Конструирование и экспрессия в ESCHERICHIA COLI искусственных генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

российская академия наук

ордена трудового красного знамени институт биоорганическои химии

им. м.м.шемякина и ю.а.овчинникова _____

1 «по 'к;!1: На правах рукописи

— 1 НИ1 л

ПЕТРОВСКАЯ Лада Евгеньевна

конструирование и экспрессия в ESCHERICHIA COLI искусственных генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель -кандидат химических наук В.Г.Коробко

Официальные оппоненты -доктор химических наук Ю.А.Берлин доктор биологических наук С.В.Машко

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится 24 апреля 1996 г. в 10 часов на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Автореферат разослан % 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат химических наук

ИБХ РАН

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В семействе факторов регуляции кроветворения человека ¡дно из ключевых положений занимает гранулоцитарно-макрофагальный :олониестимулирующий фактор (GM-CSF), представляющий собой кислый гликопротеин молекулярной массой 23-29 кДа. Он обладает плейотропным действием в отношении тволовых клеток миелоидного ряда, в частности, стимулирует рост и пролиферацию [редшественников гранулоцитов и моноцитов, а также оказывает влияние на функции релых эффекторных клеток этого ряда. Благодаря свойству GM-CSF стимулировать емопоэз in vivo и активировать нейтрофилы и моноциты открываются широкие |ерспективы его использования в терапии ряда заболеваний иммунной и кроветворной истемы (анемических и миелодиспластических синдромов, нейтропении, СПИДа и .р.), а также последствий лучевой и химиотерапии опухолевых заболеваний, что делает резвычайно актуальной задачу получения этого белка в значительных количествах для 1едицинских целей.

Источником GM-CSF в организме человека являются Т-лимфоциты, макрофаги и екоторые другие клетки, синтезирующие белок-предшественник (144 а.о.), зрелая форма которого получается путем отщепления сигнального пептида (17 а.о.) в процессе ранспорта через мембрану эндоплазматического ретикулума. Однако выделение GM-^SF из природных источников затруднено из-за чрезвычайно низкого содержания в [их белка.

В литературе описано получение GM-CSF человека путем экспрессии оответствующего гена в трансформированных клетках млекопитающих или в дрожжах. 1 первом случае рекомбинантный белок имеет правильную пространственную структуру, о выделение его в больших количествах затруднено из-за невысокого уровня биосинтеза. 1рожжевые клетки обеспечивают более высокий уровень экспрессии гена, однако в том случае препятствием для использования препарата является специфическое для рожжей посттрансляционное гликозилирование.

Эти проблемы могут быть решены путем создания бактериальных штаммов-родуцентов. Отсутствие системы гликозилирования белков в бактериальных клетках е является препятствием, поскольку известно, что удаление углеводного компонента е влияет на биологическую активность GM-CSF. Однако высокий уровень синтеза екомбинантного белка может приводить к образованию нерастворимых тел включения, енатурация которых сопровождается деградацией бактериальными протеиназами и евысоким выходом активного препарата.

Наиболее перспективным подходом к созданию системы экспрессии гена GM-CSF

человека представляется соединение его с регуляторными и структурными элемента» обеспечивающими выход в периплазматическое пространство бактериальной клет! Это позволяет обойти указанные затруднения и получать белок в нативной фор» Данная работа была посвящена разработке такой системы и штаммов-продуцен7 рекомбинантного GM-CSF человека. Работа была выполнена в 1991-1995 годах лаборатории химии генов ИБХ РАН. Финансирование проводилось в рамках програм! "Новые методы биоинженерии", раздел "Генная и клеточная инженерия".

Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению возможности использован сигнальных последовательностей различных секретируемых белков для транспорта Gi CSF в периплазматическое пространство Е. coli и созданию штаммов-продуцентов Gi CSF человека. Поставленные задачи также включали подбор условий культивирован! рекомбинантных штаммов, разработку схемы выделения и характеристику полученш белков.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделаны работы сконструированы гены гибридных предшественников, включающих сигнальш последовательности белков OmpA Е. coli и Cafl У. pestis и GM-CSF, а также гибридт ген spa-gmcsf, кодирующий гибрид IgG-связывающих доменов белка A St. aureus GM-CSF. Произведен подбор штаммов и условий культивирования, обеспечивают! оптимальный уровень экспрессии полученных генов и транспорта рекомбинантно GM-CSF в периплазматическое пространство Е. coli.

Впервые продемонстрирована возможность использования сигнальнс последовательности белка Cafl для создания системы гетерологичной секреции. Изучен! влияния аминокислотных замен в N-концевой части зрелого GM-CSF показало, ч-нейтрализация положительного заряда остатка аргинина в этой области приводит существенному повышению эффективности транслокации и процессинга гибридно: предшественника Cafl-GMCSF. Полученные результаты способствовали создани штаммов Е. coli - продуцентов N-концевых производных GM-CSF человек, обнаруживающих сходную биологическую активность и взаимодействующих с антителам к рекомбинантному GM-CSF человека, а также разработке схемы выделения эти белков с сохранением их нативного состояния из периплазматического пространстЕ бактерий.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Перво Евроазиатском Симпозиуме по биотехнологии (Турция, 1995 г.) и Первой Всероссийскс конференции по клинической иммунологии (Москва, 1995 г.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Клонирование синтетического гена pmcsf и конструирование плазмип пля его экспрессии в Е. coli.

Для конструирования плазмид, обеспечивающих прямую экспрессию гена gmcsf ^ловека в клетках E.coli, мы использовали его синтетический вариант (рис. 1), лолученный химико-ферментативным синтезом в Институте микробиологии и' экспериментальной терапии (Иена, ГДР) и клонированный в векторе pUCl 18 по :айтам рестриктаз ЕсоШ и ВатШ. Планирование нуклеотидной последовательности этого гена проводилось с учетом встречаемости различных кодонов в геноме Е. coli.

В качестве вектора для экспрессии синтетического гена gmcsf была использована плазмида pTNF331, содержащая тандем сильных промоторов А2 и A3 эанней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансляции и эбеспечивавшая высокий уровень биосинтеза фактора некроза опухолей человека в тетках кишечной палочки. Соединение синтетического гена с регуляторной областью ■ьпазмиды pTNF331, в результате которого получили плазмиду pGMS231 (рис. 2), эыло осуществлено при помощи олигонуклеотидного дуплекса I, кодирующего -жициирующий кодон и первые 4 аминокислотных остатка GM-CSF.

