Разработка эффективной технологии получения фармацевтических препаратов генно-инженерного инсулина и его аналогов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

*****

Гусаров Дмитрий Алексеевич

Разработка эффективной технологии получения фармацевтических препаратов генно-инженерного инсулина

и его аналогов

02.00.10 «Биоорганическая Химия» 03.00.23 «Биотехнология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 5 окт ?пп9

Москва 2009

003479674

Работа выполнена на кафедре «Химия и технология биологически активных соединений им. Н.А.Преображенского» Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.ВЛомоносова и Опытном биотехнологическом производстве Учреждения российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Миронов Андрей Федорович

доктор химических наук, Баирамашвили Дмитрий Ильич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН

Северин Евгений Сергеевич

кандидат химических наук, Бобрускин Алексей Игоревич

Ведущая организация: Федеральное Государственное унитарное предприятие Государственный научный центр Российской Федерации Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»),

Защита диссертации состоится ШХЯТ^-Я 2009 г в заседании

диссертационного совета Д 212.120.01 в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова, по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте http://mitht.ru Автореферат разослан « $ » О'Е-ТЛора 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.х.н.. с.н.с.

Лютик Алла Игоревна

Список сокращений

ср В - карбоксипептидаза В.

GMP - good manufacturing practice, правила надлежащего производства. SEC - size-exclusion chromatography, высокоэффективная гель-проникающая хроматография.

АФС - активная фармацевтическая субстанция. БЭ - бактериальные эндотоксины. ВМП - высокомолекулярные примеси.

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография. ГИЧ - генно-инженерный инсулин человека. дТИ - дезтреонин (ВЗО)-инсулин. ИФА - иммуноферментный анализ.

JIAJI-тест - кинетический хромогенный гель-тромб тест на определение содержания бактериальных эндотоксинов (JIAJI - лизат амебоцитов люмулуса).

ЛПС - липополисахариды клеточной стенки штамм-продуцента.

ME - международная единица.

ОФ - обращенно-фазовый.

РП - рекомбинантный предшественник.

ФГ - ферментативный гидролиз.

ЭЕ - единица измерения бактериальных эндотоксинов.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

Инсулин является одним из наиболее изученных гормонов. С момента открытия того факта, что инсулин, вырабатываемый поджелудочной железой, отвечает за снижение уровня сахара В крови [Banting F.G., Best C.II. / The Internal Secretion of the Pancreas//J. Lab. Clin. Med. 1922. V.7. P.251-266], ДО настоящего времени прошло уже более 80 лет. Тем не менее, и по сей день этот гормон вызывает огромный интерес. Сахарный диабет занимает третье место по смертности после сердечнососудистых И онкологических заболеваний [BarfoedH.C. /Insulin Production Technology //Chem. Eng. Prog. 1987. V.SJ. P.49-54; Ladish M.R.. Kohlmann K.L. /Recombinant Human Insulin //Biotechnol. Prog. 1992. V.461. P.469-478]. В 2000 году в мире насчитывалось около 150 миллионов больных сахарным диабетом [Kjeldsen T., Ludvigsen S., Diers /., Baischmidt P., Sorensen A.R., Kaarsholm N.C. / Engineering Enhanced Protein Secretory Expression in Yeast With Application to Insulin HJ. Biolog. Chem. 2002. V.277. P.18245-18248], и эта цифра ежегодно растет на 2-6 % [Klyushnichenko v., Brush R., BulychevA. /Feasibility of International Technology Transfer for the Production of Recombinant Human Insulin. Parti: Preparing for Product-Specific Manufacturing on a Global Scale //Bioprocess International. 2004. V.2. P.45-59; Баирамашвили Д.И. /Генно-инженерный Инсулин Человека: Успехи и Перспективы //Рос. Хим. Ж. 2005. T.XLIX. №1. С.34-45]. Так, например, К 2010 году прогнозируется увеличение числа страдающих этим заболеванием примерно до 33 МИЛЛИОНОВ В странах Европы [Zimmet P., Alberti К. /Shaw Global and Societal Implication of the Diabetes Epidemic//Nature. 2001. V.414. P.782-787], а В нашей стране более 300 тысяч человек нуждаются в регулярном приеме препаратов инсулина. С появлением технологии рекомбинантных ДНК впервые стало возможным производить инсулин в крупных масштабах. Так в 80-е годы XX века

американской компанией Genentech разработана технология производства ГИЧ, которая впоследствии была коммерциализирована корпорацией Eli Lilly [Clark A J., Adeniyi-Jones R.O., Knight G., LeiperJ.M., Wiles P.G., Jones R.H., Keen H., MacCuish A.C., Ward J.D., Watkins P.J., Cauldwell J.M., GlynneA., ScottonJ.B. / Biosynthetic Human Insulin in the Treatment of Diabetes. A Double-Blind Crossover Trial in Established Diabetic Patients. //Lancet. 1982. V.2 (8294). P.354-357]. В настоящее время ежегодное производство АФС инсулина ВО всем мире превышает 15000 КГ [Petrides D., SapidouE., Calandranis J. / Computer-A ided Process Analysis and Economie Evaluation for Biosynthetic Human Insulin Production - A Case Study//Biotechnol. Bioeng. 1995. V.48. Р.529-541]. К лидирующим производителям ГИЧ относятся такие зарубежные фирмы, как Novo Nordisk (Дания), Eli Lilly (США), Sanofi-Aventis (Германия-Франция). В нашей стране исследования в области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые организовать производство полного цикла и выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина.

Разработка конкурентоспособной высокоэффективной технологии получения лекарственных препаратов ГИЧ и других терапевтических белков является одним из основных направлений современной отечественной бифармацевтики. Не менее важно производство аналогов ГИЧ, таких как инсулин-аспарт, инсулин-лизпро, которые существенно улучшают физиологическую динамику инсулина в крови. В инсулине-аспарт модификация молекулы, выраженная в замене остатка пролина (В28) на остаток аспарагиновой кислоты, привела к снижению способности молекулы к самоассоциации. Подобный же эффект был достигнут изменением местами остатков пролина (В28) и лизина (В29) в инсулине-лизпро. Эти модификации способствуют более быстрой абсорбции препаратов в кровь человека после введения.

Современные стандарты качества, принятые как в нашей стране, так и за рубежом предъявляют очень высокие требования к чистоте АФС, предназначенных для производства инъекционных лекарственных препаратов [United States Pharmacopeia. Philadelphia, РА. USA. 2000. (USP24). Suppl. 3; British Pharmacopoeia 1988. London: H.M. Stationary Office. 1988. P. 1-312; Фармакопейная Статья Предприятия ФСП 42-0452361302// 2002. С. 1-44]. Однако разделение инсулина и близкородственных ему белков является сложной задачей из-за сходства их физико-химических характеристик.

Цель исследования.

Разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения и очистки ГИЧ и его фармацевтических аналогов (инсулина-лизпро и инсулина-аспарт), ее оптимизация, разработка методов внутрипроизводственного контроля.

Задачи исследования.

1. Изучить и оптимизировать процесс ФГ РП с образованием инсулина.

2. Разработать и оптимизировать очистку инсулина методом ВЭЖХ на аналитическом уровне.

