Влияние хлоридов щелочных металлов на распределение сывороточного альбумина в системе вода-межфазный адсорбционный слой-углеводород тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ОД

Химический факультет

На правах рукописи

ПЕЛЕХ ВАЛЕРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ВЛИЯНИЕ ХЛОРИДОВ ЩЕЛОЧНЫХ МЕТАЛЛОВ НА РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА В СИСТЕМЕ ВОДА - МЕЖФАЗНЫЙ АДСОРБЦИОННЫЙ СЛОЙ - УГЛЕВОДОРОД.

Специальность 02.00.11 - коллоидная химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

£

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре коллоидной химии Химического факультета

МГУ.

Научный руководитель - доктор химических наук,

профессор В.Н.Измайлова

Научные консультанты

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Г.П.Ямпольская кандидат химических наук, научный сотрудник А.Ю.Алентьев

Официальные оппоненты - доктор химических наук,

профессор А.Б.Зезин кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник И.Н.Влодавец

Ведущая организация

- Московская академия тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится

1996г. в/^Г час. в ауд. ./У

на заседании специализированного совета №2 по химическим наукам (Д-053.05.69) при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова (Москва, 119899 ГСП, Воробьевы горы, МГУ, Химический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета

МГУ.

Автореферат разослан

Ут^/^/^Д^ 1996г.

Ученый секретарь специализированного ученого

совета доктор химических наук

В.Н.Матвеенко

I. Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Важным объектом современной коллоидном химии являются межфазные слон белков, формирующиеся на границе раздела двух несмешивающихся жидкостей. Такие системы представляют значительней интерес в связи с задачами выяснения механизма высокоэффективной стабилизации эмульсий природными высокомолекулярными веществами, образования микроэмульспй и жидкокристаллических структур на границе раздела фаз, обращения фаз в системах. Применение белков в качестве ПАВ позволяет использовать такие системы для моделирования биологических процессов, связанных с функциональными особенностями белков.

К настоящему времени проведено много исследований формирования, структуры и свойств межфазных адсорбционных слоев (MAC) белков. Результаты этих работ трудно сопоставлять, так как исследования проводились в различных буферных системах с разной ионной силой. Вопрос о влиянии электролитов на процесс сгущения массы белка на границе жидких фаз систематически не изучался. Это необходимо для адекватного моделирования биологических систем и сопоставления с подобными системами, содержащими низкомолекулярные ПАВ, для которых влияние солей достаточно подробно исследовано.

При постановке исследования мы располагали результатами двух работ, в которых изучалось равновесное распределение белка между фазами (вода-углеводород) и межфазным слоем. Исследования проводились с помощью радиометрического метода сцинтиллирующей фазы, разработанного на кафедрах коллоидной химии и радиохимии химического факультета МГУ, позволяющего одновременно наблюдать процесс накопления вещества в межфазном слое и в углеводородной фазе без возмущающего вмешательства в систему. Этот метод был выбран нами для исследования распределения бычьего сывороточного альбумина (БСА) в системе водный раствор-межфазный адсорбционный слой-углеводород в присутствии хлоридов щелочных металлов - лития, натрия, калия, цезия, что является продолжением работ, проводимых на кафедре в течение ряда лег. Цель работы состояла в изучении динамики формирования межфазных адсорбционных слоев БСА в системе водный раствор-углеводород с использованием двух методов - по сгущению массы белка на межфазной границе (метод радиоактивных индикаторов) и по формированию структуры межфазного слоя (по

реологическим параметрам) и определении влияния солей на распределение белка между межфазным слоем и двумя макрофазами - водной и углеводородной.

На границе раздела фаз вода-углеводород белки образуют межфазные слои, характеризующиеся специфическим реологическим поведением. Одной из целей данной работы было исследование влияния хлоридов щелочных металлов па реологические параметры межфазных слоев БСА на границе жидких фаз. Научная новизна работы. Впервые систематически изучено влияние электролитов на распределение белка в системе водный раствор - межфазный адсорбционный слой -углеводород. Определены коэффициенты распределения БСА в системе в присутствии солей. Проведено исследование влияния хлоридов щелочных металлов на динамику формирования и реологические характеристики межфазного адсорбционного слоя. Получены ряды эффективности влияния солей на распределение БСА в системе и реологические характеристики MAC белка. Практическая ценность работы. Полученные закономерности влияния электролитов на свойства межфазных адсорбционных слоев белков на жидких границах раздела фаз могут служить основой для регулирования устойчивости эмульсионных систем и моделирования биологических процессов в природных системах. Результаты, полученные в работе, могут быть использованы специалистами в области фармакологии и биотехнологии, при исследовании биомембран.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на:

1) Ломоносовских чтениях химического факультета МГУ (апрель 1994г.);

2) Конференции "Коллоидная химия в странах СНГ" (г.Москва, июнь 1994г.);

3) Научной сессии секции Физико-химии поверхностно-активных веществ Научного Совета РАН по коллоидной химии и физико-химической механике (г.С.-Петербург, апрель 1995г.);

4) Семинарах лаборатории коллоидной химии кафедры коллоидной химии химического факультета МГУ;

5) Международном Симпозиуме "ПАВ в растворах" (г. Иерусалим, Израиль, июнь 1996г.);

6) Международной Конференции "Поверхностные силы" (г. Москва, июнь 1996г.);

7) Конференции "Поверхностно-активные вещества и сырье для их производства" (г.Белгород, сентябрь 1996г.) ;

8) Симпозиуме по реологии (г. Карачарово, октябрь 1996г.).

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов, списка литературы и Приложений. Диссертация изложена на 158 стр. машинописного текста с 77 рисунками, 29 таблицами и 2 приложениями. Список литературы содержит 161 наименование.

