Сравнительное исследование структуры и свойств бактериальных NAD+-зависимых формиатдегидрогеназ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Из правах рукописи

•ГЛАДЫШЕВ Вадим Николаевич

УДК 577.15.02

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ NAD -ЗАВИСИМЫХ Ф ОРМИ АТДЕГИДР ОГЕНАЗ .

(02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

АВТОРЕФЕРАТ ' диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ч v Москва —1992 г.

Работа выполнена ва кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета им. МВ. Ломоносова.

Научный руководитель: лбл. Егоров АМ. _

Научный консультант: кхн. Тишхов ВД.

Официальные оппонеягы: доктор биологических наук Наградова НХ кандидат химических наук Габибов АГ.

Ведущая организация Институт биохимии им. АЛ. Баха РАН.

Защита состоится 1592 г. на заседании специализированного

Ученого совета N ДЯ53.05.76 при Московском Государственном Университете им. МЛ5. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3, Москва, Ленинские горы, Химический факультет МГУ, аудитория 202 корпуса кафедры химической энзимологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М£. Ломоносова.

Автореферат разослан:"_" _ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химически наук

■'УХ/'

О А: Кост

ОВЩА.Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В последнее время особое внимание улгляетег i\'AD ^-зависимой формиатдегидрогегазе (К.Ф.1.2.1.2, ФДГ). Этот фермент играет важную роль . з метаболизме метилотрофов. Формкатдегидрогеназа катализирует реакцию окисления формиата до углекислого газа при сопряженном ¡юсстанОЕЛешт NAOT до NADH. Зга реакция является последней стадией в полиферментной цепи окисления метанола к является основным источником энергии в метклотрофных микроорганизмах при росте на метаноле.

Исследование формиатдепгдрогеназы предегазляет ' собой как теоретический, так и практический интерес. Возможность моделирования с ее помощью процессов, дегидрирования, эволюционная неоднозначность, громадный биотехнологический потенциал - лишь одни из немногих причин

такого интереса.

Несмотря на то, что дрожжевые ФДГ хорошо изучены, среди бактериальных формиатдегидрогепаз есть подробные данные лишь для ФДГ из ' Fse.udcmcr.as sp. 101. Недавние к продолжающиеся з настоящее вре;>«л работы, связанные с генетической инженерией и ренпенсструктурным анализом этого фермента, подпяля наше по штампе функционирования ФДГ на новый качественный вровень. Эги исследования кататпируют изменив рекомбинангных форм фермента, чрезвычайно важных и в теоретическом, и в часах» • прак.пкеском атаке. В настоящее время в нккях знаниях об этом фермсяге есть еще много, белых пятек. Одним иг важных вопросов здесь является проблема мккрогеттгрогекносги формиаг.гегидроггназы. Изучение этого явлгша,.а также выделений новых формиатдегидрогенгз к изучение их свойств несомнекйо внесут существенный вклад в понимавие особенностей я закономерностей функциоиировакия этой интересной группы ферментов. '

Диссертация ' посвящена хыделению новой. NAD+-3actiOiMOÄ формкатдсгядрогенязы мегилстрсфных бактерий Мгя&оагНшг. vazene N10, яссяедогасЕНЮ свойот рекомбиьакгного Ссл~а ?°nuecrronas in. 101, 3Kciipsc!r.ipOiia-;".?OTo % Escherichia coli, к ' созместпуму сравнительному чееяедоаанию структуры к свойств этих Агрментоз, а также фор'.1яатдегидрог«'.азы :<з Psaidomsszat sp. 301.

Цель и ачяь'чя ясгаЪйрвакия. Нгсгогщаг работа &гла предпринята с целью, срарюптельного нэу»ек>а свойств и огрует)риых характеристик бактериальных КАВ+-зависимых формиатдегидрогенаг. В связи с этим были посгакяепм следующие задачи. / ^^ '

1. Выделить новую NAD +-заЕисимую ФДГ из метилотрофных бактерий Mycobacterium vaccae N10 и изучить ее свойства.

2. Выделить рехомбинантную ФДГ Pseudomonas jp. 101, экспрессированную в E.coli, изучшъ ее свойства и сравнить юс со свойствами нативной ФДГ.

3. Исследовать явление микрогетерогенности ФДГ го Pseudomonas ip.lOl.

4. Провести сравнительный анализ бактериальных ч ФДГ и выявить особенности и закономерности их функционирования.

Научная_новизна. Впервые выделена NAD "^-зависимая

формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Mycobacterium vaccae N10, ее свойства исследованы и сравнены со свойствами других гомодимерных формиатдегидрогеназ. Исследовано явление микрогетерогенности ФДГ из Pseudomonas зр.101, предложена экспериментально обоснованная модель образования изоформ ФДГ га Pseudomonas sp.101.

Практическая значимость работы. Работа является составной частью проводимых на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ комплексных исследований структуры и механизма действия NAD+-зависимых формиатдегидрогеназ.

' Новая формиатдегидрогеназа, выделенная из Mycobacterium vaccae N10, является одним из лучших кандидатов для использования в биотехнологических процессах с системами регенерации кофактора. Определение особенностей и закономерностей функционирования бактериальных NAD +-загксимых формиатдегидрогеназ дозволяет предсказывать свойства и методы исследования для . новых бактериальных формиатдегидрогеназ и использовать формиатдегидрогеназы как модельные ферменты.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 14 Всесоюзном съезде по общей и прикладной химии (Ташкент, 1989), XX съезде' ФЕБО (Будапгшг, 1990) и научной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Пущино, 1992).

• Публикации. Основные материалы диссертационной работы отражены в 5 публикациях, приведенных в конце автореферата.

Объем работы. .Диссертация состоит ш введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 110 страницах, содержит 20 рисунков и 13 таблиц. Список литературы включает 138 ссылок.

результаты и их ос-сум-гдникг:.

.¡.'. О:'-3ЛйЧСИ AlА51 ФСР'ЛИАТДЕГИДРОГКНАЗА КЗ МЕТИЛО! РОчУ;-,'ЫХ

Бл.ХТНРМЙ /■Áycob'icfcrrjm угссае Kill.

i. С кг ч; Mycnbscterium vaceaet N10. •

ÍUr..:¿ínirorr;c^,r?Erí б»ктя>ий libia ии»у-;ол ж ;.1!:«рс6чолоп«ескои коллекции биологического факультета МГУ. Формиатдегидрогеказа из этих бактерий, ь отличие от многих других бактериальны* формиатдешдрогеназ, б:.-1ла стабильной е экстрактах клеток и не теряла активности з течение нескольких часов при нагревании до 55°С. Удельная активность фер.-.гента в клеточных экстрактах была разна 0257 мкмоль/мин на иг белка, что является достаточно ropoiLTo.í показателем как для бактериальных, так и для /т.т.|<жевы;: ФДГ.

Экспериментальный анализ различных схг:с ФДГ из

с'сси:;сг1и>п vsccae N10 показал, что нзилутогам» гп'-ля'оте;: методы, r.sjiK.-isuoiuH's гидрофобную уроь'агографггк? как осгокную палию очистки Ф^чмстя. Метода."* вилеясяян, предкоженна» нами, з пршшкие била похожа на пр«длагав<ли'лся pairee и включала ь себя стадии раарушегкк клеток ультразвуком, центркфугаролаш1.;!, фракциониреззнмя сульфитам аммония, гйлрофобгюГ; хроматографа ¡ta фенил-сшгсхрс^е х кт-проткающей KPLC. Фермент бмл счищен в 22 раза с гыходом 709&. Гомогажосп. фермента была подтверждена данными SDS-элек'дрофореаа и электрофорез^ в недекгтурируючгк условиях.

О'.омстзз ФДГ.

OcHOSTíbie свойства ФДГ ю Mycobacterium vaccae N10 представлены в таблице 1, для сравнения также показаны юрсстяые из литературы свойства ФДГ из Fseudomonus sp. 301 и Moraxella ip-strain C-i. По данным SDS-олектрофореза и электрофореза в нед£"-тур!?рующих условиях фермент имеет модекульр^то маку около 88 ада и ахтоит из двух илгктич^ьк субьедккиц с молекулярными массами, около 44' кДа. По данным шозлектрофохус^-рога.чля ФДГ и» Mycobacterium vaccae N"10 имеет щпзлектри<:е."куто точку pi 4.6.

•Как -и .-другие.... .хлмодимгтиые ФДГ, формиатлегаяроггназа из Myccbe-Xerium vacate N3.0 лараи^азуетсч зыедакой субстратной специфичностью. Формиат является елияпиевкым найденным субстратом átoro. фермента,. а '•... NAD+ - единственным " ксферментом. Формиа'гдегксрогеназа '• способна . восстанавливать также1 синтетическое произвоотсе кофггтера' г карбокснмёзнл-" NAD■ однако эффективность катализа составляет прл этом лишь r»09í>.

Таблица 1. Свойства гомодимерных NAD +-зависимых формиатдегидрогенэз из метилотрофных бактерий Mycobacterium vacca» N10, Pseudomonas sp.101 к Moraxella jpjstrain C-l.

Формиатдегидрогеназа из

Свойства М. vaccae N10 Pseudomonas sp. 101 . Moraxella spst.C-l

Уд. активность, мкМ/мин/мг белка б (37°С) 11 (37°C) 6 (25°C)

Молекулярная масса, Да 88 ООО 88 000 98 000

Субъединичный состав с2 al- at

Масса субъединицы 44 ООО , 44 000 48 000

Число изоформ 1' ' „ 5-7 1

Изоэлектрическая точка 4.6 4.6-5.2 ' 3.9

Кофактор NAD + NAD + NAD +

Субстратная специфичность формиат формиат, формиат

S-формилглутатион

Кт по формиату, мМ 20 15 13

Кт по NAD+, мМ 0.2 0.11 • 0.068

pH-оптимум 5.0-10.0 • 6.0-9.0 6.0-9.0

Оптимум температуры, °С 57 55 55

Энтальпия активации 403+50 510+60 H

термоденатурации, ДН#, кДж/моль

Энтропия активации 271+19 290+30 / H

термодгкатурации, знт.ед. J

Взаимодействие с антителами + + н

против ФДГ из Pseudomonas ip.101

Число SH-групп 12 14 н

Ингибиторы Hg2 + , Cu2 + , ДТНБ, Hg2 + , ДТНБ, Hg2 + , Ag+, ДТНБ, CN-,

N3-, SCN", CN- N3", OCN-, CN- N3", гидроксиламин

Стабилизаторы ЭДТА ЭДТА ЭДТА

H - не определено.