3. Масштабировать результаты ВЭЖХ очистки от аналитического до производственного уровня, рассчитать производительность процесса.

4. Разработать и валидировать методы внутрипроизводственного контроля содержания ГИЧ.

5. Провести валидацию процесса очистки инсулина.

6. Разработать процесс получения аналогов инсулина из соответствующих рекомбинантных предшественников (ФГ).

7. Разработать эффективный способ очистки аналогов.

Научная новизна.

1. Разработан метод контроля содержания дТИ в растворах ГИЧ, основанный на аналитической ион-парной ОФ ВЭЖХ.

2. Разработан и валидирован внутрипроизводственный метод контроля содержания ГИЧ, основанный на ОФ ВЭЖХ, более оперативный, чем метод, рекомендованный фармакопейной статьей.

3. Разработан способ получения ГИЧ ферментативным расщеплением РП с предварительно блокированными аминогруппами, что позволило снизить содержание дТИ в растворах ГИЧ до минимума.

4. Изучен процесс фибриллобразования (агрегации) инсулина в растворах с низким значением рН, предложены условия, в которых волокнообразование минимально.

5. Разработан и валидирован эффективный технологический процесс очистки ГИЧ, основанный на ОФ ВЭЖХ в смешанном (элюентном и «вытеснительном») режиме.

Практическая значимость работы.

Разработана и запатентована эффективная технология получения ГИЧ из РП методом ФГ с выходом ГИЧ около 90 % от теоретически возможного. Предложена схема ФГ РП с предварительно блокированными аминогруппами с помощью цитраконового ангидрида и последующим снятием защиты с получением инсулина. Разработан эффективный процесс очистки ГИЧ от примесей, содержание которых регламентировано фармакопейной статьей. Технология в настоящее время успешно внедрена и реализована на Опытном биотехнологическом производстве Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Разработана технологическая схема выделения и очистки инсулина-аспарта и инсулина-лизпро, позволившая наработать опытные образцы АФС аналогов инсулина, которые в настоящее время проходят государственную регистрацию.

Апробация работы.

Результаты исследований были изложены на Третьем московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2005), Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Россия, Москва, 2006), Пятой международной конференции «HIC/RPC Bioseparations» (Швейцария, Интерлакен, 2007), Пятом

московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2009).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 10 статей в научных журналах и 1 патент.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 177 страницах. Текст содержит 59 рисунков и 15 таблиц. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Литературный обзор, Результаты и обсуждение, Материалы, приборы и методы, Выводы, Список опубликованных работ, Библиография, содержащая ссылки на 249 публикаций.

Содержание работы

ФГ предшественника инсулина ФГ РП с образованием инсулина протекает под действием двух ферментов, трипсина и ср В. Схематически процесс можно представить следующим образом (Рис. 1).

Рис. 1. Схема ферментативного гидролиза.

РП, имеющий молекулярный вес около 17 кДа, гидролизуется с образованием инсулина (5808 Да). Трипсин специфично расщепляет пептидную последовательность по остаткам основных аминокислот, в данном случае по остаткам аргинина. Карбоксипептидаза В отщепляет оставшиеся аминокислотные остатки (два аргинина) с С-конца В-цепи. В результате действия ферментов РП превращается в инсулин, лидерный фрагмент, С-пептид (без двух остатков аргинина) и два остатка аргинина. При этом трипсин, отщепив в первую очередь вышеуказанные аминокислотные последовательности, приступает к расщеплению связи между остатками лизина (ВЗО) и треонина (В31). Так образуется побочный продукт, дТИ. Методика, рекомендованная фармакопейными статьями, не

позволяет количественно определять содержание дТИ в инсулиновых препаратах. В то же время близкие физико-химические свойства и подобное хроматографическое поведение инсулина и дТИ серьезно осложняют количественное определение содержания дТИ при выделении и очистке ГИЧ. Однако задача по оптимизации ФГ не может быть решена при отсутствии метода контроля.

Метол контроля содержяния дТИ, Путем трипсинолиза в течение 24 ч раствора РП и последующей очистки от примесей был получен контрольный образец дТИ с чистотой 98,0 %. Соответствие продукта трипсинолиза дТИ доказали с помощью С-концевого анализа, а также масс-спектрометрически. В условиях, близких к фармакопейным, было проведен ВЭЖХ-анализ полученного в ходе трипсинолиза инсулина раствора дТИ для определения хроматографической подвижности дТИ. В этих же условиях для сравнения был проанализирован образец человеческого инсулина, полученный после совместного ФГ рекомбинантного препроинсулина. Инсулин и дТИ обладают сходной хроматографической подвижностью, что делает невозможным количественный анализ (Рис. 2).

3 6 9 12 15 18 21 24 27

Рис. 2. Хроматограммы образцов человеческого инсулина-сырца и раствора дТИ. Пик 1 соответствует дТИ (98,0 %), пик 2 -инсулину (87,8%), пик 3-А21-дезамидоинсулину (8,5%). Колонка Luna С18-2,5 мкм, 10 нм (Phenomenex, США). Детектирование при 214 нм. Расход подвижной фазы 1,5 мл/мин. Подвижная фаза А: 10 %-ный раствор ацетонитрила в воде, содержащий 0,1 М сульфата натрия, 0,02 М ортофосфорной кислоты и 0,25 мл/л триэтаноламина. Подвижная фаза В: 50 %-ный раствор ацетонитрила в воде.

Для разделения ГИЧ и дТИ нами было предложено симулировать ионообменные свойства ВЭЖХ-колонны за счет введения в подвижную фазу ион-парных реагентов. Были изучены несколько наиболее часто используемых в хроматографии ион-парных добавок на основе производных сульфоновой кислоты: пентилсульфонат, гексилсульфонат, октилсульфонат и

додецилсульфонат (Рис. 3). Найдено, что добавление солей октилсульфоновой кислоты или додецилсульфоновой кислоты в сходных концентрациях (20 мМ) в подвижную фазу способствует разделению пиков инсулина и дТИ. Однако, после проведения нескольких циклов ВЭЖХ анализов препаратов инсулина в системе, содержащей додецилсульфонат, давление в колонне резко возрастало, делая невозможным ее дальнейшее использование. Это происходило из-за того, что инсулин или родственные ему пептиды образуют нерастворимые комплексы с солями додецилсульфоновой кислоты. Поэтому, для дальнейших анализов использовали исключительно соли октилсульфоновой кислоты.

Разделение между пиками инсулина и А21-дезамидоинсулина

о я

X ф

с

о

га а.

2.0 -

Разделение между пиками инсулина и дТИ

1-Без ион-парных агентов

2-Пентилсульфонат;

3-Гексилсульфонат;

4-Октилсульфонат;

5-Додецилсульфонат

Рис. 3. Влияние ион-парных сурфактантов на разделение между пиками инсулина и А21-дезамидоинсулина и между пиками инсулина и дТИ.

