Взаимосвязь структуры и свойств рекомбинантных формиатдегидрогеназ из пекарских дрожжей и метилотрофных бактерий тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ NAD+-ЗАВИСИМОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.

2.1.1. Физико-химические свойства NAD+-3ABHCHMbix формиатдегидрогеназ из различных источников.

2.1.2. Сравнение аминокислотных последовательностей ЫАБ+-зависимых формиатдегидрогеназ.

2.1.3. Трехмерная структура NAI^-зависимой формиатдегидрогеназы из pseudomonas SP. 101.

2.1.4. Молекулярный механизм формиатдегидрогеназ.

2.1.5. Механизмы инактивации формиатдегидрогеназ при различных температурах.

2.2. ИЗМЕНЕНИЕ КОФЕРМЕНТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ФЕРМЕНТОВ МЕТОДОМ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА.

2.2.1. Биологическая роль никотинамидных коферментов.

2.2.2. Общие закономерности связывания никотинамидных коферментов в активных центрах дегидрогеназ.

2.2.3. Изменение коферментной специфичности КАО(Н)-зависимых ферментов.

2.2.4. Изменение коферментной специфичности NADP(H)-3abhchmmx ферментов.

2.2.5. Практическая значимость работ по изменению коферментной специфичности.

2.3. ВЛИЯНИЕ ЖЕСТКОСТИ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ НА СТАБИЛЬНОСТЬ И КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ.

2.3.1. Остаток пролина.

2.3.2. Остаток глицина.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 МАТЕРИАЛЫ.

3.2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.2.1. Синтез олигонуклеотидов.

3.2.2. Трансформация клеток Е. сои.

3.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.4. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.5. Рестрикция плазмидной ДНК.

3.2.6. Выделение рестрикционных фрагментов.

3.2.7. Лигирование фрагментов ДНК.

3.2.8. СеквенированиеДНК.

3.2.9. Клонирование гена формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей.

3.2.10. Проведение реакции мутагенеза формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей.

3.2.11. Проведение реакции мутагенеза формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101.

3.2.12. Получение фазмидной ДНК в одноцепочечной форме для реакции направленного мутагенеза формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101.

3.2.13. Выделение фага-помощника М13К07.

3.2.14. Определение количества бляшкообразующих единиц фага.

3.2.15. Наработка биомассы.

3.2.16. Выделение формиатдегидрогеназы.

3.2.17. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-электрофорез).

3.2.18. Кинетические эксперименты с бактериальной и дрожжевой формиатдегидрогеназами.

3.2.19. Спектральные характеристики и тушение собственной флуоресценции формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей.

3.2.20. Исследование термостабильности бактериальной и дрожжевой формиатдегидрогеназ.

3.2.21. Анализ кинетических данных.

3.2.22. Анализ трехмерных структур бактериальной и дрожжевой формиатдегидрогеназ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Клонирование гена формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей.

4.2. Экспрессия гена формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей в клетках e.coli.

4.3. Механизм термоинактивации и стабилизация формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей.

4.4. Кинетический механизм формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей.

4.5. Влияние аминокислоных остатков рядом с каталитически важной парой Gln-His на термостабильность и кинетические свойства дрожжевой и бактериальной формиатдегидрогеназ.

4.6. Влияние конформации полипептидной цепи на термостабильность формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp. 101.

4.7. Изменение коферментной специфичности формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей.

5. ВЫВОДЫ.

NAD+-3aBHCHMaa формиатдегидрогеназа (ФДГ; КФ 1.2.1.2) катализирует реакцию .окисления формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH.

NAD+ + НСОСГ -> NADH + С02

Поскольку формиат-ион является очень простым по своей структуре субстратом, а сама ферментативная реакция не включает в себя стадии с участием протонов, ФДГ представляет собой удобную модель для изучения общих закономерностей механизма переноса гидрид-иона в активном центре дегидрогеназ. Практическая ценность ФДГ заключается в том, что этот фермент - наилучший биокатализатор для регенерации NADH in situ в процессах ферментативного синтеза оптически активных соединений.

Несколько научных групп в России, США, Великобритании, Германии, Японии и Греции в настоящее время ведут активные исследования ФДГ с применением метода направленного мутагенеза. Можно выделить четыре основных направления данных исследований:

1) Изменение коферментной специфичности ФДГ.

2) Выяснение взаимосвязи структуры и стабильности ФДГ.

3) Изучение молекулярного механизма ФДГ.

4) Разработка биотехнологических процессов с участием ФДГ.

До последнего времени систематически изучались только ФДГ из метилотрофных бактерий (Pseudomonas sp. 101, Moraxella С-1 и Mycobacterium vaccae N10) и низших метилотрофных дрожжей (Candida methylica и Candida boidinii). Были клонированы гены этих ферментов и созданы векторные конструкции, обеспечивающие их эффективную экспрессию в клетках E.coli. Методом рентгеноструктурного анализа определены трехмерные структуры апо- и холо-форм ФДГ из Pseudomonas sp.101 (РэеФДГ). При проведении исследований по перечисленным выше направлениям в ФДГ из бактерий и низших дрожжей было введено несколько десятков мутаций.

Гены ФДГ обнаружены не только в бактериях и метилотрофных дрожжах, но и в высших дрожжах, грибах, высших растениях и даже млекопитающих. На настоящий момент становится актуальной задача по выделению и изучению свойств новых ФДГ из организмов, находящихся на более высокой ступени эволюционного развития. Следует отметить, что ФДГ является высоко консервативным белком с общим уровнем абсолютной гомологии более 50%. Среди недавно обнаруженных ФДГ особое внимание привлекает фермент из пекарских дрожжей (8сеФДГ). Ряд консервативных для других формиатдегидрогеназ остатков, в том числе и в районе активного центра, в БсеФДГ заменен на другие аминокислоты. Так, в этом ферменте на месте консервативных Pro перед каталитически важными остатками Gln-ЗОО и His-324 расположены Lys и Val. Из особенностей первичной структуры 8сеФДГ также следует упомянуть общее пониженное содержание остатков Pro (в 2 раза меньше по сравнению с РвеФДГ); замену консервативного His на Phe в 73 положении (гидрофобная стенка активного центра); вставку Pro-Gin-Pro после 50-ого аминокислотного остатка и вставку из 12 аминокислот после 209 аминокислотного остатка. Сравнительное изучение свойств 8сеФДГ и наиболее исследованного фермента данной группы, РвеФДГ, позволит получить дополнительную информацию о роли упомянутых консервативных остатков в стабильности и кинетическом поведении ФДГ в целом. Кроме того, геном пекарских дрожжей рассматривается как модель для изучения высших эукариот [1], что вызывает дополнительный интерес к белкам, выделенным из этого организма.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Клонирован ген формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей (8сеФДГ) и осуществлена его экспрессия в клетках E.coli в виде активного растворимого фермента. Уровень экспрессии составил до 25-30% от общего количества растворимых клеточных белков.

2. Изучен механизм термоинактивации БсеФДГ. Показано, что кинетический механизм инактивации этого фермента отличается от соответствующих механизмов для ФДГ из бактерий и метилотрофных дрожжей. Процесс состоит из двух кинетически различимых стадий, причем первая стадия является обратимой. Повышение ионной силы стабилизирует БсеФДГ на 10-15 °С. Кроме того, наблюдается специфическая стабилизация фермента кофактором.

3. Определен кинетический механизм 8сеФДГ. Фермент окисляет формиат-ион по двухсубстратной упорядоченной кинетической схеме, где первым присоединяемым субстратом является кофактор. Эта схема характерна и для других эукариотических ФДГ. Кинетические константы 8сеФДГ и их рН-зависимости похожи на соответствующие константы и зависимости для остальных ферментов этой группы. Однако в щелочной области кинетика катализируемой 8сеФДГ реакции не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен.

4. Изучено влияние остатка Pro перед участвующим в катализе и связывании субстрата остатком His на стабильность и кинетические свойства ФДГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 (РэеФДГ) и пекарских дрожжей. Получены мутанты 8сеФДГ V323P и РэеФДГ P331Y. Замена V323P стабилизировала 8сеФДГ в 34 раза, вызвав резкое ухудшение кинетических свойств этого фермента и переход к немихаэлисовской кинетике при рН 7. В результате обратной мутации P331V в бактериальной ФДГ ее термостабильность уменьшилась в 34 раза, а константы Михаэлиса по NAD+ и формиату улучшились в 4 и 3 раза. Полученные данные позволяют предположить, что наличие остатка Pro перед строго консервативным His приводит к увеличению термостабильности большинства ФДГ за счет снижения их каталитической эффективности.

5. Выявлена связь остатка Pro перед каталитически важным остатком Gin со свойствами бактериальной и дрожжевой ФДГ. Получены мутанты 8сеФДГ К299Р и РвеФДГ Р312К и P312L. В результате мутагенеза термостабильность 8сеФДГ увеличилась в 4 раза, а бактериальный фермент стал менее стабильным в 64 (РЗ12L) и 280 (Р312К) раз. Замены существенно не повлияли на кинетические константы обеих ФДГ. Таким образом, остаток Pro в данном участке активного центра ФДГ влияет только на термостабильность этих ферментов.

6. Проведена конформационная стабилизация РвеФДГ. Получено шесть точечных (К112Р, N136G, Y144G, A191G, N234G, H263G) один двойной (Y144Gly/A198G) и один многоточечный мутант (Т8) этого фермента. Замены К112Р и H263G дестабилизировали РвеФДГ в 1,6 и 1,3 раза. Замены A191G и N234G не повлияли на термостабильность фермента. Замены N136G и Y144G стабилизировали РэеФДГ в 1,2 и 1,5 раза. Двойной и многоточечный мутанты более стабильны, чем фермент дикого типа в 3,3 и 45 раз. Стабилизация РвеФДГ была основана на анализе карты Рамачандрана белка.

7. Впервые получена эукариотическая ФДГ с селективностью к NADP+. Изменение коферментной специфичности было обусловлено введением двойной замены D196A/Y197R в ген 8сеФДГ. Фермент дикого типа обладает абсолютной специфичностью к NAD+.

1. Clayton R.A., White О., Ketchum К.А. & Venter J.C. (1997) The first genome from the third domain of life. Nature, v.387, p.459-462.

2. Popov V.O. & Lamzin V.S. (1994) NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem. J., v.301, p.625-643.

3. Khangulov S.V., Gladyshev V.N., Dismukes G.C. & Stadtman T.C. (1998) Selenium-containing formate dehydrogenase H from Escherichia coli: a molybdopterin enzyme that catalyzes formate oxidation without oxygen transfer. Biochemistry, p.37, v.3518-3528.

4. Karzanov V.V., Bogatsky Yu.A., Tishkov V.I. & Egorov A.M. (1989) Evidence for the presence of a new NAD+-dependent formate dehydrogenase in Pseudomonas sp. 101 cells grown on a molybdenum-containing medium. FEMSMicrobiol. Lett., v.51, p. 197-200.

5. Kato N., Капо M., Tany Y. & Ogata K. (1974) Purification and choric characterization of formate dehydrogenase in methanol-utilizing yeast Kloeckera sp.2201. Agr.Biol. Chem., v.38(l), p.l 11-116.

6. Shutte H., Flossdorf J., Sahm H. & Kula M.-R. (1976) Purification and properties of formate dehydrogenase frpm Candida boidinii. Eur.J.Biochem., v.62(l), p.151-160.

