Распределение сывороточного альбумина и его комплексов с сульфаниламидами в системе вода-межфазный адсорбционный слой-углеводород тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи УДК 541.182.02

АЛЕНТЬЕВ Александр Юрьевич

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА И ЕГО КОМПЛЕКСОВ С СУЛЬФАНИЛАМИДАМИ В СИСТЕМЕ ВОДА—МЕЖФАЗНЫЙ АДСОРБЦИОННЫЙ СЛОЙ—УГЛЕВОДОРОД

Специальность 02.00.11 — коллоидная химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва —1990

Работа выполнена на кафедре коллоидной химии Химического факультета МГУ

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор ИЗМАЙЛОВА В.Н.

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор химических наук, профессор ПОЛТОРАК О.М.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник ВЛОДАВЕЦ И.Н.

Московский институт тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится " «сентября, гээо г. в час. в ауд. 337 на заседании специализированно-

го совета Л 2 по химическим наукам (Д-053.05.56) при Мое -ковском государственном университете им. М.В.Ломоносова ( Москва, Г19899 ГСП, Ленинские горы, МГУ, Химический фа -культет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МТУ.

Автореферат разослан ■ ¿0* абгус/па 1990 г.

- , .. Ученый секретарь специализированного ученого совета

кандидат химических

В.Н.МАТВЕЕНКО

Актуальность теш. Для многофазных и многокомпонентных систем, состоящих из двух несмешиванцнхся жидкостей и поверхностно-активных веществ (ЛАВ) характерны сложные равновесия с тен -денцией к образованию лиофильных дисперсий со взаимными перехо -дами типа ассоциативных структур, микроэмульсий, яадних кристаллов и т.д. С этими переходами в значительной мере связаны стабилизация эмульсий, обращение фаз в них и переход ПАВ из одной фазы в другую и формирование межфазных слоев особой структуры и состава. В том случае, если в качестве ПАВ применять белки,то все указанные процессы можно использовать для моделирования биологических явлений, в частности для моделирования биомембран.

В данной работе была поставлена задача разработки нового варианта метода радиоактивных индикаторов (МРИ) с использованием сцинтиллирупцей фазы для изучения межфазных слоев ПАВ и исследования процессов перехода водорастворимых ПАВ в органическую фазу и на границу раздела фаз. Этот метод позволяет изучать систему водный раствор ПАВ - мекфазный слой - углеводород без нарушения целостности межфазных слоев z равновесия системы в отличие от отбора проб, или переноса меяфазной границы на твердую подложку. В качестве ПАВ были использованы водорастворимые белки - сывороточные альбумины человека (ЧСА) и быка (БСА). В связи с тем, что сывороточные альбумины обладают уникальными транспортными свойствами благодаря лабильности конформации молекулы и связывают ли-ганды различной природы, в работе изучено взаимодействие белков с рядом лекарственных веществ (сульфаниламидов), используемых на практике, и исследовано состояние межфазных границ для комплек -сов белок - лиганд. Образование комплексов белка с сульфаниламидами изучено калориметрическими методами - проточной микрокало -риметрией и дифференциальной сканирующей калориметрией. Явления, происходящие в системе вода-белок-сульфаниламид-углеводород изучены разработанным методом сцинтиллирунщей фазы (СФ).

Цель работы состояла в изучении закономерностей формирования межфазных слоев альбумина в системе водный раствор-углеводород и распределения белка мевду контактирующими фазами и межфазным слоем, а .также исследование влияния комплексообразования сульфаниламидов с альбумином в водной фазе на распределение белка в системе.

Научная новизна работы. Разработан и применен новый радиометрический метод исследования системы типа вода-ПАВ-углеводо -

род - метод "сцинтиллирующей фазы" (СФ), позволяющий одновре -менно наблюдать процессы накопления меченого ПАВ в межфазном слое и распределение ПАВ между водной и углеводородной фазами. С помощью этого метода показан переход альбуминов из водной фазы в углеводородную.

Сделан вывод о равновесности сформированных межфазных слоев белка с контактирующими фазами, а также показан сложный харак -тер кинетики образования мевфазных слоев, свидетельствующий о существовании многообразных переходных процессов, приводящих к равновесию. Обнаружено, что комплексообразование альбумина с сульфаниламидами промотирует переход белка в углеводородную фазу, причем отмечена корреляция полученных результатов с транс -портными свойствами альбумина.

Практическая ценность работа состоит в разработке нового метода исследования жидкофазных систем с ПАВ, который может применяться для анализа фазошх равновесий, исследования эмульсий, процессов экстракции, межфазного катализа и других процессов, протекавших на межфазных границах. Результаты, подученные в работе могут быть использованы специалистами в области фармакологии и токсикологии, биотехнологии, а также в исследованиях биомембран.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы докладывались на:

1) конференции молодых ученых Химического факультета МГУ, 1988 г.;

2) Всесоюзной конференции по ПАВ, Белгород, 1988 г.

По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Объем работы. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора. Экспериментальной части, Выводов, списка литературы и Приложений. Диссертация изложена на II2 стр. машино -писного текста, содержит 21 таблицу , 39 рисунков и список литературы из 125 наименований. ,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор состоит из двух глав.