В качестве органического модификатора подвижной фазы использовали этиловый, изопропиловый спирты или ацетонитрил. Показано, что при использовании этанола сорбция пептидов на колоне чрезвычайно высока, что не позволяет регенерировать сорбент. Использование ацетонитрила и изопропанола позволило получить сходные результаты как по времени удержания основного пика, так и по разделению инсулина и дТИ. Следует отметить, что использование ацетонитрила является более целесообразным, т.к. он в несколько раз менее вязкий, чем изопропанол, и элюция сопровождается меньшими значениями давления в колонне. Для снижения значения рН подвижной фазы до 2,0-2,5 в качестве добавок применяли различные кислоты: уксусную, трифторуксусную, лимонную, ортофосфорную. Найдено, что при использовании ортофосфорной или лимонной кислот разделение компонентов смеси происходит наиболее полно (Рис. 4).

Разделение мужду пиками инсулина и А21-дезамидоинсулина »д™ Разделение между пиками инсулина и дТИ

Рис. 4. Влияние различных кислот в составе подвижных фаз на разделение между ликами инсулина и А21-дезамидоинсулина и между ликами инсулина и дТИ.

Таким образом, были найдены и оптимизированы условия для ВЭЖХ-анализа содержания дТИ в препаратах инсулина: подвижная фаза, содержащая 20 мМ октилсульфоната натрия, ЗОмМ лимонной (или ортофосфорной) кислоты и 3941 % ацетонитрила в воде для инъекций, обеспечила разделение инсулина и дТИ

Рис. 5. Хроматографический анализ модельной смеси инсулина и примесных полипептидов. Условия анализа в тексте. Пик 1 соответствует инсулину, пик2-дТИ. пикЗ- А21*дезамидоинсулину.

Время анализа составило 20 мин.

Температура гидролиза РП. Скорость гидролиза РП сильно зависит от температуры (Рис. 6). При повышенной температуре (+36°С) гидролиз завершается через 4-5 ч после добавления ферментов, в то время как при пониженной температуре (+6°С) для этого требуется более 20 ч. При комнатной

температуре гидролиз завершался через 8 ч. Однако содержание дТИ резко возрастало с увеличением температуры гидролиза и составило 9,3 % при 36°С. При проведении гидролиза при пониженной температуре содержание дТИ составило менее 4,0 % от общего содержания белка (Рис. 7). Интересно, что повышение температуры сильнее всего сказывалось на содержании дТИ, в то время как выход инсулина и содержание родственных примесей изменяется не сильно (Таблица 1). Изменение концентрации полипептидов во времени нелинейно и их содержание достигает определенного значения через некоторый промежуток времени, далее не изменяясь.

^»•а'О'О-»"®—и--о—а

1-21° С *— +36° с

Время гидролиза, час

Рис. 6. Зависимость протекания гидролиза от температуры.

17,5 Время, мин

Рис. 7. Хроматограмма гидролиэата РП на момент окончания гидролиза при различных температурах. Пик 1 - инсулин; пик 2 - дТИ; пик 3 -А21-дезамидоинсулин. Колонна УМС-Раск ООЭ-А 125 х 2,1 мм, скорость потока 0.3 мл/мин, элюент: 20 мМ оггилсульфонат натрия, 0.2 % ортофосфорная кислота, 40 % ацетонитрил, температура 40°С.

Таблица 1. Результаты гидролизов, проведенных при различных температурах

Температура, иС дТИ, % Прочие примеси, % Выход ГИЧ, % от теор.

+6 3,87 15,8 80,2

+21 5,54 16,4 78,3

+36 931 18,2 72,6

Оптимальной для проведения гидролиза является температура +6°С, при которой, несмотря на длительность процесса, достигается минимальное содержание дТИ. По-видимому, в течение первых 4 часов преимущественно протекает реакция трипсинолиза без вовлечения ср В. По мере накопления в системе продуктов трипсинолиза (ди-Агц (В31)-А^ (В32)-инсулина и моно-Аг§ (В31)-инсулина) в реакцию вступает ср В, которая отщепляет оставшиеся остатки аргининов с С-конца.

Соотношения реагентов. Трипсин и ср В являются дорогостоящими реагентами, поэтому необходимо было определить минимальное соотношение фермент/субстрат, при котором в процессе гидролиза достигается минимальное содержание инсулиноподобных пептидов (без учета А21-дезамидоинсулина), особенно дТИ, а выход инсулина не ниже 30 % (т.е. 90 % от теоретически возможного, равного примерно 33 %). Концентрация трипсина варьировалась от 0,5 до 3 мг/л (отношение фермент/субстрат составляет 1/21500 и 1/3600 соответственно) при постоянной концентрации ср В 2,3 мг/л (соотношение фермент/субстрат 1/4500). Из полученных данных (Рис. 8) видно, что минимальное содержание инсулиноподобных пептидов достигалось при поддержании концентрации трипсина выше 1 мг/л. Однако с ростом концентрации трипсина резко увеличивалось содержание дТИ, причем при концентрации трипсина выше 1,4 мг/л содержание этой примеси превышало 5 %. Выход инсулина с ростом концентрации трипсина увеличивался и выходил на плато (около 30 %) при концентрации трипсина 1,4 мг/л и выше. Таким образом, для проведения гидролиза оптимальной является концентрация трипсина от 1 до 1,4 мг/л (отношение фермент/субстрат 1/11000 и 1/7500 соответственно).

Концентрация ср В варьировалась от 0,25 до 7,5 мг/л (отношение фермент/субстрат 1/42000 и 1/1400 соответственно) при постоянной концентрации трипсина 1,4 мг/л (соотношение фермент/субстрат 1/7500). Из представленных данных (Рис. 9) видно, что при концентрации ср В, равной

за

32

а

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Концентрация трипсина, мг/л

Рис. 8. Влияние концентрации трипсина на содержание примесей и выход инсулина.

1,5 мг/л и выше, содержание родственных пептидов составляло около 2,5 %, а дТИ - порядка 4 %. При этом выход инсулина составил 30-32 %. С экономической точки зрения нерентабельно поддерживать в реакционной смеси высокую концентрацию ср В, поэтому оптимальной является концентрация от 1,5 до 2 мг/л (соотношение фермент / субстрат 1 / 7000 и 1 / 5500, соответственно).

4&г

40,

35

ш

8 за | 2&| | 20| I 1&1

| П

о

О & &

1 ■ 1 ' 1 1 1 * 1 »—1—

1 1 / •'/»—выход инсулина, %

в -Иисулиноподобныв примеси, %

1

у!

/ V--

- 32

£ 28 2 С О

24 1 ч о

X

20 ю

012345678 Концентрация карбоксипептидазы В, мг/л

16

Рис. 9. Влияние концентрации ср В на содержание примесей и выход инсулина.

Таким образом, в реакционной смеси рекомендуется поддерживать соотношения трипсин/РП от 1/11000 до 1/7500, карбоксипептидаза В/РП от 1/7000 до 1/5500. При этом отношение трипсин/карбоксипептидаза В составит около 1,5/1,0. Концентрация РП. Поскольку проведение реакции гидролиза в промышленном масштабе требует высоких конечных концентраций инсулина для сокращения объема реакции и удобства дальнейшей очистки, было изучено влияние концентрации РП на протекание процесса гидролиза. Концентрация РП варьировалась в пределах от 6,2 до 13,6 мг/мл, поддерживались соотношения трипсин/РП 1/7500 (концентрация трипсина 1,43 мг/л), ср В/РП 1/5500 (концентрация ср В 2,0 мг/л). Показано, что концентрация инсулина, получаемого в процессе гидролиза, практически пропорциональна исходной концентрации РП (Рис. 10). Однако кривая выхода имеет четко выраженный максимум в диапазоне концентраций РП от 9 до 10,5 мг/мл. По-видимому, это объясняется тем, что процесс гидролиза при высоких концентрациях РП протекал не полностью, и для его завершения необходим достаточно длительный период времени. В образцах с исходной концентрацией РП более 11 мг/мл наблюдалось наиболее высокое содержание инсулиноподобных примесей и наименьшее содержание дТИ, что подтверждает предположение о незавершенности гидролиза, поскольку дТИ является продуктом распада инсулина. В образцах с наименьшими исходными концентрациями РП содержание дТИ максимально, т.к. для завершения процесса требовалось меньшее количество времени.

8 10 12 Концентрация РП, мг/мл

Рис. 10. Влияние концентрации РП на выход и концентрацию инсулина.

Интересно, что сумма всех инсулиноподобных полипептидов (кроме А21-дезамидоинсулина), включая дТИ, имела выраженный минимум при

Концентрация РП, мг/мл Рис. 11. Влияние концентрации РП на содержание лримесей.

Таким образом, для проведения гидролиза оптимальной является исходная концентрация РП 9,5-10 мг/мл; при этом достигается конечная концентрация инсулина около 3 мг/мл (т.е. выход инсулина около 30 %, или примерно 90 % от теор.); содержание дТИ составляет 4% и менее, а содержание инсулиноподобных полипептидов - около 2,5 %.

Гидролиз РП с блокированными аминогруппами. Как было отмечено выше, трипсин обладает уникальной специфичностью к основным аминокислотным остаткам, что является причиной образования побочного продукта - дТИ. Однако, если лизин (В29) обратимо модифицировать, то образование примесного дТИ

можно минимизировать. Для этой цели нами предложено обратимо модифицировать аминогруппы РП перед гидролизом с помощью цитраконового ангидрида. В ходе этой реакции аминогруппы, включая е-аминогруппы лизина, приобретают отрицательный заряд, который мешает узнаванию трипсином. После проведения ФГ с полученного инсулина снимают ацилированную защиту путем снижения значения рН раствора. Нами были детально изучены процессы блокирования и деблокирования остатков лизина в РП. Блокирование РП протекает достаточно быстро (в пределах 1 ч) в широком диапазоне температур от 5 до 37°С. Однако, при повышенных температурах (выше 20-22°С) после внесения ферментов субстратный белок выпадает в осадок, что существенно ухудшает дальнейший процесс гидролиза. Поэтому блокирование проводили при комнатной температуре, а гидролиз - при 30-35°С (при такой температуре гидролиз проходит за 3-5 ч). Количество цитраконового ангидрида, необходимое для блокирования РП, варьировалось в диапазоне от 0,1 до 2,0 г ангидрида/г РП. Определено, что наименьшее содержание дТИ и максимальный выход ГИЧ наблюдаются при использовании ангидрида в концентрации 0,25-0,5 г/г (Рис. 12).

• ••о**. Выход ШЧЧ

Количество цитраконового ангидридаг/ГРП Рис. 12. Влияние цитраконового ангидрида на результаты гидролиза РП.

Деблокирование проводили при комнатной температуре, подкисляя гидролизат до рН 3,0 ледяной уксусной кислотой. Общее время деблокирования - 24 часа. В результате гидролиза РП, с предварительно модифицированным лизином (В29), и последующего снятия цитраконовой защиты с выходом около 83 % от теор. был получен инсулин, содержащий менее 0,5 % дТИ, а также менее 2 % дезамидоинсулина и 14 % других инсулиноподобных примесей.

Разработка и валидация метода внутрипроизводственного контроля содержания ГИЧ Необходимым условием создания эффективного производства является постоянный контроль результатов каждой стадии: качественная и количественная оценка всех полупродуктов и продуктов. Нами разработан и валидирован метод производственного контроля инсулина с помощью ВЭЖХ, условия которого

отличались от описанных в фармакопейной статье. Это связано с необходимостью создания методики анализа, более оперативной, чем рекомендуется нормативной документацией, чтобы быстро и с достаточной достоверностью оценивать основные показатели производственных процессов. Безусловно, возможность использования разработанной методики в качестве производственного контроля должна быть доказана с помощью валидации. Метод позволяет анализировать образцы инсулина с концентрацией от 0,04 до 3,00 мг/мл — в этом диапазоне получаемые значения площадей пиков изменяются линейно в зависимости от концентрации образца (коэффициент линейной регрессии 0,99969). Относительная систематическая погрешность предсказываемых значений концентраций составила 1,93 %, т.е. меньше значения метода ВЭЖХ-анализа инсулина, описанного ранее и составившего 2,6 % [Oliva A., Fariña J., Llabrés М. / Development of Two High-Performance Liquid Chromatographic Methods for the Analysis and Characterization of Insulin and its Degradation Products in Pharmaceutical Preparations //J. Chromatogr. A. 2001. V.749. P.25-34]. Разработанный метод производственного контроля является правильным и точным, так как значения коэффициентов вариации и относительной систематической погрешности не превышают 15 %. Более того, в нижнем пределе количественной оценки концентрации инсулина коэффициент вариации составил 17,7 %, что меньше, чем рекомендовано GMP (20 %). Показано, что описанный метод обладает высокой специфичностью, позволяющей получать достоверные результаты по количественному содержанию инсулина (чистоте) в его растворах: ни относительная систематическая погрешность, ни коэффициент вариации образцов инсулина, «загрязненных» инсулиноподобными пептидами, не превышают 1 %. Использование колонок для ВЭЖХ YMC ODS-A (YMC Со, Германия), как было продемонстрировано, позволяет получать достоверные результаты даже при некотором отклонении от стандартных условий анализа (уменьшение или увеличение температуры или скорости потока; изменении состава соотношения подвижных фаз; замена одной колонки на другую, упакованную той же маркой сорбента). Следовательно, метод является устойчивым к таким вариациям.

Разработка и валидация процесса очистки ГИЧ с помощью ВЭЖХ Процедура очистки ГИЧ от примесей должна позволять получать продукт с высоким выходом и чистотой. Мы ставили себе целью добиться такой чистоты белка, чтобы содержание родственных примесей было не выше 1,0 %, А21-дезамидоинсулина - не выше 1,0 %, БЭ - не выше 10 Ед/мг, проинсулинподобных полипептидов - не выше 10 нг/мг, ВМП - не выше 1 %. При этом выход основного продукта должен быть не менее 80%. Операционные параметры должны быть совместимы с физико-химическими свойствами молекулы инсулина. Условия должны обеспечивать хорошую растворимость, избегая при этом крайних значений кислотности среды в силу возможной денатурации белка или уменьшения его активности. Процесс очистки должен быть совместим с остальными производственными стадиями. Поскольку А21-дезамидоинсулин наиболее близок по хроматографическим свойствам к инсулину, очистка

инсулина от него наиболее проблематична. Поэтому, при решении поставленных задач, приоритет отдавался очистке от А21-дезамидоинсулина. Подвижная фаза. Состав подвижной фазы является краеугольным камнем оптимизации процесса хроматографической очистки. Корректно подобранная подвижная фаза может позволить существенно увеличить выход чистого продукта и снизить его себестоимость. Подвижная фаза для ОФ ВЭЖХ состоит из трех основных компонентов: воды, органического модификатора и буферного вещества (или веществ), обеспечивающих необходимый рН раствора. Во всех опытах мы использовали дистиллированную воду, удовлетворяющую требованиям к воде для инъекций (содержание БЭ не превышает 0,005 ЭЕ/мл). В качестве органического модификатора был использован этиловый спирт, как дешевый и наименее токсичный вариант. Дальнейшая оптимизация была связана с необходимостью определения диапазона рН подвижной фазы, в котором разделение между инсулином и родственными примесями максимально. При фиксированных временах удержания степень разделения инсулина и А21-дезамидоинсулина, как оказалось, имеет наибольшие значения в области рН 2,03,0 (Рис. 13). При увеличении рН разделение ухудшается. Снижение рН ниже 2,0 отрицательно влияет на неподвижную фазу.

