Повышение термостабильности бактериальной формиатдегидрогеназы методом направленного мутагенеза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

I. Введение.

II. Обзор литературы.

Глава 1. Стабилизация белков.

1.1 Общие положения.

1.2 Физико-химические методы.

1.3 Методы белковой инженерии.

1.3.1 Создание дополнительных 8-8 связей.

1.3.2 Повышение жесткости полипептидной цепи.

1.3.3 Оптимизация электростатических взаимодействий.

1.3.4 Гидрофобизация белковой глобулы.

1.3.5 Основы пространственного строения полипептидной цепи.

1.3.6 Снятие конформационных напряжений.

1.3.7 Другие методы.

1.4 Стабилизация МАБ+-зависимых формиатдегидрогеназ.

1.4.1 Сравнение аминокислотных последовательностей.

1.4.2 Механизмы инактивации ФДГ.

Глава 2. Очистка белков в двухфазных системах.

III. Экспериментальная часть.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1 Материалы.

3.2 Методы исследования.

IV. Результаты и их обсуждение.

4.1. Влияние ионной силы на термостабильность ФДГ.

4.2 Роль аминокислотного остатка в положении 61 в стабильности бактериальных ФДГ.

4.3 Мутагенез остатков Азр13, 01иЮ6, 01и170 и С1и391.

4.3.1 Мутагенез остатка Азр13.

4.3.2 Мутагенез остатка С1и170.

4.3.3 Мутагенез остатков 01и106 и 01и391.

4.3.4 Температурные зависимости термоинактивации.

4.4 Мутагенез остатка А1а198 и мутант Т7.

4.5 Разработка метода крупномасштабной очистки формиатдегидрогеназы с помощью двухфазных систем.

4.5.1. Оптимизация состава двухфазных систем.

4.5.2. Оптимизация очистки формиатдегидрогеназы термообработкой биомассы.

V. Выводы.

VI. Литература.

Последние десятилетия биотехнологические процессы все больше и больше теснят классические технологии. Ферменты используются в пищевой и текстильной промышленности, в производстве лекарственных препаратов и тонком органическом синтезе, в аналитических системах и как добавки к различным моющим средствам. Однако, более активное внедрение ферментативных процессов в различные области человеческой деятельности сдерживается рядом факторов. К этим факторам можно отнести:

- трудность отделения ферментов от исходных реагентов и продуктов реакции по завершении процесса;

- недостаточная стабильность большинства ферментов;

- трудоемкость получения чистых ферментов в больших количествах;

- дороговизна кофакторов многих ферментов, что исключает их промышленное использование без систем регенерации кофактора.

Одним из ферментов, который в настоящее время представляет большой теоретический и практический интерес, является КАЕ)+-зависимая формиатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.2, ФДГ). Этот фермент катализирует реакцию окисления формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH и интересен тем, что является наилучшим ферментом для систем регенерации NADH, который используется в качестве кофактора несколькими сотнями дегидрогеназ [1]. Превосходство ФДГ над другими ферментами при использовании в системе регенерации NADH обусловлено необратимостью катализируемой реакции, широким pH оптимумом, строгой специфичностью фермента, а также дешевизной второго субстрата - формиата. Наиболее высокой удельной активностью и стабильностью обладает изучаемая в нашей лаборатории ФДГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101. Ген этого фермента был клонирован и экспрессирован в клетках Е. coli [2]. Оказалось, что благодаря отсутствию посттрансляционной модификации ФДГ в клетках Е. coli рекомбинантный фермент превосходит по своим кинетическим характеристикам нативную ФДГ, выделенную из Pseudomonas sp. 101 [3]. Оптимизированная система экспрессии ФДГ позволяет получить фермент в растворимой и активной форме с выходом до 50-60% от всех растворимых белков Е. coli. В нашей лаборатории также был получена мутантная ФДГ специфичная к NADP+. Этот мутант был успешно использован для создания системы регенерации NADPH [4,5].

Несмотря на то, что ФДГ из Pseudomonas ¿р. 101 является самой стабильной из всех известных в настоящее время формиатдегидрогеназ, ее стабильность в ряде случаев недостаточна, например, для использования в системах регенерации NADH с сопряженными ферментами из термофилов. Кроме того, изучение связи структуры и стабильности белков является одной из актуальнейших задач и фундаментальной науки. В нашей лаборатории проводились эксперименты по повышению термостабильности ФДГ с использованием подходов, основанных на гидрофобизации а-спиралей и вытеснении молекул воды из внутренних полостей белковой глобулы [6,7]. В результате был получен содержащий шесть аминокислотных замен мутант формиатдегидрогеназы Т6. Этот мутант был 9 раз стабильнее исходного фермента, причем такое повышение стабильности было достигнуто без изменения кинетических характеристик ФДГ. Однако, кроме гидрофобных существенное влияние на стабильность белковой глобулы могут играть и другие взаимодействия. Одними из самых сильных среди нековалентных взаимодействий являются электростатические. Роль этих взаимодействий в стабильности нашего фермента еще не исследовалась. Кроме того, анализ карты Рамачандрана свидетельствует, что ряд аминокислотных остатков имеет конформацию далекую от оптимальной [8]. Поэтому оптимизация электростатических взаимодействий и снятие конформационных напряжений могут быть одними из путей дальнейшего повышения стабильности ФДГ.

Целью данной работы являлось: 1) дальнейшее повышение термостабильности ФДГ с использованием подходов, основанных на оптимизации

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

V. выводы.

1. Изучено влияние ионной силы на термостабильность бактериальной формиатдегидрогеназы. Показана важная роль электростатических взаимодействий в стабильности ФДГ из Pseudomonas sp. 101, в отличие от фермента из Moraxella С-1, где главную роль в стабильности играют гидрофобные взаимодействия.

2. Показана важность ионной пары Asp43-Lys61 для стабильности бактериальной формиатдегидрогеназы. Ее удаление приводит к 6 кратному снижению термостабильности фермента.

3. Показана возможность оптимизации структуры электростатических взаимодействий в белковой глобуле. Наибольший стабилизирующий эффект был достигнут в случае мутанта Glul70Asp который на 40% стабильнее фермента дикого типа.

4. Проведена оптимизация конформации полипептидной цепи ФДГ путем замены Alal98Gly. Достигнуто повышение термостабильности формиатдегидрогеназы в 2,5 раза и улучшение сродства фермента к NAD+ в 2 раза. Введение мутации Alal98Gly в полученный ранее мутант ФДГ Т6 повысило термостабильность фермента по сравнению с мутантом Т6 и формиатдегидрогеназой дикого типа в 2 и 18 раз, соответственно.

5. Разработана система крупномасштабной очистки формиатдегидрогеназы на основе двухфазных систем ПЭГ-соль-вода, включающая стадию термообработки, и позволяющая получать ФДГ с чистотой до 90% и выходом 75-80%.

107

1. Hummel W. and Kula M.R. Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. Eur. JBiochem - 1989, v. 184, N 1, p.1-13.

2. Tishkov V.I., Galkin A.G., Marchenko G.N., Tsygankov Y.D. and Egorov A.M. Formate dehydrogenase from methylotrophyc bacterium Pseudomonas sp.\0l\ gene cloning and expression in Escherichia coli. Biotechnol. Biochem. Appl. 1993, v. 18, p.201-207.

3. Тишков В.И., Галкин А.Г., Гладышев B.H., Карзанов В.В. и Егоров A.M. Анализ структуры гена, оптимизация экспрессии в Е. coli и свойства рекомбинантной формиатдегидрогеназы бактерий Pseudomonas ^р.101. Биотехнология 1992, т.5, с.52-59.

4. Seelbach К., Riebel В., Hummel W., Kula M.-R., Tishkov V.I., Egorov A.M., Wandrey C. and Kragl U. A novel, efficient regeneration method of NADPH by using new formate dehydrogenase. Tetrahedron Letters 1996, v.37, N 9, p. 13771380.

5. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V. and Tishkov V.I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of a-helices. FEBS Letters 1999, v.445, N 1, p.183-188.

6. Рожкова A.M. Стабилизация бактериальной формиатдегидрогеназы гидрофобизацией белковой глобулы методом направленного мутагенеза. Диссетация кандидата химических наук 1999, Москва, МГУ.108

7. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H. and Wilson K.S. High resolution structure of holo and apo formate dehydrogenase. Journal of Molecular Biology 1994, v.236, p.759-785.

8. Baldwin R.L. and Eisenberg D. Protein Engineering 1987, p.127-148.

9. Jaenicke R. Protein Stability and Molecular Adaptation to Extreme Conditions. European Journal of Biochemistry 1991, v.202, N 3, p.715-728.

10. Березин И.В., Клячко H.JI., Левашов A.B., Мартинек К., Можаев В.В. и Хмельницкий Л. Иммобилизованные ферменты. Биотехнология 1987, Москва, Высшая школа

11. Дебабов В.Г. и Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. Биотехнология 1988, Москва, Высшая школа

12. Arnold F.H. and Volkov A.A. Directed evolution of biocatalysts. Curr. Opin. Chem Biol 1999, v.3, N 1, p.54-59.

13. Arnold F.H., Giver L., Gershenson A., Zhao H. and Miyazaki K. Directed evolution of mesophilic enzymes into their thermophilic counterparts. Ann N Y Acad Sci -1999, v.870, p.400-403.

14. Langridge J. Genetic and enzymatic experiments relating to the tertiary structure of beta-galactosidase. Journal of Bacteriology 1968, v.96, N5, p. 1711-1717.

15. Lee B. and Vasmatzis G. Stabilization of protein structures. Current Opinion in Biotechnology 1997, v.8, p.423-428.

16. Daniel R.M. The upper limits of enzyme thermal stability. Enzyme and Microbial Technology 1996, v.19,N 1, p.74-79.

17. Akanuma S., Yamagishi A., Tanaka N. and Oshima T. Serial increase in the thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Bacillus subtilis by experimental evolution. Protein Science 1998, v.7, N 3, p.698-705.

18. Щелкунов C.H. Генетическая инженерия. 1994, Новосибирск, Новосибирский Университет109

19. Vandenburg B., Dijkstra B.W., Vriend G., Vandervinne B., Venema G. and Eijsink V.G.H. Protein Stabilization by Hydrophobic Interactions at the Surface. European Journal of Biochemistry 1994, v.220, N 3, p.981-985.

20. Popov V.O. and Lamzin V.S. NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem J -1994, v.301 ( Pt 3), p.625-643.

21. Vogt G., Woell S. and Argos P. Protein thermal stability, hydrogen bonds, and ion pairs. Journal of Molecular Biology 1997, v.269, N 4, p.631-643.

22. Vogt G. and Argos P. Protein thermal stability: hydrogen bonds or internal packing? Folding & Design 1997, v.2, N 4, p.S40-S46.

23. Menendez-Arias L. and Argos P. Engineering protein thermal stability. Sequence statistics point to residue substitutions in a-helices. J Mol Biol 1989, v.206, N 2, p.397-406.

24. Pace C.N., Grimsley G.R., Thomson J.A. and Barnett B.J. Conformational stability and activity of ribonuclease T1 with zero, one, and two intact disulfide bonds. J. Biol. Chem. 1988, v.263,p.l 1820-11825.

25. Gokhale R.S., Agarwalla S., Francis V.S., Santi D.V. and Balaram P. Thermal Stabilization of Thymidylate Synthase by Engineering Two Disulfide Bridges Across the Dimer Interface. Journal of Molecular Biology 1994, v.235, N 1, p.89-94.

26. Reiter Y., Brinkmann U., Lee B. and Pastan I. Engineering antibody Fv fragments for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. Nat. Biotechnol. 1996,v.l4,p.l239-1245.

27. Zhou N.E., Kay C.M. and Hodges R.S. Disulfide Bond Contribution to Protein Stability Positional Effects of Substitution in the Hydrophobic Core of the 2-Stranded alpha-Helical Coiled-Coil. Biochemistry - 1993, v.32, N 12, p.3178-3187.

28. Betz S.F. Disulfide bonds and the stability of globular proteins. Protein Science -1993, v.2, p.1551-1558.

29. Hinck A.P., Truckses D.M. and Markley J.L. Engineered disulfide bonds in staphylococcal nuclease: effects on the stability and conformation of the folded protein. Biochemistry 1996, v.35, p. 10328-10338.

30. Betz S.F. and Pielak G.J. Introduction of a disulfide bond into cytochrome c stabilizes a compact denatured state. Biochemistry 1992, v.31, p.12337-12344.

31. Betz S.F., Marmorino J.L., Saunders A.J., Doyle D.F., Young G.B. and Pielak G.J. Unusual effects of an engineered disulfide on global and local protein stability. Biochemistry 1996, v.35, N 23, p.7422-7428.

32. Huang W., Petrosino J., Hirsch M., Shenkin P.S. and Palzkill T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol 1996, v.258, N 4, p.688-703.

33. Cannio R., Rossi M. and Bartolucci S. A few amino acid substitutions are responsible for the higher thermostability of a novel NAD(+)-dependent bacillar alcohol dehydrogenase. Eur. JBiochem 1994, v.222, N 2, p.345-352.

34. Feller G., Zekhnini Z., Lamotte-Brasseur J. and Gerday C. Enzymes from cold-adapted microorganisms. The class С beta-lactamase from the antarctic psychrophile Psychrobacter immobilis A5. Eur. J Biochem 1997, v.244, N 1, p. 186-191.

35. Matthews B.W. Structural and genetic analysis of protein stability. Annu. Rev. Biochem 1993, v.62, p. 139-160.

36. Ishikawa K., Kimura S., Kanaya S., Morikawa K. and Nakamura H. Structural study of mutants of Escherichia coli ribonuclease HI with enhanced thermostability. Protein Engineering 1993, v.6, N 1, p.85-91.

37. Gekko K., Kunori Y., Takeuchi H., Ichihara S. and Kodama M. Point mutations at glycine-121 of Escherichia coli dihydrofolate reductase: important roles of a flexible loop in the stability and function. J Biochem (Tokyo) 1994, v. 116, N 1, p.34-41.

38. Brunet A.P., Huang E.S., Huffine M.E., Loeb J.E., Weltman R.J. and Hecht M.H. The role of turns in the structure of an a-helical protein. Nature 1993, v.364, N 6435, p.355-358.

39. Янике P. Что можно узнать о стабильности белка из исследований ультрастабильных глобулярных белков. Биохимия 1998, v.63, N 3, р.370-380.

40. Hendsch Z.S., Jonsson T., Sauer R.T. and Tidor B. Protein stabilization by removal of unsatisfied polar groups: computational approaches and experimental tests. Biochemistry 1996, v.35, p.7621-7625.

41. Szilagyi A. and Zavodszky P. Structural basis for the extreme thermostability of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Thermotoga maritima: analysis based on homology modelling. Protein Engineering 1995, v.8, N 8, p.779-789.

42. Tanner J.J., Hecht R.M. and Krause K.L. Determinants of enzyme thermostability observed in the molecular structure of Thermus aquaticus D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase at 25 Angstroms Resolution. Biochemistry 1996, v.35, N 8, p.2597-2609.

43. Ladbury J.E., Wynn R., Thomson J.A. and Sturtevant J.M. Substitution of charged residues into the hydrophobic core of Escherichia coli thioredoxin results in a change in heat capacity of the native protein. Biochemistry 1995, v.34, N 7, p.2148-2152.

44. Tissot A.C., Vuilleumier S. and Fersht A.R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry 1996, v.35, p.6786-6794.

45. Anderson D.E., Becktel W.J. and Dahlquist F.W. pH-induced denaturation of proteins: a single salt bridge contributes 3-5 kcal/mol to the free energy of folding of T4 lysozyme. Biochemistry 1990, v.29, p.2403-2408.

46. Waldburger C.D., Jonsson T. and Sauer R.T. Are buried salt bridges important for protein stability and conformational specificity? Nat. Struct. Biol. 1995, v.2, p. 122128.

47. Dao-pin S., Anderson D.E., Baase W.A., Dahlquist F.W. and Matthews B.W. Structural and thermodynamic consequences of burying a charged residue within the hydrophobic core of T4 lysozyme. Biochemistry 1991, v.30, p. 11521-11529.

48. Scholtz J.M., Qian H., Robbins V.H. and Baldwin R.L. The energetics of ion-pair and hydrogen-bonding interactions in a helical peptide. Biochemistry 1993, v.32, p.9668-9676.

49. Huyghues-Despointes B.M. and Baldwin R.L. Ion-pair and charged hydrogen-bond interactions between histidine and aspartate in a peptide helix. Biochemistry 1997, v.36, p. 1965-1970.

50. Krylov D., Mikhailenko I. and Vinson C. A thermodynamic scale for leucine zipper stability and dimerization specificity: e and g interhelical interactions. EMBO J. -1994, v.13, p.2849-2861.

51. Zhou N.E., Kay C.M. and Hodges R.S. The net energetic contribution of interhelical electrostatic attractions to coiled-coil stability. Protein Engineering 1994, v.7, p.1365-1372.

52. Lumb K.J. and Kim P.S. Measurement of interhelical electrostatic interactions in the GCN4 leucine zipper. Science 1995, v.268, p.436-439.

53. Fairman R., Chao H.G., Lavoie T.B., Villafranca J .J., Matsueda G.R. and Novotny J. Design of heterotetrameric coiled coils: evidence for increased stabilization by Glu"-Lys+ ion pair interactions. Biochemistry 1996, v.35, p.2824-2829.

54. Matthews B.W. Structural and Genetic Analysis of Protein Stability. Annual Review of Biochemistry 1993, v.62, p. 139-160.

55. Akanuma S., Qu C., Yamagishi A., Tanaka N. and Oshima T. Effect of polar side chains at position 172 on thermal stability of 3- isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus. FEBS Lett 1997, v.410, N 2-3, p.141-144.

56. White P.J., Squirrell D.J., Arnaud P., Lowe C.R. and Murray J.A. Improved thermostability of the North American firefly luciferase: saturation mutagenesis at position 354. Biochem J- 1996, v.319 (Pt 2), p.343-350.- 114

57. Goward C.R., Miller J., Nicholls D.J., Irons L.I., Scawen M.D., O'Brien R. and Chowdhry B.Z. A single amino acid mutation enhances the thermal stability of Escherichia coli malate dehydrogenase. Eur. J Biochem 1994, v.224, N 1, p.249-255.

58. Rose G.D., Geselowitz A.R., Lesser GJ., Lee R.H. and Zehfus M.H. Hydrophobicity of amino acid residues in globular proteins. Science 1985, v.229, N 4716, p.834-838.

59. Imada K., Sato M., Tanaka N., Katsube Y., Matsuura Y. and Oshima T. Three-dimensional structure of a highly thermostable enzyme, 3- isopropylmalate dehydrogenase of Thermus thermophilus at 2.2 A resolution. J Mol Biol 1991, v.222, N 3, p.725-738.

60. Arnone M.I., Birolo L., Pascarella S., Cubellis M.V., Bossa F., Sannia G. and Marino G. Stability of aspartate aminotransferase from Sulfolobus solfataricus. Protein Engineering 1997, v.10, N 3, p.237-248.

61. Korndorfer I., Steipe B., Huber R., Tomschy A. and Jaenicke R. The crystal structure of holo-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima at 2.5 A resolution. J Mol Biol -1995, v.246,N 4, p.511-521.

62. Serrano L., Day A.G. and Fersht A.R. Step-wise mutation of barnase to binase. A procedure for engineering increased stability of proteins and an experimental analysis of the evolution of protein stability. J Mol Biol 1993, v.233, N 2, p.305-312.-115

63. Petukhov M., Kil Y., Kuramitsu S. and Lanzov V. Insights into thermal resistance of proteins from the intrinsic stability of their alpha-helices. Proteins 1997, v.29, N 3, p.309-320.

64. Declerck N., Joyet P., Trosset J.Y., Gamier J. and Gaillardin C. Hyperthermostable mutants of Bacillus licheniformis alpha-amylase: multiple amino acid replacements and molecular modelling. Protein Engineering 1995, v.8, N 10, p.1029-1037.

65. Kajiyama N. and Nakano E. Thermostabilization of firefly luciferase by a single amino acid substitution at position 217. Biochemistry 1993, v.32, N 50, p. 1379513799.

66. Jackson S.E., Moracci M., elMasry N., Johnson C.M. and Fersht A.R. Effect of cavity-creating mutations in the hydrophobic core of chymotrypsin inhibitor 2. Biochemistry 1993, v.32, N 42, p.l 1259-11269.

67. Березин И.В. и Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. 1977, Москва, Высшая Школа

68. Aoshima М. and Oshima Т. Stabilization of Escherichia coli isopropylmalate dehydrogenase by single amino acid substitution. Protein Engineering 1997, v. 10, N 3, p.249-254.

69. Declerck N., Machius M., Chambert R., Wiegand G., Huber R. and Gaillardin C. Hyperthermostable mutants of Bacillus licheniformis alpha-amylase: thermodynamic studies and structural interpretation. Protein Engineering 1997, v. 10, N 5, p.541-549.

70. Ohage E.C., Graml W., Walter M.M., Steinbacher S. and Steipe B. Beta-turn propensities as paradigms for the analysis of structural motifs to engineer protein stability. Protein Science 1997, v.6, N 1, p.233-241.

71. Shih P. and Kirsch J.F. Design and structural analysis of an engineered thermostable chicken lysozyme. Protein Science 1995, v.4, N 10, p.2063-2072.

72. Anderson D.E., Hurley J.H., Nicholson H., Baase W.A. and Matthews B.W. Hydrophobic core repacking and aromatic-aromatic interaction in the thermostable mutant of T4 lysozyme Ser 117~>Phe. Protein Science 1993, v.2, N 8, p. 12851290.

73. Chen Y.W., Fersht A.R. and Henrick K. Contribution of buried hydrogen bonds to protein stability. The crystal structures of two barnase mutants. J Mol Biol 1993, v.234, N 4, p. 1158-1170.

74. Кантор Ч. и Шиммел П. Биофизическая химия. 1994, Москва, МИР

75. Brant D.A. Conformational analysis of biopolymers: conformational energy calculations. Annu. Rev. Biophys Bioeng 1972, v.l, p.369-408.

76. Gunasekaran K., Ramakrishnan C. and Balaram P. Disallowed Ramachandran conformations of amino acid residues in protein structures. J Mol Biol 1996, v.264, N 1, p.191-198.

77. Ramakrishnan C., Srinivasan N. and Prashanth D. Conformation of glycyl residues in globular proteins. Int. JPept. Protein Res 1987, v.29, N 5, p.629-637.

78. Wilmot C.M. and Thornton J.M. p-turns and their distortions: a proposed new nomenclature. Protein Engineering 1990, v.3, N 6, p.479-493.

79. Hutchinson E.G. and Thornton J.M. A revised set of potentials for beta-turn formation in proteins. Protein Science 1994, v.3, N 12, p.2207-2216.

80. Rajashankar K.R. and Ramakumar S. 7r-turns in proteins and peptides: Classification, conformation, occurrence, hydration and sequence. Protein Science -1996, v.5, N 5, p.932-946.

81. Weaver L.H., Tronrud D.E., Nicholson H. and Marrews B.W. Some uses of Ramachandran ((p,i|/) diagram in the structural analysis of lysozymes. Current Science 1990, v.59, p.833-837.

82. Jia Z., Vandonselaar M., Quail J.W. and Delbaere L.T. Active-centre torsion-angle strain revealed in 1.6 A-resolution structure of histidine-containing phosphocarrier protein. Nature 1993, v.361, N 6407, p.94-97.-117

83. Zeng C., Aleshin A.E., Chen G., Honzatko R.B. and Fromm H.J. The roles of glycine residues in the ATP binding site of human brain hexokinase. J Biol Chern -1998, v.273, N 2, p.700-704.

84. Karzanov V.V., Bogatsky Y., Tishkov Y.I. and Egorov A.M. Evidence for the presence of a new NAD+-dependent formate dehydrogenase in Pseudomonas sp. 101 cells grown on a molybdenum-containing medium. FEMS Microbiol Lett -1989, v.51,N 1, p. 197-200.

85. Shaked Z. and Whitesides G.M. Enzyme-catalyzed organic synthesis: NADH regeneration by using formate dehydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 1980.

86. Wichmann R., Wandrey C., Buckmann A.F. and Kula M.-R. Continuos enzymatic transformation in an enzyme membrane reactor with simultaneous NAD(P)H regeneration. Biotechnol. andBioeng. 1981, v.23, N 12, p.2789-2802.

87. Егоров A.M. и Осипов А.П. Уточнить название. Прикладная биохимия и микробиология 1982, т. 18, N 4, с.515-524.

88. Тишков В.И. и Егоров A.M. 1986, v.1271783, N 43, p.

89. Methods of Enzymatic Food Analysis 1984, Boehringer Mannhaim, p.23.

90. Тишков В.И. Структура, механизм действия и белковая инженерия NAD-зависимой формиатдегидрогеназы. Диссертация доктора химических наук -1993, Москва, МГУ.

91. Galkin A.G. GenBank direct submission (accession number Y13245) 1997.

92. Galkin A.G., Kulakova L.B., Tishkov V.I., Esaki N. and Soda K. Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol-utilizing bacterium Mycobacterium vaccae N10. Applied Microbiology and Biotechnology 1995, v.44, N 3-4, p.479-483.-119

93. Allen S.J. and Holbrook J.J. Isolation, sequence and overexpression of the gene encoding NAD- dependent formate dehydrogenase from the methylotrophic yeast Candida methylica. Gene 1995, v.162, N 1, p.99-104.

94. Hollenberg C.P. and Janowicz Z.A. DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses. European Patent Application 1989.

95. Delius H., Hebling U. and Hofmann B. GenBank direct submission (accession number Z75296)- 1996.

96. Desprez T., Amselem J., Chiapello H., Rouze P., Caboche M. and Hofte H. The Arabidopsis thaliana transcribed genome: the GDR cDNA program (GenBank accession numbers Z30777, Z30880) 1994.

97. Colas des Francs-Small, Ambard-Bretteville F., Small I.D. and Remy R. Identification of a major soluble protein in mitochondria from nonphotosynthetic tissues as NAD-dependent formate dehydrogenase. Plant Physiol 1993, v. 102, N 4, p.l 171-1177.

98. Sasaki T. and Minobe Y. Rice cDNA from callus (GenBank accession numbers D15743,D23989)- 1999.

99. Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.K., Yoshimura E. and Mori S. Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol 1998, v. 116, N 2, p.725-732.

100. Chow C.M. and RajBhandary U.L. Developmental regulation of the gene for formate dehydrogenase in Neurospora crassa. J Bacteriol 1993, v. 175, N 12, p.3703-3709.

101. Saleeba J.A., Cobbett C.S. and Hynes M.J. Characterization of the amdA-regulated aciA gene of Aspergillus nidulans. Mol Gen. Genet. 1992, v.235, N 2-3, p.349-358.-120

102. Wu S.-C., Bernstein B.D., Darvill A.G. and Albersheim P. Expressed sequence tags of the rice blast fungus grown on rice cell walls (GenBank accession number AA415108)- 1999.

103. Ok S.H., Chung Y.S. and Shin J.S. Generation of Expressed Sequence Tags of Watermelon Leaf cDNAs (GenBank accession number AA660126) 1997.

104. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W. and Lipman D.J. Basic local alignment search tool. JMolBiol 1990, v.215, N 3, p.403-410.

105. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Rapp B.A. and Wheeler D.L. GenBank. Nucleic Acids Res 2000, v.28, N 1, p. 15-18.

106. Диков M.M., Карулин А.Ю., Осипов А.П. и Егоров A.M. Изучение методом аналитического изотахофореза изменений структуры формиатдегидрогеназы при ее инактивации. Биоорганическая химия 1979, т.5, N 8, с.1217-1221.

107. Тишков В.И., Галкин А.Г. и Егоров A.M. NAD-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных дрожжей. Выделение и физикохимические свойства. Биохимия 1989, т.54, N 2, с.299-305.

108. Albertson Р.А. Biochim. etBiophys. Acta 1958, v.27.

109. Albertson Р.А. Partitioning in aqueous two-phase systems. Theory, methods, uses and application to biotechnology. 1985, Orlando, Academic

110. Bronsted J.N. Z. phys. Chem. 1931, v.A (Bodenstein-Festband), p.257

111. Bronsted J.N. Z. phys. Chem. 1931, v.A, v.155, p.343

112. Шабарова 3.A., Богданов А.А. и Золотухин A.C. Химические основы генетической инженерии. 1994, Учебное пособие.

113. Kunkel Т.A. Rapid and efficient site-derected mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, v.82, p.488-492.

114. Manniatis Т., Fritch E.F. and Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. 1982, New-York, Cold Spring Harbor.

115. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, v.74, N 12, p.5463-5467.

116. Тишков В.И., Галкин А.Г., Егоров A.M., Кадушевичюс B.A., Петкявичене Р.И., Вайткявичюс Р.-К. и Глемжа А.А. Способ выделения фомиатдегидогеназы. 1990, АС N1551741.

117. Cornish-Bowden A. Principles of Enzyme Kinetics. 1976, London, Boston, Butterworth & Co

118. Маторин А.Д. Механизм субстратной и коферментативной специфицности бактериальной формиатдегидрогеназы. Диссертация кандидата химических наук 2000, Москва, МГУ.

119. Савицкий П. А. Влияние регуляторных элементов и структуры ко донов на экспрессию бактериальной формиатдегидрогеназы в клетках E.coli. Диссетация кандидата химических наук 1999, Москва, МГУ.

120. Weuster-Botz D., Paschold Н., Gieren Н., Kula M.-R. and Wandrey С. Continuous computer controlled production of formate dehydrogenase (FDH) and isolation on a pilot scale. Chem. Eng. Technol. 1994, v.17, p.131-137.