В первой главе приведены данные по структуре молекулы альбумина, ее функциям, комплексообразованию альбумина с низкомолекулярными лигандами, в том числе и с сульфаниламидами.

Вторая глава посвящена обзору результатов исследований систам типа зода-бал оя-углеводород. В этой главе представлены данные по изотермам адсорбции,кинетике адсорбции,поверхностному и мезкфазному натяжениям,реологическим свойствам межфазных ело -ев.обсуждены результаты исследований структурных изменений мо -лекулы белков при адсорбции. Здесь же приведен обзор различных вариантов применения МРИ в изучении адсорбции ПАВ. Отмечается важность изучения поведения альбумина на жидких меяфазных границах при комплексообразовании с лекарственными веществами (суль -фаниламидами),а также необходимость разработки и использования новых методов для изучения явлений, происходящих в жидкофазных системах, содержащих ПАВ.

I. Объекты и методы исследования. Для экспериментов были использованы белки: ЧСА, выделенный из крови доноров Харьковской станции переливания крови и БСА Одайнского завода хшреактнвов. Меченные тритием БСА и ЧСА для работы методом радиоактивных индикаторов были синтезированы с помощью метода термической активации трития и очищены диализом и гель-фильтрацией на сефадексе 0-100.Был использован также ряд сульфаниламидов (препараты фирмы 5ЮПА,США):

I) Сульфадиазягн п ( 51)

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2) Сульфамеразин

( 5 2)

3) Сульфаметазин (он же сульфадимезин)

( 5 3)

4) Сульфадиметоксин

( 5 4)

Для поддержания постоянного рН водной фазы использовали буферные растворы на основе фосфатов (л'й/ДРС., и а/аа.ирйа ) фирмы SIG-NA , США и бидистиллированной воды.

В работе методом СФ применяли таете тритиевую воду, п-терфенил (синтезированный методом термической активации трития и очищенный хроматографически), сцинтиллиругацие растворы на основе бензола и толуола со сцинтиллируищими добавками 2,5-дифенилоксазола (РРО) и 1,4-ди-(5-фенил-2-оксазолил)бензола (РОРОР).

Для исследования термодинамики комплексообразования сульфаниламидов с альбумином были использованы методы проточной мшфокалориметрии (на калориметре типа 2107 (ЛКБ, Швеция) при t" = 37°С, рН=7,4 и двух значениях ионной силы раствора - 0,15 и 0,08 М) и дифференциальной сканирующей калориметрии (на сканирующем калориметре ДСК-1090 ("Допон", США) при рН=7,4 и ионной силе раствора - 0,15 1,1, в диапазоне температур -10 + 115°С со скоростью сканирования Ю°С/мин).

Эксперименты методем СФ проводили в стандартных стеклянных флаконах для сцинтшшщионного счета и растворов белка в диапазоне концентраций Ю-9 * Ю-3 Моль/л при рН=7,4, ионной силе раствора - 0,15 М и комнатной температуре ( f =22±2°С). Измерения радиоактивности проводили на жидкостно-сцинтилля -гщошшх счетчиках МАИС-2 и МАЕК-3 (США) в диапазоне регистри -руемых скоростей счета Ю3 * 10^ имп/мин.

В экспериментах с меченым БСА применяли СФ состава: 0,4% РРО и 0,02$ РОРОР в бензоле, в экспериментах с меченым ЧСА состав СФ был другим: 0,4% РРО в толуоле.

2. Термодинамика комплексообразования сулк&ашишмитов

с. ЧСА

2.1. Калориметрическое титрование с помощью проточной

цроточной микрокалориметрии позволяет 01феделить константы

связывания (К „) и тепловые эффекты ( д Н), а также рассчи -ьл

тать значения л б- и л S (табл.1). Термодинамические параметры комплексообразования практически не зависят от ионной силы раствора, что указывает на незначительную роль электро -статических взаимодействий в комплексе ЧСА-сульфаниламид. Величина теплового эффекта свидетельствует о доминирующем ха -рактере ван-дер-ваалъсовых и водородных связей в комплексе,

Таблица I

Термодинамические параметры ассоциации сульфаниламидов с ЧСА

Соединение Ионная сила раствора, М Константа связыва-- ния К* Ю"3лД1 ~лН, -дб, кДж/М А 5, ДжА1-к к

0,15 0,08 6,0±2,0 8,0±2,0 15,0±5,0 13,0*5,0 22,4*0,8 23,1*0,8 24,0*16,0 33,0*16,0 1.0

52 0,15 0,08 6,0±1,0 5,5±0,5 34,0±2,0 39,0±2,0 22,4*0,4 22,2*0,2 -37,0*6,0 -54,0*6,0 1.8

БЗ 0,15 0,08 2,0±0,6 6,0±0,8 34,0*2,0 24,0-2,0 19,6*0,6 22,4*0,3 -46,0*6,0 - 5,0*6,0 1.5

54 0,15 0,08 21,0-3,0 40,0±3,0 74,0±3,0 72,0±3,0 25,6*0,4 27,3*0,2 -156,0*10,0 -144,0*6,0 6,0

а величина л & _ о значительном вкладе гидрофобных взаимодействий. Ход изменения параметров в ряду сульфаниламидов свидетель -ствует о влиянии СН3-заместителей в гетероциклической части молекулы на процесс комплексообразования.

2.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) позволяет оценить конформационную подвижность молекулы комплекса по его термостабильности. Увеличение температуры денатурации комплекса по сравнению с температурой денатурации свободного белка ( д Т) указывает на увеличение термостабильности белка в комплексе (табл.1).

По-видимому, в результате связывания с сульфаниламидами конформационное состояние.молекулы белка в комплексе становится менее лабильным за счет стабилизации водородными связями в центре связывания, причем конформационная подвижность изученных мо -лекул уменьшается в ряду:

; ■ ЧСА У ЧСА + $ I > ЧСА + ¿> 3 > ЧСА + 5 2 ЧСА +54

Оба варианта калориметрических исследований показали, что в образовании комплекса значительную роль играют водородные

связи (с участием, по-видимому, гетероатомов в молекуле сульфаниламида) , приводящие к уменьшению конформационной подвижности молекулы белка в комплексе.

3. Радиометрический метод исследования межфазных границ двух неомешивамцихся жидкостей. В данной работе был разработан и применен новый вариант МРИ, названный методом "сцинтиллирую -щей фазы" (СФ). Аналоги этого метода имеются в литературе,однако ранее использовали специально сконструированный прибор и меченные углеродом ПАВ и ацетшшроизводных белков. Применение трития в качестве метки позволяет значительно уменьшить толщины экспериментально наблюдаемых межфазных слоев до нескольких микрон, а иная схема измерений позволяет проводить эксперименты на любых стандартных жидкоетно-сцинтилляционных счетчиках.

3.1. Принцип метода состоит в следующем: в органическую фазу добавляют поверхносгно-инактивный сцинтиллятор, на молекулах которого происходит высвечивание поглощенной энергии Р -излу --чения трития, регистрируемое фотоэлектронным умножителем (ФЭУ). В качестве органической фазы можно применять,в основном, ароматические углеводороды или смеси с ними. Тогда вся органическая фаза становится детектором излучения - "сцинтиллирующей фазой" (СФ).

Эксперимент проводили следующим образом: в стандартный стеклянный флакон для жидкостно-сцинтилляционного счетчика по -мещади определенный объем ( 5 мл ) водного раствора радиоактивного компонента, затем сверху приливали раствор сцинтиллятора в бензоле или толуоле и регистрировали на счетчиках изменения скорости счета импульсов света, вызванных торможением в СФ р -частиц трития.

Регистрируемая скорость счета ( и ) будет определяться, в основном, двумя слагаемыми:

У= + 3сср (I)

Гд0 у^ _ скорость счета, вызванная р -излучением, испускаемым с границы раздела фаз и из слоя водной фазы, расположенного под поверхностью раздела фаз, толщиной Я , равной пробегу р -частиц трития (Я. = I мкм ), и поглощенным в СФ; Зар -скорость счета, вызванная р -излучением, испускаемым и поглощаемым в СФ. '

Величину D'c.-p в определенных пределах значений объемов СФ можно связать с концентрацией меченого компонента в СФ ( ССф ):

Уыр = Ссср ■ Q.l/9 • V • £с>р (2)

где - удельная массовая радиоактивность компонента, V' -

объем СФ ; £ (\ф ~ эффективность регистрации уЗ -излучения в СФ, зависящая от V , причем эту зависимость можно определить в отдельных экспериментах. Тогда из выражений (I) и (2) получил:

%*>= ^/бар * Сс? ' -V (3)

Если отношение / Sctp практически не зависит от объема СФ, то в координатах zf /£С(р ( V ) зависимость (3) должна быть прямой линией, угол наклона которой определяет ССф, а отрезок, отсекаемый на оси ординат при V =0 дает значение ■Уз / ¿ Сср , связанное с содержанием меченого компонента в приповерхностном слое толщиной Я .

В случае, когда меченый компонент равномерно распределен в межфазном слое толщиной h , выражение для расчета приповерх -ностной концентрации компонента ( Cs ) можно представить в виде:

%С9> = У-h .S-Qj/9 • <*)

где У - обобщенный коэффициент регистрации, включающий геометрический коэффициент регистрации, а также поправки на рассеяние, самоослабление и изменение спектра fi -излучения; S - площадь поверхности контакта фаз; И. - толщина fi -источника. Величина

У зависит от Л и может быть определена экспериментально, или оценена для двух предельных случаев.

Для тонких межфазных'пленок ПАВ, когда k ¡i , в частности, цри монослойной адсорбции ПАВ, величина У определяется только геометрией измерений, т.е. У =0,5. Отсюда следует, что:

^/¿ср -0.5-S-r-avg (5)

где Г - значение адсорбции ПАВ. Выражение (5) можно использо -вать и в случае более толстых межфазных пленок для оценки минимального количества меченого компонента в пленке, отнесенного к единице поверхности,т.е. минимального сгущения массы ПАВ в пленке.

В случае толстых межфазных пленок ПАВ, т.е. при Л^Я ,или, что тоже самое, для меченых поверхностно-инактивных веществ, величина 1/ не превышает 0,27 - значения коэффициента регист -рации р -излучения из толстослойного fi -источника без учета поправки на сдвиг спектра Ji -излучения. Тогда

~ 0,21-Я- S-at/ff ■ Cs (6)

Для дальнейшей работы необходимо было экспериментально проверить правильность сделанных вше предположений.

3.2. Экспериментальная проверка применимости метода. Для работы по предложенной методике необходимо предварительно установить зависимость сер от объема СФ. Было измерено изменение скорости счета от объема СФ определенного количества меченого стандартного вещества, поверхностно-инактивного и нерастворимого в воде. В качестве такого вещества применяли меченный три -тием п-терфенил, синтезированный методом термической активации трития и очищенный хромато, рафически. По результатам эксперимента были построены зависимости £ир ( V ) для используемых счет -чкков и рецептур ,СФ, применяемые в дальнейшем анализе экспери -ментальных данных в рамках выражения (3).

Проверка предложенного метода была проведена в эксперимен -тах с тритиевой водой, в которых исследовали кинетику распределения тритиевой воды между фазами, определяли равновесную кон -центрацию воды в бензоле и толуоле и сопоставляли ее с литера -турными данными по растворимости воды в этих растворителях, а также по значениям ^s/£Сер находили коэффициент регистра -ции J5 .-излучения с поверхности раздела фаз для воды и сравнивали его с теоретическим значением ( У = 0,27).

Эксперименты с тритиевой водой показали, что скорость счета в СФ, вызванная переходом воды в углеводородную фазу, изме -няется в течение суток и сильно зависит от объема СФ. Выполне — ние зависимости (3) в широком интервале времени, отсчитываемого от начала контакта двух фаз, и для объемов СФ от 0,5 до 10 мл показывает справедливость предположения о малой зависимости

^ /Ес<р от У • Линеаризация зависимости Cf /¿сер ( V ) для условий равновесия (через сутки) согласно выражению (3) дает возможность оценить растворимость воды в органической фазе. Полученные значения растворимости воды совпадают со справочны-

ми данными в пределах ошибки эксперимента ( -5% ).

Оценка коэффициента регистрации £ -излучения с поверхности раздела фаз по выражению (4) показала, что У =0,030^0,005, что в пределах ошибки эксперимента совпадает с теоретическим значением У =0,27.

4. Изучение процессов массопереноса в системе водный * Раствор белка - межфазный слой - углеводород

Разработанный радиометрический метод позволяет изучать накопление ПАВ, в том числе и белка, вблизи границы раздела жидких фаз, а также процессы распределения меченых компонентов между жидкими фазами и межфазной пленкой как в кинетическом режиме,так и в равновесных условиях. Кроме того, линейность зависимости (3) может выполняться лишь для систем, находящихся в равновесии,или вблизи состояния равновесия, поэтому алализ в рамках выражения (3) позволяет оценивать равновесность системы и следить за от -«лонениями от состояния равновесия.

При проведении эксперимента в растворы немеченого белка добавляли аликвоты раствора меченого белка, затем в стеклянных флаконах на 5 мл раствора белка с меткой наслаивали СФ опреде -ленного объема и регистрировали изменение скорости счета СФ на счетчике.

4.1. Перекос бежа кз водной фазы в углеводородную и на границу раздела фаз осуществляется в течение длительного пе -риода времени - около двух суток. Кинетические зависимости скорости счета ( 3 ) от времени ( ± ) контакта жидких фаз имеют сложный вид (наблюдаются максимумы, минимумы, плато или пере -гибы, причем вид 1фивых аналогичен для ЕСА и ЧСА и зависит как от концентрации белка, так и от объема СФ). Кинетические кривые (рис.1) можно разделить на три участка, ограниченных временами -¿I и , соответствующими перегибам на кривых,и разли -чающихся по возможности анализа в рамках уравнения (3). На участке I при 0<± < скорость счета не подчиняется выра -жениго (3); на участке П при < ¿г спрямление зависимо -

сти 3 /Веер ( V ) не наблюдается, или достигается с большим разбросом и тангенсом угла наклона, близким к нулю; на участке Ш яри ti > tí скорость счета подчиняется уравнению (3). Значения ■¿"1 и Ьг представлены в табл. 2 и 3.

Рис.1. Кинетика изменения скорости счета ( :7 ) в процессе

перехода БОА из раствора концентрации 1,2"Ю-8 Моль/л в СФ различных объемов.

Объемы СФ: 0,5 мл (I,о ); I мл ( 2, х ); 2,5 мл (3,Д);

5 мл (4, о )

На участке I наблюдается увеличение скорости счета,по достижении времени кривые достигают максимума, или выходят на практически линейный участок П, прЭдставлявдий собой плато, или прямую с небольшим наклоном. На участке П на кривой З(-Ь) мо -хет также наблюдаться спад до достижения минимума при -Ь = ¿я • На участке Ш наблюдается медленное увеличение скорости счета вплоть до достижения постоянного значения через двое суток контакта фаз. Немонотонность кинетических кривых на участках I и П проявляется тем ярче, чем меньше объем СФ, что указывает на непосредственную связь изменений скорости счета в этот период времени с явлениями, происходящими на границе раздела фаз.

Допуская, что на участке I рост скорости счета обусловлен только адсорбцией белка на границе раздела фаз (в пользу данного предположения свидетельствуют близость хода кривых для раз -личных объемов СФ и неподчинение системы уравнению (3)), можно определить константу скорости адсорбции белка ( Аа ) (табл.2 и 3). Наклон зависимостей У /£Сф ( V ), отличный от нуля, указывает на появление белка в углеводородной фазе.

Предположив, что через ~Ь = 2 суток, когда дальнейших из -менений скорости счета не наблюдается, система водный раствор белка - межфазный слой - углеводород приходит к состоянию рав -новесия, можно вычислить значения равновесной концентрации белка в СФ (ССф) по выражению (3) и сгущения массы белка на меж -фазной границе (Г) по выражению (5). Из величин Г и С0 , где С0 - начальная концентрация белка в растворе, можно вы -числить величину равновесной концентрации белка в водном растворе ( Ср ) и коэффициента распределения белка между водной и углеводородной фазами ( Кр , где Кр = Сер / Ср ).

Величины Ср , Г и Кр также представлены в табл.2,3.

Известно, что сывороточные альбумины хорошо растворяются в воде и практически не растворяются в углеводородах (количест -венные данные по растворимости бежа в углеводородах отсутствуют). Это было проверено специальными опытами по извлечению БСА бензолом из тонкой пленки белка, нанесенной на поверхность стекла' методом лиофильной сушки. Коэффициент распределения в этом случае не превышал 0,000025. Высокие значения Кр в случае системы вода-белок-углеводород свидетельствуют о том, что переход белка в углеводородную фазу промотируется контактом жидких фаз,т.е. наличием воды в системе.

Таблица 2

Характеристики процессов перехода БСА из водного раствора в бензол и на границу раздела фаз

ср, М/л мин мин Аа . Кр Г. , мин М/м

1,1-ю-8 4.8-Ю"8 4.9-Ю-7 200 50 ' 30 700 200 50 0,026±0,006 0,069 4,8-Ю"8 0,028^0,002 0,023 1,8'Ю~7 0,030±0,003 0,011 1,9-Ю"6

, , Таблица 3 Характеристики процессов перехода ЧСА из водного раствора в толуол и на границу раздела фаз

Ср, М/л ¿i . мин £г> мин A a, ¡{р Г. мин МДг

2,2'Ю"8 7,7 "Ю-8 1,4'Ю-7 1,3'Ю"6 5,7'КГ6 120 80 60 15 3 10Л 300 200 ¿0 20 0,033t0,003 0,147 I,5*I0-7 0,022±0,008 0,062 7,3'КГ8 0,018^0,008 0,023 2,0'I0~7 0,034^0,005 0,028 1,2'Ю-6 0,032^0 ¿010 0,032 3,4-Ю-6

Специальными опытами с отбором проб из органической фазы показано, что на участке П кинетических щ>иыас в СФ обнаруживаются следы белка, а на третьем участке в СФ обнаруживается•бе -лок, концентрация которого совпадает с вычисленной по выражению (3). Таким образом, перенос белка из водной фазы в углеводородную и на границу раздела фаз является равновесным процессом по крайней мере через tj> é¿ контакта жидких фаз, причем,по-ви -димому, белок находится в обеих фазах в составе различных кинетических единиц, равновесных с межфазным слоем определенной структуры. Формированием этой структуры и определяется слож -ность кинетических кривых, а также и большие значения величин

КР и Г . Эти предположения были подтвервдены экспериментами по обратному переходу белка из углеводородной фазы в водную. ■

4.2. Перенос белка из углеводородной фазы в водную и на границу раздела фаз также является длительным и многоступенчатым процессом. Эксперименты по изучению этого процесса проводили следующим образом: над растворами меченого и немеченого БСА выдерживали в течение суток раствор сцинтиллятора в бензоле,затем ьо флаконы с дистиллированной водой ( 5 мл ) добавляли по I мл СФ, равновесной с водным раствором белка определенной концентрации, в СФ добавляли аликвоту органической фазы, равновесной о раствором меченого белка, и регистрировали изменения скорости счета СФ.

Кинетические кривые, полученные экспериментально, имеют характерную двухступенчатую форму (рис.2): кривая начинается рез -ким падением радиоактивности, что можно связать с быстрой ад -сорбцией БСА на границе раздела фаз, затем кривая выходит на плато и при t = t пд наблюдается перегиб, а после i = t начинается медленное, почти линейное падение регистрируемой • скорости счета.

Отбором проб показано, что радиоактивность в водной фазе не превышает фона, тогда как радиоактивность СФ примерно соответствует вычисленной при следующих допущениях: а) падение и вы -ход на плато наблюдается только за счет адсорбции БСА из СФ на границе раздела фаз; б) медленное падение z/ при f > г ^ происходит только за счет медленной диффузии БСА из адсорбционного слоя в водную фазу. В этом случае:

'Ji/л ~ ZJc<p I- Z?s ^

где у jjjj - скорость счета при / = ; УсФ ~ СКОРОСТЬ счета, определяемая БСА, распределенным в СФ; z/s - скорость счета, определяемая БСА, распределенным на границе раздела фаз. Учитывая, что падение скорости счета при перерасцределеоти белка из объема СФ на границу раздела фаз вызвано только изменением геометрического коэффициента регистрации излучения от I до 0,5, получим:

% * Усдо +2 3s ' (8)

где С/о - начальная радиоактивность, введенная в СФ.

Тогда из (7) и (8) следует, что

' 3- ¿о"' "«л/аду

7.5}

7,0

'Упл 6 5

О 100

±пл 500

1000

Рис.2. Кинетика изменения скорости счета ( С ) в процессе перехода БСА из СФ объемом I ил и концентрацией БСА 5,8'Ю-8 Моль/л в воду, не содержащую белка

Уз - Уо - У пл.

(9)

Поскольку Уз = 0,5 бс/р'^-Г-а^ ( см. (5)), можно получить выражение для вычисления адсорбции при £

Гпл ~ 2

У о - Улл

¿ср-^-ауу.

(Ю)

Полученные значения -6 дд и Г^ представлены в табл.4. По начальному участку кинетических кривых можно определить константы скорости адсорбции БСА из бензола на границу раздела фаз ( йа^ ),значения которых также представлены в табл.4. При £ » -Ьпл. изменения регистрируемой скорости счета будут, зависеть только от процесса переноса БСА с границы раздела фаз в . воду. Тогда установившийся поток белка через границу раздела фаз из СФ в воду ( у ), определяемый по наклону линейного участка кинетической кривой при »'¿пл., будет пропорциона -

лен величине Г„_ : пл

£ - йп ' гпл. (ii)

■ где кп - константа потока БСА с границы раздела фаз в воду, значения которой также представлены в табл. 4.

Таблица 4

Характеристики процессов перехода БСА из бензола в воду и на границу раздела фаз

,м/л tnAj мин Гпл, М/м2 j с<р Аа, мин-* Пп, мин-*

9,4-Ю"10 500 2,8'Ю"11 0,010 0,017

2,1-Ю"9 450 6,1'Ю"10 0,013 0,030

1,3'КГ8 450 3,4'Ю-9 0,013 0,017

5,8'Ю"6 400 1,2-Ю"8 0,013 0,029

Значение Со - начальной концентрации белка в СФ, было вычислено из известных концентраций белка в водном растворе, I над которым сформировали равновесную СФ, с помощью значений Нр , определенных ранее.

Двухстуленчатость полученных кинетических кривых свидетельствует о том, что белок,преаде чем перейти из СФ в воду,должен образовать определенную структуру на границе раздела фаз -меяфазный адсорбционный слой, равновесный с кинетическими . единицами, в составе которых находится белок в разных фазах. Близость величин fía. , ft-'a' и подчеркивает равно-

весный характер переходных процессов в системе водный раст-

вор белка - углеводород по крайней мере через время t >~Ь2 контакта жидких фаз. Однако, в целом, система характеризуется множеством переходных процессов, каждый из которых описывается собственными кинетическими параметрами.

Суммируя все факты, полученные цри изучении переходных процессов в системе.водный раствор белка - углеводород, можно предложить следующую схему процессов распределения белка в системе ( рис.3):

Рис.3. Схема переход-■ ных процессов в системе водный раствор белка - угле -водород

Белок в водном растворе может находиться в двух основных существенно различных состояниях: в составе кинетической единицы Ра до контакта с углеводородной фазой и в составе кинети -ческой единицы Рх после контакта с углеводородной фазой.

Р0 представляет собой обычные водорастворимые формы белка (мономеры, димеры и т.д.) с непосредственным контактом белок-белок. Рл представляет собой более крупный ассоциат гидро-фобизованных ("намасленных") глобул белка, солюбилизировавших углеводород. Такое предположение подтверждается и литературными данными по распределению размеров ассоциатов БСА до и после эмульгирования. Конформация глобул в /о и Р1 , по-видтажу, меняется несущественно, кроме того, денатурация белка выводила бы всю систему из состояния равновесия.

На границе раздела фаз белок также может существовать в двух основных состояниях: в составе закрепленной на границе раздела фаз кинетической единицы Р/ и в составе межфазной пленки Рг с характерным реологическим поведением.

В органической фазе белок находится в составе кинетиче -ской единицы Рз , причем можно считать, что Ро , Р0 , Р* , Рг и Р3 отличаются друг от друга лишь количеством связан -ных глобул и способом их связей, основным же структурным эле -ментом всех агрегатов является глобула белка. Тогда при прямом переходе из водной фазы в СФ на 1-м участке кинетической кривой

Ро'

Р/

■ &п I

е с9=>1 п.? ко. I

( рис. I, 2 ) будет происходить процесс адсорбции агрегатов Ра: Ро —P0S с константбй скорости Аа •

На П-м участке завершается процесс формирования межфазной пленки из адсорбированных агрегатов P0S : P0S—>- Р3 В результате этого перехода избыток белка с солюбилизированным углеводородом, может переходить в воду в составе агрегатов Pt или в СФ в составе . На этом этапе фактически происходит формирование межфазного слоя, представляющего собой фазу,состоящую из белка, углеводорода и воды.

На третьем участке все эти фазы приближаются к равновесному состоянию.

Зсли на этом этапе систему вывести из состояния равновесия, т.е. перенести насыщенную агрегатами Р3 СФ на подложку из чистой вода, то начнется процесс адсорбции Р5 на свободной границе раздела фаз, т.е. Р3 —> с константой адсорбции

fco?. Этот процесс завершается (см.рис.З) при t = t ^ образованием стабильной пленки : P3S —> Pz . Затем будет происходить медленный переход из Рг в воду агрегатов Pj о константой tin .

Все процессы, протекающие в системе, можно разделить на три группы:

1) адсорбция белка, шш закрепление агрегатов белка на свободной границе раздела фаз:

Рй ^ Р/; Р3 — Р/

2) фазовые переходы в межфазном слое:

— Рг } в5 --А

3) равновесие межфазного слоя с обеими макрофазами, характеризующееся распределением типа:

Рх ^ А Рз

Таким образом, при анализе процессов массопереноса в системе водный раствор белка - углеводород необходимо отметить равновесность системы в целом и многоступенчатость переходных процессов.

5. Изучение равновесного распределения ЧСА и комплексов ЧСА с сульфаниламидами в системе водный раствор белка - межфазный слой - углеводород

Равновесное распределение белка в системе вода-углеводо -род было определено следующим образом. По 5 мл растворов белка, содержащих меченый белок, вносили во флаконы для сцинтияля -ционного счета, затем в каждый флакон добавляли по I мл СФ и измеряли скорость счета в течение суток.

По достижении постоянного значения скорости счета в каждый флакон вносили еще по I мл СФ и повторяли всю операцию до тех пор, пока объем СФ не становился равным 5 мл. ■ Подученную сту -' пенчатую полную кривую зависимости скорости счета от времени обрабатывали по выражению (3) с использованием средних значе -ний скоростей счета для каждого из объемов СФ в области постоянных значений 'J . Таким же образом было определено рас -пределение в системе вода - углеводород ЧСА, связанного в комплекс с сульфаниламидами. Величину минимального сгущения массы белка (Г) оценивали с помощью выражения (5), величину ССф - с помощью выражения (3). Аналогично представленному выше рассчитывались значения Ср и Кр .

При Ср <1,5* Ю-7 М/л значения Г близки к литературным данным, при Ср >1,5'10~€ М/л значения Г превышают литературные данные в несколько раз, а при Ср ~3*Ю М/л (концентра -ция раствора, близкая к физиологической) различия достигают четырех порядков. Это связано, по-видимому, с различием структур межфазных слоев, сформированных на невозодщенной межфаз,-ной границе ( метод СФ), и межфазных слоев в случае эмульсий ( литературные данные для высоких Ср ).

Величина Кр практически не отличается для ЧСА и комплексов ЧСА с сульфаниламвдами, однако зависит от Ср . При Ср > > Ю-^ М/л значения Кр мало зависят от Ср и лежат в пределах 0,025 ¿ Кр ^ 0,045. При уменьшении СР величина Мр резко возрастает до ¡<p ~ 0,050 при Ср = 5-I0-S М/л, а в интервале Í0~I0< Ср < Ю-9 М/л /Ср близка к I.

Зависимости содержания ЧСА в органической фазе (С^ф) и сгущения массы ЧСА в межфазном слое от равновесной концентрации белка в водном растворе представлены на рис. 4 и 5 в

9' ! /и

-5

-6

т

- ж^-о ■ >1

-л» !

______I.

-8

Л

.гр

г

*р/0 •а

Рис.4. Зависимость сгущения массы белка в межфазной пленке (Г) от равновесной концентрации белка в водном растворе (Ср) для ЧСА и комплексов ЧСА с сульфаниламидами

» - данные для ЧСА к - данные для комплекса ЧСА + 5I д - данные для комплекс ЧСА + 52 о - данные для комплекса ЧСА + 53 о - данные для комплекса ЧСА + 54

--—---рассчитанная граница для плотно упакованного

монослоя глобул ЧСА в горизонтальной ориентации

------— рассчитанная граница для плотно упакованного

монослоя глобул ЧСА в вертикальной ориентации

Ф Сер ("/)

"7

-9'4

•10

£

х° Ъ

кУ

Ха,-4°

кУ

о

А

-9

-8

■1

-4

Рис.5. Зависимость концентрации белка в органической фазе (ССф) от равновесной концентрации белка в водном растворе (Ср) для ЧСА и комплексов ЧСА с сульфаниламидами

• - данные для ЧСА х - данные для комплекса ЧСА + 51 Л - данные для комплекса ЧСА + 52 □ - данные для комплекса ЧСА + ¿3 о - данные для комплекса ЧСА + 54

-----рассчитанная граница для плотно упакованного монослоя глобул ЧСА в гозизоктальной ориентации

------рассчитанная граница для плотно упакованного монослоя глобул ЧСА в верти -калькой ориентации

билографических координатах. Ход этих зависимостей близок как для ЧСА, так и для комплексов ЧСА с сульфаниламидами, Все щ>и-вые имеют плато в области концентраций, соответствующей по значениям адсорбции плотно упакованным монослоям сывороточного альбумина. .

По-видимому, в этой области концентраций (ТО""8-!«)-7 М/л) происходит изменение структуры межфазного слоя от характерной для адсорбционного слоя белка к структуре отдельной фазы сложного состава. При Ср> 10~7 М/л ярко проявляются отличия кривых для ЧСА от кривых для комплексов ЧСА с сульфаниламидами. Ха -рактерно, что при '10 М/л на кривых можно выделить

линейные участки, соответствующие степенным зависимостям ре -гистрируемых параметров от начальной концентрации ЧСА в вод -ном растворе. Так, для ЧСА

ССф = 0,015-Ср0'93

Г = 0,035-Ср0'76, для комплекса ЧСА с сульфадаазином (51)

ССф= 0,013-Ср0'90

Г = 0,032'Ср0'75 , для комплекса ЧСА с сульфамеразином ( S 2 )

ССф= 0,01ГСР0'88

Г = 0,044'Ср0'77 ,

для комплекса ЧСА о сульфаметазином (53)

ССФ= 0,010-Ср0'88

Г = 0,036'Ср0»77 , и для комплекса ЧСА с сульфадимэтоксином (54)

ССФ= 0,0I2.Cp0,S8

Г = 0,058'Ср0»79 .

Таким образом, как растворимость белка в СФ, так и.содержание белка в межфазном слое оказываются величинами, зависящими от процесса комплексообразования с сульфаниламидами.

Растворимость ЧСА и его комплексов с сульфаниламидами в СФ во всей исследованной области концентраций увеличивается в ряду:

ЧСА < ЧСА +51 < ЧСА + 5 3 < ЧСА + 5 2<ЧСА + Б4,

который соответствует ряду уменьшения конформационной подвиж -ности молекул белка в комплексе. По-видимому, способность белка образовывать кинетические единицы, переходящие в углеводо -род явно зависит как от гидрофобности ассоциатбв белка, так и от конформационной подвижности молекул белка в комплексе. Зависимость состава и структуры межфазного слоя, характеризуемого величиной Г, от этих факторов менее заметна.

ВЫВОДЫ

1. Методами проточной микрокалориметрии и дифференциальной сканирующей калориметрии получены термодинамические параметры комплексообразования сывороточного альбумина человека с рядом сульфаниламидов (константы комплексообразования - 2'10^-4'10^ л/Моль, л5 изменяется от -156 до +33 Дж/Моль'К,¿Н - от

-13 до -74 кДкЛЛоль, л О - от -19,6 до -27,3 кДж/Моль), показана связь этих параметров со структурой молекул сульфанил -амидов и зависимость конформационной подвижности молекулы белка в комплексе от природы лиганда.

2. Разработан и использован радиометрический метод иссле -дования систем типа вода-межфазный адсорбционный слой ПАВ-углеводород, названный методом "сцинтиллирупцей фазы" (СФ) и позволяющий одновременно наблвдать процессы накопления вещества в межфазном слое и в углеводородной фазе без неравновесного вмешательства в систему.

3. Показано, что кинетика формирования межфазных адсорб -ционных слоев белков имеет сложный характер, свидетельствующий о многообразии переходных процессов, приводящих к равновесию межфазного слоя с водной и углеводородной фазами. Обнару -жено, что переход белка в углеводородную фазу осуществляется только в условиях сформированного межфазного адсорбционного слоя.

4. Получены изотермы сгущения'массы белка на межфазной границе и растворимости белка в толуоле в широком интервале концентраций белка в водном растворе для ЧСА и комплексов ЧСА

с сульфаниламидами, вычислены константы распределения белка мезвду водной и углеводородной фазами.

5. Установлено, что комплексообразование ЧСА с сульфаниламидами в водных растворах промотирует переход белка в углеводородную фазу, причем увеличение растворимости белка в толуоле коррелирует с уменьшением конформационной подвижности молекулы белка в комплексе.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертация;

1. Алентьев А.Ю. Радиометрический метод исследования межфаз -ных слоев поверхностно-активных веществ на границах несме-шивавдихся жидкостей // Материалы Конф. мол. ученых хим. фак. МГУ. Москва. 26-28 янв. 1988. 4.2. МГУ.М. 1988. С.218 Деп. в ВИНИТИ 25.07.88. № 588I-B88

2. Алентьев А.Ю. Термодинамика взаимодействия сульфаниламидов с сывороточным альбуминов человека // Материалы Конф. мол. ученых хим.фак. МГУ. Москва. 26-28 янв. 1988. 4.2. МГУ. М. 1988. С. 183. Деп. в ВИНИТИ 25.07.88. № 588I-B88

3. Алентьев А.Ю., Филатов Э.С. Радиометрический метод изучения межфазной границы жидкость-жидкость в присутствии ПАВ.-

в сб.: Поверхностно-активные вещества и сырье для их производства. Тезисы докладов УП Всесоюзной конференции. НПО "Синтез ПАВ". Шебекино. 1988. Ч. П. С. 458.

Подл, в печ. 18.07.90г. Л-Ш65 'Тираж 100 экз. Заказ $ 2013 Централизованная типография ГА "Союзстройматериалов"