Рис. 13. Зависимость разделения между инсулином и А21-дезамидоинсулином от значения рН подвижной фазы и времени удержания пика инсулина.

Для обеспечения диапазона рН подвижной фазы от 2 до 3 можно применять различные кислоты, как неорганические (наиболее часто используются ортофосфорная, серная, соляная), так и органические (например, лимонная, уксусная, трифторуксусная). При этом наиболее высокие степени разделения наблюдались при использовании серной и ортофосфорной, а также лимонной кислоты (Рис. 14).

2,50.

2

ю а

0,0

0,5

1,0

1,5

_I_

Разделение 2,0 2,5

0,03мМ серная кислота, рН 2,54

0,06мМ соляная кислота, рН 2,42

О.ОЗмМ фосфорная кислота, рН 2,62

1СмМ лимонная кислота. рН 2,47

0,03мМ трифторуксусная кислота, рН 2,22

ЮОмМ уксусная кислота, рН 2,82

50мМ молочная кислота, рН 2,91

Рис. 14. Влияние различных кислот на разделение между инсулином и А21-дезамидоинсулином.

Степень волокнообразования, % ? . 1 ..

10 12 14 16 18 20

_1_._I_._I_,_I_._I_._I

О.ОЗмМ серная кислота, рН 2,54

0,06мМ соляная кислота, рН 2,42

О.ОЗмМ фосфорная кислота, рН 2,62

: ЮмМ лимонная кислота, рН 2,47

О.ОЗмМ трифторуксусная кислота, рН 2,22

ЮОмМ уксусная кислота, рН 2,82

50мМ молочная кислота, рН 2,91

Рис. 15. Степень волокнообразования инсулина в растворах с рН 2,0-3,0.

Однако при использовании подвижных фаз с кислотами с течением времени качество очистки инсулина начинает ухудшаться. Предполагается, что существенный вклад в подобное ухудшение качества работы сорбента вносит процесс образования волокон инсулина. Склонность полипептида к формированию нерастворимых агрегатов может приводить к забиванию пор сорбента и входной фритты колонки, что выражается в первую очередь в ухудшении диффузионных процессов и негативно сказывается на разделении инсулина и примесей, а также в повышении давления, что создает трудности для ведения процесса в целом. Было проведено сравнение различных кислот по их способности влиять на агрегацию инсулина. Данные аналитического ВЭЖХ-

определения падения концентрации инсулина в растворе позволили расположить кислоты в порядке убывания способности вызывать агрегацию: серная » фосфорная > соляная = лимонная > трифторуксусная > молочная ~ уксусная (Рис. 15).

Наименьшее волокнообразование наблюдается в растворах с уксусной кислотой. Однако при ее использовании не удавалось достичь высоких степеней разделения (Рис. 14). Для улучшения разделения предложено изменить условия хроматографии, применив кроме элюентного режима еще режим «вытеснения». Если молекулы А21-дезамидоинсулина имеют сродство к активным группам сорбента ниже, чем собственно молекулы инсулина, то последние, так как находятся в большей концентрации, могут вытеснять первые из этих активных центров. В результате А21-дезамидоинсулин элюируется из колонны раньше, чем инсулин. Показано, что сложный эфир органической кислоты (например, этилацетат) может проявлять свойства «вытеснителя». Влияние концентрации искусственно добавляемого в подвижную фазу этилацетата было тщательно изучено. Найдено, что максимально высокие степени разделения между инсулином и А21-дезамидоинсулином наблюдаются при содержании этилацетата в подвижной фазе в диапазоне от 1 до 3 % об. (Рис. 16). Ниже 1 % об. концентрации эфира недостаточно для проявления «вытеснительного» эффекта, а выше 3 % во-первых, снижается растворимость эфира в водном растворе, что приводит к образованию эмульсии, а во-вторых, эфир начинает выступать в качестве элюента, причем менее селективного, чем этанол, что негативно отражается на разделении._

_Концентрация этилацетата, %

Рис. 16. Влияние концентрации этилацетата на разделение между инсулином и А21<дезамкдоинсулином.

Таким образом, подвижная фаза, минимально приводящая к волокнообразованию инсулина и позволяющая максимально разделять инсулин и А21-

дезамидоинсулин, должна состоять из воды для инъекций, этилового спирта, уксусной кислоты (рН 2,0-3,0) и этилацетата (1-3 % об.). Рабочая нагрузка на сорбент. «Вытеснительный» эффект проявляется, когда колонна существенно перегружена. Тем не менее, слишком высокая перегрузка колонны может привести к тому, что все активные центры сорбента будут заняты. Поэтому мы тщательно изучили влияние нагрузки образца инсулина на разделение. «Вытеснительный» эффект начинает заметно проявляться при нагрузке более 5 мг инсулина на каждый мл сорбента. А при нагрузке выше 20 мг/мл разделение резко ухудшается в связи с недостатком незанятых активных центров сорбента. Оптимальной нагрузкой следует принять 10-15 мг/мл. При этом выход чистой фракции инсулина (с чистотой 98,5 %) превышает 80 %. Неподвижная фаза. При работе с колоннами одного размера (4,6x250 мм), упакованными сорбентами одного типа (Kromasil), отличными друг от друга только неподвижной фазой, точнее длиной углеводородного радикала (С 18, С8 и С4), строилась графическая характеристика «проскока» для определения предельно емкости сорбента. Для этого на каждую колонну наносили опытный раствор инсулина до тех пор, пока не наблюдалась десорбция полипептида из-за отсутствия незанятых активных центров сорбента. Было установлено, что предельная емкость сорбента возрастает с уменьшением длины углеводородной прививки. Так, при использовании сорбента С18 предельная емкость составила 62 мг инсулина/мл сорбента, в случае сорбента С8 - около 82 мг/мл, а в случае С4 - приблизительно 89 мг/мл. Однако разделение, наоборот, уменьшается с уменьшением длины прививки (в ряду С4-С8-С18 разделение R было равно 1,4; 1,8; 2,0, соответственно). Было решено использовать на производственном уровне «золотую середину», т.е. силикагель, модифицированный октилсиланом С8. В целях подбора оптимального хроматографического сорбента был протестирован ряд коммерчески доступных образцов от различных производителей. Наилучшие результаты были получены при тестировании YMC Basic С8-15 мкм-20 нм. В ходе дополнительный теоретических и практических исследований было установлено, что оптимальная высота слоя сорбента в хроматографической колонне должна лежать в диапазоне от 10 до 15 см.