В литературном обзоре (глава II) приведены данные по структуре молекулы альбумина, ее функциям, рассмотрены результаты исследований процессов адсорбции сывороточного альбумина на жидких границах раздела фаз, представлены результаты реологических испытаний MAC БСА, а также единичных исследований влияния электролитов на свойства белковых межфазных адсорбционных слоев.

В экспериментальной части (глава III) описаны использованные в работе методики, представлены результаты исследования влияния хлоридов щелочных металлов на распределение бычьего сывороточного альбумина в системе водный раствор белка - межфазный адсорбционный слой - углеводород, на динамику образования и реологические свойства межфазных адсорбционных слоев белка на границе жидких фаз.

В главе IV приведены и обсуждены результаты, полученные при изучении системы радиометрическим методом и при измерении реологических параметров MAC БСА.

II. Содержание работы.

I. Объекты и методы исследования. В работе использован бычий сывороточный альбумин Олайнского завода химреактивов (марка Б). Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было показано, что препарат на 82% состоит из мономерного белка с молекулярной массой 67000. Основная примесь в препарате представлена димером белка.

Исследовалось влияние следующих солей: LiCl, NaCl, KCI, CsCl марки ХЧ.

Меченые соединения (БСА, п-терфенил) были синтезированы методом термической активации трития с использованием газообразного трития Т2 ("Изотоп").

В работе использован также п-терфеннл (ЧДА) (CfjHs^CgH,).

Для приготовления сцинтилляционных растворов применяли толуол сциитилляционный, диоксан сцинтилляционный, РРО (2,5-дифенилоксазол) (ЧДА).

При исследовании реологических параметров межфазного адсорбционного слоя в качестве органической фазы использовали толуол сцинтилляционный.

Растворы готовили на основе бидистиллированной воды.

Эксперименты с использованием радиометрического метода сцинтиллирующей фазы проводили в стандартных стеклянных флаконах для сцинтилляционного счета при комнатной температуре (t = 22±2°С). Измерение радиоактивности проводили на жндкостно-сцинтилляционном счетчике MARK-2 (США) в диапазоне регистрируемых скоростей счета 103 - 105 имп/мин.

В работе исследованы системы с содержанием БСА от 5,3-)0"'°М до 6,3'10"5М; концентрации солей варьировали в диапазоне 0-1,2М. Всего исследовано более 300 систем.

Реологические параметры MAC БСА изучались на приборе Ребиндера -Трапезникова методом закручивания диска при постоянной скорости деформирования (метод co=const).

2. Влияние хлоридов щелочных металлов на процессы массопереноса в системе водный раствор БСА - межфазный адсопбнионный слой - толуол. 2.1. Кинетика формирования MAC БСА в присутствии хлоридов щелочных металлов. На рис. 1 показаны типичные кривые накопления белка в межфазном слое во времени в координатах I = f(x), где /(имп/мин) - скорость счета импульсов, пропорциональная сгущению массы белка на границе раздела фаз (Г,) в момент времени т для начальных моментов времени. Такого вида кривые были получены для всех исследованных систем. Все кривые однотипны, без перегибов, достигают насыщения в среднем за двое суток при постоянном объеме углеводородной фазы.

В координатах In [Ге/(Ге - Г,)] - т кинетическая зависимость процесса сгущения массы Г = f(x) описывается уравнением прямой линии: In 1(Ге - Г, )/Ге] = -ка . т (1),

где Ге - равновесное значение содержания белка на единицу поверхности в межфазном слое, Г, - содержание белка в межфазном слое в момент времени т, ка -константа скорости адсорбции белка на межфазной границе.

Правомерность использования уравнения (1) для исследованных систем связана с тем, что в начальные моменты времени изменение скорости счета обусловлено сгущением массы белка в межфазном слое. Влияние хлоридов щелочных металлов на кинетику перехода белка из водной фазы в MAC было

/, имп/мин

Рис. 1. Зависимость скорости счета импульсов (/) от времени (т) в системе водный раствор БСЛ-толуол в присутствии хлорида калия: 1 - ОМ, 2 -0,5М, 3 - 0,2М. Концентрация БСД в водной фазе 2,1-108М, объем углеводородной фазы 2мл, Ь = 22°С (скорость счета пропорциональна сгущению массы БСА).

-8

изучено для начальной концентрации белка в водной фазе 2,1-10" М. При такой концентрации БСА количество белка в MAC не противоречит модели плотного монослойиого заполнения межфазной границы.

Используя экспериментально измеряемые вел1гчины - скорости счета импульсов - уравнение (1) можно привести к виду:

In [(есф(у=2) ' ¡о' Л)/(есф(у=2) " /о)! = -кэф ' т (2),

где /, - скорость счета импульсов в момент времени т, есф(у=2) - эффективность регистрации р-излучения в углеводородной фазе объемом 2мл, /o=/s/ec<f> ('s -скорость счета, вызванная р-излучением, испускаемым с границы раздела фаз) вычисляется путем экстраполирования зависимости I/бсф от объема органической фазы V к нулевому объему органической фазы, кэф - эффективная константа скорости сгущения массы БСА на границе раздела фаз. Эффективность регистрации излучения 8сф определяется в отдельном эксперименте.

Массивы зависимостей / = f(V, т) обрабатывались в координатах уравнения (2) методом наименьших квадратов. Таким образом были определены эффективные константы скорости накопления белка в межфазном слое (к^), отражающие совокупность процессов, происходящих в системе вода-углеводород-белок-соль.

Эффективные кинетические константы для исследованных систем приведены в табл.1 и на рис.2. Средняя ошибка для кэф составляет 27%.

Влияние хлоридов щелочных металлов на кэф сводится к следующему. В отсутствие солей кэф равно 6,0-КНс"1, что хорошо совпадает с литературными данными. Добавки №С1 практически не влияли на кэф во всем диапазоне изученных концентраций соли. При содержании КС1 > 0,01 М кЭф снижается почти вдвое. В случае добавок ЫС1 и СзС1 зависимость кэф от концентрации соли носит сложный характер: минимальное значение кэф для хлористого цезия составляет 2,3-10"'1с"1 при

Таблица 1.

