

Рис. 13 Изотермы двумерного давления Ю пленок, сформированных на поверхности водной субфазы из: 1 - БСА и его ассоциатов с 2 - холестерином С=2.6-10"4 М, 3 -холестерином С=2.6-10"3 М, 4 - лецитином С=1.3-10"4 М, 5 - лецитином С=1.3-10"3 М.

рН=6,2, Т= 293К.

Для изотерм Ю пленок, сформированных из ХТ закономерности, обнаруженные в системах, содержащих БСА, повторяются, за исключением, того факта, что образование ассоциатов ХТ с лецитином приводит к увеличению значений площадей, приходящихся на одну молекулу белка в точке коллапса пленки, рисунок 14. На фоне роста значений двумерного давления коллапса пленок при переходе от индивидуального ХТ к его ассоциатам с липидами, можно утверждать, что образующиеся ассоциаты белок-липид имеют более высокую поверхностную активность, чем исходные макромолекулы глобулярных белков.

Рис.14 Изотермы двумерного давления 2Т) пленок, сформированных на поверхности водной субфазы из: 1 - ХТ и его ассоциатов с 2 — холестерином С=2.6-10"4 М, 3 -холестерином С=2.6-10"3 М, 4 - лецитином С=1.3-10"4 М, 5 - лецитином С=1.3-10"3 М. рН=6,2, Т= 293К.

Переход к вопросу рассмотрения влияния образования ассоциатов белок-липид для фибриллярных белков требует очередного упоминания о различии свойств исследованных глобулярных (БСА, ХТ) и фибриллярных (коллаген,

кератин) белков. В отличие от глобулярных белков фибриллярные образуют в водной фазе не растворы, а молекулярные дисперсии. Такое различие в свойствах этих классов белков определяет тот факт, что 2Э пленки, сформированные из коллагена или кератина, устойчивы при любых значениях двумерного давления.

На рисунке 15 представлены изотермы двумерного давления 20 пленок, сформированных из коллагена и его ассоциатов с липидами. Отличительной особенностью поведения коллагена в 20 пленках является его способность к фибриллообразованию и образованию сплошной пленки, построенной из коллагенового волокна. Такие фазовые переходы позволяют объяснить полученные характеристики изотерм двумерного давления: значительный перегиб на изотерме, резкое увеличение значений двумерного давления при площадях, приходящихся на одну молекулу менее 400 нм2 и большие значения давления коллапса пленки. Введение в систему холестерина приводит к возрастанию значений двумерного давления при площадях, приходящихся на одну молекулу более 400 нм2, что свидетельствует об изменении поверхностно-активных свойств отдельных макромолекул коллагена, но сохранение его способности к фибриллообразованию. Для ассоциатов коллагена с лецитином вид изотерм меняется. Введение лецитина в систему приводит к исчезновению области изотермы, соответствующей процессу фибриллообразованию коллагена в Ю

пленке. При этом происходит увеличение значений площадей приходящихся на одну молекулу в точке коллапса.

Рис. 15. Изотермы двумерного давления Ю пленок, сформированных на поверхности водной субфазы из: 1 — коллагена и его ассоциатов с 2 — холестерином С=2.6-10"4 М, 3 -холестерином С=2.6-10"3 М, 4 -лецитином С=1.3-10"4 М, 5 - лецитином С=1.3-10"3 М. рН=б,2, Т= 293К.

Для изотерм двумерного давления 2Т) пленок, сформированных из кератина и его ассоциатов с липидами, рисунок 16, наблюдаются аналогичные закономерности влияния липидов, обнаруженные в случае коллагена.

Таким образом, образование ассоциатов фибриллярных белков с липидами изменяют их способность к образованию надмолекулярных структур в 20 пленках. При этом, поверхностная активность образующихся ассоциатов оказывается выше, чем у исходных макромолекул белка.

50 60 . 70

А, км /молекула

Рис. 16 Изотермы двумерного давления 20 пленок, сформированных на поверхности водной субфазы из: 1 — кератина и его ассоциатов с 2 — холестерином С=2.6-10~4 М, 3 -холестерином С=2.6-10"3 М, 4 - лецитином С=1.3-10"4 М, 5 - лецитином С=1.3-10"3 М. рН=6,2, Т= 293К.

Исследование систем 2Б пленок, сформированных из желатина, показало, что для этого гибкоцепного полипептида возможно получение устойчивых пленок только при введении в водную субфазу электролитов, приводящих к снижению его растворимости в воде, рисунок 17. В противном случае, наблюдался процесс десорбции желатина из 20 пленки в водную субфазу при значениях двумерного давления выше 5 мН/м. Наибольшую эффективность в процессе предотвращения выхода желатина из Ю пленки при минимальной концентрации показал сульфат аммония. Устойчивые 2Б пленки, сформированные из желатина и его ассоциатов с липидами, были получены на поверхности 0,4М раствора (МН4)2804. Как и для коллагена, желатин демонстрирует способность к образованию надмолекулярных структур в 2Б пленках. Введение в систему липидов приводит к изменению способности желатина к образованию данных структур. Отличительной

особенностью в характеристиках изотерм двумерного давления 2Т) пленок, сформированных из ассоциатов желатина с липидами от систем, основанных на коллагене, является величины максимального значения двумерного давления. Обнаруженные закономерности показывают, что при денатурации коллагена, образующийся желатин теряет значительную часть поверхностно-активных свойств в 2Б пленках. Образование ассоциатов с липидами способно компенсировать эти потери не полностью.

Рис.17 Изотермы двумерного давления 2Б пленок, сформированных на поверхности водного раствора (ЫН4)2804 субфазы из: 1 - кератина и его ассоциатов с 2 — холестерином С=2.6Т0"4 М, 3 - холестерином С=2.6Т0" 3 М, 4 - лецитином С= 1.3-1О"4 М, 5 -

лецитином С=1.3Т0" М. рН=6,2, Т=

150 200 250 А, нм /молекула 293К.

Определены условия формирования устойчивых 2D пленок, сформированных из белков и их ассоциатов с липидами на поверхности водной субфазы. Обнаружено, что ассоциация глобулярных белков и желатина с лецитином приводят к повышению устойчивости 20 пленок. Это связано с затруднением способности выхода полимерного компонента из Ю пленки в обьем водной субфазы.

Установлено, что максимальные значения двумерного давления Ю пленок зависят от химического состава ассоциата. Введение в систему липидного компонента приводит к возрастанию двумерного давления, что свидетельствует о возникновении структур 20 пленки, способных к большей компенсации нескомпенсированных межмолекулярных взаимодействий на границе раздела фаз

вода/воздух. Для ассоциатов глобулярных белков с лецитином эта способность максимальна.

3.4. Морфология Ю пленок белков и их ассоциатов с липидами.

В работе исследована морфология образующихся Ю пленок методами брюстеровской, атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопией в зависимости от поверхностного давления, позволило обнаружить образование кластерных структур макромолекул белков при переходе от газообразного к жидко-конденсированному состоянию 2D пленки. Введение в систему липидов при их ассоциации с макромолекулами разрушают кластерные структуры пленки.

При увеличении двумерного давления в 2Б пленке фибрилярных белков происходит агрегация белковых макромолекул. Для коллагена при двумерном давлении более 40 мН/м образуются структуры, построенные из параллельно расположенных макромолекул. При образовании ассоциатов с липидами нарушается порядок упаковки макромолекул, возрастает беспорядок во взаимоориентации анизотропных полимерных частиц, уменьшается плотность образующейся 20 пленки.

Для 20 пленок, сформированных из кератина и его ассоциатов с лецитином, характерно образование нерегулярных структур, представляющих собой пространственные сетки с узлами, полученными при скручивании в единую спираль нескольких макромолекулярных цепочек, рисунок 18. Введение в систему лецитина изменяет параметры образующейся надмолекулярной структуры, ассоциаты кератин-лецитин образуют сетки с меньшим числом узловых точек.

Методом Брюстеровской микроскопии исследована морфология 20 пленок, сформированных из БСА. На рисунке 19 представлены фотографии 20 пленок, полученных при сжатии до точки коллапса пленки и при растяжении этой пленки до состояния, характеризующегося двумерным давлением, равным 10 мН/м. Полученные результаты показывают, что образующаяся конденсированная фаза при сжатии 2Б пленки БСА не полностью разрушается на элементарные структурные составляющие при увеличении площади, приходящейся на одну

молекулу белка. Таким образом, обнаружено, что структуры 2В пленок не являются обратимо восстанавливаемыми объектами. Сравнивая данный факт со

Рис.18 Фотографии структур 2Б пленок, сформированных из кератина (а) и ассоциатов кератина с лецитином (б), полученных методом сканирующей электронной микроскопии. Двумерное давление 20 мН/м. рН=6,2, Т= 293К.

свойствами обратимого поведения изотерм двумерного давления в режимах сжатия-растяжения можно утверждать, что поверхностно-активные характеристики белков и белок-липидных ассоциатов определяются поведением отдельных структурных элементов и образующихся из них структур в целом. Вклад этих составляющих в интегральную характеристику системы зависит от химического состава компонентов и особенностей надмолекулярных структур, образованных из них.

а б

Рис.19 Фотографии структур Ю пленок, сформированных из БСА в точке коллапса пленки (а) и БСА при растяжении пленки до значение двумерного давления 10 мН/м (б), полученных методом Брюстеровской микроскопии. рН=6,2, Т= 293К.

Поведение отдельных макромолекул белков в 20 пленках не может рассматриваться в приближении идеального газа. На рисунке 20 представлена фотография структуры 2Б пленки, сформированной из БСА при сжатии до значений двумерного давления 5 мН/м. При таком низком значении двумерного давления зафиксировано образование кластерных структур, имеющих размер порядка нескольких сотен нм.

Структура 20 пленок, сформированных из белок-липидных ассоциатов, отличается меньшим числом дефектов, но появляется возможность сегрегации компонентов, приводящей к выделению липидной фракции (темная зона).

Тенденция к выделению отдельной липидной фракции в структуре 2В пленки усиливается при увеличении концентрации лецитина в системе.

а б в

Рис. 20. Фотографии структур 2Б пленок, сформированных из БСА при двумерном давлении 5 мН/м (а), ассоциатов БСА-лецитин при С= 1.3-10"3 М, значения двумерного давления 40 мН/м (б) и ассоциатов желатин-лецитин при С= 1.3-10"3 М, значение двумерного давления 40 мН/м (в), полученных методом Брюстеровской микроскопии. рН=6,2, Т= 293К.

3.5. Адсорбция белков и белок-липидных ассоциатов на границе раздела фаз вода/толуол

Введение в систему липидов приводит к увеличению значений адсорбции белков на межфазной границе, рисунок 21 и 22. причем наибольшие изменения наблюдаются в интервале концентраций белка от 10"8 до 10"бМ, то есть в области концентраций, в которых для индивидуальных белков наблюдается переход от разряженного слоя к слою, характеризующегося полислойной структурой. Таким образом, образование белок-липидных ассоциатов способствует образованию

Г, моль/м'

межфазных слоев, характеризующихся полислойной структурой, вероятно, имеющих жидкокристаллическое строение.

Рис.21. Изотермы адсорбции БСА на межфазной границе вода-толуол при концентрации липидов: 1 - С=0 2 -холестерином С=2.6-10"4 М, 3 -холестерином С=2.6-10"3 М, 4 -лецитином С= 1.3-10"4 М, 5 - лецитином С=1.3-10-3 М. рН=6,2, Т= 293К.

10 ю КГ 10"

Рис.22 Изотермы адсорбции ХТ на межфазной границе вода-толуол при концентрации липидов: 1 — С=0 2 — холестерином С=2.6-10"4 М, 3 -холестерином С=2.6-10"3 М, 4 -лецитином С=1.3-10"4 М, 5 - лецитином С=1.3-10"3 М. рН=6,2, Т= 293К.

3.6. Влияние лецитина на иммобилизацию БСА на поверхности полистирольпых микросфер

Методом ИК-спектроскопии изучено изменение вторичной структуры БСА при его адсорбции на поверхности полистирольных микросфер. При адсорбции БСА на полимерной поверхности происходит изменение конформационного состояния макромолекулы. Предварительная ассоциация БСА с лецитином приводит к уменьшению этих изменений состояния полимерной цепи. Вероятно, это связано с перестройкой структуры ассоциата, иммобилизирующегося на полимерной поверхности. В этих условиях молекулы лецитина могут

переориентироваться в адсорбционном слое, как наиболее лабильный компонент, выполняя функции переходного элемента от гидрофобной поверхности полистирола к гидрофильной молекуле БСА.

Процентное содержание каждой из форм вторичной структуры макромолекулы БСА определяется площадью под соответствующей кривой,

В таблице 1 представлены результаты по определению вторичной структуры макромолекул БСА в зависимости от их иммобилизации на поверхности полистирольных микросфер. Видно, что при адсорбции БСА на поверхности полистирольных микросфер происходит изменение их конформационного состояния: чем более гидрофобна полимерная поверхность, тем выше адсорбция БСА и тем большие изменения претерпевает вторичная структура белковых макромолекул. Это связано с необходимостью максимального соответствия гидрофобных участков на поверхности белковой глобулы и поверхности полимерной микросферы. Наличие полярных групп на полимерной поверхности, приводит к сохранению в большей степени вторичной структуры макромолекулы БСА, характерной для ее структуры в водном растворе.

Таблица 1

Зависимость содержания элементов вторичной структуры макромолекул БСА в водном растворе и адсорбционном слое на поверхности полистирольных микросфер

Образец Содержание элементов вторичной структуры, % Погрешность, %

а Р Р*п> Р сумм Повороты

БСА кристаллический 69 31 31 3

БСА в растворе 70 5 20 25 5 5

БСА, солюбилизировавший толуол в растворе 58 8 29 36 6 5

БСА адсорбированный на микросферах 55 8 29 37 8 8

Ассоциат БСА-лецитин, С= 1.3-10"4 М, адсорбированные на микросферах 61 10 25 35 4 8

Ассоциат БСА-лецитин, С= 1.3-10"3 М адсорбированные на микросферах 68 9 19 28 4 8

Таким образом, образование белок-липидных ассоциатов обеспечивает сохранение исходной третичной структуры БСА. Данное свойство белок-липидных ассоциатов связано с появлением в них легкоподвижного компонента, способного обеспечивать минимальный градиент нескомпенсированных межатомных взаимодействий при переходе от гидрофобного полистирола к воде.

3.7. Реологические свойства адсорбционных слоев белков и их ассоциатов с липидами

3.7.1. Сдвиговая реология адсорбционных слоев

Методом Ребиндера-Трапезникова исследовано влияние липидного компонента на реологические свойства адсорбционных слоев и тонких пленок, стабилизированных глобулярными белками, желатином и их ассоциатами с липидами. На рисунке 23 представлены экспериментальные кривые развития

напряжения сдвига в межфазном слое при его деформации с различными скоростями.

Рис.23 Кривые развития напряжения сдвига во времени для МАС БСА на границе вода-толуол, время формирования 1 час, при различных скоростях деформации: 1 - 0,00041, 2 - 0,0020, 3 -

100

200

300

400

500

600

0,0104, 4-0,0837 с".

Обработка экспериментальных кривых позволила рассчитать реологические параметры адсорбционных слоев и тонких пленок, стабилизированных желатином и его ассоциатами с лецитином, таблица 2. Следует отметить, что при увеличении концентрации лецитина прочность, упругость и вязкость пленки увеличиваются.

Однако реологические параметры пленок не равны удвоенным соответствующим величинам адсорбционного слоя.

Анализ данных позволяет сделать вывод, о том, что модуль упругости и предельное напряжение сдвига эмульсионных пленок меньше аналогичных значений для межфазных адсорбционных слоев. В то же время эмульсионные пленки более вязки, чем межфазные адсорбционные слои. Реологические параметры пленок (в условиях формирования адсорбционных слоев в них в течение нескольких минут) соизмеримы с аналогичными характеристиками слоя, формировавшегося 4 часа.

Таблица 2

Эффективный модуль упругости (в), двумерное предельное напряжение сдвига (гг), двумерная вязкость (т; ) эмульсионных пленок и межфазных адсорбционных слоев, сформированных из водных смесей желатина и желатин-лецитиновых ассоциатов, на границе с толуолом; время формирования слоя 4 часа

Параметр Эмульсионная пленка Межфазный адсорбционный слой

Содержание ПАВ

юЖел = 0.5 %; солец=М02, % Мжел = 0.5% сожел = О-5 солец=М02, % Сйжел = 0.5%

О , мН/м 2.15 4.10 5.41 7.18

гг, мН/м 0.68 1.32 3.00 5.16

77 , мН'с/м 1.02 3.75 0.96 1.51

Введение в систему лецитина приводит к снижению реологических параметров квазиравновесных межфазных слоев по сравнению со слоями желатины без лецитина (время формирования слоев 6 час). По мере увеличения концентрации фосфолипидного компонента в водной фазе при постоянной концентрации желатины наблюдается монотонное снижение поверхностной вязкости и упругости слоя.

3.7.2. Изучение свойств адсорбционных слоев, сформированных из белков и белок-липидных ассоциатов методом осциллирующей капли

Методом осциллирующей капли исследованы зависимости влияния лецитина на межфазное натяжение и поверхностный модуль упругости межфазных слоев, сформированных на границе водный раствор БСА и толуольный раствор лецитина. Проведенные измерения показали, что значения межфазного натяжения, полученные двумя методами: Вильгельми и пульсирующей капли, совпадают. Введение в систему лецитина, наряду с уменьшением межфазного натяжения, приводит к снижению и поверхностного модуля упругости адсорбционного слоя, рисунок 24.

с, м

Рис.24 Зависимость эффективного модуля упругости МАС от концентрации лецитина,

сформированных на границе водный раствор белка - толуольный раствор липида для: 1 - БСА. С=7,4.10'7М, 2 - БСА,С=7,4.10"6М, З -ХТ С=3.6-10'7 М, 4 - ХТ, С=3.6-10"6 М, 5 - желатин 0,1%, 6 - желатин, 0,9%. рН=6,2, Т= 293К.

3.4. Влияние белок-липидных ассоциатов на устойчивость эмульсий

Анализ результатов исследования поверхностных свойств белок-липидных ассоциатов позволяет сделать весьма важные выводы, нашедшие, как будет показано, экспериментальное подтверждение.

Образование ассоциатов на межфазной границе изменяет механизм стабилизации дисперсных систем. Если для эмульсий, стабилизированных

белками, приоритетным фактором стабилизации является особые реологические свойства МАС (эффективный модуль упругости, прочность и вязкость), то для белок-липидных ассоциатов большое значение приобретают термодинамические характеристики границы раздела фаз. Такое смещение роли факторов стабилизации эмульсий в сторону возрастания роли снижения межфазного натяжения определяется коллоидно-химическими свойствами белок-липидных ассоциатов. При образовании белок-липидных ассоциатов снижается способность белковых макромолекул к структурообразованию в МАС, но при этом, благодаря уникальной структуре ассоциатов открываются возможности значительной лиофилизации межфазной границы водный раствор — углеводородный раствор. Эти закономерности отражаются на возможности получения высококонцентрированных эмульсий, рисунок 25.

Изучена эмульгирующая способность растворов глобулярных белков и желатина и толуольного раствора лецитина. Показано, что эмульгирующая способность в системе экстремальным образом зависит от концентрации лецитина. Это связано с двумя разнонаправленными тенденциями при образовании ассоциатов белков с лецитином. Во-первых, при введении липидного компонента происходит снижение значений межфазного натяжения, что способствует лиофилизации образующейся дисперсной системы. Во-вторых, образующиеся ассоциаты формируют адсорбционный слой, структура которого характеризуется более низкими значениями реологических параметров (поверхностного модуля упругости, поверхносной вязкости). Эти два фактора, зависящие от концентрации компонентов, приводят к получению экстремальной зависимости эмульгирующей способности системы от концентрации ПАВ. При этом первый фактор оказывает большее влияние на величину среднего размера капель эмульсии. Этот параметр снижается, даже в области значений концентрации лецитина, соответствующей уменьшению эмульгирующей способности.

Рис.25 Изменение объемной доли заполнения ср во времени в концентрированных эмульсиях м/в, стабилизированных ассоциатами

желатины (Сжел = 0.10 %) с лецитином при Слец, %: 0 (1), 0.0010 (2), 0.0020 (3), 0.0050 (4), 0.010 (5). рН=6,2, Т=293К.

На рисунке 26 представлены кривые распределения капель эмульсии толуола в водной фазе по размерам. При использовании в качестве стабилизатора эастворов белков или желатина получаются эмульсии со средним размером сапель 10 мкм, в случае БСА, и 6 мкм — желатина, при унимодальном эаспределении капель по размерам. Введение в систему липидного компонента триводит к появлению фракции капель эмульсии, характеризующихся более низкими значениями диаметров. Такое поведение системы связано с образованием белок-липидных ассоциатов на границе раздела фаз, обладающих более высокими поверхностно-активными свойствами по сравнению с исходными высокомолекулярными соединениями. Появление бимодальности распределения капель эмульсии по размерам в этих системах обусловлено кинетическими закономерностями процессов: сгущением массы компонентов на межфазной поверхности, образованием ассоциатов, снижением межфазного натяжения и формированием на границе вода/толуол тонкой пленки, характеризующейся особыми реологическими свойствами. Избежать развития этих сложных процессов возможно при использовании в качестве стабилизатора предварительно синтезированных белок-липидных ассоциатов. Растворение в водной фазе выделенных и лиофилизированных ассоциатов позволяет получить эмульсии с

унимодальным распределением капель по размерам со средним значением диаметра 3 мкм для БСА и 2 мкм для желатина.

а б

Рис. 26. Распределение по размерам капель эмульсий стабилизированных: а — БСА и БСА-липидными ассоциатами БСА,СБса=7,4Т0"6М, Слец : 1-0; 2-5-10'8М; 3-1,ЗТ0"7М; Схол: 4-2,6Т0"5М; 5-2,6-10"4М; 6- раствор лиофилизированных ассоциатов БСА-лецитин СБса=7,4-10"6М; б - желатином и желатин-липидными ассоциатами, шжел=0,9%, Слец: 1-0; 2-5-10"8М; 3-1,3-10-7М; 4-1,3-10"5М; Схол: 5-2,6-10"5М; 6-2,6-1 О^М ;7- раствор лиофилизированных ассоциатов желатин-лецитин юЖел=0,9%.

3.5. Реология эмульсий, стабилизированных белок-липидными

ассоциатами.

Вопрос создания новых видов пищевых и фармацевтических продуктов очень часто связан с получением дисперсных систем, содержащих большую обьемную долю высокодисперсной неполярной фазы. Важной характеристикой таких систем, наряду с их устойчивостью в статических условиях, является поведение эмульсии при наложении на нее сдвиговых напряжений. Таким образом, реологические испытания предельно концентрированных эмульсий приобретают громадное технологическое значение.

В таблице 3 представлены реологические параметры, рассчитанные по моделям Гершеля-Балкли и Кэссона в зависимости от концентрации лецитина, ¡начения пределов текучести т'к и г", характеризующие прочностные свойства ¡труктурированных эмульсий, различаются не более чем на 6 — 18 %. Исключением является система с высоким содержанием лецитина (Слец = 0.010 /о), для которой различие составляет ~30 %. Обе использованные модели с юстаточной точностью описывают реологическое поведение эмульсий. Однако соэффициенты корреляции между экспериментальными значениями т и $еличинами, рассчитанными с использованием реологических моделей, выше в ;лучае уравнения Гершеля-Балкли с индексом течения п от 0.27 до 0.69. Анализ 1риведенных в табл. данных показывает, что введение фосфолипида в систему, юпровождающееся ассоциацией с желатиной, приводит к понижению пределов текучести. Например, при увеличении концентрации лецитина от 0 до 0.010 % шачение т'к уменьшается от 17.8 до 5.0 Па. С увеличением соотношения келатина/лецитин в исследуемом диапазоне концентраций пластическая вязкость т]р монотонно возрастает от 4.9'10-2 до 1.610"' Па с соответственно.

Полученные результаты, описывающие аномально-вязкое поведение лгульсий при течении, объясняются наличием трехмерных пространственных ;труктур, формирующихся при флокуляции капель в процессе потери агрегативной устойчивости эмульсий разного состава. Единой теории, объясняющей неньютоновское течение концентрированных эмульсий, пока не существует. В большинстве случаев объяснения основаны на описании процессов флокуляции-дефлокуляции, которые регулируют рост или разрушение агрегатов (образование или разрушение контактов) при изменении скорости сдвига.

Решающим фактором, влияющим на реологию структурированных эмульсий, является прочность и природа коллективных межчастичных взаимодействий. В случае использования высокомолекулярных стабилизаторов определяющую роль играют межфазные адсорбционные слои макромолекул (структурно-механический барьер). Межфазный адсорбционный слой желатины

на границе масло/водный раствор (Сжел = 0.10 %) представляет собой концентрированный (~20 %) гель толщиной 20 — 50 нм с неоднородным распределением плотностей по мере удаления от границы раздела. Поскольку такие адсорбционные слои содержат много воды и имеют диффузионное строение, сложная константа Гамакера А* составляет 5'10-21 Дж. Лиофилизация межфазного слоя и низкая поверхностная вязкость определяют и структуру концентрированных эмульсий. Капли масла, покрытые такими слоями, при седиментации перемещаются на малых расстояниях друг от друга, что приводит к их максимальной упаковке ср = 0.80 при Слец = 0.010 % .

Таблица 3.

Реологические параметры концентрированных эмульсий толуола, стабилизированных желатиной (Сжел = 0.10 %) с лецитином при 293К, рассчитанные по уравнениям Гершеля-Балкли и Кэссона_

Слецю3, % Модель Гершеля-Балкли Модель Кэссона

<,Па п К <, Па т]рЛ02, Па с

0 17.8 0.60 1.5 15.7 5.0

1.0 15.9 0.58 1.9 15.0 9.7

2.0 14.5 0.69 1.2 13.4 10.0

5.0 7.2 0.33 4.6 8.8 15.0

10.0 5.0 0.27 6.4 7.1 16.0

На основании традиционных представлений, реологические параметры структурированных эмульсий зависят от объемной доли заполнения ф, среднего размера частиц и от прочности индивидуального контакта тш,д между частицами, что определяется числом и прочностью микроконтактов между адсорбционными слоями на поверхности частиц.

При допущении, что предел текучести, рассчитанный с использованием реологических моделей, характеризует механическую прочность структурированных эмульсий (гк = тс), т.е. способность материала сопротивляться

»азрушению под действием внешних напряжений при сдвиге, можно :оличественно оценить прочность индивидуального контакта между каплями. На юнове модели Кэссона, используя экспериментально найденные параметры т" и 7Р, также можно оценить параметры межчастичных взаимодействий: силу цепления частиц на единицу площади контакта /А и прочность межчастичных :онтактов

Полученные эмульсии толуольного раствора лецитина в водном растворе >СА и желатины концентрировались в процессе седиментации. Увеличение юнцентрации лецитина в системе приводит к увеличению значений дологических параметров системы. Данная закономерность связана не только с 'меныпением размера капель эмульсии, но и возможностью образования шдкокристаллических структур в тонких пленках, содержащих белок-липидные .ссоциаты.

В Заключении сформулированы основные результаты работы:

1. Установлено образование ассоциатов белок-липид, отличающихся от известных стехиометрических комплексов белок-ПАВ (методами динамического светорассеяния, радиоактивных индикаторов, дифференциальной калориметрии и ИК-спектроскопии). Эти отличия проявляются в их поверхностной активности на различных границах раздела фаз. Дополнительная функция белок-липидных ассоциатов заключается в создание депо ПАВ при формировании межфазных адсорбционных слоев.

2. Создана модель белок-липидных ассоциатов и показано, что природа белковой макромолекулы (глобулярный белок, фибриллярный белок или гибкоцепной полипептид) играет определяющую роль в закономерностях их образования.

3. Обнаружено, что образование ассоциациатов белок-липид сопровождается изменением конформационного состояния полимерных макромолекул и

термодинамических характеристик структурных переходов макромолекул. Это связано с возможностью реализации не только гидрофобных, но и электростатических взаимодействий между полимерными и липидными молекулами, зависящих от химического строения липида.

4. Изучены кинетические закономерности снижения межфазного натяжения в системах содержащих белки и белок липидные ассоциаты. Показано, что образование ассоциатов приводит к снижению времен релаксации межфазного натяжения на границе раздела вода/толуол.

5. Установлено, что максимальные значения двумерного давления Ю пленок, сформированных на поверхности водной субфазы, зависят от химического состава нанесенного ассоциатов. Введение в систему липидного компонента приводит к возрастанию этого параметра в 2-3 раза относительно индивидуальных белковых систем. Это может свидетельствовать о возникновении структур 2П пленки, способных к большей компенсации некомпенсированных межмолекулярных взаимодействий на границе раздела фаз вода/воздух.

6. Методами Ребиндера-Трапезникова и осциллирующей капли исследовано влияние липидного компонента на реологические свойства адсорбционных слоев глобулярных белков и желатина. Показано, что введение в систему липидов приводит к экстремальной зависимости реологических параметров межфазных адсорбционных слоев от количества ассоциированного липида.

7. Сформулированы закономерности влияния строения белка, а также образования ассоциациатов белок-липид на их эмульгирующую способность и устойчивость образующихся эмульсий первого и второго типа. Показано, что отличительная особенность стабилизации эмульсий белок-липидными ассоциатами состоит в сочетании двух различных тенденций: лиофилизации межфазной границы и экстремальной зависимости значений реологических параметров межфазных адсорбционных слоев от концентрации липида. Максимальные значения

эмульгирующей способности и устойчивости эмульсии достигаются при оптимальном соотношении этих параметров.

8. Систематизированы уже существующие знания по влиянию липидов на регулирование поверхностных свойств белков, предложены пути создания и использования новых ПАВ из получаемых природных источников пищевых компонентов без глубокой их переработки (химической модификации).

9. Предложен способ совершенствования технологий получения диагностических тест-систем, капсулирования биологически-активных веществ и создания защитных пленочных покрытий на поверхности мехового полуфабриката.

Список печатных работ, опубликованных в журналах ВАК:

. Ямпольская Г.П. Роль жидкокристаллического состояния в стабилизации симметричныхпленок./ Ямпольская Г.П., Левачев С.М., Измайлова В.Н. // Вестник МГУ, Серия 2, Химия, 1989, Т.ЗО, №1, с.110-117

:. Денисова Н.Е. Исследование взаимодействия защищенных формальдегидных дубителей с желатиной потенциометрическим методом/ Денисова Н.Е., Завлин П.М., Левачев С.М., Измайлова В.Н. // Журнал прикладной химии, №5, 1990, с.1099-1103.

. Денисова Н.Е. Поверхностные свойства желатины, модифицированной дубителями/ Денисова Н.Е., Завлин П.М., Левачев С.М., Измайлова В.Н. // Журнал прикладной химии, №5,1990, с.1104-1108.

. Рангелова Н.И Свободные черные пленки белков. Влияние кардиолипина/ Рангелова Н.И., Измайлова В.Н., Платиканов Д.Н., Ямпольская Г.П., Туловская З.Д., Левачев С.М.// Коллоидный журнал, 1992, Т.54, №3, с.133-136.

. Левачев С.М. Некоторые свойства ассоциатов бычьего сывороточного альбумина и липидов (лецитина, холестерина)/ Левачев С.М., Измайлова В.Н. // Коллоидный журнал, Т.56, №2, с.193-196.

. Левачев С.М Влияние додецилсульфата натрия на свойства межфазных адсорбционных слоев и двусторонних эмульсионных пленок желатины/ Левачев С.М., Тарасевич Б.Н., Зотова К.В., Поддубная О.Н. Измайлова В.Н., Деркач С.Р.//Коллоидый журнал 1997. Т.59. № 2. С. 174-177.

. Деркач С.Р Особенности поверхностных свойств систем вода-желатина-ПАВ. Стабилизация эмульсионных пленок/ Деркач С.Р., Измайлова В.Н., Тарасевич Б.Н., Зотова К.В., Левачев С.М. //Журнал научной и прикладной фотографии. 1997. Т.42. № 1. С.54-60.

. Фадеев A.C. Свойства монослоев коллагена, сформированных на границе фаз вода-воздух. Влияние pH и ионной силы субфазы/ Фадеев A.C., Левачев С.М.,

Ямпольская Г.П., Рудой В.М., Измайлова В.Н. //Коллоидный журнал, 1999, Т.61, №4, с.558-566.

9. Фадеев A.C. Мономолекулярные слои коллагена/ Фадеев A.C., Левачев С.М., Измайлова В.Н. //Вестник МГУ. Серия 2 - Химия, 1999, Т.40, №4, с.270-275.

10.. Левачев С.М. Влияние поверхностно-активных веществ на свойства межфазных адсорбционных слоев и эмульсионных пленок желатины, сформированных на границе водный раствор/масло/ Левачев С.М., Ямпольская Г.П., Тарасевич Б.Н// Журнал научной и прикладной фотографии. 2000. Т.45. № 5. С.6-77.

11.Деркач С.Р Развитие реологических методов для исследования тонких слоев/ Деркач С.Р., Левачев С.М., Измайлова В., Иванов Я. // Техническая мысль. 2000. Т.37. № 1-2. С.69-88. (Болгария).

12.Измайлова В.Н Свойства межфазных слоев в многокомпонентных системах, содержащих желатину/ Измайлова В.Н., Деркач С.Р.,Левачев С.М., Ямпольская Г.П., Туловская З.Д., Тарасевич Б.Н.// Коллоидный журнал. 2000. Т.62. № 6. С.725-748.

13.Левачев С.М Гелеобразование в системах, содержащих желатину/ Левачев С.М., Деркач С.Р., Туловская З.Д., Воронько Н.Г. //Журнал научной и прикладной фотографии. 2001. Т.46. № 4. С. 34-43.

14.Ямпольская Г.П. Мономолекулярные слои белков и перспективы конструирования наноматериалов на их основе/ Ямпольская Г.П., Левачев С.М., Харлов А.Е., Фадеев A.C., Измайлова В.Н. // Вестник Моск. ун-та. Серия 2 -Химия, 2001, Т.42. № 5, с. 355-362.

15.Измайлова В.Н. Двумерные реологические характеристики полидиметилсилоксана на границе двух несмешивающихся жидкостей/ Измайлова В.Н., Грицкова И.А., Левачев С.М., Булатова Т.В., Капустина A.A., Нусс П.В., Ямпольская Г.П.// ВМС, сер.А, 2001, №12, с.2123.

16.Измайлова В.Н, Гелеобразование в системах, содержащих желатину/ Измайлова В.Н, Ямпольская Г.П., Левачев С.М., Деркач С.Р., Туловская З.Д., Воронько Н.Г. // Журн. научн. и прикл. фотографии, 2001, Т.46, с.34.

17.Харлов А.Е. Роль химической модификации в управлении поверхностно-активными свойствами желатины/ Харлов А.Е., Магдасси III., Камыпшый А., Ямпольская Г.П., Левачев С.М., Измайлова В.Н. // Вестник Моск. ун-та. Серия 2 -Химия, 2002, Т.43. № 1, с. 38-43.

18.Измайлова В.Н.Взаимодействие желатины с цетилпиридиний хлоридом по данным *Н ЯМР высокого разрешения/ Измайлова В.Н., Деркач С.Р., Родин В.В., Ямпольская Г.П., Туловская З.Д., Левачев С.М. //Журнал научной и прикладной фотографии. 2002. Т. 47. № 1. С. 13-22.

19.Izmailova V.N.Rheological Characteristics of Adsorption Layers of Interpolymer Associates of Poly(dimethylsiloxane) and Bovine Serum Albumin at the Interface of Two Immiscible Liquids/ Izmailova V.N., Gritskova I.A., Levachev S.M., Bulativa T.V., Kapustina A.A., Nuss P.V., Yampolskay G.P. //Polimer Science;"A", 2002, V.44, №3, p.309.

:0.Измайлова В.Н . Саморганизованные структуры в межфазных слоях на жидких границах вода/масло в системах, содержащих желатину и а-(карбоксиэтил)-ю-(триметилсилокси) полидиметилсилоксан/ Измайлова В.Н., Левачев С.М., Грицкова И.А., Булатова Т.В., Харлов А.Е., Капустина A.A., Нусс П.В., Ямпольская Г.П. //Журн. научн. и прикл. фотогр., 2002, Т.47, № 1, с. 23-28. Измайлова В.Н Характеристика межфазных адсорбционных слоев интерполимерных ассоциатов желатины с полистиролом и сополимером стирола с метакриловой кислотой на границе вода/ксилол/ Измайлова В.Н., Левачев С.М., Грицкова И.А., Капустина A.A., Харлов А.Е., Нусс П.В., Ямпольская Г.П. // Журн. научн. и прикл. фотогр., 2002, Т.47, № 1, с.5-12.

З.Измайлова В.Н.Влияние дубителя (ЛИКИ-1) на реологические свойства межфазных адсорбционных слоев желатины на границе раздела водный растовр/ м- ксилол Измайлова В.Н., Левачев С.М., Сакварелидзе М.А., Харлов А.Е., Чезлов И.Г., Ямпольская Г.П., Рыбаков A.B. // Журн. научн. и прикл. фотогр., 2002, Т.47, № 1, с.29-35.

ІЗ.Харлов А.Е. Мономолекулярные слои желатины/ Харлов А.Е., Левачев С.М., Ямпольская Г.П., Измайлова В.Н. // Журн. научн. и прикл. фотогр., 2002, Т.47, № 1, с.36-43.

^4.Харлов А.Е Мономолекулярные слои желатины модифицированной защищенным формальдегидным дубителем ЛИКИ-1/ Харлов А.Е., Левачев С.М., Сакварелидзе М.А., Ямпольская Г.П., Измайлова В.Н. // Журн. научн. и прикл. фотогр., 2002, Т.47, № 1, с44-50.

:5. Деркач С.Р. Гидродинамические свойства макромолекул модифицированной желатины (по данным капиллярной вискозиметрии)/ Деркач С.Р., Дякина А.Е., Харлов А.Е., Коновалова И.Н., Левачев С.М., Измайлова В.Н. // Журн. научн. и прикл. фотогр., 2002, Т.47, № 1, с. 58-65.

.6. Измайлова В.Н Параметры мономолекулярных слоев химически модифицированных желатин/ Измайлова В.Н., Kamyshny А., Левачев С.М., Magdassi S., Харлов А.Е., Ямпольская Г.П. //Коллоида, журн., 2002, Т.64, №5, с.708.

:7.Измайлова В.Н., Устойчивость прямых эмульсий (масло / вода), стабилизированных желатиной/ Измайлова В.Н., Деркач С.Р., Левачев С.М., Ямпольская Г.П.., Туловская З.Д., Харлов А.Е., Дякина Т.А., Тарасевич Б.Н. //Журнал научной и прикладной фотографии, 2002, Т.47, №6, с. 45.

,8.Измайлова В.Н., Влияние молекулярно массового распределения желатин модифицированных дубителем ЛИКИ-1 на реологические параметры межфазных адсорбционных слоев на границе раздела 0,1% водный раствор желатины/метаксилол/ Измайлова В.Н., Сакварелидзе М.А., Левачев С.М., Ямпольская Г.П. // Инженерно-физический журнал, 2003, Т.76, №3, с. 76-81.

,9.Измайлова В.Н Свойства гелей желатины и их модификация/ Измайлова В.Н., Деркач С.Р., Сакварелидзе М.А., Левачев С.М. // Журнал научной и прикладной фотографии. 2003, Т.48, №4, с.65-86.

О.Фадеев А.С Свойства нанесенных монослоев коллагена I на поверхности водных растворов трет-бутанола и н-гексанола/ Фадеев A.C., Ямпольская Г.П.,

Рудой В.М., Левачев С.М., Измайлова В.Н. // Коллоидный журнал, 2003, Т.65., №4, с.543.

31. Сакварелидзе М.А Взаимодействия фотографических желатин с дубителями различных классов в объеме водной фазы Сакварелидзе М.А, Измайлова В.Н., Левачев С.М., Родин В.В., Ямпольская Г.П., Харлов А.Е., Нусс П.В., Чезлов И.Г. // Журнал прикладной химии, 2003, Выпуск 76, №7, с.1171-1180.

32.Измайлова В.Н.Реологические свойства межфазных адсорбционных слоев гидрофобизованных желатин/ Измайлова В.Н., Kamysyny А, Левачев С..М., Magdassi S., Харлов А.Е., Ямпольская Г.П. / // Коллоидный журнал, 2003, Т.65 №6, с. 117-118.

33.Измайлова В.Н., Гелеобразование в желатине и в многокомпонентных системах на ее основе / Измайлова В.Н., Деркач С.Р., Сакварелидзе М.А., Левачев С.М., Воронько Н.Г., Ямпольская Г.П. //Высокомолекулярные соединения. Серия С. Т. 46. № 12. 2004. С. 2216-2240

34.Дякина Т.А.Концентрированные эмульсии на основе смесей желатины с лецитином: реологические свойства/ Дякина Т.А., Деркач С.Р., Левачев С.М. // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. Т.45. № 1. 2004. С. 5863

35.Деркач С.Р., Перераспределение воды и желатины между контактирующими жидкими фазами по данным ИК-спектроскопии: роль лецитина/ Деркач С.Р., Дякина Т.А., Левачев С.М. // Коллоид, журн. 2005. Т. 67. № 5. С. 605-612.

36.Левачев С.М. Реологическое поведение концентрированных эмульсий, стабилизированных бычьим сывороточным альбумином в присутствии Твина80/ Левачев С.М., Харлов А.Е., Кукушкина А.Н., Новоселова Н.В., Матвеенко В.Н., Деркач С.Р. //Вестн. Моск. ун-та, серия Химия, 2006, Т. 47, №3, с.218-222.

37.Деркач С.Р., Неньютоновское поведение концентрированных эмульсий, стабилизированных глобулярным белком в присутствии неионного ПАВ/ Деркач С.Р., Левачев С.М., Кукушкина А.Н., Новоселова Н.В., Харлов А.Е., Матвеенко В.Н. //Коллоид, журн., 2006, Т.68, №6, с.769-776.

38.Левачева И.С. Роль сульфата аммония в регулировании структуры и свойств 2D пленок фуллерена С6о-/ Левачева И.С., Грицкова И.А., Лушов A.A., Пушкин А.Н., Левачев С.М.// Вестник МГУ, Серия Химия, Т.47, №5, 2006, с.253-257.

39.Левачева И.С Влияние электролитного состава субфазы на структуру 2D пленокфуллерена С6о- /Левачева И.С., Грицкова И.А., Лушов A.A., Пушкин А.Н., Левачев С.М.//Вестник МГУ, Серия Химия, Т.48, №1, 2007, с.171-178.

40.Derkatch S.R. Rheological properties of concentrated emulsions stabilized by globular protein in the presence of nonionic surfactant/ S.R. Derkatch,. Levachev S.M, A.N. Kuhkushkina, N.V. Novosyolova, A.E. Kharlov and V.N. Matveenko// Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2007, Volume 297, Issues 1-3, Pages 123-129.

41. Деркач C.P., Вязкоупругость концентрированных эмульсий, стабилизированных бычьим сывороточным альбумином в присутствии

неионогенного ПАВ/ Деркач С.Р., Левачев С.М., Кукушкина А.Н., Новосёлова Н.В., Харлов А.Е., Матвеенко В.Н. // Коллоидный журнал, 2007, Т. 69, №2, с.170-178.

.Кукушкина А.Н. Взаимодействие бычьего сывороточного альбумина с катионными поверхностно-активными веществами по данным флуоресценции/ Кукушкина А.Н., Деркач С.Р., Ужинов Б.М., Левачев С.М., Сакварелидзе М.А. // Известия КГТУ . 2008. № 13. С. 59-62

I .Грицкова И. А., Свойства тонких пленок латексов, модифицированных желатиной Грицкова И.А., Сакварелидзе М.А., Левачев С.М., Харлов А.Е., Макарова С.А. // Мир техники кино, 2008, №9, с 5-8.

к Фадеев A.C. Денатурация монослоев коллагена на границе раздела вода-воздух: моделирование процесса/ Фадеев A.C., Ямпольская Г.П., Левачев С.М., Зайцев С.Ю. // Биологические мембраны, 2008, Т.25, №2, с.142-154.

>. Макарова С.А.Влияние сульфата аммония на свойства 2D пленок, сформированных из полистирольных микросфер/ Макарова С.А., Левачева И.С., Грицкова И.А., Сакварелидзе М.А., Харлов А.Е., Левачев С.М. // Вестник МИТХТ, том IV, №1, 2009, с. 70-74.

j.Derkach S.R. Rheological Behavior of Interfacial Layers Stabilized by Gelatin with Lecithin/ S.R. Derkach,. Levachov S.M, T.A. Dyakina, L.A. Petrova //Progress in Colloid and Polymer Science, 2011,

ЛКедик C.A., Формирование ультратонких защитных пленок офтальмологического применения из водных растворов полимеров с таурином/ Кедик С.А., Левачев С.М., Панов A.B., Сакаева И.В., Харлов А.Е., Григорьева O.A. Жаворонок Е.С., Черта Ю.В., Зайцев М.А., Ха Кам Ань// Химико-фармацевтический журнал. Том 45,№4, 2011, с 49-52.

8./ Кедик С.А Разработка новых подходов к оценке эффективности глазных капель на основе их физико-химических характеристик/ Кедик С.А., Ярцев Е.И., Левачев С.М., Панов A.B., Сакаева И.В., Григорьева O.A., Жаворонок Е.С., Черта Ю.В., Зайцев М.А., Ха Кам Ань// Химико-фармацевтический журнал. Том 45,№3,2011, с 45-49.

9.Харлов А.Е., Закономерности взаимодействия бычьего сывороточного альбумина с дифильными молекулами/ Харлов А.Е., Анищук А.Н., Деркач С.Р., Левачев С.М. // Вестник Восточно-Сибирского государственного университета технологий и управления, 2012, № 3, Т. 38, с. 81-89.

Падгшсгно к печати ??. CH.i3-

Тираж 12.0 Заказ _JZ-

Отпечатано а отделе оперативной печати физического фа-культгга МПУ

Федеральное государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

СВОЙСТВА БЕЛОК-ЛИПИДНЫХ АССОЦИАТОВ В ЖИДКИХ ФАЗАХ И НА МЕЖФАЗНЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ

02.00.11 - Коллоидная химия и физико-химическая механика 02.00.06 -высокомолекулярные соединения

052О135ОШ

На правах рукописи

ЛЕВАЧЕВ СЕРГЕИ МИХАИЛОВИЧ

диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение 5

Глава 1. Обзор литературы 8

1.1. Строение липопротеиновых комплексов плазмы крови человека 8

] .2. Поверхностно-активные свойства белков и белок-липидных ассоциатов 23

1.3. Использование модифицированных белковых систем для создания

39

эмульсии

1.4. Свойства 20 пленок белков и липидов 61 Глава 2. Экспериментальная часть 77

2.1. Объекты исследования и используемые вещества 77

2.1.1. Белки и желатин 77

2.1.2. Лецитин и холестерин 78

2.2. Методы исследования 80

2.2.1. Метод квазиупругого рассеяния лазерного света 80

2.2.2. Метод Вильгельми 82

2.2.3. Метод инфракрасной спектроскопии 85

2.2.4. Измерение реологических параметров межфазных 90 адсорбционных слоев и двусторонних эмульсионных пленок

2.2.5. Определение реологических параметров концентрированных 93 эмульсий

2.2.6. Метод оптической микроскопии 96

2.2.7. Построение диаграмм стабильности эмульсий 96

2.2.8. Анализ седиментационной устойчивости эмульсий 100

2.2.9. Исследование свойств 2Б пленок 101

2.2.10. Исследование морфологии 2Б пленок методом 102 Брюстеровской микроскопии

2.2.11. Перенесение 2Б пленок на твердые подложки 104

2.2.12. Исследование морфологии перенесенных Ю пленок методом 104 атомно-силовой Микроскопии.

2.2.13. Метод эллипсометрии 106

2.2.14. Метод радиоактивных индикаторов 107

Глава 3. Результаты и их обсуждение 112

3.1. Свойства белок-липидных ассоциатов в объемах водной и 112

толуольной фаз.

3.1.1. Закономерности агрегации макромолекул белков в водной 113 фазе при образовании ассоциатов с липидами

3.1.2. Закономерности изменения размера рассеивающих частиц в 120 толуольных растворах липидов при солюбилизации белков и желатина

3.1.3. Взаимодействие лецитина с глобулярными белками и 122 желатином в объеме фазы

3.1.4. Транспорт молекул воды и белка через межфазную границу в 123 углеводородную фазу

3.1.5. Взаимодействие лецитина с молекулами воды и белка 136

3.1.6. Размер ассоциатов желатины с лецитином в контактирующих 140 жидких фазах

3.1.7. Размер частиц ассоциатов в объеме водной фазы. Влияние 143 концентрации лецитина

3.1.8. Изменение параметров конформационных переходов 147 макромолекул белков и желатины в водных растворах при образовании ассоциатов с липидами

3.1.9. Распределение белка между водной и толуольной фазами 148 3.2 Поверхностные свойства белок-липидных ассоциатов 159

3.2.1. Изотермы поверхностного натяжения растворов белков и 159 ассоциатов белк-липид

3.2.2. Изотермы двумерного давления 2D пленок, сформированных 165 из белков и белок липидных ассоциатов

3.2.3. Морфология 2D пленок белков и их ассоциатов с липидами 175

3.2.4. Адсорбция белков и белок-липидных ассоциатов на границе 180 раздела фаз вода/толуол.

3.2.5. Влияние лецитина на иммобилизацию БСА на поверхности 184 полистирольных микросфер

3.3. Реологические свойства адсорбционных слоев белков и их 187 ассоциатов с липидами

3.3.1. Сдвиговая реология адсорбционных слоев 187

3.3.2. Реологические свойства межфазных адсорбционных слоев и 188 эмульсионных пленок на границе вода/углеводород

3.3.3. Изучение свойств адсорбционных слоев, сформированных из белков и 197 белок-липидных ассоциатов методом осциллирующей капли

3.3.4. Влияние белок-липидных ассоциатов на устойчивость эмульсий 203

3.4. Реология эмульсий, стабилизированных белок-липидными 185 ассоциатами

3.5. Дисперсность эмульсий. Влияние концентрации лецитина 212

3.6. Седиментационная устойчивость 214

3.7. Реологические свойства концентрированных эмульсий 217

3.8. Практическое использование белок-липидных ассоциатов 230

3.8.1. Создание защитных пленочных покрытий на поверхности 230 мехового полуфабриката

3.8.2. Создание термоустойчивых капсул на основе белок- 232 липидных ассоциатов

3.8.3. Повышение агрегативной устойчивости темт-систем на 244 основе полистирольных микросфер

Заключение 250

Литература 254

Приложение 289

Приложение 1 290

Приложение 2 293

Введение

Работа является развитием коллоидной химии высокомолекулярных соединений, основы которой заложены в трудах П.А.Ребиндера и В.Н.Измайловой, особенно того ее раздела, в котором выяснялась взаимосвязь объемных и поверхностных свойств низко- и высокомолекулярных поверхностно-активных веществ (ПАВ).

Одной из актуальных проблем коллоидной химии белка является установление фундаментальных закономерностей, характеризующих особенности поведения нанодисперсных систем при их модификации. Это важно потому, что поверхностная активность и реологические свойства белков на границах раздела фаз лежат в основе получения устойчивых дисперсных систем. Особый интерес представляет модификация белковых макромолекул лигшдами, поскольку ассоциация этих природных веществ открывает возможность широкого варьирования их гидрофильпо-олеофильного соотношения, что позволит расширить область практического использования таких систем.

В данной работе исследовалась закономерности образования, взаимосвязь объемных и поверхностных свойств белок-липидных ассоциатов для создания физико-химической модели образования лиофильных нанодисперсных супрамолекулярных систем, основанных на белках различной природы (глобулярных, фибриллярных и гибкоцепных полипептидах) и полярных липидах (фосфатидилхолинах и холестерине). Цель работы

Комплексное изучение обьемных и поверхностных свойств белок-липидных ассоциатов с целыо создания методологии управления устойчивостью дисперсных систем, стабилизированных белок-липидными ассоциатами с широким спектром гидрофильно-олеофильного соотношения.

Научная новизна

Систематические исследования многофазных систем, содержащих белки различной природы (глобулярные, фибриллярные и гибкоцепной полипептид) и липиды (фосфотидилхолин и холестерин) позволили впервые дать комплексную оценку процессов образования белок-липидных ассоциатов, отличающихся от известных стехиометрических комплексов белок-ПАВ. Методами динамического светорассеяния, радиоактивных индикаторов, дифференциальной калориметрии и ИК-спектроскопии показано, что эги ассоциаты характеризуются широким распределением по размерам и соотношению компонентов.

Показано, что природа белковых макромолекул, а именно, содержание вторичных структур (а-спиралей, (3-складок и неупорядоченных участков), конформационное состояние макромолекул в целом, подвижность сегментов полимерных цепей, и липидов, отличающихся химическим составом полярной части и наличием сопряженных 7Г-структур в гидрофобной части определяют состав и свойства образующихся ассоциатов.

Установлена связь между образованием ассоциатов белок-липид, конформационным состоянием полимериой макромолекулы и термодинамическими характеристиками структурных переходов полипептидной цепи.

Проведено комплексное исследование кииетики изменения межфазного натяжения на границе водный раствор белка - толуольный раствор липида и показано, что степень его изменения зависит от природы белка. В отличие от стехиометрических комплексов белок-ПАВ, белок-липидные ассоциаты имеют переменный состав, достигающий стационарных значений при выдерживании системы во времени.

По изменению параметров изотерм 2Б пленок, сформированных из белок-липидных ассоциатов при варьировании природы белка и липида,

показано, что при увеличении двумерного давления потеря устойчивости 2D пленок может быть вызвана фазовыми переходами в смешанных слоях и изменением состава белок-липидных ассоциатов. Впервые определены реологические параметры межфазных адсорбционных слоев (MAC) белок-липидных ассоциатов методами Ребиндера-Трапезникова и осциллирующей капли и показано, что введение в систему липидов приводит к снижению значений реологических параметров MAC.

Впервые предложен новый подход к рассмотрению влияния процесса ассоциации белковых и липидных молекул на их эмульгирующую способность и устойчивость образующихся эмульсий. Он состоит в комплексной оценке изменения термодинамических характеристик MAC и реологических параметров структур, формируемых белок-липидными ассоциатами на границе раздела фаз.

Систематизированы уже имеющиеся знания в области образования белок-липидных ассоциатов и предложены новые подходы к управлению свойствами многофазных систем, содержащих белки и липиды различной природы.

Показаны перспективные пути создания и использования новых ПАВ с широко варьируемым гидрофильно-олеофильным соотношением из природных источников (белки и липиды). Практическая значимость

Разработана методология создания диагностических тест-систем, термоустойчивых капсул и формирования защитных пленочных покрытий на поверхности мехового полуфабриката на основе использования белок-липидных ассоциатов. Полученные в работе новые результаты по управлению коллоидно-химическими свойствами белковых систем послужили основой для расширения курса лекций по «Коллоидной химии» в МГУ имени М.В.Ломоносова, а также, курса лекций «Технология синтеза полимеров для медицины» в МИТХТ имени М.В.Ломоносова. Автор защищает:

• Результаты комплексного изучения обьемных свойств растворов белков и белок-липидных ассоциатов.

• Характеристические свойства белок-липидных ассоциатов и их отличия от традиционных белок-ПАВ комплексов.

• Влияние природы белка на строение и свойства белок-липидных ассоциатов.

• Кинетические закономерности изменения поверхностных свойств белков и белок-липидных ассоциатов в зависимости от их химического состава.

• Новые подходы к созданию эффективных высокомолекулярных ПАВ на основе белок-липидных ассоциатов.

• Результаты изучения свойств 20 пленок сформированных из белков и белок-липидных ассоциатов на границе водной субфазы.

• Закономерности влияния строения белка и белок-липидных ассоциатов на их эмульгирующую способность, устойчивость эмульсий и реологические свойства, полученных предельно концентрированных эмульсий.

• Новые подходы к созданию диагностических тест-систем, термоустойчивых капсул и формированию защитных пленочных покрытий на поверхности мехового полуфабриката.

1. Литературный обзор

1.1. Строение линонрогеиновых комплексов плазмы крови человека

Липопротеины представляют собой комплексы, состоящие из белков (аполипопротеинов; сокращенно— апо-ЛП) и липидов, связь между которыми осуществляется посредством гидрофобных и электростатических взаимодействий. Липопротеины являются лиофильными коллоидными системами, представляющие собой дисперсию в водной фазе (липопротеины плазмы крови, молока и др.) Функционирование живого организма не

возможно без транспорта липидов. Основная проблема в обеспечении эффективности этого процесса связанны с нерастворимостью липидов в воде. Этот вопрос и призваны решать липопротеиновые комплексы [1-15]. Липопротеипы имеют сложное строение и для их классификации используют несколько принципов, отвечающих основным физико-химическим особенностям строения и функционирования этих дисперсных систем, таких как: относительная плотность, определяющая скорости седиметации, электрофоретическая подвижность, а также, различия в апопротеиновом составе частиц.

Наибольшее распространение получила классификация, основанная на поведении отдельных липопротеинов в гравитационном поле в процессе ультрацентрифугирования. Варьируя градиент плотностей, можно изолировать отдельные фракции липопротеинов: хиломикроны (ХМ) -самые легкие частицы, затем липопротеипы очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеипы низкой плотности (ЛПНП) и липопротеипы высокой плотности (ЛПВП).

Различная электрофоретическая подвижность с глобулинами плазмы крови [16] положена в основу другой классификации ЛП, согласно которой различают ХМ (остаются на старте подобно у-глобулинам), (3-ЛП, пре-Р-ЛП и а-ЛП, занимающие положение [3-, аг и оь-глобулинов соответственно. Электрофоретическая подвижность фракций липопротеина, выделенных путем ультрацентрифугирования, соответствует подвижности отдельных глобулинов, поэтому иногда используют двойное их обозначение: ЛПОНП и пре-[3-ЛП, ЛПНП и |3-ЛП, ЛПВП и а-ЛП, рисунок 1. Изолированные различными методами липопротеипы не являются полностью идентичными, поэтому возникают сложности в интерпретации экспериментальных результатов, что требует внимательного отношения к используемой терминологии, учитывая методы выделения из биологических обьектов.

Рис. 1. Шлирен-профиль липопротеинов плазмы крови человека при аналитическом ультрацентрифугировании.

Представленная на рисунке 1 зависимость электрофоретической подвижность фракций липопротеинов от их плотности, выделенных путем ультрацентрифугирования, позволяет их разделить на четыре группы. Это разделение используется для классификации различных липопротеинов.

В настоящее время принято, что особое значение имеет функционирование липопротеинов высокой плотности, так как они обеспечивают возможность контроля за содержанием холестерина в тканях и органах. Они переносят холестерин в печень, далее он превращается в желчные кислоты, которые выделяются с желчью в кишечник [17-22]. Кроме того они являются важными компонентами живых организмов, выполняя многочисленные функции: входят в состав мембраны клеток (регулируют ее проницаемость и активность мембранных ферментов), являются предшественником биологически активных веществ (стероидных гормонов, витаминов группы Б и желчных кислот).

Количественные характеристики [23-25] различных классов липопротеинов представлены в таблицах 1-3. Размер частиц содержание белковой и липидной фракций и их химический состав изменяется в широком диапазоне значений. Общим свойством липопротеинов является их термодинамическая устойчивость в водной фазе.

Таблица 1

Состав липидов в липопротеинах плазмы крови человека.

Фракция липопротеинов Источник Диаметр молекулы, нм Плотность Скорость флотации Содержание белка, % Содержание липидов, %

Хиломикроны Кишечник - 100 -1000 <0,96 >400 -1-2 -98-99

Липопротеины очень низкой плотности, ЛПОНП, Печень и кишечник -30-90 - 0,96 -1,006 - 20 - 400 -7-10 - 90 - 93

Липопротеины средней плотности, ЛПСП, ЛПОНП и хиломикроны - 25 - 30 - 1,006- 1, 019 - 12-20 - И -89

Липопротеины низкой плотности, лпнп, ? -20-25 - 1,019- 1, 063 -2-12 -21 -79

Липопротеины высокой плотности, ЛПВП, ЛПВП2 ЛПОНП из печени и кишечника? - 10-20 ~ 1,063 - 1, 125 ~ ? -33 -67

Липопротеины высокой плотност и, ЛПВПЗ Хило-микропы? -7,5-10 - 1,125-1, 210 - ? -57 -43

Лльбумин-СЖК Жировая ткань ? > 1,280 - ? -99 - I

Таблица. 2.

Характеристики липидов в липопротеинах плазмы крови человека.

Фракция липопротеинов Содержание липидов, % Триацпл-глицерол, % от липидов Фосфо-липид, %от липидов Эфир холесте-рола, %от липидов Свободные жирные КИСЛО 1Ы, %OI липидов

Хиломикроны Кишечник ~ 100- 1000 <0,96 >400 -1-2

Липопротеины очень низкой плотности, лпонп, Печень и кишечник -30-90 - 0,96 -1,006 -20-400 -7-10

Липопротеины средней плотности, ЛПСП, ЛПОНП и хиломикроны -25-30 ~ 1,0061,019 - 12-20 - 11

Липопротеины низкой плотности, ЛПНГ1, 7 -20-25 - 1,0191,063 -2-12 -21

Линонро1еины ЛПОНП из ~ 1,063 -1,125

высокой плотности, печени и - 10-20 ~ ? -33

ЛПВП, ЛПВП 2 кишечника?

Липопротеины высокой плотности, лпвпз Хиломикроны? -7,5 - 10 - 1,125 -1,210 ~ ? -57

Альбумин-СЖК Жировая ткань ? > 1,280 ~ ? -99

Таблица. 3.

Состав белковой фракции (апобелки) в липопротеинах плазмы крови

человека.

Апобелки Ассоциация с липопротеинами Молекуляр-ная масса анобелка Функция, примечания

A-I ЛПВП, хиломикроны -28300 Активатор фермента лецитин: холестерол-апилтрансферазы (JIXAT)

A-I1 ЛПВП, хиломикроны - 17400 Образованы двумя идентичными мономерами, соединенными дисульфидпым мостиком

В-100 ЛПНП, ЛПОНП, ЛПСП -350000 Синтезируется в печени

В-4 8 Хиломикроны, остатки хиломикронов ~200000 Синтезируется в кишечнике

C-I ЛПОНП, ЛПВП -7000 Возможный актватор Л ХАТ

C-1I ЛПОНП, ЛПВП, хиломикроны - 8800 Актива юр внепеченочной липопротеинлипазы

C-III ЛПОНП, ЛПВП, хиломикроны -8750 Несколько полиморфных форм п зависимости oi содержания сиалопой кислоты

D Субфракция ЛПВП - 32500 Возможно, идентичен белку-переносчику эфиров холестерола

Е (богатый аргинином) ЛПОНП, ЛПВП, хиломикроны, ос гатки хиломикронов ~ 34000 Присутствует в избытке в Р-ЛПНОП у людей, страдающих гиперлипопротеинемией типа III. Это единственный апобелок, обнаруженный в ЛПВП животных, у которых с помощью специальной диеты была индуцирована гиперхолестеролемия

Аполипопротеины (апобелки, ano) входят в состав липопротеинов. Это один белок либо несколько белков, или полипептидов, которые на