Механизм субстратной и коферментативной специфичности бактериальной формиатдегидрогеназы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

£

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

МАТОРИН Андрей Дмитриевич

Механизм субстратной и коферментативной специфичности бактериальной формиатдегидрогеназы.

02.00.15 - ХИМИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА И КАТАЛИЗ.

/Г/

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2000

»

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультет; Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОдаТЕЛЬ:

профессор, доктор химических наук

Тишков В.И.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

профессор, доктор биологических наук Наградова Н.К.

профессор, доктор химических наук Габибов А.Г.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт Биохимии им. Баха А.Н. РАН

Защита диссертации состоится 6 июня 2000 г. в 16 часов на заседали] Диссертационного совета Д 053.05.76 по химическим наукам пр] Химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москве Воробьевы Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзим олопп аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МП им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан

»1

II

мая 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И.Ь

+ 401 о

Общая характеристика работы:

Актуальность проблемы: Бурное развитие методов генетической инженерии в последнее время позволило клонировать большое количество генов различных белков из самых разных источников - от бактерий до человека. Это дало возможность исследовать эти белки на новом уровне, который был ранее недоступен. Стало возможным изучать взаимосвязь структуры и функции ферментов, выявлять роль отдельных аминокислот в катализе, получать с помощью направленного мутагенеза новые белки с измененными, заданными свойствами. Данные рентгеноструктурного анализа (РСА) о четвертичной структуре свободного фермента и комплекса с различными лигандами позволяют выявить существенные для протекания ферментативной реакции аминокислотные остатки, а, в совокупности с результатами кинетических исследований, предложить модель механизма действия фермента. Однако, для определения точной роли выявленных аминокислотных остатков в катализе й связывании субстратов необходима дополнительная информация, которая может быть получена с помощью метода направленного мутагенеза.

КАП+-зависимые формиатдегидрогеназы (К.Ф. 1.2.1.2., ФДГ) относятся к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. На основании сравнения аминокислотных последовательностей ферментов этого суперсемейства было показано наличие ряда высококонсервативных остатков, которые согласно рентгеноструктурным данным, расположены в активных центрах и. могут быть важными для катализа или существенными для связывания субстратов. Ранее на основании данных РСА для апо-формы ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 и его тройного комплекса (ФДГ-МАО^-азид) (Popov V.O. et al., 1994) была предложена модель механизма действия формиатдегидрогеназы. Однако, в настоящее время нет точных и однозначных данных о роли вышеупомянутых остатков в механизме действия ФДГ. В связи с этим одной из задач представленной работы было изучить методом направленного мутагенеза роль ряда аминокислотных остатков активного центра ФДГ из Pseudomonas sp. 101 в механизме действия этого фермента.

Не менее интересной задачей является изучение механизма коферментативной специфичности ФДГ. NAD+-3aBHCHMbie бактериальные формиатдегидрогеназы проявляют слабую каталитическую активность при использовании NADP+ в качестве кофермента, в то время как аналогичные ферменты из других источников: дрожжи, низшие грибы, высшие растения - являются абсолютно специфичными к NAD . При анализе аминокислотной последовательности бактериальных формиатдегидрогеназ в области кофермент-связывающего домена можно найти мотивы, характерные для NADP+ связывающих доменов. Ранее, в нашей лаборатории с помощью точечной замены была получена мутантная форма ФДГ, обладавшая более высокой специфичностью к NADP+, чем к NAD+ (Тишков В.И., 1993), однако, детальные исследования механизма коферментативной специфичности формиатдегидрогеназы

проведены не были. Поэтому второй задачей данного исследования было продолжение изучения механизма коферментативной специфичности, а также изучение роли нехарактерного остатка Ala в первом положении консервативного для адениндинуклеотидсвязьшающих доменов мотива дегидрогеназ G(A)XGXXG(+17/18)D на коферментативную и субстратную специфичность ФДГ Pseudomonas sp.lOl. Научная ■ новизна. На основании ранее проведенного сравнительного анализа структуры и аминокислотной последовательности ФДГ Pseudomonas sp.101 с рядом D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот был определен ряд аминокислотных остатков активного центра ФДГ, которые могут являться каталитически важными или участвовать в сорбции формиата в активном центре. Такими остатками, в частности, являются-остатки Ilel22, Asnl46, Gln313 и His332. Методом направленного мутагенеза показано,-что, в отличие от ранее предложенной модели, остаток His332 является ключевым для сорбции формиата в активном центре. Показано, что остаток в 313 положении определяет эффективность сорбции формиата в активном центре бактериальных формиатдегвдрогеназ при различных pH. На основании полученных данных предложена исправленная модель связывания формиата в активном центре ФДГ.

Показано, что сродство формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.lOl kNAD+ или NADP+ определяется типом аминокислотного остатка в 221 положении. Увеличение сродства фермента к NADP* достигается в случае замены 221 остатка аспарагиновой кислоты на незаряженный остаток с небольшим боковым радикалом. Показано, что замена остатка Ala на остаток Gly в канонической для коферментсвязывающих доменов дегидрогеназ последовательности AxGxxG приводит к увеличению сродства к NADP+ в 2 раза для всех полученных NADP+-специфичных мутантных форм ФДГ. При этом также существенно возрастает термостабильность этих ферментов, но сродство к формнату ухудшается в 10 раз. Высказана гипотеза об эволюционном развитии формиатдещдрогеназ. Практическая значимость работы. Формиатдегидрогеназа широко используется в ферментативных системах синтеза оптически активных соединений с участием NAD(P)+-3aBHCHMbix дегидрогеназ, поскольку этот фермент является наилучшим ферментом для создания систем регенерации кофакторов. Полученные в данной работе мутантные формы ФДГ с измененной коферментативной специфичностью и рН-профилем связывания формиата позволяют значительно расширить возможный набор мультиферментных систем для синтеза различных органических и биологически активных'соединений.

Апробация работы: Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и отечественных конференциях: "Biocatalysis-95" (Суздаль, Россия, 1995), "Biocatalysis-98. Fundamentals and Applications" (Пущино-на-Оке, Россия, 1998), "Enzyme Engineering XIII" (San Diego,

USA, 1995), на 8-м Международном симпозиуме "Microbial Growth on Cl Compounds" (San Diego, USA, 1995), на 2-м Международном симпозиуме "Perspectives on Protein Engineering 2" (Nottingham, UK, 1997), на Втором съезде Российского Биохимического общества (Москва, Россия, 1997).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем работы: Диссертация построена по традиционной схеме и состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы^срдержащего M ссылок. Работа изложена на страницах, содержит -Х^рисунков и

таблиц.

Результаты и их обсуждение Исследование роли GIn313 в механизме действия бактериальной ФЛГ: Основной характерной особенностью ферментов суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот является наличие цепи переноса протона из активного центра, которая образована остатком гистидина и расположенной рядом с ним карбоксильной группы остатка глутаминовой кислоты. В случае ' L-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот вместо остатка Glu используется остаток Asp. Существенным отличием механизма действия ФДГ является отсутствие стадии переноса протона в ходе реакции, и вместо остатка глутаминовой кислоты в этом месте расположен остаток глутамина. Причина замены консервативного Glu на остаток Gin в активном центре ФДГ не ясна. В связи с этим, было решено изменить остаток Gln313 в ФДГ из Pseudomonas sp. 101 на остаток глутаминовой кислоты. Такой мутант был получен с помощью направленного мутагенеза и были изучены его кинетические свойства. Оказалось, что удельная активность двух полученных препаратов мутанта Q313E была равна удельной активности нативного фермента. Измерение кинетических параметров мутанта при pH 7.0 показало, что константа Михаэлиса по NAD+ уменьшилась по сравнению с нативной примерно в 1,5 раза, а константа Михаэлиса по формиату при данном pH улучшилась примерно в 2 раза. (Таблица 1.)

Таблица 1.

Кинетические характеристики нативной ФДГ и мутанта Gln313Glu при pH 7.0.

Препарат Km по NAD+, Km ПО Кхазид, Koat с

mkM формиату, тМ *10"7М ■

Нативная ФДГ 110±5 7,5+0,2 1,1+0.1 10

Gln313Glu 70±2 3,8±0,3 0.8±0.2 10

Поскольку, внесение карбоксильной группы в непосредственной близости от активного центра могло вызвать изменение рКа ионогенных групп, участвующих в связывании кофермента или субстрата, была изучена зависимость кинетических параметров мутеина ФДГ С?313Е от рН среды. Зависимости максимальной скорости

реакции и К„ по NAD+ не отличались от аналогичных зависимостей для нативного фермента во всем исследовавшемся диапазоне рН (6,0-11,0). Однако, рН среды очень сильно влияла на Км мутанта по формиату (рис 1).

350 т

н я

| 150 Си

J. "Ю

Е

« 50

Рисунок 1. Зависимость Кт по формиату для фермента дикого типа (•) и мутанта вЬЗ 13С1и (О) от рН.

Для нативного фермента Км по формиату практически не изменялась в диапазоне рН 6.0 - 9.0 и возрастала в области более щелочных рН. Для мутанта С>313Е Км по формиату при переходе от 7.0 к 9.7 увеличивалась в 45 раз. Методом нелинейной регрессии была определена величина рКа ионогенной группы, которая контролирует связывание формиата в активном центре. Она оказалась равной 7.6±0.2, в то время как для нативного фермента рКа ионогенной группы составляет 9.8+0.2. Таким образом, замена остатка 01п313 на остаток глутаминовой кислоты приводит к смещению рКа ионогенной группы примерно на 2 единицы в более кислую область. Полученные данные не позволяют точно судить о природе этой ионогенной группы, однако, по всей видимости, это консервативный остаток Шз332. Для эффективного связывания формиата в активном центре, имидазольное кольцо гистидина должно иметь частичный положительный заряд. На следующем рисунке представлены возможные состояния гистидина в различных условиях, (рис. 2).

Как видно из рис. 2, в случае замены остатка глутамина на остаток глутаминовой кислоты, в области нейтральных рН (6.0 - 7.5) имидазольное кольцо находиться в протонированной форме и имеет больший положительный заряд, чем в случае нативного фермента. Как следствие, связывание формиата в этой области оказывается более выгодным, что и объясняет некоторое снижение Кт по формиату для мутанта (}313Е в нейтральной области рН. При увеличении рН, происходит депротонирование имвдазольного кольца и уменьшение его эффективного положительного заряда, причем в случае карбоксиамидной группы (нативный фермент), это начинает происходить в более щелочной области, чем в случае

карбоксильной (замена Q313E). Этим объясняется резкое возрастание Кт по формиату мутаптнсй формы в щелочной области.

binding form non-binding form

c+f 0

NO N- H » HN . N HN .N V

N - ■•

\

N ""-.-У' -|C-

V- /

-jl pK <5.5 »!

pK 6.7-7.2 н'л рК7.6

binding fonm

HN + NH "N +. Mh Hrt' + ... „

/

Рисунок 2. Возможные состояния имидазольного кольца His в различных условиях. . После связывания формиата в активном центре, состояние имидазольного кольца не влияет собственно на лимитирующую стадию - перенос гидрид иона - что и объясняет постоянство максимальной скорости реакции как для мутанта Q313E, так и для нативного фермента во всем изучавшемся диапазоне pH. Таким образом, согласно полученным нами данным, замена в молекуле ФДГ консервативного для суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ остатка Glu па остаток Gin, обеспечивает более широкий pH-оптимум действия формиатдегидрогеназ, нежели других ферментов этого суперсемейства.

Роль остатка His332: Остаток His332 по нумерации ФДГ Pseudomonas sp.lOl является строго консервативным для всего суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. Этот остаток вместе с расположенным рядом остатком Glu образует цепь передачи протона из активного центра и обеспечивает реализацию общего кислотно-основного механизма катализа. Подробно роль этого остатка His была изучена на примере D-лактатдегадрогеназы и ряда других ферментов. Поскольку в случае формиатдегидрогеназной реакции нет необходимости в удалении (введении) протона из активного центра, то роль этого остатка в механизме действия фермента не ясна. Для выяснения роли остатка His332 в механизме действия ФДГ был проведен направленный мутагенез этого остатка. В качестве одной из замен был выбран остаток фенилаланина, который является наиболее близким структурным аналогом гистидина, но при этом имеет нейтральный боковой радикал. Кроме того, остаток His332 был заменен на остаток Ala. Эта замена полностью удаляла боковую группу аминокислоты в 332-м положении и гарантировала минимальное искажение структуры фермента в этой области. Оказалось, что замена остатка His332 как на остаток Phe, так и на остаток Ala приводит к полной потере фермептативной активности. Подобный результат мог быть обусловлен или серьезными изменениями конформации белковой глобулы, или отсутствием связывания одного из субстратов. Для выяснения причин отсутствия у

н '

мутанта H332F ферментативной активности нами с помощью спектрофлуориметрических методов было изучено связывание этим мутантом коферментов NAD+ и NADH и наиболее сильного, конкурентного по формиату ингибитора - азида Одинаковый квантовый выход флуоресценции, а также идентичньгс спектры возбуждения и эмиссии у нативной и мутантной форм ФДГ свидетельствуют, что подобная замена не приводит к серьезным конформационнъгм изменениям фермента. Нативная формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.IOI обладает максимумом собственной триптофановой флуоресценции на 340 нм. Ранее было показано, что при связывании в активном центре ФДГ NAD+ или NADH наблюдается тушение собственной флуоресценции белка за счет конформационных изменений белковой глобулы при образовании двойного комплекса (ФДГ-кофермент). Зависимость интенсивности собственной остаточной флуоресценции фермента от концентрации добавленного кофермента описывается следующей формулой (1).

F = \+[QVK

Fo ~ \ + f *\Q\!К (1)

Где Fo -т интенсивность собственной флуоресценции свободного фермента, / -отношение квантовых выходов флуоресценции связанного в комплекс с лигандом и свободного фермента, К - константа диссоциации двойного комплекса ФДГ-лиганд, [Q] - концентрация лиганда.

Это выражение может быть линеаризовано в соответствии с уравнением (2):

Fo-F~i-f*[Q] + l-f (2)

На рисунке 3 представлены кривые интенсивности собственной флуоресценции нативной и мутантной форм ФДГ (H332F) от концентрации добавленного кофермента (NAD+). Как следует из рис. 3, оба фермента, как дикого типа, так и мутеин H332F, способны связывать NAD+, однако в последнем случае эффективность связывания ниже. Обсчет кривых, представленных на рис. ЗА с помощью нелинейной регрессии показал, что у мутантного фермента константа диссоциации (1.0 тМ ) возросла по сравнению с нативным в 3 раза (3.1 гаМ). Как следует из рис. ЗВ, линеаризованные зависимости интенсивности флуоресценции мутанта и нативного фермента от обратной концентрации NAD+ пересекаются в одной точке. Это означает, что величины/- изменение квантового при переходе от свободного фермента к двойному комплексу с NAD+ (см. уравнение 2) одинаковы для нативного и мутантного ферментов.

ч u

1 0.6 1° J

u § 0.5

2 э

1 s 04

Я о

а е. о.з

3 с

о

и Я 5

0Л 0.2 0.4 0.6 0.S 1.0 1.2 1.4 [NAD+], гаМ

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45

1/[NAD+], шМ'

А

в

исунок 3. А). Зависимость собственной триптофановой флуоресценции нативной ФДГ (Ж) и утанта His332Phe (Т) от концентрации добавленного NAD*. 0.1 М КФБ буфер, рН=7.1. В), [инеаризация зависимостей, представленных на рисунке А в соответствии с уравнением (2).

Эти данные являются дополнительным подтверждением об отсутствии ¡информационных изменений в районе активного центра в результате замены

Азид-ион является наиболее сильным конкурентным по формиату ингибитором ФДГ (К,= 1*10'7М). При ненасыщающих концентрациях NAD* фермент в растворе присутствует в виде свободного и комплекса с коферментом. Если к подобной смеси добавлять азид, то за счет очень низкой константы ингибирования часть двойного комплекса и часть свободного фермента перейдут в стабильный комплекс ФДГ-NAD*-азид. При этом будет наблюдаться дальнейшее тушение собственной флуоресценции ФДГ. Таким образом, по изменению собственной флуоресценции фермента при титровании азидом можно судить о связывании последнего в активном центре. На рисунке 4 представлены зависимости интенсивности собственной флуоресценции нативной и мутантной форм ФДГ, частично связанной (примерно на 60-65%) в двойной комплекс с NAD+ от концентрации добавленного азида.

Как видно из этого рисунка, в случае фермента дикого типа наблюдается дальнейшее падение интенсивности собственной флуоресценции белка за счет образования тройного комплекса. В случае мутанта H332F снижения интенсивности не наблюдается, что свидетельствует о том, что азид не связывается в активном центре.

В общем случае, нельзя было исключить возможности, что интенсивность собственной флуоресценции мутантной формы ФДГ в тройном комплексе ФДГ-NAD*-азид будет выше, чем интенсивность флуоресценции комплекса фермент-NAD . В таком случае при определенных соотношениях квантовых выходов для свободного фермента, двойного комплекса с коферментом и тройного комплекса OflT-NAD+-a3aa, возможна ситуация, при которой дополнительного падения интенсивности флуоресценции наблюдаться не будет. В связи с этим, нами были проведены

His332Phe.

дополнительные эксперименты, в которых измерялись интенсивности собственной флуоресценции свободного КАОН и в двойном комплексе с ФДГ.

Е

& -

£ 3

а. я» S

я s

« 4

>>u

* Si й

е I

Я О

2 «

Я ю

I s

I &

1.0

0.9 Н 0.8 0.70.60.5 0.4 0.3 Н 0.2 0.1

0.0

2.0x10 4.0x10 6.0x10

[азид], М

Рисунок 4. Зависимость интенсивности собственной флуоресценции нативной ФДГ (■) и мутанта His332Phe (Ш)от концентрации добавленного азида. 0,1М КФБ буфер, рН=7.0. Титрование азидом проводилось после 60-65 % насыщения фермента NAD+.

NADH имеет максимумы возбуждения и эмиссии на длинах волн 340 и 450 нм,

соответственно. В двойном комплексе с ферментом наблюдается увеличение

квантового выхода собственной флуоресценции NADH за счет связывания кофермента

в активном центре в открытой конформации. При добавлении NAD+ к раствору,

содержащему комплекс ФДГ-NADH, часть ранее связанного NADH будет вытесняться

в раствор. При этом будет наблюдаться уменьшение интенсивности собственной

флуоресценции NADH. При дальнейшем добавлении в раствор азида установившееся

после добавления NAD+ равновесие будет смещаться в сторону образования тройного

комплекса (ФДГ-ЫАО+-азид), и при высоких концентрациях ингибитора весь ранее

связанный NADH будет полностью вытеснен из комплекса с ферментом. При этом

будет происходить дополнительное уменьшение интенсивности собственной

флуоресценции NADH, что позволяет судить о связывании азида в активном центре

ФДГ.

На рисунке 5 приведены зависимости интенсивности собственной флуоресценции NADH в присутствии ФДГ и NAD+ от концентрации азида. Перед добавлением азида нативный или мутантный фермент были насыщены до 80% восстановленной формой кофермента. Затем в раствор был добавлен NAD+ в количестве, обеспечивающем примерно 50% уменьшение интенсивности флуоресценции NADH, после чего проводили титрование азидом. Как видно из рисунка 5, для нативного фермента наблюдалось значительное падение интенсивности собственной флуоресценции NADH при добавлении азида, в то время как для мутанта

она оставалась постоянном. Таким образом, полученные экспериментальные данные являются дополнительным доказательством того, что замена остатка His332 на Phe приводит к тому, что фермент теряет способность связывать азид, но способен связывать кофермент. Это подтверждает предположение, что остаток His является чрезвычайно важным для сорбции не только ингибитора, но и субстрата в активном центре.

s я

3 я

и

Щ

а о >.

4

л . ¡4

и о я м

5 у

3 н

я

Я

я

4 щ

о 3

3

5 a со я о а к

8.0x10

т---1-■-г

2.0x10"6 4.0x10"6 6.0x106

[азид], М

Рисунок 5. Зависимость интенсивности собственной флуоресценции NADH от концентрации азида для нативной ФДГ (И) и мутанта His332Phe (в). 0.1М КФБ буфер, рН=7.9. Более подробно об условиях эксперимента см. в тексте. Роль остатка Asnl46. Согласно данным ретгеноструктурного анализа (Lamzin et al., J994) в тройном комплексе ФДГ-КАБ+-азид, который может рассматриваться в качестве модели переходного состояния реакции, азид ориентирован между остатками Asnl46 и Arg284. Поскольку было показано, что остаток His332 является критичным для сорбции формиата в активном центре ФДГ, было также решено исследовать и роль остатка Asnl46. Этот остаток не является высоко консервативным для суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот, но соответствующие ему остатки участвуют в связывании субстратов для ферментов этого суперсемейства. В случае D-лактатдегидрогеназ остатку Asnl46 соответствует остаток серина. Были сделаны замены остатка Asnl46 на остатки Ser, Ala и Cys. Для всех полученных мутантных форм были изучены кинетические характеристики (Таблица 2).

Как видно из таблицы 2, менее всего на кинетические параметры влияет замена остатка Asn на остаток Ser (аналогично D-лактатдегидрогеназам). В этом случае остается 'возможным эффективное взаимодействие бокового радикала остатка с карбоксиамидной частью кофермента, но связывание субстрата становится несколько менее выгодным. Некоторое уменьшение Кга по NAD+ мутантного фермента может быть объяснено снятием части стерических затруднений, так как Ser имеет менее

объемный боковой радикал, при сохранении возможности взаимодействия с карбоксиамидной частью.

Таблица 2.

Кинетические параметры мутантных по Asnl46 форм ФДГ Pseudomonas sp. 101

Препарат Km по NAD\ цМ Km ПО формиату, mM К| по азиду, М К,« mutant kc« FDH, %

Нативная ФДГ 110±5 7.5±0.3 1,1*10"7 100

Asnl46Ala 640+10 940±20 2*10'5 52

Asnl46Ser 86+3 86+3 1.4*10"6 56

Asnl46Cys 240±10 890±20 1.5*10"5 60

В случае замены на остаток А1а, когда исчезают все возможные взаимодействия этого остатка как с коферментом так и с субстратом, происходит самое большое ухудшение кинетических характеристик фермента. Замена на остаток Cys приводит к незначительным изменениям сродства фермента к коферменту (возможно взаимодействие с карбоксиамидной группой), но сильно ухудшается сродство к субстрату, поскольку обладающий высокоподвижной и объемной электронной оболочкой атом серы бокового радикала остатка Cys оказывается ориентирован в направлении кислорода формиат иона. Все замены приводят к уменьшению каталитической константы примерно в 2 раза. Это свидетельствует о том, что ни одна замена не приводит к серьезным изменениям конформащш активного центра и остаток Asnl46 не влияет собственно на лимитирующую стадию, но является важным для обеспечения продуктивной ориентации субстрата в активном центре. Важным является тот факт, -что изменение Кга по формиату и К, по азиду для всех замен происходят синхронно, что позволяет сделать предположение о том, что остаток Asnl46 одинаково взаимодействует с формиатом и азидом в активном центре ФДГ Pseudomonas ¿р. 101. Роль остатка 11е122. Согласно данным рентгеноструктурного анализа в положительно заряженный кластер активного центра ФДГ Pseudomonas sp. 101 помимо вышеописанных остатков His332, Asnl46 и Arg284 входит остаток Ие122, который как предполагается, также участвует в связывании субстрата. Остаток 11е122 не является абсолютно консервативным для формиатдегидрогеназ. В ФДГ из пекарских дрожжей S.cerevisiae и метилотрофных дрожжей C.methylica и H.polymorpha в этом положении находится остаток Val. Для выяснения роли остатка 11е122 нами были проведены две замены этого остатка - на остаток Val, достаточно близкого структурного аналога Не, и на остаток Gly. Замена остатка 11е122 на остаток Val не привела к существенному изменению кинетических характеристик мутанта. Замена остатка Не 122 на остаток Gly привела к полной потере ферментативной активности. Результаты исследования кинетических свойств полученных мутантов представлены в Таблице 3.

Таблица 3

Кинетические характеристики мутанта I!el22Val и Ilel22Gly.

Препарат Кга по NAD+, цМ Кга по формиату, шМ Kj азид, *10"7 М ксиМут/кде нат, %

Нативная ФДГ 110±5 7.5±0.3 1,1+0.1 100

Ilel22Val 180± 18±3 4,3±0,3 79

Ilel22Gly Фермент неактивен

Данные, приведенные в табл. 3, свидетельствуют, что присутствие имеенно остатка Не в ¡22 положении не является строго необходимым. Этот остаток может быть заменен на остаток Val без существенных изменений кинетических свойств, что и наблюдается для ФДГ из дрожжей. Также отметим, что в активных центрах большинства ферментов суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот в этом положении находится именно остаток Val, а остаток Не встречается намного реже. Критичным для остатка в этом положении, по-видимому, является наличие достаточно объемной боковой гидрофобной группы, которая необходима для поддержания продуктивной конформации активного центра. Удаление такой группы приводит к получению неактивного фермента. Для выяснения причин отсутствия ферментативной активности у мутанта ФДГ Ilel22Gly были выполнены спектрофлуориметрические исследования, аналогичные тем, что проводились для мутанта ФДГ H332F. Результаты исследования собственной триптофановой флуоресценции ФДГ при связывании NAD+ показали, что мутант Ilel22Gly связывал NAD+ в 15 раз хуже, чем фермент дикого типа (константы диссоциации из двойного комплекса с NADT 0.31 и 2,6 тМ для нативной и мутантпой ФДГ, соответственно), а также был абсолютно не способен связывать азид. Резкое ухудшение связывания кофермента свидетельствует, что замена остатка Не 122 па Gly приводит к сильным информационным изменениям активного центра, в результате чего становится невозможным взаимодействие кислородного атома основной цепи и центрального атома азида. Можно предположить, что по этой же причине становиться невозможным аналогичное взаимодействие и с атомом кислорода формиата. Исследования собственной флуоресценции NADI1 также показали, что фермент не способен связывать азид, но связывает кофермент. Полученные данные свидетельствуют, что остаток Не 122 является важным для продуктивного связывания формиата в активном центре ФДГ и участвует в связывании за счет карбонильного кислорода основной цепи.

Двойная замена Asnl36Ser/Gln313Glu. В случае D-лактатдегидрогеназ остатку Asnl46 ФДГ из Pseudomonas sp. 101 соответствует консервативный остаток Ser. В

случае замены Gln313 на остаток Glu, как было показано нами, вполне возможным становится функционирование цепи передачи протона, характерной для суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. В связи с этим, было интересно' получить двойной мутант и изучить его субстратную специфичность. Кинетические свойства мутанта N146S/Q313E при рН 7.0 представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Кинетические характеристики мутанта Asnl46Ser/Gln313Glu при рН 7.0

Препарат Кт по NAD+, mkM Кш по формиату, шМ К, азид, *10'7М l'est mutant/^, FDH %

ФДГ дикого типа 110±5 7.5+0.3 1.1+0.1 100

N146S/Q313E 96±6 76±8 12+1 52

Видно, что в области нейтральных рН кинетические характеристики определяются заменой АзпНбБег. Так как ранее было показано, что введение карбоксильной группы в активный центр приводит к существенному изменению рКа ионогенной группы, ответственной за связывание субстрата, было решено изучить рН-зависимость кинетических параметров, которая представлена на следующем рисунке 6. Видно, что рН-зависимость Кт по формиату мутанта N1468/(2313Е аналогична такой же зависимости для мутанта (2313Е (вставка), и наблюдается полная аддитивность

900

еоо

"с 700 , 600 f«

Я 500

S 400 Со 300

■в" 200 В

О 100

двойного мутанта.

350 -

300 -

S Е h а 250 -200 -

150 ■

о ■е- 100 -

Е Ж 50 ■

5 6 7 8 9

рН

А

Рисунок 6. Зависимость Кт

10

рН

в

мутанта

Asnl46S

то формиату дл и двойного мутанта А5п1465егА31п31301и (Д) (А) и аналогичная зависимость нативной ФДГ (•) и мутанта С1п313С1и (о) (В).

Рассчитанная из полученных результатов рКа ионогенной группы двойного мутанта (рКа = 7.8+0,3) практически совпала с рКа мутанта 0313Е (7,6±0,2). Это может служить подтверждением того факта, что ионогенной группой, ответственной за связывание формиата в активном центре ФДГ может являться остаток Ш$332. Во-вторых, подобная аддитивность влияния одинарных замен может служить

подтверждением, что ни одна из них не приводит к существенным изменениям структуры активного центра. Двойной мутант был не способен использовать в качестве субстрата ни лактат, ни пируват.

На основании совокупности всех полученных результатов можно существенно модифицировать ранее предложенную модель связывания формиата в активном центре (Popov et. al, 1994). Согласно ранее предложенной модели осповной вклад в сорбцию формиата в активном центре ФДГ вносят остатки Arg284 и Asnl46 (Рисунок 7А).

Рисунок 7. Ранее предложенная (Popov et al., Biochem.J. 1994) (А) и модифицированная на основании наших экспериментов (В) модели связывания формиата в активном центре бактериальной ФДГ. Толщина связей отражает величину их вклада в связывание субстрата

Атомы кислорода формиата ориентированы за счет водородных связей с этими остатками. Уходящий водородный атом формиата оказывается в непосредственной близости от С4 атома никопшамидного кольца кофермента и расположен под углом, близким 90°. Частичный положительный заряд углеродного атома стабилизируется за счет взаимодействия с атомом кислорода основной цепи остатка 11е122. Ориентация остатка His332 позволяет предположить, что он также может участвовать в ориентации формиата, но поскольку имидазольное кольцо находится в депротонированном состоянии (за счет водородной связи с остатком Gln313), подобное взаимодействие считается менее выгодным.

А

В

Согласно полученным нами данными основной вклад в сорбцию формиата в активном центре ФДГ вносят водородные взаимодействия атомов кислорода формиата с азотами боковых радикалов остатков Iïis332 и Asnl46 (Рисунок 7В). Об этом свидетельствует полная потеря ферментативной активности при замене His332 на остаток Phe или Ala. Остаток Arg284, по-видимому, также принимает участие в связывании формиата. но это взаимодействие очень слабое. На это указывают следующие факторы. При замене остатка Arg284 на остаток Gin наблюдается сильное ухудшение всех кинетических параметров (Типпсов, 1993): скорость реакции падает в 70 раз, a Km по NAD* и формиату увеличиваются в 30 и 40 раз соответственно. Сильное взаимодействие кислорода формиата с положительным зарядом на гуанидиниевой группе остатка Arg также невыгодно и для переноса гидрид-иона с субстрата к С4 атому никотинамидного кольца. Можно предположить, что кроме ключевой роли остатка His332 в сорбции формиата, он может участвовать в связывании карбоксиамидной части кофермента. Об этом свидетельствует некоторое ухудшение сродства мутанта His332Phe к NAD+. Роль остатка Asnl46 в основном заключается в обеспечении правильной ориентации формиата в активном центре за счет слабых взаимодействий. Еще одним важным остатком для сорбции формиата является остаток Ile 122, который участвует в связывании формиата кислородом основной цепи. Об этом свидетельствует полная потеря ферментативной активности при его замене на остаток Gly. Важная роль этого остатка в поддержании продуктивной конформации активного центра за счет гидрофобного бокового радикала подтверждается 15-ти кратным ухудшением сродства мутанта Ilel22Gly к NAD+. Замена остатка Glu, характерного для суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот, на остаток Gin очевидно, была призвана увеличить pH-оптимум действия ФДГ. Об этом свидетельствует смещение рКа ионогенной группы примерно на две единицы в более кислую область при замене остатка Gln313 на остаток глутаминовой кислоты. Аддитивность воздействия на кинетические параметры двойного мутанта Asnl46Ser/Gln313Glu и практически совпадение полученных значений рКа ионогенной группы, важной для сорбции формиата в активном центре ФДГ для мутанта Q313E и двойного мутанта могут свидетельствовать, что этой ионогенной группой является имидазольное кольцо остатка His332. Кроме этого, можно сделать вывод о том, что ни одна из этих замен не приводит к существенным изменениям конформации в области активного центра. Отметим, что, когда наши эксперименты по изучению роли вышеуказанных остатков в связывании формиата в активном центре ФДГ были уже завершены, в сентябре 1999 года была опубликована статья (Torres et al., J.Am.Chem.Soc., 1999, v.121, p.8164-8173) по компьютерному моделированию структуры активного центра тройного комплекса (ФДГ-NAD*-формиат) и переходного состояния ферментативной реакции. В этой работе также были использованы наши данные по направленному мутагенезу остатков Gln313 и

His332. Результаты моделирования совпали с нашей моделью связывания формиата в активном центре ФДГ.

Изучение коферментативной специфичности ФДГ Pseudomonas ^ут. 101.

NAD+ и NADP+ являются универсальными двухэлектронными акцепторами электронов и используются в качестве коферментов более чем 700 дегидрогеназами. Отличаясь структурно только на одну фосфатную группу, они играют различные физиологические роли в живых организмах. NAD* участвует в процессах, связанных с окислением органических соединений с последующей передачей энергии химической реакции для образования ATP. NAJDP* за некоторыми исключениями, наоборот, участвует в восстановительных процессах биосинтеза. Исследование механизма молекулярного распознавания коферментов дегидрогеназами представляет большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований связи структуры и функции биологических макромолекул.

Эксперименты по изменению коферментативной специфичности дегидрогеназ были начаты в конце 80-х годов во многих лабораториях мира, однако лишь в немногих случаях были достигнуты заметные успехи. Как правило, существенное (от десятков до тысячи раз) изменение коферментативной специфичности было достигнуто с помощью многоточечных (7-10) замен. Первый успешный результат был достигнут для КАПР+-зависимой глутатионредуктазы из E.coli. После замены 7 аминокислотных остатков в коферментсвязывающем домене был получен мутант, у которого эффективность связывания NAD+ была улучшена в 64 раза. В качестве отправной точки для проведения экспериментов служила трехмерная модель NAD+-зависимой тетрагидрофолатдегидрогеназы. Позднее этими же авторами была проделана аналогичная работа с самой тетрагидрофолатредуктазой, но в обратном направлении - изменение коферментативной специфичности от NAD+ к NADP* . Аналогичная работа была сделана для КАО+-зависимой малатдегидрогеназы из Thermus flavus. В этом случае улучшение специфичности фермента к NADP+ было достигнуто за счет полной замены структуры а-спирали. Следует отметить, что ни в одной работе не было достигнуто изменение коферментативной специфичности путем замены одного аминокислотного остатка, хотя таких попыток было сделано немало. Единственным исключением являются эксперименты по белковой инженерии коферментативной специфичности ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101, проведенные в нашей лаборатории, когда за счет единственной аминокислотной замены удалось повысить эффективность использования этим ферментом NADP+ более, чем в 400 раз.

Как уже обсуждалось ранее, для всех NAD+ специфичных дегидрогеназ в конце ßB участка коферментсвязывающего домена расположен остаток аспарагиновой или глутаминовой кислоты. Этот остаток образует водородную связь с 2'-ОН группой рнбозы аденозина. У NADP+ специфичных дегидрогеназ этот остаток отсутствует, но в соседнем лоложении обязательно расположен положительно заряженный остаток Arg.

Вслед за этим остатком, как правило, расположено еще несколько положительно заряженных остатков для компенсации заряда фосфатной группы NADP+. Вторым условием эффективного связывания NADP+ является наличие дополнительного пространства для фосфатной группы. В связи с этим, характерным мотивом для NAD+-зависимых дегидрогеназ является GXGXXG, а для NADP+ зависимых мотив GXGXXA. Кроме этого, на расстоянии 3 остатков (один шаг а-спирали) у первых ферментов часто расположен остаток Gly(Ala), а для вторых еще один гидрофобный остаток собъемным боковым радикалом - Ala, Leu, Ile. Контакт между боковыми радикалами этих остатков приводит к увеличению длины аВ спирали, и, как следствие, к появлению вышеназванного дополнительного объема.

Формиатдегидрогеназы из дрожжей обладают практически абсолютной специфичностью к NAD+ и не способны использовать в качестве кофермента NADP+. Бактериальные ферменты проявляют слабую каталитическую активность с NADPt. Для ФДГ из Pseudomonas sp.lOi Km по NADP+ составляет около 100 mM, максимальной скорость реакции всего 5% от максимальной скорости реакции с NA1)+. В последовательности ФДГ из Pseudomonas л/7.101 имеется классический мотив G(A)XGXXG(+17)D. Однако, рядом с остатком Asp221 расположен остаток Arg222, наличие которого строго обязательно для эффективного связывания NADP+ . Рядом с ним расположены еще два остатка His223 и Arg224, способные также нейтрализовать избыточный отрицательный заряд при связывании NADP+. В аВ спирали в положении +3 от третьего остатка Gly мотива GXGXXG расположен остаток Leu207. Все это указывает, на "предрасположенность" ФДГ к NADP+, и можно предположить, что ФДГ эволюционировали от КАОР^-зависимого предшественника.

Существенным отличием от классического мотива для ФДГ Pseudomonas sp.101 является то, что первый остаток мотива GXGXXG заменен на остаток Ala. Ранее в нашей лаборатории было показано, что замена этого остатка на Gly приводит к увеличению сродства фермента к NAD+ примерно в 2 раза и увеличению термостабильности фермента примерно в 2.5 раза. Помимо этого, замена остатка Asp221 на нейтральный остаток Ala привела к появлению специчности ФДГ не только к NAD+, но и к NADP+.

Для более детального исследования роли остатка Asp221 в связывании коферментов было решено заменить этот остаток на остатки Ser и Gly. Кроме этого, интересно было изучить взаимное влияние вышеупомянутых замен остатка Asp221 (на остатки Ala, Ser и Gly) и замены Alal98Gly. Для этого были получены соответствующие двойные мутанты и исследованы их кинетические характеристики, а также термоинактиваиия в диапазоне 60-65 °С. Кинетические параметры всех полученных мутантов приведены в таблице 5. Отметим, что среди всех исследованных мутантов наиболее оптимальным катализатором для создания системы регенерации NADPH является полученный еще в 1993 году мутант D221A. Обладая практически тем же сродством к NADP+ , что и мутант D221G, он имеет более высокую на 70%

iаолнцаэ

Кинетические параметры мутантов Asp22IX и двойных мутантов Asp221X/AI98G.

Препарат Км по NAD+ • рМ Ки по NADP+ цМ К„ по формиату тМ К, по азиду х10'7М Кем, с • Kcai/Km, тМ-'с1 Кса|/Кт, . тМ-'с1 мутант/нативн.

Реакция с NAD+

Нативцая ФДГ 11015 1110,5 1.110.2 10 90.91 1

D221S 710±45 3212 3.210.2 5 7.04 0.077

D221S/A198G 540+42 53+5 5.210.3 5 9.26 0.102

D221A 1020±50 1411 2.510.5 5 4.90 0.054

D221A/A198G 920±б0 12015 1411 5 5.43 0.06

D221G 670±50 3013 3.2+0.4 5 7.46 0.082

D221G/A198G 18001110 15014 1511 5 2.78 0.031

Реакция с NADP+

Нагивная ФДГ 100000* н.о н.о 1.3 0.01 1

D221S 560+30 н.о н.о 1.7 3.04 234

D221S/A198G 280+25 н.о н.о 1.8 6.43 495

D221A 710164 12* н.о 2.5 3.52 271

D221A/A198G 360130 120 н.о 2.4 6.67 513

D221G 710160 н.о . Н.о 1.7 2.39 184

D221G/A198G 360126 н.о 11.0 1.7 4.72 363

* Литературные данные.

каталитическую константу и лучшее сродство к формиату. Наихудшим сродством к NADP+ обладает мутант D221S. Это может быть объяснено тем, что в результате данной мутации создается наименьшая по размеру полость, в которую должна входить дополнительная по сравнению с NAP+ фосфатная группа NADP+. Кроме того, любая замена остатка аспарагиновой кислоты приводила к ухудшению сродства фермента к NAD+. Это легко объяснить, приняв во внимание тот факт, что любая замена остатка Asp221 убирает карбоксильную группу, которая обеспечивает специфичность к NAD+ за счет водородной связи с 2'-ОН группой рибозы аденозина.

Введение второй замены остатка Л1а198 приводило к еще большему ухудшению сродства фермента к NAD+, но улучшала сродство к NADP+ примерно в 1,5-2 раза. К сожалению, замена Alal98Gly вызывала существенное ухудшение сродства двойных мутантов к формиату. Это, по-видимому, связано с тем, что основные структурные изменения белковой глобулы ФДГ, необходимые для образования тройного фермент-субстратного комплекса и переходного состояния ферментативной реакции, происходят на стадии связывании кофермента. Поэтому именно конформация двойного комплекса (ФДГ-кофермент) является определяющей для эффективного связывания формиата. Как было показано нами выше, даже очень небольшие изменения в активном центре ФДГ приводят к довольно заметным изменениям в сродстве к формиату. Наиболее высоким сродством к формиату обладает мутант Asp221Ala. Худшее сродство к субстрату мутанта Asp221Ser может быть связано со стерическими затруднениями при связывании фосфатной группы. В случае мутанта Asp221Gly структура белка в этой области становится более подвижной и таким образом повышается вероятность конформационных изменений. Отметим, что изменение сродства к формиату в одинарных мутантах коррелирует с изменением максимальной скорости реакции. Чем меньше ухудшение сродства к субстрату, тем меньше падение максимальной скорости реакции. Введение замены Alal98Gly обеспечивает еще большую подвижность а-спирали коферментсвязывающего домена. Это уже становится заметным на стадии получения просто одинарного мутанта Alal98Gly, когда Км по формиату возросла на 25%, но без изменения максимальной скорости реакции. В случае двойных мутантов эффекты влияния каждой из мутаций на связывания формиата складываются, что приводит к еще более плохому связыванию субстрата в активном центре.

Для всех полученных препаратов была изучена термоинактивация в диапазоне от 60 до 65 °С. На рисунке 8 приведены графики зависимости натурального логарифма остаточной активности всех препаратов от времени при 60 °С. Отметим, что стабильность всех трех NADP'-специфичных мутантов ниже, чем стабильность ФДГ дикого типа. Среди мутантов наибольшая стабильность наблюдается в случае мутеина Asp221Ala. В случае же двойных мутантов различия в их термостабильности практически не наблюдается. Эти данные указывают на то, что метильная ipynna остатка А1а198 является главным дестабилизирующим фактором в этой области

Зелковой глобулы. Удаление этой метальной группы в результате замены А1а19801у триводит к тому, что стабильность этой части фермента становится настолько зысокой, что общая термостабильность ФДГ уже начинает определяться :табильностью других участков белковой глобулы.

Время, иня. ВРСИ"'

Рисупок 8. Термоинактивация точечных мутантов АБр221X (А) и двойных мутантов А5Р221Х/А1а198ау (В) при 60 "С, 0.1 М КФБ буфер, рН 7.0.

Интересно было выяснить, какой из двух факторов - изменение энтальпии или нпропии, приводят к повышению стабильности полученных мутантов. Для этого были >пределены константы скорости инактивации в диапазоне температур 60 - 65 °С. На шсунке 9 представлены зависимости величины ^(¿„„/Т) от 1/Т, где кш - наблюдаемая :онстанта скорости инактивации первого порядка, а Т - температура в градусах Сельвина.

Линейная зависимость вторичных графиков свидетельствует, что процесс ■ермоинактивации нативной и мутантных ФДГ может быть описан с помощью теории [ктивированного комплекса. В соответствии с этой теорией зависимость наблюдаемой :онстанты скорости термоинактивации от температуры описывается следующим 'равнением: (уравнение 3)

•деки к - постоянные Больцмана и Планка, соответственно, Я - универсальная газовая юстояннйя, а ДО*„и, АИ"т и Д8*„„ - активациопные параметры процесса ермоинактивации.

Значения ДН*„„ и ДБ*«, могут быть определены экспериментально из графика ависимости в координатах 1п(Аи/Г) от 1/Т по уравнению (4), полученным из равнения (3) делением уравнения на Т и логарифмированием.

т

V У

yh) RT R

'к >

-12 1

-13

t С

-14

-15

-16

-17

♦ D221A

■ D221A/A198G a D221S

■ D221S/A198G ж 0221G

• D221G/A198G + pFDH6

0.00295 0.00296 0.00297 0.00298 0.00299 0.00300 0.00301 1/Т, К"1

Рисунок 9. Зависимость натурального логарифма Kin/T от обратной температуры для мутантов Asp221X и Asp221X/Alal98Gly.

Параллельный ход прямых и различные величины отсекаемых ими отрезков, (рис. 9) свидетельствует о том что процесс термоинактиващш нативнон ФДГ и ее мутацтов Характеризуется примерно одинаковыми величинами ДН#ии, а основной вклад в увеличение стабильности ФДГ в результате введения мутации A198G обусловлен энтропийным фактором.

Полученные нами данные по влиянию мутаций в 198 и 221 положениях на сродство ФДГ к коферменту и формиату позволяют выдвинуть гипотезу, объясняющую наличие остатка Ala в первом положении высококонсервативной "канонической" последовательности GlyXGlyXXGly для кофермснт-связывающего домена дегидрогеназ. По всей видимости, бактериальная ФДГ является промежуточным продуктом эволюции от NADP+- к КАО+-специфичному ферменту. На ранних стадиях развития живых систем, когда основными метаболитическими путями были аэробные процессы, ФДГ изначально была NADP+-3aiuicHMbiM ферментом и обеспечивала получение NADPH для биосинтеза различных соединений. Наличие остатка Ala в 198 в положении в NADP^-зави симом ферменте обеспечивало в 10 раз

более эффективное связывание формиата, чем в случае остатка Gly. У этого фермента в 221-ом положении находился незаряженный аминокислотный остаток, а в 222-ом положении - положительно заряженный остаток Arg, необходимый для нейтрализации отрицательного заряда фосфатной группы NADP*. Кроме того, в этом же регионе были еще и другие положительно заряженные остатки (His223, Arg224 в нашем случае). В процессе эволюции при появлении метилотрофных микроорганизмов потребовался фермент, эффективно использующий NAD*, а не NA DP*. Первым этапом эволюционного процесса было появление остатка Asp в 221-ом положении, обеспечивающего специфичность к NAD*. ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.lOl, по-видимому, и является продуктом этого первого этапа эволюции. Этот фермент уже имеет остаток Asp, ответственный за специфичность к NAD*, но при этом в качестве "рудиментов" содержит положительно заряженные аминокислотные остатки, необходимые для связывания NADP*, а также остаток Ala в 198-ом положении. Следствием этого является наличие слабой каталитической активности бактериальных ФДГ с NADP*. ФДГ из метилотрофных дрожжей представляют собой результат более поздних этапов эволюции. Эти ферменты потеряли вышеуказанные "рудий'ёнтарные" остатки и обладают абсолютной специфичностью к NAD*. В ходе эволюции для дрожжевых формиатдегидрогеназ также произошла замена "неканонического" остатка Ala в 198 положении на "канонический" остаток Gly.

Выводы

1 Методом направленного мутагенеза изучена роль остатка Gln313 в механизме действия NAD'-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2, ФДГ) из метилотрофных бактерий Pseudomonas jp.101. Показано, что замена остатка глутаминовой кислоты, абсолютно консервативного для ферментов суиерсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот, на остаток глутамина в молекуле ФДГ обеспечивает более широкий (на две единицы pH) pH-оптимум действия этого фермента.ч

! Методом направленного мутагенеза изучена роль остатка His332 в молекуле ФДГ бактерий Pseudomonas лр.101, соответствующего каталитически важному остатку His в. активных центрах других ферментов суперсемейства D-специфйчных дегидрогеназ -2-гидрокСикислот.' Показано, что в случае ФДГ метилотрофных бактерий"Pseudomonas íp.101 этот остаток является важным для сорбции формиата в активном центре фермента.

Методом направленного мутагенеза изучена роль остатка Asnl46 в активном центре ФДГ Pseudomonas íp.101. Показано, что этот остаток является важным для продуктивной ориентации формиата в активном центре. Синхронность изменения Кт по формиату и константы ингибирования азидом подтверждает предположение, что остаток Asnl4 играет одинаковую роль в связывании как формиата, так и азида в активном центре фермента. Получен двойной мутант формиатдегидрогеназы,

содержащий замены Asnl46Ser и Gln313Glu. Показана аддитивность воздействия одинарных замен на кинетические характеристики двойного мутанта, что свидетельствует об отсутствии конформационных изменений в области активного центра в результате каждой из одинарных замен. На основании совокупности ранее полученных данных и данных по направленному мутагенезу вышеперечисленных остатков предложена модель связывания формиата в активном центре ФДГ Pseudomonas sp.101.

4 Методом направленного мутагенеза изучена роль остатка 11е122 в механизме действия бактериальных формиатдегидрогеназ. Показано, что наличие в этом положении аминокислотног о остатка с объемным гидрофобным боковым радикалом является важным для поддержания продуктивной конформации активного центра.

5 С целью дальнейшего изучения механизма коферментативной специфичности ФДГ Pseudomonas sp.101 в дополнение к ранее полученному мутанту Asp221Ala получены еще две мутантных формы ФДГ - Asp221Ser и Asp221Gly, обладающих специфичностью не только к NAD+, но и к NADP+. Установлено, что наилучшая эффективность использования NADP+ в качестве кофермента наблюдается в случае Asp221Ala. Во все три ЫАОР+-специфичных мутанта ФДГ была введена вторая мутация Alal98Gly, которая в случае фермента дикого типа обеспечивала двукратное увеличение сродства к NAD+ без заметного изменения сродства к формиату. Показано, что в случае ЫАОР+-специфичных мутантов такая замена также увеличивает сродство к коферменту, но при этом сродство к формиату ухудшается примерно на порядок. Высказана гипотеза, что формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий являются промежуточным продуктом эволюции от NADP+-3aBHCHMoro фермента к ФДГ с абсолютной специфичностью к NAD1".

Список работ по теме диссертации:

1. Matorin A.D., Kulakova L.B., Rojkova A.M., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., Dementieva L.A., Tishkov V.I. "The Mechanism of Formate Dehydrogenase Reaction. Site Directed Mutagenesis ofHis332 and Gln313." Abstracts of International Conference Biocatalysis-95. 1995 Suzdal, Russia, June 13-18, p 53.

2. Tishkov, V.I., Rogkova, A.M., Savitsky, P.A., Fedorchuk, V.V., Matorin, A.D. Role of conservative His332 and Gln313 residues in catalysis of bacterial formate dehydrogenase. Abstr. of the 8th Int.Symp. on Microbial Growth on CI Compounds, San Diego, USA 1995, B37, p.66

3. Tishkov, V.I., Fedorchuk, V.V., Matorin, A.D., Savitsky, P.A., Dementieva, L.A., Kulakova, L.B., Galkin, A.G., Rojkova, A.M. Single-point mutations result in formate dehydrogenase with absolute specificity to NAD+. Program & Abstracts of Intern.Conference "Enzyme Engineering XIII", San Diego, USA 1995, PI.-47

4. Vladimir I. Tishkov, Andrey D. Matorin, Alexandra M. Rojkova, Vladimir V. Fedorchuk, Pavel P. Savitsky, Larissa A. Dementieva, Victor S. Lamzin, Alexander V. Mezentzev, Vladimir O. Popov. "Site-directed mutagenesis of the formate

dehydrogenase active centre: role of the His332-Gln313 pair in enzyme catalysis", FEBS Letters 390 (1996) p. 104-108

5. Matorin, A.D., Fedorchuk, V.V., Rojkova, A.M., Savitsky, P.A., Tishkov, V.I. Site-directed mutagenesis of formate dehydrogenase from bacterium Pseudomonas ip.101: role of Asnl46 in enzyme catalysis, in: "Perspectives on Protein Engineering 2". (Geisow, M.J., ed.) BIODIGM, Nottingham, UK -1997 (ISBN 0-9529015-1-X), p.48-51.

6. Материи А., Рожкова А., Савицкий П., Федорчук В., Тишков В. Роль консервативных остатков His332 и Gln313 в катализе бактериальных формиатдегидрогеназ. Тезисы стендовых сообщений Второго съезда биохимического общества Российской Академии Наук, Москва 19-23 мая 1997 г., ч.1, с.48-49.

7. Matorin, A.D., Tishkov, V.I. The role of Asnl46 residue in enzyme catalysis of NAD+-dependent formate dehydrogenase. Abstracts of Intern. Conf. "Biocatalysis-98. Fundamentals and Applications", June 1998, Puschino-on-Oka, p. 45.

I. ВВЕДЕНИЕ

II ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РЕАКЦИЙ ДЕГИДРИРОВАНИЯ.

1.1 Основные закономерности реакций гидридного переноса.

1.2 Основные закономерности механизма действия и строения NAD(P)+ зависимых дегидрогеназ.

ГЛАВА 2. СТРОЕНИЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ NAD+-3ABHCHMbIX ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ.

2.1 Основные физико-химические свойства формиатдегидрогеназ.

2.2 Сравнение аминокислотных последовательностей ФДГ.

2.3 Строение белковой глобулы ФДГ метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101.

2.4 Строение коферментсвязывающего домена.

2.5 Строение активного центра ФДГ.

2.6 Механизм катализа ФДГ.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Материалы.

3.2 Методы исследования.

IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ОСТАТКОВ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ФДГ Pseudomonas sp.101, УЧАСТВУЮЩИХ В КАТАЛИЗЕ И

СОРБЦИИ ФОРМИАТА.

4.1 Роль остатка His332.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ИМ)+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный

КАОН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

МАОР+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

ЫАБРН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

ФДГ - формиатдегидрогеназа

АДГ - алкогольдегидрогеназа

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МДГ - малатдегидрогеназа

ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

ИПМДГ - 3-изопропилмалатдегидрогеназа

АТФ - аденозин-5 -трифосфат сШТР - дезоксирибонуклеозид -5 -трифосфат ИПТГ - изопропилтио-(3-0-галактозид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ДТТ - дитиотреитол

NAD(P)+-3aBHCHMbie дегидрогеназы составляют обширный класс ферментов, катализирующих обратимый (в большинстве случаев) перенос гидрид-иона от субстрата к окисленной форме кофермента. Эти ферменты катализируют ряд ключевых метаболических процессов и относятся к одному из самых исследуемых в настоящее время классов.

Как было показано [1], КАО+-зависимые формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2., ФДГ) относятся к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидрокси кислот, в которое, в частности, входят D-лактат дегидрогеназы. В аминокислотных последовательностях ферментов этого суперсемейства имеется целый ряд высоко консервативных аминокислотных остатков, которые по данным рентгеноструктурного анализа расположены в активном центре и являются каталитически важными или участвуют связывания субстрата. Такими остатками, в частности являются остатки His332, Arg284,11е202 и ряд других по нумерации ФДГ метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.lQl. Механизм действия и строение этих ферментов тоже имеют некоторые общие закономерности.

Исследованию ферментов этого суперсемейства в настоящее время посвящено огромное число работ. Для многих из них была показана роль как отдельных остатков в катализе, так и общий механизм действия, имеются ренгеноструктурные данные с высоким разрешением, клонирован и секвенирован ген, осуществлена экспрессия в различные микроорганизмы.

Рассматриваемая нами формиатдегидрогеназа состоит из двух идентичных субъединиц, имеет на каждой субъединице по одному независимому активному центру и не содержит в своем составе ни ионов металлов, ни простетических групп. В ходе реакции, катализируемой этим ферментом, отсутствует стадия присоединия - отщепления протона, характерная для механизма действия остальных NAD(P)+ зависимых дегидрогеназ 2-гидроксикислот, что значительно упрощает исследование собственно каталитической стадии - переноса гидрид-иона от формиата к С4-атому никотинамидного кольца кофермента и реакция может рассматриваться в качестве модельной для ферментов этого суперсемейства. Ранее на основании исследований кинетики реакции в стационарном и предстационарном режимах, данных рентгеноструктурного анализа для апо-фермента и тройного комплекса ФДГ-МАЕ)+-азид, а также исследований методом направленного мутагенеза, была предложена модель действия бактериальной ФДГ. Однако, точных данных о роли вышеупомянутых остатков, сорбции субстрата в активном центре в настоящее время нет. Надо отметить, что именно благодаря простоте механизма действия ( отсутствие стадии присоединения-отщепления протона ) роль ряда консервативных остатков в случае ФДГ может существенно отличаться от их роли в случае других ферментов этого суперсемейства.

Самой изученной из формиатдегидрогеназ является фермент из метилотрофных бактерии Pseudomonas sp. 101 [2]. Для этой ФДГ в настоящее время имеются рентгеноструктурные данные с высоким разрешением [3], секвенирован [4] и клонирован [5] ген этого фермента, что позволило использовать методы белковой и генной инженерии при изучении этого фермента. Таким образом, одной из задач представленной работы было методом направленного мутагенеза изучить роль консервативных остатков в случае ФДГ метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 и уточнить на основании этих данных модель действия бактериальных ФДГ.

Не менее интересной задачей в настоящее время является исследование механизма коферментативной специфичности дегидрогеназ. методами генной и белковой инженерии. Формиатдегидрогеназы из метилотрофных дрожжей обладают абсолютной специфичностью к NAD+. Нативная ФДГ метилотрофных бактерий Pseudomonas 5/7.101 кроме высокого сродства к NAD+ проявляет небольшую активность и с NADP+. Ранее в нашей лаборатории в рамках исследования механизма коферментативной специфичности дегидрогеназ был получен мутант ФДГ, способный утилизировать NADP+ в качестве кофактора почти с такой же эффективностью, какую фермент дикого типа проявляет с NAD+. Кроме того, бактериальные ФДГ представляют отдельную группу дегидрогеназ, у которых в консервативной последовательности для коферментсвязывающего домена GlyXGlyXXGly вместо первого остатка глицина расположен остаток аланина (А1а198). Было показано, что замена этого остатка аланина в 198 положении на остаток глицина в ферменте дикого типа приводит к улучшению связывания NAD+ и повышению термостабильности более, чем в два раза. Поэтому второй задачей данной работы было получить мутантные формы фермента, обладающие еще большим сродством к NADP+ и изучить влияние замены остатка А1а198 на связывание NADP+.

II ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

V выводы.

I. Методом направленного мутагенеза изучена роль остатка Gln313 в механизме действия 1ЧАО+-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2, ФДГ) изметилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101. Показано, что замена остатка глутаминовой кислоты, абсолютно консервативного для ферментов суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот, на остаток глутамина в молекуле ФДГ обеспечивает более широкий (на две единицы pH) pH-оптимум действия этого фермента.

II. Методом направленного мутагенеза изучена роль остатка His332 в молекуле ФДГ бактерий Pseudomonas sp. 101, соответствующего каталитически важному остатку His в активных центрах других ферментов суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. Показано, что в случае ФДГ метилотрофных бактерий Pseudomonas 101 этот остаток является важным для сорбции формиата в активном центре фермента.

III. Методом направленного мутагенеза изучена роль остатка Asnl46 в активном центре ФДГ Pseudomonas sp. 101. Показано, что этот остаток является важным для продуктивной ориентации формиата в активном центре. Синхронность изменения Кт по формиату и константы ингибирования азидом подтверждает предположение, что и формиат и азид связываются одинаково в активном центре фермента. Получен двойной мутант формиатдегидрогеназы, содержавший замены Asnl46Ser и Gln313Glu. Показана аддитивность воздействия одинарных замен на кинетические характеристики двойного мутанта, что свидетельствует об отсутствии конформационных изменений в области активного центра в результате каждой из одинарных замен. На основании совокупности ранее полученных данных и данных по направленному мутагенезу вышеперечисленных остатков предложена модель связывания формиата в активном центре ФДГ Pseudomonas sp.\0\.

IV. Методом направленного мутагенеза изучена роль остатка Не 122 в механизме действия бактериальных формиатдегидрогеназ. Показано, что наличие в этом положении объемного гидрофобного радикала является важным для поддержания продуктивной конформации активного центра.

V. С целью дальнейшего изучения механизма коферментативной специфичности ФДГ Pseudomonas 101 в дополнение к ранее полученному мутанту Asp221Ala получены еще две мутантных формы ФДГ - Asp221Ser и Asp221Gly, обладающих специфичностью не только к NAD+, но и к NADP+. Установлено, что наилучшая эффективность использования NADP+ в качестве кофермента наблюдается в случае Asp221Ala. Во все три NADP^-специфичных мутанта ФДГ была введена вторая мутация Alal98Gly, которая в случае фермента дикого типа обеспечивала двукратное увеличение сродства к NAD+ без заметного изменения сродства к формиату. Показано, что в случае NADP+-специфичных мутантов такая замена также увеличивает сродство к коферменту, но при этом сродство к формиату ухудшается примерно на порядок. Высказана гипотеза, что формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий являются промежуточным продуктом эволюции формиатдегидрогеназы от КА0Р+-зависимого фермента к ФДГ с абсолютной специфичностью к NAD+.

1. Vinals С., Depiereux Е. and Feytmans Е. "Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase". Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, v.192, N 1, p.182-188.

2. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H. and Wilson K.S. "High resolution structures of holo and apo formate dehydrogenase". J. Mol. Biol. 1994, v.236, N 3, p.759-785.

3. Galkin A., Kulakova L., Tishkov V., Esaki N. and Soda K. "Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol-utilizing bacterium Mycobacterium vaccae N10". Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995, v.44, N 3-4, p.479-483.

4. Тишков В.И., Галкин А.Г., Гладышев B.H., Карзанов В.В. и Егоров A.M. "Анализ структуры гена, оптимизация экспрессии в E.coli и свойства рекомбинантной формиатдегидрогеназы бактерий Pseudomonas sp. 101." Биотехнология, -1992, N5, стр.52-59

5. You K.S. "Stereospecificity for nicotinamide nucleotides in enzymatic and chemical hydride transfer reactions". CRC CritRev. Biochem. 1985, v.17, N 4, p.313-451.

6. Glasfeld A., Leanz G.F. and Benner S.A. "The stereospecificities of seven dehydrogenases from Acholeplasma laidlawii. The simplest historical model that explains dehydrogenase stereospecificity". J. Biol. Chem. 1990, v.265, N 20, p.l 1692-11699.

7. Nambiar K.P., Stauffer D.M., Kolodziej P.A. and Benner S.A. "A mechanistic basis for the stereoselectivity of enzymatic transfer from nicotineamide cofactors". J. Am. Chem. Soc. 1982, v.105, p.5886-5890.

8. Orn Almarsson, Rafic Karaman and Thomas C.Bruice "Kinetic Importance of Conformation of Nicotineamide Adenine Dinucleotide in the Reaction of Dehydrogenase Enzymes". J. Am. Chem. Soc. 1992, v.l 14, N 22, p.8702-8704.

9. Cornforth J.W., Ryback G., Popjak G., Donninger C. and Schroepfer G.Jr. "Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962, v.3, p.9371-375.

10. Eklund H., Samama J.P. and Jones T.A. "Crystallographic investigations of nicotinamide adenine dinucleotide binding to horse liver alcohol dehydrogenase". Biochemistry 1984, v.23, N 25, p.5982-5996.

11. Oppenheimer N .J., Marschner T.M. and Malver O. in Enzyme Mechanism: Stereochemistry. Proceeding of the Steenhook Symposium. 1985, p. 15-28.

12. Weinhold E.G., Glasfeld A., Ellington A.D. and Benner S.A. "Structural determinants of stereospecificity in yeast alcohol dehydrogenase". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A- 1991, v.88, N 19, p.8420-8424.

13. Wierenga R.W., DeMaeyer M.C.H. and Hoi W.G.J. "Interaction of pyrophosphate moieties with a-helices in dinucleotide-binding proteins". Biochemistry 1985, v.24, p.1346-1357.

14. Rossmann M.G., Moras D. and Olsen K.W. "Chemical and biological evolution of nucleotide-binding proteins.". Nature 1974, v.250, p.194-199.

15. Carugo O. and Argos P. "NADP-dependent enzymes. I: Conserved stereochemistry of cofactor binding". Proteins 1997, v.28, N 1, p.10-28.

16. Rao S.T. and Rossmann M.G. "Comparison of super-secondary structures in proteins.". J. Mol. Biol. 1973, v.76, p.241-256.

17. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Recommendations 1982". Eur. J. Biochem. 1983, v.131, N 1, p.9-15.

18. Vinals C., De B., X, Depiereux E. and Feytmans E. "Knowledge-based modeling of the D-lactate dehydrogenase three- dimensional structure". Proteins 1995, v.21, N 4, p.307-318.

19. Hummel W. and Kula M.R. "Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds". Eur. J. Biochem. 1989, v. 184, N 1, p.1-13.

20. Carugo O. and Argos P. "NADP-dependent enzymes. II: Evolution of the Mono-and Dinucleotide Binding Domains". Proteins 1997, v.28, N 1, p.29-40.

21. Karplus P.A. and Schulz G.E. "Substrate binding and catalysis by glutatione reductase as delivered from refined enzyme: substrate crystal structure as 2 angstroms resolutions.". J. Mol. Biol. 1989, v.210, p.163-180.

22. Bailey S., Smith K., Fairlamb A.H. and Hunter W.N. "Substrate interactions between trypanothione reductase and N1- glutathionylspermidine disulphide at 0.28-nm resolution". Eur. J. Biochem. 1993, v.213, N 1, p.67-75.

23. Correll C.C., Batie C.J., Ballou D.P. and Ludwig M.L. "Phthalate dioxygenase reductase: a modular structure for electron transfer from pyridine nucleotides to 2Fe-2S.". Science 1992, v.258, N 5088, p.1604-1610.

24. Bellamacina C.R. "The nicotinamide dinucleotide binding motif: a comparison of nucleotide binding proteins". FASEBJ. 1996, v.10, N 11, p.1257-1269.

25. Cui K., Ma Q., Lu Ant.Y.H. and Yang Ch. "Roles of Histidine-194, Aspartate-163, and Glycine-Rich Sequence of NAD(P)H:Quinone Oxireductase in the Interaction with Nicotineamide Coenzymes". Arch. Biochem. Biophys. 1995, v.323, N 2, p.265-273.

26. Bernard N., Ferain T., Garmyn D., Hols P. and Delcour J. "Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus by complementation in Escherichia coli". FEBSLett. 1991, v.290, N 1-2, p.61-64.

27. Kochhar S., Hottinger H., Chuard N., Taylor P.G., Atkinson T., Scawen M.D. and Nicholls DJ. "Cloning and overexpression of Lactobacillus helveticus D-lactate dehydrogenase gene in Escherichia coli". Eur. J. Biochem. 1992, v.208, N 3, p.799-805.

28. Lerch H.P., Frank R. and Collins J. "Cloning, sequencing and expression of the L-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase-encoding gene of Lactobacillus confusus in Escherichia coli". Gene 1989, v.83, N 2, p.263-270.

29. Arthur M., Molinas C., Dutka-Malen S. and Courvalin P. "Structural relationship between the vancomycin resistance protein VanH and 2-hydroxycarboxylic acid dehydrogenases". Gene 1991, v.103, N 1, p.133-134.

30. Goldberg J.D., Yoshida T. and Brick P. "Crystal structure of a NAD-dependent D-glycerate dehydrogenase at 2.4 A resolution". J. Mol. Biol. 1994, v.236, N 4, p. 11231140.

31. Greenler J.M., Sloan J.S., Schwartz B.W. and Becker W.M. "Isolation, characterization and sequence analysis of a full-length cDNA clone encoding NADH-dependent hydroxypyruvate reductase from cucumber". Plant Mol. Biol. 1989, v.13, N 2, p.139-150.

32. Tobey K.L. and Grant G.A. "The nucleotide sequence of the serA gene of Escherichia coli and the amino acid sequence of the encoded protein, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase". J. Biol. Chem. 1986, v.261, N 26, p.12179-12183.

33. Schoenlein P.V., Roa B.B. and Winkler M.E. "Divergent transcription ofpdxB and homology between the pdxB and serA gene products in Escherichia coli K-12". J. Bacteriol. 1989, v.171, N 11, p.6084-6092.

34. Yomano L.P., Scopes R.K. and Ingram L.O. "Cloning, sequencing, and expression of the Zymomonas mobilis phosphoglycerate mutase gene (pgm) in Escherichia coli". J. Bacteriol. 1993, v.175, N 13, p.3926-3933.

35. Allber T., Banner D.W., Bloomer A.C., Petsko G., Phillips D.C., Rivers P.S. and Wilson I.A. "On the three dimensional structure and catalytic mechanism of triose phosphate isomerase.". Philos. Trans. R. Soc. London. 1981, v.293, p.159-171.

36. Drenth J., Hoi W.G., Jansonius J.N. and Koekoek R. "A comparison of three-dimensional structures of subitilisn BPN' and subitilisn novo.". Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1971, v.36, p.107-116.

37. Drenth J., Kalk K.H. and Swen H.M. "Binding of chloromethyl ketone substrate analog to crystalline papain.". Biochemistry 1976, v. 15, p.3731- 3738.

38. Krisch J.F., Eichele G., Ford G.C., Vincent M.G. and Jansonius J.N. "Mechanism of action of aspartate aminotransferase proposed on the basis of its spatial structure.". J. Mol. Biol. 1984, v.174, p.497-525.

39. Johnson L.N., Jenkins J.A., Wilson K.S., Stura E.A. and Zanotti G. "Proposals for the catalytic mechanism of glycogen phosphoiylase beta prompted by crystallographic studies on glucose 1-phosphate binding". J. Mol. Biol. 1980, v. 140, N 4, p.565-580.

40. Blagdon D.E. and Goodman M. "Letter: Mechanisms of protein and polypeptide helix initiation". Biopolymers 1975, v.14, N 1, p.241-245.

41. Hoi W.G., van Duijnen P.T. and Berendsen H.J. "The alpha-helix dipole and the properties of proteins". Nature 1978, v.273, N 5662, p.443-446.

42. Sheridan R.P. and Allen L.C. "The electrostatic potential of the alpha helix (electrostatic potential/alpha-helix/secondary structure/helix dipole)". Biophys. Chem. 1980, v.ll,N2, p.133-136.

43. Vinals C., Depiereux E. and Feytmans E. "Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase". Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, v. 192, N 1, p. 182188.

44. Lamzin V.S., Dauter Z. and Wilson K.S. "Dehydrogenation through the looking-glass letter.". Nat. Struct. Biol. 1994, v.l, N 5, p.281-282.

45. Clarke A.R., Wigley D.B., Chia W.N., Barstow D., Atkinson T. and Holbrook J.J. "Site-directed mutagenesis reveals role of mobile arginine residue in lactate dehydrogenase catalysis". Nature 1986, v.324, N 6098, p.699-702.

46. Тишков В.И. Диссертация доктора химических наук, Москва, МГУ. 1993 г.

47. Birktoft J.J. and Banaszak L.J. "The presence of a histidine-aspartic acid pair in the active site of 2- hydroxyacid dehydrogenases. X-ray refinement of cytoplasmic malate dehydrogenase". J. Biol. Chem. 1983, v.258, N 1, p.472-482.

48. Taguchi H. and Ohta T. "Histidine 296 is essential for the catalysis in Lactobacillusplantarum D-lactate dehydrogenase". J. Biol. Chem. 1993, v.268, N 24, p.18030-18034.

49. Taguchi H., Ohta T. and Matsuzawa H. "Involvement of Glu-264 and Arg-235 in the essential interaction between the catalytic imidazole and substrate for the D-lactate dehydrogenase catalysis". J. Biochem. (Tokyo) 1997, v. 122, N 4, p.802-809.

50. Kochhar S., Chuard N. and Hottinger H. "Glutamate 264 modulates the pH dependence of the NAD(+)-dependent D- lactate dehydrogenase". J. Biol. Chem. -1992, v.267, N 28, p.20298-20301.

51. Karzanov V.V., Bogatsky Y., Tishkov V.I. and Egorov A.M. "Evidence for the presence of a new NAD+-dependent formate dehydrogenase in Pseudomonas sp. 101 cells grown on a molybdenum-containing medium". FEMS Microbiol. Lett. 1989, v.51,Nl, p. 197-200.

52. Kato N., Капо M., Tany Y. and Ogata K. "Purification and choric characterization of formate dehydrogenase in methanol utilizing yeast Kloekera sp. 2201". Agr. Biol. Chem. 1974, v.38, N l,p.l 11-116.

53. Shutte H., Flossdorf J., Sahm H. and Kula M.R. "Purification and properties of formate dehydrogenase from Candida Boidini.". Eur. J. Biochem. 1976, v.62, N 1, p.151-160.

54. Егорова O.A., Авилова T.B., Платоненкова JI.C. and Егоров A.M. "Выделение и свойства NAD-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофных дрожжей Candida methylica". Биохимия 1981, Т.46, N 6, стр.1119-1126.

55. Wou С.Т., Patel R.N., Laskin A.L. and Barnabe N. "NAD-dependent formate dehydrogenase from methanol-grow Pichiapastoris NRRL Y-7556". Arch. Biochem. Biophys. 1982, v.216, N 1, p.296-305.

56. Allais J J., Louktibi A. and Barati J. "Oxidation of methanol by the yeast Pichia Pastoris". Agr. Biol. Chem. 1983, v.47, N 11, p.2547-2554.

57. Izumi Y., Kanzaki H., Morita S., Futazuka H. and Yamada H. "Characterization of crystalline formate dehydrogenase from Candida methanolica". Eur. J. Biochem. -1989, v.182, N 2, p.333-341.

58. Egorov A.M., Avilova T.V., Dikov M.M., Popov V.O., Rodionov Y.V. and Berezin I.V. "NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium, strain 1. Purification and characterization". Eur. J. Biochem. 1979, v.99, N 3, p.569-576.

59. Babel W. and Mothes G. "Rolle de formiat dehydrogenase in "Serin-weg" bacterial". Z. Allg. Microbiol. 1980, v.20, N 3, p.167-175.

60. Asano Y., Sekigawa Т., Inukai H. and Nakazawa A. "Purification and properties of formate dehydrogenase from Moraxella sp. strain C-l". J. Bacteriol. 1988, v. 170, N 7, p.3189-3193.

61. Iida M., Kitamurakimura K., Maeda H. and Mineki S. "Purification and Characterization of NAD+-dependent formate dehydrogenase produced by Paracocus Sp. 12-A". Biosci. Biotech. andBiochem. 1992, v.56, N 12, p.1966-1970.

62. Colas d.F.-S., Ambard-Bretteville F., Small I.D. and Remy R. "Identification of a major soluble protein in mitochondria from nonphotosynthetic tissues as NAD-dependent formate dehydrogenase". Plant Physiol 1993, v. 102, N 4, p. 1171-1177.

63. Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.K., Yoshimura E. and Mori S. "Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots". Plant Physiol 1998, v. 116, N 2, p.725-732.

64. Тишков В.И., Галкин А.Г. and Егоров A.M. "NAD-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101: клонирование, экспрессия и изучение структуры гена.". Доклады АН СССР -1991, T.317,N3, стр. 345-348.

65. Тишков В .И. Диссетация кандидата химических наук, Москва, 1984

66. Dijken J.P., Oostra-Demkes G J., Otto R. and Harder W. "S-formyl glutathion: The substrate for formate dehydrogenase in methanol-utilizing yeasts.". Arch. Microbiol. -1976, v.llljN 1, p. 187-192.

67. Hollenberg C.P. and Janowicz Z. "DNA-molecules cloning for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses.", in European Patent Application 1989.

68. Тишков В.И., Галкин А.Г. and Егоров A.M. "NAD-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных дрожжей. Выделение и физико-химические свойства". Биохимия 1989, Т.54, N 2, стр.299-305.

69. Peacock D. and Boulter D. "Kinetic studies of formate dehydrogenase". Biochem. J. 1970, v.120, N 4, p.763-769.

70. Ohyama T. and Yamazaki I. "Purification and some properties of formate dehydrogenase". J. Biochem. (Tokyo) 1974, v.75, N 6, p.77-85.

71. Popov V.O. and Lamzin V.S. "NAD(+)-dependent formate dehydrogenase published erratum appears in Biochem J 1994 Sep 15;302(Pt 3):967.". Biochem. J. -1994, v.301 ( Pt 3) p.625-643.

72. Mesentsev A.V., Lamzin V.S., Tishkov V.I., Ustinnikova T.B. and Popov V.O. "Effect of pH on kinetic parameters of NAD+-dependent formate dehydrogenase". Biochem. J. 1997, v.321 (Pt2)p.475-480.

73. Попов B.O., Родионов Ю.В., Егоров A.M. and Березин И.В. "NAD-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий. Изучение кинетической схемы действия.". Биоорганическая химия 1978, Т.4, N 1, стр.117-129.

74. Egorov A.M., Popov V.O., Berezin I.V. and Rodionov Y.V. "Kinetic and structural properties of NAD-dependent formate dehydrogenase.". J. Solid-Phase Biochem. -1980, v.5, N 1, p.19-33 .

75. Kato N., Sahm H. and Wagfer F. "Steady-State kinetics of formaldehyde dehydrogenase and formate dehydrogenase from methanol-utilizing yeast Candida boidini". Biochim. Biophys. Acta 1979, v.566, N 1, p.12-20.

76. Blanchard J.S. and Cleland W.W. "Kinetic and chemical mechanisms of yeast formate dehydrogenase". Biochemistry 1980, v. 19, N 15, p.3543-3550.

77. Закс A.M., Авилова T.B., Егорова O.A., Попов B.O. and Березин И.В. "Кинетический механизм действия NAD-зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных дрожжей Candida methylica.". Биохимия 1982, Т.47, N 4, стр.546-551.

78. Hermes J.D., Morrical S.W., O'Leary М.Н. and Cleland W.W. "Variation of transition-state structure as a function of the nucleotide in reactions catalyzed by dehydrogenases. 2. Formate dehydrogenase". Biochemistry 1984, v.23, N 23, p.5479 5488.

79. Ruppert R., Herrmann S. and Stechman E. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1988, v.l 150-1151.

80. Saleeba J.A., Cobbett C.S. and Hynes M .J. "Characterization of the amdA-regulated aciA gene of Aspergillus nidulans". Mol. Gen. Genet. 1992, v.23 5, N 2-3, p.349-358.

81. Wong C.-H. and Whitesides G. "J. Am. Chem. Soc. 1981, v. 1034890-4899.

82. Родионов В. "Метаболизм формиата у микроорганизмов.". Успехи микробиологии 1981, Т.11, стр. 104-138.

83. Allen S.J. and Holbrook J.J. "Isolation, sequence and overexpression of the gene encoding NAD- dependent formate dehydrogenase from the methylotrophic yeast Candida methylica". Gene 1995, v. 162, N 1, p.99-104.

84. Chow C.M. and RajBhandary U.L. "Developmental regulation of the gene for formate dehydrogenase inNeurospora crassa". J. Bacteriol. 1993, v. 175, N 12, p.3703-3709.

85. Hourton-Cabassa C., Ambard-Bretteville F., Moreau F., Davy d., V, Remy R. and Francs-Small C.C. "Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves". Plant Physiol 1998, v. 116, N 2, p.627-635.

86. Le Bras G. and Garel J.R. "Properties of D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus bulgaricus: a possible different evolutionary origin for t". FEMS Microbiol. Lett. 1991, v.63, N 1, p.89-93.

87. Kutzenko A.S., Lamzin V.S. and Popov V.O. "Conserved supersecondary structural motif in NAD-dependent dehydrogenases". FEBS Lett. 1998, v.423, N 1, p.105-109.

88. Куценко A.C., Королев C.B., Ламзин B.C. and Попов B.O. "Исследование внутренней симметрии пространственной структуры NAD-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp.101.". Молекулярная Биология 1994, Т.28, N 3, стр.626-632.

89. Taguchi H. and Ohta T. "Essential role of arginine 235 in the substrate-binding of Lactobacillus plantarum D-lactate dehydrogenase". J. Biochem. (Tokyo) 1994, v.l 15, N 5, p.930-936.

90. Torres R.A., Schiott В. and Bruice T.C. "Molecular Dinamics Simulations of Ground and Transsition States for the Hydride Transfer from formate to NAD+ in the active Site of Formate Dehydrogenase". J. Am. Chem. Soc. 1999, v.1218164-8173.

91. Birgit Schiott "Theoretical investigation of the Hydride Transfer from Formate to NAD+ and the Implications for the catalytic Mechanism of Formate Dehydrogenase". 1998, v.120, p.7192-7200.

92. Cook P.F., Oppenheimer N.J. and Cleland W.W. "Secondary deuterium and nitrogen-15 isotope effects in enzyme-catalyzed reactions. Chemical mechanism of liver alcohol dehydrogenase". Biochemistry 1981, v.20, N 7, p.1817-1825.

93. Rotberg N.S. and Cleland W.W. "Secondary 15N isotope effects on the reactions catalyzed by alcohol and formate dehydrogenases". Biochemistry 1991, v.30, N 16, p.4068-4071.

94. Шабарова 3.A., Богданов A.A. and Золотухин A.C. "Химические основы генетической инженерии ". Учебное пособие. Москва. Изд-во МГУ. 1994.

95. Kunkel Т.A. "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A 1985, v.82, N 2, p.488-492.

96. Manniatis Т., Fritch E.F. and Sambrook J. "Molecular cloning: a laboratory manual". N. Y. : Cold Spring Harbor 1982.

97. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A 1977, v.74, N 12, p.5463-5467.

98. Тишков В.И., Березин И.В., Егоров A.M., Вайткявичус P.K., Кадушвичус В., Глемжа А.А., Галкин А.Г. и Петкявичене Р.И. "Выделение КАО+-зависимой формиатдегидрогеназы". Академия наук СССР 1988.

99. Kochhar S., Lamzin V.S., Razeto A., Delley M., Hottinger H. and Germond J.E. "Roles of His205, His296, His303 and Asp259 in catalysis by NAD+- specific D-lactate dehydrogenase". Eur. J. Biochem. 2000, v.267, N 6, p.1633-1639.

100. Yaughn W.M. and Weber G. "Oxygen quenching of pyrenebutyric acid fluorescence in water. Dynamic probe of the microenviroment.". Biochemistry 1970, v.9, N 3, p.464-473.

101. Tishkov V., Galkin A. and Egorov A.M. "Kinetic isotope effect and pre-steady state kinetics of the reaction catalyzed by bacterial formate dehydrogenase". Biochimie 1989,v.71,N4,p.551-557.

102. Gurr P.A., Bronskill P.M., Hanes C.S. and Wong J.T. "Purification of isoenzyme and coenzymes for kinetic study of horse liver alcohol dehydrogenase". Can. J. Biochem. 1972, v.50, N 12, p.1376-1384.

103. Hubatsch I., Maurer P., Engel D. and Adolph H.W. "Preparation and characterization of isozymes and isoforms of horse liver alcohol dehydrogenase". J. Chromatogr. A 1995, v.711, N 1, p.105-112.

104. Chen F., Okabe Y., Osano K. and Tajima S. "Purification and characterization of an NAD-malic enzyme from Bradyrhizobium japonicum A1017". Appl. Environ. Microbiol. 1998, v.64, N 10, p.4073-4075.

105. Wise D.J., Anderson C.D. and Anderson B.M. "Purification and kinetic characterization of Haemophilus parasuis malate dehydrogenase". Arch. Biochem. Biophys. 1997, v.344, N 1, p. 176-183.

106. Honka E., Fabry S., Niermann T., Palm P. and Hensel R. "Properties and primary structure of the L-malate dehydrogenase from the extremely thermophilic archaebacterium Methanothermus fervidus". Eur. J. Biochem. 1990, v.188, N 3, p.623-632.

107. Denicola-Seoane A. and Anderson B.M. "Purification and characterization of Haemophilus influenzae D-lactate dehydrogenase". J. Biol. Chem. 1990, v.265, N 7, p.3691-3696.

108. Ogata M., Arihara K. and Yagi T. "D-lactate dehydrogenase of Desulfovibrio vulgaris". J. Biochem. (Tokyo) 1981, v.89, N 5, p.1423-1431.

109. Szumilo T. and Szymona M. "Purification and properties of D-lactate dehydrogenase from Mycobacterium sp. 279". Physiol Chem. Phys. 1972, v.4, N 5, p.407-426.

110. Long G.L. "D-lactate dehydrogenase from the horseshoe crab". Methods Enzymol. 1975, v.41, p.313-318.

111. Scrutton N.S., Berry A. and Perham R.N. "Redesign of the coenzyme specificity of a dehydrogenase by protein engineering". Nature 1990, v.343, N 6253, p.38-43.

112. Clarke A.R., Atkinson T. and Holbrook J.J. "From analysis to synthesis: new ligand binding sites on the lactate dehydrogenase framework. Part II". Trends Biochem. Sei. 1989, v. 14, N 4, p. 145-148.

113. Chen R., Greer A. and Dean A.M. "A highly active decarboxylating dehydrogenase with rationally inverted coenzyme specificity". Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A- 1995, v.92, N 25, p.l 1666-11670.

114. Bocanegra J.A., Scrutton N.S. and Perham R.N. "Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering". Biochemistry 1993, v.32, N 11, p.2737-2740.

115. Nishiyama M., Birktoft J.J. and Beppu T. "Alteration of coenzyme specificity of malate dehydrogenase from Thermus flavus by site-directed mutagenesis". J. Biol. Chem. 1993, v.268, N 7, p.4656-4660.

116. Corbier C., Clermont S., Billard P., Skarzynski T., Branlant C., Wonacott A. and Branlant G. "Probing the coenzyme specificity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases by site-directed mutagenesis". Biochemistry 1990, v.29, N 30, p.7101-7106.

117. Gui K., Ma Q., Lu Ant.Y.H. and Yang C.S. "Roles of Histidinel94, Aspartatel63 and a Glycine-Rich Sequence of NAD(P)H: Quione Oxireductase in the interaction withNicotineamide Coenzymes.". Arch. Biochem. Biophys. 1995, v.323, N 2, p.265-273.

118. Wiegert T., Sahm H. and Sprenger G.A. "The substitution of a single amino acid residue (Ser-116 --> Asp) alters NADP-containing glucose-fructose oxidoreductase of

119. Zymomonas mobilis into a glucose dehydrogenase with dual coenzyme specificity". J. Biol. Chem. 1997, v.272,N20, p.13126-13133.

120. Chen Z., Tsigelny I., Lee W.R., Baker M.E. and Chang S.H. "Adding a positive charge at residue 46 of Drosophila alcohol dehydrogenase increases cofactor specificity forNADP+". FEBSLett. 1994, v.356, N 1, p.81-85.

121. Fan F., Lorenzen J.A. and Plapp B.V. "An aspartate residue in yeast alcohol dehydrogenase I determines the specificity for coenzyme". Biochemistry 1991, v.30, N 26, p.6397-6401.

122. Fan F. and Plapp B.V. "Probing the affinity and specificity of yeast alcohol dehydrogenase I for coenzymes". Arch. Biochem. Biophys. 1999, v.367, N 2, p.240-249.

123. Feeney R., Clarke A.R. and Holbrook J.J. "A single amino acid substitution in lactate dehydrogenase improves the catalytic efficiency with an alternative coenzyme". Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, v. 166, N 2, p.667-672.

124. Kikov M.M., Osipov A.P. and Egorov A.M. "Role of sulfhydryl groups in the inactivation mechanism of bacterial formate dehydrogenase". Biokhimiia. 1980, v.45, N9, p.1554-1559.

125. Чанг Р. "Физическая химия с приложениями к биологическим Москва, Из-во 'Мир" 1980.