Величины Kln в 0.1 М калий-фосфатном буфере, рН 7.0, равны 20 ыМ для формиата s: 02 мМ для NAD+. Эти данные согласуются с данными для других гомодкмерных ' NAD+-зависимых формиатдсгадрогеназ, которые также имеют невысокие значения Km по NAD+ и высокие - по формнату.

Исследование рН-зазисимсстен кинетических параметров реакции формиата показало, что активность фермента остается практически пстяниой ч широком диапгзстгс рН от S .по 10. Б интервале рН от 5.5 ло 9.0 практически не изменяют свое значение хоястгнты Михгзлига. no NAD"1" и по формиату. Неизменность кинетических параметров в сталь широком диапазоне рН свойственна и другим бактериальным форыиатдегадрогеназам. В случае дрожжевых ферментов этот диапазон несколько уже.

-• Ингибиторный анализ ФДГ из Mycobacterium vacate N10 показал, что, как и в случае других гомодкмерных ферментов, наиболее сильно активность ФДГ кигабкруется сульфгидрильными реагентами, такими: как ДТНБ, некоторыми танами металле-.« (Bg^+ и Сд^*), а также небольшими линейными анионами (Ыу, CN" к SCN"). В концентрациях более O.i i/j инптбчтором является также >:лортц:-иог\

Под докстзпем ДТНБ происходит модификация сул:^фгидр;:льнь!х групп ФДГ, приче;.? » разных условиях, в заьисимссги от того, присутствует в растворе денатурирующий агент (мочевшта) или нет, модифицируется разног число SH-Фупгт. Модификация двух сульфгадрильных групп ал молекулу фермента приводила к ".толпой инактивации ФДГ. Общее число SH-грулп в молекуле фермента, определенное тьпровагяем ДТНБ з присутствии мочевины, было равно 12. Эти результаты находятся в соответствия с литературными данными: г. халдой и? исследованных гог-'од.ч мерных ФДГ есть две, БН-гоуппы, модификация кагорах. приводит к инактигацни фермента. В то w. сремя общее число судьфпшрильных групп в молекулах формиатдегидрогсказ существенно различается. Изученные, к настоящему времени дрожжевые ферменты имеют 4-6, а бактериальные - 12-14 SH-rpyna.

3. Стабильность.

Широкое применение в био-ге-хкологтескиг процессах кашли в настоящее время лишь дрожгдевые ферменты. В то r'.t гремя некоторые бгаириалькиг ФДГ лр^зосхолгг дролодгзые по ряд» караметров, я то;.; чкдяс. по стабильности. Кгшш исследования показали, что ФДГ из Mycabactenurn voccoe N10 входит в ияо таких ферментов. Активность фермента сохраняется в течение как мияимум одного • года при хранении при 4°С. При комнатной температуре активность фермента не падает в течение двух суток, и даже при 56 °С она не умёггыдается в течение 24 часов. На рис. 1 показано влияние

Время, дни

Рис. 1. Инактивация ФДГ из Mycobacterium vaccae N10 в присутствии, различных конов. Исследование проводили при 25°С б 0.1 М калий-фосфатном буфере, pH 7.0. [ФДП~Ю"5 М. (а) Фермент з отсутствие добавок, (а) 1 мМ ЭДТА, (в) 1 мМСа2+ и 1-мМ Mg2 + , (О) 1 мМ Cu2+, (v) 1 мМ Hg2+, (v) 0.01 мМ Hg2 + , (а) 1 мМ №2+ и 1 мМ WO42", (Д) 1 мМ Со2+ и 1 мМ. Мо042-.

0 2 4 6 8-Ю

Моноклональные антитела, М* 1 О

Рис. 2. .Активность ФДГ id Mycobacterium vaccae N10 как функция концентрации моноклональных антител протез ФДГ га Pseudomonas sp.iül. [ФДГ] = 10"7М. (О) Фермгнт в присутствии антител G-2, (О) фермент в присутствии антител G-30.

ионов .металлов и других соединений ка стабючькость фермента. Профили инактивации ФДГ из. Mycobactmum vaccx N10, как и в случае других бактериальных ферментов, имели ^-образный В 0.1 М калий-фосфатном буфере, рН 7.0, :: отсутствие эффекторов (контроль) формиатдегидрсгепаза rep;j7a активность за 72 часа, в присутствии ионов Са^ + и Mg"+ - в течение 48 часов, з присутствии Си~+ - в течение 16 часов. Ионы инактавировали

ф-рмсгг мгкогенно, олнако при инкубации в равных концентрациях ФДГ и попас гемгхт'ехна терялось SO'yí а;:тивнсспг, п^аче чего наблюдалась

реактивация фермента до уровня контроля. Такой необычный профиль геактмацни фермента объясняется, по-видимому, тем, что при равных концентрациях ионоз и фермента гю еле быстрой модификации

находящихся на поверхности белковой глобулы и существенных для катализа SH-rpyim происходят перераспределение состояния окисления сульфгидрилыгнх групп, в результате чего некоторые молекулы ФДГ вновь становятся способными окислять формиат. В присутствии ионов Ni и стабильность ФДГ несколько увеличивалась, а йены МиС.^" зг Сс^"1" обладали ь2чьвл стабилизирующим эффектом. Если инлКтиеядия ФДГ под действием иомов некоторых металлов обменяется способностью этих ионоз каталчзпроваг-ь процесс окисления SH-ipynn, то эффект стабилизации ферменте в присутствии вышеперечисленных ионов, за исключением чисто спекунятччных предположений, объяснить пг представляете? возможным. Как и з сл-тае других бактериальных гомодимервых формиатдегкдрог'чзз, дупиим стабилизатором ферментативной активности оказалась ЭДТА.

Исследование устойчивости фермента к. действию бысокой температуры пеггазгло, -гго ФДГ из Myccbacterium уассаг N10 ягляетгх одной из самых термосгабнльных фер'миат.чегкдрогенгз. Константа сирости инактивации гычкеяеккая из зависимости и\г 1, изменялась с О32-10Г-1 сек"1 при 63-С до 95-10"3 сек"* при 7!°С. Сравнительное исследования ФДГ ю lhmiomc:c¡s sp. 101 я ФДГ и Mycobiicíeiium vaccas N10 пг-хаззло. что ФДГ ra Mycobacteñum vatxas N?0 fcneí тйэмостаСкльна, наттр/г.-^р, пртг 65.5 °С k¡ имела значения 2.52.10" ? сек"- - aix ФДГ ж Pseudomcns ¡p.101 и 1.60'Ю'~s сек"1 для ФДГ из МуъзЫг&гЬпп vtftxce N10. Энтальпия аггизащш термоданат^рлцип ЗоТ^С"-'- активации тср»*одсяатурац;.и дл'5" для ФДГ из Mycccactsñi»л vncca: N10, клччсчсшЕ^е ít, замещлкти Ьг(к-/Т) i 1/Т, оь/ли pas-.-ы 403 кДж/моль и 1140 Дж/мояг./гргд, соответстгемго: Эп: »еятгчинь: оказала*. од;ю.'с порядка с ранее вычисленными для ФДГ из Psadamcnas то. 10? CerAic!?. r.ieíkylica, vo свтаетельствует о 'том, что в' случае ьсах это: кермешоз механизм

инактивации связан с необратимыми конформационными преобразованиями в белковой глобуле.

4. Иммукохилгические свойства.

Чтобы определить место ФДГ из Mycobacterium vaccae N10 в ряду других формиатдегидрогеназ; была ■ изучена возможность ее взаимодействия с антителами против других ферментов с помощью ' Вестерн-блот анализа. Образцы ФДГ давали 'сильный иммунологический ответ в "иммунохимической реакции с поликловальными и моноклопальными антителами против ФДГ из Pseudomonas sp. 10L Этот эксперимент показал наличие общих антигенных детерминант у двух бактериальных ФДГ. Известно, что большинство дрожжевых фермеигвз дают перекрестную реакцию с антителами против других дрожжевых ФДГ' (Izumi Y, 1989) В то же время дрожжевые формиатдегидрогеназы не взаимодействую!' (или слабо взаимодействуют) с антителами протав бактериальных ферментов, а бактериальные формиатдегидрогеназы - о антителами протиг дрожжевых ФДГ. В нашей работе впервые показана возможность взаимодействия бактериальной ФДГ с антителами против другой бактериальной ФДГ.

Некоторые мшюклональные антитела против ФДГ из Pseudomonas jp.101 существенно влияют на каталитическую активность ФДГ из Mycobacterium vaccae N10 (рис. 2). Так, антитела G-2 икгибировали активность фермента до 15% от исходной. В присутствии антител G-10 активность фермента несколько увеличивалась (на 10-20%), причем максимальная активация наблюдалась при равных концентрациях ФДГ и' антител. ,

Кроме исследования структурного родства формиатдегидрогеназ из Pseudomonas ip.101 и Mycobacterium vaccae N10 иммунохимическими методами, была сделана попытка определить близость их аминокислотных последовательностей. Для этого параллельно, в одинаковых условиях, проводили трнптичеашй гидролиз этих' ферментов. Хроматограм'мы триптических пептидов формиатдегидрогеназ в обращенно-фазовой HPLC на колонке С8 несколько различались, но имели достаточно схожий вид (Рис. 3). Кроме того, в одинаковых условиях проводили расщепление ферментов по остаткам цистеияа. с помощью 2-шпро-5-тиоцигнобензойной кислоты с последующей детекцией молекулярно-массового распределения крупных пептидов в условиях SDS-электрсфоргза. Такие электрофореграммы для ФДГ из Pseudomonas ijj.101 и ' Mycobacterium vaccae N10 имели полностью идентичный вид. Результаты этих экспериментов свидетельствуют, что исследуемые формиатдегидрогеназы имеют близкие аминокислотные последовательности.

2 15 15 21

Время, мин

Рис. 3. ' Высокоэффективная оорашенно-фазоБая хроматография триптическчх пепт^доа формилтдегидрсгеиаз на колонке Сд. (Л) Псгли^!- ФДГ in Mycobacterium vaccac N40. (ß) Пептиды ФДГ кз Pjradomnics j-v.lOi. Разделен,ie пептидов лроноляли п 0.01%-иой грчх-пору^усной кислогс.и градиенгс гцегонптрила t(0-40%).

5. С-/бог.р,:!Нкч!1!г!Й состав.

. В обычном C2ú£í.í состоянии ;-юлекула ФДГ' да Myccbactcriuiä vaccac N'IO состояла из двух идентичных, субъединиц. По данным гель-проникающей хроматографа гл наблюдалось ни диссоциации на отдгльшле субьгдинкцы, их ассоциации Сол^г чг-м ттву>: субьедикчц фермента ей.при увеличении, ни прч умгзазсики ионкзй (г буферах с моляр»осттач 0.0(11-05 I'.*). Однако з условиях капиллярного злектрс^фореза при 12 icB и ь 0Л2 М калий-фосфатном буфере, рйЕ 7.0, то ecu гго;: выдохом- напряжении т. кюкой кокчой силе, квкякчоягни» песгодьккх пиков в области с ьт5ны1яс.< стношеика» за*яда ж массе, чем, в- ьлчаг ика обигояой фермы Мы предполагаем, что в' знп усломсх происходит сорггсвэкис гссоц;татаг s* нескольких молекул фермента (Рке.4). Добавление сульфата амможя приэдтао к уменьшению высоты пиков. Таким oójoso.v, увеличение контаЯ силы способствует разрушению ассоцяг.тов. • •

Рис. 4. Электрофореграммы

ФДГ из МусдЬайепит

уассаг N10 в услозиях капиллярного электрофореза.

(А) фермент в 0.02 М калий-фосфатном 4 ч буфере (ФБ), 03) фермент' чв 0.02 М ФБ в присутствие 0.4% от насыщения раствора сульфата аммония, (С) фермент в 0.02 М ФБ з присутствии 20% от насыщения раствора сульфата аммония. (1) пик формиатдетидрогеназы, (2-4) пихи ассоциатов ФДГ. Электрофорез проводили при напряжении 12 ¿В, детекцию -при 280 нм\

О 1

2 3 4 5 6. Время, мин

Диаметр .мицеллы, А

•25 50 75 100 125 150 175 200

4

3 -

я £

§

I-<0

" 0 Ю 20 30 40 50 60

Степень гидратации, [Н20]/[А0Т]

Рис. 5. Зависимость каталитической активности формиатдегидро1еназы из МусоЪшетт -¿сосав N10, солюбилизированной в системах обращенных мицелл (АОТ-октан-вода), от степени гидратации. Для сравнения вверху похазана ткала радиусов внутренних полостей обращенных мицелл. Вертикальные черточки обозначают размеры мономерной (М), димер.чой (О) и охтамерной (О) форм ФДГ.

5

/

Для определения состава и молекулярных масс ассоцигтоз были использованы методы мнцелляркоп энзимологии. Известно, что изменением степени гидратации обращенной шщеллы, содержащей субъединичный белок, то есть фактически -а?лснет-гем размера внутренней полости обращенной мицеллы, иногда можно добиться изменения субъединичного состава олигомерного белка. С этой целью исследуют зависимость каталитической актргстягтя ст степени гидратации; максимумы на такой зависимости наблюдаются при степенях гидратации, когда размеры заутренней полости обращенной мицеллы равны размерам молекулы белка. На зависимости У/[Б] -: Ь (каталитическая активность ст степени гидратации) для ФДГ ш МусоЪаЗелит ь'ассае N10 в' системе АОТ-октал-ьода наблюдали три пика (рис. .5), соответствующие мономеркой "(одна субъединица), димерной (обычная двухсубьединичная молекула) и октамерной (8 субъединиц или 4 молекулы ФДГ) формам фермента, причем разные формы имели разные каталитичесхие активности. Таким образом, обнаружена возможность регуляции олигомерного состава и каталитической активности ФДГ мтщеллярными и электройгаретачесаши методами. Интересен также результат, показывающий принципиальную гсиможнссть функционирования одной субьединицы фермента, поскольку ранее считалось, что для успешного катализа необходима димсрнад форма ФДГ. Такого рида мицеллярные исследования ранее были проведаны только для одной формиатдегидрогеназы (Леийогаоши spЛ01), я они находятся в согласии с наигими результатами.

ИССЛЕДОВАНИЕ' МНОЖЕСТВЕННОСТИ ФОРМ НАО+-ЗАВИСИМОЙ

ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ Psbudomonas sp.i01.

Несмотря на то, что ФДГ ш Pseudomonas jp.101 хорошо изучена, к началу нашего исследования оставалось неясным, почему она имеет множественность форм и чем ее шсформы отлэтактгет друг от друга. Обычно наблюдали 5-7 юсформ этого фермента с одинаковыми по данным ЗОЗ-элехтрофореза молекулярными массами и с различными по данным аналитического юоэяектрофокусирозания точхамн pl в интервале 4 6-5,2 (рис. 6). Эги изоформы прсяадялись пр:» электрофорезе г неденатурярующих условиях в виде двух полос, одинаково красящихся и по белку, и по активности (рис. 7). Количество изоформ менялось от выделения к выделению без какой-либо закономерности.

" Нам удалось препаративно разделить изоформы ФДГ из Pseudomonas ур.101 -методом хроматофокусирования. Абсолютной чистоты каждой из

/

t •

Рис. б. Изоэлектрофокусированис препаратов формиатдегидрогеназ: (1) ргкомбинантная ФДГ Pseudomonas sp. 101, экспрессированная в Escherichia coli; (2-5) изоформы ФДГ из Pseudomonas у>.101 после их разделения с помощью хроматофохусирозания; (6) метчики. Справа показан интервал pl, в кагором лежат изоэлектрические точки ■ препаратов формиатдегадрогеназ.

1 2

'«ESSäi

Рис 7. Электрофорез в пгденатуриру.ощях условиях препаратов формиатдегадрогеназ: (1) ФДГ из Pseudomonas sp. 101; (2) рекомбинантная ФДГ.

юоформ достичь не удалось, однако вся "изоформная каша" была разделена на множество фракций. В некоторых из них наблюдалось значительное преобладание одной 'из шоформ нал всеми другими (Рис. 6). Дальнейшие исследования показали, что некоторые свойства шоформ ФДГ различаются. Так, если Кго по NAD"*' у них были приблизительно одинаковы, то Кт по формиату существенно различались (табл. 2). В общем случае, с увеличением рХ изеформы уменьшалась ее Кт по формиату. Некоторое различие в свойствах шоформ бите замечено также при воздействии на mix температуры, когда с ростом изоэлектрической точки изоформы росла и ее константа скорости термоинакгивацик (табл. 2). В то же время с помощью элехтрофоретическогс исследования препаратов ФДГ, выделенных на разных стадиях роста культуры, было показано, что соотношение изоформ на разных стадиях роста остается постоянным. '

РНКОМ5ИНАИТНАЯ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗА Pseudomonas sp. 101.

Э1ССПРЕССИРОВАННАЯ ß E.coli.

1. Очистка и свойства'рокомбинантной ФДГ.

Рскомбин.-.нтаая фермиатдешлрогеназа Pseudomonas sp. 101 экспресгировалась в штамме E.coii АВ2463, содержащем плазмиду с геном ФДГ. Фермент был достаточно термосгабклек и не терял активности при нагревании до 50°С и без нагревания в течение двух часов. Схема очистки фермента зхлючала стадии разрушения клеток ультразвуком, центрифугирования, фракционирования сульфатом аммония, гидрофобной хроматографии на фенил-силохроме и гель-пролигаюшей HPLC.

Были исследованы физико-химические, кинетические и иммунохимические свойства рекомбинантной ФДГ. За некоторыми исключениями, на которых' мы остановимся далее подробнее, они оказались идентичными свойствам нативного фермента (табл. 1).

2. Сравнительный анализ роко/лбинонтной » нагисной ФДГ.

Сравнение свойств рекембикантчон w нативкой ФДГ иг Pseudomonas

sp.101 показало, что, несмотря на чрезвычайную блтпость, эти ферменты имеют некоторые отличия:

1) Аминокислотное секвенирование. и его сопоставление с данными рентгеноярухтурного анализа (Попов В.О. и др., 1990) показало наличие 393 аминокислот в полипегггшшой цепочке каждой in субьедкниц. В то же время по данным нуклеоггидного секвенирования (Тишков В.И. и др., 1991) открытая

2-

Ser GXu Glu Ala Ala Lys Phs Lys Lys Ala Val 390 393 400

Ser Glu Glu Ala

Рис. 8. С-концевые последовательности полипептида (I), кодируемого геном ФДГ из Pseudomonas sp.101 (состоит из 400 аминокислот) и голипептида (2), последовательность которого была определена при аминокислотном секвенирозании (состоит из 393 аминокислот).

Таблица 2. Значения констант скорости -гермоинакгивации (6Со°С) и констант Михаэлисг по форм пату и по -NAD+ для различных форм ФДГ из Pseudomonas ip.101.

Формы ФДГ Km ПО NAD + , шМ Kmno /«г/ формиату, шМ мин

Нативная 0.11+0.02 15+1.2 0.150+0.015

Рекомбиналгнах 0.08+0.02 75+0.9 0.195+0.025

t Изоформы

формиатдегидрогеназы

Д) pl=5.2 . 0.11+С.02 8.0+0.7 0.164+0.Ö17 .

2) р! =5.1 0.13+0.03 14.0+0.8 0.130+0.015

3) pl=4.9 0.12+0.03 14.0+1.0 0.138+0.010

4) pi-4.6 0.14+0.02 1S3+0.9 0.112+0.018

*

- под изоформой понимается смесь, в которой содержание одной из изоформ превышает Е0%.

рамка считывания гена ФДГ кодировала белок, состоящий из 400 аминокислот (ру.с. 8). Среди недосгающих семи С-концевых аминокислот нативного фермента находились 3 остатка лизина, присутствие которых придавало бы С-концу .сильный подо;кительпь;й заряд. Отметим, что - С-хонец слабо структурирован к находится на поверхности белковой глобулы в районе активного центра. Сравнительный компьютерный анализ возможного полноратмерного Садка и иапаятого фермента без С-конца. с исгальговгмием программы РСвЕИЕ показал, что разница в семь аминокислот должна привести к сдвигу изсслеотрической точки на 05 единицы.

2) Несмотря на то, что оба фермента по данным БОБ-электрофореза имели одинаковую массу, з нативном электрофорезе рекомбинантная ФДГ

. проявлялась в виде одной полосы, а дативная формиатдегидрогеназа в виде двух полос, причем менее подвижная полоса нативного фермента совпадала с полосой рекомбинангаого (рис. 7). •

3) Нативная ФДГ амела кесксопдо изоформ в интервале р1 4.6-52, а рекомбинантная формиатдегидрогеназа проявлялась в виде одной полосы с мзоэлектрзгческок точкой 52. Эта полоса совпадала с полосой одной из изоформ нативного фермента (рис. 6).

4) Рекомбинантная ФДГ имела К;Т1 по формиату "15 шМ. Константы Михаэлиса для зооферм нативного фермента находились в интервале 818.5 тМ, причем с ростом р! изоформы уменьшалась ее Кт.

5) При одной и той же температуре (в интервале 63-71°С) рекомбинантная формиатдегидрогеназа имела большую, чем любая из изоформ нативного фермента, константу скорости термоинактнвацки, то есть она была менее устойчива к действию температуры.

6) Монохлональйые атгпггела С-2 хуже связывались с рехомбчнантней • ФДГ, чем с нативной, поскольку з случае рекомбинантного фермента

наблюдался меньший эффект ингибирования.

Сопоставление ' свойств рекомбинангной ФДГ и изоформы нативной формллтдегидрогепазы, имеющей по сравнению с другими изеформами максимальные значения. р! и к( » мкньмалыгое значение К.га. показывает, что эти формы ФДГ имеют идентичные свойства. Это позволило нам выдвинуть модель, объясняющую вышеперечисленные различия. Мы предполагаем, что после синтеза полноразмерного белка в 400 аминокислот в клетках РзеосЬтопаз гр.101 происходят посггрансляционные модификации в полипёптидпой цепочке, приводящие к отщеплению аминокислот с С-конца. По-видимому, такие отщеплезгжг происходят по остаткам лизина, находящимся на поверхности белковой глобулы и являющимися удобными мишенями для

трипсиноподобных протеаз. В зависимости от того, сколько положительно заряженных аминокислот было отщеплено с С-конца, образуются разные изоформы формиатдегидрогеназы.

Такие поспрансляциокные модификации приведут к результатам, наблюдаемым экспериментально:~ уменьшению изотлектрических точек образующихся ферментных форм (отметим, что величина уменьшения pl совпала с предсказаютой с помощью компьютерного анализа), увеличению подвижности при электрофорезе в кеденатурирующих условиях (как из-за уменьшения молекулярной массы, так и из-за увеличения общего отрицательного заряда белковой глобулы), увеличению Кт по формиату (за счет ухудшения связывания отрицательно заряженного формиата при экспонировании Glu-391 и Glu-392), з'величснию термостабильности (за счет укорочения экспонированного - в раствор С-конца) и улучшению связывания с мошшгональными аюителами, поскольку * антитела получены против дативного фермента (присутствие аминокислот с С-конца может создавать сгерические затруднения при связывании).

Рекомбинантная формиатдегидрогеназа не поддается

посттранспяционным модификациям, поэтому каждая ее субъединица состоит из 400 аминокислот. Это происходит, по-видимому, потому, что использованный для экспрессии рекомбикакгной ФДГ штамм Ecoii АВ2463 является дефектным по нескольким метаболическим путям и в нем сильно снижена протеазная активность.

Анализ литературных данных показал, что похожие изменения С-концевых последовательностей, приводящие к изменению свойств ферментов, ухе встречались в практике ученых. Это, однако, не делает предложенную для ФДГ из Pseudomonas sp. 101 модель раз и навсегда доказанной и не исключает ее возможной корректировки.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ NAD*-3ABHCMMblX ФДГ.

Сравнительное изучение свойств и структурных характеристик исслсдозанных ферментов позволяет понять их место - в ряду формиатдегидрогеназ и выявить некоторые особенности и закономерности их функционирования. Так, исследование гомодимерных бактериальных формиатдегидрогеназ подтвердило отмеченный ранее факт, что эти ферменты по своим свойствам находятся гораздо ближе к формиатдегидрогеназам эукариэтических организмов, чем к другим бактериальным ФДГ.

Исследованные формиатдегидрогеназы входят в группу гомодимерных NAD+-зависнмых формиатдегадрогеназ. Кроме уже известных, общим свойством ферментов этой группы, по-видимому, является положительно заряженная С-нонцевая последовательность. Бактериальные ФДГ внутри этой группы образуют сбою группу, свойства членов которой несколько отличаются пт свойств дрожжевых ФДГ. Таг:, например, дрожжевые ФДГ имеют меньшее •п'сло остатков цистеина, однако это не уменьшает стабильность бактериальных формиатдегадрогеназ, относительно чего имеется данные из литературы. Наоборот, по удельной активности, стабильности при хранении и при действии высокой температуры бактериальные ФДГ превосходят дрожжевые ферменты и могут рассматриваться как разумная альтернатива используемым в настоящее время в биотехнологических системах дрожжевым ферментам. Чрезвычайная близость структур и свойств бактериальных ФДГ, по-видимому, свидетельствует об эволюционной консервативности этих ферментов и может помочь в предсказании свойств и методик для новых ФДГ.

ВЫВОД Ы.

1. Выделена нсаая NAD+-зависимая формиатдегидрогеназа из метжгсгрофяь'-х бактерий Mycobacterium vcccae N10. Изучены ее физико-химические и кинетические характеристики. Показано, что структура и свойства иовой ФДГ йлюкч к свойствам ФДГ из Pseudomonas jp.lOi и Moraxella sp.slTüm С-1, эти ферменты вместе образуют группу гомодимерных NADT-3a2sncHMbix формиатдегадрогеназ.На основе - сравнительного анализа свойств NADT-зависнмых ФДГ определены некоторые особенности и закономерности их функционирования.

2.;Показано, что антитела против ФДГ из Pseudomonas jp.iül могут связываться с ферментом из Mycobacterium vaccae N10. Обнаружены и исследованы эффекты активации и иягибирования азехивности этого фермента моноклональными антителами. Показана возможность регуляции активности и олигомерного сосгаза ФД1' из Mycobacterium vsccas N10 элехтрофоретическими методами и метода? m мицеллярной эизимологии. Иа основе исследования стабильности ФДГ показано, что новый фермент является одной из лучших формиатдегидрогеназ для использования в бистехнсшогических системах.

3. Проведено исследование множественности форм ФДГ из Pseudomonas зр.101 и их соотношения на разных стадиях роста. Похазано различие в кинетических и физико-химических свойствах изоформ этого фермента.

4. Выделана рексмбинантная ФДГ Pseudomonas гр. 101, экспрессироаакная в E.coli. Показано, что некоторые ее свойства отличаются от свойств нативного фермента. Показано, что рекомбикантная ФДГ имеет идентичные свойства с одной из лзоформ нативного фермента.

5. Предложена экспериментально обоснованная модель, объясняющая образование изоформ форг.шатдегндрогеназы" посттраисляцконнымк модификациями С-хонцевой последовательности фермента.

1. Богданова АЛ., Ткшков В.И., -Лередникова ТВ. к Гладышев Е.К. Моноклоиалькые антитела к формиатдегидрогеназд меткяотрсфкых бактерий. (1S89) Тезисы докл. 14 Менделеевского сьезда но общей к прикладной химик, Ташкент, т.1, c53i.

2. Tishkov VX and Giadyshev V.N. Physical-chemical properties of isoforms of formats dehydrogenase from' Pseudomoiias w.101. (1990) Abstracts of 2C!th FEBS Met. Budapest, Tlr.534, p211.

3. Giadyshev V.N., Samoiicva K.N, Egorov A.M. and Tishkov VI. Purification ада properties of NAD'1'-dependent formate dehydrogenase from Mycobacterium vaccae N10. (1992) EurJJBiochein, in press.

4. Егоров, AJM, Гладышев, BJH, Галкин, А.Г. и Тишков, ВН. Рексмбинантная бактериальная формиатдегидрогеяаза из Pseudomonas jp.101. Сравнение с нативным ферментом. (1S92) Тезисы докл. 5-й конференции Российской Федерации "Новые направления в биотехнологии", Сб. тез. докл., М., с.116.

5. Гладышев ВВ. и Ткшков ВН. Выделение, свойства и возможность использования новой NAP+ -зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий Mycobacterium vaccae N10. (1S92) Тезясы докл. 5-й конференции Российской Федерации "Новые направления в биотехнологии", Сб. тез. дскл, М.,

Список работ, опубликованных по томе диссертация.

с.114.