MetAlaProAlaArg CGATATGGCACCTGCTA дуплекс I

TATACCGTGGACGATCTAC

Однако после трансформации полученной плазмидой различных штаммов E.coli электрофорезом в SDS-ПААГ не удалось выявить белкового продукта с юответствующей дегликозилированному GM-CSF молекулярной массой (14,5 кДа). Следует отметить, что начальная часть синтетического гена gmcsf содержала 5ольшое число остатков G и С, стабилизирующих шпилечные структуры в мРНК, соторые оказывают негативное влияние на процесс инициации трансляции. Поэтому мы фовели замену участка синтетического гена между сайтами Bglll и NcoY ¡лигонуклеотидным дуплексом II с более высоким содержанием А/Т пар, используя :инонимические замены.

SerProSerProSerThrGlnPro

GATCTCCAAGTCCTTCTACTCAAC дуплекс II

AGGTTCAGGAAGATGAGTTGGTAC

а)

g т es f

6) ATGGCACCTGCTAGATCTCCATCGCCGTCCACCCAACCATGGGAACACGTCAAC MetAlaProAlaArgSerProSerProSerThrGlnProTrpGluHisValAsn

GCTATCCAGGAAGCTCGTCGTCTGCTCAACCTGTCTAGAGACACCGCTGCGGAAATGAAC AlalleGlnGluAlaArgArgLeuLeuAsnLsuSerArgAspThrAlaAlaGluMetAsri

GAAACTGTTGAAGTGATATCGGAAATGTTCGACCTTCAAGAACCGACCTGCCTGCAAACA GluThrValGluVallleSerGluMetPheAspLeuGlnGluProThrCysLeuGlnThr

CGTCTCGAGCTGTATAAACAAGGTCTGCGTGGTTCTCTGACTAAGCTTAAAGGACCGCTG ArgLeuGluLeuTyrLysGlnGlyLeuArgGlySerLeuThrLysLeuLysGlyProLeu

ACCATGATGGCTTCACACTACAAGCAGCACTGCCCACCTACTCCCGAGACCTCTTGTGCT ThrMetMatAlaSerHisTyrLysGlnHisCysProProThrProGluThrSerCysAla

ACGCAAATCATCACCTTCGAATCCTTCAAGGAAAACCTCAAGGACTTCCTCCTGGTTATT ThrGlnllelleThrPheGluSerPheLysGluAsnLeuLysAspPheLeuLeuVallle

CCATTCGATTGCTGGGAACCCGTGCAGGAGTAA ProPheAspCysTrpGluProValGlnGluTec

Рис. 1. Синтетический ген gmcsf: а) рестриктная карта и б) нуклеотидная последовательность.

Однако полученная в результате этого плазмида pGMS232 (рис. 2) поел трансформации различных штаммов E.coli также не обеспечивала заметного уровн: биосинтеза целевого белка. В связи с этим мы произвели замену синтетическоп участка связывания рибосом фрагментом ДНК, содержащим широко используемый i последнее время трансляционный энхансер гена 10 фага Т7, и поместили полученную конструкцию под контроль различных промоторов (рис. 2). Однако ни одна из указанны: плазмид, несмотря на наличие эффективных участков инициации транскрипции I трансляции, не обеспечивала заметного повышения уровня экспрессии гена gmcsf, чт< дало основания предположить, что при невысоком уровне биосинтеза происходи' быстрая посттрансляционная деградация рекомбинантного белка внутриклеточным! протеазами. Это явление нередко наблюдается при экспрессии чужеродных генов в £ coli, которая сопровождается нарушением формирования пространственной структурь рекомбинантных белков и, как следствие, активацией системы стрессового ответа клетки

£

РА2 РЛЗ.

rrl

SD Clal BglU Nco\

AAGGATTATCGATATGGCACCTGCTAGATCTCCATCGCCGTCCACCCAACCATGG

pGMS231

с £

PAl РЛЗ.

rr I

SD Cla\ BglU Nco\

AAGGATTATCGATATGGCACCTGCTAGATCTCCAAGTCCTTCTACTCAACCATGG

pGMS232

PA2 РАЗ ,

rr

с

ÖS-

TREN

ьо 03

Ш pGMS232E

с £

P tac

Г» [_ TREN

о £

pKK-GMSE

Pire

с £

xU=

о

TREN

03

pTrc-GMSE

Рис. 2. Схемы регуляторных последовательностей гена gmesf в плазмидах для внутриклеточной экспрессии.

2. Конструирование и экспрессия гибридных генов spa-gmesf.

Повышение устойчивости рекомбинантного белка к воздействию протеиназ Е. coli может быть достигнуто несколькими способами, в частности, путем подбора юответствующего штамма и условий культивирования, а также в результате транспортировки в периплазматическое пространство, где уровень протеиназной активности существенно ниже. Другим эффективным подходом к повышению :табильности рекомбинантных продуктов является их биосинтез в составе гибридных белков. Объединить эти стратегии позволяет широко используемая система экспрессии «а основе структурных элементов гена белка A (spa) из Staphylococcus aureus, обеспечивающая как выход гибридного белка в периплазму, так и относительно простой :пособ его выделения за счет способности белка А связываться с константными участками IgG.

Для создания такой системы мы использовали в качестве вектора сконструированную ранее в Лаборатории биоинженерии генов ИБХ РАН плазмиду pUCL2b (рис. За), :одержащую синтетическую последовательность ДНК, которая кодирует лидерный пептид

и два IgG-связывающие домена белка А, причем экспрессия этого гена регулируете

/дс-промотором и участком инициации трансляции гена lacZ. Его объединение

синтетическим геном gmesf было достигнуто за счет синтетического дуплекса II

кодирующего участок расщепления энтеропептидазой (Asp)4Lys для последующег

процессирования гибридного белка, а также кислотолабильную дипептидную "связку

Asp-Pro. В результате была получена плазмида pPAGMS21, содержащая гибридный ге

spa-gmcsf (рис.За).

AspProAspAspAspAspLysAlaProAlaArg GATCCAGATGACGATGATAAAGCACCTGCTA дуплекс III

GTCTACTGCTACTATTTCGTGGACGATCTAG

Для изучения экспрессии гибридного гена мы использовали штамм Е.соИ НВ101 В клетках этого штамма, не являющегося суперпродуцентом /ас-репрессора, синте гибридного белка носит конститутивный характер.

Электрофоретическое исследование различных клеточных фракций показало, чт! при культивировании культуры клеток в течение 16-18 ч при 37°С большая часть гибридноп белка с молекулярной массой около 32 кДа, соответствующей непроцессированном; варианту (рис. 36), локализована внутри клеток в форме нерастворимых тел включени: (рис. 4а, дорожки 4, 5), тогда как в периплазматическом пространстве обнаруживаете:

а)

l> lac

GATCCAGATGACGATGATAAAGCACCTGCTA Xhol GTCTACTGCTACTATTTCGTGGACGATCTAG Xho I

P lac

/JßamHI+Sa/GI \ 2)T1 ДНК- °П

лигаза j

дуплекс III

pUCL2b

ßamHI Sa/Gl

pPAGMS21

б)

gmesf

SPA-GMCSF (28 кДа) линкер

BamHl BglU

SalGl

СП

белка А

GM-CSF

IgG-связывающие домены белка А — Предшественник SPA-GMCSF (32 кДа)

Рис. 3. Схемы конструирования плазмиды pPAGMS21 (а) и строения гибридного белка SPA-GMCSF (б).

белок с молекулярной массой около 28 кДа, по-видимому, образующийся после отщепления лидерной последовательности в процессе транслокации через цитоплазматическую мембрану (рис. 36). Ы-концевой анализ этого белка показал наличие аминокислотной последовательности А1а-01п-Х-Х-С1и и подтвердил это предположение.

Продукты экспрессии гибридного гена spa^gmcs[ характеризовали при помощи иммуноблотинга с использованием конъюгата полного ^ кролика с пероксидазой хрена. Как и ожидалось, оба белка обладают способностью взаимодействовать с кролика, что подтверждает присутствие в них 1{*0-связывающих участков белка А (рис. 4а, дорожка 6).

а) б)

М. кДа

12345678 1 2

Рис.4. Изучение экспрессии гена spa-gmcsf. а). Анализ белков, синтезируемых клетками Е. coli HB 101 с плазмидой pPAGMS21, при помощи электрофореза в 13% SDS-ПААГ (дорожки 1-5) и иммуноблотинга с пероксидазным конъюгатом IgG кролика (дорожки 6-8). 1 - лизат клеток без плазмиды; 2 - периплазматическая фракция клеток с плазмидой после выращивания в течении ночи при 30° С; 3 - фракция растворимых белков клеток с плазмидой после выращивания в течение ночи при 37°С; 4 - фракция нерастворимых белков (условия как в 3); 5 - суммарный клеточный белок (условия как в 3); 6 - иммуноблот клеточных белков Е. coli НВ101 с плазмидой pPAGMS21 (условия как в 3); 7 и 8 - то же, условия как в 2. б). Препарат, полученный после хроматографической очистки гибридного белка на IgG-агарозе. 1 - электрофорез в 13% SDS-ПААГ; 2 - иммуноблот с пероксидазным конъюгатом IgG кролика.

При выращивании этой же культуры клеток E.coli НВ101, трансформированж плазм идой pPAGMS2l, в течение 20 ч при 30°С большая часть гибридного бел локализуется в периплазме (рис. 4а, дорожки 2, 8). При этом иногда с помощью блс гибридизации выявляется дополнительная полоса с молекулярной массой около 18 kJ (рис. 4а, дорожка 7), которая, вероятно, представляет собой продукт частичного гидроли гибридного белка бактериальными протеазами. Способность этого продук' взаимодействовать с IgG и его молекулярная масса позволяют сделать предположен! о том, что участок расщепления расположен в N-концевой части последовательное-GM-CSF.

Для очистки гибридного белка SPA-GMCSF мы использовали стандартну процедуру аффинной хроматографии на агарозе с иммобилизованным IgG кролика, i которую наносили белки периплазматической фракции клеток E.coli НВ10 трансформированных плазмидной ДНК pPAGMS21. Элюцию связавшихся белков колонки проводили при pH 2,85; в результате из 200 мл клеточной культуры бьи получено 0,18 мг гетерогенного препарата, образованного двумя основными несколькими минорными белками (рис. 46, дорожки 1,2).

Попытки изучить экспрессию гена spa-gmcsf в Ion' штамме SG20050 не приве/ к успеху, так как клетки этого штамма, трансформированные плазмидой pPAGMS2 подвергались лизису на ранних стадиях роста. Поскольку наиболее строгая ре гуляш-транскрипции достигается при клонировании в экспрессионной плазмиде гена penpeccoj lacмы решили создать систему такой регуляции экспрессии гибридного гена ь основе плазмиды pPAGMS21 и вектора рТгс99А. Последний был выбран нами ь основании литературных данных, свидетельствующих о практически полной репресси промотора trc этой плазмиды в отсутствие IPTG.

С этой целью мы провели полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на матри! рТгсЭЭА с использованием ДНК-полимеразы Vent и олигонуклеотидных праймерс CTGCATTAATGAATCGGCC (IV) и GATCCTCTAGAGTCGACCTG (V). При тако амплификации оказалась делетированной часть плазмиды, включающая в себя 3

q

концевую часть гена lad (за PvuU- сайтом), промоторно-операторный участок начало полилинкера. Олигонуклеотид (IV) комплементарен участку ДШ заканчивающемуся тупым концом, который образуется при расщеплении PvuU, олигонуклеотид (V) соответствует части полилинкера, включающей в себя сай расщепления эндонуклеазы рестрикции Sa/Gl (подчеркнут). Продукт ПЦР обработал рестриктазой SaiGI, после чего он был очищен электрофорезом в 1% легкоплавко агарозе. С другой стороны, из плазмиды pPAGMS21 путем обработки рестриктазам Pvull и Sal Gl был выделен фрагмент ДНК, включающий в себя 3' -концевую часть ген

Рис. 5. Схема конструирования плазмиды pPAGMS211. q

lacl , промоторно-операторный участок и гибридный ген spa-gmcsf. В результате объединения этого фрагмента с линеаризованной плазмидой рТгсЭЭА, лишенной промоторной части, была получена плазмида pPAGMS2ll (рис. 5).

Культура клеток SG20050, трансформированных этой плазмидой, характеризуется стабильным ростом в отсутствие индуктора. При электрофоретическом анализе клеточных белков полоса, соответствующая продукту экспрессии гибридного гена, не обнаруживается. (рис. 6, дорожка I), что подтверждает наличие более строгой системы контроля /ас-промотора в штамме с плазмидой pPAGMS211. Добавление IPTG вызывает появление в клетках бактерий единственного дополнительного белка, обнаруживаемого как в суммарном препарате, так и в периплазматической фракции, и обладающего электрофоретической подвижностью, характерной для зрелого гибридного белка SPA-GMCSF (рис. 6, дорожки 2, 3). Таким образом, при использовании сконструированной нами системы экспрессии наблюдаются более эффективный процессинг и транслокация гибридного белка в периплазматическое пространство Е. coli.

Чтобы исследовать свойства очищенного препарата гибридного белка, мы провели индукцию в 1 л культуры клеток SG20050, трансформированных плазмидой pPAGMS211,

и затем аффинную хроматографию белков периплазматической фракции. В результат элюции с ¡^-агарозы была получена смесь белков, среди которых преобладали, как в предыдущем случае, белки с молекулярной массой 28 и 18 кДа (рис. 6, дорожка 4 Чтобы избежать кислотного расщепления гибридного белка, мы также использовал для элюции 2 М роданид калия. Этот способ позволил получить более чистый препара белка (рис. 6, дорожка 5). Следует отметить, что в обоих случаях выход очищенног гибридного белка не превышал 0,9 мг на 1 л бактериальной культуры.

Очищенный таким образом белок БРА-ОМСБР подвергали расщепленж энтеропептидазой тонкого кишечника быка. Обработка ферментом раствора белка пр концентрации последнего 100 мкг/мл в течение 3 ч не дала видимых результате! Лишь инкубация в течение 72 ч привела к частичному гидролизу гибридного белкг Поскольку известно, что для энтеропептидазы характерна низкая константа связывани с субстратом, мы провели концентрирование раствора БРА-ОМСБР до 2 мг/мл. Однак и при этой концентрации не удалось достигнуть количественного расщеплеия препарате

М, кДа

SPA-GMCSF

GM-CSF SPA

MW 1 2 3 4 5 6 7

Рис.6. Электрофорез в 15% SDS-ПААГ продуктов экспрессии гена spa-gmcsf в клетка) Е. coli штамма SG20050. 1 - лизат неиндуцированных клеток с плазмидой; 2 - то же после индукции IPTG в течение 4 ч; 3 - периплазматическая фракция клеток после индукции; 4 - анализ препарата, полученного после очистки аффинной хроматографиеР на IgG-агарозе (элюция при pH 2,85); 5 - то же, элюция 2 М роданидом калия; 6 продукты расщепления очищенного белка энтеропептидазой тонкого кишечника быка концентрация гибридного белка 100 мкг/мл; 7 - то же, концентрация гибридного белкг 2 мг/мл.

Анализ продуктов ферментативного гидролиза электрофорезом в денатурирующем геле показал наличие небольшого количества исходного белка с молекулярной массой 28 кДа и двух белков, подвижности которых соответствуют рассчитанным молекулярным массам составляющих его частей (рис. 6, дорожки 6, 7).

Оценивая эффективность сконструированной нами системы экспрессии гибридного гена необходимо отметить, что выход целевого белка довольно низок, а

после расщепления энтеропептидазой он уменьшается еще примерно вдвое. Если предположить, что возможности клетки транспортировать белок БРА-ОМСБР в периплазму ограничены, более рациональным представляется создание гибридных предшественников, включающих сигнальные последовательности секретируемых бактериальных белков и ОМ-СБИ. Такой подход в случае успеха дает возможность получать зрелый белок, не нуждающийся в дальнейшем расщеплении.

2.3. Конструирование и экспрессия гибридного гена отра-фтсз}. Влияние уровня экспрессии на эффективность транслокации рекомбинантного белка через плазматическую мембрану.

Для создания системы секреции йМ-СЭР на первом этапе мы решили использовать сигнальный пептид основного белка внешней мембраны Е.соИ - ОшрА. Это было обусловлено тем, что белок ОшрА является одним из наиболее эффективно секретируемых клетками бактерий - до 10е молекул белка на клетку. Кроме того, первые два аминокислотных остатка последовательности зрелых ОгпрА и ОМ-СЭР совпадают, что создает благоприятные условия для точного отщепления сигнального пептида. Наконец, сигнальная последовательность этого белка была успешно использована в ряде работ по гетерологичной секреции. В частности, имелись литературные данные об экспрессии гена отра-цтсв} под контролем гибридного промотора 1рр-1ас. При этом уровень синтеза рекомбинантного йМ-СЭР достигал 10% от общего клеточного белка, а сам продукт подвергался правильному процессингу, однако оставался связанным с внутренней мембраной. Мы предположили, что понижение уровня синтеза гибридного белка может способствовать его более эффективной транслокации. В связи с этим было предпринято конструирование нескольких вариантов плазмид, обеспечивающих-транскрипцию гибридного гена отра^тсз[ под контролем промоторов различной силы.

Для соединения гена gmcsf с регуляторной областью и последовательностью, кодирующей лидерный пептид ОшрА, мы использовали подход, основанный на применении ПЦР и временных сайтов узнавания рестриктаз. Для этого сначала с

использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов TCTCGTTGGAGAATTCA' GGC (VI) и TATATTCTGCAfîGÇCTGCGCTACGGTAGCG (VII)* амплифицировал фрагмент генома E.coli, содержащий участок инициации трансляции и первые 22 кодон предшественника белка ОшрА .

Затем при помощи олигонуклеотидных праймеров ACCTGCAGCTCCGGCCCC CTCGCCCAGCCCCAGC (VIH) и AATTGGAGCTCGAGTACCCACCAA (IX)" мы провел ПЦР с использованием в качестве матрицы безынтронного гена gmcsf. Этот ген бы получен методом точного сочленения фрагментов ДНК путем элонгации перекрываюшихс участков (SOE) в группе экспрессии белковых факторов роста и дифференцировк! ИБХ РАН и клонирован в плазмиде pGM5a (рис. 7). В результате ПЦР получил: фланкированный сайтами эндонуклеаз Pstl и XhoI фрагмент ДНК величиной около 40 п.о., кодирующий последовательность зрелого белка GM-CSF.

Полученные таким образом фрагменты ДНК после обработки соответствующим! рестриктазами одновременно клонировали в фагмиду pGEM-7Zf(+), расщепленнук рестриктазами Eco RI и Xhol. В результате получили плазмиду pGAGMNl, содержащун последовательности, кодирующие сигнальный пептид белка ОшрА и GM-CSF разделенные тетрануклеотидной последовательностью TGCA Psíl-сайта . Для соединена обеих рамок считывания эта последовательность была удалена обработкой фрагментоь Кленова в присутствии четырех дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов, в результате чегс получили плазмиду pGAGMN3 (рис. 7).

В плазмиде pGAGMN3 транскрипция гибридного гена контролируется промоторно операторной системой íac-оперона E.coli. С целью исследования влияния промотора нг экспрессию гибридного гена мы поместили его в плазмиды рКК223-3 и рТгс99А, содержащие промоторы транскрипции lac и trc, соответственно. Таким образом, были получены плазмиды pGAGMN3, pKAGMN7 и pTAGMNl (рис. 7), в которых транскрипция гибридного гена ompA-gmcs¡ регулируется соответственно промоторами lac, tac и trc при наличии одинакового сайта связывания рибосомы. Экспрессию гибридного гена изучали в различных штаммах Е. coli, причем для репрессии lac- и tac- промоторов

плазмид pGAGMN3 и pKAGMN7 использовали штаммы - суперпродуценты /ас-репрессора,

q

в то время как плазмида pTAGMNl содержит клонированный ген lac/ , что позволяет проводить индукцию в любом штамме.

* В праймере VII подчеркнут триплет, комплементарный кодону Ala12 пребелка ОшрА; жирным шрифтом выделены сайты рестриктаз EcoRI и Pstl.

** В праймере VIII подчеркнут триплет, кодирующий Ala1 зрелого белка GM-CSF; выделены сайты рестриктаз Pstl и Xhol.

ДНК Е. coli

pGMSa

1) ПЦР с праймерами VI и VII,

Taq ДНК-полимераза

2) EcoRI +pj/I

I) ПЦР с праймерами VIII а IX,

I . Тр2 ДНК^полимераза pGEM-7Zf (+) £ioRI +Xho I

ss ompA

T4 ДНК-лигаза pGAGMN 1 О Pstl

I 2) фрагмент Кленова

3) Т4 ДНК-лигаза

lacZ' HindlH Xho\

рКК223-3

Eco RT + IlindW

T4 ДНК-лигаза

рТгсЭЭА

Eco RI + HindlU

T4 ДНК-лигаза

HindU

Рис. 7. Схема конструирования плазмид с гибридным геном ompa-gmcsf.

Максимальный уровень экспрессии гибридного гена под контролем различных промоторов достигается в различных штаммах Е. coli. Так, для плазмиды pGAGMN3 оптимальным было использование штамма XL-1, для pKAGMN7 - TGI, тогда как для pTAGMNl - HB 101 (рис. 8а). Однако и в этих клетках синтез рекомбинантного белка был недостаточно стабилен, наблюдались случаи лизиса культуры, а также снижение

скорости роста после индукции. При этом, как показал анализ в SDS-ПААГ, периплазматической фракции клеток, содержащих плазмиды pGAGMN3 и pKAGMN а также во всех образцах тотального клеточного белка индуцированных культ} обнаруживается белок с молекулярной массой около 14,5 кДа, соответствующей зрелои белку GM-CSF (рис. 8а, дорожки 2, 3, 5, 6, 7).

Определение семи N-концевых аминокислотных остатков этого белка показа; полное совпадение с последовательностью GM-CSF человека, что свидетельствует правильном отщеплении сигнального пептида ОшрА при транслокации через внутренню мембрану клеток бактерий. Исследование образца периплазматической фракции клетс штамма E.coli XL-1, трансформированных плазмидой pGAGMN3, методом иммуноблотиш с поликлональными кроличьими антителами против GM-CSF обнаружило наличк специфически окрашиваемой полосы (рис. 86).

Как и ожидалось, использование /rc-промотора, активность которого в 10-20 рг превышает активность Р/<к> привело к заметному повышению уровня синтеза GM-CSI Однако образующийся в клетках с плазмидой pTAGMNl белок не транспортируется периплазму, а накапливается в нерастворимой фракции клеток, откуда может бьп выделен только в денатурирующих условиях. Отсутствие у него сигнально а) б)

Рис.8. Анализ компартментализации продуктов экспрессии гибридного гена отрА-£тс$1 при помощи электрофореза в 13% БОБ-ПААГ (а) и иммуноблотинга (б), а) 1, 4. 8- суммарный клеточный белок штаммов ХЫ (рОАОМШ), ТС-1 (рКАйМЫ7) 1 НВ101 (рТАОММ) без индукции; 2, 5, 7-то же после индукции; 3, б - периплазматиче екая фракция штаммов ХЫ (рОАОМШ) и ТС-1 (рКАОМЫ7). б) Периплазматическа! фракция штамма ХЫ (рОАСМЫЗ), выращенного в присутствии (1) или без 1РТС (2)

последовательности указывает на то, что он вступил в процесс транслокации, который затем в силу каких-то причин оказался блокированным. Мы предполагаем, что наличие положительного заряда остатка аргинина в N-концевой части молекулы этого белка, а также гидрофобный характер многих его участков затрудняют процесс выхода процессированного белка в периплазму, предположительно осуществляемый при участии белков SecD и SecF. При повышении уровня синтеза GM-CSF в описанной системе может происходить насыщение указанных компонентов системы транслокации, число которых не превышает 30 копий на клетку, и накопление связанного с мембраной продукта.

Таким образом, увеличение уровня экспрессии, достигаемое при использовании более сильных промоторов и повышении копийности плазмиды, приводит к нарушению нормального процесса транспорта зрелого белка в периплазматическое пространство, хотя и не влияет на эффективность процессинга предшественника. Использование lac-и tac- промоторов для экспрессии гибридного гена ompa-gmcsf позволяет добиться накопления рекомбинантного GM-CSF в периплазматическом пространстве штаммов Е. coli с плазмидами pKAGMN7 и pTAGMNl, однако этот процесс недостаточно эффективен и нуждается в дальнейшей оптимизации.