7. Avilova T.V., Egorova O.A., Ioanesyan L.S. & Egorov A.M. (1985) Biosynthesis, isolation and properties of NAD-dependent formate dehydrogenase from the yeast Candida methylica. Eur. J. Biochem., v. 152, p.657-662.

8. Wou C.T., Patel R.N., Laskin A.L. & Barnabe N. (1982) NAD-dependent formate dehydrogenase from methanol-grow Pichia pastoris NRRL Y-7556.

9. Arch.Biochem.Biophys., v.216(l), p.296-305.

10. Allais J.J., Louktibi A. & Barati J. (1983) Oxidation of methanol by the yeast Pichia pastoris. Purification and properties of the formate dehydrogenase. Agric.Biol.Chem. v.47(l 1), p.2547-2554.

11. Izumi Y., Kanzaki H., Morita S., Futazuka H. & Yamada H. (1989) Characterization of crystalline formate dehydrogenase from Candida methanolica. Eur. J. Biochem., v.182, p.333-341.

12. Egorov A.M., Avilova T.V., Dikov M.M., Popov V.O., Rodionov Y.V. & Berezin I.V. (1979) NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium, strain 1. Purification and characterization. Eur. J. Biochem., v.99, p.569-576.

13. Babel W. & Mothes G. (1980) Rolle der formiat dehydrogenase in "Serin-weg"-bacterien. Z. Allg.Microbiol., v.20(3), p. 167-175.

14. Asano Y., Sekigawa Т., Inukai H. & Nakazawa A. (1988) Purification and properties of formate dehydrogenase from Moraxella sp. strain СЛ. J. Bacteriol., v. 170, p.3189-3193.

15. Iida M., Kitamurakimura K., Maeda H. & Mineki S. (1992) Purification and Characterization of a NAD+-Dependent Formate Dehydrogenase Produced by Paracoccus Sp.l2-A. Biosci.Biotech.andBiochem., v.56(12), p.1966-1970.

16. Гладышев B.H. (1992) Кинетические свойства формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий. Диссертация кандидата химических наук, Москва, МГУ.

17. Ohyama Т. & Yamazaki I. (1974) Purification and some properties of formate dehydrogenase. J. Biochem. (Tokyo), v.75, p.257-1263.

18. Colas d.F.-S., Ambard-Bretteville F., Small I.D. & Remy R. (1993) Identification of a major soluble protein in mitochondria from nonphotosynthetic tissues as NAD-dependent formate dehydrogenase. Plant Physiol., v. 102, p. 1171-1177.

19. Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.K., Yoshimura E.

20. Mori S. (1998) Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol, v.l 16, p.725-732.

21. Li R., Ziola B. & King J. (2000) Purification and characterization of formate dehydrogenase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol, v.157, p.161-167.

22. Olson B.J.S.C., Skavdahl M., Ramberg H., Osterman J.C. & Markwell J. (2000) Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: characterization and possible targeting to the chloroplast. Plant Sci., v. 159, p.205-212.

23. Тишков В.И. и Егоров A.M. (1985) Механизм формиатдегидрогеназной реакции. Биохимия, т.50, с.895-901.

24. Blanchard J.S. & Cleland.W.W. (1980) Kinetic and chemical mechanisms of yeast formate dehydrogenase. Biochemistry, v.19, p.3543-3550.

25. Hermes J.D., Morrical S.W., O'Leary M.H. & Cleland,W.W. (1984) Variation of transition-state structure as a function of the nucleotide in reactions catalyzed by dehydrogenases. 2. Formate dehydrogenase. Biochemistry, v.23, p.5479-5488.

26. Тишков В.И., Галкин А.Г. и Егоров A.M. (1989) НАД-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных дрожжей выделение и физико-химические свойства. Биохимия, т.54, с.231-236.

27. Tishkov V.I., Galkin A.G. & Egorov A.M. (1989) Kinetic isotope effect and the presteady-state kinetics of the reaction catalyzed by the bacterial formate dehydrogenase. Biochimie, v.71, p.551-557.

28. Mesentsev A.V., Lamzin V.S., Tishkov V.I., Ustinnikova T.B. & Popov,V.O. (1997) Effect of pH on kinetic parameters of NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem. J., v.321, p.475-480.

29. Oliver D.J. Formate oxidation and oxygen reduction by leaf mitochondria. (1981) Plant Physiol, v.68, p.703-705.

30. Hourton-Cabassa С., Ambard-Bretteville F., Moreau F., Davy Y., Remy R. & Francs-Small C.C. (1998) Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves. Plant Physiol., v.l 16, p.627-635.

31. Distel В., Veenhuis M. & Tabak H.F. (1987) Import of alcohol oxidase into peroxisomes of Saccharomyces cerevisiae. EMBOJ., v.6, p.3111-3116.

32. Wehner E.P., Rao E. & Brendel M. (1993) Molecular structure and genetic regulation of SFA, a gene responsible for resistance to formaldehyde in Saccharomyces cerevisiae, and characterization of its protein product. Mol. Gen. Genet., v.237, p.351-358.

33. Van den Berg M.A. & Steensma H.Y. (1997) Expression cassettes for formaldehyde and fluoroacetate resistance, two dominant markers in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, v. 13, p.551-559.

34. Vandenbol M., Durand P., Dion C., Portetelle D. & Hilger F. (1995) Sequence of a 17.1 kb DNA fragment from chromosome X of Saccharomyces cerevisiae includes the mitochondrial ribosomal protein L8. Yeast, v.l 1, p.57-60.

35. Galkin A., Kulakova L., Tishkov V., Esaki N„ & Soda K. (1995) Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol-utilizing bacterium Mycobacterium vaccae N10. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.44, p.479-483.

36. Тишков В.И. (1993) Структура, механизм действия и белковая инженерия NAIH-зависимой формиатдегидрогеназы. Диссертация доктора химических наук, Москва, МГУ.

37. Мезенцев А.В., Устинникова Т.В., Тихонова Т.В. и Попов В.О. (1996) Выделение и кинетический механизм действия НАД-зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorphs. Прикладная биохимия и микробиология, т.32, с.589-595.

38. Dijken J.P., Oostra-Demkes G.J., Otto R. & Harder W. (1976) S-Formyl glutathion: the substrate for formate dehydrogenase in methanol-utilizing yeasts. Arch.Microbiol., v. 111(1), p. 187-192.

39. Slusarczyk H., Felber S., KulaM.R. & Pohl M. (2000) Stabilization of NAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues. Eur. J. Biochem., v.267, p. 1280-1289.

40. Allen S.J. & Holbrook J.J. (1995) Isolation, sequence and overexpression of the gene encoding NAD- dependent formate dehydrogenase from the methylotrophic yeast Candida methylica. Gene, v. 162, p.99-104.

41. Peacock D. & Boulter D. (1970) Kinetic studies of formate dehydrogenase. Biochem. J., v. 120, p.763-769.

42. Tishkov V.I., Galkin A.G., Marchenko G.N., Tsygankov Y.D. & Egorov A.M. (1993) Formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium Pseudomonas sp. 101: gene cloning and expression in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem., v.18, p.201-207.

43. Hollenberg C.P. & Janowicz Z. (1989) DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses. European Patent Application.

44. Shiraishi Т., Fukusaki E. & Kobayashi A. (2000) Formate dehydrogenase in rice plant: Growth stimulation effect of formate in rice plant. J. Biosci. Bioeng., v.89, p .241-246.

45. Chow C.M. & RajBhandary U.L. (1993) Developmental regulation of the gene for formate dehydrogenase inNeurospora crassa. J. Bacteriol., v. 175, p.3703-3709.

46. Saleeba J.A., Cobbett C.S. & Hynes M.J. (1992) Characterization of the amdA-regulated aciA gene of Aspergillus nidulans. Mol. Gen. Genet., v.235, p.349-358.

47. Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H., Davis R.W., Dujon В., Feldmann H., Galibert F., Hoheisel J.D., Jacq C., Johnston M., Louis E.J., Mewes H.W., Murakami Y., Philippsen P., Tettelin H. & Oliver S.G. (1996) Life with 6000 genes. Science, 274, 546-563.

48. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H. & Wilson K.S. (1994) High resolution structures ofholo and apo formate dehydrogenase. J. Mol. Biol, v.236, p.759-785.

49. Клячко H.JI., Вакула C.B., Гладышев B.H., Тишков В.И. и Левашов А.В. (1997) Фомиатдегидогеназа в системе обращенных мицелл: регуляция каталитической активности и олигомерного состава фермента. Биохимия, т.62, с. 1691-1695.

50. Wilmot С.М. & Thornton J.M. (1990) Beta-turns and their distortions: a proposed new nomenclature. Protein Eng, v.3, p.479-493.

51. Vinals C., Depiereux E. & Feytmans E. (1993) Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 192, p. 182-188.

52. Labrou N.E., Rigden D.J.& Clonis Y.D. (2000) Characterization of the NAD+ binding site of Candida boidinii formate dehydrogenase by affinity labelling and site-directed mutagenesis. Eur. J. Biochem., v.267, p.6657-6664.

53. Labrou N.E. & Rigden D.J. (2001) Active-site characterization of Candida boidinii formate dehydrogenase. Biochem. J., v.354, p.455-463.

54. Gul-Karaguler N., Sessions R.B., Clarke A.R. & Holbrook J. (2001) A single mutation in the NAD-specific formate dehydrogenase from Candida methylica allows the enzyme to use NADP. Biotechnol. Lett., v.23, p.283-287.

55. Taguchi H., Ohta T. & Matsuzawa H. (1997) Involvement of Glu-264 and Arg-235 in the essential interaction between the catalytic imidazole and substrate for the D-lactate dehydrogenase catalysis. J. Biochem. (Tokyo), v. 122, p.802-809.

56. Clarke A.R., Wigley D.B., Chia W.N., Barstow D., Atkinson T. & Holbrook J.J. (1986) Site-directed mutagenesis reveals role of mobile arginine residue in lactate dehydrogenase catalysis. Nature, 324, 699-702.

57. Маторин А.Д. (2000) Механизм субстратной и коферментативной специфичности бактериальной формиатдегидрогеназы. Диссертация кандидата химических наук, Москва, МГУ.

58. Диков М.М., Карулин А., Осипов А.П. и Егоров A.M. (1979) Изучение методом аналитического изотахофореза изменений структуры формиатдегидрогеназы при ее инактивации. Биоорган, химия, т.5(8), с.1217-1221.

59. Patel R.N., Hou C.T. & Derelanko P. (1983) Microbial oxidation of methanol: purification and properties of formaldehyde dehydrogenase from a Pichia sp. NRRL-Y-11328.Arch. Biochem. Biophys., v.221, p.135-142.

60. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V. & Tishkov,V.I. (1999) Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., v.445, p.183-188.

61. Van den Burg В., Dijkstra B.W., Vriend G., Venema G. & Eijsink V.G. (1994) Protein stabilization by hydrophobic interactions at the surface. Eur. J. Biochem., v.220, p.981-985.

62. Lee B. & Vasmatzis G. (1997) Stabilization of protein structures. Curr. Opin. Biotechnol., v.8, p.423-428.

63. Федорчук B.B. (2000) Повышение термостабильности бактериальной формиатдегидрогеназы методом направленного мутагенеза. Диссертация кандидата химических наук, Москва, МГУ.

64. Carugo О. & Argos Р. (1997) NADP-dependent enzymes. I: Conserved stereochemistry of cofactor binding. Proteins, v.28, p.10-28.

65. Adams M.J., Ford G.C., Koekoek R., Lentz P.J., McPherson A.Jr., Rossmann M.G., Smiley I.E., Schevitz R.W. & Wonacott A.J. (1970) Structure of lactate dehydrogenase at 2-8 A resolution. Nature, v.221, p.1098-1103.

66. Rossmann M.G., Moras D. & Olsen K.W. (1974) Chemical and biological evolution of nucleotide-binding protein. Nature, v.250, p. 194-199.

67. Bellamacina C.R. (1996) The nicotinamide dinucleotide binding motif: a comparison of nucleotide binding proteins. FASEBJ., v.10, p. 1257-1269.

68. Harrison D.H., Bohren K.M., Ringe D., Petsko G.A. & Gabbay K.H. (1994) An anion binding site in human aldose reductase: mechanistic implications for the binding of citrate, cacodylate, and glucose 6- phosphate. Biochemistry, v.33, p.2011-2020.

69. Imada К., Sato M., Tanaka N., Katsube Y., Matsuura Y. & Oshima T. (1991) Three-dimensional structure of a highly thermostable enzyme, 3- isopropylmalate dehydrogenase of Thermus thermophilus at 2.2 A resolution. J. Mol. Biol., v.222, p.725-738.

70. Hurley J.H., Dean A.M., Koshland D.E. & Stroud R.M. (1991) Catalytic mechanism of NADP(+)-dependent isocitrate dehydrogenase: implications from the structures of magnesium-isocitrate and NADP+ complexes. Biochemistry, v.30, p.8671-8678.

71. Karplus P.A. & Schulz G.E. (1989) Substrate binding and catalysis by glutathione reductase as derived from,refined enzyme: substrate crystal structures at 2 A resolution. J. Mol. Biol., v.210, p. 163-180.

72. Lesk A.M. (1995) NAD-binding domains of dehydrogenases. Curr. Opin. Struct. Biol., v.5, p.775-783.

73. Rao S.T. & Rossmann M.G. (1973) Comparison of super-secondary structures in proteins. J. Mol. Biol, v.76, p.241-256.

74. Baker P.J., Britton K.L., Rice D. W., Rob A., & Stillman T.J. (1992) Structural consequences of sequence patterns in the fingerprint region of the nucleotide binding fold. Implications for nucleotide specificity. J. Mol. Biol., v.228, p.662-671.

75. Levy H.R., Ejchart A. & Levy G.C. (1983) Conformations of nicotinamide coenzymes bound to dehydrogenases determined by transferred nuclear Overhauser effects. Biochemistry, v.22, p.2792-2796.

76. Scrutton N.S., Berry A. & Perham R.N. (1990) Redesign of the coenzyme specificity of a dehydrogenase by protein engineering. Nature, v.343, p.38-43.

77. Feeney R., Clarke A.R. & Holbrook J.J. (1990) A single amino acid substitution in lactate dehydrogenase improves the catalytic efficiency with an alternative coenzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 166, p.667-672.

78. Holmberg N., Ryde U. & Bulow L. (1999) Redesign of the coenzyme specificity in L-lactate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus using site-directed mutagenesis and media engineering. Protein Eng, v.12, p.851-856.

79. Corbier C., Clermont S., Billard P., SkarzynskiT., Branlant C., Wonacott A. & Branlant G. (1990) Probing the coenzyme specificity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases by site-directed mutagenesis. Biochemistry, v.29, p.7101-7106.

80. Eyschen J., Vitoux В., Rahuel-Clermont S., Marraud M., Branlant G. & Cung M.T. (1996) Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance studies on coenzyme binding and specificity in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry, v.35, p.6064-6072.

81. Fan F., Lorenzen J.A. & Plapp B.V. (1991) An aspartate residue in yeast alcohol dehydrogenase I determines the specificity for coenzyme. Biochemistry, v.30, p.6397-6401.

82. Chen Z., Lee W.R. & Chang,S.H. (1991) Role of aspartic acid 38 in the cofactor specificity of Drosophila alcohol dehydrogenase. Eur. J. Biochem., v.202, p.263-267.

83. Chen Z., Tsigelny I., Lee W.R., Baker M.E. & Chang,S.H. (1994) Adding a positive charge at residue 46 of Drosophila alcohol dehydrogenase increases cofactor specificity for NADP+. FEBSLett. , v.356, p.81-85.

84. Nishiyama M., Birktoft J.J. & Beppu T. (1993) Alteration of coenzyme specificity of malate dehydrogenase from Thermus flavus by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem., v.268, p.4656-4660.

85. Bocanegra J.A., Scrutton N.S. & Perham R.N. (1993) Creation of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering. Biochemistry, v.32, p.2737-2740.

86. Chen R., Greer A. & Dean A.M. (1996) Redesigning secondary structure to invert coenzyme specificity in isopropylmalate dehydrogenase.

87. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, v.93, p.12171-12176.

88. Bernard N., Johnsen K., Holbrook J.J. & Delcour J. (1995) D175 discriminates between NADH and NADPH in the coenzyme binding site of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus D-lactate dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun., v.208, p.895-900.

89. Galkin A., Kulakova L., Ohshima Т., Esaki N. & Soda K. (1997) Construction of a new leucine dehydrogenase with preferred specificity for NADP+ by site-directed mutagenesis of the strictly NAD+-specific enzyme. Protein Eng, v. 10, p.687-690.

90. Mittl P.R., Berry A., Scrutton N.S., Perham R.N. & Schulz,G.E. (1994) Anatomy of an engineered NAD-binding site. Protein Sci., v.3, p.1504-1514.

91. Mittl P.R., Berry A., Scrutton N.S., Perham R.N. & Schulz,G.E. (1993) Structural differences between wild-type NADP-dependent glutathione reductase from Escherichia coli and a redesigned NAD-dependent mutant. J. Mol. Biol., v.231, p.191-195.

92. Chen R., Greer A. & Dean A.M. (1995) A highly active decarboxylatingdehydrogenase with rationally inverted coenzyme specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,v.92, p.l 1666-11670.

93. Yaoi Т., Miyazaki К., Oshima Т., Komukai Y. & Go M. (1996) Conversion of the coenzyme specificity of isocitrate dehydrogenase by module replacement.

94. J. Biochem. (Tokyo), \Л19,рА014~т&.

95. Yaoi Т., Miyazaki K., & Oshima T. (1994) Roles of Arg231 and Tyr284 of Thermus thermophilics isocitrate dehydrogenase in the coenzyme specificity. FEBSLett., v.355, p.171-172.

96. Tetaud E., Hanau S., Wells J.M., Le Page R.W., Adams M.J., Arkison S.

97. Barrett M.P. (1999) 6-Phosphogluconate dehydrogenase from Lactococcus lactis: a role for arginine residues in binding substrate and coenzyme. Biochem J, v.338, p.55-60.

98. Zhang L., Ahvazi В., Szittner R., Vrielink A. & Meighen,E. (1999) Change of nucleotide specificity and enhancement of catalytic efficiency in single point mutants of Vibrio harveyi aldehyde dehydrogenase. Biochemistry, v.38, p. 11440-11447.

99. Eppink M.H., Overkamp K.M., Schreuder H.A. & van Berkel W.J. (1999) Switch of coenzyme specificity ofp-hydroxybenzoate hydroxylase. J. Mol. Biol., v.292, p.87-96.

100. Rees-Milton K.J., Jia Z., Green N.C., Bhatia M., El Kabbani O. & Flynn T.G. (1998) Aldehyde reductase: the role of C-terminal residues in defining substrate and cofactor specificities. Arch. Biochem. Biophys., v.355, p.137-144.

101. Wang H., Lei B. & Tu S.C. (2000) Vibrio harveyi NADPH-FMN oxidoreductase Arg203 as a critical residue for NADPH recognition and binding. Biochemistry, v.39, p.7813-7819.

102. Cui К., Ma Q., Lu A.Y. & Yang C.S. (1995) Roles of histidine-194, aspartate-163, and a glycine-rich sequence of NAD(P)H:quinone oxidoreductase in the interaction with nicotinamide coenzymes. Arch. Biochem. Biophys., v.323, p.265-273.

103. Mazza C., Breton R., Housset D. & Fontecilla-Camps J.C. (1998) Unusual charge stabilization of NADP+ in 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase. J. Biol. Chem., v.273, p.8145-8152.

104. Hummel W. (1999) Large-scale applications of NAD(P)-dependent oxidoreductases: recent developments. Trends Biotechnol., v. 17, p.487-492.

105. Kula M.-R. Coenzyme dependent synthesis: New developments. (1997) Collection of papers presented at the INBIO Europe 97 Conference, Spring innovations Ltd, Stockport, UK.

106. Bommarius A.S., Schwarm M., Stingl K., Kottenhahn M., Huthmacher K. & Drauz K. (1995) Synthesis and use of enantiomericall pure ferMeucine. Tetrahedron Asymmetry, v.6, p.2851-2888.

107. Kragl U., Kruse W., Hummel W. & Wandrey C. (1996) Enzyme engineering aspects of biocatalysis: cofactor regeneration as example. Biotechnol.Bioeng., v.52, p.309-319.

108. Hummel W. (1997) New alcohol dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. Adv. Biochem. EngBiotechnol., v.58, p.145-184.

109. Seelbach K., Riebel В., Hummel W., Kula M.-R., Tishkov V.I., Egorov A.M., Wandrey C. & Kragl U. (1996) A novel, efficient regenerating method of NADPH using a new formate dehydrogenase. Tetrahedron Lett., v.37, p.1377-1380.

110. Wong C.-H. & Whitesides G.M. (1981) Enzyme-catalyzed organic synthesis: NAD(P)H cofactor regeneration by using glucose-6-phosphate and the glucose-5-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides. J.Am.Chem.Soc., v. 103, p.4890-4899.

111. MacArthur M.W. & Thornton J.M. (1991) Influence of proline residues on protein conformation. J. Mol. Biol., v.218, p.397-412.

112. Schimmel P.R. & Flory P.J. (1968) Conformational energies and configurational statistics of copolypeptides containing L-proline. J. Mol. Biol., v.34, p. 105-120.

113. Ramachandran G.N. & Mitra A.K. (1976) An explanation for the rare occurrence of cis peptide units in proteins and polypeptides. J. Mol. Biol., v.107, p.85-92.

114. Brandts J.F., Halvorson H.R. & Brennan M. (1975) Consideration of the Possibility that the slow step in protein denaturation reactions is due to cis-trans isomerism of proline residues. Biochemistry, v. 14, p.4953-4963.

115. Kartha G., Ambady G. & Shanker P.V. (1974) Structure and conformation of a cyclic tripeptide. Nature, v.247, p.204-205.

116. Ramachandran G.N. & Sasisekharan V. (1968) Conformation of polypeptides and proteins. Adv. Protein Chem., v.23, p.283-438.

117. Argos P. & Palau J. (1982) Amino acid distribution in protein secondary structures. Int. J. Pept. Protein Res., v.19, p.380-393.

118. Richardson J.S. (1981) The anatomy and taxonomy of protein structure. Adv. Protein Chem., v.34, p. 167-339. '

119. Hutchinson E.G. & Thornton J.M. (1994) A revised set of potentials for beta-turn formation in proteins. Protein Sci., v.3, p.2207-2216.

120. Richardson J.S. & Richardson D.C. (1988) Amino acid preferences for specific locations at the ends of alpha helices. Science, v.240, p.1648-1652.

121. O'Neil K.T. & DeGrado W.F. (1990) A thermodynamic scale for the helix-forming tendencies of the commonly occurring amino acids. Science, v.250, p.646-651.

122. Yun R.H., Anderson A. & Hermans J. (1991) Proline in alpha-helix: stability and conformation studied by dynamics simulation. Proteins, v. 10, p.219-228.

123. Hurley J.H., Mason D.A. & Matthews B.W. (1992) Flexible-geometry conformational energy maps for the amino acid residue preceding a proline. Biopolymers, v.32, p. 1443-1446.

124. Dasgupta S. & Bell J.A. (1993) Design of helix ends. Amino acid preferences, hydrogen bonding and electrostatic interactions. Int. J. Pept. Protein Res., v.41, p.499-511.

125. Donate L.E., Rufino S.D., Canard L.H. & Blundell T.L. (1996) Conformational analysis and clustering of short and medium size loops connecting regular secondary structures: a database for modeling and prediction. Protein Set, v. 5, p.2600-2616.

126. Rajashankar K.R. & Ramakumar S. (1996) Pi-turns in proteins and peptides: Classification, conformation, occurrence, hydration and sequence. Protein Sci., v.5, p.932-946.

127. Suzuki Y. & Watanabe K. (1998) Protein thermostabilization by proline substitutions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.4, p.167-180.

128. Cannio R., Rossi M. & Bartolucci S. (1994) A few amino acid substitutions are responsible for the higher thermostability of a novel NAD(+)-dependent bacillar alcohol dehydrogenase. Eur. J. Biochem., v.222, p.345-352.

129. Huang W., Petrosino J., Hirsch M., Shenkin P.S. & Palzkill T. (1996) Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J. Mol. Biol., v.258, p.688-703.

130. McHarg J., Kelly S.M., Price N.C., Cooper A. & Littlechild J.A. (1999) Site-directed mutagenesis of proline 204 in the 'hinge' region of yeast phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochemv.259, p.939-945.

131. Tagaya M., Yagami Т., Noumi Т., Futai M., Kishi F., Nakazawa A. & Fukui T. (1989) Site-directed mutagenesis of Pro-17 located in the gly cine-rich region of adenylate kinase. J. Biol. Chem., v.264, p.990-994.

132. Takagi H., Morinaga Y., Ikemura H. & Inouye M. (1989) The role of Pro-239 in the catalysis and heat stability of subtilisin E. J. Biochem. (Tokyo), v. 105, p.953-956.

133. Feller G., Zekhnini Z., Lamotte-Brasseur J. & Gerday C. (1997) Enzymes from cold-adapted microorganisms. The class С beta-lactamase from the antarctic psychrophile Psychrobacter immobilis A5. Eur. J. Biochem., v.244, p. 186-191.

134. Matthews B.W., Nicholson H. & Becktel WJ. (1987) Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, v.84, p.6663-6667.

135. Matthews B.W. (1993) Structural and genetic analysis of protein stability. Annu. Rev. Biochem., v.62, p. 139-160.

136. Ueda Т., Tamura Т., Maeda Y., Hashimoto Y., Miki Т., Yamada H. & Imoto T. (1993) Stabilization of lysozyme by the introduction of Gly-Pro sequence. Protein Eng, v.6,p.l83-187.

137. Masui A., Fujiwara N. & Imanaka T. (1994) Stabilization and rational design of serine protease AprM under highly alkaline and high-temperature conditions. Appl. Environ. Microbiol., v.60, p.3579-3584.

138. Ishikawa K., Kimura S., Kanaya S., Morikawa K. & Nakamura H. (1993) Structural study of mutants of Escherichia coli ribonuclease HI with enhanced thermostability. Protein Eng, v.6, p.85-91.

139. Kimura S., Nakamura H., Hashimoto Т., Oobatake M. & Kanaya S. (1992) Stabilization of Escherichia coli ribonuclease HI by strategic replacement of amino acid residues with those from the thermophilic counterpart. J. Biol. Chem., v.261, p.21535-21542.

140. Ohage E.C., Graml W., Walter M.M., Steinbacher S. & Steipe B. (1997) Beta-turn propensities as paradigms for the analysis of structural motifs to engineer protein stability. Protein Sci., v.6, p.233-241.

141. Zhu G.P., Xu C., Teng M.K., Tao L.M., Zhu X.Y., Wu C.J., Hang J., Niu L.W. & Wang Y.Z. (1999) Increasing the thermostability of D-xylose isomerase by introduction of a proline into the turn of a random coil. Protein Eng, v. 12, p.635-638.

142. Saksela K., Cheng G. & Baltimore D. (1995) Proline-rich (PxxP) motifs in HIV-1 Nef bind to SH3 domains of a subset of Src kinases and are required for the enhancedgrowth of Nef+ viruses but not for down-regulation of CD4. EMBO J., v. 14, p.484-491.

143. Hong S., Ryu K.S., Oh M.S., Ji I. & Ji Т.Н. (1997) Roles of transmembrane prolines and proline-induced kinks of the lutropin/choriogonadotropin receptor. J. Biol. Chem., v.272, p.4166-4171.

144. O'Sullivan J.M., Cannon R.D., Sullivan P.A. & Jenkinson H.F. (1997) Identification of salivary basic proline-rich proteins as receptors for Candida albicans adhesion. Microbiology, v. 143(2), p.341-348.

145. Ramaswamy S., Park D.H. & Plapp B.V. (1999) Substitutions in a flexible loop of horse liver alcohol dehydrogenase hinder the conformational change and unmask hydrogen transfer. Biochemistry, v.38, p.13951-13959.

146. Meyer C.R., Yirsa J., Gott B. & Preiss J. (1998) A kinetic study of site-directed mutants of Escherichia coli ADP- glucose pyrophosphorylase: the role of residue 295 in allosteric regulation. Arch. Biochem. Biophys., v.352, p.247-254.

147. Schalk M., Nedelkina S., Schoch G., Batard Y. & Werck-Reichhart D. (1999) Role of unusual amino acid residues in the proximal and distal heme regions of a plant P450, CYP73A1. Biochemistry, v.38, p.6093-6103.

148. Svensson S., Stromberg P. & Hoog J.O. (1999) A novel subtype of class II alcohol dehydrogenase in rodents. Unique Pro(47) and Ser(182) modulates hydride transfer in the mouse enzyme. J. Biol. Chem., v.274, p.29712-29719.

149. Кантор Ч. и Шиммел П. (1984) Биофизическая химия, Издательство «Мир», Москва.

150. Ramakrishnan С. & Srinivasan N. (1990) Glycyl rezidues in proteins and peptides: an analysis. Curr. Sci., v.59, p.851-861.

151. Gunasekaran K., Ramakrishnan C. & Balaram P. (1996) Disallowed Ramachandran conformations of amino acid residues in protein structures. J. Mol. Biol, v.264,p.191-198.

152. Weaver L.H., Tronrud D.E., Nicholson H. & Marrews B.W. (1990) Some uses of Ramachandran diagram in the structural analysis of lysozymes. Curr. Sci., v.59, p.833-837.

153. Stites W.E., Meeker A.K. & Shortle D. (1994) Evidence for strained interactions between side-chains and the polypeptide backbone. J. Mol. Biol., v.235, p.27-32.

154. Deane C.M., Allen F.H., Taylor R. & Blundell T.L. (1999) Carbonyl-carbonyl interactions stabilize the partially allowed Ramachandran conformations of asparagine and aspartic acid. Protein Eng, v. 12, p. 1025-1028.

155. Jia Z., Vandonselaar M., Quail J.W. & Delbaere L.T. (1993) Active-centre torsion-angle strain revealed in 1.6 A-resolution structure of histidine-containing phosphocarrier protein. Nature, v.361, p.94-97.

156. Zeng C., Aleshin A.E., Chen G. Honzatko R.B. & Fromm H.J. (1998) The roles of glycine residues in the ATP binding site of human brain hexokinase. J. Biol. Chem., v.273, p.700-704.

157. Шабарова 3.A., Богданов A.A. и Золотухин A.C. (1994) Химические основы генетической инженерии. Учебное пособие, Издательство МГУ, Москва.

158. Manniatis Т., Fritch E.F. & Sambrook J. (1982) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor N. Y.

159. Sanger F., Nicklen S. & Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A, v.74, p.5463-5467.

160. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K. & Pease L.R. (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, v.77, p.51-59.

161. Kunkel T.A. (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A, v.82, p.488-492.

162. Olins P.O. & Rangwala S.H. (1989) A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J. Biol. Chem., v.264, p. 16973-16976.

163. Tishkov V.I., Galkin A.G., Fedorchuk V.V., Savitsky P.A., Rojkova A.M., Gieren H., & Kula M.R. (1999) Pilot scale production and isolation of recombinant NAD+-andNADP4- specific formate dehydrogenases. Biotechnol. Bioeng., v.64, p. 187-193.

164. Попов В.И., Родионов Ю.В., Егоров A.M. и Березин И.В. (1978) NAD-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий. Изучение кинетической схемы действия. Биоорг. химия, т.4, с.117-128.

165. Тишков В.И., Егоров A.M. и Попов В.О. (1983) Бактериальная формиатдегидрогеназа. Субстратная специфичность и кинетический механизм окисления S-формилглутатиона. Биохимия, т.48, с. 1003-1010.

166. Kato N., Sahm Н. & Wagner F. (1979) Steady-state kinetics of formaldehyde dehydrogenase and formate dehydrogenase from a methanol-utilizing yeast, Candida boidinii. Biochim. Biophys. Acta, v.566, p. 12-20.

167. Закс A.M., Авилова Т.В., Егорова О.А., Попов В.О. и Егоров A.M. (1982) Кинетика NAD-зависимой формиатдегидрогеназы из метанол-утилизирующих дрожжей Candida methylica. Биохимия, т.47, с.546-551.

168. Cornish-Bowden А. (1975) Principles of Enzyme Kinetics, London, Boston -Butterworths.

169. Тишков В.И. (1984) Механизм действия формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий. Диссертация кандидата химических наук, Москва, МГУ.

170. Vaughan W.M. & Weber G. (1970) Oxygen quenching of pyrenebutyric acid fluorescence in water. A dynamic probe of the microenvironment. Biochemistry, v. 9, p.464-473.

171. Yaughn W.M. & Weber G. (1970) Oxygen quenching of pyrenebutyric acid fluorescence in water. Dynamic probe of the microenviroment. Biochemistry, v.9, p.464-473.

172. Ohyama T. & Yamazaki I. (1975) Formate dehydrogenase. Subunit and mechanism of inhibition by cyanide and azide. J. Biochem. (Tokyo), v.11, p.845-852.

173. Hummel W. & Kula M.R. (1989) Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. Eur. J. Biochem., v. 184, p. 1-13.

174. Рожкова A.M. (1999) Стабилизация бактериальной фомиатдегидрогеназы гидрофобизацией белковой глобулы методом направленного мутагенеза. Диссертация кандидата химических наук, Москва, МГУ.

175. Li R., Bonham-Smith Р.С. & King J. (2001) Molecular characterization and regulation of formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique, v.79, p.796-804.