Разработка эффективного способа получения рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения штамм-продуцента E.coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Гусарова, Валентина Дмитриевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2010
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
Гусарова Валентина Дмитриевна
Разработка эффективного способа получения рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения штамм-продуцента Е.соИ
02.00.10 «Биоорганическая Химия» 03.00.23 «Биотехнология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
2 5 НОЯ
Москва 2010
004614277
Работа выполнена на кафедре «Химия и технология биологически активных соединений им. Н.А.Преображенского» Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова и Опытном биотехнологическом производстве Учреждения российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.
Научные руководители: доктор химических наук, профессор
Миронов Андрей Федорович
доктор химических наук, Баирамашвили Дмитрий Ильич
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
Штильман Михаил Исаакович
кандидат биологических наук, Крымский Михаил Александрович
Ведущая организация: Федеральное Государственное унитарное предприятие Государственный научный центр Российской Федерации Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»).
Защита диссертации состоится «С» 2010 г в ч на заседании диссертаци-
онного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова, по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте http://mitht.ru Автореферат разослан « /» 2010 г.
Ученый секретарь к.х.н.. с.н.с.
диссертационного совета, Лютик Алла Игоревна
Список сокращений
GMP - good manufacturing practice, правила надлежащего производства. GSH — восстановленный глутатион. GSSG — окисленный глутатон.
SEC - size-exclusion chromatography, высокоэффективная гель-проникаюгцая хроматография.
АФС - активная фармацевтическая субстанция.
ВОЗ - всемирная организация здравоохранения.
ВМС — высокомолекулярные соединения.
ВЭЖХ- высокоэффективная жидкостная хроматография.
ВЭТТ — высота, эквивалентная теоретической тарелке (отношение числа
теоретических тарелок к длине хроматографичеекой колонки).
ДТТ - дитиотрешпол.
ОФ - обращснно-фазовый.
ПААГЭ - электрофорез в полиакриламидном геле. РБ - рекомбинантный белок. ТВ - тела включения;
Трис - трис(гидроксиметил)-аминометан; ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота; Ч.т.т. - число теоретических тарелок.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы.
Инсулин является одним из наиболее изученных гормонов. Этот полипептид синтезируется специализированными кластерами ß-клеток поджелудочной железы, называемых островками Лангерганса. Инсулин выполняет в организме ряд важных функций контроля метаболизма и гомеостаза глюкозы, оказывая влияние на экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы [Saltiel A.R., Pessin J.E. eds / Mechanism of Insulin Action. // Springer NY 2007. P.214]. Дефицит инсулина, который может быть вызван различными факторами, сопровождается развитием тяжелых патологических состояний организма, характеризующихся повышением уровня глюкозы в плазме крови, получивших название сахарного диабета (diabetes mellitus). По оценкам ВОЗ, более 220 млн. человек во всем мире больны диабетом [http://www.who.int/ mediacentre/factsheets/fs312/ги/]. К 2030 году эта цифра, вероятно, более чем удвоится.
Инсулиновая терапия интенсивно применяется для лечения больных ин-сулинозависимым сахарным диабетом типа I (около 10% от общего числа больных сахарным диабетом), а также используется для коррекции тех больных диабетом типа II, у которых нарушена секреция инсулина. Исходя из того, что средняя ежедневная доза инсулина в терапии сахарного диабета типа I лежит в пределах -1.4 - 2.1 мг (40-60 ME), легко подсчитать, что ежегодная потребность в инсулине составляет как минимум 11 тонн, и эта потребность ежегодно увеличивается на ~3 - 4% [Kjeldsen Т. / Yeast secretory expression of insulin precursors // Appl Microbiol Biotechnol. 2000. V.54(3). P.277-286.]. В
связи с этим до настоящего времени проводятся интенсивные исследования, направленные на оптимизацию технологии получения инсулина, получение производных с требуемыми потребительскими свойствами и совершенствование средств и способов направленной доставки гормона к клеткам-мишеням.
В нашей стране исследования в области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина.
В настоящее время предпринимаются попытки повысить эффективность процесса получения инсулина, однако высокий уровень биосинтеза рекомби-нантного белка в E.coli приводит к образованию нерастворимых и неактивных агрегатов, называемых телами включения (ТВ) [Middelberg A.P.J. / Preparative protein refolding // Trends Biotech. 2002. V.20(10). P.437-443], в состав которых входят не только целевые рекомбинантные белки (РБ), но и ряд бактериальных («балластных») белков. Поэтому для получения целевого компонента в натив-ном виде требуются определенные шаги для растворения таких агрегатов, выделения из них белка и его ренатурации. Способы проведения этих процедур во многом определяют специфику всего производства биофармацевтических белков и имеют существенное влияние на производственные затраты.
Цель исследования.
Основной целью данной работы была разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения РБ проинсулина человека из ТВ E.coli, ее оптимизация и разработка соответствующего метода контроля.
Задачи исследования.
1. Разработать и валидировать метод контроля содержания мономера РБ в растворах.
2. Изучить и оптимизировать процесс денатурации рекомбинантного белка из ТВ.
2.1. Определить тип хаотропного агента;
2.2. Определить оптимальное значение pH среды и тип буферной системы;
2.3. Определить концентрацию восстанавливающего агента и концентрацию РБ.
3. Исследовать и оптимизировать процесс ренатурации восстановленного РБ.
3.1. Определить максимальный выход нативного РБ;
3.2. Определить влияние внешних факторов (температура, pH);
3.3. Определить оптимальную концентрацию РБ;
3.4. Исследовать влияние низкомолекулярных добавок (L-аргинин, ЭДТА);
3.5. Исследовать влияние окислительно-восстановительных пар;
4. Масштабировать полученные результаты от аналитического до препаративного уровня.
Научная новизна.
1. Разработан метод внутрипроизводственного контроля содержания мономера РБ проинсулина человека в растворах восстановленного и рена-турированного РБ. Метод позволяет точно, правильно, специфично и воспроизводимо контролировать содержание и чистоту белка с молекулярной массой от 10 до 30 кДа и может использоваться для контроля и других биофармацевтических процессов.
2. Разработан эффективный процесс восстановления РБ проинсулина человека с использованием дитиотреитола и NH4OH в качестве источника свободных аминогрупп.
3. Разработана эффективная схема ренатурации РБ проинсулина человека, в которой минимизирована агрегация белка за счет добавления ЭД-ТА в раствор и максимизировано образование целевой нативной мономерной формы.
Практическая значимость работы.
Разработана эффективная технология выделения мономера рекомбинантного предшественника проинсулина человека из ТВ E.coli, состоящая из этапов денатурации и восстановления РБ с последующей его ренатурацией. Оптимизация восстановления позволила увеличить количество выделяемого из ТВ целевого белка со 110 до 165 г с 1 кг ТВ, минимизировать образование агрегатов РБ во время ренатурации и увеличить максимальный выход ренатури-рованного РБ с 70 до 85%, что привело к суммарному увеличению количества получаемого ренатурированного мономера РБ на 30%. При этом выход АФС инсулина увеличился с 220 до 300 г / мЗ культуральной жидкости.
Разработанная технология в настоящее время успешно реализуется на Опытном биотехнологическом производстве Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова.
Разработан и валидирован метод контроля содержания мономера РБ проинсулина человека в растворах на основе SEC. Метод обладает значительной мобильностью (ведение цикла определения при скорости 0.5 мл/мин; время цикла 25 минут), воспроизводимостью результатов, селективностью определения чистоты мономерной формы РБ внутри диапазона концентраций РБ в образце (2^-8) мг/мл.
Апробация работы.
Результаты исследований были изложены на XVI Менделеевской конференции молодых ученых (Уфа, Россия, 2006), Пятом Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2009) и Международной научной конференции SPICA2010 (Стокгольм, Швеция, 2010).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 9 статей в научных журналах.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 126 страницах. Текст содержит 37 рисунков и 8 таблиц. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Литературный обзор, Результаты и обсуждение, Материалы, приборы и методы, Выводы, Список опубликованных работ, Библиография, содержащая ссылки на 197 публикаций.
Содержание работы Результаты исследований и их обсуждение.
Выделение РБ из тел включения Е. coli
Рекомбинантные белки в составе ТВ находятся в агрегированной, неактивной форме. Технологический процесс получения РБ проинсулина включает растворение ТВ в присутствии хаотропного агента (например, 8 М мочевины), денатурацию целевого белка, восстановление дисульфидных связей и рена-турацию, сопровождающуюся образованием правильно-замкнутых дисульфидных связей, в ходе чего белок приобретает нативную конформацию (Рис. 1). Данный процесс сопровождается большим количеством побочных реакций агрегации мономера РБ, а также образованием ненативных межмолекулярных и внутримолекулярных дисульфидных связей. Описанные в литературе методы анализа позволяют оценить качество и количество белка в растворе только на финальном этапе процесса, что затрудняет оптимизацию его стадий.
Ренатурированный Восстановленный
препроинсулин (РБ) препроинсулин
Рис. 1. Схема выделения РБ проинсулина из ТВ E.coli.
В рамках исследовательской работы нами был разработан метод контроля содержания мономера РБ в растворах. Исходя из разницы в молекулярных массах мономера РБ (-17800 Да) и его мультимерных форм, наиболее подходящим методом для определения процентного содержания и концентрации мономера РБ в растворах восстановленного и ренатурированного белка является высокоэффективная эксклюзионная хроматография.
Разработка и валидация метода контроля содержания
мономера РБ
Для изучения хроматографического поведения мономера РБ предварительно был получен контрольный образец РБ с чистотой 99% путем двухступенчатой очистки (ионообменная хроматография, ВЭЖХ ренатурированного РБ. Чистоту контрольного образца анализировали при помощи ПААГЭ, ВЭЖХ. Масс-спектрометрически было подтверждено, что выделенный чистый препарат белка соответствует по молекулярной массе целевому РБ. Подбор условий аналитического разделения
Подвижная фаза представляла собой раствор ацетонитрила (15% по объему) и уксусной кислоты (15% по объему) в воде для инъекций, также в состав подвижной фазы был введен Ь-аргинин. Ацетонитрил был использован для увеличения смачиваемости частиц сорбента, уксусная кислота - для выполнения антибактериальных функций, а также в качестве буферного агента для поддержания рН системы в пределах от 2.5 до 3.5 (рекомендуемый производителем диапазон рН составляет 2.0-7.0), а Ь-аргинин - для повышения эффективности колонки. Нами продемонстрировано, что оптимальная концентрация Ь-аргинина в подвижной фазе составляет 7 мг/мл (Рис. 2). При этом эффективность колонки превышала 10 тыс. ч.т.т. (в выбранном диапазоне концентраций РБ), поэтому дальнейшее увеличение концентрации аминокислоты в подвижной фазе нецелесообразно.
д
-А-----_
10 мг/мл ЬАгд
1,0 мг/мл 1-Агд
0 мг/мл ЬАгд
^ а
Номинальная концентрация РБ в растворе, мг/мл
Е 6000 -
Концентрация [.-аргинина в подвижной фазе, мг/мл
Рис. 2. Сравнение эффективности хроматографической колонны в зависимости от концентрации Ь-аргинина в составе подвижной фаз.
Определение оптимальной скорости элюции проводили с помощью построения графической характеристики Ван Димтра. Для этого определяли величины ВЭТТ при различных скоростях потока, элюируя образец РБ, инжектированный в колонку во всех опытах в одинаковой концентрации. Показано, что
оптимальным является ведение процесса при скорости 0.5 мл/мин (60 см/ч), когда ВЭТТ была ниже 0.02 мм.
Валидация метода анализа
Разработанный метод анализа, основанный на применении колонны, упакованной силикагелем с привитой диольной фазой, обладает значительной мобильностью (ведение цикла определения со скоростью 0.5 мл/мин; время цикла 25 минут), воспроизводимостью результатов, селективностью определения чистоты мономерной формы РБ внутри диапазона концентраций РБ в образце (2^8) мг/мл. Значения систематического отклонения определения концентраций лежат в диапазоне от -6.50 до 4.63; значения коэффициента вариации изменяются от 4.43 до 10.25 %. Поскольку ни один из систематических показателей не выходит за рамки ограничения в 15%, установленного ВОЗ и ОМР, то метод можно считать правильным и точным. Воспроизводимость и повторяемость метода в диапазоне нескольких дней оценивались в течение 5 дней на восьми образцах с теми же концентрациями (каждый день готовились новые образцы) путем проведения по 4 определения каждого образца. Значения систематического отклонения изменялись от -2.99 до 3.38%; коэффициент вариации изменялся от 3.54 до 8.96%. Предел количественной оценки составил 0,1 мг/мл. При этом погрешность и коэффициент вариации составили -8.98 и 13.22% соответственно. Был установлен предел обнаружения равный 30 мкг/мл. Специфичность метода была продемонстрирована на опытных образцах с различными концентрациями белка, модельно загрязненного высокомолекулярными примесями. Для оценки устойчивости метода варьировались такие параметры, как скорость потока от 0.4 до 0.6 мл/мин; температура процесса от 18 до 22°С; состав подвижной фазы (содержание ацетонитрила от 10 до 20%, уксусной кислоты от 10 до 20%, Ь-аргинина от 6 до 8 мг/мл). В качестве параметров контроля были выбраны отношение площади пика мономера к его концентрации; коэффициент распределения. В ходе значительного числа экспериментов показано, что обе характеристики не выходят за рамки 2а. Метод БЕС может быть с успехом применен для анализа восстановленной формы РБ, ренатурированной формы, а также определения чистоты фракций после анионообменной очистки РБ. Кроме того, простота и селективность метода позволяют сделать вывод, что он может применяться и для контроля производства и других биофармацевтических белков.
При помощи данного метода был определен спектр примесей, образующийся во время денатурации/ренатурации восстановленного РБ (Рис. 3). Было обнаружено, что наибольшую часть агрегатов составляет димер целевого РБ (~35 кДа), также образуется небольшое количество тримеров (-53 кДа).
д л 1
"А _1 3 1
S 0,8]
x Й
8 о,б
0 ¡g
а
1 °'4' ®
I 0.2.
о
1_1
20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 m/z
Рис. 3. SEC-хроматограмма раствора ренатурированного РБ и Maldi TOF мономера РБ (В) и высокомолекулярных примесей (А).
Разработка эффективной схемы денатурации РБ
В качестве продуцента рекомбинантного белка проинсулина человека использовали штамм E.coli BL21(DE 3) / pPins 07 [Патрушев Л.И., Баирамашви-лиД.К, Мирошников А.И. //Патент Российской Федерации №2267534 2006].
Влияние хаотропного агента.
Для растворения ТВ и денатурации использовали такие хаотропные агенты, как 6 М гуанидин-HCl и 8 М мочевину. В качестве буферирующих агентов применяли растворы 25 мМ трис и 0.5% об. NH4OH. Поскольку гуанидин-HCl является хаотропным агентом более сильным, чем мочевина, то в нем ТВ растворялись быстрее. Время растворения составило 15 мин для обеих буферных систем. При этом содержание мономера РБ в полученном растворе превышало 58%. Для растворения ТВ в 8 М мочевине потребовалось больше времени. При использовании в качестве буферного агента 0.5% об. NH4OH для завершения процесса было достаточно 30 мин (содержание мономера РБ превысило 58%>); в 25 мМ трисе РБ растворился только после 3 ч, причем содержание мономера РБ не достигало и 50%).
Из сравнительной таблицы (Табл.1) видно, что для растворения ТВ предпочтительно использовать 6 М гуанидин-HCl, а не 8 М мочевину и 0.5%> об. NH4OH, а не 25 мМ трис.
Состав системы для растворения Время растворения, ч Содержание мономера РБ, % Концентрация мономера РБ, г/л
6 М гуанидин 25 мМ трис 0,25 58.70 41.53
6 М гуанидин 0.5% об. ТчИ4ОН 0,25 58.05 49.50
8 М мочевина 25 мМ трис 3 49.44 35.86
8 М мочевина 0.5% об. №1,011 0,5 58.51 45.80
В дальнейшем проводилась ренатурация всех образцов посредством 40-кратного разбавления в ренатурирующем буферном растворе (25 мМ трис, рН 10.0). В образцах с 6 М гуанидин-НС1 выход ренатурированного мономера РБ составил менее 10% (от теоретического), а в образцах с 8 М мочевиной более 40%. Как видно из представленных хроматограмм (Рис. 4), присутствие гуанидин-НС1 отрицательно сказывается на протекании процесса ренатура-ции и приводит к образованию большого количества агрегатов РБ. Таким образом, несмотря на хорошее растворение ТВ в 6 М гуанидин-НС1, данный хаотропный реагент не позволяет достичь высокого выхода мономера РБ при последующей ренатурации. Возможно, дополнительная стадия удаления гуа-нидин-НС1 (например, диализом или хроматографически) могла бы позволить избежать проблемы агрегации белка во время ренатурации. Однако добавление дополнительной стадии приведет к снижению общего выхода.
43.6
т V
ю 14 ми|[
1М 10 15 мин
Рис. 4. ЭЕС-определение содержания ренатурированного мономера РБ.Системы для восстановления: а) 8 М мочевина, 1 мМ ЭДТА, 0.5% об. ИНдОН; б) 6 М гуанидин-НС1, 0.5% об. МН4ОН. Пик 3 соответствует ренатурированному мономеру РБ, штриховой линией обозначен стандарт РБ.
Величина рН и буферная система
Отмытые ТВ растворяли при различных значениях рН в буферном растворе, содержащем 8 М мочевину, 0.1 М №2НР03, 0.1 М НаН2Р03, варьируя значение рН от 5.4 до 10.0, с одновременным восстановлением при помощи 10 мМ ДТТ. Обнаружено, что при рН менее 7.0 ТВ практически нерастворимы в данном буферном растворе. С ростом значения рН степень растворения увеличивается (табл.2.). Максимальная степень растворения достигалась при рН 10.0 и составляла 48% при концентрации мономера РБ около 41 мг/мл.
Таким образом, для солюбилизации предпочтительно использование растворов с высоким значением рН, что далеко от изоэлектрической точки ре-комбинантного белка. 8 М мочевина и основная среда дестабилизируют как ионные, так и гидрофобные взаимодействия, которые являются главной причиной агрегации белка в ТВ. Также ТВ солюбилизировались в растворе 8 М мочевины в присутствии источника свободных аминогрупп - 0.5% об. 1\1Н4ОН (рН~9.5), при этом степень растворения составляла более 56%, а концентрация мономера РБ - 44.9 мг/мл.
Табл.2. Растворение рекомбинантиого белка проинсулина человека в составе тел включения при различных значениях рН__
рН Содержание мономера РБ, % Концентрация мономера РБ, г/л
5.4 29.62 25.03
6.0 35.76 29.71
7.0 38.46 33.57
8.0 43.25 36.84
9.0 44.70 38.85
10.0 48.01 41.11
9.5* 56.16 44.89
* Восстановление в растворе 8 М мочевина, 0.5% об. 1ЧН4ОН.
Исследовали влияние буферной системы на степень восстановления РБ при рН 9.5-10.0 (растворение, сопровождающееся восстановлением 10 мМ ДТТ). Для этого использовали следующие буферные системы:
1) 0.1 М №2НР03+0.1 М №Н2РО.,, 0.2 М ЫаС1, 1 мМ ЭДТА, рН 9.5;
2) 25 мМ трис, 0.2 М ШС1, 1 мМ ЭДТА, рН 9.5;
3) 0.5% ШДШ, 1 мМ ЭДТА, рН 10.0.
4) 10 мМ глицин, 0.2 М №01, 1 мМ ЭДТА, рН 10.0;
Полученные данные представлены на Рис.5. Наиболее быстро и полно ТВ растворялись в 0.5% МЩОН, в 10 мМ глицине не удалось достичь удовлетворительного растворения (осадок нерастворенного РБ составил более 50%).
30,6
о ш со
10 0_
к
"Г
га &
I
Ф тг
I
о
30,0
32,0
30-»
51,9
; 20-
10-
50,2
56,4
42,3
5.13
си о.
55 |
о
-50
О ш со
2 3
Буферный агент
0> х
X
ТО -
£ Ш
45 § о О
40
Рис.5. Влияние буферной системы. (1) - 25 мМ трис; (2) - 0,1 М Ыа2НР03, 0,1 М МаН2Р03; (3) -0.5% ЫНдОН; (4) - 10 мМ глицин.
В дальнейшем проводили ренатурацию восстановленного РБ образцов 1-3. На основе полученных данных (Рис.6) можно сделать однозначный вывод, что буферная система на основе 0.1 МКа2НРОз+ОЛ М МаН2Р03, хотя и обеспечивает хорошее растворение и восстановление РБ, приводит к агрегации белка при последующей ренатурации. Таким образом, пригодными для восстановления являются буферные системы 25 мМ трис и 0.5% ]ЧН4ОН, однако предпочтительно использовать 0.5% МН4ОН из-за более полного растворения и восстановления РБ.
Рис.6. Ренатурация образцов РБ, растворенного в: (а) 25 мМ трис; (в) 0.5% МН4ОН; (с) 0.1 М Ма2НР03, 0.1 М №Н2Р03. На (А) и (В) пик 4 соотвествует мономеру ренатурированного РБ, пик 3 - восстановленному РБ, пики 1-2 - ВМС; на (С) пик 2 - ренатурированный РБ, пик 1 -ВМС.
Концентрация восстанавливающего агента и концентрация РБ Поскольку концентрацию восстанавливающего агента невозможно исследовать без учета концентрации РБ, то данное исследование проводилось в 2 этапа. На первом этапе варьировали концентрацию ДТТ при определенной концентрации РБ; на втором этапе при найденном оптимальном соотношении РБ/ДТТ меняли концентрацию РБ в растворе.
Для восстановления РБ использовали ДТТ в различной концентрации (110 мМ), при этом исходная концентрация РБ составляла 30.2 мг/мл. Из представленного графика (Рис. 7) следует, что максимальная степень восстановления РБ достигается при концентрации ДТТ 5 мМ и более и составляет около 60%. Затем исследовали влияние концентрации РБ на степень восстановления. Для этого изучали протекание процесса при различных степенях разбавления ТВ солюбилизирующим раствором. При этом концентрация ДТТ изменялась пропорционально концентрации РБ. Полученные данные представлены на Рис.8.
Рис.7. Влияние концентрации восстанавливающего агента на восстановление РБ
При концентрации РБ от 20 до 30 мг/мл (соотношение ТВ/раствор от 1/8 до 1/4) наблюдалось быстрое растворение ТВ, содержание мономера РБ после восстановления 5 мМ ДТТ составляло 60-62%. При этом с 1 кг ТВ было получено -170 г мономера РБ. Однако для промышленного выделения РБ из ТВ предпочтительно проводить процесс восстановления при высоких исходных концентрациях. При дальнейшем увеличении концентрации РБ для растворения требовалось больше времени и большее количество ДТТ для восстановления дисульфидных связей. При соотношении ТВ/раствор = 1/2 при концентрации ДТТ 10 мМ достигнуто содержание мономера РБ не выше 55%. Выход мономера РБ составил всего 140 г с 1 кг ТВ. При обеспечении соотношения ТВ/раствор = 1/3 получена концентрация мономера РБ 34.8 мг/мл (содержание мономера 54.71%) при концентрации ДТТ 5 мМ (выход 150 г мономера РБ с 1 кг ТВ); при увеличении концентрации ДТТ до
О
О
2 4 6 8
Концентрация ДТТ, мМ
т о
10 мМ достигнуто содержание мономера РБ 61.02, однако концентрация мономера РБ составила 37.6 мг/мл (выход 165 г мономера РБ с 1 кг ТВ).
Ш
о.
от о.
Ф
5 О X
о
<и
х
со
*
о.
ф
э
О
65 60 55 50 45 40 35 30 25 20
г 45
■ 40
35
30
25
20
15
О
X ф
X
ч
■О О)
2
0
1
о ф
■а 0)
"О
ОТ
1/2 1/3 1/4 1/6 1/8
Соотношение ТВ, г/солюбилизирующий р-р, мл
—о — Содержание мономера РБ,% ....... Концентрация мономера РБ г/л
Рис. 8. Восстановление при различном соотношении ТВ, г/солюбилизирующий раствор, мл.
Таким образом, в ходе работы были определены оптимальные условия денатурации (восстановления) РБ из ТВ:
- хаотропный агент 8 М мочевина;
- буферирующий агент 0.5% об. 1\ГН4ОН;
- восстанавливающий агент дитиотреитол в концентрации 10 мМ;
- соотношение ТВ/солюбилизирующий раствор 1/3.
При данных условиях содержание мономера РБ в растворе превышает 60%, а концентрация составляет -37 г/л, что соответствует выходу 165 г мономера РБ с 1 кг ТВ.
Разработка эффективной схемы ренатурации РБ
Определение максимального выхода
Для определения максимально возможного выхода нативного РБ проводили ренатурацию предварительно восстановленного рабочего стандарта РБ. В подобранных ранее условиях стандарт РБ в концентрации 35 г/л был восстановлен со 100% выходом (Рис. 9). Ренатурацию осуществляли при 40-кратном разбавлении образца в ренатурирующем буферном растворе 25 мМ триса (рН 10.0). Обнаружено, что во время ренатурации образуется -30% высокомолекулярных соединений, причем агрегация мономера необратима. Таким образом, установлен максимально возможный в условиях процесса выход нативного РБ 70%.
21 mV
15.4 mV
2
i
10
15
20
А 10
15 мин ß
Рис.9. Ренатурация стандарта РБ. (А) - восстановленный стандарт РБ; (В) - ренатурирован-ный стандарт РБ. 1 - агрегаты РБ; 2 - мономер РБ
Влияние на ренатурацию внешних факторов
Существенным фактором, определяющим выход на стадии ренатурации, является значение pH. Как правило, ренатурация белков с дисульфидными связями проводится при pH 8.0-9.0,что способствует образованию тиолатного аниона (рКа = 8.6) и облегчает тиол-дисульфидный обмен. Для определения оптимального значения pH ренатурацию проводили в буферном растворе 25 мМ трис в диапазоне pH 8.0-11.0. Как видно из полученного графика (рис.10), вопреки литературным данным при pH 8.0 выход ренатурированно-го мономера РБ не превышал 10%. При увеличении pH до 9.0 выход достигал 45%, а при pH 10.0-11.0 - более 60%. Таким образом, благоприятные для ренатурации условия обеспечиваются при значениях pH от 10.0 до 11.0. Хотя обычно температура сильно влияет на агрегацию, протеолитическую деградацию и химическую модификацию белков [Rudolph R. et al. / Folding proteins, p. 57-99 in Creighton T.E.Protein function, a practical approach // IRLPress, Oxford University Press Oxford 1997], нами показано, что ренатурация РБ не зависит от температуры. Изменение температуры влияет только на скорость процесса ренатурации, но не оказывает значительного влияния на выход ренатурированного РБ. При температуре +4°С для завершения ренатурации требовалось около 60-70 ч, при комнатной температуре - всего 24 ч. При этом выход ренатурированного мономера РБ в обоих случаях составлял 65-70% (Рис. 10).
ф
75
60
70-
68,7
2
0
т ^
¡-45-
§а
1 СО
^30
ч
о
-60-
15-
I <л
СТ5 ^
* ИЗ
1111 ф
ч
50-
-60
1-40
-20 1
А ^
8,0
9,0 10,0
рН
11,0
404
+6 +25
Температура, °С
Рис.10. Влияние внешних факторов на ренатурацию. (А) - величина рН; (В) - температура.
Влияние концентрации РБ
Одним из критических параметров при ренатурации является концентрация ренатурированного белка. В лабораторных условиях процесс проводят при крайне низкой концентрации РБ ~10мкг/мл для предотвращения образования агрегатов. Однако в промышленном масштабе крайне неудобно оперировать такими низкими концентрациями. Поэтому основной задачей был поиск сравнительно высокой концентрации РБ, при которой потери из-за агрегации уравновешиваются удобством дальнейшего использования раствора РБ высокой концентрации. Ренатурацию проводили методом разбавления восстановленного раствора РБ разной концентрации от 0.2 до 1.25 мг/мл в буферном растворе 25 мМ трис (Рис. 11). Как и ожидалось, выход ренатурированного мономера РБ снижался при увеличении исходной концентрации РБ за счет образования агрегатов. При 0.2 г/л был получен ренатурированный РБ с содержанием мономера 43.5% и выходом более 70%; при 1.25 г/л выход составил всего 61% при содержании мономера РБ 34%. Однако несмотря на хорошие результаты, полученные при 0.2 г/л, данная концентрация слишком низка для промышленного производства, поэтому была выбрана промежуточная концентрация РБ 0.8-1.0 г/л
72-,
о
ш СО
ш а.
ел а. аз 2 О X
о
7068666462-
-44 Ь" ьП О. -42 <о
О.
а>
-40 о —
о ° § ш
■38
-36 | а ш
-34 §■
О
0,2 0,4 0,6 0.8 1.0 1,2 Исходная концентрация РБ, г/л Рис.11. Влияние концентрации РБ на ренатурацию
Низкомолекулярные добавки в ренатурирующем растворе Наиболее часто используемой низкомолекулярной добавкой является L-аргинин [Chen J., Liu Y., Li X., Wang Y., Ding K, Ma G, Su Z. / Cooperative effects of urea and l-arginine on protein refolding //Protein Expression and Purification 2009. V.66. LI. P.82-90., Singh S. M, Panda A.K. / Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins // Journal of Bioscience and Bioengineering 2005. V.99. 1.4. P.303-310.]. В общем случае, аргинин в концентрации 0.1-1.0 М снижает содержание белковых агрегатов и таким образом увеличивает выход ренатурированного белка. Концентрацию L-аргинина в ренатурирующем буфере 25 М трис варьировали в пределах от 0.1 до 1.0 М. Вопреки ожиданиям, L-аргинин не оказал никакого положительного воздействия на процесс ренатурации (Рис. 12). В диапазоне концентраций L-аргинина 0.5 -1.0 М выход мономера РБ не превышал 10%; при концентрации L-аргинина ниже 0.5 .М - 15%.
27.1
mV !
10 15 Ю 15 мин
Рис.12. Ренатурация в присутствии 1_-аргинина: (А) 0.5 М; (В) 1.0 М. 1-2- высокомолекулярные соединения, 3 - неренатурированный мономер РБ, 4 - ренатурированный мономер РБ. Штриховой линией обозначен стандарт РБ.
Известно, что процесс ренатурации с окислением дисульфидных связей кислородом воздуха катализируется следовыми количествами ионов двухвалентных металлов в воздухе и растворе, причем побочные реакции агрегации ускоряются сильнее, нежели целевая реакция ренатурации. В ходе работы было сделано предположение, что выход ренатурированного мономера РБ при высоких исходных концентрациях РБ может быть увеличен при добавлении в ренатурирующий раствор ЭДТА, который будет связывать находящиеся в растворе ионы металлов. Для проверки этого исследовали влияние различных концентраций ЭДТА на образование агрегатов целевого белка. Концентрацию ЭДТА в ренатурирующем буфере изменяли в пределах от 0.1 до 10 мМ. Как видно из полученного графика (Рис. 13), зависимость выхода мономера РБ от концентрации ЭДТА имеет четко выраженный максимум в районе концентраций 0.1-0.5 мМ. При этом выход составил 75%, что на 10% превышает выход, полученный при ренатурации в отсутствие Т-аргинина.
Дальнейшее увеличение концентрации ЭДТА привело к образованию агрегатов и, соответственно, к снижению выхода до 30% при концентрации 10 мМ ЭДТА.
80-,
70-
ш о.
го
о.
ф
о
X
о
60-
50-
40Ч О х
-о 30-1 СО ^
20-
Г*
4 6
ЭДТА, мМ
ю
Рис.13. Ренатурация в присутствии ЭДТА.
Окислительно-восстановительные пары
Для оптимизации условий ренатурации протестированы различные низкомолекулярные тиолы при различном соотношении «окисленная/восстановленная форма», а именно: глутатион и цистеин/цистин.
Соотношение восстановленной (ОЭН) и окисленной (ОББв) форм глута-тиона в ренатурирующем растворе изменяли в пределах от 10/1 до 1/10, при сохранении максимальной общей концентрации глутатиона 10 мМ. Для оценки результатов использовали относительный выход ренатурированного РБ: за 1.0 был принят выход РБ без глутатиона. Как видно из полученных данных (Рис. 14), добавление глутатиона не приводит к желаемому увеличению выхода ренатурации. Несмотря на то, что обычно наиболее благоприятные условия для ренатурации создаются при избытке восстановленной формы, при соотношении ОЗН/ОББв =10/1 и 5/1 относительный выход составил лишь 0.67. Сходные результаты получены при избытке окисленной формы (ОБН/ОББС = 1/5 и 1/10).
1,00
0,94
0,58
0,67 0,67
-Г" о о
то
¡Ь
ю
ТГ
0,64 0,64
0,69
0,46
т-
-Го
1Й
о
Соотношение СЗН/0886
Рис.14. Ренатурация в присутствии глутатиона.
Также был изучен процесс ренатурации в присутствии другой окислительно-восстановительной пары - цистеин/цистин. Для оценки результатов использовали относительный выход ренатурированного РБ: за 1.0 был принят выход РБ в отсутствии цистеин/цистин. Как следует из полученных данных (Рис. 15), при ренатурации в присутствии высокой общей концентрации (5.0-10.0 мМ) тиолов выход ниже на 20%, чем при ренатурации без тиолов. При общей концентрации тиолов ниже 1.0 мМ наблюдалось увеличение выхода в среднем на 20%, причем как при соотношении цистеин/цистин = 0.1/0.5 мМ, так и при соотношении 0.5/0.1 мМ. Причем следует отметить, что в данном диапазоне концентраций окислительно-восстановительной пары выход ренатурированного мономера РБ составил 85%, что выше установленного ранее максимального выхода при ренатурации стандарта РБ! Это свидетельствует о том, что для достижения эффективного восстановления, сопровождающегося образованием нативных дисульфидных связей, целесообразно использовать не глутатион, а более низкомолекулярные вещества, такие как цистеин/цистин.
=t о
X Jj
m is л
X
J}
с
<D 1-
s
о о
X
1,31,ft 0,80,60,40,1
0,ft
1,26
1,27
1,00
0,87
0,80 Г~П 0,79 °'82
1,19
1,02
1,06
§
о Й о"
т-
p If)
й о d о
0,91
0,81
О IЛ
Й
о о
Соотношение цистин/цистеин, мМ/мМ
Рис.15. Ренатурация в присутствии пары цистеин/цистин.
Таким образом, в ходе работы были определены оптимальные условия ренатурациивосстановленного РБ:
- значение рН от 10.0 до 11.0;
- концентрация РБ от 0.8 до 1.0 мг/мл;
- концентрация ЭДТА 0.5 мМ;
- соотношение цистеин/цистин от 0.1/0.5 мМ до 0.5/0.1 мМ при общей концентрации тиолов 1.0 мМ.
В данных условиях был получен ренатурированный мономер РБ с 85%-м выходом.
Масштабирование результатов до препаративного уровня
Исходя из описанной выше оптимизации выделения РБ из тел включения, на производственном уровне мы применяли следующие условия:
1) Растворение и восстановление:
а) температура: комнатная;
б) хаотропный агент: 8 М мочевина;
в) буферирующий агент: 0.5% об. NH4OH;
г) восстанавливающий агент: ДТТ в концентрации 10 мМ;
д) соотношение ТВ/солюбилизирующий раствор: 1/3;
е) время восстановления: 1 ч
2) Ренатурация:
а) температура: +6 ± 1 °С;
б) значение рН 10;
в) концентрация РБ 1.0 мг/мл;
г) концентрация ЭДТА 0.5 мМ;
д) соотношение цистеин/цистин от 0.1/0.5 мМ до 0.5/0.1 мМ при общей концентрации тиолов 1.0 мМ;
е) время ренатурации: 60 ч.
ТВ в количестве 18.5 кг были успешно растворены, содержание мономера РБ составило 56.72% (Рис. 16), концентрация мономера РБ - 35.13 г/л, что соответствует выходу 140.5 г РБ с 1 кг ТВ. После ренатурации был получен раствор ренатурированного мономера РБ с содержанием 43.37% и концентрацией 0.91 г/л, при этом выход составил 82.4%.
140i
120100-во-
604020-G
-20
56.72%
50-
40-
>
Е
» 30-
Z3
<
20-
В 10-
43.37%
10 15 20 Время, МИН
10 15 20
Время, мин
Рис.16. Промышленное выделение РБ из тел включения.
(А) - хроматограмма восстановленного РБ; (В) - хроматограмма ренатурированного РБ. Цветом указан пик, соответсвующий мономеру целевого РБ, цифры обозначают его процентное содержаниею
Выводы.
1. Разработан и валидирован метод контроля содержания мономера РБ в растворах. Метод основан на эксклюзионной хроматографии. Достоверность результатов анализа была подтверждена валидационной процедурой, в ходе которой оценивались линейность, правильность, точность, предел обнаружения, нижний предел количественной оценки, специфичность, устойчивость к изменению температуры и составу подвижных фаз.
2. Изучен и оптимизирован процесс денатурации рекомбинантного белка проинсулина человека из ТВ E.coli.
2.1. Определен хаотропный агент - 8 М мочевина, - наиболее подходящий для денатурации РБ.
2.2. Определен состав буферной системы для растворения ТВ; 0.5% об. NH4OH (pH -9.5).
2.3. Определено оптимальное соотношение ТВ / солюбилизирующий раствор, составившее 1/3. При этом концентрация мономера РБ составляет ~35 г/л.
2.4. Определена оптимальная концентрация восстанавливающего агента дитиотреитола, составившая 10 мМ.
3. Исследован и оптимизирован процесс ренатурации восстановленного
РБ.
3.1. При ренатурации восстановленного рабочего стандарта РБ был определен максимальный выход нативного РБ, составивший 70%.
3.2. Исследовано влияние внешних факторов на ренатурацию РБ. Определено оптимальное значение рН ренатурирующего раствора, которое составило 10.0. Определена оптимальная температура для проведения ренатурации, составившая температура: +6 ± (-1)°С.
3.3. Определена оптимальная концентрация РБ, составившая 1.0 мг/мл.
3.4. Исследовано влияние низкомолекулярных добавок (L-аргинин и ЭДТА) на протекание ренатурации. Несмотря на то, что наиболее часто используемой низкомолекулярной добавкой является L-аргинин, он не оказал никакого положительного эффекта на ренатурацию в диапазоне рекомендуемых концентраций 0.1 до 1.0 М. Определена оптимальная концентрация ЭДТА в ренатурирующем растворе, которая составила 0.5 мМ.
3.5. Исследовано влияние окислительно-восстановительных пар на протекание ренатурации. Использование глутатиона при различных соотношениях восстановленной и окисленной форм не привело к увеличению выхода нативного РБ. Для окислительно-восстановительной пары цистеин/цистин определено оптимальное соотношение, составившее от 0.1/0.5 мМ до 0.5/0.1 мМ при общей концентрации тиолов 1.0 мМ, что позволило увеличить выход ренатурированного мономера РБ до 85%.
4. Полученные результаты масштабированы до препаративного уровня, что позволило получать раствор ренатурированного мономера РБ с концентрацией не менее 0.9 г/л с выходом 80 %.
Разработанная технология выделения РБ из тел включения E.coli позволила увеличить количество получаемого ренатурированного мономера РБ па 30%. При этом суммарный выход АФС инсулина увеличился с 220 до 300 г инсулина /м3 кулыпуральной жидкости.
Разработанная технология в настоящее время успешно реализуется на Опытном биотехнологическом производстве Учреждения российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинпикова.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. V.Gusarova, T.Vorobjeva, D.Gusarov, V.Lasman, D.Bayramashvili / Size-exclusion Chromatography Based on Silica-diol for the Analysis of the Proinsulin Fusion Protein // Journal of Chromatography A, 2007, v. 1176, pp.157-162.
2. Гусаров Д.А., Гусарова В.Д., Баирамашвши Д.И., Миронов А. Ф. / Генно-инженерный инсулин и его фармацевтические аналоги // Биомедицинская Химия. 2008. Т.54. №6. С.624-642.
3. Гусаров Д.Л., Гусарова В.Д., Михалев A.B., Ласман В.А., Баирамашвили Д.И., Миронов А.Ф., Сенаторова Н.К., Сенаторов A.B. / Валидация метода контроля производства генно-инженерного инсулина человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №1. С.55-61.
4. Гусаров Д.А., Гусарова В.Д., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И. / Инсу-лины пролонгированного действия: структура и фармакологический эффект П Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №1. С.3-11.
5. Гусарова В.Д., Гусаров Д.А., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И., Ми-рошников А.И. / Оптимизация промышленного получения рекомби-нантного предшественника инсулина человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №4. С.510-518.
6. Воробьева Т.В., Гусарова В.Д., Ласман В.А., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И / Контроль производства рекомбинантного препроинсулина с помощью электрофореза в полиакриламидном геле // Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №3, С.36-43.
7. Gusarov D., Nekipelova V., Gusarova V., Lasman V., Bayramashvili D., /Displacement Effect During HPLC Preparative Purification of Human Insulin//J. Chromatogr. B, 2009, v. 877, pp.1216-1220.
8. Гусарова В.Д., Миронов А. Ф. / Выделение рекомбинантных белков из тел включения бактериальных продуцентов // Биофармацевтический Журнал. 2010. Т.2. №1, С.14-29.
9. Гусарова В.Д., Михалев A.B., Воробьева Т.В., Гусаров Д.А. / Разработка аналитического контроля производства мономера рекомбинантного препроинсулина // Биофармацевтический Журнал. 2010. Т.2. №5, С. 1624.
Ю.Гусарова В Д. / Оптимизация процесса получения генноинженерного инсулина человека из препроинсулина в производстве активной субстанции // XVI Менделеевская конференция молодых ученых, материалы конференции, Уфа, Россия, 2006.
11 .Гусарова В.Д., Гусаров Д.А., Воробьева Т.В., Ласман В.А., Баирамашвили Д.И. / Оптимизация фолдинга и рефолдинга рекомбинантного препроинсулина // Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, Россия, 2009.
12. Gusarova V., Gusarov D., Bairamashvili D. / Application of SE HPLC as a main method of recombinant proteins in-process control // SPICA, материалы конференции, Стокгольм, Швеция, 2010.
Подписано в печать 14.10.2010 Формат 60x84 1/16
Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 775
Типография издательства «Фолиум» 127238, Москва, Дмитровское ш., 58
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.Образование тел включения.
1.1 .Особенности биосинтеза рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках.
1.2. Выделение тел включения.
1.3. Растворение тел включения.
1.4. Очистка растворенных белков тел включения.
2. Ренатурация белков тел включения.
2.1. Удаление денатуранта.
2.2. Хроматографическая ренатурация.
2.2.1 .Эксклюзионная хроматография.
2.2.2. Адсорбционная ренатурация.
2.2.3. Ренатурация с иммобилизированными катализаторами фолдинга
2.3. Ренатурация белков с дисульфидными связями.
2.4. Влияние физических факторов на ренатурацию.
2.5. Ренатурация с низкомолекулярными добавками.
2.6. Ренатурация, имитирующая процесс in vivo.
2.6.1. Природные шапероны.
2.6.2. Мицеллярные системы.
2.6.3. Жидкий парафин как псевдолипидний бислой.
3. Получение генноинженерног инсулина человека из ТВ E.coli.
3.1. Методы получения рекомбинантных блков проинсулина.
3.2. Фолдинг рекомбинантных белков проинсулина.
3.2.1. Восстановление.
3.2.2. Сульфитолиз.
3.2.3. Метод мини-проинсулина.
ОБСУЖДЕНИЕ И РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Постановка задачи.
2. Разработка внутрипроизводственного контроля содержания мономера РБ в растворах.
2.1. Получение стандартного образца мономера РБ.
2.2. Подбор условий аналитического разделения мономера РБ и его мультимерных форм.
2.2.1. Подвижная фаза.
2.2.2. Определение оптимальной скорости элюции.
2.3. Валидация метода анализа.
2.3.1. Линейность определения концентрации РБ.
2.3.2. Правильность и точность.
2.3.3.Пред ел обнаружения и предел количественной оценки.
2.3.4.Специфичност ь.
2.3.5.Устойчивость метода.
2.4. Выводы.
3. Денатурация РБ.
3.1. Денатурация РБ: влияние хаотропного агента.
3.2. Денатурация РБ: рН и буферная система.
3.3. Денатурация РБ: концентрация восстанавливающего агента и концентрация РБ.
4. Ренатурация восстановленного РБ.
4.1. Ренатурация РБ: определение максимального выхода.
4.2.Ренатурация РБ: влияние внешних факторов.
4.3. Ренатурация РБ: концентрация РБ.
4.4. Ренатурация РБ: низкомолекулярные добавки.
4.5. Ренатурация РБ: окислительно-восстановительные пары.
5. Масштабирование результатов до препаративного уровня.
МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ПРИБОРЫ.
1. Материалы.
1.1. Реактивы.
1.2. Хроматографические сорбенты и колонны.
2. Приборы.
2.1. Хроматографические системы.
2.2. Оборудование.
3. Методы.
3.1. Контроль содержания мономера РБ методом SEC.
3.2. Получение рабочего стандарта РБ.
3.2.1. Выделение РБ из ТВ.
3.2.2.Проведение ионообменной очистки.
3.2.3.Проведение ВЭЖХ-очистки.
3.3. Валидация SEC-анализарекомбинантного белка.
3.3.1. Линейность определения концентрации РБ.
3.3.2. Правильность и точность.
3.3.3. Специфичность.
3.3.4. Устойчивость метода.
4. Оптимизация денатурации-восстановления РБ.
4.1. Влияние хаотропного агента.
4.2. Влияние рН среды и буферного агента.
4.3. Влияние концентрации восстанавливающего агента и РБ.
5. Оптимизация ренатурации восстановленного РБ.
5.1. Определение максимального выхода ренатурации.
5.2. Определение влияния внешних факторов на ренатурацию.
5.3. Определение влияния концентрации РБ на ренатурацию.
5.4. Влияние низкомолекулярных добавок.
5.5. Влияние окислительно-восстановительных пар.
6. Масштабирование результатов до препаративного уровня.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.
Инсулин является одним из наиболее изученных гормонов. Этот полипептид синтезируется специализированными кластерами ß-клеток поджелудочной железы, называемых островками Лангерганса. Инсулин выполняет в организме ряд важных функций контроля метаболизма и гомеостаза глюкозы, оказывая влияние на экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы [1]. Дефицит инсулина, который может быть вызван различными факторами, сопровождается развитием тяжелых патологических состояний организма, характеризующихся повышением уровня глюкозы в плазме крови, получивших название сахарного диабета (diabetes mellitus). По оценкам Всемирной организации здравоохранения, более 220 млн. человек во всем мире больны диабетом [2]. К 2030 году эта цифра, вероятно, более чем удвоится. Инсулиновая терапия интенсивно применяется для лечения больных инсули-нозависимым сахарным диабетом типа I (около 10% от общего числа больных сахарным диабетом), а также используется для коррекции тех больных диабетом типа II, у которых нарушена секреция инсулина. Исходя из того, что средняя ежедневная доза инсулина в терапии сахарного диабета типа I лежит в пределах -1.4 - 2.1 мг (40-60 ME). Легко подсчитать, что ежегодная потребность в инсулине составляет ~11 тонн только для больных сахарным диабетом I типа, и эта потребность ежегодно увеличивается на -3 - 4% [3]. В связи с этим проводятся интенсивные исследования, направленные на улучшение методов производства инсулина, получение производных с требуемыми потребительскими свойствами и совершенствование средств и способов его доставки.
Длительное время (с момента открытия в 1920 году) инсулин получали, в основном, экстракцией из поджелудочных желез животных. Такой подход сдерживал развитие терапии диабета, поскольку из одной поджелудочной железы свиньи можно выделить -150 мг этого гормона. Кроме того, использование недостаточно очищенного инсулина животных часто сопровождалось развитием у пациентов осложнений в виде иммунного ответа на гетеро-логичный пептид, к тому же содержащий примеси проинсулина. Поскольку молекулы инсулина свиней и человека различаются только одним аминокислотным остатком (А1а/ТЬг в положении ВЗО) (рис.1), был разработан полусинтетический метод изменения последовательности свиного инсулина с использованием ферментативной реакции транспептидации [4]. Значительный прогресс в производстве инсулина, как и других терапевтических белков, был достигнут с применением генно-инженерных методов для создания соответствующих трансгенных микроорганизмов.
Главный успех генной инженерии заключается в разработке бактериальных экспрессионных систем, в частности на основе штамм-продуцента E.coli, способных производить большие количества белка при помощи технологии рекомбинантных ДНК [6, 7]. Как правило, запас большинства белков, имеющих потенциальное клиническое или промышленное значение, ограничивается их малой природной доступностью. В свете этого кажется очевидным использование данной технологии как гаранта неограниченного запаса рекомбинантных белков. Так в 80-е годы XX века американской компанией Genentech разработана технология производства генно-инженерного инсулина человека (ГИЧ), которая впоследствии была коммерциализирована корпорацией Eli Lilly [8]. К лидирующим производителям ГИЧ относятся такие за рубежные фирмы, как Eli Lilly (США), Sanofi-Aventis (Германия-Франция), Novo Nordisk (Дания). В нашей стране исследования в области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина.
В настоящее время предпринимаются попытки повысить эффективность процесса получения инсулина, однако высокий уровень биосинтеза рекомби-нантного белка в E.coli приводит к образованию нерастворимых и неактивных агрегатов, называемых телами включения (inclusion bodies, ТВ) [9, 10, 11]], в состав которых входят не только целевые рекомбинантные белки (РБ), но и ряд бактериальных («балластных») белков. Поэтому для получения целевого компонента в нативном виде требуются определенные шаги для растворения таких агрегатов, выделения из них белка и его ренатурации. Способы проведения этих процедур во многом определяют специфику всего производства биофармацевтических белков и имеют существенное влияние на производственные затраты.
Основной целью данной работы была разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения E.coli, ее оптимизация и разработка соответствующего метода контроля.
В соответствии с поставленной .целью были определены следующие задачи исследования:
1. Разработать и валидировать метод контроля содержания мономера РБ в растворах.
2. Изучить и оптимизировать процесс денатурации рекомбинантного белка из ТВ.
2.1. Определить тип хаотропного агента;
2.2. Определить оптимальное значение рН среды и тип буферной системы;
2.3. Определить концентрацию восстанавливающего агента и концентрацию РБ.
3. Исследовать и оптимизировать процесс ренатурации восстановленного РБ.
3.1. Определить максимального выхода нативного РБ;
3.2. Определить влияние внешних факторов (температура, рН);
3.3. Определить оптимальную концентрацию РБ;
3.4. Исследовать влияние низкомолекулярных добавок (Ь-аргинин, ЭД-ТА);
3.5. Исследовать влияние окислительно-восстановительных пар;
4. Масштабировать полученные результаты от аналитического до препаративного уровня.
Литературный обзор
Выводы
1. Разработан и валидирован метод контроля содержания мономера РБ в растворах. Метод основан на эксклюзионной хроматографии. Достоверность результатов анализа была доказана валидационной процедурой, в ходе которой оценивались линейность, правильность, точность, предел обнаружения, нижний предел количественной оценки, специфичность, устойчивость к изменению температуры и составу подвижных фаз.
2. Изучен и оптимизирован процесс денатурации рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения E.coli.
2.1. Определен хаотропный агент - 8 М мочевина, - наиболее подходящий для денатурации РБ.
2.2. Определен состав буферной системы для растворения ТВ: 0.15% об. NH4OH (pH -9.5).
2.3. Определено оптимальное соотношение ТВ / солюбилизирующий раствор, составившее 1/3. При этом концентрация мономера РБ составляет -25 г/л.
2.4. Определена оптимальная концентрация восстанавливающего агента ди-тиотреитола, составившая 10 мМ.
3. Исследован и оптимизирован процесс ренатурации восстановленного РБ.
3.1. При ренатурации восстановленного рабочего стандарта РБ был определен максимальный выход нативного РБ, составивший 70%.
3.2. Изучено влияние внешних факторов на ренатурацию РБ. Определено оптимальное значение pH ренатурирующего раствора, которое составило 10.0. Оценена оптимальная температура для проведения ренатурации, составившая температура: +6 ± 1 °С.
3.3. Определена оптимальная концентрация РБ, составившая 1.0 мг/мл.
3.4. Исследовано влияние низкомолекулярных добавок (L-аргинин и ЭДТА) на протекание ренатурации. Несмотря на то, что наиболее часто используемой низкомолекулярной добавкой является Ь-аргинин, он не оказал никакого положительного эффекта на ренатурацию в диапазоне рекомендуемых концентраций 1 до 10 М. Определена оптимальная концентрация ЭДТА в рена-турирующем растворе, которая составила 0.1 мМ.
3.5. Исследовано влияние окислительно-восстановительных пар на протекание ренатурации. Использование глутатиона при различных соотношениях восстановленной и окисленной форм не привело к увеличению выхода на-тивного РБ. Для окислительно-восстановительной пары цистеин/цистин определено оптимальное соотношение, составившее от 0.1/0.5 мМ до 0.5/0.1 мМ при общей концентрации тиолов 1.0 мМ, что позволило увеличить выход ренатурированного мономера РБ до 85%.
4. Полученные результаты масштабированы до препаративного уровня, что позволило получить раствор ренатурированного мономера РБ концентрацией 0.91 г/л с выходом 82.4%.
Разработанная технология выделения РБ из тел включения Е.соИ позволила увеличить количество получаемого ренатурированного мономера РБ на 30%. При этом суммарный выход АФС инсулину увеличился со 210 до 300 г инсулина / м3 культуральной жидкости.
Разработанная технология в настоящее время успешно реализуется на Опытном биотехнологическом производстве Учреждения российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М'.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова.
Список опубликованных работ
Опубликованные статьи:
1. V. Gusarova, T.Vorobjeva, D.Gusarov, V.Lasman, D.Bayramashvili / Size-exclusion Chromatography Based on Silica-diol for the Analysis of the Proinsulin Fusion Protein I I Journal of Chromatography A, 2007, v. 1176, pp. 157-162.
2. Гусаров Д.А., Гусарова В.Д., Баирамашвши Д.И., Миронов А.Ф. / Генно-инженерный инсулин и его фармацевтические аналоги // Биомедицинская Химия. 2008. Т.54. №6. С.624-642.
3. Гусаров ДА., Гусарова В.Д., Михалев A.B., Ласман В.А., Баирамашвили Д.И.,.Миронов А.Ф., Сенаторова Н.К., Сенаторов A.B. / Валидация метода контроля производства генно-инженерного инсулина человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №1. С.55-61.
4. Гусаров ДА., Гусарова В.Д., Миронов А. Ф., Баирамашвили Д.И. / Инсу-лины Пролонгированного Действия: Структура и Фармакологический Эффект// Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №1. С.3-11.
5. Гусарова В. Д., Гусаров Д.А., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И., Ми-рошников А.И. / Оптимизация Промышленного Получения Рекомби-нантного Предшественника Инсулина Человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №4. С.510-518.
6. Воробьева Т.В., Гусарова В Д., Ласман В.А., Миронов А.Ф., Баирамашвили ДИ / Контроль производства рекомбинантного препроинсулина с помощью электрофореза в полиакриламидном геле // Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №3, С.36-43.
7. Gusarov D., Nekipelova V., Gusarova V., Lasman V., Bayramashvili D., /Displacement Effect During HPLC Preparative Purification of Human Insulin//J. Chromatogr. B, 2009, v. 877, pp. 1216-1220.
8. Гусарова В.Д., Миронов А. Ф. / Выделение рекомбинантных белков из тел включения бактериальных продуцентов // Биофармацевтический Журнал. 2010. Т.2. №1, С. 14-29.
9. Гусарова В. Д., Михалев A.B., Воробьева Т.В., Гусаров Д. А. /Разработка аналитического контроля производства мономера рекомбинантного препроинсулина // Биофармацевтический Журнал. 2010. Т.2. №5, С. 1624.
Опубликованные тезисы докладов и конференций:
1. Гусарова В.Д. / Оптимизация процесса получения генноинженерного инсулина человека из препроинсулина в производстве активной субстанции // XVI Менделеевская конференция молодых ученых, материалы конференции, Уфа, 2006. I
2. Гусарова В.Д., Гусаров Д. А., Воробьева Т.В., Ласман В. А., Баирамашви-лиД.И. / Оптимизация фолдинга и рефолдинга рекомбинантного препроинсулина // Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2009.
3. Gusarova V., Gusarov D., Bairamashvili D. / Application of SE HPLC as a main method of recombinant proteins in-process control // SPICA, материалы конференции, Стокгольм, 2010.
1.R., Pessin J.E. eds / Mechanism of 1.sulin Action. // Springer NY 2007. P.214.2 http://wvvw.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/ru/
2. Kjeldsen T. / Yeast secretory expression of insulin precursors // Appl Microbiol Biotechnol. 2000. V.54(3). P.277-286.
3. Ю.А. Овчинников / Биоорганическая химия // M: «Просвещение» 1987. стр.41 -42, 67-68, 247-249.
4. F. Sanger / Chemistry of insulin// Science 1959. V.129, P. 1340-1344.
5. Kane J.F., Hartley D.L. / Properties of inclusion bodies from recombinant Escherichia coli. // Biochem Soc Trans. 1988. V.16(2). P.101-102.
6. Marston F.A. O. / The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.//Biochem J. 1986. V.240(l). P.l-12.
7. Middelberg A.P.J. / Preparative protein refolding // Trends Biotech. 2002. V.20(10). P.437-443.
8. Taylor G., Hoare M, Gray D. R., Marston F. A. O. / Size and density of protein inclusion bodies // Bio/Technol 1986. V.4. P.553-557.
9. Schein С. / Solubility as a function of protein structure and solvent components // Biotechnology (NY). 1990. V.8(4). P.308-317.
10. Staehelin Т., Hobbs D. S., Kung H.-F., Pestka S. / Purification of recombinant human leukocyte interferon (IFLrA) with monoclonal antibodies // Methods Enzymol. 1981. V.78(Pt A). P.505-512.
11. Misawa S., Kumagai L / Refolding of therapeuyic proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies // Biopolimers (Peptide Science) 1999. V.51. Р.297-307/
12. Л.И. Патрушев / Искусственные генетические системы, т.1 Генная и белковая инженерия // М: «Наука». 2004.
13. Ming Li, Zhi-Guo Su, and Janson J.-C. / In vitro protein refolding by chromatographic procedures // Protein Expression and Purification 2004. V.33. P.l-10.
14. Mukhopadhyay A. / Inclusion bodies and purification of proteins in biologically active forms. //Adv Biochem Eng Biotechnol. 1997. V.56. P.61-109.
15. Fischer, В.; Sumner, /.; Goodenough, P. / Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. // Biotechnol Bioeng. 1993. V.41(l). P.3-13.
16. Datar, R. V.; Cartwright, Т.; Rosen, C.-G. / Process economics of animal cell and bacterial fermentations: a case study analysis of tissue plasminogen activator//Biotechnology (N Y) 1993. V.ll(3). P.349-357.
17. Gross, G.; Hollatz, I. / Coliphage lambda to terminator lowers the stability of messenger RNA in Escherichia coli hosts // Gene 1988. V.72(l-2). P.119-128.
18. Sowers G., Jarsch M. / Alternative regulation principles for the production of recombinant proteins in Escherichia coli // Appl Microbiol Biotechnol. 1996. V.46(l). P.1-9.
19. GoldL., Stormo G. D. / High-level translation initiation // Methods En-zymol. 1990. V.185. P.89-93.
20. Gottesman S. / Minimizing proteolysis in Escherichia coli: genetic solutions // Methods Enzymol. 1990. V.185. P.l 19-129.
21. Nygren P.-A., Sthl S., Uhlen M. / Engineering proteins to facilitate bio-processing//Trends Biotechnol. 1994. V.12(5). P.184-188.
22. Schein C. / Solubility as a iiinction of protein structure and solvent of protein structure and solvent components. // Bio/Technology 1990. V.8. P.308-317/
23. Kane J. F., and Hartley D. L. / Formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia coli // Tibtech 1988. V.6. P.95-101.
24. Wilkinson D. L., and Harrison R. G. / Predicting the solubility ofrecom-binant proteins in Escherichia coli. // Bio/Technology 1991. V.9. P.443-448.
25. Gribskov M. and Burgess R. R. / Overexpression and purification of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase. // Gene 1983. V.26. P.109-118
26. Kiefliaber T., Rudolph R., Kohler H.-H., and Buchner J. / Protein aggregation in vitro and in viva: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. //Bio/Technology 1991. V.9. P.825-829.
27. Kopetzki, E., Schumacher, C., and Bucket, P. / Control of formation of active soluble or inactive insoluble baker's yeast alpha-glucosidase PI in Escherichia coli by induction and growth conditions. // Mol. Gen. Genet. 1989. V.216. P.149-155.
28. Cabilly S. / Growth at sub-optimal temperatures allows the production of functional antigen-binding Fab fragments in Escherichia coli. // Gene 1989. V.85. P.553-557.
29. Fahey R. C., Hunt, J. S. and Windham, C. C. / On the cysteine and cystine content of proteins. Differences between intracellular and extracellular proteins. // J. Mol. Evol. 1977. V.10. P.155-163.
30. Rudolph R., and Fuch ,1. / Influence of glutathione on the reactivation of enzymes containing cysteine. // Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1983. V/364. P.813-820.
31. Derman A. I., Prinz W., Belin D., andBeclcwith J. / Mutations that allow disulfide bond formation in the cytosol of Escherichia coli. // Science 1993. V.262. P. 1744-1747.
32. Skerra A., and Pluckthun A. / Assembly of a functional immunoglobulini
33. Fv fragment in Escherichia coli. // Science 1988. V.240. P.1038-1042.
34. Pluckthun A. / Antibody engineering: Advances from the use of Escherichia coil expression systems. // Bio/Technology 1991. V.9. P.545-551.
35. Bardwel, J. C. A., McGovem K., and Beckwith J. / Identification of a protein required for disulfide bond formation in viva. // Cell 1991. V.67. P.581-589.
36. Missiakas D., Schwager F., and Raina S. / Identification and characterization of a new disulfide isomerase-like protein (DsbD) in Escherichia coli. // EMBO J. 1995. V.14. P.3415-3424.
37. Rudolph R. / Successful protein folding on an industrial scale. In Protein Engineering: Principles and Practices // (Cleland J. L., and Craik Ch. S., eds) John Wiley & Sons(NY) P.283-298.
38. Kuhelj R., Dolinar M., Pungerrcar J., and Turk V. / The preparation of catalytical active human cathepsin B from its precursor expressed in Escherichia coli in the form of inclusion bodies. // Eur. J. Biochem. 1995. V.229. P.533-539.
39. Hejnaes K. R., Bayne S., Norskoy L., Sorensen H. H., Thomsen J., Schaff er L., Wollmer A., and Skriver L. / Development of an optimized refolding process for recombinant Ala-Clu-IGF-1. // Protein Eng. 1992. Y.8. P.797-806.
40. Vallejo L.F., Rinas U. / Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins // Microbial Cell Factories 2004. V.3 P.l 1.
41. Hart R. A., Rinse U., and Bailey J. E. / Protein composition of Vitreo-sciiia hemoglobin inclusion bodies produced in Escherichia coli. // J. Biol. Chem. 1990. V.265. P.12728-12733.
42. Valax P. and Georgiou G. / Molecular characterization of beta-lactamase inclusionbodies produced in Escherichia coli. 1. Composition. // Biotechnol. Prog. 1993. V.9. P.539-547.
43. Oberg K., ChrunykA., Wetzel R., and Fink A. / Native-like secondary structure in interleukin-1 inclusion bodies by attenuated total reflectance FTIR. //Biochemistry 1994. V.33. P.2628-2634.
44. Przybycien T. M., Dunn J. P., Valax, P. and Ceorgiou, C. / Secondary structure characterization of -lactamase inclusion bodies. // Protein Eng. 1994. V.l.P.131-136.
45. Hagel P., Gerding J.J. T., Fieggen W., Bloemendal H. / Cyanate formation in solutions of urea I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. // Biochim Biophys Acta 1971. V.243. P.366-373.
46. Cejka J., Vodrazka Z, SalakJ. / Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. // Biochim Biophys Acta 1968. V.154. P.589-591.
47. Iwakura M., Ohara K, Kokubu T., Ohashi S., Izutsu H. / Expression and purification of growth hormone-releasing factor with the aid of dihydrofolate reductase handle. //J Biochem (Tokyo) 1992. V.112. P57-62.
48. Patra A.K., Mukhopadhyay R., Mukhija R., Krishnan A., Garg L. C., Panda A.K. / Optimization of inclusion body solubilization and renaturation of recombinant human growth hormone from Escherichia coli. // Protein Expr Purif 2000. V.18. P.182-192.
49. Thatcher D.R., Hitchcock A. / Protein folding in biotechnology. In Mechanisms of protein refolding Edited by: Pain HR. // Oxford: Oxford University Press 1994. P.229-254.
50. Stockei J., Döring K., MalotkaJ., J ähnig F., Dornmair K. I Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. // Eur J Bio- • chem. 1997. V.248(3). P.684-691.
51. Cardamone M., Puri N.K., Brandon M.R. / Comparing the refolding and reoxidating of recombinant porcine growth hormone from a urea denaturated state and from Escherichia coli inclusion bodies // Biochemistry 1995. V.34. P.5773-5794.
52. Puri N. K. et. al. / Solubisation of growth hormone and other recombinant proteins from Escherichia coli inclusion bodies by using a cationic surfactant// Biochem. J. 1992. V.285. P.871-879.
53. Burgess R.R. / Purification of overproduced Escherichia coli RNA polymerase sigma factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from sar-cosyl // Methods Enzymol. 1996. V.273. P.145-149.
54. Gierasch L.M., Lacy J.E., Thompson K.F., Rockwell A.L., Watnick P.I. / Conformations of model peptides in membrane-mimetic environments // Bio-phy. J. 1982. V.37. P.275-284.
55. Tsumoto K., EjimaD., Kumagai I., Arakawa T. / Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies // Protein Expression and Purification 2003. V2.8. P.l-8.
56. Bhavesh N.S., Panchal S. C., Mittal R., Hosur R. V. / NMR identification of local structure preferences I HIV protease tethered heterodimer in 6M gua-nidine hydrochloride // FEBS Lett. 2001. V.509. P.218-224.
57. Arakawa T., Philo J., Kenney W.C. / Structure and solubility of inter-leukin-2 in sodium dodecyl sulfate // Int. J. Pept. Protein Res. 1994. V.43. P.583-587.
58. SchoemakerJ. M, Brasnett A. H., and Marston F. A. O. / Examination of calf prochymotrypsin accumulation in Escherichia coli: disulphide linkages are a structural component of prochymotrypsmn-containing inclusion bodies. // EMBO J. 1985. V.4. P.775-780.
59. Hart R. A., Lester P. M., Reifsnyder D. H„ Ogez J. R., and Builder S. E. / Isolation of non-native ICF-I by aqueous two-phase extraction. // Bio/Technology 1994. V.12. P.l 113-1117.
60. Jaenicke R., Rudolph R., andHeider I. / Specificity in the subunit assembly of oligomeric enzymes. Synchronous reconstitution of mammalian lactic and malic dehydrogenases. // Biochem. Int. 1981. V.l. P.23-31.
61. Maachupalli-Reddy J., Kelley B.D., De Bernárdez Clark E. I Effect of inclusion body contaminants on the oxidative renaturation of hen egg white ly-sozyme. //Biotechnol. Prog. 1997. V.13. P. 144-150.
62. Tran-Moseman A., Schauer N., De Bernárdez ClarkE. / Renaturation of Escherichia coli-derived recombinant human macrophage colony-stimulating factor. // Protein Expr. Purif. 1999. V.16. P. 181-189.
63. Thatcher D.R., Hitchcock A. / Protein folding in biotechnology. In Mechanisms of protein refolding Edited by: Pain HR. // Oxford: Oxford University Press. 1994. P.229-254
64. Hochuli E., Dobeli H and Schacher A. / New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighboring histidine residues. // J. Chromatography 1987. V.411. P. 177-184.
65. Maeda Y., Koga H., YamadaH., Ueda T., Imoto T. / Effective renaturation of redused lysozyme by gentle removal of urea // Protein Eng., 1995. V.8. P.201-205.
66. WestS.M., Chaudhari J.B., Howell J.A. / Improved protein refolding using hollow-fibre membrane dialysis // Biotechnol. Bioeng.1998. Y.57. P.590-599.
67. Yoshii H., Furuta T., Yonehara T., Ito D., Linko Y.-Y., Linko P. / Refolding of denaturated/redused lysozyme at high concentration with diafiltration // Biosci. Biotechnol. Biopchem. 2000. V.64. P. 1159-1165.
68. Varnerin J.P., Smith T., Rosenblum C.I., Vongs A., Murphy B.A., Nunes C., Meilin T.N., King J. J., Burgess B. V. / Production of leptin in Escherichia coli: a comparison of methods // Protein Expr. Purif. 1998. V.14. P.335-342.
69. UmetsuM., Tsumoto K., HaraM., Ashish K., Goda .S, Adschiri T., Ku-magai I. / How Additives Influence the Refolding of Immunoglobulin-folded Proteins in a Stepwise Dialysis System // The Journal Of Biological Chemistry 2003. V.278. No.ll. P.8979-8987.
70. West S.M., Chaudhuri J.B., Howell J.A. / Improved protein refolding using hollow-fibre membrane dialysis // Biotechnol. Bioeng. 1998. V.57. P.590-599.
71. Hevehan D.L., Clark E.B. / Oxidative renaturation of lysozyme at high concentrations //Biotechnol. Bioeng. 1997. V.54. P.221-230.
72. Hamada K,. Shiraki / L-Argininamide improves the refolding more effectively then L-arginine // Journal of Biotechnology 2007. V.130. P.153-165.
73. Winter J., Lilie H., Rudolph R. / Recombinant expression and in vitro folding of pro insulin are stimulated by the synthetic dithiol Vectrase-P // FEMS Microbiology Letters 2002. V.213. P.225-230.
74. Katoh S., Katoh Y. / Continuous refolding of lysozyme with fedbatch addition of denatured protein solution // Process Biochem. 2000 V.35. P. 11191124./
75. Winter J., Lilie H., and Rudolph RJ Renaturation of human proinsulin—a study on refolding and conversion to insulin // Analytical Biochemistry 2002. V.310. P.148-155.
76. De Bernardez Clark E., Schwarz E., Rudolph R. / Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding // Methods Enzymol 1999. V.309. P.217-236.
77. Amons R., Schrier P.L / Removal of sodium dodecyl sulfate from proteins and peptides by gel filtration // Anal. Biochem. 1981. V.l 16. P .439-443.
78. Werner M.H., Clore G.M., Gronenborn A.M, Kondoh A., Fisher R.J. / Refolding proteins by gel filtration chromatography // FEBS Lett. 1994. V.345. P.125-130.
79. Batas B., Chaudhuri J.B. / Protein refolding at high concentration using size-exclusion chromatography // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.50. P. 16-23.
80. Batas B., Chaudhuri J.B. / Consideration of sample application and elu-tion during size-exclusion chromatography-based protein refolding // J. Chromatogr. A 1999. V.864. P.229-236.
81. Batas B., Jones H.R., Chaudhuri J.B. / Studies of the hydrodynamic volume changes that occur during refolding of lysozyme using size-exclusion chromatography // J. Chromatogr. A 1997. V.766. P.109-119.
82. Fahey E.M., Chaudhuri J.B. / Molecular characterization of size exclusion chromatography refolded urokinase-plasminogen activator // Chem. Eng. Sci. 2001. V.56. P.4971-4978.
83. Gu Z., Su Z., Janson J.-C. / Urea gradient size-exclusion chromatography enhanced the yield of lysozyme refolding // J. Chromatogr. A 2001. V.918.1. P.311-318.
84. GuZ., Weidenhaupt M., Ivanova N., Pavlov M, Xu B„ Su Z., Janson J.-C. / Chromatographic methods for the isolation of, and refolding of proteins from Escherichia coli inclusion bodies // Protein Expr. Purif. 2002. V.25.1. P. 174-179.
85. Lanckriet H., Middelberg A.P.J. / Continuous chromatographic protein refolding // Journal of Chromatography A 2004. V.1022. P. 103-113.
86. Orsini G., Goldberg M.E. / The renaturation of reduced chymotrypsino-gen A in guanidine-HCl // J. Biol. Chem. 1978. V.253. P.3453- 3458.
87. Epstein C.J., Anfinsen C.B. / The reversible reduction of disulfide bonds in trypsin and ribonuclease coupled to carboxymethyl cellulose // J. Biol. Chem. 1962. V.237. P.2175-2179.
88. Light A.L. / Protein solubility, protein modifications, and protein folding // Bio/Techniques 1983. V.3. P.298-305.
89. Stempfer G, Holl-Neugebauer B, Kopetzki E, Rudolph R. / Improved refolding of an immobilised fusion protein //Nat. Biotechnol. 1996. V.14. P.329-334.
90. Kogl H., Kosemund K., Kufehlbrandt W., Collinsonl. / Refolding of Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodies immobilized by nickel chelating chromatography // FEBS Lett. 1998. V.432. P.21-26.
91. Berdichersky Y., Lamed R., Frenkel D., Gphna V., Bayer E.A., Yaron S., Shoham Y., Benharl. / Matrix-assisted folding of singlechain Fv cellulose binding domain fusion proteins // Protein Expr. Purif. 1999. V.17. P.249-259.
92. Creighton T.E. / Folding of proteins adsorbed reversibly to ionexchange resins, in: D.L. Oxender (Ed.): UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology New York, 1986. V.39. P.249-257.
93. Guo L. / Simultaneous purification and renaturation of recombinant human interferon alpha expressed by E. coli by highperformance hydrophobic interaction chromatography // Chin. J. Chromatogr. 2001. V.19. P.301-303.
94. LingM., XuX., Shi F., Zhu Y., LongN. / Refolding of recombinant human interleukin-2 by reverse phase high performance liquid chromatography //Chin. J. Biotechnol. 1997. V. 13. P. 180- 183.
95. Zouhar J., Nanak E., Brzobohaty B. / Expression, single-step purification, and matrix-assisted refolding of a maize cytokinin glucoside-specific b-glucosidase//Protein Expr. Purif. 1999. V.17. P.153-162.
96. Li M, Zhang G.F., Su Z. / Dual gradient ion-exchange chromatography improved refolding yield of lysozyme // J. Chromatogr. A 2002. V.959.1. P.l 13-120.
97. Misawa S., Aoshima M., Takaku H., Matsumoto M., Hayashi H. / Highlevel expression of mycoplasma arginine deiminase in Escherichia coli and its efficient renaturation as an anti-tumor enzyme // J. Biotechnol. 1994. V.36.1. P.145-155/
98. Cleland J.L / Impact of protein folding on biotechnology // in: J.L. Cle-land (Ed.) Protein Folding: In Vivo and In Vitro American Chemical Society Washington 1993. P. 1-21.
99. Baneyx F. / Recombinant protein expression in Escherichia coli // Curr. Opin. Biotechno1. 1999. V.10. P.411-421.
100. Mayer M., Kies U., Kammermeier R., Buchner J. / BIP and PDI cooperate in the oxidative folding of antibodies in vitro // J. Biol. Chem. 2000., V.275. P.29421-29425.
101. DongX., Yang H., Sun Y. / Lysozyme refolding with immobilized GroEL column chromatography // J. Chromatogr. A 2000. V.878. P. 197-204.
102. Altamirano M.M., Garcia C., Possani L.D., Fersht A. / Oxidative refolding chromatography: folding of the scorpion toxin Cn5 I I Nature Biotechnol. 1999. V.17. P. 187-191.
103. Carlson J.D., Yarmush M.L. / Antibody assisted protein refolding // Bio/Technology 1992. V.10. P.86-91.
104. Rudolph, R. / Renaturation of recombinant, disulfide-bonded proteins from inclusion bodies // In Modern Methods in Protein and Nuckic Acid Research (Tschesche, H., ed) 1990. P. 149-172.
105. Sela M., White F. H., and Anfinsen C. B. / Reductive cleavage of disulfide bridges in ribonuclease. // Science 1956. V.16. P.691-692.
106. Ahmed A. K, Schajfer S. W, and Wetlaufer D. B. / Noenzymatic reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by air oxidation and by glutathione oxidoreduction buffers // J. Biol. Chem. 1985. V.250. P.8477-8482.
107. Wetlaufer D. B., Branca P. A., and Chen G.-X. / The oxidative folding of proteins by disulfide plus thiol does not correlate with redox potential // Protein Eng. 1987. V.2. P.141-146.
108. Fischer S., Rudolph R., and Mattes R.I European Patent Application, Patent No.0393 725 A 1. 1986.
109. DiBella E. E., Maurer M. C., and Scheraga H. A J Expression and folding of recombinant bovine prethrombin-2 and its activation to thrombin // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.163-169.
110. Kuhelj R., Dolinar M, Pungerrcar J., and Turk V. / The preparation of catalytical active human cathepsin B from its precursor expressed in Escherichia coli in the form of inclusion bodies // Eur. J. Biochem. 1995. V.229. P.533-539.
111. Vallejo L.F., Rinas U. / Optimized procedure for renaturation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 at high protein concentration // Biotechnol Bioeng 2004. V.85. P.601-609.
112. Midler C., Rinas U. / Renaturation of heterodimeric platelet-derivedgrowth factor from inclusion bodies of recombinant Escherichia coli usingsize-exclusion chromatography // J Chromatogr A 1999. V.855. P.203-213.
113. Privalov P.L. / Physical basis of the stability of the folded conformations of proteins // In Protein folding Edited by: Creighton T.E. New York: W. H. Freeman and Company 1992. P/83-126.
114. Robinson C.R., Sligar S.G. / Hydrostatic and osmotic pressure as tools to study macromolecular recognition // Methods Enzymol. 1995. V.259. P.395-427.
115. FoguelD., Robinson C.R., de Sousa P.C. Jr., Silva J.L., Robinson A.S. / Hydrostatic pressure rescues native protein from aggregates // Biotechnol Bioeng 1999. V.63. P.552-558.
116. St John R.J., Carpenter J.F., Randolph T.W. / High pressure fosters protein refolding from aggregates at high concentrations // Proc Natl Acad Sei USA 1999. V.96. P.13029-13033.
117. St John R.J., Carpenter J.F., Balny C., Randolph T. W. / High pressure refolding of recombinant human growth hormone from insoluble aggregates: Structural transformations, kinetic barriers and energetics // J Biol Chem 2001. V.276. P.46856-46863.
118. Builder S., and Ogez J. R. / United States Patent Application 4620 948. 1986.
119. Orsini C., and Goldberg M. E. / The renaturation of reduced chy-motrypsinogen A in guanidine HCL Refolding versus aggregation/ J. Biol. Chem. 1978. V.253. P.34-39.
120. Yasuda M, Murakami Y., Sowa A., Ogino K, and Ishikawa H. / Effect , of Additives on Refolding of a Denatured Protein // Biotechnol. Prog. 1998. V.14. P.601-606.
121. Cleland J.L.,. Wang D.I. C. / Cosolvent assisted protein refolding // Biotechnology 1990. V.8. P.1274-1278.
122. Karuppiah N., Sharma A. / Cyclodextrins as protein folding aids // Bio-chem. Biophys. R. 1995. V.211. P.60-66.
123. Arora D., Khanna N., / Method for increasing the yield of properly folded recombinant y-interferon from inclusion bodies // J. Biotechnol. 1996. V.52. P.127-133.
124. Suenaga M., Ohmae H., Tsuji S., Itoh T., Nishimura O. / Renaturation of recombinant human neurotrophin-3 from inclusion bodies using a suppressor agent of aggregation // Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. V.28. P. 119-124.
125. Arakawa T. and Tsumoto K. / The effects of arginine on refolding of aggregated proteins: Not facilitate refolding, but suppress aggregation // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2003. V.304. P.148-152.
126. Reddy K.R.C., Lilie H., Rudolph .R, Lange C. / L-Arginine increases the solubility of unfolded species of hen egg white lysozyme // Protein Sei. 2005. V.14. P.929-935.
127. Rudolph R., Fischer S., and Mattes R. / Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes // U.S. patent 5,453,363 1995.
128. Kudou M., Shiraki K., Fujiwara S., Imanaka T., Takagi M. / Prevention of thermal inactivation and aggregation of lysozyme by polyamines // Eur. J. Biochem. 2003. V.270. P.4547-4554.
129. Ou W.B., Park Y.D.,. Zhou H.M. / Effect of osmolytes as folding aids on creatine kinase refolding pathway // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002. V.34. P.136-147.
130. Meng F., Park Y., Zhou H. / Role of proline, glycerol, and heparin in protein folding aids during refolding of rabbit muscle creatine kinase // Int. J. Biochem. Ceil Biol. 2001. V.33. P.701-709.
131. ClelandJ. L., Hedgepeth C., and Wang D. I. C. / Polyethylene glycol enhanced refolding of bovine carbonic anhydrase B // J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.13327-13334.
132. Buchner J., and Rudolph R. / Renaturation, purification and characterization of recombinant Fab-fragments produced in Escherichia coli // Bio/Technology 1991, V.9. P.157-161.
133. Taneja S., and Ahmad F. / Increased thermal stability of proteins in the presence of amino acids //Biochem. J. 1994. V.303. P.147-153.
134. Rudolph R., Lilie H. / In vitro folding of inclusion bodies protein // FASEB J. 1996. V.10. P.49-56.
135. Ambrosius D., and Rudolph R. / European Patent Application No. WO 92/09622. 1992.
136. Tandon S., and Horowitz P. M. / Detergent-assisted refolding of gua-nidmnium chloride-denatured rhodanese // J. Boil. Chem. 1987. V.262. P.4486-4491.
137. CerlettiN., McMaster C., Cox D., SchmitzA., MeyhackB. / European Patent Application No.0433 225 Al. 1990.
138. Zardeneta C., and Horowitz P. M. / Protein refolding at high concentrations using detergent/phospholipid mixtures // Anal. Biochern. 1994. V.218. P.392-398.
139. Rozena D., and Gellma S. H. / Artificial chaperones: Protein refolding via sequential use of detergent and cyclodcxtrin // J. Am. Chem. Soc. 1995. V.117. P.2373-2374.
140. Cooper A. / Effect of cyclodextrins on the thermal stability of globular proteins//J. Am. Chem. Soc. 1992. V.114. P.9208-9214.
141. Lange K., Patil G., Rudolph R. / Ionic liquids as refolding additives: N.-alkyl and N.-(v-hydroxyalkyl) N-methylimidazolium chlorides // Protein Science 2005. V.14. P.2693-2701.
142. Summers C.A. and Flowers R.A. / Protein renaturation by the liquid organic salt ethylammonium nitrate. // Protein Sci. 2000. V.9. P.2001-2008.
143. Dabora J. M, Sanyal C., andMiddaugh C. R. / Effect of polyanions on the refolding of human acidic fibroblast growth factor // J. Biol. Chem. 1991. V.266. P.23637-23640.
144. Carlson J. D., and Yarmush M. I. / Antibody assisted protein refolding // Bio/Technology 1992. V.10. P.86-91.
145. Ewalt K.L., Hendrick J.P., Houry W.A., Hartl F. U. / In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system // Cell 1997. V.90. P.491-500.
146. Thomas J.G., AylingA., BaneyxF. / Molecular chaperones, folding catalysts, and the recoverey of active recombinant proteins from E. coli // Appl Biochem Bioiechnol 1997. V.66. P. 197-238.
147. Buchner J., Brinkmann U., Pastan I. / Renaturation of a single-chain immunotoxin facilitated by chaperones and protein disulfide isomerase // Bio/Technology 1992. V.10. P.682-685.
148. Machida S., Ogawa S., Xiaohua S., Takaha Т., Fujii K., Hayashi K. / Cycloamylose as an efficient artificial chaperone for protein refolding // FEBS Lett 2000. V.486. P.131-135.
149. Simon S.M., Peskin C.S., Oster G.F. /What drives the translocations of proteins // Proc Natl Acad Sci USA 1992. V.89. P.3770-3774.
150. Yoshii II., Furuta Т., Yasunishi A., Kojima ,T. / Rapid renaturation of denatured and aggregated proteins using liquid paraffin as a pseudolipid bi-layer membrane//Biotechnol Bioeng 1994. V.43. P.57-63.
151. Frank S.H., Pettee J.M., Zimmerman R.E. and Burck P.J. in: Peptides: Proceedings о f the Seventh American Peptide Chemistry Symposium 1981. P.729-738.
152. Williams D.C., Van Frank R.M., Muth W.L. and Burnett J.P. / Cytoplasmic inclusion bodies in Escherichia coli producing biosynthetic human insulin proteins // Science. 1982. V.215(4533). P.687-903.
153. Sung. W.L., Yau, F.L., Zahab, D.M, andNarang, S.A. / Short synthetic oligodeoxyribonucleotide leader sequences enhance accumulation of human proinsulin synthesized in Escherichia coli. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. V.83. P.561-565.
154. Cowley D. J., Maskin R.B. / Expression, purification and characterization of recombinant human proinsulin // FEBS Lett. 1997. V.402. P.124-130.
155. Иванкин A.H., Миталева С.И., Неклюдов А.Д. // Биосинтез и выделение рекомбинантного белка с целью получения генно-инженерного проинсулина человека // Прикладная биохимия и микробиология 1998. т.34. №3. с.293-299.
156. Obermeier et al. / Process for converting preproinsulin analogs into insulins // United States Patent #4.639.333 1987.
157. Chan S.G. / Biosynthesis and periplasmic segregation of human proinsulin in Escherichia coli // PNAS 1981. V.78. №2. P.5401-5405.
158. Brousscau R., Scarpulla R., Sung W. V. / Enzymatic assembly, cloning and characterization of the human proinsulin DNA // Gene 1982. V.17. №3 P. 279-289.
159. Навашин C.M. и др. / Инсулин человека: физико-химические свойства и получение // Антибиотики и химиотерапия 1988. т.23. №9. с.701-708.
160. GuoL.H., Stepien P.P., TsoJ.Y., Brousseau R., NarangS., Thomas D.Y., Wu R. / Synthesis of a human insulin gene VIII. Construction of expression vectors for fused proinsulin production in Escherichia coli // Gene 1984. V.29. №1/2. P.251-254.
161. Mackin R.B. / Streamlined procedure for the production of normal and altered version of recombinant human proinsulin // Protein Expression and Purification 1999. V.15. P.308-313.
162. Chance R .E. and Frank B. / Research, development, production, and safety of biosynthetic human insulin. // Diabetes Care Suppl. 1993. V.3.1. P.133-142.
163. Nilsson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. / Integrated production of human insulin and its C-peptide // Journal of Biotechnology 1996. V.48. P.241-250.
164. Dai Y., Tang J.G. I Intra-A chain disulfide bond (A6-11) of insulin is essential for displaying its activity // Biochem. Mol. Biol. Int. 1994. V.33. P.1049-1053.
165. Ю.М. Торчинский / Сера в белках // М: Наука 1977
166. Winter J., Klappa P., Freedman R.B., Lilie H. and Rudolph R. / Catalytic activity and chaperone function of human protein disulfide isomerase are required for the efficient refolding of proinsulin // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.310-317.
167. Winter J., Neubauer P., Glockshuber R., Rudolph R. / Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA // Journal of Biotechnology 2000. V.84. P.175-185.
168. Иванкин A.H., Миталева С.И., Неклюдов А.Д. / Биосинтез и выделение рекомбинантного белка с целью получения генно-инженерного проинсулина человека // Прикладная биохимия и микробиология 1998. т.34. №3. с.293-299.
169. Petrides D., SapidouE., Calandranis J. / Computer-aided process analysis and economic evaluation for biosynthetic human insulin production -a case study // Biotechnology and Bioengineering 1995. V.48. P.529-541.
170. Chang S. G., Kim D. Y, Choi K.D., Shin J.M., Shin H. C. / Human insulin production from mini-proinsulin which has high receptor-binding activity // Biochem. J. 1998. V.329. P.631-635.
171. Oliva A., Farina J., Llabres N. J. / Development of two highperformance liquid chromatographic methods for the analysis and characterization of insulin and its degradation products in pharmaceutical preparations. // Chromatogr. В 2000. V.749. P.25-28.
172. BrangeJ., Havelund S., Hougaard P. / Chemical stability of insulin. 2. Formation of higher molecular weight transformation products during storage of pharmaceutical preparations. // Pharm Res. 1992. V.6. P.727-734.
173. Клюшниченко В. E., Вульфсон A. H. / Генно-инженерный инсулин человека. II. Эксклюзионная ВЭЖХ биотехнологических предшественников. Факторы, влияющие на разрешение и селективность // Биоорг. химия 1993. т. 19. №2ю с.174-181.
174. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Q2(R1)), Geneva2005.
175. Guidance for industry: Bioanalytical method validation / US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Rock-ville MD May 2001.
176. The United States Pharmacopeia, Philadelphia PA USA 2000 (USP24) Suppl. 3.
177. Rudolph R. et al. / Folding proteins, p. 57-99 in Creighton T.E.Protein function, a practical approach I I IRL-Press, Oxford University Press Oxford 1997.
178. Chen J., Liu Y., LiX., Wang Y„ Ding H., Ma G, Su Z. / Cooperative effects of urea and 1-arginine on protein refolding // Protein Expression and Purification 2009. V.66.1.1. P.82-90.
179. Hamada H., Shiraki K./ L-Argininamide improves the refolding more effectively than 1-arginine // Journal of Biotechnology 2007. V.130.1.2.1. P.153-160.
180. Singh S. M., Panda A.K. / Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins // Journal of Bioscience and Bioengineering 2005. V.99. 1.4. P.303-310.