2.4. Конструирование и экспрессия гибридного гена scafl-gmcsf. Влияние изменений аминокислотной последовательности вблизи участка отщепления сигнального пептида на эффективность процессинга и транспорта в периплазму.

Как следует из обзора литературных данных, результат транслокации полипептидной цепи через плазматическую мембрану Е. coli во многом определяется взаимодействием с сигнальной последовательностью белка-предшественника. Примером эффективно секретируюшихся во внеклеточное пространство белков Грам-отрицательных бактерий является белок Cafl Yersinia pestis, который представляет собой один из основных компонентов покрывающей бактерию капсулы. Поэтому мы исследовали возможность использования сигнальной последовательности этого белка для секреции GM-CSF в периплазму Е. coli.

С этой целью мы запланировали получение плазмидных конструкций, содержащих полностью синтетические гибридные гены, в которых последовательность, кодирующая сигнальный пептид Cafl, соединена с синтетическим геном gmcsf. В качестве источника гена, кодирующего сигнальный пептид Cafl, была использована сконструированная в Институте инженерной иммунологии плазмида pSPFl (рис. 9а, б). Эта плазмида получена клонированием по сайтам Hindill и Xbal искусственного гена лидерного пептида Cafl в плазмиде pUC19. Таким образом, она содержит искусственный ген (scafl), кодирующий

сигнальный пептид Cafl, удлиненный с N-конца на восемь аминокислотных остатко Мы предполагали, что наличие этих дополнительных остатков не окажет негативно влияния на процесс секреции, поскольку известны примеры природных сигнальнь последовательностей, длина которых значительно превышает среднее значение.

Для конструирования искусственного гена, кодирующего гибрид сигнального пепти; Cafl с GM-CSF, BglU/Sa/GI-фрагмент плазмиды pGMS231, содержащий основну часть гена gmcsf, встроили в вектор pSPFl (рис. 9а) по одноименным сайтам. Полученнг таким образом плазмида pFGMU (рис. 9а, б) содержит последовательность scaf соединенную с геном gmcsf, однако не может обеспечить экспрессии гибридного ген поскольку трансляционные рамки считывания составляющих его частей не совпадаю Для восстановления единой рамки считывания был синтезирован олигонуклеотидны дуплекс X,

ThrlleAlaThrAlaAsnAlaAlaProAlaArg

CATCGCAACTGCTAACGCAGCACCTGCTA дуплекс )

CATGGTAGCGTTGACGATTGCGTCGTGGACGATCTAG

который был клонирован далее в плазмиду pFGMll между генами scafl и gmcsf п сайтам Крп\ и Bglll. В результате получили плазмиду pFGM12 (рис. 9в), содержащу) гибридный ген, в котором последовательности, кодирующие сигнальный пептид Cafl зрелый белок GM-CSF, образуют единую рамку считывания и находятся под контроле: индуцибельного /ас-промотора.

Для исследования экспрессии гибридного гена были выбраны клетки E.coli штамм JM101. В результате индукции /ас-промотора в клетках этого штамма трансформированных плазмидой pFGM12, наблюдалось появление белкового продукт с молекулярной массой около 18 кДа (рис. 10а, дорожка 4), тогда как в случае правильной процессинга его молекулярная масса должна была бы составить 14,5 кДа. Увеличенна: молекулярная масса соответствует непроцессированному продукту экспрессии rew гибридного предшественника scafl-gmcsf. Этот белок находится в нерастворимой фракщн клеток и не обнаруживается в периплазматической фракции (рис. 10а, дорожки 7, 10) Из литературных данных известно, что эффективность транслокации чере: внутреннюю мембрану и процессинг предшественника секретируемого белка зависят о-суммарного электрического заряда N-концевого участка зрелого белка. Наличие в неь отрицательно заряженных аминокислотных остатков благоприятствует указаннык процессам, а положительно заряженные, напротив, оказывают ингибирующее воздействие Мы предположили, что наличие остатка аргинина в четвертом положении молекуль GM-CSF также может препятствовать его транспорту в периплазматическое пространство С другой стороны, структура сигнального пептида, кодируемого pFGM12, несколькс

гличается от природной последовательности, что также может оказывать влияние на ффективность транспорта и процессинга.

Для проверки этих предположений мы решили произвести замены в N-концевой оследовательности зрелого GM-CSF, чтобы компенсировать или полностью удалить оложительный заряд остатка аргинина. Для этого ДНК плазмиды pFGMl 1 расщепили естриктазой Bgill, одноцепочечные концы достроили при помощи фрагмента Кленова лигировали встык. В результате мы получили плазмиду pFGM13 (рис. 9в), кодирующую Аридный белок Cafl-FGM13, в котором второй и третий аминокислотные остатки 3го-А1а) зрелой части белка замещены остатком аспарагиновой кислоты, нейтрализующей эложительный заряд соседнего остатка аргинина.

Наряду с этим путем клонирования олигонуклеотидного дуплекса XI в плазмиду FGM11 мы сконструировали плазмиду pFGM14, кодирующую гибридный белок Cafl-GM14, в котором три аминокислоты GM-CSF (Pro-Ala-Arg)

LeuSerProSerProSerThrGlnProTrp TCTCTCCAAGTCCTTCTACTCAAC дуплекс XI

AGAGAGGTTCAGGAAGATGAGTTGGTAC

шенены дипептидом Asp-Leu (рис. 9в). Этим достигается, во-первых, удаление эложительно заряженного аргинина из N-концевой части зрелого белка, а, во-вторых, злее полное совпадение аминокислотной последовательности вблизи места расщепления анальной пептидазой с соответствующей последовательностью предшественника СаП 1ис. 9в). Можно было предположить, что такая структурная организация предшественника мжна облегчить его транслокацию через мембрану и последующий процессинг и в то е время не повлиять на биологическую активность зрелого белка, так как известно, го незначительные изменения N-концевой аминокислотной последовательности GM-SF не приводят к снижению биологической активности мутантов.

Для экспрессии гибридных генов, кодируемых плазмидами pFGM13 и pFGM14, :пользовали штамм E.coli JM101. Индукцию /ас-промотора IPTG проводили в течение ч. При этом было обнаружено, что кодируемые плазмидами pFGM13 и pFGM14 белки-эедшественники претерпевают нормальную транслокацию и процессинг, о чем шдетельствует появление на электрофореграммах белка с молекулярной массой около 1,5 кДа как в пробе суммарного клеточного белка, так и в периплазматической фракции тазмидосодержащих штаммов (рис. 10а, дорожки 2, 3, 8, 9). Следует отметить, что ювень экспрессии гибридного гена scafl-gmcsf в штаммах, трансформированных тазмидами pFGMI3 и pFGMH, был практически одинаковым и хорошо воспроизводимым ряде экспериментов.

ClaX

BglU

6)

DBglll + Sa/Gl EcoRl T4 ДНК-лигаза Koni " ^

Xbal Sa/Gl BglU Kpnl

HindlU EcoRl

Kpnl Sa/Gl

Ncol BglU Kpnl HindlU

pSPFl HindlU

scafl Kpnl

Bgill SalGl

ATúACCATGATTACGCCAAGCTTGAAAAAAATCTCATCTGTAATCGCAATCGCArTGTTr^riTArr>TrXiCAACTriCTAA(triCA ПГ^ОАТСТОТСОАСТСТА^ MTMITPSLKKISSVIAIALFGT I ATAN Af A D L S T

pFGMll

lacT

HindlU

scaft

Kpnl BglU

gmcsf

Ncol

■ше

в)

pFGM12

BglU

Ncol

gcacctgctagatctccatcgccgtccacccaaccatgg ▼aparspspstqpw

pFGM.14

BglU

Ncol

gcagatctctctccaagtccttctactcaaccatgg Iadlspspstqpw

gcagatctccatcgccgtccacccaaccatgg

pFGM13

Neo

......................................................1 '

gcagatcgatctccatcgccgtccacccaaccatí

Iadrspspstqp

Последовательности ДНК.кодируюи ЯШШ сигнальный пептид Cafl ШШ^Ш зрелый белок Cafl

Рис.9. Схема конструирования плазмид с гибридным геном 5са//-§тс5/.

Анализ белков периплазматической фракции этих штаммов методом иммуноблотинга с поликлональной сывороткой против рекомбинантного йМ-СБР человека показал, что данные антитела специфически взаимодействуют только с целевыми белками (рис. 106). Определение Ы-концевой последовательности (5 аминокислотных остатков) белков РйШЗ и РСМ14 показало ее полное совпадение с ожидаемой из структуры

соответствующих генов, что свидетельствовало о точном процессинге предшественника. В то же время анализ содержания рекомбинантных белков в сферопластах клеток с плазмидами рРСМ13 и рРйМН указал на наличие в них значительного количества процессированного йМ-СБТ (рис. 10, дорожки 5, 6). Для повышения эффективности гранслокации требуется дальнейшая оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов и/или структуры экспорт-инициирующего домена гибридного предшественника.

Сравнение результатов транслокации гибридных предшественников, включающих сигнальные последовательности белков ОтрА и СаП и нативную последовательность аМ-СБР, обнаруживает, что только первый из них подвергается транслокации и процессингу, несмотря на наличие положительного заряда в Ы-концевой части зрелого оелка. Можно предположить, что сигнальная последовательность ОтрА содержит какие-то элементы, отсутствующие в сигнальной последовательности СаП и экранирующие положительно заряженный Ы-концевой остаток аргинина в молекуле йМ-СЭР.

М, кДа 46 — 30 — 21,5 — 14,3 —

МШ 1 2345678 9 10 1 23

Рис.10. Анализ экспрессии гибридного гена а) Электрофорез в 15% БОБ-

ПААГ лизатов (1-4), сферопластов (5-7) и периплазматических фракций (8-10) клеток штамма ЛМ101 с плазмидами рРОМ13 (1 - без индукции; 2, 5, 8 - после индукции), рРйМ14 (3, 6, 9), рРбМ12 (4, 7, 10). б) Иммуноблот белков периплазматической фракции клеток штамма ЛМ101 с плазмидами рРйМ13 (1), рРбМ14 (2), рРбМ12 (3).

2.5. Выделение и характеристика N-кончевых вариантов GM-CSF.

С целью исследования полученных рекомбинантных белков мы разработав двухстадийную схему их выделения из бактеральной культуры. Белки, кодируемь плазмидами pFGM13 и pFGM14 (FGMI3 и FGM14), были очищены по одинаково схеме. Препарат периплазматической фракции культуры клеток, трансформирование этими плазмидами (рис. 11, дорожка 1), хроматографировали на DEAE-Сефацеле градиенте концентрации NaCl; к фракциям, содержащим GM-CSF (дорожка 2), добавлял сульфат аммония до концентрации 1 М и хроматографировали на фенил-сефарозе С1 4В в обратном градиенте концентрации (NH4),S04. Выход обоих рекомбинантных белке из 1 л бактериальной культуры после этой стадии составлял в среднем 1,5 мг.

Полученные в результате гидрофобной хроматографии образцы был проанализированы высокоэффективной обращеннофазовой хроматографией на колонк RPC-5 в градиенте концентрации ацетонитрила в 0,1% трихлоруксусной кислоте. 1 этих условиях белки FGM13 и FGM14 образуют главным образом по одном симметричному пику (рис. 12). Используя ВЭЖХ в качестве дополнительной стади очистки данных препаратов, удается получить рекомбинантные белки, имеющие чистот около 98%.

Мы предполагали, что использование секреторного аппарата Е. coli для синтез рекомбинантного GM-CSF обеспечивает правильное формирование его пространственно; структуры и дисульфидных связей. Известно, что наличие компактной укладк: полипептидной цепи периплазматических белков Е. coli коррелирует с их устойчивости* к действию протеолитических ферментов - трипсина или протеиназы К. В результат обработки выделенных нами белков раствором протеиназы К (25 мкг/мл) мы обнаружили что они также не подвергаются расщеплению. Однако их инкубация в присутствии 6 N мочевины и ß-меркаптоэтанола, обеспечивающих разрушение водородных и дисульфидны; связей, приводит к полной деградации белка после протеиназной обработки. Эт! результаты указывают на то, что выделенные нами варианты GM-CSF обладаю' компактной пространственной структурой, характерной для нативных белков.

Вторичная структура выделенных белков исследовалась методом кругового дихроизм; в дальней ультрафиолетовой области спектра. Полученные кривые (рис. 13) совпадаю' с опубликованными ранее для рекомбинантного GM-CSF человека, что подтверждав-наши выводы о нативности структуры FGM13 и FGM14.

Для проверки правильности формирования дисульфидных связей в молекула; белков FGM13 и FGM14 мы провели их электрофоретический анализ в отсутстви« восстанавливающего агента (ß-меркаптоэтанола). При этом не выявлено каких-либс дополнительных полос, что свидетельствует в пользу существования единого типг формирования дисульфидных связей в большинстве молекул этих белков.

Основным критерием нативности рекомбинантных белков является наличие у них биологической активности, присущей эукариотическому аналогу. Проверку биологической активности полученных нами рекомбинантных белков проводили по их способности стимулировать рост на метилцеллюлозе колоний предшественников гранулоцитов и макрофагов из клеток эмбриональной печени человека. При этом обнаружено, что белки FGM13 и FGM14 обладают колониестимулирующей активностью, характерной для рекомбинантногодегликозилированного GM-CSF (рис. 14). Приведенные результаты показывают, что полученные нами N-концевые варианты GM-CSF являются близкими аналогами человеческого фактора.

Сопоставление полученных нами систем гетерологичной экспрессии гена gmcsf человека в клетках Е. coli показывает, что использование сигнальной последовательности белка Cafl обладает некоторыми преимуществами: 1) эта система позволяет получать рекомбинантный белок из периплазматического пространства в растворимом виде, минуя стадию ферментативного расщепления; 2) подобранные нами условия культивирования штаммов-продуцентов обеспечивают стабильный уровень экспрессии гибридного гена scafl-gmcsf; 3) выход рекомбинантного белка в данном случае наибольший. Недостатком панной системы является зависимость эффективности процессинга и транслокации продукта экспрессии гибридного гена от структуры N-концевой области зрелого GMCSF.

го и j0 и «ии

1 2 3

Рис. 11. Электрофорез в 15% SDS-ПААГ белков Рис.12. ВЭЖХ препарата GM-

периплазматической фракции клеток штамма CSF (FGM13).

JM101 (pFGM13) после индукции (1); фракции,

содержащей GM-CSF, после хроматографии на

DEAE-Сефацеле (2) и фенил-сефарозе CL-4B (3).

________ '

нптпшаоии длина волны, нм

Рис.13. Спектр кругового дихро- Рис" 14' Фотография колоний предшествен-изма белка РСМ13. ников гранулоцитов и макрофагов, получен-

ных после обработки культуры клеток эмбриональной печени человека белком РОМ13. Увеличение 400Х.

Полученные нами Ы-концевые мутанты йМ-СБР обнаруживают такую же биологически активность, однако внесенные изменения могут затруднить клиническое использовани препаратов. Поэтому перспективным представляется создание в дальнейшем при помощ) сконструированной системы делеционного Ы-концевого варианта ОМ-СБР человека лишенного остатка аргинина.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлено клонирование синтетического гена gmcsf, включающего различные регуляторные элементы. Сконструирован ген spa-gmcsf, кодирующий гибрид IgG-связывающих доменов белка А и GM-CSF человека. Изучена его экспрессия в клетках Е. coli.

2. Разработана схема выделения гибридного белка SPA-GMCSF, позволяющая минимизировать степень протеолитического расщепления. Проведены подбор условий и характеристика продуктов гидролиза выделенного белка энтеропептидазой из кишечника быка.

3. Сконструирован гибридный ген ompa-gmcsf и изучена его экспрессия под контролем трех различных промоторов. Показано, что использование lac- и tac-промоторов обеспечивает процессинг и транслокацию рекомбинантного GM-CSF, а увеличение уровня экспрессии приводит к задержке процессированного продукта в мембранной фракции клеток.

4. Сконструирован гибридный ген scaft-gmcsf. Установлено, что продукт его экспрессии не подвергается процессингу и локализуется в мембранной фракции клеток.

5. Исследована функциональная топография сайта расщепления сигнальной пептидазы в гибридных белках Cafl-GMCSF. Показано, что нейтрализация положительного заряда остатка Arg4 (в белке FGM13) или введение отрицательного заряда (в белке FGM14) приводит к повышению эффективности транслокации и процессинга. Впервые продемонстрирована возможность использования сигнальной последовательности капсульного антигена Fl Y.pestis для транспорта рекомбинантных белков в периплазматическое пространство Е. coli.

6. Разработана схема выделения N-концевых вариантов GM-CSF из 1 л культуры. Показано, что выделенные белки сохраняют нативную структуру и биологическую активность GM-CSF.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Л.Е.Петровская, А.В.Рузин, Л.Н.Шингарова, В.Г.Коробко. Конструировани рекомбинантных штаммов Escherichia coli, детерминирующих секреторную экспрессш искусственных генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующег фактора человека//Биоорган. химия. Т. 21. № 11. С. 845-854..

2. Л.Е.Петровская, Е.А.Крюкова, С.А.Якимов, А.Н.Вульфсон, Р.А.Алибаева Л.Н.Шингарова, А.А.Гузаев, В.М.Абрамов, В.Г.Коробко. Влияние топографии сайт: сигнальной пептидазы на эффективность секреции в периплазму Escherichia col рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактор; человека//Биорган. химия. 1995. Т. 21. № 12. С. 917-924.

3. L.E.Petrovskaya, E.A.Kryukova, L.N.Shingarova, V.G.Korobko. Study of the recombinan human GM-CSF heterologous secretion in E. coli//Avances en biotecnología moderna 1995. V. 3. P. III. 22/Тезисы докладов международной конференции "Biotechnology Havana'95". Гавана. 1995.

4. Л.Е.Петровская, ЕА.Крюкова, О.Е.Лахтина, В .А.Несмеянов, В.М.Абрамов, В.Г.Коробко Разработка иммуноферментной тест-системы для определения гранулоцитарно макрофагального колониестимулирующего фактора человека//Тезисы докладоЕ Всероссийской конференции "Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация." С. 43-44. Москва. 1995.

5. L.E.Petrovskaya, E.A.Kryukova, A.V.Khodyakov, V.G.Korobko. N-terminal derivatives о human GM-CSF exhibit full colony-forming activity on embryonic liver cells//J. o! Interferon and Cytokine Res. 1995. V. 15. S. 1. P. S131. Abstracts of 1995 Annua! Meeting of the ISICR.

Отпечатано на полиграфическом участке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Печать офсетная. Усл.п.л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ №110