Новая технологическая схема получения генно-инженерного инсулина человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им.академиков М. М.ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

МАЛЬЦЕВ Константин Валентинович.

НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА.

02.00.10 - Биоороганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химическеих наук.

МОСКВА 1994

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии с комплексной опытной установкой Института бисорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова.

Научный руководитель; кандидат химических наук А.Н. Вульфсон. Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор fö. П. Швачкин; доктор химических наук, профессор И.А. Донецкий.

Ведущая организация: Московская академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится 18 мая 1994 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д. 002.35.01 при Институте биосрганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова.

Автореферат разослан " " апреля 1994 года.

специализированного совета

кандидат химических наук

Ученый секретарь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Основным средством лечения и предотвращения развития сахарного диабета является парэнтеральное введение больным инсулина, потребность в котором в нашей стране исчисляется сотнями килограммов в год. Однако инсулин, выделяемый прежде из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней, структурно отличается от инсулина человека и может вызывать аллергические реакции. Поэтому в настоящее время в употребление вводится инсулин, полностью идентичный инсулину человека, получаемый полусинтетическим способом из свиного инсулина или при помощи рекомби-нантных микроорганизмов, трансформированных плазмидой со встроенным экспрессирующимся геном инсулина человека. Получение инсулина из поджелудочных желез является процессом, требующим-больших количеств исходного материала, и ощущается его нехватка в связи с увеличением инсулин7зависимых больных. Поэтому получение инсулина при помощи рекомбинантных микроорганизмов становится более актуальным. Однако в микроорганизмах инсулин обычно синтезируется в составе своего биотехнологического предшественника, и его получение является сложным процессом, включающим трансформацию и очистку ' промежуточных продуктов и характеризующимся большим числом стадий. Поэтому существенно возрастает значение разработки оптимальной технологической схемы получения, которая должна обеспечить высокий выход и чистоту конечного продукта, а также легко масштабироваться.

Цель работы. Настоящая работа посвящена разработке технологи-

Список сокращений:

ГБ - гибридный белок, в котором домен В белка А соединен с последовательностью проинсулиНа через остаток метионина; ГБ' ' - гибридный белок;

ВПАК - сополимер винилпирролидона с акролеином; ПААГ - полиакриламидный гель; C-KR - (Lys, Arg)-C-nenrafl человека; Ins-R - (Arg В31)-инсулин человека;' Ins-RR - (Arg B31,Arg B32)-инсулин человека; desT-Ins - дез-(Thr ВЗО)-инсулин человека.

ческой схемы получения генно-инженерного инсулина человека, использующей в качестве продуцента бактериальный штамм, в котором инсулин экспрессируется в составе ГБ, и позволяющей осуществить масштабную наработку продукта с высоким выходом и чистотой.

Научная новизна. Разработана новая технологическая схема получения генно-инженерного инсулина человека на основе новых способов трансформации биотехнологических предшественников инсулина в инсулин с широким применением мембранной фильтрации и частичным задействованием, отечественных материалов.

Практическая ценность работы. На основе разработанной схемы наработаны образцы субстанции инсулина человека для проведения испытаний и изготовления лекарственных форм, создан "Опытно-промышленный регламент на производство инсулина человека", спроектирована опытно-производственная линия получения инсулина производительностью 80 кг в год на СНОПЕ ПО "Прогресс" (Казахстан). .

Апробация работы и публикации. Результаты работы доложены на V Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Юрмала, 1990); III Всесоюзном семинаре "Актуапьные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения" (Степногорск, 1991); II Российско-Израильском симпозиуме по петидам и белкам (Москва, 1992); 17 Международном симпозиуме по колоночной жидкостной хроматографии "ВЭЖХ 93" (Гамбург, 1993); 12 Международном симпозиуме по биомедицинскому применению хроматогроафии и электрофореза и 2 Международном симпозиуме по применению ВЭЖХ в химии ферментов (Верона, 1993). По материалам диссертации имеется 19 печатных работ, в том числе 5 авторских свидетельств.

'Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (179 наименований). Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 14 рисунков, 3 таблицы и 4 схемы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. В обзоре литературы дана подробная характеристика структуры инсулина. Показано значение дисульфидных связей в формировании

пространственной структуры биологически активной . молекулы. Это вызвано тем, что невозможно разработать эффективную схему получения без представлений о структуре, свойствах и характеристиках конечного продукта. Особенно зто важно при получении генно-инженерного инсулина, который в бактериальных рекомбинантных клетках синтезируется в составе своего неактивного биотехнологического предшественника - гибридного белка, значительно отличающегося по структуре и свойствам от инсулина. Отражен прослеживающийся интерес к созданию новых антидиабетических препаратов с улучшенными терапевтическими свойствами на основе изучения;структурно-функциональных взаимосвязей в молекуле и определения эволюционно изменчивых и консервативных районов, ответственных за биологическое действие инсулина. В частности, создание антидиабетических лекарственных форм пролонгированного действия без специфических добавок видится в использовании производных инсулина человека, модифицированных основными группами. Этот мотив актуален в связи с тем, что в разработанной схеме в качестве промежуточного продукта получается.1пб-1?Я, являющийся основным, и в перспективе возможна постановка поисковых работ в этом направлении.

В обзоре литературы рассмотрены различные способы получения инсулина. Показано, что выход биологически активной молекулы инсулина при комбинировании отдельных природных, химически синтезированных или полученных с помощью генетической инженерии цепочек А и В - низкий. Оказалось, что образование правильных дисульфид-ных связей в полипептиде с последовательностью проинсулина. который стал доступен с развитием методов генетической инженерии, проходит с большей эффективностью. По аналогии с эндогенным синтезом инсулина в клетках поджелудочной железы были созданы штаммы рекомбинантных дрожжевых клеток, которые способны экспрессировать предшественник инсулина, включающий пре-последовательность, обеспечивающую прохождение белка по секреторному пути дрожжевой клетки-хозяина. При этом, как и в клетках поджелудочной железы, пре-последовательность отщепляется и формируются правильные ди-сульфидные связи. Получение инсулина в этом случае сводится к выделению предшественника из культуральной среды, удалению соединительного пептида с образованием инсулина и его заключительной очистке. Несмотря на то, что большая часть процессинга предшест-

венника инсулина в дрожжевых штаммах-продуцентах может происходить in vivo, что значительно упрощает технологию получения инсулина, использование бактериальных штаммов-суперпродуцентов является экономически более предпочтительным благодаря высокому уровню экспрессии инсулина в составе ГБ' в виде тел включения, которые накапливаются в цитоплазме. Однако, в этом случае необходимо in vitro проводить трансформацию предшественника инсулина в инсулин, включающую кроме удаления соединительного пептида расщепле-' ние ГБ' с получением полипептидной последовательности проинсулина, и формирование в молекуле правильной пространственной структуры, закрепленной дисульфидными связями. Это влияет на стоимость производства и конечный выход продукта, который обычно составляет несколько процентов. В связи с этим возрастает значение эффективного проведения процессов трансформации и препаративной очистки как самого инсулина, так и.его биотехнологических предшественников. Для достижения высокой чистоты конечного продукта обычно применяют большое количество хроматографических стадий. Наиболее часто применяемыми видами хроматографий. являются ионообменная (например, анионообменная хроматография для очистки сульфированных в результате реакции сульфитолиза предшественников инсулина) и гель-хроматография, которая использует выраженное различие в размерах ГБ', проинсулина и инсулина. Для достижения высокой чистоты конечного продукта применяют препаративную обращенно-фазовую ВЭЖХ инсулина. Рассмотрение основных способов получения инсулина помогло сформировать ориентиры при разработке эффективной технологической схемы получения генно-инженерного инсулина.

' II. ' РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ ' ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА.

Введение.

При разработке новой технологической схемы получения генно-инженерного инсулина человека был использован опыт работы автора по разработке препаративных схем выделения биологически активных факторов из мозга животных, когда в одном цикле наработки использовалось свыше 40 кг исходного сырья. Сущность разработанных препаративных схем выделения заключается в широком применении раз-

личных видов мемабранной фильтрации, особенно на начальных этапах выделения, вместо таких традиционных не очень технологичных процессов, как центрифугирование, гель-хроматография, концентрирование под вакуумом в роторном испарителе. Другим отличительным признаком разработанных схем является применение на начальных этапах выделения двух следующих друг за другом ионообменных хро-матографических стадий с промежуточным обессоливанием при помощи ультрафильтрационных мембран. Другие виды хроматографий (прямо- и обращенно-фазовая, гель-хроматография) применяются на более поздних этапах выделения и очистки. Такое распределение хроматографи-ческих стадий наиболее технологично и значительно облегчает крупномасштабную наработку веществ. Это объясняется тем, что нагрузка образца на единицу объма сорбента является одной из самых высоких именно при использовании ионнообменной хроматографии, причем при этом в качестве элюентов используются дешевые водно-солевые буферные растворы. Эффективность применения разработанных препаративных схем возрасла с приобретением специального оборудования, позволяющего создавать гибкие технологические линии для выделения белков. Разработанные подходы и методы препаративного выделения, изучение вопросов, связанных со структурой, структурно-функциональными взаимосвязям^ и способами получения инсулина, а- также решение проблем*, связанных с трансформацией биотехнологических предшественников инсулина в инсулин, обеспечивающих.высокий выход конечного продукта, -явились базой для разработки новой технологической схемы получения генно-инженерного инсулина человека.

Характеристика схемы.

Технологическая схема получения генно-инженерного инсулина человека разработана на основе штамма-продуцента £. coli JM 109 N 1084, в котором плазмидный вектор несет последовательность ДНК, кодирующую ГБ, включающий полипептиднук пйследив&толс^ссть проин-сулина человека. Этот белок содержит в качестве лидирующего полипептида иммуноглобулин-связывающий домен белка А из Staphylococcus aureus, соединенный через остаток метионина с последовательностью проинсулина человека. Для этого штамма-продуцента была отработана с высокой воспроизводимостью в лабораторном и 3000-литровом ферментерах технология культивирования (выполнено на КОУ

ИБХ РАН Т. И. 'Костроминой), обеспечивающая выход биомассы клеток (75 % влажности) 22 - 25 г/л с содержанием экспрессированного ГБ от общего количества белков в клетках - около 30 % (по данным БОБ-электрофореза в ПААГ с последующим денситометрированием обработанного Кумасси геля при 633 нм).

На схеме 1. представлены основные стадии технологической схемы получения генно-инженерного инсулина человека.'

БИОМАССА

1. Дезинтеграция клеток

2. Выделение и отмывка тел включения мембранной фильтрацией

3. Растворение ГБ

4. Отделение раствора ГБ от дебриса мембранной фильтрацией

5. Осаждение примесей (рН 5,5)

6. Отделение примесей мембранной фильтрацией "7. Лиофилизация

ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК

4 1- Обработка ВКДО (С1СЮ

ПОЛИПЕПТИД С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ ПРОИНСУЛИНА

1. Окислительный сульфитолиз

2. Хроматографическая очистка проинсулина-Б-(БОз)6

3. Замыкание дисульфидных связей

Т 4. Хроматографическая очистка проинсулина . ПРОИНСУЛИН

Обработка трипсином и карбоксипептидазой В.

2. Хроматографическая очистка инсулина • ИНСУЛИН

Схема 1. Технологическая схема получения генно-инженерного инсулина человека.

Основными особенностями этой схемы является применение на всех этапах мембранной фильтрации, использование четырех ионообменных хроматографических процессов, которые применяются только на этапах получения проинсулина и инсулина, частичное задействование

отечественных сорбентов и фильтрационных мембран. Выделение и очистка ГБ осуществляется с применением простого' и технологичного метода осаждения примесей и мембранной фильтрации. На этапе расщепления ГБ с получением полипептидной последовательности проин-сулина проверена возможность использования хлорциана, который благодаря летучести может использоваться многократно: Процесс получения проинсулина осуществляется на основе разработанного способа, обеспечивающего высокий выход в реакции ренатурирования. Получение инсулина из проинсулина проводится по схеме, обеспечивающей эффективное отделение от целевого продукта desT-Ins, являющегося трудноудаляемой близкородственной примесью. При этом в качестве промежуточного продукта получается основный Ins-RR, который в перспективе может быть использован как активное начало при создании антидиабетических лекарственных форм пролонгированного действия. Разработанная технологическая схема обеспечивает 6,5 % выход инсулина с чистотой, удовлетворяющей требованиям фармакопейных статей, а также получение в качестве побочного продукта С-пептида 95 % чистоты. Схема состоит из следующих основных этапов:

1. Выделение и очистка ГБ из биомассы рекомбинантных клеток.

2. Расщепление ГБ с получением полипептида с последовательностью проинсулина! ; _ -

3. Получение~7тройЯсулина.

4. Получение инсулина из проинсулина.

II. 1. Выделение и очистка ГБ.

ГБ накапливается в цитоплазме клеток в виде плохо растворимых тел включения, что защищает его от действия внутриклеточных про-теаз и облегчает процесс выделения, первым этапом которого является разрушение клеток.и отмывка тел включения от водорастворимых примесей. Дезинтеграцию клеток проводили по методу "French pressing" при помощи проточного дезинтегратора высокого давления типа МС-4 "Gaulin", позволяющего обрабатывать большое количество биомассы. Было установлено, что трехкратное пропускание клеточной суспензии через дезинтегратор под давлением 550-600 атм обеспечивает эффективность разрушенния клеток на уровне 95 % (определено

методом прямого подсчета клеток в камере Горяева). Для отмывки тел включения от водорастворимых примесей более -технологичным по сравнению с центрифугированием оказалось применение мембранной технологии, которая позволяет исключить.потери тел включения и легко масштабируется. Мембранная фильтрация позволяет также отмывать тела включения отмывочным буферным раствором в режиме диа-фильтрации непосредственно после их концентрирования. Эти процессы отработаны как на установке Ре 11 icon (Millipore) с касетами' HVLP, так и на- отечественной установке "Пластек" с мембранами. УПМ-100.

Для растворения ГБ из тел включения использовали раствор 7,5 М мочевины в 30 мМ трис-HCl (рН 8,0), в который добавляли 2-меркап-тоэтанол. Для отделения растворившегося ГБ от дебриса и других нерастворимых в .мочевине примесей разработали сопряженные во времени процессы микро- и ультрафильтрации на мембранах. При микрофильтрации ГБ отделяется от нерастворимых примесей, а при ультрафильтрации он концентрируется, причем ультрафильтрационный раствор используется для вымывания ГБ из микроконцентрата в режиме диафильтрации. Сопряжение этих процессов во времени позволяет без дополнительных затрат на приготовление буфера максимально полно извлечь ГБ. Процессы ультрафильтрации отработаны с использованием как импортных мембран (PTGC, Millipore), так и отечественных мембран (Биопор-Т10, Пластек). '

Хроматографическая очистка полученного ГБ осложнена наличием в его молекуле шести цистеиновых остатков, которые в процессе выделения могут образовывать различные как внутримолекулярные, так и межмолекулярные дисульфидные связи. В результате ГБ существует в виде множества молекулярных изоформ и при проведении хроматогра-фической очиски не может элюироваться с колонки в виде одного пика. По тем же причинам не удается проводить непосредственный анализ содержания ГБ на разных стадиях его выделения при помощи ВЭКХ методов. Для этой цели удобным и эффективным методом анализа является SDS-электрофорез в ПААГ по Лэммли. Приведение ГБ к одной форме, например, посредством реакции сульфитолиза, позволяет при проведении хроматографической очистки элюировать его в виде одного пика. Однако, дополнительная стадия - сульфитолиз - требует дополнительных реактивов и уменьшает общий выход ГБ.

Для очистки ГБ вместо дорогих хроматографических процессов был предложен простой и технологичный метод осаждения примесей, который хорошо сочетается с фильтрационной техникой для их отделения от раствора ГБ. Было найдено, что при рН 5,5 и концентрации мочевины ниже 2 М формируется осадок, большую часть которого составляют примесные белки. Основная масса ГБ (85%) остается в растворе, и его чистота достигает 70% (по данным гель-электрофореза).

Уточнение структуры ГБ (рис.1) секвенированием по методу Эдма-

NH2-A-D-N-K-F-N-K-E-Q-Q-N-A-F-Y-E-I-L-H-L-P-N-L-N-E-E-Q-R-N-G-

58

F-I-Q-S-L-K-D-D-P-S-Q-S-A-N-L-L-A-E-A-K-K-L-N-D-A-Q-A-P-K-A-D-

66

N-K-E-S-M-F-V-N-Q-H-L-C-G-S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G-E-R-G-F-F-Y-t :

T-P-K-T-R-R-E-A-E-N-L-Q-V-G-Q-V-E-L-G-G-G-P-G-A-G-S-L-Q-P-L-A-t ' 151

L-E-G-S-L-Q-K-R-G-I-V-E-Q-C-C-T-S-I-C-S-L-Y-Q-L-G-N-I-C-N-COOH t

. Рис. 1. Аминокислотная последовательность ГБ. Последовательность (1-58) принадлежит домену В белка А из Staphylococcus aureus. Последовательность (66-151) принадлежит проинсулину человека.

на (выполнено в ИБХ РАН к. х. н. И. В. Назимовым и к. х. н. О.Ю. Чертовым) подтвердило, что лидирующим полипептидом является иммуно-глобулин-связывающий домен В белка А. С уточненной формулой ГБ хорошо согласуется его молекулярный вес. определенный с помощью времяпролетного масс-спектрометра., (разработанного в ФИЭПХФ РАН) (табл. 1.).

Наличие в молекуле ГБ домена В белка'А позволяет использовать этот промежуточный продукт технологической схемы в качестве самостоятельного продукта для выделения иммуноглобулинов посредством аффинной хроматографии на сорбентах- с иммобилизованным ГБ. В частности, ГБ1 был иммобилизован на носителях Сефароза и Биохром, и полученные сорбенты были- использованы для очистки моноклональ-ных антител подклассов IgGl. IgG2a, IgG2b мыши, а также для выделения суммарной фракции IgG из сыворотки крови кроликов, иммуни-

Таблица 1. Масс-спектрометрический анализ инсулина и его биотехнологических предшественников.

1 1 Белок 1 1 1 Молекулярный вес, Da 1 1 расчетный . I определенный 1

1 ГБ 1 ■ 16671.6 1 1 1 16678 ±3 1

1 Проинсулин 1 9388.6 1 9390.8 ± 1.3 1

1 Инсулин 1 1 5807.6 1 1 5807.6 ± 0.7 1 | '

зированных С-пептидом и проинсулином при • разработке тест-системы определения проинсулина в субстанции инсулина.

II.2. Расщепление-ГБ с получением полипептида с последовательностью проинсулина.

Расщепление гибридных белков, у которых целевой белок соединен с лидерным пептидом через остаток метионина, обычно проводят при помощи реакции с бромцианом в муравьиной кислоте. С целью увеличения выхода и сокращения расхода бромциана были оптимизированы условия: длительность -7ч, концентрация белка - 45 г/л, расход бромциана - 40г/100 г лиофилизата ГБ. Выход продукта при этом составил 85%. Полноту прохождения реакции контролировали с помощью SDS-электрофореза в ПААГ. На конечный выход инсулина влияет время нахождения белка в кислых условиях, так как при этом происходит частичное дезамидирование белка. Помимо стоимости реагента, сокращение расхода бромциана до 40 г на 100 г лиофилизата ГБ уменьшает объем работ, связанных с уничтожением отходов, так как высокотоксичный бромциан'при завершении реакции необходимо разлагать. В промышленных масштабах для расщепления ГБ целесообразнее использовать хлорциан, который благодаря летучести может использоваться многократно. Были отработаны условия расщепления ГБ хлорцианом (совместно с ГНИИОХТ) с выходом 80?. Была проведена наработка инсулина из нескольких партий (всего около 150 г) ГБ, который был расщеплен с помощью хлорциана. Качество полученного

при этом инсулина не уступало качеству инсулина;• полученного из аналогичных партий ГБ. расщепленного с помощью бромциана.

II. 3. Получение проинсулина.

Для получения проинсулина был выбран способ, заключающийся в окислительном сульфировании полипептидной последовательности проинсулина с помощью сульфита натрия и тетратионата натрия, очистке полученного проинсулин-Э-сульфоната. его ренатурировании и заключительной очистке полученного проинсулина. Сульфирование цистеи-новых остатков белков является способом обратимого модифицирования молекул, в результате которого устраняются сульфгидрильные группы, способствующие агрегации белков, и облегчается процесс очистки. При этом полипептидная последовательность проинсулина, которая существует в виде набора молекулярных изоформ, превращается в одну форму - проинсулин-(3-50з)6, что позволяет эффективно проводить хроматографическую очистку. Это отрицательно заряженное производное очень легко очищается при помощи анионообменной хроматографии, поэтому этот вид хроматографии был использован как для очистки, так и для анализа содержания проинсулин-З-сульфоната в реакционном растворе (рис.2.). Другим преимуществом проведения сульфитолиза является то, что замыкание дисульфидных связей при ренатурировании может происходить непосредственно из проинсу-лин-8-сульфоната при добавлении небольших количеств меркаптанов.

С целью снижения расхода дорогостоящего тетратионата натрия была проведена оптимизация проведения реакций сульфитолиза проинсулина. Было установлено, что в присутствии 0,2-0,25 M сульфита натрия и при концентрации белка 25 мг/мл уменьшение содержания тетратионата натрия до 0,037 M не снижает выход проинсу-лин-Э-сульфоната, который близок к'количественному.

Анализ полноты 4 проведения реакции проводили с помощью системы FPLC на анионообменной колонке Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) (рис.2. А. ), а также с помощью ионообменной ВЭЯХ на колонке Protein РАК DEAE 5 PW (7,5 мы х 7, 5 см) (Waters).

После проведения сульфитолиза в реакционном растворе кроме проинсулин-Б-сульфоната находится S-сульфонатное ■ производное ГБ ввиду его неполного расщепления под действием бромциана. Это наи-

более трудноудаляемая примесь. Помимо нее в растворе находится отщепленная частично гидролизованная (из-за наличия сайтов чувствительных к кислотному гидролизу) лидирующая последовательность, а также другие примеси, так' как чистота используемого ГБ составляла около 70%. , *

Хроматографическая очистка проинсулин-Б-сульфоната эффективно осуществлялась на, различных анионообменных сорбентах, например. БЕАЕ-Сефарозе ГР. Учитывая, что в технологической схеме присутствует три градиентных хроматографии, на этом этапе для "Опытно-промышленного регламента на производство инсулина человека"' было отработано ступенчатое элюирование проинсулин-Б-сульфоната на разработанном в ГНИИОЧБ совместно с ИБХ РАН сорбенте ДЭАП-Сфе-ранйте-ОН (рис. 2. Б.).

Рис.2.Выделение проинсулин-Б-сульфоната после сульфитолиза. А. Анализ полноты прохождения реакции на колонке Mono Q HR 5/5 (FPLC) в градиенте концентрации NaCl (рН 7.5), скорость потока 1 мл/мин. Б. Хроматография на колонке (d=30 см, h=14 см) с ДЭАП-Сферанитом-ОН; элюент (1) - 1 М СН3С00Н, элюент (2) - 1 М CHiCOOH, 1 М NaCl, в 7.5 М CO(NH2)2; скорость потока 20 л/ч. •

Проведение хроматографии в градиенте концентрации NaCl обеспечивает более высокую чистоту проинсулин-Б-сульфоната по сравнению со ступенчатой хроматографической очисткой," при которой во фракциях с проинсулин-Б-сульфонатом содержится 13 % не полностью отделяющегося ГБ-Б-сульфоната (по данным гель-электрофореза). Однако, второй тип хроматографии более технологичен, так как не требует аппаратурного исполнения, формирующего градиент из двух буферов. Кроме того, в этом случае используют широкую невысокую ко-

лонку, что позволяет вести элхзирование с высокой скоростью и сокращает время проведения процесса.

При получении проинсулина реакция ренатурирования является ключевой. Был разработан способ, который обеспечивает высокий выход продукта в реакции ренатурирования. Он заключается в титровании реакционного раствора водным раствором 2-меркаптоэтанола из расчета 0,1 - 0,18 экв на каждую (-S-S03) группу в час. В исходный реакционный раствор, содержащий проинсулин-Б-сульфонат, добавляют цистин(и 2-меркаптоэтанол в количестве обеспечивающем массовое соотношение полипептид : цистин : 2-меркаптоэтанол - 1 : (0,1 -0,2) : (0,07-0,15). Такое соотношение компонентов в реакционной среде обуславливает создание в начальный момент оптимального значения окислительно-восстановительного потенциала, который далее поддерживается на уровне оптимальном для проведения контролируемого таким образом процесса ренатурирования. Формирование правильной пространственной структуры дает возможность. Начиная с этой стадии, эффективно применять при анализе обращенно-фазовую ВЭЖХ. Для этой цели использовали аналитические колонки с сорбентом ApMCop6-Si-300-C8/RP-PR, совместной разработки ИБХ РАН и ЕрОНЕМ "Армхром" (рис.3.Á.), которые по своим характеристикам не уступапают коммерческим колонкам д-Bondapack С18, Nucleosil С18, Núcleos!1 Protein RP. Через 18 ч концентрация получаемого проинсулина достигала максимума. Реакция успешно проходила в 10 мМ глициновом буфере (рН 10,0) при 4°С . Выход проинсулина существенно зависел от исходной концентрации проинсулин-Б-сульфоната.' При низких концентрациях белка (менее 100 мкг/мл) он достигал 70%. Однако, при этом требовался биореактор больших объемов. При концентрации белка 1 мг/мл выход в реакции падал до 30%. Исходя из этого, реакцию проводили при концентрации белка 0,5 мг/мл, что обеспечивало выход 60%.

Проведение анионообменной хроматографии в градиенте концентрации Nad'позволяло получить проинсулин 90-95% чистоты (рис.3. Б.). Для этого, концентрировали реакционный раствор с помощью ультрафильтрационной установки Pell icon на мембранах PTGC до концентрации белка 10 - 20 мг/мл, доводили рН до 7,5 и наносили на колонку. Выбор анионообменной хроматографии для очистки проинсулина объясняется тем, что при рН 7.5 проинсулин хорошо растворя-

А214 А. В, % А280 Б. МаС1, СМ]

Рис.3. Очистка проинсулина. А. Анализ содержания проинсулина в реакционном растворе через 18 ч. Колонка Армсорб-31300-С8/НР-РН (4x150 мм). Элюенты: А - 10% СН3СМ, 0,1% ТРА в воде,. В - 0,1% ТРА в СН3СМ. Скорость потока 0,8 мл/мин. Б. Хроматограмма очистки проинсулина на колонке (11,3x50 см) с БЕАЕ-Сефарозой РЕ в градиенте концентрации ИаСЬ Буфер - 30 мМ трис-НС1 (рН 7,5) в 2.5 М С0(Ш2)2. Скорость потока 5 л/ч.

ется в воде, что дает возможность добавлять мочевину в элюенты в низких концентрациях (или не применять ее вообще). А это значительно удешевляет проведение процесса. Полученный биосинтетический проинсулин человека идентичен природному по времени выхода при обращенно-фазовой ВЭЖХ. Его молекулярный вес. определенный методом времяпролетной масс-спектрометрии, сответствует расчетным данным (табл.1.).

II.4. Получение инсулина из проинсулина.

При использовании хорошо известного процесса превращения проинсулина в инсулин человека путем отщепления С-пептида под действием трипсина и карбоксипептидазы В образуется большое количество с1езТ-1пз (4-6%), являющегося трудноудаляемой близкородственной примесью. Поэтому было предпринято изучение конверсионного процесса и поиск путей, обеспечивающих в конечном итоге получение инсулина человека требуемой чистоты. В результате была разработана схема (схема 2.) на этапе получение инсулина из проинсулина, в которой обработка проинсулина трипсином и карбоксипептидазой В разделены промежуточной катионообменной хроматографической очисткой. Это объясняется тем, что'образующийся в результате обработки

ПРОИНСУЛИН

I 1. Обработка трипсином . т 2. Катионообменная хроматографическая очистка (Arg B31,Arg В32)-ИНСУЛИН

I 1. Обработка карбсксипептидазой В Т 2. Анионообменная хроматографическая очистка ИНСУЛИН

Схема 2. Получение инсулина из проинсулина.

проинсулина трипсином Ins-RR, являясь основкым белком, имеет высокую степень удерживания при проведении катионообменной хроматографии, что позволяет эффективно отделять от него desT-Ins. Кроме того, в настоящее время активно разрабатываются лекарственные форш пролонгированного действия, в которых в качестве активного начала используются непосредственные продукты расщепления проинсулина трипсином - Ins-R, Ins-RR.

Хроматографическая очистка образующегося в качестве побочного продукта C-KR благодаря наличию•остатков Lys и Arg также проходит эффективнее, чем С-пептида. Получений после катионообменной хроматографии (рис.7.) C-KR имел 95% чистоту , его первичная структура была подтверждена секвенированием (выполнено в ИБХ РАН к.х.н. И.В. Назимовым), и он был использован в качестве антигена для иммунизации животных и для иммобилизации на инертных носителях при разработке в ИБХ РАН тест-системы определения содержания проинсулина в субстанции инсулина.

Для эффективного осуществления процесса получения инсулина проинсулина с помощью масс-спектрометрии и обращенно-фазовой B3S.X были изучены продукты и кинетика протеолиза проинсулина трипсинов и определены параметры реакции, позволяющие обеспечить максимальный выход целевего Ins-RR (выполнено совместно с д.х.н. O.A. Миргородской, Институт цитологии РАН). Для этой цели был испольгов-л времяпролетный масс-спектрометр, разработанный в ФИЭПХФ РАН с источником ионов "ЭРИАД". Прибор позволяет регистрировать ионы высокомолекулярных соединений, в том числе белков, с высокой разрешающей способностью и чувствительностью.

На схеме 3. стрелками отмечены возможные сайты расщеп.:'е;-.чя

в | i 1 С i А

Но N-Phei-Lys •Thr•Arg• Arg • Glu-Lys • Arg • Gl ут—i-rAsn-COOH

1-:-(S-S)2-H i

L(S-S)2J ■

Схема 3. Пептидные связи, гидролизуемые трипсином в проинсулине.

проинсулина трипсином. После инкубации проинсулина с трипсином реакционную смесь разделяли хроматографически (рис.4.), и пики

Рис.4. Хроматограммы гидролизатов проинсулина: а - нативным трипсином, б - иммобилизованным на Силохроме трипсином. Колонка (2x62 мм) заполнена сорбентом Nucleosil С18, градиент концентрации CH3CN от 20 до 40% в 0,1% TFA в течении 15 мин. Скорость потока 0,25 мл/мин. Хроматографические пики идентифицировали масс-спектрометрически (таблица 2). 1 - C-KR, 2 - Ins-RR, 3 -Ins-R, 4 - Intermediate I.. 5 - desT-Ins, 6 - Intermediate II, 7 -Prolns.

идентифицировали по молекулярным массам, расчитанным по сериям многозарядных ионов в их масс-спектрах (табл. 2). Кроме того, отсутствие фрагментных ионов в масс-спектрах позволило непосредственно контролировать состав реакционной смеси (рис.5.). Было выяснено, что из проинсулина первоначально образуются два промежуточных продукта с различной хроматографической подвижностью' и одинаковой молекулярной массой на 18 а.е.м. большей массы проинсулина. Сопоставление хроматограммы (рис.4.а.) с данными литературы позволило отнести пик (Intermediate I) к промежуточному продукту с разрывом в проинсулине связи (Arg 65-Gly 66), а пик (In-

Таблица 2. Масс-спектрометрическая идентификация продуктов гидролиза проинсулина трипсином.

Т I

Молекулярный вес. Da расчетный I измеренный

I Продукт

I

Prolns 9389.4 • 1 9390.8 + 1. 3

Intermediate 1 ,9407. 4 1 9409.4 ± 1. 2

Intermediate 2 9407. 4 1 9408.7 ± 1. 3

Ins-RR 6120.6 1 6120.0 ± 1. 0

Ins-R 5963. 9 1 5964.1 ± 1. 3

desThr-Ins 5707.1 1 5707.5 ± 0. 5

C-KR 3304.8 1 3305.5 ± 0. 4

termediate II) - с разрывом связи (Arg 32-Glu 33). Последующий гидролиз этих промежуточных продуктов приводит к образованию целевого Ins-RR и C-KR. При увеличении времени реакции Ins-RR гид-ролизуется до desT-Ins. На основании кинетических данных (концентрации образующихся продуктов определяли по площадям хроматог-рафических пиков) построена следующая схема протеолиза (схема 4).

i-Prolns-1

1 I

Intermediate I Intermedlate II

I C-KR I i-> + <-1

Ins-RR

I

desThr-Ins

Схема 4. Схема протеолиза проинсулина нативным трипсином.

Были построены кинетические кривые протеолиза, которые хорошо согласуются с экспериментальными данными по текущим концетрациям отдельных компонентов (рис.6.). Полученные кинетические зависи-

Рис.5. Масс-спектр гидролизатов проинсулина: А - нативным трипсином, В - иммобилизованным на силохроме трипсином.

Рис.6. Кинетические кривые протеолиза проинсулина нативным трипсином. Концентрации указаны в % от исходной молярной концентрации проинсулина.

мости позволяют на разных глубинах превращения субстрата предсказать соотношения концентраций образующихся продуктов и выбрать условия для достижения наибольшего выхода целевого 1пб-1Ж.

Модификация ферментов гидрофильными полимерами и их иммобилизация на инертных носителях увеличивает стабильность ферментов и делает возможным их многократное использование, что является целесообразным в условиях технологического процесса. Вместе с тем уход от нативнсй фермы фермента может привести к изменению его специфичности (к изменению соотношений скоростей отдельных стадий превращения). Поэтому аналогичным образом с использованием ВЭКХ и ЭРИАД МС был изучен состав продуктов при гидролизе проинсулина модифицированным ВПАК трипсином и иммобилизованном на Силохрочэ

модифицированном ВПАК трипсином. В таблице 3 приведены концентрации продуктов протеолиза проинсулина при сопоставимых степенях превращения последнего. Данные таблицы показывают, что само по

Таблица 3. Концентрации продуктов протеолиза различными формами трипсина.

1 1Форма трипсина, 1 время гидролиза. Концентрации, в % от исходной концентрации проинсулина i

C-KR 1 Ins-RRlIns-R 1 i desTIns Intermediate 1 Intermediate 2 1 Pro-I Ins 1

1Нативный; игидр.= 10 мин 49 49 i 1 0 1 1 0 30 8 13 1

1Модифицир. ВПАК игидр.= 45 мин 34 34 1 1 0 1 1 0 35 10 21 1

1Иммоболизован. игидр.=5,5 мин 33 ' 12 1 1 8 I 12 34 4 30 1

¡Иммобилизован. игидр.=11,5 мин 1 82 9 1 •1 22 1 i 51 1 3 14 1 'i

себе ковапентное связывание с ВПАК, приводящее к стабилизации исходного фермента, не меняет соотношения скоростей отдельных стадий этого процесса. Иная картина наблюдается при изучении иммобилизованного фермента. В этом случае при сохранении исходного субстрата и Intermediate I и II наблюдается образование desT-Ins, а также Ins-R. Такой состав реакционной смеси также подтверждается масс-спектрометрически (рис.5. В.). Таким образом, изменение специфичности, приводящее к появлению в реакционной смеси значительного количества desT-Ins до израсходования проинсулина, не позволяет использовать иммобилизованный трипсин в данном технологическом процессе.

Гидролиз проинсулина проводили в 50 мМ трис-НС1 (рН 8,0) при исходной концентрации субстрата 2,25 мг/мл, соотношении фермент/субстрат 1:1000, 25°С. Причем в соответствии с полученными кинетическими кривыми время максимального выхода 1пб-И? (около 80%) составляло 40 мин. Реакцию останавливали добавлением уксусной кислоты до рН 4,2 и мочевины до общей концентрации 6,О М. и полученный раствор подвергали хроматографии в градиенте концентрации ИаС1 при рН 4,5. Первоначально в качестве сорбента использовали ТЭК-гель БР-Тоуореаг1 650 М. Из отечественных сорбентов для этой же цели был выбран Фосфо-Биохром К. разработанный в ГНИ-ИОЧБ совместно с ИБХ РАН (рис.7.).

Рис.7. Хроматограмма выделения 1пз-№ и С-КИ на колонке (11,3x30 см) с Фосфо-Биохромом К в градиенте концентрации ИаС1; буфер - 50 мМ СН3 СООИа (рН 4,5), 6.0 М С0(ИН2 )2: скорость потока 5 л/ч.

Несмотря на то, что по сравнению с первым сорбентом хроматография на Фосфо-Биохроме К дает более широкие пики элюируемых веществ, что ухудшает эффективность очистки, емкостные характеристики сорбента вполне удовлетворительны и позволяют проводить хроматографию при нагрузках образца до 20 г на литр. Было установлено, что для обессоливания полученных фракций можно эффективно применять стабильные, с высокой скоростью фильтрации мембраны РТйС, несмотря на то, что по данным фирмы-производителя они имеют границу фильтрации 10000 Ба.

После отщепления с С-конца В-цепи остатков аргинина с помощью карбоксипептидазы В полученный инсулин подвергали анионообменной хроматсграфической очистке. Причем было найдено, что ее проведение эффективно при значениях рН выше 9,0 на сорбентах, имеющих сильноосновные четвертичные ионообменные аминогруппы, например, ТБК-геле ОАЕ-Тоуореаг1 550. Для получения аналогичного отечественного сорбента в ГНИИОЧБ был приготовлен модификацией носителя

Биохром четвертичными аминогруппами сорбент Q-Биохром А. позволяющий достичь высокой степени чистоты целевого продукта (рис.8).

1 , 0 i"Av (ч Q

I NaCl.fM] Рис.8. Хроматограмма очист-

г --- -10,5 ки инсулина на колонке

0,5 г / \ I (11,3x30 см) с Q-Биохромом

-10,25 А в градиенте концентрации NaCl; буфер-30 мМ CH3C00NH. (DH 9,0) в 2,5 М СООМНоЬ; скорость потока 5 л/ч.

В полученных фракциях относительное содержание инсулина составило - 97,5%, дезамидированного инсулина - 0,5%, высокомолекуляр-.¡ь'л примесей - 0,2% (по данным обращенно-фазовой и эксклюзионной ЬЖ), проинсулина - менее 0.1% (по данным гель-электрофореза). Таким образом, качество получаемого инсулина челозека после проведения анионообменной хроматографии близко к современным фармакопейным требованиям. Недостатком сорбента является невысокие емкостные характеристики, которые не позволяют получить эффективную очистку при нагрузках исходного образца более 2.5 г на литр сорбента. Однако, эта нагрузка на порядок выше, чем нагрузка при проведении гель-хроматографии на колонке с Сефадексом G-50, которую обычно используют для очистки инсулина от проинсулина и высо-чомол' чулярных примесей. Первичная структура полученного инсулина подтверждена секвенированием; конфигурация трех дисульфидных связей - пептидной картой, полученной с помощью ВЭЖХ пептидов, образовавшихся в результате обработки инсулина протеазой из S. aureus '8. Этот анализ был проведен на Фирме "Biobras". Масс-спектромет-рическк определенный молекулярный вес получаемого инсулина соот-ветст./ет расчетному (табл.1). Биологическая активность, определенная в ГНИИ кровезаменителей и медицинских препаратов составила более 28 ед/мг, т.е. соответствовала максимальной.

При необходимости получения инсулина высокой чистоты с содержал основного вещества более 99 можно использовать дополнительную поепаративную обращенно-фазовую ВЗЖХ. Для ."»той цели наработка образцов инсулина проводилась в лаборатории биотехнологии

ИБХ РАН С. А. Якимовым и В.Е. Клюшниченко на колонке (2,2 х 25 см) с сорбентом Армсорб-ДК-С8(П)ДМ совместной разработки ИБХ РАН и ЕрОНЕМ "Армхром".

Выход на этапах трансформации составил 34,56% (расщепление ГБ -80%, сульфитолиз - 90%, фолдинг с формированием дисульфидных связей - 60%, трансформация проинсулина в инсулин - 80%).

Выход при извлечении ГБ из тел'включения, проведении фильтрационных процессов, осаждении и лиофилизации продуктов составил 75%.

Выход на стадиях хроматографической очистки инсулина и его предшественников составил 17,5% (с применением пяти хроматографии, выход в каждом процессе около 70%).

Общий выход получения генно-инженерного инсулина человека с содержанием основного вещества более 99 % составил 4,54%.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана новая технологическая схема получения генно-инженерного инсулина человека на основе новых способов трансформации биотехнологических предшественников инсулина в инсулин с широким применением мембранной фильтрации и частичным задействованием отечественных материалов.

2. На основе разработанной схемы наработаны образцы генно-инженерного инсулина человека в количестве около 100 г, которые были переданы для испытаний и изготовления лекарственны,; форм.

3. На основе разработанной схемы создан "Опытно-прсмышленный регламент на производство инсулина человека", на основе которого была спроектирована на СН0ПБ ПО "Прогресс" (Казахстан) опытно-производственная линия получения генно-инженерного инсулина человека производительностью 80 кг в год.

4. Разработанная технологическая схема обеспечивает получение в качестве побочного продукта С-пептида 95% чистоты.

5. На базе являющегося промежуточным продуктом технологической схемы ГБ получены аффинные сорбенты для выделения иммуноглобулинов класса G.

По основным материалам работы имеются следующие публикации: 1. Опытно-промышленный регламент на производство инсулина челове-

ка. ОПР 12315-01-91/64-12001-91./ ИБХ РАН, СНОПБ ПО "Прогресс". •

2. Мальцев К.В.. Вульфсон А.Н., Муравьева Т.И... Коваленко В.А., Гапиев А.Х., Петров П.П.. Харитонов В.Г., Иванов В.Т. Способ выделения ГБ, содержащего аминокислотную последовательность проин-сулина человека. Заявка на авторское свидетельство N 4946841/13, положительное решение от 18.06.91.

3. Мальцев К. В., Вульфсон А.Н. , Иванов В.Т. Способ получения про-инсулина человека. Заявка на авторское свидетельство N 4953678/13, положительное решение от 18.06.91.

4. Леонова Е. Ф., Гаврюченкова Л. П., Громова 0. А., Хрущева Т. А., Цуканова Л. П., Коршунов Н. А, Михлин В. С., Мелихов В. М., Беляев С. В. . Вульфсон А.Н., Мальцев К.В., Куликов С.В. Способ выделения S-сульфоната проинсулина. Заявка на авторское свидетельство

N 4946564/13, положительное решение от 18.06.91.

5. Леонова Е. Ф., Гаврюченкова Л. П., Громова 0. А., Хрущева Т. А., Цуканова Л.П., Коршунов Н.А, Михлин В.С., Мелихов В.М., Беляев С. В., Вульфсон А. Н., Мальцев К. В., Куликов С. В. Способ выделения рекомбинантного проинсулина человека. Заявка на авторское свидетельство N 4946565/04, положительное решение от 18.06.91.

6. Леонова Е. Ф., Гаврюченкова Л. П., Громова 0. А., Хрущева Т. А., Цуканова Л. П., Коршунов Н. А, Михлин В. С., Мелихов В. М., Беляев С. В., Вульфсон А. Н., Мальцев К. В., Куликов С. В. Способы получения рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина. Заявка на авторское свидетельство N 4838187/13, положительное решение от 28.03.91.

7. В.Е. Клюшниченко, К.В. Мальцев. Разработка и оптимизация методов выделения и очистки рекомбинантного человеческого проинсулина. 1990. Деп. в ВИНИТИ N 5125-В-90.

8. В. Е.Клюшниченко, • С.А.Якимов, ■ К.В.Мальцев, А.М.Арутюнян, А.Е.Иванов, А.Н.Вульфсон. Генно-инженерный инсулин человека. I. ВЭЖХ в анализе продуктов основных стадий производства. Биоорганическая химия. 1992, Т. 18, N 12, С. 1478-1486.

9. V.E. Klyushnichenko,' D.M. Koulich, S.A. Yakimov. K.V. Maltsev, G.A. Grishina, I.V. Nazlmov, A.N. Wulfson. III. High-performance liquid chromatography and high-performance capillary electrophoresis control In the analysis .of step-by-step prodaction of recombinant human insulin. J. Ch'romatogr., 1994, A, 661, p. 83-92.