Константы скорости сгущения массы БСА на границе водный раствор белка - толуол в присутствии хлоридов щелочных металлов. Начальная концентрация БСА в водной фазе - 2,1-10'8М, I = 22°С.

СМеС1.М 0 0,01 0,05 0,1 0,2 0,3 0,5 1,0

СОЛЬ кэф'Ю4, с1

ис1 6,0 8,5 9,0 6,2 6,0 4,0 5,3 5,0

№С1 6,0 6,8 7,2 6,7 6,7 5,5 6,7 6,7

КС1 6,0 4,0 3,7 5,0 2,7 3,2 3,5 3,3

СБС! 6,0 6,3 3,5 2,3 5,5 5,0 3,8 4,7

бса к^ на межфазной границе в системе вода-толуол. сбса = 2,1-10"8м, ь = 22°с. На диаграмме указана концентрация электролита (М).

0,1 М концентрации соли; соответствующая величина для хлорида лития составляет 4,0-КИс'1 при концентрации соли 0,ЗМ. При малых добавках 1ЛС1, не превышающих 0,05М, кэф возрастает в 1,5 раза по сравнению с кэф в отсутствие электролита. Несмотря на сложное влияние электролита на кэф, при высоких концентрациях солей кэф становится не зависящим от концентрации электролита. Однако, эта пороговая концентрация электролита зависит от природы катиона и специфичности его влияния на совокупность межмолекулярных взаимодействий в системе. Так, в случае №С1 нулевой порядок скорости выполняется практ!гчески во всем изученном интервале концентраций (10"2-1,2М). В случае КС1 и СбС! скорость адсорбции не зависит от концентрации электролита при с > 0,2М, а для иС1 - при с > 0,ЗМ.

2.2. Сгущение массы белка на межфазной границе и концентрация ВСЛ в углеводородной фазе. Использованный метод радиоактивных индикаторов позволил по значениям скоростей счета импульсов в исследованных системах, находящихся в состоянии равновесия, рассчитать сгущение массы белка на межфазной границе Г и концентрацию белка в углеводородной фазе ссф. Средняя ошибка измерений составляла 11% для Г и 14% для ссф.

На рисунках За и 36 представлены относительные изменения сгущения массы белка в межфазном адсорбционном слое Гот„ (Готн = Г/Г0, где Г - сгущение массы белка в присутствии электролитов, Г0 - сгущение массы белка в тех же условиях в отсутствие электролитов) и концентрации БСА в органической фазе ссф°™ <ссф°™ = ссф/ссф°, где ссф - концентрация белка в органической фазе в присутствии электролитов, ссф° - без электролита в тех же условиях) по сравнению с системой без соли в зависимости от концентрации и вида электролита для начальной концентрации белка 2,1-10"8М. Аналогичного вида кривые получены для всех исследованных концентрации белка.

Все зависимости носят сложный характер, с экстремумами в области концентрации электролитов 0,1 - 0,ЗМ (в случае хлорида натрия эти концентрации соответствуют физиологическим значениям). При повышении содержания соли выше 0,5 - 0,7М зависимости выходят на плато, где Гот„ и ссф°™ зависят только от природы катиона.

Рис. За. Зависимость относительного изменения сгущения массы БСА (Готн) на границе водный раствор белка-толуол от концентрации электролитов (смеа): 1 -LiCl, 2 - NaCl, 3 - KCl, 4 - CsCl. Начальная концентрация белка в водной фазе -2,1-10"8М, t = 22°С (Готн = Г/Г0, где Г(моль/м2) - сгущение массы белка в присутствии электролитов, Го(моль/м2) - сгущение массы белка в тех же условиях в

Рис. 36. Зависимость относительного изменения концентрации БСА в толуоле (ссф°™) в системе водный раствор белка-толуол от концентрации электролитов (cMeCl); 1 " LiCl, 2 - KCl, 3 - CsCl, 4 - NaCl. Начальная концентрация белка в водной фазе - 2,1-10"8М, t = 22°С (ссфотн = ссф /ссф°, где ссф(М) - концентрация белка в органической фазе в присутствии электролитов, ссф°(М) - без электролита в тех же условиях).

Все хлориды щелочных металлов в широком области концентрации повышают содержание белка в межфазном адсорбционном слое. Рассмотрим влияние солей на Готн пр11 больших концентрациях электролитов (выше 0,5 - 0,7М), когда сгущение массы БСА в MAC перестает зависеть от количества добавляемой соли. Па рис. эти данные представлены п виде диаграммы для разных областей концентраций белка: области разреженной монослойиой адсорбции I, области образования плотного межфазного адсорбционного слоя II, области полислойной адсорбции III. В области III высоких концентраций БСА влияние солей различно для с0 < 3,2-10'6М (в дальнейшем обозначаем область Ша) и для со > 3,2-10'бМ (в дальнейшем обозначаем область II16).

Зависимость Готн от природы катиона наиболее ярко проявляется при низких начальных концентрациях белка (область 1). Наибольший эффект наблюдается в случае хлорида калия - содержание белка в MAC повышается практически в 2 раза. При высоких концентрациях белка Готн увел1гчивается приблизительно в 1,5 раза независимо от типа катиона (рис.4). Следует отметить, что наименьшее повышение Гот„ наблюдалось для всех солей при концентрациях белка, отвечающих областям II и II 1а.

Зависимости ссфотн от концентрации солей также носят сложный характер. При концентрациях солей 0,1 - 0,ЗМ наблюдаются экстремумы: минимумы для всех изученных систем за исключением добавок хлорида калия при малых концентрациях белка (область I). В этом случае наблюдались максимумы на кривых ссф°™ (сщеа)-Начиная с концентрации солей 0,5 - 0,7М зависимости выходят на плато, так же как и зависимости Готн от концентрации соли. Обращает на себя внимание тот факт, что введение соли в систему, как правило, приводит к снижению перехода белка в углеводород (рис.5). Хлорид натрия в наименьшей степени влияет на величину концентрации белка в органической фазе.

При малых концентрациях БСА (область I) обнаруживается специфика воздействия на систему ионов калия и цезия, заключающаяся в увеличении содержания белка не только в межфазном слое, но и в углеводородной фазе. В случае хлорида цезия этот эффект обнаружен при концентрации БСА < 10"ЭМ. Возможно, это происходит из-за снижения гидратации и сильной гидрофобизации молекулы БСА, приводящей к усилению ассоциации белка в водной фазе и

■ отн

2.0 г

Ыа

Се

1.5 ■

1.0

0.5 ■

0.0 ----------------

I II ШаШб I II ШаШб I II ШаШб I II ШаШб

Рис. 4. Влияние солей на относительное изменение сгущения массы БСА в межфазном адсорбционном слое (Готн) при больших концентрациях электролитов (выше 0,5 - 0,7М), когда Г не зависит от концентрации соли. I, II, III - области концентраций БСА: разреженной монослойной адсорбции, образования плотного адсорбционного слоя и полислойной адсорбции соответственно.

отн

С + + + +

у Ма К Се

1.5- _

1.0

0.5 -

0.0 I________________

I II ШаШб I II ШаШб I II ШаШб I II ШаШб

Рис. 5. Влияние солей на относительное изменение концентрации БСА в толуоле

(ссфотн) при больших концентрациях электролитов (выше 0,5 - 0,7М), когда

концентрация белка в толуоле не зависит от концентрации соли. I, II, III - области

концентраций БСА: разреженной монослойной адсорбции, образования плотного

адсорбционного слоя и полислойной адсорбции соответственно.

солюбилизацни углеводорода. Достигаемое в этом случае наибольшее изменение гидрофильно - липофилыюго баланса поверхности глобулы белка приводит к увеличению концентрации БСА в углеводородной фазе и в MAC. В этом случае наблюдается наибольшее обеднение водной фазы белком.

При переходе от области I к областям II и Ша (по концентрации белка) содержание БСА в органической фазе по сравнению с системой без соли заметно снижается. Так же, как и для сгущения массы белка в MAC, содержание БСА в органической фазе в области Шб практически не зависит от типа соли и составляет около 70% от соответствующей величины в системе без добавок солей.

На диаграммах, представленных на рис. 4 и 5, можно видеть монотонное изменение Готн и ссфоти до образования полимолекулярного слоя и нарушение монотонности в области Шб. В этой области сгущение массы белка в MAC и концентрация БСА в органической фазе перестают зависеть от природы катиона к зависят только от ионной силы раствора.

Практически для всех исследованных систем при высоких концентрациях солей сгущение массы БСА в MAC и концентрация белка в углеводородной фазе не зависят от концентрации электролита, хотя содержание белка в MAC по сравнению с системой без соли остается повышенным, а в углеводороде - пониженным.

Действие солей, в целом, реализуется как сдвиг равновесия по содержанию белка в сторону межфазного слоя по сравнению с оргашгческой фазой.

Для того, чтобы перейти к термодинамическому рассмотрению изучаемых систем, было необходимо далее исследовать зависимости сгущения массы БСА в MAC и концентрации белка в органической фазе от равновесной концентрации БСА в водной фазе ср в присутствии электролитов.

2.3. Кол)гчественное описание перехода белка в межфазный слой и углеводородную фазу. Влияние солей. На рис. 6-7 представлены зависимости концентрации белка в углеводородной фазе ссф и сгущения массы белка на межфазной границе Г от равновесной концентрации БСА в водной фазе ср в билогарифмических координатах для системы, содержащей хлорид натрия, для двух концентраций солей: 0,2М (область концентраций соли, где наблюдаются экстремумы на кривых зависимостей Готн и ссфоти от концентрации электролита) и 1М (область, где Г и ссф не зависят от концентрации соли). На тех же рисунках для сравнения приведены соответствующие

Ig Г (моль/м )

Рис. 6. Зависимость сгущения массы БСА на межфазной границе (Г) от равновесной концентрации белка в водном растворе (ср) в системах, не содержащих солей (1) и содержащих NaCl: 0,2М (2) и 1,0М (3). Вертикальными и

горизонтальными линиями указаны пределы

монослойной адсорбции глобул альбумина в различных ориентациях: штрих-пунктирными - для системы без электролитов, сплошными - для системы с добавлением 0,2М NaCl, пунктирными - для системы с добавлением IM NaCl. I, II, Illa и Шб-области концентраций БСА(см. 2.2.).

lg CD(M)

lg ссфМ) „ рис. 7. Зависимость

содержания БСА в толуоле (ссф) от равновесной концентрации белка в водном растворе (ср) в системах, не содержащих солей (3) и содержащих NaCl: 0,2М (1) и 1,0М (2). Вертикальными и горизонтальными линиями указаны пределы монослойной адсорбции глобул альбумина в различных ориентациях: штрих-пунктирными - для системы без электролитов, сплошными - для системы с добавлением 0,2М NaCl, пунктирными - для системы с добавлением IM NaCl.

I, II, Illa и Шб-области концентраций БСА (см. 2.2.).

изотермы для системы, не содержащей электролитов. Горизонтальными и вертикальными линиями выделены три области, соответствующие различной степени заполнения MAC белком. Аналогичного вида кривые построены для систем, содержащих хлориды лития, калия и цезия.

Кривые lgr (lgCp) и lgccfj, (lgCp) имеют два прямолинейных участка и промежуточную, переходную область. Эта область совпадает с областью II для систем без добавления электролитов и с областями II и Illa (приблизительно до ср= 3-10 GM) для систем с добавками хлоридов лития, натрия, калия и цезия.

В работе дано аналитическое описание линейных участков изотерм. Коэффициент корреляции составил не менее 0,96.

В области I в системах, не содержащих солей и содержащих хлориды литня и натрия, сгущение массы белка в MAC прямо пропорционально зависит от равновесной концентрации БСА в водном растворе, поскольку показатель степени п в выражении Г = А • срп близок к единице (линейная область I совпадает с областью Генри). Для систем, содержащих хлориды калия и цезия, область Генри находится за пределами чувствительности метода.

Для всех систем в данной области концентраций белка (исключая системы с добавками хлорида калия) выполняется соотношение ссф - ср0'8. В случае хлорида калия показатель степени данной зависимости уменьшается до 0,4.

Следует отметить, что несмотря на то, что БСА хорошо растворим в воде и практически не растворяется в углеводороде, в исследованных системах количество белка в органической фазе велико. Переход белка в углеводородную фазу промотируется контактом двух жидких фаз, т.е. наличием воды в системе и солюбилизацией углеводорода в макромолекуле белка.

По литературным данным, в этой области концентраций белка межфазное натяжение близко к межфазному натяжению вода - углеводород; межфазный слой не препятствует проникновению воды в толуол.

Рассмотрим область концентраций белка II. При концентрации белка выше 10"8М зависимости lgr (lgcp) имеют вид:

lgr = 0,5 lgCp (3)

Значения сгущения массы белка в межфазном слое формально соответствуют модели плотного монослойного заполнения границы.

В этой области концентрации БСА по литературным данным реализуется наиболее структурированный слой. Влияние хлоридов щелочных металлов на MAC в области средних концентраций белка в водном растворе (область II) заключается в расширении на порядок по концентрации белка средней, переходной области изотерм с максимальным эффектом в случаях добавок хлоридов натрия и цезия. В расширении переходной области изотерм наименее эффективен ион лития. Это может быть связано с меньшим относительным содержанием ионов лития в гидратных оболочках БСА в межфазном слое.

При дальнейшем увелтении начальной концентрации белка зависимости lg Г (IgCp) и igcc<j, (IgCp) имеют вторую прямолинейную область.

Несмотря на то, что в начале области III количество белка в органической фазе в системах, содержащих соли, значительно ниже, чем в системах без соли, при росте начальной концентрации белка до 6-10"5М количество БСА в углеводороде в системах с добавками электролита и без них практически не различается.

В данной области концентраций БСА (область Шб) наблюдается также рост растворимости воды в углеводородной фазе ссфН2°. Слой на границе раздела фаз содержит большое количество воды (с;!,20 » 1г/мл). Межфазное натяжение достигает значений ниже 1мН/м. Прочность слоя падает. По-видимому, в этой области образуется поликомпонентный (белок, вода, углеводород, соль) рыхлый полислой. Система приобретает, возможно, микроэмульсионный характер. Добавление хлоридов щелочных металлов приводит к сдвигу образования такого слоя в область более высоких концентраций БСА.

При таких концентрациях БСА (третий участок изотерм), вероятно, в системе совершается фазовый переход - об этом свидетельствует резкий рост накопления белка на межфазной границе и перехода белка в углеводородную фазу; снижение реологических параметров MAC; изменение тенденции влияния солей на параметры системы (рис. 4-5); в этих условиях происходит образование на межфазной границе наблюдаемой визуально средней фазы. В рамках данной работы достаточно трудно было охарактеризовать строение третьей, промежуточной фазы в области высоких концентраций белка.

2.4. Влияние солей на коэффициенты распределения БСА в системе водный раствор белка-межфазный слой-толуол. Полученные экспериментально значения ссф, Г и рассчитанные значения ср позволяют определить коэффициенты распределения

Таблица 2.

Равновесное распределение БСА в системе водный раствор белка-межфазный слой-толуол в присутствии хлоридов щелочных

металлов. Концентрация соли - 1,0М, I = 22°С.

сл. М 5,3-Ю-10 1.4-10'9 2.9-109 1,0-10"8 2.1-Ю-8 5.0-10'8 t.6-10'7 4.0-10"7 1.0-10 6 3.2-10« 1.0-10"5 6.3-Ю-5

без соли

Ср, М 2, МО10 6,4-Ю"10 9,6-Ю'10 5,3-10"9 1,0-10'8 3,7-10'8 1,2-tO"7 3,5-10"7 8,6-Ю"7 2,9-10"6 9,1-10-6 5,9-Ю'5

ч 0,50 0,52 0,79 0,32 0,25 0,084 0,045 0,023 0,030 0,023 0,019 0,022

к? 5,0 4,5 8,2 3,8 5,5 1,7 2,0 0,71 0,90 0,59 0,49 0,32

К, 10 8,7 10 12 22 20 44 30 30 25 26 15

LiCI

ср, М 2,5-10"10 5,3-Ю10 5,3-Ю-9 1,1-Ю'8 3,8 -10 е 1,1-Ю"7 3,5-Ю'7 8,7-10"7 2,9-10-« 8,9-10-6 5,8-10-5

Кр 0,28 0,55 0,26 0,10 0,040 0,020 0,006 0,010 0,006 0,014 0,016

к? 5,7 7,3 4,2 5,8 1,9 2,4 0,93 0,91 0,66 0,69 0,40

К, 20 13 16 56 45 98 150 88 110 48 25

NaCI

ср, М 2,4-Ю'10 4,6-Ю10 9,5-Ю'10 5,5-Ю'9 8,0-10"9 3,7-10"8 1,2-Ю'7 3,6-10"7 8,7-Ю'7 2,9-10-6 8,9-10-6 5,8-10-5

кр 0,46 0,66 0,68 0,30 0,31 0,052 0,045 0,012 0,016 0,011 0,014 0,018

к? 4,7 9,0 9,1 3,4 8,7 2,1 2,0 0,74 0,84 0,57 0,75 0,50

К, 10 14 13 12 28 40 45 60 52 49 53 28

KCI

ср, М 8,6-10"" 7,МО11 3,1-10'9 7,7- 10"а 3,7-10'8 1,1-10'' 3,6-10"7 8,4-Ю"7 2,8-10-6 8,8-10-6 5,7-10-5

РКр 1,8 6,8 0,52 0,26 0,038 0,038 0,008 0,019 0,034 0,011 0,020

к, 22 79 11 9,9 2,1 2,9 0,77 1,1 3,2 0,80 0,51

к, 12 12 21 38 56 76 98 59 91 74 26

CsCI

Ср, М 1,8-Ю'10 4,7-Ю10 8,3-Ю"10 4,7-Ю"9 6,4-10"9 3,7-10"8 1,1-Ю"7 3,4-10"7 8,6-10"7 2,8-10-6 8,8-10-6 5,7-10-5

Кр 0,60 0,54 0,84 0,33 0,33 0,043 0,039 0,008 0,008 0,007 0,008 0,020

К? 8,4 9,4 11 5,2 13 2,2 2,9 1,1 1,0 0,88 0,81 0,51

к, 14 17 13 16 40 50 75 . 140 120 120 98 26

Кр = ссф/ср> К, = Г/Ср, К2 = Г/ссф, где со - начальная концентрация белка в водной фазе, ср - равновесная концентрация белка в водной фазе, Г - сгущение массы БСА в MAC, ссф - концентрация БСА в органической фазе.

белка между тремя фазами: двумя объемными (водной и органической) и межфазным слоем (Кр = ссф/ср, К] = Г/ср и Кг = Г/ссф)(табл. 2). Эти коэффициенты не являются константами, т.к. прямая пропорциональность между Г и Ср (исключая область Генри), а также ссф и ср отсутствует.

В качестве примера на рис. 8 представлены зависимости этих величин от логарифма концентрации БСА в водной фазе для систем, не содержащих электролитов н содержащих 1М NaCl.

Как можно видеть, с увеличением ср выше 10"8М (область II) уменьшается Кр, т.е. падает содержание белка в углеводородной фазе. Одновременно уменьшается и значение К], т.е. уменьшается относительное сгущение массы белка на границе раздела фаз из водной фазы. При этом значение К2 резко возрастает, т.е. равновесие межфазный слой - органическая фаза смещается в сторону формирования межфазного слоя. При дальнейшем увеличении ср кривая К2 (ср) проходит через максимум. В системах с добавлением электролитов максимум сдвигается в сторону более высоких концентраций белка, что соответствует расширению переходной области на изотермах.

При дальнейшем увеличении концентрации белка переход БСА в органическую фазу из MAC облегчается, и 1<2 падает (область Шб). В этой области кривая К] (lgcp) выходит на участок слабого практически линейного падения.

Концентрирование белка на межфазной границе и переход БСА из водной в углеводородную фазу под действием солей можно в общем виде отнести к эффекту высаливания белка как потере растворимости в водной фазе. Расчет коэффициента распределения белка между водной фазой и суммарно межфазным слоем и толуолом позволил получить следующий ряд по эффективности действия солей:

LiCl < NaCl < КС1 * CsCl

Этот ряд совпадает с известным рядом Гофмейстера, связанным с уменьшением растворимости белков в воде.

Электролиты по своему действию на исследованные системы различаются по способности удерживать белок в MAC, препятствуя переходу в углеводородную фазу. Удерживающая способность катиона характеризуется коэффициентом распределения белка между межфазным слоем и углеводородной фазой. Эту способность выражают следующие ряды:

Рис. 8. Зависимость равновесных характеристик системы водный раствор-межфазный адсорбционный слой-толуол от равновесной концентрации белка в водном растворе (ср). t = 22°С.

Кр = ссф(М)/ср(М); К, = Г(моль/м2)/ср(М); К2 = Г(моль/м2)/ссф(М). Система без соли: 2 - Кр, 3 - К), 5 - К2» система с добавлением 1М №С1: 1 - Кр, 4 - К], 6 - К2; Штрих-пунктирные линии - границы монослойной адсорбции для системы без электролита; пунктирные - для системы с добавлением 1М №С1.

для низких концентраций белка -

LiCl > CsCl > KCl > NaCl для высоких концентраций белка -

CsCl > KCl > LiCl > NaCl .

За исключением иона лития оба ряда совпадают, и рост удерживающей способности коррелирует с увеличением ионного радиуса и уменьшением плотности заряда катиона. Это может быть связано с энергетической невыгодностью переноса частиц белка, содержащих в двойном электр!гческом слое в качестве противоионов ионы калия и цезия, в органическую фазу. Несмотря на то, что по отношению к воде такие частицы более гидрофобизированы, наличие высокой концентрации ионов калия и цезия вблизи белка делает переход в углеводородную фазу из межфазного слоя энергетически затрудненным.

Для катиона лития отмечено существование комплексов мостикового типа, что может быть пр1гчиной наибольшей удерживающей способности ионов лития при малых концентрациях белка. При увеличении концентрации белка, по-видимому, суммарный вклад мостнковых структур в межфазном слое падает.

3. Структурообразование и реологические свойства MAC БСА в системе водный раствор-толуол в присутствии электролитов.

Для реологических исследований использовали водные растворы БСА при концентрации 10"5М. При этой концентрации белка на границе жидких фаз образуется толстый межфазный слой (полнслой в пересчете на БСА), визуально наблюдаемая третья, промежуточная фаза.

3.1. Кинетика формирования MAC БСА на границе жидких фаз в присутствии хлоридов щелочных металлов. В работе исследована кинетика формирования межфазных слоев БСА на границе водный раствор-толуол без добавления солей и с добавками 0,5М растворов хлоридов лития, натрия, калия и цезия.

Для задачи исследования кинетики структурообразования в MAC белков использован метод определения предельного напряжения сдвига Prs, позволяющий качественно следить за развитием структуры на границе раздела фаз. Ошибка измерений Ps составляет 6,5%. Предельное напряжение сдвига слоя Prs определяли при постоянной скорости вращения столика с ячейкой, равной 0,042рад/с.

Предельное напряжение сдвига и стационарное напряжение вязкого течения MAC белка зависят от продолжительности формирования слоя. Зависимость Prs от времени формирования MAC БСА в системах, содержащих электролиты, представлена на рис. 9. В течение некоторого времени прочность MAC нарастает, а затем падает до постоянного значения. Вид зависимостей (рис. 9) свидетельствует о взаимной конкуренции нескольких (по крайней мере, двух) процессов при образовании межфазного слоя. По-видимому, при больших концентрациях белка (10"5М) массоперенос на границу раздела фаз велик и возникает большое число случайных контактов, при этом образуется относительно прочная напряженная структура, которая термодинамически неустойчива и разрушается при переходе к более равновесному состоянию. Изменения предельного напряжения сдвига происходят за ЗОмин. формирования слоя в системах без добавок электролита; 40мин. - в системах, содержащих хлориды лития и калия, бОмнн. - в присутствии хлоридов натрия и цезия. Соли существенно замедляют формирование MAC как в

Рис. 9. Зависимости предельного напряжения сдвига (Prs) от времени формирования межфазного адсорбционного слоя в системе толуол-водный раствор БСА, содержащий 0,5М растворы солен: 1 - NaCI, 2 - KCl, 3 - CsCl, 4 - LiCI, 5 - без добавления соли. сБсл = 1,0 • 10"5М, t = 22°С. Скорость деформации - (),042рад/с.

начальный момент времени, так и на стадии перехода к равновесным структурам на границе двух фаз. В дальнейшем все исследования реологических свойств межфазных адсорбционных слоев БСА проводились после формирования слоя в течение 60 минут. Следует отметить, что равновесное распределение белка между жидкими фазами и MAC (по данным метода радиоактивных индикаторов) достигается в течение большего времени (2 суток). Специфика использованной в реологических измерениях ячейки затрудняла измерение в течение столь долгого времени. Однако, было показано, что поверхностные реологические параметры MAC БСА не меняются в процессе его формирования в течение 1-6 часов, и такой слой можно считать квазиравновесным.

3.2. Зависимость напряжения сдвига межфазных слоев БСА на границе водный раствор-толуол от концентрации электролитов. Кривые развития напряжения сдвига во времени в системах, содержащих хлориды щелочных металлов, и в отсутствие солей носили одинаковый характер. В системах, содержащих соли, предельное напряжение сдвига и стационарное напряжение вязкого течения ниже, чем в системах в отсутствие солей. Концентрации солей варьировали в диапазоне 0 - 1,0М.

Для всех солей зависимости Prs и Pss от концентрации солей идентичны: при увеличении концентрации соли в системе прочность межфазного слоя сперва падает, затем перестает зависеть от концентрации электролита. Для систем, содержащих хлориды лития и натрия, предельное напряжение сдвига и стационарное напряжение вязкого течения не изменяются с увеличением концентрации соли начиная с 0,2 -0,ЗМ; для систем с добавками хлоридов калия и цезия - начиная с 0,4М.

Дальнейшие исследования нами проводились при 0,5М содержания солей.

3.3. Реологические кривые течения межфазных адсорбционных слоев БСА в присутствии электролитов. В работе получены зависимости напряжения сдвига от времени при различных скоростях деформирования для MAC на границе раздела водный раствор белка-толуол для чистого белка и при добавлении хлоридов лития, натрия, калия и цезия. При увеличении скорости деформации на два порядка Prs возрастает в 2 - 3 раза, а время достижения Prs уменьшается от нескольких минут до секунд. Напряжение сдвига Pss, характеризующее стационарное течение при данной скорости, определяет вязкостные свойства слоя и также растет с увеличением

скорости деформации. На основании полученных данных были построены кривые течения МЛС БСЛ на границе жидких фаз в присутствии электролитов. Кривые приведены на рис. 10 и 11. Кривая течения межфазного слоя БСЛ в системе без добавок солей имеет вид, характерный для твердообразных структур с пределами текучести Рк) и РК2- В присутствии хлоридов щелочных металлов межфазные слои БСЛ характеризуются скорее как аномально вязкие жидкости. Кривые течения, однако, позволяют условно выделить Рк1 для систем с добавками LiCl, NaCl и KCl. В табл. 3 представлены параметры межфазного слоя БСЛ: пределы текучести, шведовская и бннгамовская вязкости, модули эластической деформации Es.

Как можно видеть, электролиты снижают модуль эластической деформации в 1,3 (LiCl) - 2,8 (NaCl, KCl, CsCl) раза.

Добавление солей снижает прочность структуры (Prs) и шведовскую вязкость в ряду:

LiCl < CsCl < NaCl < KCl и предел текучести структуры MAC Рк1 в ряду:

LiCl < NaCl < КСК CsCl На бингамовскую вязкость соли практически не влияют, что указывает на идентичность элементов, образующих структуры слоев во всех системах.

Таблица 3.

Реологические характеристики MAC БСА на границе водный раствор-толуол. сбсл = Ю-5М, концентрация соли - 0,5М, t=22°C. Время формирования слоя - бОмнн.

Добавление соли Es, мН/м PKl, mH/m PK2, mH/m rto, mH-c/m rf, мН-с/m

- 2,8 0,34 0,62 1,11 0,11

LiCl 2,1 0,09 0,29 0,96 0,12

NaCl 1.0 0,05 0,16 0,76 0,10

KCl 0,8 0,04 0,11 0,44 0,16

CsCl 1,2 - 0,21 0,80 0,10

Рис. 10. Кривые течения MAC БСА, сформированных на границе водный раствор -толуол в системе без солей (5) и в присутствии 0,5М LiCl (4), КС1 (3), CsCl (2), NaCl (1). сбса = 1,0-10"3М, t = 22°С. Время формирования слоя - бОмин.

•Пзф. мН*с/м

1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

\ \«

2\\ \ —v 1 v \ 1 \l 43 * \ \ и \ \

\5

_Р„, мН/м

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

\

\

\

Л

\

\

\

\

Ч

\

Рис. 11. Зависимость эффективной вязкости (т|эф*) MAC БСА на границе водный раствор - толуол от стационарного напряжения вязкого течения (Pss) в системе без солей (5) и в присутствии 0,5М LiCl (4), NaCl (2), КС1 (1), CsCl (3). сбса = 1,0 • 10"5M, t = 22°С. Время формирования слоя - бОмин.

23

ВЫВОДЫ.

1. Проведено систематическое исследование влияния хлоридов щелочных металлов на систему водный раствор БСЛ - межфазный адсорбционный слой -толуол реологическим методом закручивания диска и радиометрическим методом "сцинтиллирующей фазы" в широком диапазоне концентраций белка. Показано, что добавки солей расширяют по концентрации белка область образования плотного, близкого к мономолекулярному слоя па границе раздела фаз с усилением белок-белковых взаимодействий в слое.

2. На примере исследованных систем с БСА (природным высокомолекулярным поверхностно-активным веществом) и двумя несмешивающимися жидкостями показано, что действие солей аналогично известному для систем с низкомолекулярными ПАВ, заключающемуся в концентрировании ПАВ на межфазной границе. Эффект наибольшего накопления белка на межфазной границе при минимальном переходе БСА в углеводородную фазу проявляется в области концентраций солей 0,1 - 0,ЗМ.

3. Введение солей в систему изменяет равновесное распределение белка между водной и углеводородной фазами. Это указывает на то, что именно межфазный адсорбционный слой служит источником накопления белка в углеводородной фазе.

4. Рассчитаны коэффициенты распределения белка в присутствии солей между межфазным слоем и двумя макрофазами: водной и углеводородной. Получены ряды эффективности действия солей на систему:

"высаливающий" (переход белка в межфазный слой и углеводородную фазу под действием солей) -

LiCl < NaCl < KCU CsCl, и ряд, отражающий влияние солей на сдвиг равновесия по содержанию белка в сторону межфазного слоя по сравнению с органической фазой:

NaCl < KCl < CsCl < LiCl - для малых концентраций белка, NaCl < LiCl » KCl < CsCl - для больших концентраций белка.

5. По данным радиометрического метода можно отметить слабо выраженную тенденцию к уменьшению констант скорости сгущения массы БСА в межфазном слое в присутствии солей.

6. Исследование динамики формирования межфазного слоя на основе измерений реологических параметров в области образования третьей, промежуточной фазы показало возникновение неравновесных структур на межфазной границе в первые 20 минут. Влияние солей проявляется в замедлении формирования равновесных, менее прочных слоев.

7. Получены кривые течения структур межфазных адсорбционных слоев БСА на границе водный раствор - толуол и определены модуль упругости, шведовская вязкость, бингамовская вязкость, пределы текучести в области образования третьей фазы в присутствии электролитов. Установлено снижение поверхностных реолопгческих параметров и образование в присутствии солей более рыхлых структур со свойствами аномальных жидкостей.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации:

1. Пелех В.В., Алентьев А.Ю., Ямпольская Г.П., Измайлова В.Н. Влияние хлоридов щелочных металлов на распределение сывороточного альбумина в системе водный раствор-углеводород.// Коллоидн. ж. 1994. Т.56. №1. С. 68-72.

2. Alentyev A.Yu., Pelech V.V., Izmailova V.N. The Influence of Electrolytes on the Distribution of Protein in Water-Interface Adsorption Layer-Hydrocarbon System. 8th International Conference of Surface and Colloid Science. 13-18 February 1994. Adelaide, South Australia. Program and Abstracts. P.49, p.195. '

3. Pelech V.V., Izmailova V.N., Yampolskaya G.P., Alent'ev A.Yu. Influence of Electrolyte Additives on the Protein Partitioning and the Rheological Parameters of the Interface Layer in Hydrocarbon - Water System. 11th International Symposium on Surfactants in Solution. 9-13 June 1996. Jerusalem, Israel. Book of Abstracts. P.3, p.199.

4. Izmailova V.N., Yampolskaya G.P., Tulovskaya Z.D., Levachev S.M., Derkach S.R., Rodin V.V., Pelech V.V., Bacharvand H., Tarasevich B.N. Rheological and Structural Properties of Interfacial Adsorption Layers and Emulsions Stability. 11th International Conference on Surface Forces. 25-29 June 1996. Moscow, Russia. Conference Programme and Abstracts. P.52.

5. Измайлова B.H., Ямпольская Г.П., Левачев С.М., Деркач С.Р., Туловская З.Д., Пелех В.В., Тарасевич Б.Н. Взаимосвязь межфазных и объемных свойств смесей высоко- и низкомолекулярных поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активные вещества и сырье для их производства. Сборник тезисов докладов IX Конференции. Белгород. 1996. С. 36-37.

6. Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П., Туловская З.Д., Левачев С.М., Пелех В.В., Тарасевич Б.Н. Реологические свойства межфазных адсорбционных слоев белков и поверхностно-активных полимеров на жидких границах раздела фаз. 18-й Симпозиум по реологии. 29сент. - 4 окт. 1996. Тезисы докладов. С. 50.

А