Исследование ренатурации рекомбинантных белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Введение.

1. Ренатурация белков в биотехнологии (Обзор литературы).

1.1. Ренатурация белков in vivo в Е. coli.

1.2. Ренатурация белков in vitro.

1.3. Структура и биологическое действие а-ФНО, ИЛ-3,7-ИФН и инсулина.

2. Обсуждение результатов.

2.1. Факторы, влияющие на ренатурацию белка in vitro.

2.2. Разработка методов выделения рекомбинантных белков из биомассы трансформированных клеток Е. coli.

2.2.1. Выделение и очистка а-ФНО дикого и мутантного типов.

2.2.2. Выделение у-ИФН и ИЛ-3. 48 2.2.3 Выделение ГБ-предшественников инсулина в виде S-сульфонатных производных.

2.3. Влияние внутримолекулярных факторов.

2.4. Влияние параметров реакционной среды.

2.4.1. Условия образования дисульфидной связи.

2.4.2. Концентрация белка и температура реакции.

2.4.3. рН среды.

2.4.4. Природа реакционной среды.

2.5. Результаты оптимизации ренатурации.

2.6. Разработка схем получения рекомбинантных белков.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы.

3.2. Оборудование.

3.3. Методы.

3.3.1. Общие методы.

3.3.2. Получение ос-ФНО.

3.3.3. Получение ИЛ-3.

3.3.4. Получение у-ИФН.

3.3.5. Получение ГБ - предшественников инсулина.

4. Выводы.

Белки - один из важнейших классов биологически активных веществ. Они чрезвычайно разнообразны по структуре и выполняют многочисленные биологические функции [1]. Большой интерес для исследовательских целей и практического применения представляют белки, которые принято называть терапевтическими или белками медицинского назначения. Это условное название, объединяющее различные виды белков, перспективных или уже использующихся для лечения и профилактики различных заболеваний. Подавляющее число таких белков невозможно выделить в достаточных количествах из природных источников, поэтому их получают искусственно. Наиболее распространен биотехнологический способ, в основе которого лежит культивирование трансформированных микроорганизмов, чаще всего клеток E.coli, продуцирующих целевой белок. Биотехнология рекомбинантных белков медицинского назначения - одна из наиболее перспективных и динамически развивающихся областей науки и производства в развитых странах мира. Десятки белков применяются в клинической практике [2] и сотни проходят медико-биологические испытания, составляя все более реальную альтернативу традиционным синтетическим и природным лекарственным средствам.

Однако, несмотря на очевидные успехи в получении рекомбинантных белков, их производство остается сложным и весьма дорогостоящим. Основная проблема проистекает из самого способа их получения. Экспрессируемые в E.coli рекомбинантные белки накапливаются внутри клетки, как правило, в частично или полностью денатурированной, биологически неактивной форме в телах включения, т.к. клетки E.coli, в большинстве случаев, неспособны к правильному процессингу белков высших организмов. Для получения целевого продукта необходима ренатурация in vitro, или приобретение белком нативной пространственной структуры и биологической активности. Стадия ренатурации является ключевой в схеме препаративного получения рекомбинантных белков. Ее эффективность во многом определяет эффективность всего производственного процесса. Создание искусственного гена, трансформация клеток и их культивирование хорошо отработаны и унифицированы, тогда как методы выделения, очистки и, в особенности, ренатурации сильно различаются для каждого получаемого рекомбинантного белка. Поиск условий ренатурации для конкретного белка, тесным образом связанный с изучением ее закономерностей, представляет сложную многомерную задачу, решаемую путем постепенного подбора условий среды и оптимизации большого количества факторов. Единых методов ренатурации рекомбинантных белков на сегодняшний день не существует, однако, на основе изученных закономерностей, систематизации и обобщения данных о различных белках представляется реальной разработка унифицированных подходов к поиску условий ренатурации таких белков, в том числе и не существующих в природе.

Проблема ренатурации - не единственная трудность, возникающая при получении терапевтических белков. Как и любое лекарственное средство, такой препарат должен обладать достаточной стабильностью в условиях хранения и применения, а также минимальными побочными эффектами. Природные белки (белки дикого типа) зачастую не соответствуют этим требованиям. Нестабильность белка при хранении, слишком короткий период полураспада препарата в кровотоке, наличие в полипептидной цепи нескольких сайтов рецепторного узнавания, необходимых для проявления белком присущих ему биологических функций, но нежелательных с точки зрения его терапевтической пригодности - вот самые распространенные причины, сдерживающие широкое применение тех или иных белковых препаратов. Эти проблемы решаются путем создания методами генной инженерии мутантных молекул белков, более перспективных для терапевтических целей, например, с повышенной стабильностью или измененной биологической активностью. Не рассматривая биологические аспекты применения мутантных белков, необходимо заметить, что любые изменения в аминокислотной последовательности белка могут повлиять на его ренатурацию.

Объекты исследования настоящей работы - перспективные и уже применяющиеся в клинической практике белки. Это человеческий рекомбинантный а-фактор некроза опухолей (а-ФНО) и его мутантный аналог (R32H) с пониженной токсичностью, интерлейкин-3 (ИЛ-3), у-интерферон (у-ИФН) и его мутантный аналог (E7C/S69C) с повышенной стабильностью, а также четыре гибридных белка (ГБ) -биотехнологические предшественники инсулина человека - с различными лидерными пептидами. В работе изучались факторы, влияющие на ренатурацию этих белков с целью поиска ее закономерностей и оптимальных условий на основе исследованных факторов, с конечной целью разработки эффективных методов получения высокоочищенных биологически активных субстанций этих белков.

1. Показана зависимость вторичной структуры денатурированных белков от рН среды и найдено, что белки обладают близкой к нативной вторичной структурой при рН, оптимальном для ренатурации. Анализ вторичной структуры белка позволяет унифицировать путь поиска оптимальных условий ренатурации.2. Выявлено отрицательное влияние на ренатурацию клеточных компонентов -

нуклеиновых кислот, гидрофобных компонентов и предложен простой и эффективный хроматографический способ их удаления.3. Изучено влияние внутримолекулярных факторов на ренатурацию ГБ. Показано, что вид и размер лидерного пептида не влияет на ренатурацию ГБ, однако наличие гексагистидиновой вставки на М-конце протяженной лидерной последовательности снижает эффективность ренатурации на 40%.4. На основе изученного влияния температуры, концентрации белка, состава среды и условий образования дисульфидных связей оптимизирована ренатурация ИЛ-3, у ИФН и ГБ. Достигнутый выход составлял не менее 90%.5. Разработаны эффективные методы получения биологически активных рекомбинантных ИЛ-3, а-ФНО и его мутантного аналога (К32Н) с пониженной токсичностью, у-ИФН и его мутантного аналога (Е7С/869С) с повышенной стабильностью в препаративных количествах с выходом 30-50%), высокоочиш;енных ГБ с выходом не менее 70% (от количества белка в биомассе), унифицированные схематически и по использованию хроматографических методов.6. Ренатурированные ГБ трансформированы в инсулин, идентичность которого человеческому подтверждена.5. Приложения.

1. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М. Просвещение. 1987. С. 20.

2. Purcell D.J. Financing biotechnology in an inefficient market Nat: Biotechnol. 1999. V. 17 Supplement. P. 31-32.

3. Levinthal C. Are there pathways for protein folding? J. Chem. Phys. 1968. V. 65. P. 4445.

4. Zwanzig R., Szabo A., Bagchi B. Levinthal's paradox. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. V. 89. P. 20-22.

5. Pande V.S., Grosberg A.Y., Tanaka Т., Rokhsar D.S. Pathways for protein folding: is a new view needed? Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. V. 8. P. 68-79.

6. Marquardt Т., Helenius A. Misfolding and aggregation of newly synthesized proteins in the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 1992. V. 117. P. 505-513.

7. Kane J.F., Hartley D.L. Formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia coli: refractile body formation following overexpression of cloned genes. Trends Biotechnol. 1988. V. 6. P. 95-101.

8. Taylor G., Hoare M., Gray D.R., Marston F. A. O. Size and density of protein inclusion bodies from synthesis of recombinant cattle prochymosin and gamma-interferon in Escherichia coli. Bio/Technology. 1986. V. 4. P. 553-557.

9. Misawa S., Kumagai I. Refolding of therapeutic proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies. Biopolymers. 1999. V. 51. P. 297-307.

10. Schein C.H., Noteborn M.H.M. Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature. Bio/Technology. 1988. V. 6. P. 291-294.

11. Goldenberg D.P., Smith D.H., King J. Genetic analysis of the folding pathway for the tail spike protein of phage P22. Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 7060-7064.

12. Seckler R., Fuchs A., King J., Jaenicke R. Reconstitution of the termostable trimeric phage P22 tailspike protein from denatured chains in vitro. J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 11750-11753.

13. Bowden G.A., Georgiou G. The effect of sugars on beta-lactamase aggregation in Escherichia coli. Biotech. Prog. 1988. V. 4. P. 97-101.

14. Langer Т., Lu C., Echols H., Flanagan J., Hayer M.K., Hartl F.-U. Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated protein folding. Nature. 1992. V. 356. P. 683-689.

15. Todd M.J., Lorimer G.H., Thrumalai D. Chaperonin-facilitated protein folding: Optimization of rate and yield by iterative annealing mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 4030-4035.

16. Blum P., Velligan M., Lin N., Matin A. DnaK-mediated alterations in human growth hormone protein inclusion bodies. Biotechnology. 1992. V. 10. P. 301-309.

17. Machida S., Yu Y., Singh S.P., Kim J.D., Hayashi K., Kawata Y. Overproduction of a-glucosidase in active form by an Escherichia coli system coexpressing the chaperonin GroEL/ES. FEMS Microbiol. Lett. 1998. V. 159. P. 41-46.

18. Sun A.L.; Hua Z.C.; Yao J.; Yang Y.H.; Yin D.Q. Fusion expression of human pro-urokinase with E. coli thioredoxin. Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V. 46. P. 479-86.

19. Yasukawa Т., Kanei-Ishii C., Maekawa Т., Fujimoto J., Yamamoto Т., Ishii S. Increase ofsolubility in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 25328-25331.

20. Weickert M.J., Doherty D.H., Best E.A., Olins P.O. Optimization of heterologous protein production in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 1996. V. 7. P. 494-499.

21. Mitraki A., Fane В., Haase-Pettingell C., Sturtevant J., King J. Global suppression of protein folding defects and inclusion body formation. Science. 1991. V. 253. P. 54-58.

22. Fane В., Villafane R., Mitraki A., King J. Identification of global supressors for temperature-sensitive folding mutations of the P22 tailspike protein. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 11640-11648.

23. Brems D.N. Solubility of different folding conformers of bovine growth hormone. Biochemistry. 1988. V. 27. P. 4541-4546.

24. Brems D.N., Plaisted S.M., Havel H.A., Tomich C.-S.C. Stabilization of an associated folding intermediate of bovine growth hormone by site-directed mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 3367-3371.

25. Hartl F.-U., Hlodan R., Langer T. Molecular chaperones in protein folding the art of avoiding sticky situations. Trends Biochem. Sci. 1994. V. 19. P. 20-25.

26. Privalov P. L. Intermediate states in protein folding. J. Mol. Biol. 1996. V. 258. P. 707725.

27. Carrio M.M., Cubarsi R., Villaverde A. Fine architecture of bacterial inclusion bodies. FEBSLett. 2000. V. 471. P. 7-11.

28. Mitraki A., King J. Protein folding intermediates and inclusion body formation.Biotechology. 1989. V. 7. P. 690-697.

29. Rudolf R., Bohm G., Lilie H., Jaenicke R. Folding proteins. Protein Functiton. A practical approach. 1997. P.57-99.

30. Cardamone M., Puri N.K., Brandon M.R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 1995. V. 34. P. 5773-5794.

31. Cowlay D.J., Mackin R.B. Expression, purification and characterisation of recombinant human proinsulin. FEBS Lett. 1997. V. 402. P. 124-130.

32. Burgess R.R. Purification of overproduced E. Coli RNA polimerase q-factor by solubilisation inclusion bodies and refolding from sarcosil. Methods enzymol. 1998. V. 273. P. 145-159.

33. Kutucz I., Titus J.A., Jost C.A., Segal D.M. Correct disulphide pairing efficient refolding of detergent-solubilised single-chain Fv proteins from bacterial inclusion bodies. Mol. Immunol. 1995. V.12. P. 1443-1452.

34. Stockel J., Doring K., Malotka J., Jahnig F., Dornmair K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimer class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur. J. Biochem. 1997, V.248, P. 884-891.

35. Dorin G., McAlary P., Wong K. Bacterial production of hydrophobic polypeptides. World (WO) Patent. 1996. No 96/39523.

36. Futami J., Tsushima Y., Tada H., Seno M., Yamada H. Convenient and efficient in vitro folding of disulfide-containing globular protein from crude bacterial inclusion bodies. J. Biochem. 2000. V. 127. P. 435-441.

37. Maachupalli-Reddy J., Keley B.D., De Bernardes Clark E. Effect of inclusion bodies contaminant on the oxidaitive renatiration of hen egg-white lysozyme. Biotechnol. Prog. 1997. V. 13. P. 144-150.

38. Ahn J.H., Lee Y.P., Rhee J.S. Investigation of refolding condition for Pseudomonas fluorescens lipase by respopnse surfacant methodology. J. Biotechnol. 1997. V.54, P. 151160.

39. Cerletti N., McMaster G.K., Cox D Shmitz A., Mayback B. Process for refolding recombinantly produced TGF-p-like proteins. US Patent. 1997. No 5 650 494

40. Simmons Т., Newhouse Y.V., Arnold K.S., Inerrarity T.L., Weisgrabar K.H. Human low densitie lipoprotein receptor fragment. Successful of a functionally active ligand-binding domain produced in E. coli. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 25531-25536.

41. Negro A., Onisto M., Grassato L., Caenazzo C., Garbisa S. Recombinant human TIMP-3 from E. Coli: synthesis, refolding, physico-chemical insights. Protein Eng. 1997. V. 10. P. 593-599.

42. Kim S., Baum J., Anderson S. Production of correctly folded recombinant pig lactoglobulin. Protein Eng. 1997. V. 10. P. 455-462.

43. Buchner J., Rudolph R. Renaturation, purification and characterisation of reombinant Fab fragments prodused in E. coli. Biotechnology. 1991. V. 9. P. 157-162.

44. West S.M., Chaudhuri J.B., Howell J.A. Improved protein refolding using hollow-fibre membrane dialysis. Biotechnol. Bioeng. 1998. V. 57. P. 590-599.

45. Seely R., Ladisch M. Process for protein refolding by means of buffer exchange using a continuous stationare phase capable of separating protein from salt. World (WO) Patent 1997. No 97/04003.

46. Hemaker K.h, Liu J, Seely R.J, Ladisch C.M, Ladisch M.R. Chromatography for rapid buffer exchange and refolding of secretory leykocyte protease inhibitor. Biotechnol. Prog. 1996. V.12. P. 184-189.

47. Batas B, Jones H.R, Chaudhuri J.B. Studies of the hydrodynamic volume changes that occur during refolding of lysozyme using size-exclusion chromatography. J. Chromatogr.1997. V. 766. P.109-119.

48. Batas В., Chaundhuri J.B. Protein refolding at high concentration using size-exclusion chromatography. Biotechnol. Bioeng. 1998. V. 50. P. 18-23.

49. Batas В., Schiraldi C., Chaudhuri J.B. Inclusion body purification and protein refolding using microfiltration and size exclusion chromatography. J. Biotechnol. 1999. V. 68. P. 149-158.

50. Qui H., Wen D., Belanger A., Bann H.F. Overexpression and refolding of biologically active human erythropoietin from E. coli. Protein Eng. 1997. V. 10. P.33.

51. Rogl H., Kosemund K., Kuhlbrandt W., Collinson I. Refolding of Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodies immobilised by nickel chelating chromatography. FEBSLett. 1998. V. 432 P. 21-26.

52. Stempher G., Rudolph R. Improved refolding of a matrix-bound fusion protein. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1996. V. 782. P. 506-512.

53. Stempher G., Holl-Neugabauer В., Rudolph R. Improved refolding of an immobilized fusion protein. Nat. Biotechnol. 1996. V. 14. P. 329-334.

54. Builder S., Hart R., Lester P., Reifsnyder D. Refolding of misfolded insulin-like growth factor-1. US Patent. 1997. No 5 863 304

55. Rudolph R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J. 1996. V. 10. P. 49-56.

56. Bailey J.L., Cole R.D. Studies on the reaction of sulfite with proteins. J. Biol. Chem. 1959. V. 234. P. 1733-1739.

57. Chan W. A method for the complete S sulfonation of cysteine residues in proteins. Biochemistry. 1968. V. 7. P. 4247-4254.

58. Xie Y., Wetlaufer D.B. Control of aggregation in protein folding: the temperature-leap tactic. Protein Sci. 1996. V. 5. P. 517-523.

59. Hevehan D., De Bernardes Clark E. Oxidative renaturation of iyzozyme at high concentrations. Biotechnol. Bioeng. 1997. V. 54. P. 221-230.

60. Maeda Y., Ueda Т., Imoto T. Effective renaturation of denatured and reduced immunoglobulin G in vitro without assistance of chaperone. Protein Eng. 1997. V. 9. P. 95-100.

61. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Uversky Y.N. Kinetic and equilibrium folding intermediates. Phylos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 1995. V. 348. P. 35-41.

62. Craighton Т.Е. How important is the molten globule for correct protein folding? Trends Biochem. Sci. 1997. V. 22. P. 6-10.

63. Yon J.M. The specifiety of protein aggregathion. Nat. Biotechnol. 1996. V. 14. P. 1231.

64. Goldberg M.E., Rudolph R., Jaenicke R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatureted-reduced white egg lysozyme. Biochemistry. 1991. V. 30. P. 2790-2797.

65. Speed M.A., Wang D.I.C., King J. Specific aggregation of partially folded polypeptide chain: the molecular basis of inclusion body composition. Nat. Biotechnol. 1996. V. 14. P. 1283-1287.

66. De Bernardes Clark E., Hevehan D., Szela S., Maachupalli-Reddy J. Oxidative renaturation of hen egg-white lysozyme. Folding vs. aggregation. Biotechnol. Prog. 1998. V. 14. P. 47-54.

67. Speed M.A., King J., Wang D.I.C. Polimerization mechanism of polipeptide chain aggregation. Biotechnol. Bioeng. 1997. Y. 54. P. 333-343.

68. Knappik A., Pluckthun A. Enginereed turns of a recombinant antibody improve its in vitro folding. Protein Eng. 1995. V. 8. P. 81-89.

69. Katzav-Gozansky Т., Hanan E., Solomon B. Effect of monoclonal antibodies in preventing carboxipeptidase A aggregation. Appl. Biochem. Biotechnol. 1996. V. 23. P. 227-230.

70. Buchner J., Schmidt M., Fuchs M., Jaenicke R., Rudolph R., Schmid F.X., Kiefhaber T. GroE Facilitates Refolding of Citrate Synthase by Suppressing Aggregation. Biochemistry. 1991. V. 30. P.l586-1591.

71. Martin J., Langer Т., Boteva R., Schramel A., Horwich A.L., Hartl F.-U. Chaperonin mediated protein folding at the surface of GroEL trough a "molten globule"-like intermediate. Nature. 1991. V. 352. P. 36-42.

72. Miller D.M., Kurzban G.P., Mendoza J.A., Chirgwin J.M., Hardies S.C., Horowitz P.M. Recombinant Bovine Rhodanese Purification and Comparison with Bovine Liver Rhodanese. Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1121. P. 286-292.

73. Thomas J.G., Ayling A., Banneyx F. Molecular chaperones, folding, catalysts and the recovery of active recombinant proteins from E. coli. Appl. Biochem. Biotechnol., 1997. Y. 66. P. 197-238.

74. Schonbrunner R.E., Schmid F.X. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase improves the efficiency of protein disulfide isomerase as a catalyst of protein folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. V. 89. P. 4510-4513.

75. King J. Refolding with piece of the ring. Nat. biotechnol. 1997. V. 15. P. 514-515.

76. Altamirano M., Golbik R., Zahn R., Bucle A.M., Fersht A.R. Refolding chromatography with mini-chaperones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 3576-3578.

77. Rozema D., Gellman S.H. Artificial chaperone-assisted refolding of carbonic angidrase B. J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 3478-3487.

78. Rosema D., Gellman S.H. Artifical chaperone-assisted refolding of denaturated-reducedlysozyme: modulation of the competition beetween renaturation and aggregation. Biochemistry. 1998. V. 35. P. 15760-15771.

79. Couthon F., Clottes E., Vial C. Refolding of SDS- and thermally denatured MM-creatine kinase using cyclodextrines. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 227. P. 854-860.

80. Arakawa Т., Timasheff S.N. Stabilization of protein structure by sugars. Biochemistry 1982. V. 21. P. 6536-6544.

81. Sawano H., Kuomoto Y., Ohta K., Sasaki Y., Segawa S., Tachibana H., Efficient in vitro folding of the three-disulfide derivatives of hen lysozyme in the presence of glycerol. FEBSLett. 1992. V. 303. P. 11-14.

82. Fischer В., Sumner I., Goodenough P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol. Bioeng. 1993. V. 41. P. 3-13.

83. Fischer G., Smidt F.X. The mechanism of protein folding. Implications of in vitro refolding models for de novo protein folding and translation in the cell. Biochemistry. 1990. V. 29. P. 2205-2212.

84. Hagen A.J., Hatton T.A., Wang D.I.C. Protein refolding in reversed micelles: interactions of the protein with micelle components. Biotech. Bioeng. 1990. Y. 35. P. 966-975.

85. Arora D., Khanna N. Method for increasing the yield of properly folded recombinant human gamma interferon from inclusion bodies. J. Biotechnol. 1996. Y. 52. №2. P. 127133.

86. Cleland J.L., Hedgepeth C., Wang D.I.C. Polyethylene Glycol Enhanced Refolding of Bovine Carbonic Anhydrase-B Reaction Stoichiometry and Refolding Model. J. Biol.Chem. 1992. V. 267. P. 13327-13334.

87. Cleland J.L., Builder S.E., Swartz J.E., Winkler M„ Chang J.Y., Wahg D.I.C. Polyethylene glycol enhanced protein refolding. Biotechology. 1992. V. 10. P. 1013-1019.

88. Wang, Z., Landry, S.J., Gierasch, L.M., Srere, P.A. Renaturation of Citrate Synthase -Influence of Denaturant and Folding Assistants. Protein Sci. 1992, V. 1. P. 522-529.

89. Carlson, J. D., Yarmush, M. L. Antibody assisted protein refolding. Biotechnology. 1992. V. 10. P. 86-91.

90. Consler, T.G., Lee, J.C. Domain Interaction in Rabbit Muscle Pyruvate-Kinase. 1. Effects of Ligands on Protein Denaturation Induced by Guanidine-Hydrochloride. J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 2787-2793.

91. Wetlaufer D.B., Xie Y. Control of aggregation in protein folding: a variety of surfactants promote renaturation of carbonic angidrase II. Protein Sci. 1995. V. 4. P. 1535-1543

92. Maeda Y., Yamada H., Ueda Т., Imoto T. Effect of additives on the renaturation of reduced lysozyme in the presence of 4M urea. Protein Eng. 1996. V. 9. P. 461-465.

93. Bam N.B., Cleland J.L., Randolph T.W. Molten globule intermediate of recombinant human growth hormone: stabilisation with surfactants. Biotechnol. Prog. 1996. V. 12. P. 801-809.

94. Goldberg M.E., Expert-Bezanson N., Vuillard L., Rabiloud T. Non-detergent sulphobetaines: a new class of molecules that facilitate in vitro protein renaturation. Fold. Design. 1996. V. 1. P. 21-27.

95. Beutler В., Cerami A. Cachectin and tumour necrosis factor as two sides of the same biological coin. Nature. 1986. V. 320. P.584.

96. Pennica D., Nedwin G.E. Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature. 1984. Y. 312. P. 724-732.

97. Oftmar J., Kabelitz D. Molecular weight of recombinant human tumor necrosis factor.1987. J. Biol. Chem. V.262. P.7484-7490.

98. Smith R.A., Baglioni C. The active form of tumor necrosis factor is a trimer. 1987. J. Biol. Chem. V.262. p.6951-6960.

99. Krammer S.M. and Carwer M.E. Serum-free in vitro bioassay for the detection of tumor necrosis factor. J. Immunol. Methods. 1986. V. 93. P. 201-206.

100. Шингарова JI.H., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. Мутанты фактора некроза опухолей человека: получение и некоторые свойства. Биоорган. Химия. 1996. Т. 22. С. 243-251.

101. Wingfield P., Pain R.H., Craig S. Tumour necrosis factor is a compact trimer. FEBS lett. 1987. V. 211. P. 179-184.

102. Adams В., Regenass U., Cerletti N. An efficient method for the purification of TNF from rabbit serum. Lymphokines res. 1983. V. 6. P. 203-214.

103. Kunitoni M.G., Cuninco R.L., Staats S.J. Reversible subunit dissociation of recombinant TNF during hydrophobic interaction chromatography. J. Chromatogr. 1988. V. 443. P. 205-220.

104. Мисуно Н.И., Осипович O.A., Идельсон Г.Л., Судариков А.Б., Колесникова Т.С., Панютич А.В., Войтенюк Н.Н. Синтез а-ФНО моноцитами человека in vivo. Бюлл. эксп. биол. и мед. 1991. N. 9. С.287-290.

105. Lewis G.D., Aggarwal В.В. Modulation of the growth of transformed cells by human tumor necrosis factor-a and interferon-y. Cancer Res. 1987. V. 47. P. 5382-5391.

106. Vilcek J., Palombella V., Henriksen-DeStefano D. Fibroblast growth factor enhancing activity of tumor necrosis factor and its relationship to other polypeptide growth factors. J. Exp. Med. 1986. V. 163. P. 632-636.

107. Loetscher H., Schlaeger E.J. Purification and partial amino acid sequence analysis of two distinct tumor necrosis factor receptors from HL-60 cells. J. Biol. Chem. 1990. V.265. P.20131-20138.

108. Kronke M., Schluter C., Pfizenmaier K. Tumor necrosis factor inhibits MYC expression in HL-60 cells at the level of mRNA transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 469-473.

109. Ming W.J., Bersani L., Mantovani A. Tumor necrosis factor is chemostatic for monocytes and polymorphonuclear leukocytes. J. Immunol. 1987. V. 138. P. 1469-1474.

110. Shirai Т., Yamaguchi H., Ito H., Todd C.W., Wallace R.B. Cloning and expression in Escherichia coli of the gene for human tumour necrosis factor. Nature. 1985. V.313. P. 803-806.

111. Дранник Г.Н., Гриневич Ю.А., Дизик Г.М. Иммунотропные препараты. Киев. 1994. С. 150-151.

112. Van Ostade X., Tavernier J., Plange Т., Fiers W. Localization of the active site of human tumour necrosis factor (hTNF) by mutational analysis. EMBO J. 1991. V. 10. P. 827-836.

113. Sato N., Caux C., Kitamura Т., Watanabe V., Arai K. Exspression and factor -dependent modulation of the interleukin -3 receptor subunits on human hematopoetic cells. Blood. 1993. V. 83. P. 752-761.

114. Tafuri A., Defelice L., Goodacre A., Finu S., Petrucci M.T., Valentini Т., Alimena G., Petti M.C., Handell F. Interleukin-3 priming in acute myeloid leukamia patient. Brit. J. Haematol. 1995. V. 91. P. 234-244.

115. Scaddem D.T., Levit J.P., Busnahan J., Gere J., Mcgrath J., Wand Z.Y., Resra P.J., Yound D., Hammer S.W. In vivo effects of interleukin-3 in HIV type 1 infected patients with cytopenia. AIDS Res. 1995. V. 11. P. 731-740.

116. Луценко C.B., Гуревич А.И., Птицын Л.П., Рязанов Л.А., Смирнов В.А. Системы экспрессии в Е. coli рекомбинантного интерлейкина-3. Биоорган, химия. 1992. Т. 18. С. 391-396.

117. Dorreser L.S., Burger Н., Wagemaker G., Dehoning J.P. Indetification of functional domains of interleukin-3 byconstruction of primate interspecies chimera. Growth Factors. 1994. V. 11. P. 93-104.

118. Freeman J.J., Parr G.R., Hecht R.I., Morris J.C., McKearn J.P. Secondary structure of human interleukin-3. Int. J. Biochem. 1991.Y. 23. P. 353-360.

119. Feng Y., Klein B.K., McWherter C.A. Three-dimensional solution structure and backbone dynamics of a Variant of human Interleukin-3. J. Mol. Biol. 1996. V. 259. P. 524-541.

120. Kraulis P.J. MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J. Appl. Crystallog. 1996. V. 24. P. 946-950.

121. Kimmenenade A., Bond M.W., Shumacher J.H., Laguon C., Expression, renaruration and purificarion of recombinant interleukin-4 from E. coli. Eur. J. Biochem. 1988. V. 173. P. 109-114.

122. Dijkmans. R., Billiau. A. Interferon gamma: a master key in the immune system. Curr. Opin. Immunol. 1988. V. 2. P. 269-274.

123. Wheelock E.F. Isolation and characterisation of new subspices human immuneinterferon. Science. 1965. V. 149. P. 310-311.

124. Rinderknecht E., O'Connor B.H., Rodriguez H. Natural human interferon-gamma: complete amino acids sequence and determination of sites of glycosylation. J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 6790-6797.

125. Yip Y.K., Barrowclough B.S., Urban C., Vilcheck. J. Molecular weight of human gamma interferon is similar to that of other human interferons. Science. 1982. V. 215. P. 411-413.

126. Hsu Y.R., Arakawa T. Structural studies on acid unfolding and refolding of recombinant human interferon-y. Biochemistry. 1985.V. 24. P. 7959-7963.

127. Ealick S.E., Cook W.J., Vijay-Kumar S., Carson M., Nagabhushan T.L., Trotta P.P., Bugg C.E. Three-dimensional structure of recombinant human interferon-y. Science. 1991. V. 252. P. 698-702.

128. Slodowski O., Bohm J., Schone В., and Otto B. Carboxy-terminal truncated rhuIFN-y with a substitution of Gin 133 or Ser 132 to Leucine leads to higher biological activity than in the wild type. Eur J. Biochem. 1991. V. 202. P. 1133-1140.

129. Chan S.J., Keim P., Steiner D.F. Cell-free synthesis of rat preproinsulins: characterisation and partial amino acid sequence determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 1964-1968.

130. Brown H., Sanger F., Kitai R. The structure of sheep and pig insulins. Biochem. J.1955. V. 60. P. 556-565.

131. Nicol S., Smith L.F. Amino-acid sequence of human insulin. Nature. 1960. V. 187. P. 483.

132. Шредер Э., Любке К. Пептиды. М., 1969. Т. 2. С. 468.

133. Frank В.Н., Pekar А.Н., Veros A.J. Insulin and proinsulin conformation in solution. Diabets suppl 2. 1972. V. 21. P. 486-491.

134. Milthorpe B.K., Nicol L.W., Jeffrey P.D. The polimerisation pattern of zinc (II) insulin at pH 7. Biochem. Biophys. Acta. 1977. V. 495. P. 195-202.

135. Petrides D., Sapidou E., Calandranis J. Computer-aided process analysis and economic evaluation for biosynthetic human insulin production a case study. Biotechnol. Bioeng. 1995. V. 48. P. 529-541.

136. Ladisch M.R., Kohlmann K.L. Recombinant human insulin. Biotechnol. Prog. 1992. V. 8. P. 469-478.

137. Thim L., Hansen M.T., Norris K., Hoegh I., Boel E., Forstrom J., Ammerer G., Fiil N.P. Secretion and processing of insulin precursors in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 6766-6770.

138. Chen, J.Q., Zhang, H.T., Ни, M.H., and Tang, J.G. Production of human insulin in an E. coli system with Met-Lys-human proinsulin as the expressed precursor. Appl. Biochem. Biotechnol. 1995. Y. 55. P. 5-15.

139. Nilsson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. Integrated production of human insulin and its C-peptide. J. Biotechnol. 1996. V. 48. P. 241-250.

140. Коробко В.Г., Селезнева В.И. Конструирование гена, кодирующего предшественник фактора некроза опухолей человека. Биоорган. Химия. 1991. Т. 17. С. 1365-1374.

141. Ikehara М., Fujimoto К., Matsuo N., Tamatsukiri S., Yoshida Т., Uemura H., Nishikava S., Uesugi S. and Ohtsuka E. Synthesis and expression of a gene for tumor necrosis factor. Chem. Farm. Bull. 1988. V. 36. P. 291-296.

142. Луценко C.B., Гуревич А.И., Каневский Ю.А., Смирнов В.А., Назимов И.В., Ажикина Т.Л., Чернов И.П., Ростапшов В.М., Сонина Н.В., Ажаев А.В. Выделение рекомбинантного интерлейкина-3, продуцируемого Е. coli. Биоорган, химия. 1991. Т. 17. С. 1649-1654.

143. P.W. Riddles, R.L. Blakeley, В. Zerner. Reassessement of Ellman's reagent. J. Metods Enzym. 1983. V. 91. P. 49.

144. Bailey S.M., Blum P.H., Meagher M.M. Improved homogenization of recombinant Escherichia coli following pretreatment with guanidine hydrochloride. Biotechnol Prog. 1995. Y. 5. P. 533-539.

145. Patrick, J.S., and Lagu, A.L. Determination of recombinant human proinsulin fusion protein produced in Escherichia coli using oxidative sulfitolysis and two-dimensional HPLC. Anal. Chem. 1992. V. 64. P. 507-511.

146. Мальцев K.B., Вульфсон A.H., Иванов B.T. Метод получения проинсулина человека. 1995. Пат. РФ № 2045535.

147. Мальцев К., Вульфсон А., Муравьева Т., Коваленко В., Галиев А., Петров П., Харитонов В., Иванов В. Метод выделения гибридного белка, содержащего последовательность проинсулина человека. 1996. Пат. РФ № 206700.

148. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М. «Наука». 1977. С. 74-75.160. Там же. С. 98-91.

149. Kendrick B.S., Cleland J.L., Lam X., Nguyen Т., Randolph T.W., Manning M.C., Carpenter J.F. Aggregation of recombinant human interferon gamma: kinetics and structural transitions. J. Pharm. Sci. 1998. V. 87. P. 1069-1076.

150. Nandi P.K. Evidence of molten globule like state(s) of interferon gamma in acidic and sodium perchlorate solutions. Int. J. Biol. Macromol. 1998. V. 22. P. 23-31.

151. Beldarrain A., Lopez-Lacomba J.L., Furrazola G., Barberia D., Cortijo M. Thermal denaturation of human gamma-interferon. A calorimetric and spectroscopic study. Biochemistry. 1999. V. 38. P. 7865-7873.

152. Blanch E.W., Hecht L., Barron L.D. New insight into the pH-dependent conformational changes in bovine beta-lactoglobulin from Raman optical activity. Protein Science. 1999. V. 8. P. 1362-1367.

153. Swietnicki R., Petersen P., Gambetti W., Surewicz K. pH-dependent Stability and Conformation of the Recombinant Human Prion Protein PrP(90-231). J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P.27517-27520.

154. Boyle D.M., McKinnie R.E., Joy W.D., Violand B.N., McLaughlin J.K., Landis B.H.Evaluation of refolding conditions for a recombinant human interleukin-3 variant (daniplestim) Biotechnol. Appl. Biochem. 1999. V. 30. P. 163-170.

155. Yasuda M., Murakami Y., Sowa A., Ogino H., Ishikawa H. Effect of additives on refolding of a denatured protein. Biotechnol. Prog. 1998. V. 14. P. 601-606.

156. Klyushnichenko V.E., Wulfson A.N. Recombinant human insulin. II. Size-exclusion HPLC of biotechnological precursors. Factors influencing on retention and selectivity. Pure & Appl. Chem. 1993. V. 65. P. 2265-2272.

157. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

158. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle protein dye-binding. Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

159. Andrade M.A., Chacon P., Merelo J.J., Moran F. Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism spectra using an unsupervised learning neural network Protein Eng. 1993. V. 6. P. 383-390.

160. Merelo J.J., Andrade M.A., Prieto A., Moran F. Proteinotopic feature maps. Neurocomputing. 1994. V.6. P.l-12.