Рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои Glycine max: белковая инженерия и структурные исследования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

005010406

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВА Анастасия Александровна

РЕКОМБИНАНТНАЯ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗА ИЗ СОИ GLYCINE МАХ: БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ И СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

02.00.15 - кинетика и катализ 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2011

005010406

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Готтих Марина Борисовна

доктор химических наук Туницкая Вера Леонидовна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 20 декабря 2011 года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 18 ноября 2011 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59,

кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Формиатдегидрогеназа (ФДГ'), [КФ 1.2.1.2.] относится к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-оксикислот и катализирует реакцию окисления формиат-иона в углекислый газ при сопряженном восстановлении NAD* до NADH. Ген, кодирующий ФДГ, найден в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах, а также растениях. Формиатдегидрогеназа имеет важное физиологическое значение в различных организмах. Этот фермент участвует в обеспечении энергией метилотрофов. ФДГ также играет ключевую роль в жизнедеятельности патогенных микроорганизмов, таких как Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Legionella, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, и др. В растениях ФДГ является универсальным белком стресса и ее синтез резко возрастает при таких воздействиях, как засуха, повышенная доза ультрафиолета, резкие скачки температур, действие патогенов и т.п. В отличие от микроорганизмов, в клетках растений ФДГ локализована в митохондриях и ее количество при стрессовых воздействиях достигает 9% от всех митохондриальных белков.

На практике этот фермент используется главным образом для регенерации NADH в системах синтеза оптически активных соединений. В настоящее время фирмой «Degussa» с использованием ФДГ в качестве катализатора регенерации NADH реализован промышленный процесс получения mepm-L-лейцина, являющийся одним из наиболее крупнотоннажных процессов хирального синтеза в фармацевтической химии с использованием ферментов. Помимо этого ФДГ активно применяется в биосенсорах на формиат. С помощью анализа изоферментного состава ФДГ можно определить видовую принадлежность и выявить больные растения, подлежащие вырубке.

Формиатдегидрогеназы растений имеют хорошую перспективу для применения на практике. Это связано с тем, что растительные ФДГ имеют низкие константы Михаэлиса по субстратам, что очень важно для повышения эффективности процессов синтеза оптически активных соединений. Несмотря на то, что формиатдегидрогеназная активность в растениях была впервые показана еще в 1921 г., ФДГ растений до последнего времени оставались малоизученными ферментами по сравнению с таковыми из бактерий и дрожжей. Это было обусловлено очень низким содержанием фермента в клетке. Создание трансгенных растений позволило повысить выход фермента в несколько раз, однако общее содержание ФДГ все равно не превышало 1% от общего количества растворимых белков. В нашей лаборатории несколько лет назад была создана высокоэффективная система экспрессии ФДГ из растений Arabidopsis thaliana в клетках E.coli. Также в

1 В настоящей работе приняты следующие сокращения: ФДГ- формиатдегидрогеназа, SoyFDH - формиатдегидрогеназа из сои Glycine тах, wt-SoyFDH - рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои дикого типа, AthFDH - формиатдегидрогеназа из растений Arabodopsis thaliana, NAD* - окисленная форма никотинамидадениндинуклеотида.

2009 г. была описана успешная экспрессия в Е.соН ФДГ из бобов Lotus japonicus, однако уровень экспрессии был намного ниже, чем в случае A.thaliana.

Высокий уровень экспрессии AthFDH позволили выделить ее в больших количествах, получить кристаллы и решить трехмерные структуры для свободного фермента и его двойных и тройных комплексов. Однако AthFDH является скорее модельным, чем практически важным ферментом. В нашей лаборатории также были начаты работы по получению и изучению свойств рекомбинантной ФДГ из сои (SoyFDH). Согласно предварительным данным, у этого фермента самые низкие значения Км даже среди растительных ФДГ. Кроме того, увеличение активности SoyFDH при том же уровне биосинтеза позволит значительно повысить устойчивость сои к различным неблагоприятным стрессовым воздействиям (засуха, повышенная температура, воздействие патогенных микроорганизмов). Для этого фермента в нашей лаборатории также была создана система экспрессии в клетках Е.соН, были проведены предварительные эксперименты по изучению его свойств и оказалось, что, несмотря на низкие значения Км, термостабильность SoyFDH гораздо ниже по сравнению с другими формиатдегидрогеназами. Систематических исследований этого фермента до начала данной работы не проводилось. Таким образом, исследование свойств и проведение экспериментов по белковой инженерии формиатдегидрогеназы из сои Glycine тах являются важными фундаментальными и практическими задачами.

Данная работа посвящена решению важных и актуальных проблем -получению с помощью методов генетической инженерии рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои, определению трехмерной структуры, детальному исследованию свойств фермента дикого типа и белковой инженерии этой ФДГ с целью получения мутантных форм фермента с повышенной термостабильностью и каталитической эффективностью.

Цели исследования. Основной целью работы было изучение взаимосвязи структура-функция в ФДГ из сои методами белковой инженерии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

-получение рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои в активной и растворимой форме в клетках Е.соН,

-наработка фермента для кристаллизации, получение кристаллов и определение трехмерной структуры,

- изучение каталитических свойств и термостабильности фермента, -улучшение свойств фермента методом рационального дизайна,

- объединение мутаций, дающих максимально положительный эффект. Научная новизна. Впервые проведено систематическое изучение свойств

растительной формиатдегидрогеназы, определена трехмерная структура полученного фермента, разработаны подходы для улучшения свойств фермента.

Практическая значимость работы. Получены мутантные SoyFDH с повышенной термостабильностью и каталитической эффективностью. Термостабильность лучшего мутеина возросла более чем в 100 раз при повышенных температурах, а каталитическая активность - на 76%. Учитывая высокие значения каталитической эффективности растительного фермента, полученные мутантные формы могут быть использованы для регенерации восстановленного кофактора в процессах синтеза оптически активных соединений.

Встраивание генов полученных мутантных ФДГ с увеличенной каталитической активностью в геном сои вместо генов ферментов дикого типа открывает принципиально новый подход к созданию растений с повышенной устойчивостью к стрессовым воздействиям.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: International Conference “Biocatalysis: Fundamentals & Applications” (StPetersburg, 2005, Moscow-St.Petersburg, 2007 и Arkhangelsk, 2009), Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006), 4, 5 и 6-ой Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007, 2009, 2011), Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва), VIII Международная конференция молодых ученых «Леса Евразии - Северный Кавказ» (Москва-Сочи, 2008) и «Леса Евразии - Брянский лес» (Брянск, Россия, 2011), 14th International Biotechnology Symposium. (Rimini, Italy , 2010), XIV International Conference “INPEC-2010” (International Network of Protein Engineering Centres) (Sweden, Uppsala, 2010), Международный моподежный форум «Ломоносов-2011» (Москва), ll-ая Международная конференция «Физико-химическая биология», посвященная 85-летию академика Д.Г.Кнорре (Новосибирск, 2011), XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, (Волгоград, Россия, 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей (все входят в Перечень рецензируемых научных журналов ВАК РФ) и 18 тезисов докладов конференций.

Стуктура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на /^О страницах и содержит^ рисунков, 30 таблиц и 136 ссылок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Получение рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои

При разработке эффективной системы получения рекомбинантной SoyFDH в клетках E.coli следует учитывать ряд особенностей, характерных для экспрессии эукариотических генов в прокариотах. Во-первых, гены растительных ФДГ содержат сигнальную последовательность, которая отвечает за транспорт фермента в

митохондрии. Так как в клетках E.coli митохондрий нет, то участок гена, кодирующий сигнальный пептид, необходимо удалить. На рисунке 1 показаны N-концевые участки аминокислотных последовательностей ФДГ растений и для сравнения - фермента из бактерий Pseudomonas sp.101. Черным фоном выделен остаток, после которого происходит отщепление сигнального пептида после доставки фермента в митохондрии. Для экспрессии гена изофермента SoyFDH2 использовали плазмиду p2SoyFDH2, сконструированную в нашей лаборатории ранее к.х.н. А.Е. Серовым,. Из последовательности гена soyfdh2 был удален участок, кодирующий сигнальный пептид. В результате должен был сразу синтезироваться фермент, соответствующий зрелому нативному ферменту (p2SoyFDH2 на рис. 1).

PseFDH------------------------------------------------------MAKVLCVL

HvuFDHl-----------------------MAAMWRAAARQLVDRftVGSjâAAHTSAG-SKKIVGVF

ZmaFDH---------------------------MAMWRAAARQLVDRAbGSgAAHTSTG-SKKIVGVF

LjaFDHl----------------MAMKRAASSAVRSLLTAPTPNPSSSXFSENLHASGG-KKKIVGVF

SoyFDH3-------------MAMMKRAAS S SVRS LLS S S S rFT^NLHASGE -KKKIVGVF

SoyFDHl--MSNFTLKMSDPTLAQQHLVKVHTTTHETWTTHNHWQT§SINASGE-KKKIVGVF

LsaFDHl------------------------------MAIAMKSDSGSJLtEhLHASSG-KKKIVGVF

HanFDHl----------------MAMSMAMKRSAAAATRALSSATSSSILTgDLHSSSG-KKKIVGVF

stuFDHi---------------------mamsrvastaaraitspsslvftIelqaspg-pkkivgvf

MesFDHl-------------------MKRAATSAIRAFPSSFGISGSSALGgHLHASAG-SKKIVGVF

GarFDHl----------------------MKQVANSAIKAIANSGSSSLLtEqlHASPG-SKKIVGVF

QroFDHl------------------------------MAGAATSAIKSVLt|hLHASPG-SKKIVGVF

CpaFDHl-----------------MKRAATSAIKAFASSQTSFSGLSTWFÂgNLHASPG-SKKIVGVF

AthFDH----------------MAMRQAAKATI RAC SSSSSSGY FARgQFNASSGDS KKIVGVF

McrFDH---------------MKRATASAIRAMVAS S TN S S TILSENLHAS SD-SKKIVGVF

SoyFDH2—MLNFTLKMSDPTLAQPHLVKVHTT-LETWTTHNHWHRÜSINASGE-KKKIVGVF p2SoyFDH2--------------------------------------------XNASGE-KKKIVGVF

Рис. 1.N- концевые участки последовательностей формиатдегидрогеназ из растений (HvuFDHl - ФДГ из ячменя, Hordeum vulgare, ZmaFDH - ФДГ из маиса Zea mays, LjaFDHl

- ФДГ из бобов Lotus japonicus, SoyFDH 1,2 и 3 - ФДГ из сои Glycine max, изоформы 1,2 и

3, LsaFDHl - ФДГ из латука Lactuca saligna, HanFDHl - ФДГ из подсолнечника Helianthus annuus, StuFDHi - ФДГ из картофеля Solanum tuberosum, MesFDHl - ФДГ из кассавы Manihot esculenta, GarFDHl - ФДГ из хлопка Gossypium arboreum, QroFDHI - ФДГ из дуба Quercus robur, CpaFDHl - ФДГ из папайи Carica papaya, AthFDH - ФДГ из Arabidopsis thaliana, McrFDH - ФДГ из ледянника Mesembryanthemum crystallinum)

Таблица 1.

Экспрессия рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои в клетках E.coli.

Плазмида Выход клеток с 1 л среды, г Выход фермента с 1 л среды, ед. Выход фермента с 1 л среды, мг Содержание фермента в клетках, ед/г

p2SoyFDH2b1 18,7 1780 445 95

p2SoyFDH2b2 17,0 1718 430 101

Также при экспрессии в клетках E.coli эукариотических белков следует учитывать наличие в гене целевого белка редких для штамма-хозяина кодонов. В гене soyfdh2 содержатся четыре триплета AGA и пять триплетов AGG кодирующие

Arg, а также два триплета ССС, кодирующих Pro. Поэтому, в качестве штамма-проду-цента рекомбинантной SoyFDH нами был выбран штамм Е.со// BL21 (DE3) Codon Plus/pLysS: В F" ompT hsdS{rB‘ m0') dcm* Tetr gai A(DE3) endA Hte [pLysS argU HeY leuW Cam'], экспрессирующий тРНК редких для E.coli кодонов и созданный специально для экспрессии эукариотических генов. Нами было проведено культивирование штаммов E.coli - продуцентов рекомбинантной SoyFDH. Для повышения достоверности результатов культивирования была использована плазмида из двух независимых выделений (p2SoyFDH2b1 и p2SoyFDH2b2). Результаты представлены в таблице 1. SoyFDH экспрессировалась в активной и растворимой форме с выходом около 440 мг с литра среды. Данные электрофореза в ПААГ в присутствии SDS показали, что уровень экспрессии составляет более 30% от всех растворимых белков клетки.

Изучение основных свойств рекомбинантной ФДГ из сои

Целью следующего этапа нашей работы было изучение основных свойств рекомбинантного фермента. Известно, что одним из важнейших параметров любого фермента является константа Михаэлиса. Поэтому на первом этапе нами были получены зависимости скорости реакции от концентрации кофермента и формиата при насыщающих концентрациях второго субстрата. Рассчитанные значения Км при pH 7,0 составили 13,3±0,8 мкМ и 1,5±0,1 мМ по NAD* и формиату соответственно. Исследование зависимости констант Михаэлиса от pH среды показало, что Км. как по коферменту, так и по формиату имеют постоянное значение в широком диапазоне pH

- от 5,8 до 9,8. Это позволяет использовать SoyFDH в процессах хирального синтеза совместно с различными ферментами, поскольку у большинства из них рН-оптимум активности находится этом диапазоне.

Также нами было изучено ингибирование рекомбинантной SoyFDH неорганическими ионами и было показано, что наиболее эффективным конкурентным ингибитором по формиату является азид ион, К| = (3,6±0,7)*10'7М.

В литературе в качестве меры активности белка, как правило, приводят значение удельной активности (количество единиц активности в одном мг белка). Недостатком этого параметра является то, что в процессе выделения возможна частичная инактивация фермента, в результате чего этот параметр может изменяться в зависимости от способа очистки, что часто и наблюдается при получении растительных ФДГ. Гораздо более корректным параметром, отражающим кинетические свойства фермента, является величина каталитической константы (/fca<). Поэтому следующим этапом работы стала разработка методики титрования активных центров SoyFDH для расчета каталитической константы.

Данная методика основана на эффекте тушения собственной флуоресценции фермента при образовании комплекса SoyFDH-NAD*-a3Hfl, получаемого добавлением к двойному комплексу SoyFDH-NAD* конкурентного по формиату ингибитора азид-иона. Зависимости относительной флуоресценции фермента от концентрации азид-

иона аппроксимируются прямой до величины 0,3-0,4. Значение остаточной флуоресценции после добавления азида составляет 10-12% от начальной и не зависит от концентрации фермента (рис. 2). Из точек пересечения прямых были найдены концентрации активных центров фермента, и был построен график зависимости активности препаратов фермента от его концентрации. Из вставки на рисунке 2 видно, что наблюдается линейная корреляция между активностью фермента и концентрациями активных центров, определенных методом тушения флуоресценции. Из тангенса угла наклона была рассчитана величина каталитической константы, которая составила (170,4 ± 5,7) мин'1 или (2,9 ±0,1) с'1.

В таблице 2 суммированы данные по кинетическим параметрам и каталитической эффективности для ФДГ из бактерий, дрожжей и растений. Из этой таблицы видно, что у растительных ФДГ значения констант Михаэлиса как по NAD*, так и по формиату, ниже, по сравнению с таковыми у ферментов из микроорганизмов, причем в случае SoyFDH значения Км среди всех описанных в литературе ФДГ самые низкие. Несмотря на то, что ФДГ из бактерий имеют самое высокое значение каталитической константы, а величина ки( у SoyFDH почти в 2,5 раза ниже, каталитические эффективности с NAD* (отношение ксJ K„NAD*) у мутантной PseFDH GAV и SoyFDH дикого типа практически одинаковы, а в случае формиата величина отношения kcaJ KMfonma,a самая высокая для фермента из сои.

Рис. 2. Зависимость остаточной флуоресценции ЭоуРОН от концентрации тушителя при разных концентрациях фермента и расчет каталитической константы (вставка).

Таблица 2.

Сравнение кинетических параметров и каталитической эффективности

рекомбинантных формиатдегидрогеназ из различных источников.

Источник гена формиатдегидрогеназы Кинетические параметры Каталитическая эффективность

NAD* mkM і/ formate KM , mM kcati С л. / х NAD* «cat' I'm і, / ¡у formate Kcal' f^M

Pseudomonas sp. 101 65 6,5 7,3 0,11 1,12

Pseudomonas sp. 101, мутантная (GAV) 35 6 7,3 0,21 1,22

Moraxella sp. C2 80 7,5 7,3 0,09 0,97

Saccharomyces cerevisiae 36 5,5 6,5 0,18 1,18

Candida boidini 37 5,9 3,7 0,10 0,63

Arabidopsis thaUana 20 2,8 3,8 0,19 1,36

Glycine max 13,3±0,8 1,5±0,1 2,9±0,1 0,22 1,93

Изучение термостабильности ФДГ из сои

Второй по важности характеристикой фермента после каталитической эффективности является его термостабильность. Высокая термостабильность биокатапизатора позволяет проводить процессы при повышенных температурах. Также данные о термостабильности фермента важны для разработки и оптимизации метода его очистки. Поэтому следующим этапом нашей работы стало изучение температурной стабильности рекомбинантной БоуРОН. Для этого были использованы два метода: 1) анализ кинетики термоинактивации и 2) дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).

Кинетика термоинактивации рекомбинантной БоуРОН была исследована в диапазоне температур 48-56 °С и при нескольких значениях pH. На рисунке 3 в качестве примера представлены зависимости величин остаточной ферментативной активности от времени при различных температурах. Зависимости величин остаточной активности от времени представляли собой простые экспоненты (рис. 3 ) и были линейны в полулогарифмических координатах (1п(Ж40) - /, рис. 4) во всем изученном диапазоне температур и pH среды. Величина тангенса наклона прямых -это константа скорости инактивации к,„. В отдельных экспериментах было показано, что наблюдаемая константа скорости инактивации к1п не зависела от концентрации фермента, т.е. инактивация БоуРйН при повышенных температурах является истинно мономолекулярным процессом. Анализ зависимости кт от температуры показал, что она описывается уравнением теории активированного комплекса для мономолекулярной реакции. Рассчитанные значения активационных параметров АН* и АЗ* составили 370±20 кДж/моль и 830±60 Дж/(моль*К) соответственно. Из литературы известно, что такие значения АН* и ДЭ* характерны для процессов термоинактивации, обусловленных разворачиванием белковой глобулы.

1, М4Н

Рис. 3. Зависимость остаточной активности ЭоуРОН от времени при нескольких температурах, в координатах А/Ао-1,0,1 М натрий - фосфатный буфер. pH 7,0.

В поддержании структуры белковой глобулы участвуют различные взаимодействия - электростатические, ван-дер-ваальсовы, гидрофобные, а также водородные связи. Роль этих взаимодействий сильно зависит от окружения фермента и в первую очередь от ионной силы и pH среды. По этой причине следующим этапом работы стало изучение влияния этих параметров на термостабильность ЭоуРОН. Для создания высокой ионной силы нами был выбран фосфат-ион. Это было обусловлено следующими причинами. Во-первых, фосфат-ион не ингибирует фермент. Во-вторых, он имеет достаточно большой размер и не должен проникать внутрь белковой глобулы и таким образом, в основном фосфат должен влиять на электростатические взаимодействия в ферменте на поверхности, а не внутри белковой глобулы. В-третьих, более высокий заряд фосфата должен обеспечивать более высокое изменение ионной силы по сравнению с моноанионами.

На рисунке 5 представлена зависимость величины константы скорости термоинактивации ЗоуРОН от концентрации фосфата при pH 6,0, 7,0 и 8,0. Как видно из этого рисунка, эта зависимость при всех трех значениях pH проходит через максимум при концентрации буфера около 0,1-0,15 М. Следует отметить, что при переходе к высоким концентрациям фосфата эффект стабилизации составляет около 10 раз. Стабильность фермента сильно возрастает при переходе от pH 6,0 к 7,0 и затем гораздо меньше при переходе от pH 7,0 к 8,0.

Рис. 4. Зависимость остаточной активности БоуТОИ от времени при нескольких

[фосфатный буфер], М

Рис. 5. Зависимость величины константы скорости инактивации БоуРОН от концентрации фосфат-иона. 0,01 М -1,25 М натрий-фосфатный буфер, pH 6,0-8,0, 52 °С.

Увеличение стабильности белка при повышенной ионной силы раствора было использовано для оптимизации условий очистки и хранения препаратов фермента.

Использование фосфатного буфера с pH 8,0 позволило хранить раствор фермента при температуре +4 °С минимум в течение 6 месяцев без потери активности.

Сравнение величин констант скорости термоинактивации, а также данных ДСК по температурам плавления свидетельствуют, что SoyFDH является одним из наименее термостабильных ферментов среди описанных формиатдегидрогеназ. Поэтому для внедрения этого фермента в практику актуальной задачей является повышение его стабильности при повышенных температурах.

Получение кристаллов SoyFDH и определение трехмерной структуры

Создание высокоэффективной системы экспрессии рекомбинантной SoyFDH позволило за одно выделение получать более 250 мг фермента, что дало возможность приступить к экспериментам по кристаллизации. Для получения

кристаллов использовали метод висячей капли. Для поиска оптимальных условий варьировали концентрацию и тип осаждающего агента, температуру и время кристаллизации. В результате были получены кристаллы двойного и тройного комплексов [SoyFDH-NAD*] и [SoyFOH-NAD*-^'] размером и

0,5х0,1х0,1 и 0,3*0,1*0,1 мм соответственно (рисунок 6). Параметры структуры для тройного комплекса представлены в таблице 3.

Решение трехмерной структуры проводилось совместно с к.ф.-м.н. Поляковым K.M. и к.х.н. Шабалиным И.Г. Анализ структуры показал, что общая конформация в полипептидной цепи SoyFDH близка к таковой у фермента из A. thaliana. На рисунке 7 показана структура тройного комплекса (SoyFDH-NAD^-азид) с разрешением 1,9 А. Фермент состоит из двух идентичных субъединиц, одна из которых выделена синим цветом. Вторая для более наглядного представления показана схематично с помощью а-спиралей и ß-листов. Молекулы NAD* выделены розовым, молекулы азида - желтым цветом. Хорошо видно, что в субъединице имеется два ярко выраженных домена - кофермент-связывающий и каталитический. Кофермент-связывающие домены отвечают за образование межсубъединичного контакта. Видно, что между двумя субъединицами наблюдается сильное перекрывание. Такой прочный межсубъединичный контакт, по-видимому, является причиной того, что в процессе термоденатурации не происходит диссоциации белковой глобулы на отдельные субъединицы.

Таблица 3.

Количественные характеристики для структуры тройного комплекса [SoyFDH-NAD*-N3']

Пространственная группа С2

Параметры ячейки, А

а 132,85

Ь 85,23

с 85,75

Р 127,860

Разрешение 1,9 А

Rf 16.9%

Рис. 6. Фотографии кристаллов тройного комплекса [ЗоуРОН-ЫАО+ -Мз-] (А) и двойного комплекса [ЗоуР0Н-ЫА0+] (Б).

Рис. 7. Структура тройного комплекса [SoyFDH-NAD*-N3 ], разрешение 1,9 А.

Белковая инженерия формиатдегидрогеназы из сои

Как уже отмечалось выше, SoyFDH имеет одно из самых низких значений каталитической константы среди известных формиатдегидрогеназ, а также низкую термостабильность. Поэтому было решено повысить оба параметра с помощью

Рис. 8.

А Б

Моделирование замены остатка А!а267 (А) на остаток Ala267Met

(Б).

хорошо зарекомендовавшего себя метода белковой инженерии, известного как «рациональный дизайн». Этот метод основан на детальном анализе структуры белковой глобулы и сравнении аминокислотных последовательностей ферментов из различных источников. При поиске перспективных положений в белковой глобуле для введения аминокислотных замен с целью повышения стабильности фермента были использованы такие подходы, как введение дополнительных ионных пар, оптимизация взаимодействий внутри белковой глобулы (заполнение полостей за счет введения остатков с более объемными боковыми группами, уменьшение неоптимальных взаимодействий боковых групп за счет ведения менее объемных остатков), модификация электростатических взаимодействий на поверхности белка, замена поверхностного гидрофобного остатка на гидрофильные. В качестве примера на рисунке 8 представлено моделирование замены Ala267Met, позволяющей заполнить полость внутри белковой глобулы.

В результате анализа пространственной структуры и выравнивания аминокислотных последовательностей было предложено 13 положений для введения аминокислотных замен. Направленный мутагенез проводили с помощью полимеразной цепной реакции. Секвенирование полученных плазмид показало, что в гене soyfdh содержатся только те мутации, которые обеспечивают замены кодонов для выбранных мутаций. Методика культивирования клеток Е coli - продуцентов мутантных ферментов и процедура их выделения и очистки были аналогичны таковым для wt-SoyFDH.

Температурная стабильность полученных мутантных форм

Термостабильность полученных мутантных форм изучали при двух температурах: 52 и 54 °С. На рисунке 9 представлены зависимости логарифма остаточной активности от времени для мутантных ферментов, у которых наблюдали наиболее сильное изменение термостабильности. Из рисунка 9 видно, что два мутанта обладают меньшей, а пять - более высокой термостабильностью по сравнению с ферментом дикого типа. Численные значения констант скорости инактивации для всех полученных 13 мутантных SoyFDH представлены в таблице 4. Эффект стабилизации рассчитывали как отношение полученных констант скорости инактивации к таковым для фермента дикого типа. Из таблицы видно, что с помощью одной аминокислотной замены удалось достичь эффекта стабилизации до 100 раз.

Из таблицы 4 также видно, что эффект стабилизации сильно зависит от температуры - мутант М4 при 54 °С стабильнее wt-SoyFDH в 56 раз. Поэтому для наиболее интересных мутантных форм нами была изучена температурная зависимость константы скорости термоинактивации. Оказалось, что, как и в случае фермента дикого типа, во всем исследованном диапазоне температур процесс термоинактивации протекает в соответствии с кинетикой первого порядка по мономолекулярному механизму. Полученные зависимости были представлены в

координатах 1п(к,Л) от 1/Т, которые используют для линеаризации уравнения теории активированного комплекса (ТАК) для мономолекулярной реакции (рис. 10).

Рис. 9. Зависимость остаточной активности мутантных форм и ЭоуРОН дикого типа от времени в координатах 1п(А/А0) - <• с при 54 °С, 0,1 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,0.

Таблица 4.

Значения констант скорости термоинактивации для всех полученных мутантных форм при двух значениях температуры. ___________________________________

Фермент /С(„(54°С), мин"’ *,„( 54°С)*'/ к,„( 54°С)ти*. к,„(52°С), мин'1 /ст(52°С)'"7 М52°С)ти‘.

\wt-SoyFDH (5,3±0,2)*10'2 1 (3,0±0,1)*10‘2 1

ЭоуРОН С18А (6,9±0,2)*10'2 0,8 (4,1±0,1)*10'2 0,7

БоуРОН К23Т (10,4±0,2)*102 0,5 (5,6±0,1)*10'2 0,5

ЭоуРОН 1240 (20,7±0,5)*10‘2 0,3 (10,0±0,3)*10'2 0,3

ЭоуРОН К109Р (9,0±0,1)*10'2 0,6 (4,3±0,1)*10'г 0,7

ЭоуРОН VI271* (12,6±0,8)*10'2 0,4 (7,4±0,3)*10"г 0,4

ЭоуРРН М247Е (7,2±0,2)*10'2 0,7 (3,6±0,1)*10г 0,8

БоуРОН У281 (6,1±0,1)*10'2 0,9 (2,29±0,04)*10'2 1,3

ЭоуРОН Б354Р (7,6±0,2)М0'2 0,7 (4,3±0,2)*10‘2 0,7

ЭоуРРН (М1) (1,78±0,04)*10‘2 3,0 (0,63±0,02)*10‘2 4,8

ЭоуРОН (М1+М2) (0,65±0,01)*10‘2 8,2 (0,21±0,01)*10‘2 14,6

БоуРйН (М3) (0,43 ±0,03)4 О"2 12,3 0,17*10"2 17,6

ЭоуРйН (М4) 0,095*10'2 56 0,03*10‘2 100

| ЭоуРРН (М5) (1,30±0,05)*10‘2 4,1 (0,39±0,01)*10‘2 | 7,7

Линейный характер зависимостей (рис. 10) свидетельствует о возможности применения ТАК к описанию процесса термоинактивации мутантных ЭоуРОН. Из рисунка 10 также видно, что все прямые имеют различный наклон. Из полученных зависимостей согласно теории ТАК были рассчитаны значения йН* и /35*. Эти значения затем были использованы для расчета констант скоростей инактивации в широком диапазоне температур. Эффекты стабилизации рассчитывали как отношение соответствующих констант скорости инактивации БоуРОН дикого типа и мутантного фермента при одной температуре. В таблице 5 представлены значения эффекта стабилизации для некоторых мутантных форм фермента.

Рис.10. Зависимость констант скорости термоинактивации мутантных форм и дикого типа БоуРРН от температуры в координатах ЩкиД) — 1/Т, К-1,

0,1 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,0.

Если за единицу принять значение эффекта стабилизации для БоуРОН дикого типа, то из таблицы 5 видно, что при комнатной температуре мутанты БоуРОН М1, М1+М2, М3, М4 и М5 стабильнее фермента дикого типа в 9, 130, 200, 11000 (!) и 52 раза соответственно. Таким образом, исходя их данных, приведенных в таблице 5, можно сказать, что для пяти стабильных мутантных ферментов эффект стабилизации растет с уменьшением температуры. При повышенных температурах (46-64 °С) эффект стабилизации для наиболее интересных мутаций М3 и М4 составил от 25 до 5,2 и от 230 до 13 раз соответственно. Повышение термостабильности фермента может быть использовано для упрощения процесса его очистки путем введения стадии термообработки. Известно, что большое количество собственных белков и ферментов Е.соН довольно быстро денатурируют при температуре 50 °С и выше, что

было использовано ранее в нашей лаборатории для создания методики очистки рекомбинантной ФДГ из Pseudomonas sp. 101. Для мутантных SoyFDH М3 и SoyFDH М4 расчетный период полуинактивации при этой температуре составляет 28 и 185 ч соответственно. Таким образом, для очистки этих мутеинов можно ввести стадию термообработки при 50 °С в течение 30 мин.

Таблица 5.

Значения эффекта стабилизации* мутантных ферментов по отношению к SoyFDH

Т, °с SoyFDH L24D SoyFDH V127R wt- SoyFDH SoyFDH (M1) SoyFDH (M5) SoyFDH (M1+M2) SoyFDH (М3) SoyFDH (M4)

25 0,1 Г 0,03 1,0 9 52 130 200 11000

30 0,1 0,1 1,0 7 33 81 120 4100

46 0,3 0,2 1,0 4,3 9 18 25 230

48 0,2 0,3 1,0 3,7 7 14 20 150

50 0,2 0,4 1,0 3,8 6 12 17 115

52 0,3 0,4 1,0 4,9 8 15 18 100

54 0,3 0,4 1,0 3,0 4,1 8 12 55

56 0,3 0,5 1,0 2,5 3,6 5,6 10 42

58 0,3 0,6 1,0 3,3 3,1 6,2 7,3 36

60 0,3 0,7 1,0 3,0 3,6 6,2 6,9 18

62 0,3 0,8 1,0 2,7 2,7 4,6 6,9 19

64 0,3 1,0 1,0 2,5 2,3 3,9 5,2 13

* эффект стабилизации рассчитывался как отношение соответствующих констант скорости инактивации для ЭоуРОН дикого типа и рассматриваемого мутанта при одной температуре, серым фоном выделены значения эффекта стабилизации, полученные экспериментально

Рис.11. Кривые плавления, полученные методом ДСК для фермента дикого типа и мутантных ЗоуРРН, и РэеРОН вАУ. 0,1 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,0.

Температурная стабильность полученных мутантных БоуРОН также была изучена методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), кривые плавления представлены на рисунке 11. Из этого рисунка хорошо видно, что в случае мутантов БоуРОН М1, (М1+М2), М3, М4 и М5 происходит значительное повышение температуры плавления, то есть наблюдается значительный эффект стабилизации. Таким образом, результаты исследований термостабильности мутантных форм БоуРОН как по кинетике термоинактивации, так и с помощью ДСК, говорят о том, что устойчивость ферментов БоуРОН М1, БоуРОН (М1+М2), БоуРОН М3, БоуРОН М4 и БоуРОН М5 к тепловой денатурации значительно возросла.

Численные значения теплоты и температуры плавления представлены в таблице 6. Для сравнении приведены данные для мутантной РэеРОН СМ, которая используется в качестве стандарта при таком типе экспериментов. Отметим, что разница в температурах плавления РэеРОН вАУ и М-БоуРОН составляет 11,9 градуса. Введение одной точечной замены в случае мутанта БоуРОН М4 позволило повысить температуру плавления сразу на 7,8 градуса.

Параметры тепловых переходов мутантных форм и дикого типа БоуРОН (0 1 М ^ натрии-фосфатный буфер, pH 7,0). '

Фермент д н.„, кДж/(моль*К) Температура фазового перехода, тт, °С Тт“ Тт (иЛ-БоуРОН), °С Показатель кооперативное™, Тш, °С

РэеРОН вАУ 1642 68,9 11,9 5,25

«Я-БоуРОН 1052 57,0 0,0 7,08

БоуРОН 1.240 840 53,5 -3,5 8,00

БоуРОН \AI27R 758 55,3 -1,7 6,32

БоуРОН М1 Г 1184 59,7 2,7 7,53

БоуРОН (М1+М2) 1340 61,6 4,6 6,82

БоуРОН М3 1229 61,3 4,3 6,59

БоуРОН М4 995 64,8 7,8 4,96

БоуРОН М5 1044 59,9 2,9 6,36

Кинетические параметры полученных мутантных форм

Очищенные препараты ферментов были использованы для определения кинетических параметров полученных мутантных форм БоуРОН. Титрование активных центров и расчет каталитической константы мутантных форм проводили аналогично процедуре для фермента дикого типа. В таблице 7 приведены соответствующие значения для всех мутантных белков.

Мутации У127Р!, а также (М1+М2), М3, М4 и М5 привели к увеличению Км”000-от 1,5 до 3 раз, однако и эти значения меньше таковых для бактериальных и дрожжевых ФДГ. Кроме того, такое ухудшение несущественно для практического

Применения фермента в процессах хирального синтеза с системой регенерации МЛОН, поскольку используемые в них концентрации формиата (1-3 М) намного больше наблюдаемых значений КмНС£>0. Более важным с этой точки зрения, параметром является Км"“*. В случае мутантов БоуРОН М1 и М5 эта величина снизилась в 1,3 и 1,5 раза соответственно. Для других термостабильных мутантных форм М1+М2, М3 и М4 КГ“* практически не изменилась. Интересным и важным результатом является увеличение величины кса1 для пяти мутантных форм, причем в случае трех мутантов воуРОН М1, М4 и М5 с повышенной термостабильностью значение кса, увеличилась на 72, 76 и 40% соответственно. Что касается каталитической эффективности, то в первую очередь следует отметить мутант БоуРОН М1, у которого каталитическая эффективность с коферментом и субстратом увеличилась в 2,3 и 1,2 раза соответственно. У мутантов БоуРОН М4 и М5 параметр КИЫА°* увеличился в 1,8 и 2,3 раза соответственно.

Таблица 7.

Кинетические параметры мутантных форм и дикого типа БоуРОН (0,1 М натрий -

фосфатный буфер, pH 7,0.

Фермент и нсоо-«Ч| » мМ Кмкд0* мкМ кс,ь с’ ь. цг нсоо- г'-м I (мМ*с)'1 /*Г МА0+ Л«»''« 1 (мкМ*с)

\М-ЭоуРОН 1,5±0,1 13,3±0,8 2,9±0,1 1,93 0,22

БоуРОН С18А 1,4±0,1 12,1 ±0,6 нд нд нд

БоуРОН К23Т 2,0±0,2 8,4±0,7 нд нд нд

БоуРОН 1.240 2,3±0,1 13,7±0,7 3,2±0,2 1,39 0,19

БоуРОН К109Р 1,2±0,1 11,6±1,1 нд нд нд

БоуРОН VI 27(4 3,4±0,2 9,5±0,5 3,6±0,7 1,06 0,38

БоуРОН Ы247Е 1,7±0,4 8,6±1,1 нд нд НД

БоуРОН У2811 1,7±0,1 11,6±0,6 нд НД НД

БоуРОН Б354Р 2,1±0,2 12,9±0,4 нд нд нд

БоуРОН М1 2,1 ±0,2 9,9±0,8 5,0±0,9 2,38 0,51

БоуРОН (М1+М2) 2,4±0,2 13,3±0,9 2,2±0,1 0,9 0,2

БоуРОН М3 4,5±0,3 14,0±1,0 2,8±0,1 0,62 0,2

БоуРОН М4 5,0±0,2 12,8+0,8 5,1 +0,3 1,02 0,4

БоуРОН М5 4,1±0,3 9,1+0,7 4,1±0,2 1,0 0,5

С практической точки зрения, наиболее интересным является мутантная БоуРОН (М4), так как в случае этого фермента наряду с увеличением температурной стабильности также на 70% возросла и эффективная каталитическая константа.

Объединение мутаций с положительным эффектом

Для дальнейшего увеличения термостабильности, а также для оценки взаимного влияния нескольких мутаций, были получены мутантные БоуРОН, содержащие замены (М1+М2+МЗ), (М1+М2+М4), (М1+М2+М5). Эти ферменты были выделены по стандартной методике и очищены до гомогенного состояния. Процесс

термоинактивации был изучен в диапазоне температур 58-64 “С для мутантов ЭоуРОН (М1+М2+МЗ) и (М1+М2+М5) и в диапазоне 60-66 °С для мутанта воуРОН (М1+М2+М4).

На рисунке 12 представлены зависимости остаточной активности от времени для нескольких мутантных форм при 54°С. Для сравнения приведены кривые только для ферментов, наиболее сильно отличающихся по термостабильности от БоуРОН дикого типа. Видно, что воуРОН (М1+М2+М4) практически не инактивируется за период времени, указанный на графике, в то время как для фермента дикого типа и мутантов БоуРОН М1, (М1+М2) и М4 период полуинактивации при 54 °С составляет 19, 56, 153 и 560 минут соответственно. Таким образом, можно говорить об аддитивном эффекте мутаций М1, М2 и М4.

Рис. 12. Зависимость относительной остаточной активности многоточечных мутантных форм ЭоуРОН. 54 °С, 0,1 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,0.

В таблице 8 представлены значения эффекта стабилизации для полученных мутантных форм по отношению к ферменту дикого типа. Видно, что для наиболее стабильного мутантного фермента (М1+М2+М4) эффект стабилизации при повышенных температурах (46-66°С) составляет от 2330 до 51 раза. Это гораздо больше, чем для наиболее удачного точечного мутанта М4 (см. таблицу 5). Таким образом, мутант (М1+М2+М4) является самым термостабильным ферментом из полученных мутантных форм для SoyFDH и превосходит по термостабильности фермент из растений Arabidopsis thaliana и дрожжей Candida boidini.

Таблица 8.

Значения эффекта стабилизации* мутантных ферментов по отношению к БоуРОН дикого типа при различных температурах (0,1 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,0).

Т, °с уу^оуРОН БоуРОН (М1+М2+МЗ) воурОН (М1+М2+М4) ЭоуРОН (М1+М2+М5)

25 1 9200 233200 450

30 1 3820 73540 265

46 1 280 2330 54

48 1 188 1440 41

50 1 148 1030 37

52 1 135 856 38

54 1 76 436 24

56 1 58 308 21

58 1 50 218 19

60 1 32 160 14

62 1 23 93 11

64 1 22 71 12

66 1 15 51 9

* эффект стабилизации рассчитывался как отношение соответствующих констант скорости инактивации для ЭоуРОН дикого типа и рассматриваемого мутанта при одной температуре, жирным выделены значения эффекта стабилизации, полученные экспериментально.

Рис.13. Кривые плавления, полученные методом ДСК для ФДГиз различных источников и многоточечных мутантных форм, 0,1 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,0.

Термостабильность многоточетных мутантных БоуРОН также была изучена с помощью ДСК. На рисунке 13 представлены кривые плавления для наиболее

стабильных мутантов SoyFDH и для сравнения приведены аналогичные кривые для ФДГ из других источников. Видно, что полученный мутант SoyFDH (М1+М2+М4) превосходит по термостабильности формиатдегидрогеназы из растений Arabidopsis thaUana, дрожжей Candida boidini и бактерий Moraxella sp.C-2 и совсем немного уступает мутантной PseFDH GAV. Таким образом, с помощью всего трех аминокислотных замен термостабильность SoyFDH была увеличена на 10,3 градуса, что является очень хорошим результатом. В случае формиатдегидрогеназ из других источников эффект стабилизации даже после нескольких (5-7) аминокислотных замен был заметно меньше.

Кинетические параметры многоточечных мутантных форм

В таблице 9 представлены значения констант Михазлиса, каталитической константы, величины каталитической эффективности с коферментом и субстратом для многоточечных мутантных форм SoyFDH. Для сравнения приведены аналогичные величины для SoyFDH дикого типа и трех других формиатдегидрогеназ из растений, дрожжей и бактерий - AthFDH, CboFDH и PseFDH соответственно.

Таблица 9.

Кинетические параметры многоточечных мутантных форм и дикого типа ЭоуРОН,

0,1 М натрий - фосфатный буфер, pH 7,0. '

Фермент ir HCOO-•»« . mM NAQ+ mkM fceäf, c'1 tu к»нсооу mM/c k'JK.NW\ mkM/c

wt-SoyFDH 1,5±0,1 13,3±0,8 2,9±0,1 1,9 0,2

SoyFDH (М1+М2+М5) 2,3±0,3 16,1 ±0,4 3,7±0,1 1,6 0,2

SoyFDH (М1+М2+МЗ) 2,2±0,3 14,1 ±0,7 3,2±0,2 1,5 0,2

SoyFDH (M1+M2+M4) 2,8+0,4 20,3±1,3 2,9±0,2 1.0 0,1

AthFDH 2,8 20 3,8 1,36 0,19

CboFDH 5,9 37 3,7 0,63 0,1

PseFDH GAV 6,5 35 7,3 1,12 0,2

Из таблицы 9 видно, что полученные мутантные формы М1+М2+МЗ и М1+М2+М5 также характеризуются низкими значениями констант Михаэлиса, а по каталитической эффективности превосходят ферменты из других источников. У самого стабильного мутанта ЭоуРОН М1+М2+М4 константы Михаэлиса сравнялись с таковыми значениями для фермента из AraЫdopsis tЬаПапа, а каталитическая эффективность сравнима с РэеРОН и выше, чем у СЬоРОН. Обобщая вышесказанное, можно сделать вывод, что у мутантов ЭоуРОН (М1+М2+МЗ) и (М1+М2+М5) кинетические параметры и каталитические свойства остались на уровне фермента дикого типа, а у мутантной формы (М1+М2+М4) немного ухудшились, но остались все же лучше, чем у СЬоРОН, которая, наряду с РэеРОН вА\/, в настоящее время наиболее широко используется на практике.

Выводы

1. Получена рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои в активной и растворимой форме. Подобраны оптимальные условия культивирования и очистки. Выход фермента составил 440 мг с литра среды. В результате очистки получен гомогенный препарат SoyFDH.

2. Подобраны условия кристаллизации фермента, получены кристаллы тройного комплекса [SoyFDH-NAD*-N3 ] и для него решена трехмерная структура с разрешением 1,9 А.

3. Изучены каталитические свойства рекомбинантной SoyFDH. Разработана методика титрования активных центров с помощью тушения флуоресценции и рассчитана каталитическая константа. Показано, что SoyFDH имеет самые низкие значения констант Михаэлиса как по NAD*, так и по формиату среди всех ранее изученных формиатдегидрогеназ. Изучена pH зависимость констант Михаэлиса К„нсо°' и K„NAD* и показано, что эти величины не меняются в диапазоне pH 5,8-9,8. Изучено ингибирование SoyFDH неорганическими ионами и установлено, что наилучшим конкурентным ингибитором по формиату является азид-ион. Показано, что по каталитической эффективности SoyFDH дикого типа превосходит бактериальные и дрожжевые ферменты, широко используемые в настоящее время на практике.

4. Изучена кинетика термоинактивации рекомбинантной ФДГ сои. Установлено, что процесс термоинактивации является необратимым и протекает по мономолекулярному механизму. Исследовано влияние ионной сипы и pH на константу скорости термоинактивации SoyFDH. Показано, что термостабильность фермента возрастает в 10 раз при увеличении ионной силы раствора и pH. В целом, SoyFDH является одной из наименее стабильных среди описанных на данный момент формиатдегидрогеназ.

5. Проведены эксперименты по улучшению свойств формиатдегидрогеназы из сои методом рационального дизайна. На основании детального анализа трехмерной структуры SoyFDH, а также выравнивания аминокислотных последовательностей предложено 13 точечных аминокислотных замен.

6. Проведена наработка мутантных форм формиатдегидрогеназы из сои и изучены их свойства. Термостабильность полученных ферментов изучена как по кинетике термоинактивации, так и с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Установлено, что 5 из 13 полученных мутантных форм обладают более высокой термостабильностью по сравнению с ферментом дикого типа. Для лучшего мутантного белка эффект стабилизации составил 100 раз при температуре 52 °С. Изучены каталитические свойства полученных мутантных форм. Установлено, что для трех из пяти полученных более термостабильных мутантных форм происходит увеличение каталитической константы.

7. Получены мутантные формы ФДГ сои, в которых объединили аминокислотные замены, дающие положительный эффект. Исследование кинетики термоинактивации показало, что для лучшей многоточечной мутантной формы SoyFDH эффект стабилизации при температуре 52 °С составляет 856 раз. Данные дифференциальной сканирующей калориметрии свидетельствуют, что этот мутантный фермент по термостабильности уступает только мутантной ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи.

1. Садыхов Э.Г., Серов А.Е., Ясный И.Е., Войнова Н.С., Алексеева А.А., Петров А.С., Тишков В.И. NAD^-зависимые формиатдегидрогеназы из Arabidopsis thaliana и сои: экспрессия в клетках E.coli и кинетические свойства рекомбинантных ферментов. Вестник Московского Университета, Сер. 2: Химия, 2006, т. 47, № 1, с.31-34.

2. Sadykhov, E.G., Serov, А.Е., Voinova, N.S., Uglanova, S.V., Petrov, A.S., Alexeeva, A.A.,

Kleimenov, S.Yu., Popov, V.O., Tishkov, V.l. A comparable study of thermal stability of formate dehydrogenases from microorganisms and plants. Appl.Biochem.Microbiol 2006 v.42, № 3, p.236-240. ’

3. Войнова H.C., Савин C.C., Алексеева AA., Скиргелло O.E., Тишков В.И. Инактивация

формиатдегидрогеназ при pH 8. Вестник Московского Университета Сер 2■ Химия 2008, т.49, № 2, с.77-80. ’

4. Романова Е.Г., Алексеева А.А., Пометун Е.В., Тишков В.И. Определение

концентрации активных центров и каталитической константы рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max. Вестник Московского Университета, Сер. 2: Химия, 2010, т.51, № 3, с.156-159 '

5. Алексеева А.А, Савин С.С., Тишков В.И. NAD'-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.З, № 4(11), с.14-30.

Тезисы конференций.

1. Sadykhov E.G., Serov А.Е., Yasnyl.E., Voynova N.S., Alekseeva AA., Petrov A.S., Tishkov V.l. NAD*-dependent formate dehydrogenases from Arabidopsis thaliana and soya Glycine max: expression in E.coli cells and kinetic properties. Abstracts of International Conference «Biocatalysis 2005. Fundamentals and Applications», St.Petersburq June 1923, 2005, p. 107.

2. Войнова H.C., Алексеева AA, Садыхов Э.Г., Серов A.E., Тишков В.И. Исследование свойств формиатдегидрогеназы из Arabidopsis thaliana, экспрессированной в E.coli. Тезисы Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино, 28-ноября-1 декабря 2006, с.104-105.

3. Voinova N.S., Alexeeva A.A, Sadykhov E.G., Serov А.Е., Tishkov V.l. Influence of pH and ion strength on thermal stability of plant formate dehydrogenases. Congress Proceedings of the IV Moscow International Congress “Biotechnology: State of the Art and Prospects Development", Moscow, March 12-16, 2007, vol. 2, p.254-255.

4. Voinova N.S., Alexeeva A.A., Sadykhov E.G., Serov A.E., Tishkov V.l. Study of properties of recombinant plant formate dehydrogenases from Arabidopsis thaliana and soya Glycine max, expressed in E.coli. Congress Proceedings of the IV Moscow International Congress “Biotechnology: State of the Art and Prospects Development", Moscow, March 12-16, 2007, vol. 2, p.313.

5. Алексеева A.A., Тишков В.И., Изучение термостабильности рекомбинантных формиатдегидрогеназ из сои Glycine max, экспрессированных в клетках E.coli II Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», Москва, 11-14 апреля, 2007.

6. Voinova N.S., Uglanova S.V., Savin S.S., Alexeeva A.A., Serov A.E., Sadykhov E.G. and Tishkov V.l. Media Influence on Thermal Inactivation of Formate Dehydrogenases from Bacteria, Yeasts and Plants. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2007. Fundamentals & Applications", Moscow - St.Petersburg, June 17-22, 2007, p.159.

7. Савин C.C., Войнова H.C., Алексеева A.A., Тишков В.И. Экспрессия в E.coli и свойства формиатдегидрогеназ растений. Материалы VIII Международной конференции молодых ученых “Леса Евразии - Северный Кавказ", Октябрь 6-12, 2008, Москва-Сочи, с.97-98.

8. Alexeeva А.А., Voinova N.S., Savin S.S., Shabalin I.G., Skirgelio O.E., Polakov K.M., Popov V.O., Tishkov V.l. “Plant recombinant formate dehydrogenases: preparation, stability and structure." Congress Proceedings of the Fifth Moscow International Congress “Biotechnology: State of the Art and Prospects Development", Moscow, March 16-20, 2009, vol. 2, p.311

9. Alekseeva A.A., Tishkov V.l. “Expression in £ со// Cells and Properties of Recombinant Formate Dehydrogenase from Soya Glycine max". Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2009. Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009, p.31.

10. Polyakov K.M., Shabalin I.G., Dorovatovskiy P.V., Alekseeva A.A., Tishkov V.l. “The Structure of NAD*-Dependent Formate Dehydrogenases from Soya Glycine max at 1.9A Resolution”. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2009. Fundamentals & Applications”, Arkhangelsk, June 19-24, 2009, p.90.

11. Alekseeva A.A., Shabalin I.G., Polyakov K.M., Tishkov V.l. Formate dehyrogenase from soya Glycine max: cloning, expression, properties and structure of the recombinant enzyme. Abstracts of 14th International Biotechnology Symposium. September 14-18, Rimini, Italy. J. Biotechnol. 2010, v.150, Na SI, p. 476.

12. Savin S., Alekseeva A., Romanova E., Goncharenko K. Tishkov V. Plant formate dehydrogenase: expression in E.coli, kinetic properties, stability and structural studies. Abstracts of of XIV Intematopnal Conference "INPEC-2010" (International Network of Protein Engineering Centres), Uppsala, Sweden, October 6-9, 2010 p.17.

13. Tishkov V.I., Khoronenkova S.V., Alekseeva A.A., Goncharenko K.V., Serenko A.A., Komarova N.V., Golubev I.V., Ryzhenkova K.V., Gazaryan I.G., Hushpuliyan D.M., Berezin

A.I., Stepashkina A.V., Fedorchuk V.V., Fedorchuk E.A., Chubar T.A., Savina L.I., Savin S.S. “Genetic engineering enzymes for medicine diagnostics and pharmaceutical industry”.

Congress Proceedings of the Sixth Moscow International Congress “Biotechnology: State of the Art and Prospects Development”, Moscow, March 21-25, 2011, v. 1, p.38-39.

14. Серенко A.A., Алексеева A.A., Романова Е.Г., Ратманова Н.К., Тишков В.И. Изучение

термостабильности рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max методом направленного мутагенеза. Материалы международного молодежного форума «Ломоносов-2011», секция «Химия», Москва, 11-15 апреля 2011 г М- МГУ 2011, с.375. ‘ “ ’

15. Алексеева А.А., Серенко A.A., Гончаренко К.В., Тишков В.И. Клонирование,

экспрессия и свойства рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max Материалы международного молодежного форума «Ломоносов-2011», секция «Химия», Москва, 11-15 апреля 2011 г. М.: МГУ, 2011, с.394. ’

16. Алексеева А.А., Серенко А.А., Тишков В.И., Савин С. С. Получение и свойства рекомбинантной формиатдегидрогеназы сои. Тезисы ll-ой Международонй конференции «Физико-химическая биология», посвященной 85-летию академика Д.Г.Кнорре. Новосибирск, 25-29 июля 2011г., с.102.

17. Алексеева А.А., Серенко A.A., Савин С.С. Рекомбинантная растительная

формиатдегидрогеназа: получение, свойства и практическое применение. XI Международная конференция молодых ученых «Леса Евразии - Брянский лес», Брянск, 12-18 сентября, 2011 г., с.255-256 ’

18.Тишков В.И., Алексеева А.А., Серенко A.A., Гончаренко К.В., Серов А.Е., Федорчук

В.В., Савина Л.И., Савин С.С. Синтез хиральных соединений с помощью

оксидоредуктаз. Материалы XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Волгоград, Россия, 25-30 сентября, 2011 г., т.1, с. 83.

Подписано в печать 15.11.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 1167 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения о формиатдегидрогеназе.

2.2. История открытия, локализация и физиологическая роль растительных ФДГ.

2.3. Особенности первичной структуры растительных ФДГ.

2.4. Пространственная структура формиатдегидрогеназ.

2.5. Клонирование генов и экспрессия рекомбинантных ФДГ из растений.

2.6. Основные свойства растительных формиатдегидрогеназ-.

2.6.1. Коферментная и субстратная специфичность.

2.6.2. Температурная стабильность.

2.6.3. Химическая стабильность формиатдегидрогеназ.

2.7. Стабилизация ферментов методами белковой инженерии.

2.7.1. Нупорядоченный мутагенез.

2.7.2. Направленный мутагенез.

2.8. Белковая инженерия формиатдегидрогеназ.47'

2.9. Применение ФДГ.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.:.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.2. Рестрикция фрагментов ДНК.

3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля.

3.2.4. Лигирование.

3.2.5. Трансформация клеток Е.соН.

3.2.6. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.7. Направленный мутагенез гена формиатдегидрогеназы из сои Є.тах.

3.2.8. Секвенирование ДНК.

3.2.9. Экспрессия ЗоуРБН и ее мутантных форм в клетках Е.соИ.

3.2.10. Выделение и очистка БоуРБН.

3.2.11. Белковый электофорез в денатурирующих условиях.

3.2.12. Белковый электрофорез в неденатурирующих условиях.

3.2.13. Определение активности фермента.

3.2.14. Определение констант Михаэлиса.

3.2.15. Определение констант ингибирования.

3.2.16. Титрование активных центров и расчет каталитических констант.

3.2.17. Определение активности фермента при различных температурах.

3.2.18. Определение констант скорости термоинактивации.

3.2.19. Определение активационных параметров процесса термоинактивации фермента.

3.2.20. Изучение термостабильности с помощью ДСК.

3.2.21. Получение кристаллов и определение трехмерной структуры холо-формы БоуРБН.

3.2.22. Моделирование трехмерной структуры апо-фермента.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Экспрессия рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои О.тах.

4.1.1. Особенности культивирования рекомбинантной БоуРБН.

4.2. Выделение и очистка ЭоуРБН.

4.3. Кинетические свойства рекомбинантной ЗоуРЭН.

4.3.1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстратов.

4.3.2. Влияние рН на константу Михаэлиса.

4.3.3. Температурная зависимость активности БоуРБН.

4.3.4. Ингибирование БоуРОН неорганическими ионами.

4.3.5. Определение концентрации активных центров и каталитической константы рекомбинантной БоуРВН.

4.4. Изучение температурной стабильности БоуРБН.

4.4.1. Стабильность при повышенных температурах.

4.4.2. Влияние pH и ионной силы на термоинактивацию SoyFDH.

4.4.3. Определение активационных параметров процесса термоинактивации с помощью теории активированного комплекса.

4.5. Кристаллизация SoyFDH и определение структуры холо-формы.

4.6. Моделирование структуры апо-формы SoyFDH.

4.7. Белковая инженерия SoyFDH.

4.7.1. Введение дополнительных ионных пар.

4.7.2. Заполнение полостей внутри белковой глобулы.

4.7.3. Модификация электростатических взаимодействий на поверхности белка.

4.7.4. Увеличение жесткости полипептидной цепи.

4.7.5. Замена остатка фенилаланина на поверхности белковой глобулы.

4.7.6. Получение мутантных форм SoyFDH.

4.7.7. Изучение термостабильности мутантных SoyFDH по кинетике инактивации.

4.7.8. Изучение термостабильности мутантных SoyFDH с помощью ДСК.

4.7.9. Кинетические свойства мутантных ферментов.137'

4.7.10. Получение многоточечных мутантов.

4.7.11. Изучение термостабильности многоточечных мутантов SoyFDH.

4.7.12. Кинетические свойства многоточечных мутантных SoyFDH.

V. ВЫВОДЫ.

NAD'-зависимая формиатдегидогеназа (ФДГ), [КФ 1.2.1.2.] относится к суперсемейству дегидрогеназ 2-оксикислот и катализирует реакцию окисления формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH. Фермент широко распространен в природе. Гены,, кодирующие ФДГ, найдены в большом количестве бактерий, дрожжей, грибов и растений. Физиологическое значение, этого фермента различается в зависимости от типа организма: В метилотрофах ФДГ участвует в обеспечении энергией. Этот фермент играет ключевую роль в. жизнедеятельности патогенных микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Legionella, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, шдр. В растениях ФДГ является универсальным белком, стресса и ее синтез резко возрастает при таких воздействиях, как, засуха, повышенная доза ультрафиолета, резкие скачки температур, действие патогенов и т.п. В отличие от микроорганизмов, в,-клетках растений ФДГ локализована,в митохондриях и.ее количество при;стрессовых воздействиях достигает 9% от всех митохондриальных белков.

На практике ФДГ в основном используется для.регенерации NADH в системах-синтеза, оптически активных соединений; В1 настоящее время- фирмой* «Degussa» с использованием ФДГ в качестве, катализатора регенерации NADH реализован! промышленный процесс получения Ь-?ег/-лейцина, являющийся одним из наиболее крупнотоннажных процессов' хирального синтеза в фармацевтической химии с использованием ферментов. Кроме того, ФДГ активно применяется в биосенсорах на формиат. Последние исследования показали; что в растениях, существует несколько различных генов, кодирующих ФДГ. С помощью анализа изоферментного состава ФДГ можно определять видовую принадлежность и выявлять больные растения, подлежащие вырубке. Растительные ФДГ имеют широкую перспективу для применения: на практике. Это обусловлено тем, что ф ормиатдегидрогеназы растений имеют низкие константы Михаэлиса по субстратам, что очень важно для повышения эффективности процессов синтеза оптически активных соединений.

Хотя формиатдегидрогеназная активность в растениях впервые была показана еще в 1921 г., растительные ФДГ до последнего времени оставались малоизученными ферментами по сравнению с таковыми из бактерий и дрожжей. Это было связано с низким содержанием фермента в клетках растений. В нашей лаборатории несколько лет назад была создана высокоэффективная система экспрессии ФДГ из растений Arabidopsis thaliana в клетках E.coli. Также в 2009 г. была описана успешная экспрессия в E.coli ФДГ из бобов Lotus japonicus, однако уровень экспрессии был намного ниже, чем в случае A. thaliana.

Среди растительных ферментов наиболее подробно изучена формиатдегидрогеназа из A.thaliana (AthFDH), однако из-за невысоких каталитических характеристик AthFDH является скорее модельным, чем практически важным ферментом. В дополнение к AthFDH в нашей лаборатории также были начаты работы по получению и изучению свойств рекомбинантной ФДГ из сои (SoyFDH). Согласно предварительным данным, у этого фермента самые низкие значения^ Км даже среди растительных ФДГ. Кроме того, соя является' одним из. важнейших сельскохозяйственных растений и увеличение активности SoyFDH при том же уровне биосинтеза позволит значительно повысить устойчивость растения к различным неблагоприятным стрессовым воздействиям (засуха, повышенная температура, воздействие патогенных микроорганизмов). Для этого фермента в нашей лаборатории также создана система экспрессии в клетках E.coli, проведены-предварительные эксперименты по изучению его свойств и оказалось, что, термостабильность SoyFDH . гораздо ниже по сравнению с другими формиатдегидрогеназами. Систематических исследований этого фермента до начала данной работы не проводилось. Таким образом, исследование свойств и проведение экспериментов^ по белковой инженерии SoyFDH являются важными фундаментальными и практическими задачами.

Данная работа посвящена решеншо важных и актуальных проблем -получению с помощью методов генетической инженерии рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои, определению ее трехмерной структуры, детальному исследованию свойств фермента дикого типа и белковой инженерии SoyFDH с целью получения мутантных форм фермента с повышенной термостабильностью и каталитической эффективностью.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

V. выводы

1. Получена рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои в активной и растворимой форме. Подобраны оптимальные условия культивирования и очистки. Выход составил 440 мг с литра среды. В результате получен гомогенный препарат SoyFDH.

2. Подобраны условия кристаллизации фермента; полученьг кристаллы тройного комплекса [SoyFDH-NAD+-N3"J и для. него решена трехмерная- структура с разрешением 1,9 А.

3. Изучены каталитические свойства^ рекомбинантной' SoyFDH; Разработана методика титрования активных центров с помощью тушения флуоресценции и рассчитана каталитическая константа. Показано, что SoyFDH имеет, самые низкие значения констант Михаэлиса как по NAD+, так и по формиату среди всех ранее изученных формиатдегидрогеназ. Изучена рН зависимость констант Михаэлиса: КМПС0° и KMNAD и показано, что эти величины не меняются в диапазоне рН 5,8-9,8. Изучено ингибирование SoyFDH неорганическими ионами й установлено, что наилучшим конкурентным ингибитором по формиату является' азид-ион. Показано, что по каталитической эффективности SoyFDH- превосходит бактериальные и дрожжевые.ферменты, используемые в настоящее время широко на практике.

4. Изучена кинетика термоинактивации рекомбинантной; ФДГ сои. Установлено, что процесс термоинактивации является необратимым, соответствует кинетике реакций первого порядка; и протекает по мономолекулярному механизму. Изучено влияние ионной силы и рН на константу скорости термоинактивации SoyFDH. Показано,, что термостабйльность фермента возрастает в 10 раз при увеличении ионной силы раствора и рН. В целом, SoyFDH является одной1 из наименее стабильных среди описанных на данный момент формиатдегидрогеназ.

5. Проведены эксперименты по улучшению свойств формиатдегидрогеназы из сои методом рационального дизайна. На основании детального анализа трехмерной структуры SoyFDH, а также выравнивания аминокислотных последовательностей предложено 13 точечных аминокислотных замен:

6. Проведена наработка мутантных форм формиатдегидрогеназы из сои и изучены их свойства. Термостабильность полученных ферментов изучена как по кинетике термоинактивации, так и с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Установлено, что 5 из 13 полученных мутантных форм обладают более высокой термостабильностью по сравнению с ферментом дикого типа. Для лучшего мутантного белка эффект стабилизации составил 100 раз при температуре 52 °С. Изучены каталитические свойства полученных мутантных форм. Установлено, что для трех из пяти полученных более термостабильных мутантных форм происходит увеличение каталитической константы.

7. Получены мутантные формы ФДГ сои, в которых объединили аминокислотные замены, дающие положительный эффект. Исследование кинетики термоинактивации показало, что для лучшей многоточечной мутантной формы SoyFDH эффект стабилизации при температуре 52 °С составляет 856 раз.-Данные дифференциальной сканирующей калориметрии свидетельствуют, что этот мутантный фермент по термостабильности уступает только мутантной ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.l01.

1. Родионов Ю.В. Метаболизм формиата у микроорганизмов. Успехи микробиологии, 1981, т.16, с.104-138

2. Ferry J.G. Formate dehydrogenase. FEMS Microbiol.Rev., 1990, v.7, p.377-382

3. Vinals C., Depiereux E., and Feytmans E. Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1993, v.192, p.182-188'

4. Tishkov V.I., Galkin A.G., and Egorov, A. M. Kinetic isotope effect and pre-steady state kinetics of the reaction catalyzed by bacterial formate dehydrogenase. Biochimie, 1989, v.71, p.551-557

5. Tishkov V.I. and Popov V.O. Catalytic mechanism and application of formate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc.), 2004, v.69, p.1252-1267

6. Tishkov V.I. and Popov V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase. BiomolEng, 2006, v.23, p.89-110

7. Hourton-Cabassa C., Ambard-Bretteville F., Moreau F., Davy de V., Remy R., and Francs-Small C.C. Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves. Plant Physiol, 1998, v.l 16, p.627-635

8. Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.K., Yoshimura E., and Mori S. Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol, 1998, v.l 16; p:725-732

9. Thompson P., Bowsher C. G., and. Tobin A. K. Heterogeneity of mitochondrial protein biogenesis during primary leaf development in barley. Plant Physiol, 1998, v.118, p.1089-1099

10. Andreadeli A., Flemetakis E., Axarli I., DimouM., Udvardi M. K., Katinakis P., and Labrou N.E. Cloning and characterization of Lotus japonicus formate dehydrogenase: a possible correlation with hypoxia. Biochim.Biophys.Acta, 2009, v. 1794, p.976-984

11. Thunberg T. Sur la presence de certains ferments oxydants dans les grains de phaseolus vulgaris. Arch.int.Physiol., 1921, v.18, p.601-606

12. Davison D.C. Studies on plant formic dehydrogenase. Biochem.J., 1951, v.49, p.520-526

13. Davies D.D. Soluble Enzymes from Pea Mitochondria. J.Exp.Bot., 1956, v.7, p.203-218

14. Mazelis, M. Formate Oxidation by Particulate Preparations from Higher Plants. Plant Physiol, 1960, v.35, p.3 86-391

15. Halliwell, B. Oxidation* of formate by peroxisomes and mitochondria from spinach leaves. BiochemJ., 1974, v.138,' p.77-85

16. Jansch L., Kruft V., Schmitz U.K., and Braun H.P. New insights into the composition,' molecular mass and stoichiometry of the protein complexes of plant mitochondria. Plant J., 1996, v.9, p.3 57-368

17. Oliver, D. J. Formate Oxidation,and Oxygen Reduction by Leaf Mitochondria. Plant Physiol, 1981, v.68, p.703-705

18. Hanson A.D. and Nelsen C.E. Betaine Accumulation and l4C.Formate Metabolism in Water-stressed Barley Leaves. Plant Physiol, 1978, v.62, p.305-312

19. Colas des Francs-Small, Ambard-Bretteville.F., Darpas A., Sallantin M., Huet-J.-C., Pernolett J.-C., and Remy R. Variation of the Polypeptide Composition« of Mitochondria Isolated from Different Potato* Tissues. Plant-Physiol, 1992, v.98, p.273-278.

20. Colas des Francs-Small,. Ambard-Bretteville F., Small I. D., and Remy R. Identification^ of a* major soluble protein ins mitochondria from nonphotosynthetic tissues as NAD+- dep en dent formate dehydrogenase. Plant Physiol, 1993, v. 102, p.1171-1177

21. Dubos C. and Plomion C. Identification of water-deficit responsive genes in maritime pine {Pinuspinaster Ait.) roots. Plant MohBiol., 2003, v.51, p.249-262

22. Minami A., Nagao M., Arakawa K., Fujikawa S., and Takezawa W. Abscisic acid-induced freezing tolerance in the moss Physcomitrella patens is accompanied by increased expression of stress-related genes. J Plant Physiol, 2003, v.l60,j p.475-483

23. Yin L., Lan Y., and Zhu L. Analysis of the protein expression profiling during rice callus differentiation under different plant hormone conditions. Plant Mol.Biol., 2008, v.68, p.597-617

24. Fukusaki E., Ikeda T., Shiraishi T., Nishikawa T., and Kobayashi A. Formate dehydrogenase gene of Arabidopsis thaliana is induced by formaldehyde and not by formic acid. J.BioscLBioeng., 2000, v.90, p.691-693

25. Olson B. J., Skavdahl M., Ramberg H., Osterman J. C., and Markwell J. Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: characterization and possible targeting to the chloroplast. Plant Sci., 2000, v.159, p.205-212

26. Herman P.L., Ramberg H., Baack R.D., Markwell J., and Osterman J.C. Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: overexpression and subcellular localization in leaves. Plant Sci., 2002, v,163;,p.l 137-1145

27. Igamberdiey A.U., Bykova N.V., and* Kleczkowskii L.A. Origins and metabolism-of formate in higher plants. Plant Physiology and Biochemistry, 1999; v.37, p.503-513

28. Li R., Moore M., and King J. Investigating the regulation of one-carbon metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol, 2003, v.44, p.233-241

29. Bykova N.V., Egsgaard H., and Miller I.M. Identification of 14 new phosphoproteins involved in important plantmitochondrial processes. FEBS Letters, 2003, v.540, p.141-146

30. Bykova N. V., Stensballe A., Egsgaard H., Jensen O.N., and Moller I.M. Phosphorylation of formate dehydrogenase in potato tuber mitochondria. J.Biol.Chem., 2003- v.278, p.26021-26030

31. Kruger A., Peskan-Berghofer.T., Frettinger P., Herrmann S., Buscot F., and Oelmuller R. Identification of premycorrhiza-related plant genes in the association between Quercus robur and Piloderma croceum. New Phytolist, 2004, v.163, p.149-157

32. Bruggmann, R., Abderhalden, O., Reymond, P., and Dudler, R. Analysis of epidermis- and mesophyll-speeific transcript accumulation in powdery mildew-inoculated wheat leaves. Plant Mol.BioL, 2005, v.58, p.247-267

33. Shiraishi T., Fukusaki E., and Kobayashi A. Formate dehydrogenase in rice plant: growth stimulation effect of formate in rice plant. J.Biosci.Bioeng., 2000, v.89, p.241-246

34. David P., Chen N. W., Pedrosa-Harand A., Thareau V., Sevignac M., Cannon S. B., Debouck D., Langin T., and Geffroy V. A nomadic subtelomeric disease resistance gene cluster in common bean. Plant Physiol, 2009, v. 151, p. 1048-1065

35. Peer Y., and Rokhsar D. The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa. (Torr. & Gray) Science, 2006, v.313, p.1596-1604

36. Hwang L., Hocking-Murray D., Bahrami A.K., Andersson M., Rine J., and Sil A. Identifying phase-specific genes in the fungal pathogen Histoplasma capsulatum using a genomic shotgun microarray. Mol.Biol.Cell, 2003, v. 14, p.2314-2326 >

37. Tishkov V.l., Galkin A.G., and Egorov A.M. NAD+-dependent formate dehydrogenase of methylotrophic bacteria Pseudomonas sp. 101: cloning, expression, and study of the genetic structure. Dokl.Akad.Nauk SSSR, 1991, v.317, p.745-748

38. Hatrongjit R. and Packdibamrung K. A novel NADP(+)-dependent formate dehydrogenase from Burkholderia stabilis 15516: Screening, purification and characterization. Enzyme and Microbial Technology, 2010, v.46, p.557-561

39. Weerasinghe P.A., Weerasekera M.L., and Van Holm L.H. Use of isoenzymes to differentiate growth categories of Pericopsis mooniana trees. Biología Plantarum, 1999, v.42, p.547

40. Colic S., Milatovic D., Nikolic D., and Zee G. Isoenzyme polymorphism of almond genotypes selected in the region of northern Serbia. Horticultural Science, 2010, v.37, p.56-61

41. Colich S., Milatovich D., Nikolich D., and Zee G. Dehydrogenase Isoenzyme Polymorphism in Selected Almond Genotypes (Prunus Amygdalus Batsch.). Bulgarian Journal of Agricultural Science, 2009, v. 15, p.552-556

42. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H., and Wilson K.S. High resolution structures of holo and apo formate dehydrogenase. J.Mol.Biol., 1994, v.236, p.759-785

43. Schirwitz K., Schmidt A., and Lamzin V.S. High-resolution structures of formate dehydrogenase from Candida boidinii. Protein Sei., 2007, v.16, p.l 146-1156

44. Шабалин И.Г. Структурное исследование НАД+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных организмов. Диссертация кандидата химических наук. 2010. Москва, Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

45. Farinelli М.Р., Fry D.W., and Richardson K.E. Isolation, Purification, and Partial Characterization of Formate Dehydrogenase from Soybean Seed. Plant Physiol, 1983, v.73, p.858-859

46. Serov А.Е., Popova A.S., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.I. Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from* Saccharomyces cerevisiae. Biochem.J., 2002, v.367, p.841-847

47. Seelbach K., Riebel В., Hummel W., Kula M.-R., Tishkov V.I., Egorov A.M:, Wandrey C., and Kragl U. A novel, efficient regenerating method of NADPH using a new formate dehydrogenase. Tetrahedron Lett., 1996, v.37, p.1377-1380

48. Baack R.D., Markwell J., Herman P.L., and Osterman J.C. Kinetic behavior of the Arabidopsis thaliana leaf formate dehydrogenase is thermally sensitive. J.Plant Physiol, 2003, v. 160, p.445-450

49. Li R., Ziola В., and King J. Purification and characterization of formate dehydrogenase from Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol, 2000, v. 157, p. 161-167

50. Oyama T. and Yamazaki I. Purification and some properties of formate dehydrogenase. J.Biochem., 1974, v.75, p.1257-1263

51. Uotila L. and Koivusalo M. Purification of formaldehyde and formate dehydrogenases from pea seeds by affinity chromatography and S-formylglutathione as the intermediate of formaldehyde metabolism. Arch.Biochem.Biophys., 1979, v. 196, p.33-45

52. Peacock D. andBoulter D. Kinetic studies of formate dehydrogenase. Biochem.J., 1970, v.l20,p.763-769

53. Slusarczyk H.,~Felber S., Kula M R., and Pohl M. Stabilization of NAD+-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues. Ew.J.Biochefn., 2000, v.267, p.1280-1289

54. Karaguler G.N., Sessions B.R., Clarke R.A., and Holbrook J.J. A single mutation in the NAD+-specific formate dehydrogenase from; Candida methylica allows the enzyme to useiNADV. Biotechnology Letters, 2001, v.23, p;283-287

55. Серов Л.Е. Взаимосвязь структуры. и свойств рекомбинантных формиатдегидрогеназ из пекарских дрожжей; и метилотрофных бактерий. Дисс.канд.хим.наук. 2002, Москва, МГУ

56. Диков М.М., Карулин А., Осипов А.Ш, and Егоров A.M. Изучение методом^ аналитического' изотахофореза: изменений структуры формиатдегидрогеназы при ее инактивации; Биоорган, химия; \919; т.5,.с.1217-1221

57. Egorov A.M., AvilovaT.V., Dikov M.Mi,.Popov V.O., Rodionov Y.V., andlBerezin LV. NAD+-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium, strain 1. Purification and-characterization: Eur.JBiochem,,. 1979; v.99; p.569-576

58. Avilova T.V., Egorova,0:A., Ioanesyan;E.S:, and Egorov A.M. Biosynthesis, isolation and properties of NAD+-dependent formate dehydrogenase from the yeast Candida methylica: Eur.J.Biochem., 1985' v. 152, p.657-662

59. Patel R.N;, HouClT., and DerelankoP; Microbials oxidation of methanol: purification and properties of formaldehyde dehydrogenase from a Pichia sp. NRRL-Y-1 1328. Arch.Biochem. Biophys., 1983, v.221, p.135-142

60. Садыхов Э.Г Получение, термостабильность и стркутурные исследованиям формиатдегидрогеназ из различных источников. Диссертация кандидата химических наук . 2007. Москва,,Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

61. Tishkov V.I., Uglanova S.V., Fedorchuk V.V., and Savin S.S. Influence of ion strength and pll on thermal stability of yeast formate dehydrogenase. Acta Naturae, 2010, v.2, p.82-87

62. Resch A., Rosenstein R., Nerz C., and Gotz F. Differential gene expression profiling of Staphylococcus aureus cultivated under biofilm and planktonic conditions. Appl.Environ.Microbiol., 2005, v.71, p.2663-2676

63. Savin S.S. and Tishkov V.I. Inactivation by hydrogen peroxide as a method, for estimation of stress stability of formate dehydrogenase in vivo. Acta Naturae, 2010, v.2, p.78-82

64. Березин И.В., Клячко H.JI., Левашов A.B., Мартинек К., Можаев В.В. и Хмельницкий.Л. Иммобилизованные ферменты. Биотехнология, 1987, Москва; Высшая школа

65. Дебабов В.Г. и Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. Биотехнология, 1988, Москва, Высшая школа

66. Langridge J. Genetic and enzymatic experiments relating to the tertiary structure of beta-galactosidase. Journal of Bacteriology, 1968, v.96, p.1711-1717

67. Minagawa H., Yoshida Y., Kenmochi N., Furuichi M., Shimada J., and Kaneko H. Improving the thermal stability of lactate oxidase by directed evolution. Cell Mol.Life Sci., 2007, v.64, p.77-81

68. Marion В., Ansorge-Schumacher M.B., Slusarczyk H., Schumers J., and1 Hirtz D. Directed evolution of formate dehydrogenase from Candida boidinii for-improved stability during entrapment in polyacrylamide. FEBS J., 2006, v.273, p.3938-3945

69. Goihberg E., Dym O., Tel-Or S., Levin I., Peretz M., and Burstein Y. A single proline substitution is critical for the thermostabilization. of Clostridium beijerinckii alcohol dehydrogenase. Proteins, 2007, v.66, p. 196-204

70. Vogt G., Argos P., and Woell S. Protein thermal stability, hydrogen bonds, and ion pairs. J. Mo I. Biol., 1997, v.269, p.631-643

71. Rose G.D., Zehfus M.H., Geselowitz A.R., Lesser G.J., and-Lee R.H. Hydrophobicity of amino acid residues in globular proteins. Science, 1985, v.229, p.834-83 8

72. Akanuma S., Qu-C., Yamagishi A., Tanaka N., and Oshima T. Effect of polar side chains at position 172 on thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus. FEBS Lett., 1997, v.410, p.141-144

73. Kotzia G.A. and Labrou N.E. Engineering thermal stability of L-asparagiriase by in vitro directed evolution. FEBS J.,2№9, v.276, p.1750-1761

74. Tanaka S., Igarashi S., Ferri S., and Sode K. Increasing stability of water-soluble PQQ glucose dehydrogenase by increasing hydrophobic interaction at dimeric interface. BMC Biochem, 2005, v.6, p:l

75. Bjork A., Dalhus B., Mantzilas D:, Eijsink V.G., and Sirevag R. Stabilization of a tetrameric rnalate dehydrogenase by introduction of a disulfide bridge at the dimer-dimerinterface. J.Môl.Biol.,.2003, v.334,.p.811-821

76. Goihberg E., Dym O., Tel-Or S., ShimomL., Frolow P., Peretz M^, and Burstein.Y. Thermal' stabilization of:the;protozoan» Entamoeba histolytica alcohol dehydrogenase by a single proline substitution. Proteins, 2008, v.72, p.7li-719

77. Gekko K., Kunori Y., Takeuchi? H., Ichihara S:, and;Kodama Ml Point mutations at glycine-121 of Escherichia coli dihydrofolate reductase: important roles of a flexible loop in the: stability andsftnctionï J^zoc/zem. v ^

78. Kusano Mi, Yasukawa ; K., and Inouye K. Effects ; of the; mutational combinations on: the activity and stability "of thermolysin. J.BiotechnoL, 2010;:^v. 147, p:7-16

79. Szilagyi A. and Zavodszky P. Structurait basis for the extreme thermostability of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, from Thermotoga maritima: analysis based on homology modeling. Protein Eng, 1995, v.8, p.779-789

80. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.l. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, p.183-188

81. Serov A.E. and Tishkov V.l. Role of Pro residues in stability of prokaryotic and euacaryotic formate dehydrogenases. Вестн. Моск. Ун.-та. сер. 2. химия., 2002, v. 43, p. 345-349

82. Serov A.E., Odintzeva E.R., Uporov I.V., and Tishkov V.l. Use of Ramachandran plot for increasing thermal stability of bacterial formate dehydrogenase. Biochemistry (Mose.), 2005, v.70, p.804-808

83. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., and Pohl M. Novel mutants of formate dehydrogenase from Candida boidinii. US Patent Application Publication; 2003, US2003/0157664

84. Odintseva E.R., Popova A\S., Rojkova A.M:, and Tishkov V.l. Role of cysteine residues in stability of bacterial formate dehydrogenase. Bull.Moscow Univ., 2002, Ser.2 Chem , v.43, p.356-359

85. Felber S. Optimierung der NAD+-abhafingigen Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii fuEr den Einsatz in der Biokatalyse. Ph.D. Thesis. Pleinrich-Heine University of Duesseldorf. 2001, URL: http://diss.ub.uni-duesseldorf.de/ebib/diss/file?dissid=78.

86. Rozzell J.D., Hua L., Mayhew M., and Novick S. Mutants of enzymes and methods for their use. US Patent Application Publication 2004, US2004/0115691

87. Hummel W. and Kula M. (1989) Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. Eur.J.Biochem., v.184, p.1-13120; Zhao H. and van der Donk W.A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr.Opin.Biotechnol., 2003, v.14, p.583-589

88. Hummel, W. and Harald, G. Adh from rhodococcus erythropolis. US patent US2006246561 (Al).

89. Hummel W., Harald: G., Altenbuchner J., Menzel A. Process For Preparing Optically Active Amino Acids Using a Whole-Cell Catalyst. 2009, US patent US20090087885

90. Вommarius A.S., Drauz K., Schwann :M:, Stingl K., Kottenhahn M., and Huthmacher K. Synthesis and use of enantiomerically pure tert-JLeucine. Tetrahedron: Asymmetry, 1995, v.6, p.2851-2888'

91. Ketterer L. and Keusgen M: Ampcromctric sensor for cyanide utilizing cyanidase and formate,dehydrogenase. Anal.Chim.Acta, 2010; v.673j p.54-59125: Schaller K. PI. and Triebig G. Methods in enzymatic analysis. VCH; Weinteim, 1994, v.l, p.30-42 ' ; .

92. Sanger P., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with- chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1977, v.74, p.5463-5467.

93. Popov V.O., Lamzin V.S. NAD(+)-dependent formate dehydrogenase. Biochem: J., 1994, v.301, p.625-643.

94. Закс A.M., Авилова T.B., Егорова OA., Попов B.O., Егоров A.M. Кинетический механизм" действия- NADi-зависимош формиатдегидрогеназы. метилотрофных дрожжей. Candida methylica. Биохимия, 1982, т.47, с.546-55 Г

95. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: «Мир», 1986. С. 135169.

96. Ohyama Т.; Yamazaki I. Formate dehydrogenase. Subunit and mechanism of inhibition by cyanide and azide. J.Biochem., 1975, v.11, p. 845-852

97. Попов В.О., Родионов Ю.В., Егоров A.M., Березин И.В. Формиатдегидрогеназа из Bacterium sp.l: число активных центров и константы связывания с коферментами. Докл. Ак.наук СССР, 1978, т.239, с. 1482-1485