Инженерия коферментной специфичности формиатдегидрогеназ из метилотрофных бактерий и растений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЯСНЫЙ Илья Евгеньевич

ИНЖЕНЕРИЯ КОФЕРМЕНТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ И РАСТЕНИЙ

02 00 15-КАТАЛИЗ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических нау!

Москва-2008

003171841

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЯСНЫЙ Илья Евгеньевич

ИНЖЕНЕРИЯ КОФЕРМЕНТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ И РАСТЕНИЙ

02 00 15-КАТАЛИЗ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2008

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

Официальные оппоненты

член-корр РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович профессор, доктор химических наук Витаутас-Юозапас Каятоно Швядас

Ведущая организация

Институт биохимии им А H Баха РАН

Защита диссертации состоится 17 июня 2008 года в 16 часов на заседании совета Д 501 001 59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени M В Ломоносова

Автореферат разослан 12 мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

И К Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы NAD+ и NADP+ - коферменты, играющие огромную роль во всех живых клетках NADP* отличается от NAD* всего лишь тем, что 2'-гидроксильная группа рибозы аденозина в молекуле NADP+ заменена остатком фосфорной кислоты Однако в живых клетках NAD+ и NADP+ выполняют принципиально различные функции NADPH используется в организме в реакциях синтеза различных соединений, a NAD+, напротив, участвует преимущественно в окислительных процессах, и полученный NADH расходуется на удовлетворение энергетических потребностей клетки Подавляющее большинство ферментов, катализирующих реакции с участием NAD+ и NADP+, высокоспецифичны по отношению к определенному коферменту и лишь немногие дегидрогеназы проявляют близкую активность с NAD+ и NADP* Это позволяет клетке осуществлять раздельную регуляцию процессов получения NADH, необходимого для синтеза АТР, и синтеза различных соединений с участием NADPH Таким образом, реакции, катализируемые NAD+- и ЫА0Р+-зависимыми дегидрогеназами, представляют собой прекрасный пример реализации механизма высокоспецифичного молекулярного распознавания близких по структуре соединений

ЫАО+-зависимая формиатдегидрогеназа (КФ 12 12) катализирует окисление формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH Среди большого разнообразия ФДГ отдельную группу образуют ферменты, состоящие из двух идентичных субъединиц и не содержащие ионов металлов и простетических групп ФДГ этой группы принадлежит к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксиксилот ФДГ катализирует очень простую реакцию, механизм которой включает только гидридный перенос без стадии кислотно-основного катализа Субстрат этой реакции - формиат-ион - одно из простейших органических соединений Поэтому ФДГ рассматривается как модельный фермент для изучения структуры и механизма действия всего суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот Наиболее изученным ферментом среди ФДГ данной группы является формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp 101 (РБеФДГ*) Для ФДГ из бактерий Pseudomonas sp 101 в банке данных трехмерных структур PDB имеется несколько структур высокого разрешения как для апо-, так и для

* В данной работе приняты следующие сокращения ФДГ - формиатдегидрогеназа, РэеФДГ - ФДГ из Pseudomonas sp 101, АгаФДГ - Arabidopsis thahana, СЬоФДГ - Candida boidinn, БсеФДГ -Saccharomyces cerevisiae, БоуФДГ - сои Glycine max, NAD+ и NADH -окисленная и восстановленная формы никотинамидадениндинукпеотида, NADP+ и NADPH - окисленная и восстановленная формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата

холофермента В нашей лаборатории методом направленного мутагенеза были получены различные мутантные РэеФДГ с измененной коферментной специфичностью, с повышенной химической и температурной стабильностью Вторая по изученности ФДГ - фермент из дрожжей Candida boidinn Для нее в 2007 году была опубликована структура апо-фермента и получены мутантные формы с повышенной температурной и химической стабильностью, но по своим свойствам эти мутанты значительно уступают мутантным ФДГ из Pseudomonas sp 101 (Tishkov VI ,2006)

Плохая изученность ФДГ из растений связана с тем, что выход этого фермента из природных и трансгенных растений очень низок, а экспрессия в Ecoli приводила к образованию телец включения Проблема экспрессии растительных ФДГ в клетках Ecoli в активной и растворимой форме была решена в нашей лаборатории в конце 2004 г, когда были созданы рекомбинантные штаммы-продуценты для ФДГ из растений Arabidopsis thaliana и Glycine max Их наличие сделало возможными исследования ФДГ из растений методом направленного мутагенеза

Все природные ФДГ высокоспецифичны к NAD* Однако формиатдегидрогеназы из различных источников отличаются по степени специфичности к NADP+ Наибольшую коферментную специфичность к NAD+ по сравнению с NADP* проявляет ФДГ из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (эффективность катализа с NAD+ в 3,0x109 раза больше, чем с NADP+) В случае ФДГ из Pseudomonas sp 101 эффективность катализа с NADP+ выше и уступает эффективности катализа с NAD+ только в 2400 раз Данные о коферментной специфичности растительных ФДГ в литературе отсутствуют

В нашей лаборатории были получены мутанты ФДГ из Pseudomonas sp 101, специфичные к NADP+ Однако оказалось, что первая генерация мутантов имеет узкий pH-оптимум связывания кофермента в щелочной области (до pH 7,4) Получение второй генерации мутантов позволило расширить pH-оптимум связывания кофермента до pH 9,0 Для практического применения необходимо расширение pH-оптимума связывания NADP+ до pH 10,0 Для ФДГ из Candida boidinn также был получен ЫАйР+-зависимый фермент, кинетические свойства и термостабильность которого значительно (на порядок и более) хуже по сравнению с таковыми для МАйР+-зависимых ФДГ из Pseudomonas sp 101 Для растительных ферментов данных об изменении коферментной специфичности нет

Таким образом, проблема детального исследования коферментной специфичности ФДГ методом направленного мутагенеза является важной фундаментальной и практической задачей

Цель и задачи исследования. Цепью данной работы было

1 Получение мутантов ЫАОР+-зависимой РэеФДГ с расширенным рН-опти-мумом связывания кофермента в диапазоне pH 7,0-10,0 Как уже отмечалось выше, ранее в нашей лаборатории были получены ЫАОР+-зависимые РэеФДГ, эффективно связывающие кофермент при pH не выше 9,0

2 Повышение продуктивности генетических конструкций для экспрессии ЫАОР+-зависимых РзеФДГ Использованные ранее штаммы-продуценты Е coli обеспечивали низкий уровень экспрессии выход мутантных ЫАОР*-зависимых РзеФДГ (не более 1-2% от общего растворимого белка клетки) Для применения новых мутантных ФДГ на практике необходимо было повысить уровень их экспрессии

3 Повышение химической и температурной стабильности ЫАОР+-зависимых мутантов РзеФДГ Ранее были получены мутанты ЫАО+-зависимой РвеФДГ с увеличенной температурной и химической стабильностью Решено было объединить в одном мутанте замены, обеспечивающие специфичность РэеФДГ к NADP+, с заменами, увеличивающими химическую и температурную стабильность РэеФДГ

4 Получение ЫАОР+-зависимых мутантов ФДГ из растений резуховидки Таля Arabidopsis thaliana и сои Glycine max В литературе данные о коферментной специфичности растительных ФДГ, и, тем более, о создании ЫА0Р+-зависимых форм ФДГ из растений отсутствуют

Научная новизна В данной работе были созданы подходы, позволяющие с помощью направленного мутагенеза расширить pH-оптимум связывания кофермента ЫА0Р+-зависимыми мутантами РэеФДГ Было показано, что возможно независимое объединение мутаций, которые обеспечивают улучшение различных свойств РэеФДГ - повышенную температурную и химическую стабильность, с одной стороны, и специфичность к NADP\ с другой Таким образом, мы продемонстрировали аддитивность таких мутаций

Полученные данные свидетельствуют о том, что с помощью всего одной аминокислотной замены можно на порядок повысить сродство растительных ФДГ из A thaliana и G max к NADP* Таким образом, впервые были получены ФДГ из растений с измененной коферментной специфичностью В результате проведенных экспериментов было показано, что подход к изменению коферментной специфичности, разработанный в нашей лаборатории в приложении к бактериальным ФДГ, универсален и его можно использовать для изменения коферментной специфичности ФДГ из эволюционно далекого источника (растений)

Практическая значимость работы Формиатдегидрогеназа используется в процессах синтеза оптически активных соединений с участием NAD(P)+-зависимых дегидрогеназ в качестве фермента, способного регенерировать кофермент Полученная нами NADP^-зависимая форма биокатализатора была успешно испытана в ряде зарубежных лабораторий

Создание высокоэффективных штаммов-продуцентов рекомбинантной 1ЧАОР+-зависимой ФДГ из бактерий и растений дает основу для разработки процессов получения ЫАйР+-зависимых мутантов ФДГ в больших количествах

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих Международных и российских конференциях 1-й Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2002), 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, Россия, 2003), Конференция «И В Березин - 80 лет» (Москва, Россия, 2003), Международная конференция «Ломоносов - 2006» (Москва, Россия, 2006), 4-й Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007), III Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 6 тезисов докладов конференций Обе статьи опубликованы в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, опубликованный на сайте ВАК РФ

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация содержит 119 страниц печатного текста, 25 рисунков, 20 таблиц и 150 ссылок

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методы исследования В работе использовали различные методы генетической инженерии (Sambrook J , 2001) Направленный мутагенез проводили с помощью полимеразной цепной реакции (Но SN, 1989) Мутантные и немутантные формы РБеФДГ, ЭоуФДГ и АгаФДГ, экспрессированные в клетках Ecoh, выделяли и очищали по стандартной методике, разработанной для РвеФДГ (Tishkov VI, 1999), с незначительными модификациями для растительных ферментов

Активность и кинетические константы ФДГ определяли спектрофото-метрически по накоплению NAD(P)H при длине волны 340 нм (ез4о= 6220 М 1см"1) на спектрофотометре «Shimadzu UV 1601 PC» при 30 °С Термостабильность

мутантных ФДГ и рекомбинантных ферментов дикого типа измерялась, как описано ранее (Rojkova А М , 1999)

Анализ трехмерных структур ФДГ проводили с помощью программ «Swiss-PdbViewer v3 7», «RasMol v2 7» и «Accelrys DS Vizualizer vi 7» Для РэеФДГ использовались данные рентгеноструктурного анализа для ano- (2NAC) и холо-форм (2NAD) фермента Моделирование структуры 1МАОР+-зависимых мутантов РБеФДГ проводили в сотрудничестве с кф-м н Упоровым ИВ на станции молекулярной графики SGI Indy (Silicon Graphics, США) с использованием пакета программ Insight II (Accelrys Software, США)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Расширение pH-оптимума активности №А0Р+-зависимых РэеФДГ

Известно, что в случае формиатдегидрогеназы максимальная скорость реакции Vmsx постоянна в диапазоне значений pH 6,0-11,0, поэтому уменьшение эффективности катализа при высоких значениях pH связано только с падением сродства фермента к коферменту

Двойные NADP* -зависимые мутанты. Первая генерация NADP+-зависимых ФДГ из Pseudomonas sp101, полученная в нашей лаборатории, состояла из двух точечных мутантов, РэеФДГ М8 и М9 Хотя мутант РэеФДГ М9 и вторая генерация ЫАОР+-зависимых мутантов, полученных на его основе (РэеФДГ IVI9-10 и М9-20) проявили высокое сродство к NADP+, мутант РэеФДГ М8 обладает более высокой каталитической активностью и повышенным сродством к формиату (Км по формиату 14 мМ) Поэтому мы решили провести эксперименты по расширеню pH-оптимума связывания NADP* для этого мутеина путем введения второй дополнительной мутации аналогично мутанту РэеФДГ М9 Вторые мутации были введены в ген РэеФДГ М8 методом полимеразной цепной реакции Плазмиды выделили, наличие только требуемых мутаций подтвердили секвенированием Для получения мутеинов было проведено культивирование рекомбинантых штаммов-продуцентов NADP+-зависимых ферментов, и новые мутантные ферменты были очищены до чистоты не менее 98% В результате были получены двойные мутанты РвеФДГ М8-10 и М8-20

Кинетические параметры новых мутантов представлены в табл 1, а данные по термостабильности - на рис 1

I, сек

Рис. 1 Термостабильность мутантов на основе замен М8 и М9 при температуре 62°С рН 7,0, 0,1М КФБ

Таблица 1

Кинетические параметры мутантных РэеФДГ на основе замены М8

Параметр Мутант

М8* МЭИ о" М8-10 М9-20" М8-20

ксаи С 1 2,5+0,2 1,9+0,1 1,2+0,1 2,0±0,1 1,9±0,2

Км"000", мМ

рН 7 45+1 46±5 35±4 87+6 43+4

рН 8 НД н Д 39+4 н Д 40+4

рН 9 нд н Д 65+6 н д 70±6

1СА0Р', мМ

рН 7 0,29±0,03 0,29+0,02 0,61+0,05 0,31+0,03 0,49±0,03

рН 8 1,1+0,1 0,33+0,03 1,0+0,1 0,33+0,03 0,51±0,03

рН 9 НД 0,32+0,02 1,1+0,1 0,33+0,03 0,84±0,09

рН 10 н Д 0,56+0,05 1,5+0,2 0,50+0,04 1,0+0,1

Кп, 62°,10" с"1 2,3+0,2 7,2±0,2 7,1 ±0,2 7,3±0,2 7,0±0,2

Результаты экспериментов позволяют утверждать, что полученные двойные мутанты (особенно двойной мутант РвеФДГ М8-20) обладают достаточно

* Тишков В И , 1993 " Садыхов Э Г , 2001

широким рН-оптимумом связывания кофермента и при этом имеют несколько лучшую Км по формиату, чем мутанты на основе РэеФДГ М9 Однако их Км по ЫАйР*, особенно при высоких значениях рН, намного хуже, чем у ферментов на основе РвеФДГ М9 Поэтому для дальнейшей работы решено было использовать мутанты на основе РэеФДГ М9

Процесс термоинактивации (рис 1) всех изученных мутантов описывается кинетикой реакции первого порядка, поскольку наблюдается линейная зависимость логарифма остаточной активности от времени Тангенс угла наклона прямых дает значение константы скорости инактивации

Как следует из рис 1, термостабильность двойных мутантов РэеФДГ М8-10 и М8-20 ниже по сравнению с исходным РэеФДГ М8 Аналогичные результаты были ранее получены и для двойных МАОР+-зависимых мутантов на основе РэеФДГ М9 Введение второй мутации и в том, и в другом случае приводит к увеличению константы скорости термоинактивации примерно в три раза

Тройные ЫАОР*-зависимые мутанты Ранее в нашей лаборатории на основе мутанта РвеФДГ М9 были получены три двойных мутанта ЫАОР+-зависимой рекомбинантной формиатдегидрогеназы РэеФДГ М9-10, М9-20 и М9-30 с расширенным рН-оптимумом связывания ко фермента Кинетические исследования показали, что при рН выше 9,0 сродство всех мутантов к коферменту ухудшается

Нашей задачей было получить мутанты РэеФДГ с рН-оптимумом связывания ЫАОР+, расширенным до значения рН 10,0 Для этого решено было ввести дополнительные мутации в двойные мутанты РвеФДГ М9-10 и М9-20 Предварительно для выбора мутаций, которые могли бы обеспечить наилучший результат, было проведено компьютерное моделирование структур возможных мутантов с ЫАйР+ Для проведения моделирования в качестве исходных данных использовали ранее полученные модельные структуры двух мутантных форм РэеФДГ (М9-10 и М9-20) в комплексе с ЫАРР+ В структуры этих мутантов вводили дополнительные аминокислотные замены, проводили оптимизацию конформации белковой глобулы и анализировали взаимодействие аминокислотных остатков с 2'-фосфатной группой кофермента и между собой В результате моделирования были отобраны три наиболее перспективных тройных мутанта На основании результатов моделирования было высказано предположение, что наибольшего эффекта следует ожидать от тройного мутанта РэеФДГ М9-21

Новые мутантные РэеФДГ получали с помощью полимеразной цепной реакции В качестве исходной матрицы использовали плазмиды рРОНб М9-10 и рРОНб М9-20 Для доказательства наличия только требуемых мутаций участки генов с мутациями были отсеквенированы по обеим цепям

Были получены высокоочищенные препараты мутантных РэеФДГ (не менее 98% чистоты), изучены их кинетические свойства и термостабильность На рис 2 представлены рН-зависимости Км по №АОР* двойных и тройных мутантов РэеФДГ в интервале рН от 7,0 до 10,0

Из рис 2 видно, что введение третьей мутации позволило расширить диапазон эффективного связывания кофермента до значения рН 10,0 для всех трех тройных мутантов ЫАОР+-зависимой РзеФДГ - М9-11, М9-12 и М9-21 Полученные результаты согласуются с данными нашего компьютерного моделирования Видно, что мутант РвеФДГ М9-21 обладает немного более высоким сродством к коферменту, чем два других тройных мутанта

Для всех полученных мутантов при рН 7,0 были измерены константы Михаэлиса по второму субстрату - формиату (табл 2), к которому ЫАОР+-специфичные мутанты имеют более низкое сродство, чем фермент дикого типа

7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0

РН

Рис 2 рН-зависимости Км по ЫАОР+для двойных и тройных мутантов РэеФДГ 30°С, 0,1М КФБ

Из таблицы видно, что константа Михаэлиса по формиату как двойного мутанта РзеФДГ М9-20, так и тройного РэеФДГ М9-21 в полтора раза выше, чем у двойного мутанта РэеФДГ М9-10 и тройных РэеФДГ М9-11 и М9-12 Видно, что введение еще одной аминокислотной замены в двойной мутант РвеФДГ М9-20 не привело к изменению Км по формиату Введение в двойной мутант РвеФДГ М9-10 третьей замены в одном случае не повлияло на сродство фермента к формиату, а в другом константа Михаэлиса несколько улучшилась

Таблица 2

Км по формиату и по NADP" мутантов РвеФДГ при pH 7,0

Мутанты РзеФДГ Км по формиату, мМ Км по IMADP+, мМ

Двойной М9-10 48 ±8 0,27 + 0,04

Тройной (новый) М9-11 47 + 7 0,24 ± 0,02

Тройной (новый) М9-12 40 ± 7 0,32 ± 0,06

Двойной М9-20 66 ± 10 0,38 ± 0,08

Тройной (новый) М9-21 69 + 9 0,22 ± 0,02

Для всех полученных мутантов была изучена термостабильность при температуре 62°С. На рис. 3 представлены зависимости логарифма остаточной активности мутантов от времени. Как следует из этого рисунка, введение третьей мутации не сказывается на термостабильности фермента.

5 "

3 -

2 -

ч.

М9-11 М9-21 МЭИ 2 М9-10 М9-20

х

х

ч,*

X

ч.

X

\

BOOQ

-1-

800 D

10000

О 2000 4000

t, sec

Рис. 3. Зависимость логарифма остаточной активности мутантов РэеФДГ от времени при 62°С. pH 7,0, О,IM КФБ

Таким образом, в результате проведенных экспериментов удалось существенно (на 1 единицу pH) расширить pH-оптимум связывания NADP+ у мутантных ЫАОР+-специфичных формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp. 101. Целесобраз-ность практического применения того или иного мутанта зависит от условий проведения процесса. Если технологический процесс проводится при малом избытке формиата, более целесообразно применение тройного мутанта РвеФДГ М9-12. Если лимитирующим фактором процесса является сродство к

NADP\ более выгодно применять мутант РэеФДГ М9-21, который хуже связывает формиат, но имеет повышенное сродство к коферменту

Повышение эффективности экспрессии тройных мутантов NADP+-3aBHcuMbix РэеФДГ

Полученные нами ранее гены тройных мутантов РэеФДГ М9-11 и М9-12 с расширенным рН-оптимумом активности были клонированы в плазмиду pFDH6 Данная генетическая конструкция создана на основе плазмиды pUC19, в которую в дополнение к /ас-промотору был встроен также и tac-промотор Однако даже под контролем двух промоторов выход ферментов по активности с NADP* составлял всего 150-300 ед/л Чтобы повысить выход мутантных ферментов, решено было переклонировать участок, содержащий мутации, в плазмиду pFDH8, производную от рЕТ23а Данная ппазмида содержит высокоэффективный промоторный участок ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7 В случае NAD*-зависимой РБеФДГ использование этой плазмиды для экспрессии позволило достичь выхода ФДГ в активной форме на уровне 50% от общего количества растворимых белков Eco// В результате клонирования в плазмиду pFDH8 были получены плазмиды pFDH8M9-11, pFDH8 М9-12, pFDH8 М8-10, pFDH8 M8-20 Результаты экспрессии рекомбинантных ферментов показаны в табл 3

Таблица 3

Сравнение эффективности биосинтеза в клетках Е coli мутантных NADP''-специфичных РэеФДГ при использовании различных систем экспрессии*

Плаз мида

pFDH6 М9-12 pFDH8 М9-11 pFDH8 М9-12 pFDH8 М8-10 pFDH8 M8-20

Система экспрессии lac+tac Т7 17 17 17

Выход, ед/л (активность по ЫАОР*) 150±20 1470±90 2330+150 1340±90 910±60

Выход активного белка, мг/л 60±8 930±80 590+50 540+40 360±30

* приведены средние данные из трех независимых культивирований

Из табл 3 видно, что при переходе на новую систему экспрессии выход фермента повышается как в случае двойных, так и в случае тройных мутантов В зависимости от типа мутанта наблюдается увеличение уровня экспрессии от 6 до 15 раз

В табл 4 представлены кинетические параметры мутантных ферментов, экспрессированных в новой системе

Таблица 4

Кинетические параметры тройных мутантов ФДГ

Параметр Мутант

М9-12 М9-11

ксаь с 1 1,7±0,2 1,6+0,2

Кмнсоо-,мМ

рН 7 39±3 47±3

рН 8 37+2 60+4

рН 9 45+3 60+3

КМ"А°Р+, мМ

рН 7 0,32+0,01 0,25±0,01

рН 8 0,32±0,01 0,38±0,03

рН 9 0,31±0,02 0,35±0,02

рН 10 0,ЗОЮ,02 0,34±0,02

л,т бг-с.ю" си 7,2±0,1 7 3±0,1

Из таблицы видно, что экспрессия в данной системе, как и следовало ожидать, не приводит к изменению кинетических параметров (см табл 2)

Повышение химической и температурной стабильности №0Р+-зависимых РэеФДГ

Ранее в нашей лаборатории был получен мутант ЫАО+-зависимой РэеФДГ 5М(8)3 с аминокислотными заменами, повышающими химическую и температурную стабильность В ген этого мутантного фермента решили ввести мутации М9-10 и М9-20 Плазмиды рРРН 5М(8)5М9-10 и рЯОН ЗМ(8)5М9-20 выделили, участки с геном РвеФДГ отсеквенировали по обеим цепям для доказательства наличия только требуемых мутаций

Из данной таблицы видно, что объединение мутаций позволило получить ферменты, сочетающие полезные качества ферментов-предшественников С одной стороны, новые мутанты имеют высокое сродство к ЫАЭР+ в диапазоне рН 7,0-9,0, с другой стороны, термостабильность этих ферментов возросла на 1215%

Кинетические свойства новых мутантов приведены в табл 5

Таблица 5

Кинетические свойства NADP'-зависимых мутантных ферментов на основе мутанта РэеФДГ SM(8)S

Параметр Мутант

М9-10 М9-20 SM(8)SM9-10 SM{8)SM9-20

K„NADPt, мМ pH 7 0,29±0,02 0,31±0,03 0,35±0,04 0,32±0,04

K„NADP\ нМ pH 8 0,3310,03 0 33±0,03 0,33±0,05 0,34±0,04

KMNADP*, мМ pH 9 0,32±0,02 0,32±0,03 0,36±0,06 0,32±0,04

kcau c 1,9±0,1 2,0±0,1 2,1±0,1 2,0±0,1

К», 62°,10"* с1 6,9±0,4 7,0±0,4 6,5±0,3 6,1±0,2

Ранее в нашей лаборатории был получен мутант ФДГ из Pseudomonas sp 101 Glu170Asp с повышенной термостабильностью Решено было ввести такую мутацию и в ген ЫАОР+-зависимой РэеФДГ

Мутацию Glu170Asp решили ввести в плазмиду pFDH8 SM(8)S М9-20 Плазмиды с введенной мутацией выделили и отсеквенировали для доказательства наличия только требуемых замен

Кинетические свойства мутанта РэеФДГ SM(8)SM9-20-E170D представлены в табл 6

Таблица 6

Кинетические свойства мутанта РэеФДГ SM(8)SM9-20-Glu170Asp

Параметр Мутант

РвеФДГ SM(8)SM9-20 PseOflr SM(8)SM9-20-E170D

KMNADt, мМ, pH 7 1,10±0,07 1,17±0,08

K„NADP\ мМ, pH 7 0,32±0,04 0,22±0,01

kcah С 1 2,0±0,1 2,1±0,3

с"1 6,1 ±0,2 5,2±0,2

Как и в случае мутанта Е1700 ИАО+-зависимой РэеФДГ, мутант РэеФДГ 8М(8)5-М9-20-Е1700 оказался более термостабильным, чем исходный фермент РэеФДГ 5М(8)5-М9-20 При этом его сродство к коферменту оказалось даже выше, чем у исходного фермента

Получение МАОР*-зависимых форм растительных ФДГ

Впервые растительные ФДГ были выделены одновременно с бактериальными и дрожжевыми ферментами еще в конце 40-х - начале 50-х годов прошлого века В начале 90-х годов было установлено, что растительные ФДГ локализованы в митохондриях Из-за низкого содержания фермента в растениях и трудности его выделения свойства формиатдегидрогеназ из растений

охарактеризованы намного хуже, чем бактериальных ФДГ Даже использование трансгенных растительных систем экспрессии не позволило нарабатывать эти ферменты в больших количествах

Оптимальным для изучения свойств фермента является его гетерологичная экспрессия, например, в клетках Е coli Первые попытки экспрессии растительных ФДГ в клетках Ecoli приводили к образованию телец включения Как уже отмечено выше, задача экспрессии растительных ФДГ в клетках Е coli в активной и растворимой форме впервые была успешно решена в нашей лаборатории Были созданы генетические конструкции и получены рекомбинантные растительные ФДГ из двух источников - резуховидки Таля Arabidopsis thaliana (АгаФДГ) и сои Glycine max (БоуФДГ)

В табл 7 представлены кинетические свойства рекомбинантных РэеФДГ, АгаФДГ и БоуФДГ, экспрессированных в клетках Е coli Результаты исследования коферментной специфичности показали, что АгаФДГ более специфична к NAD+, чем ФДГ из сои и РэеФДГ БоуФДГ оказалась в 2 раза менее специфична к NAD\ чем РвеФДГ Также отметим, что по сравнению с РэеФДГ Км по NADP+ растительных ферментов дикого типа значительно ниже (в 20 раз для АгаФДГ и в 200 раз для БоуФДГ) Однако в случае РзеФДГ величина kcat оказалась выше, чем у растительных формиатдегидрогеназ (табл 7)

Таблица 7

Коферментная специфичность бактериальной и растительных ФДГ

Источник ФДГ Удельная активность, ед/мг KMNAD+, мкМ KMNADP+, ш Кмнсоо",мМ U.NADP tNAD cat j cat rrNADP „NAD M KM

Pseudomonas sp 101 10,0±0,7 60±5 >200 7,0±0,8 4,2x10"4

Arabidopsis thaliana 6,5±0,5 20,0±0,8 10±2 2,8+0 3 5,0x105

Glycine max 6,2±0,4 17,4±1,6 1,00±0,05 1,2+0,1 8,7x10""

Нашей задачей стало получение ЫАОР+-зависимых мутантов растительных ферментов Для выбора нужных аминокислотных замен мы провели сравнение аминокислотных последовательностей ФДГ из различных источников в районе коферментсвязывающего домена (рис 4) Анализ последовательностей показал, что все рассмотренные ФДГ содержат консервативный остаток аспарагиновой кислоты, отвечающий за образование водородных связей с 2'- и З'-ОН-группами рибозы аденозина При связывании ЫАйР+ в активном центре ФДГ возникает электростатическое отталкивание между отрицательно заряженной карбоксильной группой остатка аспарагиновой кислоты и 2'-фосфатной группой

кофермента Поэтому необходимым условием изменения коферментной специфичности является удаление отрицательного заряда в этом положении

Ранее также было показано (Serov А Е , 2002), что вторым важным моментом в обеспечении коферментной специфичности ФДГ является тип аминокислотного остатка в положении +1 к остатку аспарагиновой кислоты Для эффективного связывания NADP+ в этом положении необходимо наличие остатка аргинина Взаимодействие положительного заряда гуанидиниевой группы остатка аргинина с 2-фосфатной группой NADP+ облегчает связывание кофермента В случае дрожжевых ФДГ дикого типа наличие в этом положении остатка тирозина приводит к очень высокой коферментной специфичности этих формиатдегидрогеназ к NAD* по сравнению с NADP* (разница в каталитической эффективности более, чем на 6 порядков) Природные бактериальные и растительные ФДГ, у которых в положении +1 к консервативному остатку аспарагиновой кислоты находится остаток аргинина, способны гораздо более эффективно катализировать окисление формиата в присутствии NADP+ (разница в каталитической эффективности всего в 3-4 порядка) Из литературных источников известно, что другие ЫАОР+-зависимые дегидрогеназы также содержат остаток аргинина в положении +1 к консервативному остатку аспарагиновой или глутаминовой кислоты Можно было предположить, что для изменения коферментной специфичности ФДГ из растений будет достаточно одной мутации, удаляющей отрицательно заряженную карбоксильную группа остатка аспарагиновой кислоты Замена консервативного остатка аспарагиновой кислоты на менее объемные и незаряженные остатки аланина и серина должна привести к повышению сродства ФДГ к NADP* Было решено получить мутанты ЭоуФДГ Asp200Ala, Asp200Ser и мутант АгаФДГ Asp201Ser

Мутации были введены в гены ферментов методом направленного мутагенеза с помощью полимеразной цепной реакции

В качестве матрицы для получения мутантов взяли плазмиды pSoyFDH2 и pAraFDH2 Мутантные плазмиды выделили, наличие только требуемых мутаций подтвердили секвенированием После культивирования рекомбинантных штаммов-продуцентов Ecoli, ферменты выделили в активном растворимом виде и очистили по стандартной методике, разработанной для бактериальных ферментов Кинетические свойства мутантных ферментов приведены в табл 9

PA

aB

рв

аС

Бактерии РэеФДГ МогФДГ РагФДГ Растения АгаФДГ БоуФДГ Ар1ФДГ Дрожжи БсеФДГ ОЬаФДГ СтеФДГ Грибы МдгФДГ ЫеиФДГ АэрФДГ

MHVGTVAAGRIGLAVLRRLAP FDV-HLH YTDRHRL PE SVEKELN---

MHVGTVAAGRIGLRVLRLLAPFDM-HLHYTDRHRLPEAVEKELN---

MHVGTVÄAGRIGLAVLRRFKPFGM-HLHYTDRHRLPREVELELD---

KTIGTVGAGRIGKLLLQRLKPFGC-NLLYHDRLQMAPELEKETG---

KTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFNC-NLLYFDRLRIDPELEKEIG---

KTVGTVGAGRIGRLLLLTLNPVHC-DLLYHDRVKIDPEVEQHTG---

KIISTVGAGRIGYRVLERLVAFNPKKLLYYDYQELPAEAINRLNEAS KVIATVGAGRIGYRVLERLIAFNPKKLL Y YD YQDL PKEAIDKLNQAS KTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYDYQALPKEAEEKVG---

KVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYFDYQALAPEVEKEIG---

KWGTVGVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLSAEKEAEIG---

KWGTVGVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLRPEVEKEIG---

XXX X

Рис 4 Сравнение последовательностей ФДГ из различных источников Полужирным шрифтом выделены остатки консенсусной последовательности G(A)XGXXG, консервативный остаток Asp и следующий за ним остаток Представлены последовательности ФДГ из Pseudomonas sp 101 (РэеФДГ), Moraxella sp (МогФДГ), Paracoccus sp 12-A (РагФДГ), Arabidopsis thaliana (АгаФДГ), Glycine max (БоуФДГ), яблока Malus x domestica (Ар1ФДГ), Saccharomyces cerevisiae (ЭсеФДГ), Debaryomyces hansenu (ОЬаФДГ), Candida methylica (СтеФДГ), Mycosphaerella gramimcola (МдгФДГ), Neurospora crassa (№иФДГ), Aspergillus nidulans (АБрФДГ)

Таблица 9

Свойства NADP+-3aBHCHMbix мутантных формиатдегидрогеназ из растений

Фермент мМ KMnadp+, MM yNADP+ уИЛО* Увеличение эффективности катализа с IMADP+, раз*

БоуФДГ D200A 2,2±0,4 1,4+0,1 2,1 42

ЭоуФДГ D200S 2,0+0,4 0,48±0,4 1,7 34

АгаФДГ D201S 1,9±0,3 1,8±0,2 4,7 187

РвеФДГ М8 1,02±0,25 0,27±0,03 0,5 665

* Увеличение эффективности катализа с NADP+ было рассчитано как отношение Cfcat/KM)NADP+ для мутанта к (kzaX/ KM)NADP+для фермента дикого типа

Замены остатка аспарагиновой кислоты в обеих растительных ФДГ привели к повышению эффективности катализа с NADP* более, чем на порядок Замена остатка аспарагиновой кислоты на остаток серина в БоуФДГ приводит к более

эффективному связыванию ЫАРР+ с ферментом по сравнению с заменой на остаток аланина. Как видно из модельной структуры (рис. 5), остаток аспарагиновой кислоты пространственно сближен с 2'-фосфатной группой кофермента. Замена этого остатка на остаток серина, способный образовывать водородную связь с кислородными атомами 2'-фосфатной группы, должна приводить к лучшему связыванию кофермента, чем замена на гидрофобный

Рис. 5. Модельная структура БоуФДГ в комплексе с NAD+

Рис. 6. Сравнение рентгеновской структуры РэеФДГ (в комплексе с NAD*, слева) и модельной структуры АгаФДГ (в комплексе с NAD+, справа)

В случае фермента из РэеФДГ эффект от одной мутации оказался гораздо значительнее, чем для ФДГ из растений Можно предположить, что причиной худшего сродства мутантных растительных ФДГ к NADP+ по сравнению с NADP+-зависимой РэеФДГ являются следующие два фактора Во-первых, в аминокислотной последовательности РвеФДГ вслед за остатком Arg222 расположен остаток His223 Положительно заряженная имидазольная группа этого остатка взаимодействует с 2'-фосфатной группой NADP+, что должно облегчать связывание кофермента В случае ферментов из растений на этом месте находится гидрофобный остаток лейцина, который не может способствовать связыванию NADP+ Во-вторых, в трехмерной структуре РэеФДГ в комплексе с NADP+ 2'-фосфатная группа кофермента сближена с остатком His379, также несущим положительный заряд (рис 6) В структуре растительных ферментов аналогичный остаток вообще отсутствует

Таким образом, можно выделить два существенных результата наших исследований коферментной специфичности растительных

формиатдегидрогеназ

1 Нам впервые удалось за счет одной аминокислотной замены изменить специфичность растительных ФДГ из А thaliana и G тах от NAD+ к NADP" В ходе кинетических исследований оказалось, что этого недостаточно для получения фермента, способного связывать NADP+ с такой же эффективностью, как ЫАОР+-зависимая ФДГ из Pseudomonas sp 101 Причина данного различия, вероятно, состоит в том, что в структуре растительных ферментов отсутствуют аминокислотные остатки, обеспечивающие наличие дополнительного положительного заряда в районе связывания 2'-фосфата кофермента

2 Наши данные свидетельствуют об универсальности механизма распознавания кофермента у ФДГ, выделенных из эволюционно отдаленных источников Разработанные в нашей лаборатории подходы, которые позволили изменить коферментную специфичность ФДГ из Pseudomonas sp 101, можно использовать и для повышения сродства к NADP* растительных ФДГ

ВЫВОДЫ

1 Получены двойные и тройные мутанты ЫАОР+-зависимой формиатдегидирогеназы бактерий Pseudomonas sp 101 с расширенным pH-оптимумом связывания кофермента Введение третьей мутации позволило расширить pH-оптимум связывания кофермента до значения pH 10,0

2 Сконструированы плазмиды, позволяющие осуществлять высокоэффективную экспрессию рекомбинантных ЫАОР+-зависимых РэеФДГ в клетках Е coli Выход активного растворимого белка составил до 1 г/л среды

3 Химическая и температурная стабильность полученных МА0Р+-зависимых мутантов РвеФДГ была увеличена за счет введения мутаций, снижающих скорость химической и температурной инактивации РэеФДГ Показано, что введение таких мутаций не влияет на кинетические свойства фермента с NADP*

4 Впервые изменена коферментная специфичность ФДГ из растений A thaliana и G max С помощью всего одной мутации удалось добиться значительного роста сродства фермента к коферменту

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Serov А Е , Fedorchuk V V , Yasny I Е , Popova A S , Matorin A D , Davydova E E , Tishkov V I Structural basis of coenzyme specificity of bacterial formate dehydrogenase // Proceedings of the 1st International Congress "Biotechnology - State of the art & prospects of development" M , 2002 P 441

2 Ясный И E , Петров А С , Попова А С pH-зависимость термостабильности нативной и мутантной формиатдегидрогеназ // Тезисы 7 Путинской школы-конференции молодых ученых Пущино, 2003 С 362

3 Ясный И Е, Тишков В И Белковая инженерия коферментной специфичности и изучение механизма действия формиатдегидрогеназы методом направленного мутагенеза // Тезисы докладов конференции «И В Березин - 80 лет» M , 2003

4 Ясный И Е , Петров А С , Садыхов Э Г, Серов А Е, Тишков В И Инженерия коферментной специфичности растительных формиатдегидрогеназ // Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов-2006» M , 2006 С 64

5 Садыхов Э Г , Серов А Е , Ясный И Е , Войнова H С , Алексеева А А , Петров А С , Тишков В И NAD '"-зависимые формиатдегидрогеназы из Arabidopsis thaliana и сои экспрессия в клетках Е coli и кинетические свойства рекомбинантных ферментов // Вестник Моек ун-та Сер 2 Химия 2006 Т 47 №2 С 79-82

6 Тишков В И , Ясный И Е , Садыхов Э Г , Маторин А Д , Серов А Е Исследование термостабильности мутантных NADP+-3aBMO*Mbix формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp 101 //Докл Акад Наук 2006 Т 409 №2 С 216-218

7 Yasny I E , Serov А Е , Ouporov I V, Tishkov V I Thermal stability of NADP+-dependent mutant formate dehydrogenases // The Fourth Moscow International Congress "Biotechnology State of the art and prospects of development" M , 2007 P 450

8 Yasny 11 E, Serov A E , Voinova N S, Tishkov V I Coenzyme specificity of plant formate dehydrogenases // Conference for young scientists, PhD-students and students on molecular biology and genetic Kiev, 2007 P 153

Ф-т 60x84/8 Уч-издл 1,0 Зак №21880 Тираж 100 экз Бесплатно Отпечатано на полиграфической базе Института ядерных исследований Российской академии наук 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, 7а

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. КОФЕРМЕНТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬNAD(P)(H)-3ABHCMMbIX ФЕРМЕНТОВ.

2.1.1. Структура и роль NAD+ и NADP+.

2.1.2. Способы выражения коферментной специфичности.

2.1.3. Детерминанты коферментной специфичности.

2.1.3.1. Строение коферментсвязьшающих доменов дегидрогеназ.

2.1.3.2. Консенсусная последовательность сайта связывания кофермента.

2.1.3.3. Другие особенности связывания кофермента.

2.1.4. История изучения специфичности дегидрогеназ.

2.2. ИЗМЕНЕНИЕ КОФЕРМЕНТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ.

2.2.1. Изменение специфичности от NADP+ к NAD+.

2.2.1.1. Глутатионредуктаза.

2.2.1.2. Альдегиддегидрогеназа (АлДГ).

2.2.1.3. Алкогольдегидрогеназа из Ranaperezi.

2.2.1.4. Ксилозоредуктаза из Candida tenuis.

2.2.2. Изменение специфичности от NAD+ к NADP+.

2.2.2.1. Дигидролипоамиддегидрогеназа.

2.2.2.2. Изопропилмалатдегидрогеназа.

2.2.2.3. Фосфитдегидрогеназа из Pseudomonas stutzeri.

2.2.2.4. Ксилитолдегидрогеназа из Pichia stipitis.

2.3. КОФЕРМЕНТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.

2.3.1. Основные свойства ФДГ.

2.3.2. Сравнение ФДГ из различных источников.

2.3.3. Растительные ФДГ.

2.3.4. Изменение коферментной специфичности РзеФДГ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.2.1. Проведение реакции мутагенеза.

3.2.2. Очистка ПЦР-продуктов.

3.2.3. Рестрикция ДНК.

3.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.5. Лигирование ДНК.

3.2.6. Трансформация клеток Е. coli.

3.2.7. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.8. Препаративная наработка биомассы.

3.2.9. Выделение формиатдегидрогеназы.

3.2.10. Измерение активности нативной и мутантной ФДГ.

3.2.11. Определение констант Михаэлиса ФДГ.

3.2.12. Определение pH.

3.2.13. Изучение pH-зависимости кинетических параметров.

3.2.14. Исследование термостабилъности полученных мутантов.

3.2.15. Компьютерное моделирование.

3.2.16. Визуализация белковых структур.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ NADP+-3ABHCHMbIE ФДГ.

4.1.1. Расширение pH-оптимума активности

NADP+-зависимых РБеФДГ.

4.1.1.1. Расширение pH-оптимума активности NADP-зависимых мутантов РвеФДГ на основе мутаци М8.

4.1.1.2. Получение мутантов М9-21, М9-11, М9-12.

4.1.2. Повышение эффективности экспрессии тройных мутантов NADP+-зависимых ферментов РБеФДГ.

4.1.3. Повышение химической и температурной стабильности ЫАБР+зависимых РяеФДГ.

4.1.3.1. Объединение мутаций, расширяющих рН-оптимум, с мутациями, повышающими температурную и химическую стабильность.

4.1.2.2. Введение замены ОІиПОАвр в КАОР+-зависимый мутант РбєФДГ 8М(8)8М9-20.

4.2. ПОЛУЧЕНИЕ МАБР+-ЗАВИСИМЫХ ФОРМ РАСТИТЕЛЬНЫХ ФДГ 91 4.2.1. Изменение коферментной специфичности ФДГ из

О. тах и А. їкаїіапа.

5. ВЫВОДЫ.

NAD -зависимые формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2) - общее название для семейства ферментов, катализирующих окисление формиат-иона до углексилого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH. Ферменты этого семейства отличаются наличием или отсутствием ионов металлов, простетических групп, четырехмерной структурой. Отдельную группу составляют ФДГ, состоящие из двух субъединиц, не содержащие ионов металлов и простетических групп. Данные ферменты относятся к классу D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. Эти ФДГ были выделены из организмов большинства таксономических групп и, в силу своей относительной простоты, представляют собой удобный объект для модельных исследований в области ферментативного катализа. Механизм реакции, катализируемой ФДГ, также относительно прост, и включает только стадию гидридного переноса без кислотно-основного катализа. Среди ФДГ есть ферменты как с неупорядоченным (из бактерий), так и с упорядоченным (из дрожжей и микроскопических грибов) механизмом действия.

Наиболее изучена формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp.101 (РвеФДГ). Для ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 определены с высоким разрешением десять трехмерных структур как апо-, так и холофермента дикого типа и мутантов. В нашей лаборатории были получены штаммы-продуценты Е. coli, проведены комплексные исследования механизма действия, структуры и свойств. Методом направленного мутагенеза было получено несколько мутантных ферментов с измененной коферментной специфичностью, с повышенной химической и температурной стабильностью. Вторая по изученности ФДГ - фермент из дрожжей Candida boidinii (СЬоФДГ). Она обладает примерно такими же кинетическими свойствами, что ФДГ из Pseudomonas sp.101, но уступает ей по каталитической активности в полтора раза и по термостабильности - в 40 раз. Для нее в 2004 году была опубликована структура апо-фермента и получены мутантные формы, которые обладают активностью с NADP+, но по своим кинетическим свойствам уступают ФДГ из Pseudomonas sp. 101,

ФДГ из растений и микроскопических грибов изучены очень плохо. В нашей лаборатории в конце 2004 года впервые были получены штаммы-продуценты Е. coli для ФДГ из растений.

Все ФДГ высокоспецифичны к NAD , хотя ферменты из различных источников отличаются по коферментной специфичности. ФДГ из пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (БсеФДГ) абсолютно специфичны к NAD+, а ФДГ из бактерий могут катализировать окисление формиата в присутствии NADP+. Коферментная специфичность к NAD+ ФДГ из дрожжей Candida boidinii на два порядка выше аналогичного показателя для РвеФДГ.

Изучение механизмов связывания коферментов в активном центре ФДГ методом направленного мутагенеза является важной фундаментальной и практической задачей. В литературном обзоре приведены наиболее удачные примеры работ по изменению коферментной специфичности NAD(P)(H)-зависимых дегидрогеназ.

Целью данной работы стало дальнейшее улучшение свойств NADP+-зависимых ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 методом направленного мутагенеза и увеличение уровня их экспрессии в клетках E.coli. В связи с отсутствием в литературе данных о коферментной специфичности ФДГ из растений, нашей целью было также получение NADP -зависимых ФДГ из растений и изучение их свойств.

1. Baker,P.J., Britton,K.L., Rice,D.W., Rob,A., Stillman,T.J. Structural consequences of sequence patterns in the fingerprint region of the nucleotide binding fold. 1.plications for nucleotide specificity // J Mol Biol. 1992. Vol. 228. №2. P. 662-671.

2. Templeton,G.W.,Moorhead,G.B. A renaissance of metabolite sensing and signaling: from modular domains to riboswitches // Plant Cell. 2004. Vol. 16. №9. P. 2252-2257.

3. Kallberg,Y.,Persson,B. Prediction of coenzyme specificity in dehydrogenases/reductases. A hidden Markov model-based method and its application on complete genomes // FEBS J. 2006. Vol. 273. №6. P. 1177-1184.

4. Kutzenko,A.S., Lamzin,V.S., Popov,V.O. Conserved supersecondary structural motif in NAD-dependent dehydrogenases // FEBS Lett. 1998. Vol. 423. №1. P. 105-109.

5. Buehner,M., Ford,G.C., Moras,D., 01sen,K.W., Rossman,M.G. D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: three-dimensional structure and evolutionary significance // Proc Natl Acad Sci U S A. 1973. Vol. 70. №11. P. 3052-3054.

6. Rossmann,M.G., Moras,D., 01sen,K.W. Chemical and biological evolution ofnucleotide-binding protein//Nature. 1974. Vol. 250. №463. P. 194-199.

7. Adams,M.J., Ford,G.C., Koekoek,R., Lentz,P.J., McPherson,A., Jr., Rossmann,M.G., Smiley,I.E., Schevitz,R.W., Wonacott,A.J. Structure of lactate dehydrogenase at 2-8 A resolution//Nature. 1970. Vol. 227. №5263. P. 1098-1103.

8. Rossmann,M.G. Evolutionary and structural relationships among dehydrogenases // The Enzymes, 3rd edn. 1975. Vol. XI. P. 61-102.

9. Bashton,M.,Chothia,C. The geometry of domain combination in proteins // J Mol Biol. 2002. Vol. 315. №4. P. 927-939.

10. Schulz,G.E., Schirmer,R.H., Sachsenheimer,W., Pai,E.F. The structure of the flavoenzyme glutathione reductase //Nature. 1978. Vol. 273. №5658. P. 120-124.

11. Bellamacina,C.R. The nicotinamide dinucleotide binding motif: a comparison of nucleotide binding proteins // FASEB J. 1996. Vol. 10. №11. P. 1257-1269.

12. Duax,W.L., Pletnev,V., Addlagatta,A., Bruenn,J., Weeks,C.M. Rational proteomics I. Fingerprint identification and cofactor specificity in the short-chain oxidoreductase (SCOR) enzyme family // Proteins. 2003. Vol. 53. №4. P. 931-943.

13. Oppermann,U., Filling,C., Hult,M., Shafqat,N., Wu,X., Lindh,M., Shafqat,J., Nordling,E., Kallberg,Y., Persson,B., Jornvall,H. Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR): the 2002 update // Chem Biol Interact. 2003. Vol. 143-144. P. 247-253.

14. Harrison,D.H., Bohren,K.M., Ringe,D., Petsko,G.A., Gabbay,K.H. An anion binding site in human aldose reductase: mechanistic implications for the binding of citrate, cacodylate, and glucose 6-phosphate // Biochemistry. 1994. Vol. 33. №8. P. 2011-2020.

15. Fita,I.,Rossmann,M.G. The NADPH binding site on beef liver catalase // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. Vol. 82. №6. P. 1604-1608.

16. Hurley,J.H., Thorsness,P.E., Ramalingam,V., Helmers,N.H., Koshland,D.E., Jr., Stroud,R.M. Structure of a bacterial enzyme regulated by phosphorylation,isocitrate dehydrogenase // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. Vol. 86. №22. P. 86358639.

17. Imada,K., Sato,M., Tanaka,N., Katsube,Y., Matsuura,Y., Oshima,T. Three-dimensional structure of a highly thermostable enzyme, 3-isopropylmalate dehydrogenase of Thermus thermophilus at 2.2 A resolution // J Mol Biol. 1991. Vol. 222. №3. P. 725-738.

18. Au,S.W., Gover,S., Lam,V.M., Adams,M.J. Human glucose-6-phosphate dehydrogenase: the crystal structure reveals a structural NADP(+) molecule and provides insights into enzyme deficiency // Structure. 2000. Vol. 8. №3. P. 293-303.

19. Wierenga,R.K., Terpstra,P., Hol,W.G. Prediction of the occurrence of the ADP-binding beta alpha beta-fold in proteins, using an amino acid sequence fingerprint // J Mol Biol. 1986. Vol. 187. №1. P. 101-107.

20. Rescigno,M.,Perham,R.N. Structure of the NADPH-binding motif of glutathione reductase: efficiency determined by evolution // Biochemistry. 1994. Vol. 33. №19. P. 5721-5727.

21. Hanukoglu,I.,Gutfinger,T. cDNA sequence of adrenodoxin reductase. Identification of NADP-binding sites in oxidoreductases // Eur J Biochem. 1989. Vol. 180. №2. P. 479-484.

22. Scrutton,N.S., Berry,A., Perham,R.N. Redesign of the coenzyme specificity of a dehydrogenase by protein engineering // Nature. 1990. Vol. 343. №6253. P. 3843.

23. Hol,W.G., van Duijnen,P.T., Berendsen,H.J. The alpha-helix dipole and the properties of proteins // Nature. 1978. Vol. 273. №5662. P. 443-446.

24. Wierenga,R, De Maeyer,M., ., Hol,W.G. Interaction of Pyrophosphate Moieties with a-Helixes in Dinucleotide BindingProteins // Biochemistry. 1985. Vol. 24. №6. P. 1346-1357.

25. Brandeen,C.I. Relation between structure and function of alpha/beta-proteins //Q RevBiophys. 1980. Vol. 13. №3. P. 317-338.

26. Wierenga,R.K.,Hol,W.G. Predicted nucleotide-binding properties of p21 protein and its cancer-associated variant // Nature. 1983. Vol. 302. №5911. P. 842844.

27. Lesk,A.M. NAD-binding domains of dehydrogenases // Curr Opin Struct Biol. 1995. Vol. 5. №6. P. 775-783.

28. Brenner,S.E., Chothia,C., Hubbard,T.J., Murzin,A.G. Understanding protein structure: using scop for fold interpretation // Methods Enzymol. 1996. Vol. 266. P. 635-643.

29. LaReau,R.D., Anderson, V.E. Lactate dehydrogenase displays absolute stereospecificity in the transfer of the prochiral hydrogen of NADH // J Biol Chem. 1989. Vol. 264. №26. P. 15338-15343.

30. Weinhold,E.G., Glasfeld,A„ Ellington,A.D., Benner,S.A. Structural determinants of stereospecificity in yeast alcohol dehydrogenase // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. Vol. 88. №19. P. 8420-8424.

31. Hummel, W. Large-scale applications of NAD(P)-dependent oxidoreductases: recent developments // Trends Biotechnol. 1999. Vol. 17. №12. P. 487-492.

32. Tishkov,V.I.,Popov,V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase // Biomol Eng. 2006. Vol. 23. №2-3. P. 89-110.

33. Carugo,0.,Argos,P. NADP-dependent enzymes. II: Evolution of the mono-and dinucleotide binding domains // Proteins. 1997. Vol. 28. №1. P. 29-40.

34. Chen,R., Greer,A., Dean,A.M. A highly active decarboxylating dehydrogenase with rationally inverted coenzyme specificity // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. Vol. 92. №25. P. 11666-11670.

35. Yaoi,T., Miyazaki,K., Oshima,T. Roles of Arg231 and Tyr284 of Thermus thermophilus isocitrate dehydrogenase in the coenzyme specificity // FEBS Lett. 1994. Vol. 355. №2. P. 171-172.

36. Yaoi,T., Miyazaki,K., Oshima,T., Komukai,Y., Go,M. Conversion of the coenzyme specificity of isocitrate dehydrogenase by module replacement // J Biochem (Tokyo). 1996. Vol. 119. №5. P. 1014-1018.

37. Cui,K., Lu,A.Y., Yang,C.S. Subunit functional studies of NAD(P)H:quinone oxidoreductase with a heterodimer approach // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. Vol. 92. №4. P. 1043-1047.

38. Cui,K., Ma,Q., Lu,A.Y., Yang,C.S. Roles of histidine-194, aspartate-163, and a glycine-rich sequence of NAD(P)H:quinone oxidoreductase in the interaction with nicotinamide coenzymes // Arch Biochem Biophys. 1995. Vol. 323. №2. P. 265-273.

39. Ma,Q., Cui,K., Wang,R.W., Lu,A.Y., Yang,C.S. Site-directed mutagenesis of rat liver NAD(P)H: quinone oxidoreductase: roles of lysine 76 and cysteine 179 // Arch Biochem Biophys. 1992. Vol. 294. №2. P. 434-439.

40. Wang,H., Lei,B., Tu,S.C. Vibrio harveyi NADPH-FMN oxidoreductase arg203 as a critical residue for NADPH recognition and binding // Biochemistry. 2000. Vol. 39. №26. P. 7813-7819.

41. Zhang,L., Ahvazi,B., Szittner,R, Vrielink,A., Meighen,E. Change of nucleotide specificity and enhancement of catalytic efficiency in single point mutants of Vibrio harveyi aldehyde dehydrogenase // Biochemistry. 1999. Vol. 38. №35. P. 11440-11447.

42. Nakanishi,M., Matsuura,K., Kaibe,H., Tanaka,N., Nonaka,T., Mitsui,Y., Hara,A. Switch of coenzyme specificity of mouse lung carbonyl reductase by substitution of threonine 38 with aspartic acid // J Biol Chem. 1997. Vol. 272. №4. P. 2218-2222.

43. Eppink,M.H., Overkamp,K.M., Schreuder,H.A., van Berkel,W.J. Switch of coenzyme specificity of p-hydroxybenzoate hydroxylase // J Mol Biol. 1999. Vol. 292. №1. P. 87-96.

44. Eppink,M.H., Bunthol,C„ Schreuder,H.A., van Berkel,W.J. Phel61 and Argl66 variants of p-hydroxybenzoate hydroxylase. Implications for NADPH recognition and structural stability // FEBS Lett. 1999. Vol. 443. №3. P. 251-255.

45. Dohr,0., Paine,M. J., Friedberg,T., Roberts,G.C., Wolf,C.R. Engineering of a functional human NADH-dependent cytochrome P450 system // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. Vol. 98. №1. P. 81-86.

46. Kamerbeek,N.M., Fraaije,M.W., Janssen,D.B. Identifying determinants of NADPH specificity in Baeyer-Villiger monooxygenases // European Journal of Biochemistry. 2004. Vol. 271. №11. P. 2107-2116.

47. Petschacher,B., Leitgeb,S., Kavanagh,K.L., Wilson,D.K., Nidetzky,B. The coenzyme specificity of Candida tenuis xylose reductase (AKR2B5) explored by site-directed mutagenesis and X-ray crystallography // Biochem J. 2005. Vol. 385. №Pt 1. P. 75-83.

48. Martinez-Julvez,M., TejeroJ., Peregrina,J.R., Nogues,I., Frago,S., Gomez-Moreno,C., Medina,M. Towards a new interaction enzyme coenzyme // Biophys Chem. 2005. Vol. 115. №2-3. P. 219-224.

49. Neeli,R., Roitel,0., Scrutton,N.S., Munro,A.W. Switching pyridine nucleotide specificity in P450BM3 Mechanistic analysis of the W1046H AND W1046A enzymes // Journal of Biological Chemistry. 2005. Vol. 280. №18. P. 17634-17644.

50. Bocanegra,J.A., Scrutton,N.S., Perham,R.N. Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering // Biochemistry. 1993. Vol. 32. №11. P. 2737-2740.

51. Corbier,C., Mougin,A., Mely,Y., Adolph,H.W., Zeppezauer,M., Gerard,D., Wonacott,A., Branlant,G. The nicotinamide subsite of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase studied by site-directed mutagenesis // Biochimie. 1990. Vol. 72. №8. P. 545-554.

52. Corbier,C., Clermont,S., Billard,P., Skarzynski,T., Branlant,C., Wonacott,A., Branlant,G. Probing the coenzyme specificity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases by site-directed mutagenesis // Biochemistry. 1990. Vol. 29. №30. P. 7101-7106.

53. Nishiyama,M., Birktoft,J.J., Beppu,T. Alteration of coenzyme specificity of malate dehydrogenase from Thermus flavus by site-directed mutagenesis // J Biol Chem. 1993. Vol. 268. №7. P. 4656-4660.

54. Miyazaki,K.,Oshima,T. Co-enzyme specificity of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus HB8 // Protein Eng. 1994. Vol. 7. №3. P. 401-403.

55. Chen,R., Greer,A., Dean,A.M. Redesigning secondary structure to invert coenzyme specificity in isopropylmalate dehydrogenase // Proc Natl Acad Sci U S A. 1996. Vol. 93. №22. P. 12171-12176.

56. Galkin,A., Kulakova,L., Ohshima,T., Esaki,N., Soda,K. Construction of a new leucine dehydrogenase with preferred specificity for NADP+ by site-directed mutagenesis of the strictly NAD+-specific enzyme // Protein Eng. 1997. Vol. 10. №6. P. 687-690.

57. Fan,F., Lorenzen,J.A., Plapp,B.V. An aspartate residue in yeast alcohol dehydrogenase I determines the specificity for coenzyme // Biochemistry. 1991. Vol. 30. №26. P. 6397-6401.

58. Chen,Z., Lee,W.R., Chang,S.H. Role of aspartic acid 38 in the cofactor specificity of Drosophila alcohol dehydrogenase // Eur J Biochem. 1991. Vol. 202. №2. P. 263-267.

59. Chen,Z., Tsigelny,L, Lee,W.R., Baker,M.E., Chang,S.H. Adding a positive charge at residue 46 of Drosophila alcohol dehydrogenase increases cofactor specificity for NADP+ // FEBS Lett. 1994. Vol. 356. №1. P. 81-85.

60. Feeney,R, Clarke,A.R., Holbrook,J.J. A single amino acid substitution in lactate dehydrogenase improves the catalytic efficiency with an alternative coenzyme // Biochem Biophys Res Commun. 1990. Vol. 166. №2. P. 667-672.

61. Tishkov,V.I., Galkin,A.G., Fedorchuk,V.V., Savitsky,P.A., Rojkova,A.M., Gieren,H., Kula,M.R. Pilot scale production and isolation of recombinant NAD+-and NADP+-specific formate dehydrogenases // Biotechnol Bioeng. 1999. Vol. 64. №2. P. 187-193.

62. Metzger,M.H.,Hollenberg,C.P. Amino acid substitutions in the yeast Pichia stipitis xylitol dehydrogenase coenzyme-binding domain affect the coenzyme specificity // Eur J Biochem. 1995. Vol. 228. №1. P. 50-54.

63. Rellos,P., Ma,J., Scopes,R.K. Alteration of substrate specificity of Zymomonas mobilis alcohol dehydrogenase-2 using in vitro random mutagenesis // Protein Expr Purif. 1997. Vol. 9. №1. P. 83-90.

64. Holmberg,N., Ryde,U., Bulow,L. Redesign of the coenzyme specificity in L-lactate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus using site-directed mutagenesis and media engineering // Protein Eng. 1999. Vol. 12. №10. P. 851-856.

65. Gul-Karaguler,N., Sessions,R.B., Clarke,A.R., Holbrook,J. A single mutation in the NAD-specific formate dehydrogenase from Candida methylica allows the enzyme to use NADP // Biotechnol Lett. 2001. Vol. 23. P. 283-283.

66. Steen,H., Lien,T., Madsen,S., Birkeland,N.K. Identification of cofactor discrimination sites in NAD-isocitrate dehydrogenase from Pyrococcus furiosus // Arch Microbiol. 2002. Vol. 178. №4. P. 297-300.

67. Woodyer,R., van der Donk,W.A., Zhao,H.M. Relaxing the nicotinamide cofactor specificity of phosphite dehydrogenase by rational design // Biochemistry. 2003. Vol. 42. №40. P. 11604-11614.

68. Ashida,H., Gallon,A., Kulakova,L., Sawa,Y., Nakajima,N., Esaki,N. Conversion of cofactor specificities of alanine dehydrogenases by site-directed mutagenesis // Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic. 2004. Vol. 30. №3-4. P. 173-176.

69. Watanabe,S., Kodaki,T., Makino,K. Complete reversal of coenzyme specificity of xylitol dehydrogenase and increase of thermostability by the introduction of structural zinc // Journal of Biological Chemistry. 2005. Vol. 280. №11. P. 10340-10349.

70. Carugo,0.,Argos,P. NADP-dependent enzymes. I: Conserved stereochemistry of cofactor binding // Proteins. 1997. Vol. 28. №1. P. 10-28.

71. Serov,A.E., Popova,A.S., Fedorchuk,V.V., Tishkov,V.I. Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae // Biochem J. 2002. Vol. 367. №Pt 3. P. 841-847.

72. Popov,V.O.,Lamzin,V.S. NAD(+)-dependent formate dehydrogenase // Biochem J. 1994. Vol. 301 (Pt 3). P. 625-643.

73. Родионов,Ю.В. Метаболизм формиата у микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1981. Vol. 16. Р. 104-138.

74. Vinals,C., Depiereux,E., Feytmans,E. Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase // Biochem Biophys Res Commun. 1993. Vol. 192. №1. P. 182-188.

75. Тишков,В.И., Галкин,А.Г., Егоров,A.M. NAD-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101: клонирование, экспрессия и изучение структуры гена // Докл Акад Наук СССР. 1991. Vol. 317. Р. 345-348.

76. Labrou,N.E.,Rigden,D.J. Active-site characterization of Candida boidinii formate dehydrogenase // Biochem J. 2001. Vol. 354. №Pt 2. P. 455-463.

77. Slusarczyk,H., Felber,S., Kula,M.R, Pohl,M. Stabilization of NAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues // Eur J Biochem. 2000. Vol. 267. №5. P. 12801289.

78. Lamzin,V.S., Aleshin,A.E., Strokopytov,B.V., Yukhnevich,M.G., Popov,V.O., Harutyunyan,E.H., Wilson,K.S. Crystal structure of NAD-dependent formate dehydrogenase // Eur J Biochem. 1992. Vol. 206. №2. P. 441-452.

79. Lamzin,V.S., Dauter,Z., Popov,V.O., Harutyunyan,E.H., Wilson,K.S. High resolution structures of holo and apo formate dehydrogenase // J Mol Biol. 1994. Vol. 236. №3. P. 759-785.

80. Galkin,A.G. Moraxella sp. FDH gene // http://www ncbi nlm nih gov/entrez/viewer fcgi?db=nuccore&id=Y 13245. 2007.

81. Olson,B.J., Skavdahl,M., Ramberg,H., Osterman,J.C., Markwell,J. Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: characterization and possible targeting to the chloroplast // Plant Sci. 2000. Vol. 159. №2. P. 205-212.

82. Shiraishi,T., Fukusaki,E., Kobayashi,A. Formate dehydrogenase in rice plant: growth stimulation effect of formate in rice plant // J Biosci Bioeng. 2000. Vol. 89. №3. P. 241-246.

83. Shoemaker,R., Keim,P., Vodkin,L., et.al. Glycine max (soybean) // EMBL access code AW507616. 2000.

84. Labrou,N.E., Rigden,D.J., Clonis,Y.D. Characterization of the NAD+ binding site of Candida boidinii formate dehydrogenase by affinity labelling and site-directed mutagenesis // Eur J Biochem. 2000. Vol. 267. №22. P. 6657-6664.

85. Hollenberg,C.P.,Janowicz,Z. DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses // Patent number EP0299108. 1989.

86. Keon,J.P.R., Bailey,A.M., Hargreaves,J.A. NAD-dependent formate dehydrogenase from Mycosphaerella graminicola // EMBL access code Q9Y790. 1999.

87. Chow,C.M.,RajBhandary,U.L. Developmental regulation of the gene for formate dehydrogenase in Neurospora crassa // J Bacteriol. 1993. Vol. 175. №12. P. 3703-3709.

88. Saleeba,J.A., Cobbett,C.S., Hynes,M.J. Characterization of the amdA-regulated aciA gene of Aspergillus nidulans // Mol Gen Genet. 1992. Vol. 235. №23. P. 349-358.

89. DAVISON,D.C. Studies on plant formic dehydrogenase // Biochem J. 1951. Vol. 49. №4. P. 520-526.

90. Hourton-Cabassa,C., mbard-Bretteville,F., Moreau,F., Davy,d., V, Remy,R., Francs-Small,C.C. Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. №2. P. 627-635.

91. Suzuki,K., Itai,R., Suzuki,K., Nakanishi,H., Nishizawa,N.K., Yoshimura,E., Mori,S. Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. №2. P. 725-732.

92. Thompson,P., Bowsher,C.G., Tobin,A.K. Heterogeneity of mitochondrial protein biogenesis during primary leaf development in barley // Plant Physiol. 1998. Vol. 118. №3. P. 1089-1099.

93. Baack,R.D., Markwell,J., Herman,P.L., OstermanJ.C. Kinetic behavior of the Arabidopsis thaliana leaf formate dehydrogenase is thermally sensitive // J Plant Physiol. 2003. Vol. 160. №5. P. 445-450.

94. Li,R., Bonham-Smith,P.C., King, J. Molecular characterization and regulation of formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana // Can J Bot. 2001. Vol. 79. P. 796-804.

95. Patricia L.Herman, Ha°kon Ramberg, Renee D.Baack, John Markwell, John C.Osterman. Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: overexpression and subcellular localization in leaves // Plant Science. 2002. Vol. 163. P. 1137-1145.

96. Садыхов,Э.Г. Получение, термостабильность и структурные исследования формиатдегидрогеназ из различных источников // дис . канд хим наук. 2007.

97. Тишков В.И. Структура, механизм действия и белковая инженерия NAD -зависимой формиатдегидрогеназы // дис . докт хим наук. 1993.

98. Ho,S.N., Hunt,H.D., Horton,R.M., Pullen,J.K., Pease,L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene. 1989. Vol. 77. №1. P. 51-59.

99. Manniatis Т., Fritch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual //NY: Cold Spring Harbor. 1982.

100. Тишков В.И., Березин И.В., Егоров A.M., Вайткявичус P.K., Кадушвичус В., Глемжа А.А., Галкин А.Г., Петкявичене Р.И. Выделение NAD+-3aBHCHMoft формиатдегидрогеназы // Академия наук СССР. 1988.

101. Mesentsev,A.V., Lamzin,V.S., Tishkov,V.I., Ustinnikova,T.B., Popov,Y.O. Effect of pH on kinetic parameters of NAD+-dependent formate dehydrogenase // Biochem J. 1997. Vol. 321 ( Pt 2). P. 475-480.

102. Маторин,А.Д. Механизм субстратной и коферментативной специфичности бактериальной формиатдегидрогеназы // дис . канд хим наук. 2000.

103. Федорчук,В.В. Повьппение термостабильности бактериальной формиатдегидрогеназы методом направленного мутагенеза // дис . канд хим наук. 2000.

104. Mitsunaga,T., Tanaka,Y., Yoshida,T., Watanabe,K. New Hyphomicrobium sp. formate dehydrogenase gene for producing formate dehydrogenase of high specific activity, high temperature stability and high pH stability // Patent of Japan JP245471A2. 2000.

105. Korban,S., Vodkin,L., Liu,L., et.al. Malus x domestica formate dehydrogenase // EMBL access code CV629055. 2004.

106. Goldberg,S.L., Cino,P.M., Patel,R.N., Nanduri,V.B., Johnston,R.M. Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor // United States Patent 7087418. 2002.

107. Nierman,W.C. NAD-dependent formate dehydrogenase AciA/Fdh from Neosartorya fischeri // EMBL access code A1DLY1. 2006.

108. Hwang,L., Hocking-Murray,D., Bahrami,A.K., Andersson,M., Rine,J., Sil,A. Identifying phase-specific genes in the fungal pathogen Histoplasma capsulatum using a genomic shotgun microarray // Mol Biol Cell. 2003. Vol. 14. №6. P. 23142326.

109. Серов A.E. Взаимосвязь структуры и свойств рекомбинантных формиатдегидрогеиаз из пекарских дрожжей и метилотрофных бактерий // дис . канд хим наук. 2002.119

110. Rozzell,J.D., Hua,L., Mayhew,M., Novick,S. Mutants of enzymes and methods for their use I I US Patent Application Publication US2004/0115691,17 06 2004. 2004.

111. Sanger,F., Nicklen,S. and Coulson,A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1977. Vol. 74. №12. P. 54635467.

112. Ganzhorn,A. J., Green,D. W., Hershey,A. D., Gould,R. M. and Plapp,B. V. Kinetic characterization of yeast alcohol dehydrogenases. Amino acid residue 294 and substrate specificity // J.Biol.Chem. 1987. Vol. 262. №8. P. 3754-3761.

113. Dym,0 and Eisenberg,D. Sequence-structure analysis of FAD-containing proteins //Protein Sci. 2001. Vol. 10. №9. P. 1712-1728.