Производственная очистки ГИЧ. Полученные результаты по очистке ГИЧ были масштабированы до производственного уровня: объем сорбента в хроматографической колонне равен 3,5 кг, размеры колонны 700x150 мм, нагрузка образца 55-65 г ГИЧ.

2оо Время, мин

Рис. 17. Препаративная хроматографическая очистка инсулина человека от примесей (профиль элюции - сплошная линия; градиент состава подвижной фазы - штриховая линия). Колонна YMC DAU150-700, упакованная сорбентом YMC Basic С8-15 мкм-20 нм. Подвижная фаза «А»: 10 % этанол, 1 % уксусная кислота, 2 % этилацетат, остальное - вода для инъекций. Подвижная фаза «Б»: 50 % этанол в воде для инъекций.

Материал, элюироваииый с колонны, фракционировали следующим образом: первая фракция, содержащая 10-15 % продукта, не отвечала требованиям к чистоте инсулина и направлялась на вторичную рехроматографическую очистку; вторая фракция, содержащая 80-90 % продукта, отвечала требованиям к чистоте инсулина и направлялась на финишную очистку (Рис. 17). Параметры аналитического контроля обеих фракций представлены ниже (Таблица 2).

Таблица 2. Аналитический контроль фракций после ВЭЖХ-очистки.

Параметр Тест Фр. 1 Фр. 2 Норма

Содержание А21 -дезамидоинсулина, % ВЭЖХ 5,0-7,0 0,2-0,4 <2

Содержание инсулиноподобных полипептидов, % ВЭЖХ 0,1-0,5 0,2-0,5 <2

Содержание БЭ, ЭЕ/мг JIAJI-тест <2,5 <2,5 < 10

Содержание проинсулиноподобных полипептидов, нг/мг ИФА 20-30 0-7 < 10

Содержание ВМП, % SEC 0,05-0,1 0,02-0,08 <1

Выход инсулина, % ВЭЖХ 10-15 85-90 -

Фракцию 2 осаждали ацетатом цинка, осадок отделяли и растворяли в 0,5 М уксусной кислоте до концентрации инсулина 45-50 мг/мл. Образец наносили на колонну, упакованную сефадексом G-50 (GE Healthcare, Швеция) и подвергали обессоливанию гель-фильтрацией, элюируя 0,5 М уксусной кислотой в качестве подвижной фазы. Основную фракцию (содержание около 90 %) снова осаждали ацетатом цинка и кристаллизовали, кристаллы лиофильно высушивали. Разработанный эффективный способ очистки позволил получать активную фармацевтическую субстанцию инсулина человека с активностью не менее 27,5 МЕ/мг, которая может быть использована в производстве готовых лекарственных форм.

Валидация ВЭЖХ-очистки. Валидация необходима для доказательства того, что процесс хроматографической очистки ГИЧ воспроизводим, предсказуем и способствует получению АФС, отвечающей требованиям к качеству. Разработанная схема очистки ГИЧ была внедрена в технологию серийного выпуска АФС инсулина на Опытном биотехнологическом производстве ИБХ РАН, поэтому было логично предложить проведение сопутствующей валидации. Для корректной оценки результатов производственной хрсматсграфичсскоя очистки в качестве критериев приемлемости были приняты следующие показатели:

1. Выход (Г, %), или количество инсулина в основной фракции с чистотой, удовлетворяющей критериям приемлемости, отнесенное к суммарно нанесенному на хроматографическую колонну инсулину. Должен быть не ниже 80 %.

2. Чистота основной фракции (Рта %), или содержание целевого инсулина в основной фракции по данным аналитического определения методом ВЭЖХ. Должна быть не ниже 98,0 %.

3. Содержание А21-дезамидоинсулина (Ран, %) в основной фракции по данным аналитического определения методом ВЭЖХ. Должно быть не выше 0,8 %.

4. Производительность процесса (Рг, г * (л * ч)~'), или количество инсулина с чистотой, отвечающей критериям приемлемости, очищаемое на 1 литре объема хроматографической колонны за 1 час. Должна быть не ниже 2 г * (л * ч)"1.

Валидация процесса была проведена в следующем порядке:

1. Проведено ознакомление с необходимой технической и нормативной документацией.

2. Проведены последовательно 5 циклов хроматографической очистки (в период с 25.06.2008 года по 09.07.2008 года, номера циклов с ЛРС004 по ЯРС008) в соответствии с утвержденной стандартной операционной процедурой. Из каждой собранной фракции отобраны образцы для проведения аналитических испытаний методом ВЭЖХ для определения чистоты и содержания А21-дезамидоинсулина, а также концентрации инсулина в основной фракции для последующего расчета значений выхода и производительности. Результаты испытаний занесены в сводный протокол параметров процесса и аналитического контроля.

3. Полученные и рассчитанные данные сопоставлены с выбранными критериями приемлемости.

4. Оформлен отчет о валидации процесса и сделаны необходимые выводы. Результаты, полученные в течение валидации процесса, представлены ниже (Таблица 3). Все показатели соответствуют принятым критериям приемлемости. Следовательно, разработанный процесс хроматографической очистки ГИЧ воспроизводим, предсказуем и способствует получению АФС, отвечающей требованиям к качеству.

Таблица 3. Показатели процесса хроматографической очистки (по пяти последовательных производственным циклам).

Номер цикла Дата цикла Рте, % PA2I, % У, % Рг, г*(л*чу' Соответствие критериям приемлемости

RPC004 25.06.08 99,10 0,43 85,74 2,55 соответствует

RPC005 01.07.08 98,80 0,44 84,93 2,25 соответствует

RPC006 02.07.08 99,25 0,33 83,00 2,06 соответствует

RPC007 08.07.08 98,00 0,34 81,45 2,41 соответствует

RPC008 09.07.08 98,00 0,24 80,26 2,47 соответствует

Среднее значение 98,63 0,34 83,08 2,35

Технология получения и очистки инсулина-аспарта и инсулина-лизпро.

Получение аналогов проводили, ферментативно расщепляя соответствующие предшественники (в каждом случае молекулярная масса предшественника была приблизительно равна 17 кДа). Условия проведения гидролиза соответствовали условиям, оптимизированным в процессе получения ГИЧ. Очистку от родственных полипептидов, ВМП, БЭ и проинсулинподобных примесей осуществляли с помощью ОФ ВЭЖХ. Поскольку физико-химические свойства молекул аналогов и молекулы инсулина достаточно близки, то мы решили использовать одну и ту же неподвижную фазу, а именно силикагель с привитой октальной группой, пористостью 20 нм, размерностью 15 мкм. Т.к. инсулин-аспарт и инсулин-лизпро, в отличие от ГИЧ, обладают пониженной способностью к самоассоциации, то, очевидно, что процесс волокнообразования практически исключен. Следовательно, в качестве подвижной фазы можно было использовать раствор, содержащий любую кислоту, способствующую высоким показателям

1] б \

, у А.Л-. ^Л -К

SO 100 150

Рис. 18. Хроматографическая препаративная очистка инсулина-аспарта (а) и инсулина-лизпро (6) от примесей (профиль элюции - сплошная линия; градиент состава подвижной фазы - штриховая линия). Колонна ВСМ100, упакованная сорбентом YMC Basic С8-15 мкм-20 нм (объем колонны 1,8 л). Подвижная фаза «А»: 10 % этанол, 10 мМ лимонная кислота, остальное - вода для инъекций. Подвижная фаза сБ»: 50 % этанол в воде для инъекций. Нагрузка; 30-35 г аналога.

Материал, элюированиый с колонны в описанных выше условиях, фракционировали следующим образом: первая фракция, содержащая 70-80 % продукта, отвечала требованиям к чистоте инсулина и направлялась на финишную очистку; вторая фракция, содержащая 10-20 % продукта, не отвечала требованиям к чистоте инсулина и подвергалась вторичной рехроматографической очистке (Рис. 18). Параметры аналитического контроля чистых фракций аналогов инсулина представлены ниже (Таблица 4).

Таблица 4. Результаты анализа фракций аналогов, полученных после ВЭЖХ*очистки.

Параметр Тест Инсулин-аспарт Инсулин-лизпро Норма

Содержание А21-дезамидированной формы, % ВЭЖХ 0,2-0,4 0,2-0,4 <2

Содержание инсулиноподобных полипептидов, % ВЭЖХ 0,1-0,5 0,5-1,0 <2

Содержание БЭ, ЭЕ/мг JIAJI-тест <2,5 <2,5 <10

Содержание проинсулиноподобных полипептидов, нг/мг ИФА 0-3 0-3 <10

Содержание ВМП, % SEC 0,02-0,08 0,02-0,08 < 1

Выход инсулина, % ВЭЖХ 78 75 -

Чистые фракции осаждали ацетатом цинка, осадок отделяли и растворяли в 0,5 М уксусной кислоте до концентрации инсулина 45-50 мг/мл. Образцы поочередно наносили на колонну, упакованную сефадексом G-50 (GE Healthcare, Швеция) и подвергали обессоливанию гель-фильтрацией, элюируя 0,5 М уксусной кислотой в качестве подвижной фазы. Основные фракции (содержание около 90 %) лиофильно высушивали.

Разработанный эффективный способ очистки позволил получить АФС инсулина-аспарт и инсулина-лизпро с активностью не менее 27,5 МЕ/мг, которые были переданы на клинические испытания.

Выводы.

1. Разработан основанный на ион-парной ОФ ВЭЖХ метод внутрипроизводственного контроля содержания дТИ, побочного продукта ФГ, в растворах ГИЧ.

2. Проведена оптимизация ферментативного гидролиза предшественника инсулина по следующим показателям: температура процесса, соотношение ферментов, концентрации реагентов.

3. Предложена схема гидролиза РП с предварительной защитой аминогрупп с тем, чтобы минимизировать образование побочного полипептида дТИ.

4. Исследован процесс фибриллоборазования инсулина в растворах с низким рН и определено, какие кислоты способствуют минимизации агрегации полипептида.

5. Разработана эффективная схема очистки инсулина методом ОФ ВЭЖХ с помощью смешанного (элюентного и «вытеснительного») режима хроматографирования. Валидационной процедурой подтверждено, что разработанный процесс воспроизводим, предсказуем и позволяет получать АФС ГИЧ качества, соответствующего фармакопейным требованиям.

6. Разработан внутрипроизводственный метод контроля содержания ГИЧ, более оперативный (длительность анализа 23,5 мин), чем метод, рекомендуемый фармакопейной статьей. Достоверность результатов анализа была доказана валидационной процедурой, в ходе которой оценивались линейность, правильность, точность, предел обнаружения, нижний предел количественной оценки, специфичность, устойчивость к изменению температуры, составу подвижных фаз, смене хроматографических колонок.

7. Разработан эффективный способ получения из предшественников и очистки инсулина-аспарт и инсулина-лизпро, позволяющий получать АФС, удовлетворяющие международным стандартам качества. Наработанные образцы АФС аналогов инсулина в настоящее время проходят государственную регистрацию.

Разработанная технология выделения и очистки позволила получать соответствующую фармакопейным требованиям АФС с суммарным выходом до 220-240 мг инсулина /мЗ кулътуралъной жидкости.

Разработанная технология в настоящее время успешно реализуется на Опытном биотехнологическом производстве Учреждения российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гусаров Д.А., Востриков В.В., Ручко Е.А., Ласман В.А., Михалев A.B., Баирамашвили Д.И / Использование ОФ ВЭЖХ для очистки генноинженерного инсулина человека // Биотехнология. 2006. №2. С. 44-49.

2. Gusarov D., Lasman V., Bayramashvili D. / Methods for protecting silica sorbents used in high-performance liquid chromatography from strongly adsorbed impurities during purification of human recombinant insulin // J. Chromatogr. B. 2007. V.853. P.354-359.

3. Gusarova V., Vorobjeva T„ Gusarov D„ Lasman V., Bayramashvili D. / Size-exclusion Chromatography Based on Silica-diol for the Analysis of the Proinsulin Fusion Protein // J. Chromatogr. A. 2007. V.l 176. P. 157-162.

4. Гусаров Д.А., Гусарова В.Д., Баирамашвили Д.И., Миронов А.Ф. / Генно-инженерный инсулин и его фармацевтические аналоги // Биомедицинская Химия.

2008. Т.54. №6. С.624-642.

5. Гусаров Д.А., Гусарова В.Д., Михалев A.B., Ласман В.А., Баирамашвили Д.И., Миронов А.Ф., Сенаторова Н.К., Сенаторов A.B. / Валидация метода контроля производства генно-инженерного инсулина человека // Биоорганическая Химия.

2009. Т.35. №1. С.55-61.

6. Гусарова В.Д., Гусаров Д.А., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И, Мирошников А.И. / Оптимизация промышленного получения рекомбинантного предшественника инсулина человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №4. С.510-518.

7. Gusarov D., Nekipelova V., Gusarova V., Lasman V., Bayramashvili D. / Displacement Effect During HPLC Preparative Purification of Human Insulin // J. Chromatogr. B. 2009. V.877. P.1216-1220.

8. Гусаров Д. А., Гусарова В.Д., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И. / Инсулины пролонгированного действия: структура и фармакологический эффект // Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №1. С.3-11.

9. Гусарова В.Д., Гусаров Д.А., Шепель E.H., Михалев A.B., Ласман В.А. / Аналитическое определение содержания ВЗО-дезтреонин-инсулина в растворах генно-инженерного инсулина человека // Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №1. С.28-33.

10. Некипелова В.О., Гусаров Д.А., Ласман В.А., Баирамашвили Д.И., Миронов А.Ф., Швец В.И. / Образование фибрилл генно-инженерного инсулина человека в условиях хроматографической очистки // Биотехнология. 2009. №3. С.49-53.

11. Баирамашвили Д.И., Гусаров Д.А., Давыдов В.И., Зинченко A.A., Косарев С.А., Ласман В.А., Мирошников А.И., Михалев A.B., Шибанова ЕД. / Способ получения генно-инженерного инсулина человека // Патент Российской Федерации №2322504 С1, заявка 26.06.2006, опубликован 20.04.2008 Бюл №11.

12. Гусаров Д.А., Востриков В.В. / Подбор и сравнительная оценка условий разделения инсулина и А21-дезамидоинсулина на ОФ ВЭЖХ // XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления биологии и биотехнологии», тезисы докладов и стендовых сообщений под ред. к.х.н. Т.В.Овчинниковой и Т.И.Соркиной, Москва, 2005.

13. Гусаров ДА., Ручко Е.А., Востриков В.В., Михалев A.B., Баирамашвили Д.И. / Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в производстве генноинженерного инсулина человека // Третий Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2005.

14. Гусаров Д.А., Ласман В.А., Баирамашвили Д.И. / Сравнение технологий очистки генноинженерного инсулина человека (ГИЧ) с помощью гидрофобной хроматографии и ОФ ВЭЖХ // Московская Международная Конференция «Биотехнология и Медицина», материалы конференции, Москва, 2006.

15. Гусарова В Д., Ласман В.А., Гусаров Д.А., Баирамашвили Д.И. / Оптимизация процесса ферментативного расщепления рекомбинантного белка в производстве субстанции инсулина человека // Московская Международная Конференция «Биотехнология и Медицина», материалы конференции, Москва, 2006.

16. Михалев A.B., Шепель E.H., Ласман В.А., Гусаров ДА., Баирамашвили Д.И. / Аналитическое определение содержания ВЗО-дезтреониноинсулина (дТИ) в растворах генноинженерного инсулина человека (ГИЧ) // Московская Международная Конференция «Биотехнология и Медицина», материалы конференции, Москва, 2006.

17. Gusarov D„ Lasman V., Bobruskin A., Bayramashvili D. / Pilot Plant Scale Purification of the Human Insulin and Human Growth Hormone by Reversed Phase HPLC and Hydrophobic Interaction Chromatography: Methods comparison and

Qualification //Advancements, Applications and Theory in Downstream Processing, 5th HIC/RPC Bioseparation Conference, abstracts, Switzerland, Interlaken, 2007.

18. Гусаров Д.А., Ласман В.А., Баирамашвши Д.И. / ВЭЖХ в производстве терапевтических рекомбииаитных белков // Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2009.

19. Гусарова В.Д., Гусаров Д.А., Воробьева Т.В., Ласман В.А., Баирамашвши Д.И. / Оптимизация фолдинга и рефолдинга рекомбинантного препроинсулина // Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2009.

Заказ № 296. Объем 1 пл. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Фолиум». Москва, Дмитровское ш., 58. Тел. (495) 482-55-44 vnvw.folium.ru

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Инсулин.

2. Способы производства инсулина человека.

2.1. Полусинтетический и генно-инженерный способы.

2.2. Ферментативное превращение предшественника в инсулин.

2.3. Методы очистки инсулина.

2.4. Валидация процессов и аналитического контроля в производстве биофармацевтических препаратов.

3. Фармацевтические аналоги генно-инженерного инсулина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Постановка задачи.

2. Ферментативный гидролиз предшественника инсулина.

2.1. Внутрипроизводственный контроль ферментативного гидролиза.

2.2. Ферментативный гидролиз: влияние температуры.

2.3. Ферментативный гидролиз: оптимальные концентрации реагентов

2.4. Производственный ферментативный гидролиз.

2.5. Ферментативный гидролиз: обратимая модификация лизина (В29).

3. Разработка и валидация метода контроля производства ГИЧ.

3.1. Линейность.

3.2. Правильность и точность (сходимость и воспроизводимость).

3.3. Предел обнаружения и нижний предел количественной оценки.

3.4. Специфичность.

3.5. Устойчивость метода.

3.6. Выводы.

4. Хроматографическая очистка инсулина.

4.1. Подготовка опытного образца.

4.2. Изучение состава подвижной фазы.

4.3. Определение оптимальной нагрузки на сорбент.

4.4. Определение оптимальной геометрии колонны.

4.5. Подбор оптимальной неподвижной фазы.

4.6. Очистка от эндотоксинов клеточной стенки, проинсулинподобных полипептидов и высокомолекулярных примесей.

4.7. Производственная очистка инсулина.

4.8. Валидация процесса хроматографической очистки инсулина.

5. Технология получения и очистки инсулина-аспарта и инсулина-лизпро.

МАТЕРИАЛЫ, ПРИБОРЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

1.1. Реактивы.

1.2. Хроматографические сорбенты и колонны.

2. Приборы.

2.1. Хроматографические системы.

2.2. Оборудование.

3. Методы.

3.1. Контроль производства ГИЧ методом ОФ ВЭЖХ.

3.2. Контроль содержания дТИ методом ион-парной ОФ ВЭЖХ.

3.3. Контроль содержания ВМП методом SEC.

3.4. Получение рекомбинантных предшественников.

3.5. Проведение ферментативного гидролиза.

3.6. Проведение ВЭЖХ-очистки.

3.7. Проведение гель-фильтрации.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Инсулин является одним из наиболее изученных гормонов. С момента открытия того факта, что инсулин, вырабатываемый поджелудочной железой, отвечает за снижение уровня сахара в крови [1], до настоящего времени прошло уже более 80 лет. Тем не менее, и по сей день этот гормон вызывает огромный интерес. Сахарный диабет занимает третье место по смертности после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [2; 3]. В 2000 году во всем мире насчитывалось почти 150 миллионов больных сахарным диабетом [4], причем эта цифра растет год от года примерно на 2-6 % [5; 6]. Так, например, к 2010 году прогнозируется увеличение числа страдающих этим заболеванием примерно до 33 миллионов в странах Европы [7], а в нашей стране почти 400 тысяч человек нуждаются в регулярном приеме препаратов инсулина.

Несмотря на то, что все люди ведут различный образ жизни, концентрация глюкозы в крови у каждого из них поддерживается в пределах достаточно узкого диапазона и мало изменяется в течение суток. Нормальная концентрация глюкозы в плазме крови составляет от 3 до 8 мМ [5]. Через 15-30 минут после принятия человеком пищи уровень сахара в крови возрастает (Рис. 1) [8]. Примерно так же как суточная динамика глюкозы в крови выглядит и динамика содержания инсулина (Рис. 2) [8]. Возрастание концентрации инсулина в крови является откликом организма на повышение уровня глюкозы, гормон в свою очередь понижает содержание глюкозы до базального уровня примерно через 2 часа после принятия человеком пищи [9]. Сахарный диабет

Рис. 1. Суточная динамика концентрации глюкозы в крови здорового человека и больного сахарным диабетом. и J m I х те

§ X

25

4:00 8:00 12 ЮО 16:00 20:00 24:00 4:00 8:00

Время суток, час:мин

Рис. 2. Физиологический профиль инсулина у здорового человека.

При сахарном диабете происходит повышение уровня сахара в крови почти в 3-4 раза вследствие либо инсулиновой недостаточности (сахарный диабет первого типа), либо резистентности организма к действию инсулина (сахарный диабет второго типа). В случае сахарного диабета первого типа поддержание базального уровня глюкозы становится задачей заместительной терапии, и пациент нуждается в постоянных инъекциях различных препаратов инсулина в течение всей жизни.

Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков