Изучение структуры и функций бактериальной формиатдегидрогеназы методами генетической инженерии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.З. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Ыа правал рукописи,

ГАЛКИН Андрей Геннадьевич

УДК 577.15,02:577.2 Ы.203-

изучен и е структуры и функций бактериальной формиатдещдрогеназы методами генетической инженерии

(02.00.IS - химическая кинетика и цагэпнэ),

АОТОРЕФЕРАТ! диссертации на соискание ученой сгепгмн кандидата химически* науи

Москва - 1531г.

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического,

факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: д.б.н., в.н.с. Егоров A.M.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, в.н.с.

Пушкин А.В кандидат химических наук, с.н.с. Калюжный C.B.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им.

В.А.Энгельгардз

Защита состоится ", . *' . , ■-.——— 1991 г. на заседании

специализированного Ученого совета N Д.053.05.76 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119099, ГСП-3, Москва, Ленинские горы, химический факультет МГУ, аудитория 202 корп. кафедры химической энзимологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан: "-" --- 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одним из ферментов, которому ß последнее рремя уделяется большое внимание, является NAD-записнмая формиитдегидрогенцза (КФ 1.2.1.2, ФАГ) 143 различных метнлогрофных микроорганизме)». Этот .фермент играет важную роль в метаболизме метнлотрофов. Он .катализирует реакцию окисления формиата до углекислого газа при сопряженном .восстановлении NAD до NADH. Этот процесс предстарляет собой последнюю .стадию л полпферментнон цепи окисления метанола до углекислого газа н является .основным источником .энергии в эти организмах при росте на метаноле.

Получение штамма метнлогрофных бактерий (Pseudomonas sp.101 - активного продуцента Н AD-завнснмой ФЛГ положило ,ианал,о .систематического исследования структуры н свойств этого фермента. ¡В .настоящее время хорошо изучены фиэико-хнмнческне и кинетические свойства ФЛГ .из Pseudomonas Sp.lO.l. Методом химической модификации выявлены .существенные для катализа аминокислотные остатки. Определение аминокислотной .последовательности (Попов н соавт. 1990) н установление с томощью рентгеиоструктурного анализа структуры тройного ФЛГ-ЫАО-азцд с »разрешением 3 А (Ламзин и соавт. 1990) позволили начать исследование ФЛГ на уровне гена.

Исследование формиатдегидрогеназы представляет ка,к теоретический, так н практический интерес, поскольку этот фермент является идеальным для реализации бпоггехнолотческих процессов с системой регенерации NADH. Разработанные в настоящее время процессы с системой регенрацни NADU рассчитаны на использование индивидуально выделенных ферментов. Гораздо , более привлекательной является идея создания геиноннженерпых конструкций, позволяющих осуществить одновременную экспресшо и,сыгранном микроорганизме всех ферментов, участвуюии« в процессе. Кроме того, .выделение и .изучение структуры гена формиатдегидрогеназы позволит .полунить дополнительную информацию о его механизме действия, выяснить степень родства с другими NAD-завнеимымн дегндрогеназамн, с помощью метода - направленного мутагенеза получить еще более стабильные препараты фермента. .Таким образом, изучения формиатдегидрогеназы на структурно-генетическом уровне является важной и актуальной задачей.

Шль Н ЭЗлачи исследования. Настоящая работа, была предпринята с целью изучения сруктуры и свойств гена ФЛГ из.Pseudomonas.sp.101. Г свяэн с этим были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать ген NAD-эавн'снмой ФЛГ из штамма метилотрофны:; бактерий Pseudomonas sp.101.

2. Определить нуклсотндмую последовательность гена'ФЛГ и прилегающих" к нему областей.

3. Экспрессировать геи ФДГиэ ;Pseudomonas sp.IO'l » клетках Escherichia coli. .

4. Сравнить продукт экспрессии гена ФДГ о Escherichia coli с фермогтом из Pseudomonas sp.101.

Научная новизна. 'Впервые клонирован ген NAD-зависнмоп формнатдегнлрогеназы из метнлотрофных бактерий. Определена полная нуклеотидная последовательность гена ФДГ из Pscuclonionas sp.IOI и прилегающих к нему областей. Проведен компьютерный анализ структурной части гена ФЛГ и фланкирующих областей. Достигнута экспрессия гена ФДГ из Pscudorrionss sp.'Ol в Escherichia coli. Изучены физико-химические свойства продукта экспрессии.

Практическая ценность работы. Клонпрооаннс и ссквеис гена NAD-эависимон формнатдегпдрогеназы из Pseudomonas sp.101 далй возможность получить 3 плазмидные конструкции обеспечивающие эффективную экспрессию гена ФДГ в Eclicrichia ¿oli. Предложена система вектор-хозяин, обеспечивающая уровень синтеза этого фермента d количестве 6-7% от растворимого клеточного белка. Эта система может быть использована для экспрессии ФДГ, модифицированного при помощи методов направленного мутагенеза, и, таким образом, для получения 'биокаталнзатора с Лучшими свойствами. ' '

'Клонирование НЛО-зависимой ФАГ открывает новые возможности для чеоздания генноинженерных конструкций, позволяющих осуществить одновременно окспресшо в выбранном микроорганизме всех ферментов, участвующих в процессах с «вистемой регенерации NADH.

Апробация Работы. Материалы диссертации были представлены »а 'Международной конференции "Progress in recombinant DNA technology anci application" (June 3-8, 1990, Potosi, Missouri, USA), на 4 Всесоюзной школс-ссминаре молодых ученых по молекулярной биологии (Юрмала, ноябрь 1990), на конкурсе -научных работ Института биохимии» им. АЛ, Баха АН СССР (декабрь 1990).

Публикации. По материалам диссертации-опубликовано_печатные работы.

О^ь^м работы. Диссертация cocroirr из введения, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, -результатов н их обсуждения (3 главы), выводои и списка шггирусмой литературы. 'Работа изложена на 122 страницах, содержит 26 рнсупкоз и 12, таблиц. Список литературы включает 153 ссылки. " ■ - - •

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы, плазмилы. Фат. В работе использовали штаммы E.coli АВ2463 (Smrf Rifr, recAl, lhilt hisG4, lcuB6, ihrEl, proA2, argE3, sir-31, iacYl. ga!K2, arol4, xgl-5, mtl-1, tsx33, sup37); E.coli TG1 (F(traD36, proAB, Iacl'l , lacZ M15), (lac-pro), thi-, hsdR, ara-); метнлотрофные бактерии Pseudomonas sp.101 (В К M B-1545).

В работе использовали фазмиду XpSL5 (гибрид pUCtO и ф^гц X, лаборатория Н.К. Янковского, ВНИИ генетика), (^a-ni: M13tgl30 и M13tgl31, плазмиды рVC19 и pDR540 (ксгочинк tac-лромотЬрч). .

Срелы. Выращивание бактерий проводили на богатой среде Хотпшгер или среде LB. В качестве минимальной использовали среду M9, дополненную 0,2 % глюкоз£| для Е. col!, н среду Канеду дополненную 0,5% метанола для метнлотрофов. Аминокислоты добавляли дй конечной концентрации 40 мг/мл, тиамин до 2 мкг/мл. Антибиотики в среды добавляли до концентрации : Ар • ЮОмкг/мл, Sm - 100 мкг/мл. \

Методы нсслслопанмя. Выделение хромосомной ЛПК из бактерий проводили по модифицированном методике Мармура и Допт. Выделение плазмндной ДИК d микропрепаративных н препаративных количествах проводили по методике Холмса н Квнгли, Трансформацию клеток E.coli плазмндной ДНК проводили согласно методике, описанной Маниатнсом. Электрофорез хромосомной ДНК, плазмид и их ресгрйкционпых фрагментов проводили в агарозе в Трнс-ацетатном буфере.

Олнгонуклеотпдпые Смеси были синтезированы на автоматическом Д HIC-сшпгезаторе фирмы Applied Biosystcms модель 3B0B. Очнсгку олнгонуклеотидоа-проводили электрофорезом в 20 % акрнламйдном геле в денатурирующих условиях. Блот по Саузерну и гибридизацию колоний проводили в соответствии' с методикой описанной Маниатисом с небольшим!! изменениями, с использованием' нитроцеллюлозных фильтров (Schleicher & Schuell или Amershanv}.

Формиатдегидрогеназы. из Pseudomonas sp. 101 из Е- coTí выделяли по стандартной методике выделения ФДГнэ метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101. Активность формиат-Легидрогеназы Определяли на автоматическом спектрофотометре Reaction Rate. Analyzer, модель 2086 táafk 1 (LKB, Швеция), при длине волны 340 им по образованию NADU. Концентрацию гомогенной формиатдегидрогеназы определяли спектрстфотометрически по величине оптической плотности при длине волны 280 нм. Общую концентрацию белка в бесклеточном экстракте определял!/ спеМрОфШометрически по разности логлещешм на 280 и 260 ни.

Для определения степени очистки полученных препарате формиатдегидрогеназ проводили вертикальный электрофорез в 10 ' полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (0,1%) на прибор фирмы "Bio-Rad" (Австрия). Окрашивание по белку осуществляли с помощи красителя Кумасси G-250. Нативный электрофорез проводили в 7 ' полиакриламидном геле на том же приборе.

Взаимодействие натнвной и рекомбинантиой формиатдегидрогеназ полнклональными антителами кролика против ФДГ из Pseudomonas sp. 1( изучали с помощью Вестерн-блегг анализа. Для определения изоэлектрическ! точек изоформ формиатдегидрогеиазы из различных источников, а также д/ дополнительного контроля чистоты использовали метол аиалитическо! изоэлектрофокусирования в 5 % полиакриламидном геле.

Определение нуклеотндной последовательности структурной части ret формиатдегидрогеиазы и прилегающих областей проводили методом Сэнгера i автоматическом ссквенаторе ДНК фирмы "Applied Biosystems" модель 370А использованием праймеров, меченных четырьмя различными флуоресцентны?, храсителями. Фрагменты секвеиируемой ДНК величиной 270 • 1000 пя. бьь клонированы в одионитевых фаговых векторах M13tgl30 и M13lgl31, имеющ противоположные ориентации полилинкера. Выделение ДНК и : реакш секаскирования проводили в соответствии с протоколами, разработанными фирм> "Applied Biosystems" для секвенатора модели 370А. реакции секвеннрован проводили с использованием трех различны* ферментов: Клеиовсхого фрагмен ДНК-полнмеразы I E.coli и модифицированной Т7 ДНК-полимера: (сеыэеназы)(НПО "Фермент", Вильнюс), модифицированной Taq-полимеразы (spec sequencing grade) фирмы "Promega" и Секвеназы версий 2 фирмы "US Biochemical Для уменьшения G/C-компрессии вместо dGTP использовали деаза-7-dGTF фкрь "Boehringer Mannhelm*.

Для анализа рекомбннантиых клоков E.coli, экспрессирующих ФД использовали реплики колоний на иитроцеллюлозных фильтрах, котор) обрабатывали в соответствии с методикой лот-блюг нммучоаналкза.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

КЛОНИРОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФОРМИАТАЕГИДРОГЕНЫ.

1. Оптимизация структуры олигонуклеотндных зоилов.

Поскольку к моменту начала наших экспериментов большая часть аминокислотной последовательности ФДГ была известна, это лало возможность использовать вырожденные олигонуклеагтилные зонды как наиболее гибкий и в тоже время самый прямой путь клонирования гена NAD-зависимой ФЛГ из Pseudomonas sp.101. В соответствии с основными принципами оптимизации вырожденных олигонуклеотидных зондов первым шагом в выборе наиболее оптимальных олнгонуклеотидов была "обратная трансляция" аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы и выбор наиболее длинных и наименее вырожденных участков с использованием компьютерной программы PCGENE. Для уменьшения вырожденности были использованы данные о частоте встречаемости колонов для некоторых генов из различных штаммов бактерий рода Pseudomonas. Вторым этапом был анализ выбранных 17, 20 и 23-членных олигонуклеотидных смесей с наименьшей вырожденкост'ьлз на наличие самокомплементариых структур с использованием про» раммы DNAS1S. И последним третьим, заключительным шагом бь;л айалма выбранных последовательностей на комплементарное-! ь с 'нуклептидными последовательностями фага X н илазмиды pUC19, поскольку orift входят в состав фэзмкдного вектора, на котором сконструирована библиотека генома бактерии Pseudomonas sp.101. В результате были синтезировать! 20 н 23-членные олигонуклеоггиды с вырожденностью, равной 64, нанб0лее Тюл'ио удовлетворяющие вышеперечисленным требованиям:

25 31

Prö Lys fie Asp His Туг Pro

5'- VC^ A^ At^GA^CA £ГА|ьС -3' (I)

■i6i 265 269

Glu His Met ile Asn Asp 'Glu Vh'r

i'-'G^ CAjfAYG Ä^Äj^ G^ GA^A'C (Й)

2. Оптимизация условий гибридизации зондов с хромосомной ДНК Pseudomonas sp.101. .

Аля определения оптимальных температур гибридизации ii отмывки, а также для оценки размеров рестрнкцпоных фрагменте»», где располагается геи ФДГ, пропели серию Саузерн-бдот экспериментов. Хромосомную ДНК Pseudomonas sp.101 подвергали полной обработке различными ресгрнйтазамн (EcoRl, B;imlll, I'sll н их комбинациями), разделяли электрофорезом!в 0,8% агарозном геле п переносили lia нигроцеллюлозкые фильтры. ПрелГнбриДнзацню и гибридизацшо, фильтров проводили в присутствии различных концентрации формамида (О - 33 об.%). При гибридизации при оптимальных концентрациях формамцда (0-7 и 16-24% для олигонуклеотидоа 1 и II соответственно) и при бгтшалыюЛ температуре отмывки (40-45 и 53-59 °С . соответственно для -зо!1дов I н И) во всех случаях наблюдалась после радноавтографин единственная явно выраженная полоса,(рис., 1Л).

При обработке ДНК рестрнктазами EcoRl it Pstl величины гибрндизукицих« фрагментов составили примерно 15 и 3,5 тлл, соответственно. Анализ фрагментов полученных при обработке комбинацией рсстриктаз (EcoRl-BamHt, EcoRI-Pstl EcoRI-BamHI-Pstl) показал, что 3,5 tjiji. Pstl-fjparMCirr располагается внутри тля. ЕсоШ-ВашШ фрагмента (рис., 1А).

3. Скриниг библиотеки геиоа Pseutlomona.s sp.101. Хромосомная ДНК Pseudomonas sp.101 была подвергнута частичном; гидролизу ресгриктазой EcoRl до получения фрагмаггои средней величины 10-2( тлл. Геномная библиотека Pseudomonas sp.101 была получена М. Фонштсино» (ВНИИ генетики .и. селекции промышленных микроорганнзмои) в результат! лигарования" полученных фрагментов с линеаризованным по EcoRl фазмидцы* вектором XpSL5 и упаковки рекомбинзнтной ДНК . в зрелые фагооые частицы Скрининг библиотеки на наличие гена ФДГ проводили метолом тбрнднзаци колоний. Гибридизацию и отмывку проводили при оптимальных условия) определенных в Саузерн-блот экспериментах.

Плазмидные ДНК из 12 отобранных клонов,- дающих устойчивы положительный гнбридизАционный сигнал, был» выделены и обработаны EcoR Анализ результатов электрофореза в 0,8% агарозном' геле. показал, чт отобранные клоны содержат три типа фазмид, обозначенных XpFDHl, XpFDH.' XpFDH3, со вставками 15, 17,6 (15+2,6) и 18,5 (15+3,5) тлл. соответственно. Саузер» блот гибридизация EcoRl-ресгриктов этих фазмид с олигонуклеотндными зондам показала, что все они содержат общую вставку величиной 15 т.п.и комплементарную обоим олигойуклеотидам. Рестрикция XpFDHl BamH

1 2

г

'=.1 2 3

«кЬ

ЗН(>„

^ - зкь ......... ■ ' ......

I • • ЩЖ^

< К.

г

л

Рисунок 1. Результаты Сзузорн-блат гибридизации с 23 члеипым. о.м1гс*гуклеатдом: Л) хромосомной АПК гр. 101, обработан!«?«'

респянтаэамн I • РйЦ, 2 - ВагЛИЬЕсоШ; В) рекомшп&нтиой <?аэмцАв.|1\ рГОШ, обработанной рестрихтаэамм I - ВатШ,2 - ВатШ+ЕсоШ, 3 - Р^,

408

Н)пй11 4ео Яа!» *|,с1 Н(пс11 1663 0,011».,

н-т——н—Н-—............Н

Ы1и* 'лвп" 1026 1303 2?Г!:

151

Рисунок 2. Сгрзтспы сеикшразаадя /еи^ФДП ю.Р^ийощотм $у.УЛ Сплошной чертой пскаэдно 1 юпрэплеиие. траясщг^щл!, гр?й."ч'АГ,

(EcoRI+BamHI) и Pstl и гибридизация с 23-членным олигощклеотидным зондом показали, что комплементарная область располагается в. 8,7 тл.и. BamlH-EcoRI фрагменте н в 34 т.пл. Pstl фрагменте (рис. 1В). Эти данные совпадают с величинами фрагментов, полученными из Саузерн-блот экспериментов с хромосомной ДНК из Pseudomonas sp.IOI н свидетельствуют о том, что вставки рекомбннантньи фазм>и ApFDHl, XpFDI12 и XpFDl 13 представляют собой искомые участки ДНК Pseudomonas sp.IOI.

4. Локализация гена формиатдегндрогеназы.

ВатШ-фрагмснт фазмнды x.pFDHl (рис. 3), содержащий EcoRI-BamfII фрагмент хромосомной ДНК был клонирован а многокошшный плазмцдный осктор pUC19. Полученная о результате плазмнда была обозначена pFDHl. С цслыо локализации нахождения гена ФДГ в этом участке был проведен еще один Саузерн-блот эксперимент. Обработка плазм цды pFDIlí рссгрнктазамн Pstl, Hin-dlll, Sali, Xhol, Mine!! и гибридизация с 23- членным олнгоиу клеотидным зондом позволили локализовать участок, комплементарностн до 0,25 тлл, Xhol-UincU фрагмента. Для определения направления транскрипции гена ФДГ был. использован другой олнгонуклсотиднын зоиД; Были показано, что часть reus, кодирующая N-концсвую последовательность ФДГ, располагается о 1,1 tjüí. Hin-dlll - Xhol фрагменте и транскрипция осуществляется-5 направлении MindlII ->. Bglll (рнс.2). Эти данные свидетельствуют также . о том, что геи ФДГ располагается примерно в .середине этого фрагмента, которым и был сыбрзи для дальнейшего анализа. - ' ,

СТРУКТУРА ГЕНА ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 1. Определение нуклеотидлой последовательности гена формиатдетдрогеназы и прилегающих, к нему областей.

После локализации гена формиатдетдрогеназы о HinilIH-BglII фрагменте с помощью различных рсстриктаз были получены отдельные фрагменты величиной 200 - 1000 пл, которые были клонированы о адпонитсаые фаги M13tgl30 t:, M13tgl31, отличающиеся ориентацией лолнлннкерз. Общая стратегия секееиирооитя приведена на рис. 2. При использовании Сскисназы it Тач-полимеразм срсдшк длина читаемых фрагментов составила 500 - 550 нукдеаткдто. Однако, следует отметить, что только с Taq- полнмеразой удалось получить надежны;: результаты.

Как следует из рис. 2, фрагменты между сайтами Hindlll-iímclt бьиш секвенированы по двум цепям. Кроме того, 'за счет того, что при рсакшш секвенирования фрагмента HincII - /Bglll о обоих направлениях было прочитано около 650 оснований, по двум цепям ..была выведена средняя часть (более 200 оснований) этого фрагмента. Для получения полной , нуилсотндноп

Vasyucz 3. Сл'е м a клонпрой.нЫл1 i'é>l!v ÑAD-3;ir;iiai.'.u>íi ФАГ нэ Pseudomonas rp.lOl,

последовательности всего секвсннруемЫ"0'фрагмента все1 Внутренние сайты рестрикции были перекрыты за счет секЬйШроогишя более' крупных фрагментов (рнс. 2). С целью большей надежности' кйжДын клон был ссквсннроваи по в среднем 5-6 раз с использованием как CekBÖiiäati.'Tiiii'ii Taij-полнмеразы.

2. Анализ структуры гена формиатлс^цдрогсиазы,

А'наЛ'и'з ' всех трех рамок .счйтйвйння : полученной нуклеотндной послёЛойатсл&носн показал наличие единственной' открытой рамки .считывания, код>фук)щсй :400 аминокислотных остатков '(не считая стартового Met) (рнс. 4). Сравнение выведенной аминокислотной ШследоЦатсльнуетн С результатами аминокислотного секвенироиания ФАГ, "Полученными ранее, показало совпадение первых 393 остатков, за исключением 7 аминокислот (рис. 4). Кроме того, было обнаружено еще 7 аминокислотных остатков в С-концспон части полннептида. Причинами данных расхождений могут быть ошибка аминокислотного или нуклеотидного секвенироиания. Различия в полученных результатах можно объяснить гетерогенностью исследуемого штамма Pscdomonas sp.101, наличием о ■нем нескольких немного' различающихся копии гена ФАГ, а также rt'.ocT,трансляционными модификациями. Наиболее вероятным объяснением •появления дополнительных' ccStit аминокислотных остатков и С-концсври части щолняептада'может Сыть посттрансляциониын процсссннг. Подобный случай имел .масто KXÖiiiipouamiii гена »-субъсдиницы алкогольдстдрогсназы нз псчснН ■человека, 1 к'огЛа исчезновение 12 аминокислоты^ остаткои в С-Кокцссой части (лолипсптида объясняют поотрансляционным протсолизом.

Аанн'ые о частота использования колонов для гена ФАГ сш (летельстиуют о •неслучайном распределении используемых колонов а отом гене Pseudomonas sp.101. Из 61 возможных триплетов 16 lic используются вообще, а 25 из оставшихся 45 кодируют 82,8 % всей белковой последовательности. Явно выражена тс1!дснц!Ш использования тех кодоиоо, которые в третьем положении содержат G. или С. ■Содержание G+C в первой, второй и третьей позиции кодоноз составляет 65,2, 44,2 •и 86,7% соответственно, о то время как, общин С+С состав для всего кодирующего ,penioiia составляет 65,6%. Этим объясняется высокбс содержание о белке таких .аминокислотных остатков, как А!а (10,1%), Arg (5,9%), Gly (8%) и Pro (6,1%), все. жоаоны которых содержат в первых двух положениям G или С и, таким образом, увеличивают общий G+C состав гена. И наоборот, наблюдается пониженное содержание Phe (2,3%), Тут (4,3%), Не (4,0%), Met (1,8%), Asn (3%), Lys (4,8%), которые увеличивают содержание А+Т.

Интересно отметить, что подобная тенденция наблюдается также в ряде генов из лругчх бактериальных штаммов, характеризующихся повышенным G+C •составом хромосомной ДНК. Таким образом, ген ФАГ из Pseudomonas sp.101 не

10 20 AlaLysValLcuCysValLcuTyrAspAspProVaiAspGlyTyrProLysThrTyrAla

30 40

ArgAspAspLc-üProLysXlcAspHisTyrProGlyGlyGlnThrLouProThrFroLys

so 60

A?aIXeAspPhoThrProGXyGlnLeuLeuGXySerValSerGlyGlul,euGXyLeuArg

70 .80

Ly3TyrLouGluSerAsnGXylUsThrLcuValValThrSerAspLysAspGXyProAsp

90 100

ScrVaXPheGXuArgGXuLcuValAspAXaAspValVaXIXeScrGlnProPhcTrpPro

110 120 AXaTyrLeuThrProGluArglleAXaLysAlabysAsnLeuLysLouAlaLouThrAXa

130 140

GXyXleGlySGrAspHisVaXABpLeuGlnSerAXaIXGAspArgAsnValTftrW>.IAla , ValThr

150 160

GXuValThrTyr^|AonSsrIlcSorValAlaGluHisValValfiGtMetricLouSar

170 180

LauValftrgAonTyr'LcuProSerHisGluTrpAXaAirgLycGlyGlyTrpAsnlleAla

190 200

AspCysVaXSorlliaAlaTyrAspLeuGXuAXaltetHisVaXGXyThrValAlaAXaGXy

. 210 220 ArgIXcGXyLouAXaVaXLouArtjArgLQuAXaProPhGAspVaX//isTJoullisTyrThr

IlisVal

230 240

ASpArgnisArgLcuProSliiGGrValGXuLyr.GXuLeuAisnLisuThrTrpHlsAlaThl:

. " 250 2c0

ArgGluAspttatTyrProValCysAspVa XValThrLouAsnCysProLeuiiisProGlu

270 200

,TI«rGluHis!totXloAsnAspGluThrLouLyotouFheLysArgG.lyAlaTyrIlGVal

290 " 300

AsnThEAXaAL'oGl'/LyQl,ouCyf;AGpArgAcpAXaValAXaArgAlaLc'jGluSerGly

310 320

ArgLeuAXaGlyTyrAXaGlyAspVaXTrpPheProGXnProAiaProLysAspHisPro

3.10 3.10

Tr pArgi'IirMatPr oTyr/jsnG XylletThcEr опд ai;1-asq cg,1 y.%r£hr&cun:hra X а Asp ' ' •

350 " • 360

GXnAläArgTyrAlaAlaGXyThrArr!GI'UlüqX/=l^iiCyflPbcEhGGluG^\r3?ro

.370 . 330

IlüArgAr^GluTyrtoiiIleValGXtlGXyGlyAlaLcuAXaGlyThrGlyAlaltisSer

320 4 00

T'/rSogT..ycnl,Msrir>XaThrGlyGlySorGX'JGluAXaAlnLysPhcI.vsLvr.AlnV.Tl

Рис. '1. Лнш1скисл0тиал последовательность ФЛГ из Pseudomonas sp.101, полученная из структуры гена. Наклонный шрифтом выделены ошибки в аминокислотном секвенирташш (шиаше аминокислоты). Кроме того указаны nocACWüia 7 пмшюкислот, иг обнаруженные в белке [28}

является исключением и подтверждает ранее выдвинутую концепцию о приоритетном влиянии G/C давления, по сравнению со всеми другими факторами, на частоту использования колонов. Таким образом, следует ожидать, что сравнение частоты использования колонов в гене ФДГ из Pseudomonas sp.101 с генами из других организмов, заметно отличающихся содержанием G+C а геномах, покажет значительные различия, что и наблюдается при сравнении, например, с генами ФАГ из Methanobacterium formlcicum (G+C 41%) i> E.coli (G+C 51%). Несколько иная картина наблюдается при сравнении с частотой использования колонов о гене NAD-зависнмой ФАГ из дрожжей Hanscnul:i polymorph* (табл. 1). Из таблицы 1 видно, что существует общая тенденция при использовании колонов. Отмстим, что существенные различия и чистоте использования колонии могут отрицательно повлиять на экспрессию генов чужеродных организмов в E.coli, и ото необходимо учитывать.

Сравнение пуклеотидной последовательности гена ФАГ из Pseudomonas sp.101 с генами, кодирующими ФАГ из Exoli и Metluiuoluicterium formicicum, показало отсутствие какой-либо значительной гомологии между анализируемыми, последовательностями. Другой результат получается при сравнении генов NAD-завнеимых формиатдегидрогеназ из мстилотрофных микроорганизмов Pseudomonas. sp.101 и Н. polymorpha. Сравнительный анализ этих двух последовательностей при использовании пакета программ PCGENE привел к слслущему результату. Из 1200 нуклеотидов для гена ФДГ из Pseudomonas sp.101 и 10X3 нуклеотндоц для ФДГ нз Н. polymorpha 647 оказались одинаковами, что составило 59,7%. Транслирование нуклеотидных послелооатсл1.постен и сравнение полученных полипептидов привело к величине гомологии, рапной 48,9%,' что практически не отличается от результатов сравнения аминокислотных послсдователынкггеи, когда использовались данные по пептидному секвснироваишо ФДГ из,Pseudomonas sp. 101 (482.%у. Если применить метод сравнения эволюционной консервативности к NAD-зависнмым формиатдегкдрогеназам на примере ферментов нз метилотрофньк дрожжей 1 [.polymorpha и бактерий Pseudomonas sp.101, то можно получить грубую оценку скорости эволюционных изменений о этом (клее. D соответствии с п аллодом Аайхофф (Dayhoff), за схорость эволюции принимается велпчшш, равная количеству принятых точховых мутаций на .100 остатков (РАМ) за 100 миллион!» лет. Если предположить по Шлегелю, что прокариоты и дрожжи разделились примерю 2000 миллионов лет назад, то для рассматриваемого класса формиатдггилрсгсиаэ можно получить величину скорости ьсол.-оцин, рапную 2-2,5 РАМ за 100 или. лет. Сравнение этой величины с 0,9-3,4 для АДГ и ГАФД позеолягт поступить ФДГ р один ряд с этими фермерами, которые, как считается, принадлежат и нянислсе консервативным полнпегггнлам. '

Поиск прокариотнческих промотороподобиых последовательностей, характерных для E.coli, осуществляли при помощи пакета программ PCGENE. Результ,\п,Г анализа свидетельствуют о том, что по всей вероятности на исследуемом участке нуклеотндной гшслсдопатсльноси отсутствуют сгру'ктуры, которые эффективно распознаются РНК полпмеразой E.col!. В результате поиска возможных участков связывания рибосом была предсказана единственная область, находящаяся о районе позиции 460, которая представляет собой первую букву стартового ATG колона гена ФЛГ. Рядом, на расстоянии 7 нуклеотпдов располагается предполагаемый сайг связывания рибосом с мРПК (область ШаГшо-Лальгарно) AGACÁGAGG. Анализ нуклеотидной последовательности, непосредственно расположенной выше ATG колона, показал, что он в значительной степени комплементарен З'-котшюй части 16S рибосомноп РНК. Оптимальным расстоянием между АТС колоном и сайтом связывания рибосом для E.coli считается 7 пуклестилоо, следовательно, можно ожидать Достаточно эффективную трансляция матричной РНК (мРПК), колирующей ФЛГ, о клетках Е. coü. Расчет возможных вариантов вторичной структуры этой области, выполненный при помощи программы DNAS1S, (тодгвержлает данное предположение.

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ФОРМНАТДЕГПДРОГЕНАЗЫ В E.coli.

1. Разработка методики иммуиохнмнческой детекции фсрмизт^егидрогенау,) в клетках E.coli.

Для идентификации рскоибннант.чых клонов E.coli, экспресснрующих 'tysr.epfluyiyîO ФАГ, был разработай метол нммунохнмнчсского дот-блот анализа с исполизооаикгм гфйлпчы« палпкленальных антител против NAD-завнсимой Сорг«1атАДГпдрйгй!а?м «a Psçudomonas sp.101. ;Лля повышения специфичности антител была негшльзооаиа аффинная хроматография на колонке с ítf.fHc&MfsicssrHioí! ФЛГ fiá DrCN-Virumpoesinroíi агарозе, согласно методике, .oratçatatoTt ранге. Ддп полного нзбежишя иеспецнфнческого связывания кроличьи антитела были прспумепы через колонку с бесклеточным экстрактом штаммов Ecoîi AD23l)t i! TG!, который был иммобилизован m таком же носителе. Эгн два зтатх nwtafio» kp:rrf!'ïck"Mit лая «ляозптпкй селекции рекомбниантных клонов, з;:спргсс!фу!е!!глх ФДТ*. Псюлъзоаодз пвнарч-Оиотнновой системы привел^ к a;m':i!!''ï? гредеда сЗ'чррЧягй по .>-~;,.wcfi мере в пять раз, что дало нам гсшга'зихгп» лсТсглтп'птп. наличия 'пггм-сна » количеств;« до 5 пг на образец. Oía г"ла дот-Слот ч"1лкза были успешно использованы для нммуноскрннннга 0птгг'Лi^лгïго"« ФЛГ!:« !':ггрОцсллк>л«т-'.к rçnwqwî.

2. Создание систем вектор - хозяин, обеспечивающих 1 экспрессию формнатАсгилрогсназы.

Анализ экстрактов клеток, полученных из рекомбинантных клонов E.coli, содержащих фазмиды XpFDHl, XpFDH2, XpFDH3.u плаэмнду pFDI И выращенных как в присутствии, так й в отсутствии индуктора, на наличие формнатдегидрогеиазной активности привели к отрицательному результату. Наиболее вероятной причиной такого поселения гена ФАГ, как это Следует из результатов анализа нуклеотндной последовательности,Моасет быть то, что РНК.-полнмераэа E.coli не " узнает" промоторпые элементы, фуикционнрукшше с Pseudomonas sp.lOJ при росте на метаноле. : ,

Поэтому первым шагом к достижению экспрессии гена ФЛГ » l:.Co!i было использование достаточно сильного, легко регулируемого (при помощи tPTG) tac промотори лактозного оперона Е. coli (plue), который расположен ншюсрелсгиенно перед полнлинкером плазмнды pUC19, Так как направление транскрипции гена ФДГ было известно, то llindlll - Bglll фрагмент плазмиды pFDl H, содержащий ген ФДГ\ был клонирован в полнлипкер плаэм11ды pUCll), и и результате была получена ллазмида получившая иазранис pFDH2, (рис. 3, рнс.5). Результаты анализа экстрактов клеток Е. coli, содержащих зту плазмнду, надставлены в таблице 1. Анализируемые экстракты показали наличие (рормнатдегилрогеиазнон активности в количествах, легко детектируемых обычными спеетрофртометрпческими методами. Дальнейшая модификация нлазмиды pFDI 12 привела к созданию плазмиды pFDI!3, которая iipuiiuumiaлит .не отличается от pFDII2, за исключением делении (последовательности и 151) иуклеотцлив, и появлением дополнительных сайтов рестрикции, и том числе и HauilU (piic.5). При анализе экстрактов клеток E.coli, содержащих илизмиду pIDI 13, наблюдалось небольшог, но воспроизводимое увеличение формнатдегидро/Чч^зно/! иктшщвст fío сравнению с pFDI12 (табл^ 1). Для дальнейшего повышении экснрсссии гена ФЛГ решено было использовать тандем двух промотороа: lac, ходящего в состав плазмиды pUCl'A и tac нз pDR540. В результате была получена илазмиди pFDH<! (pucJ). Результаты определения формнатдегидрогеназиой активности и экстрактах клеток E.coli штаммов TGI и AD2463, содержащих плазмнду pFDH4 (it cpannemic с pFDII2 и рГОШ), представлены в таблица 1. Содержание NAD-a^miçiiMoîi формийТАСгилро^ЫШи ь клеток E.coli ÁB2463, выращенных «a Lß«

среде до позд«еЯ лШф1ф.М0Цё1:>иЯ1 фазы роста без нидукини ll'TG, составило примерно 6-7% от суммарного растаоримсто белка. Этого урйзня: ciHrrcan сполна достаточно для того, чтобы можно было легко выделть »tíAÍ¡ дАЯ-1$з>«г1ВИ.ес.

р1ае ШпДШ Ц50 Ьр| Мги! депо

—сф>—сшнш--(шншн^гс2 тж|у-

огм

?1ас НЫШЦ ВапШ ГЛЬ деле

рп)нз

ог> |-1 з^сс^иа иагкег

рЬс Шл<Ш1| ^ас | ЗапШ МЬ зет

Ш1Й4

—| от }——г--—--1 5с1есИие паг1<еу~

Рисуисх 5. Схематическое изображение трех плазмнлных консгрукшш способных обеспечивать сшггез акткзной формиатдегндрогеназы.

Таблица 1. Уровень активности ФАГ в различных штаммах E.coli (мкМ/мнн/мг.

белка ).

Штамм и условия pFDH2 ПЛАЗМПЛА pFD113 pFDlM

E.coli TG1 0,016 0,016 0,17

E.coti TGI + IPTG 0,23 0.30 0,5

E.coli AB2463 0,27 0,37 0,85

Таблица 2. Сравнение кинетических параметров натнвнои ФАГ из Pseudomonas sp.101 и рекомбинантной ФАГ Pseudomonas sp.lül из E.coli.

по NAD+, шМ Kn) по формиату, шМ

рекомбинантная формиатАетдрогеназа 0,14 ± 0,04 7,5 ± 0,6

нативная формиатАегидрогеназа 0,11 ± 0,02 14,0 ± 0,7

изоформы натнвной форм катдешлрогеназы [26] 1) pl= 5,2 2)р1«5,1 3) pi в 4,9 4) pi = 4,2 0,11 ± 0,03 0,12 + 0,02 0,12 ± 0,02 0,14 ± 0,03 8,0 ± 03 14,0 ± 0,8 14,0 ± 0,7 18,7 ± 0,8

физико-химических свойств, а также использовать полученную конструкцию для экспрессии гена ФЛГ, который в ближайшем будущем предполагается подвергнуть сайт-спеиифнческому мутагенезу.

3. Выделение и физико-химические свойства ФЛГ, синтезируемой в E.co!i.

Выделение формнатдегидрогеназы из E.coli AB2463(pFDH4) проводили по методике, разработанной для выделения ФЛГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101. Результаты SDS-электрофореза и ВЭЖХ указывают, что рекомбннантный фермент !гмеет ту же молекулярную массу, что и натнвная ФЛГ. Лополнительные подтверждения того, что синтезируемый белок является формиатдетидрогеназой, были получены с помощью нммуиоблоттиига. Однако в нативном электрофорезе рекомбинантная ФЛГ дает только одну основную полосу в отличие от исходного фермента, причем электрофоретическая подвижность рекомбинантной ФЛГ совпадает с менее подвижной нзоформой нативном ФДГ. Кроме того, хотя иативньш и рекомбннантный ферменты имеют одинаковые в пределах ошибки эксперимента величины констант Мнхаэлиса по NAD, Км по формиату рекомбинантной ФЛГ ¡вдвое ниже (табл. 2). Различия в наблюдаемых свойствах препаратов нативной и рекомбинантной ФЛГ можно объяснить с помощью следующей модели. Полноразмерный ген ФДГ кодирует белок, состоящий из 400 аминокн"слот, в то время как при аминокислотном секвепнровании было найдено только 393 аминокислоты (рис. 4). Отметим, что среди недостающих семи аминокислот на С-коице ФДГ имеется три остатка лизина. Поскольку С-конец, ■ согласно данным рентгеиоструктурного анализа, очень слабо структурирован, то вполне вероятно предположить, что после синтеза фермента в Pseudomonas sp.101 концевые аминокислоты могут отщепляться с помощью протеаз типа трипсина. В результате такого отщепления будут образовываться нэоформы, р! которых будет уменьшаться. При отщеплении концевых аминокислот общий отрицательный заряд белка увеличится, а молекулярная масса уменьшится, в результате чего подвижность ФДГ в нативном электрофорезе должна повыситься, что и наблюдается в эксперименте. Рекомбинантная ФДГ синтезируется в E.coli в виде полипептида размером 400 аминокислот. Этот белок должен иметь наиболее высокое значение pl по сравнению с р! различных изоформ иатнвной ФДГ, что я видно при аналитическом изоэлектрофокусировании Результаты изоэлектрофокусирования свидетельствуют о том, что в случае рекомбинантной ФДГ, ее pl совпадает с наиболее щелочной изоформой нативной ФДГ. Кроме того, значения Км по формиату у них практически- одинаковы. Таким

образом, можно полагать, что а случае рекомбинантиой ФАГ сннтезцруется-полноразмерный белок, имеющим одинаковые свойства с наиболее щелочной иэоформой натишюй ФАГ из Pseudomonas sp. 101, " »

ВЫВОДЫ.

1. Проведено клонирование гена формнаТдепьдрогенаэы из метнлотрофных бактерий Pseudomonas sp.löl а составе фазмидного вектора xpSL5 a Escherichia coli. Показано, что геи формиатдегндрогенззы располагается b EcoRI фрагменте хромосомно»! ДНК размером 15 тЛл, Показано, что Ген располагается в Hindill -Bglll фрагменте ДНК, размером 2,3 tjui., и; транскрибируется о направлении iiindlll -> Bglll.

2. Определена первичная структура гена формиатдегндрогеназы н прилегающих к нему областей. Доказано наличке' открытой рамки считывания, размером 1200 нуклеотидов, кодирующей полипептид длинной 400 аминокислот, почти полностью совпадающий с аминокислотной последовательностью формнатдегидрогеназы, полученной ранее при пептидном секеёиировании. Сравнение структурных частей генов формнатдегндрогеназ из метнлотрофных бактерий Pseudomonas sp.101.ii метнлотрофных дрожжей Hansenula potymorpha показало наличие 59,1% гомологии. В 5'- области, размером-'460 нуклеотндоо, примыкающей к гену формиатдегндрогеназы, не обнаружено последовательностей, характерных для промоторолодобных структур Escherichia coli.

3. Показано, что критической стадией для синтеза формиатдёгидрогеназы в Escherichia coli является стадия тракскрйпцшц Получены 3 различные конструкции, обеспечивающие эффективный синтез (до 7% растворимого клеточного белка) активно» NAD-эависимои формиатдегидрогеиазы в Escherichia coli.

4. Проведено сравнение свойств натиинон и рекомбинантнон формиатдегидрогенаэ. Показано, что по фнзнко-хнмическнм и - кинетическим характеристикам синтезируемая в .Escherichia coli формнатдегидрогеназа соответствует наиболее щелочной изоформе формиатдегидрогеиазы, выделенной из Pseudomonas sp.101. Предложена модель, объясняющая существование нескольких изоформ NAD-зависимой формиатдегидрогеиазы из Pseudomonas sp.101.

Список работ опубликованных по теме 'диссертации. I. Bogdanova A.V., Tishkov Vi, Cherednikova T.V., Calkin A.G., Egorov A.M. Immunochemical detection of microquantities of bacterial formate dehydrogenase.// Anal.Letters 1989 - V22 - N 13&14 - P2761-2770.

Z Egorov A.M, Galkin A.G, Tishkov V.l. Formate dehydrogenase gene cloning.// Progress in recombinant DNA technology and application. /June 3-3, 1S90, Potosi, Missouri, USA/: Abstracts -1990 - P.77. ,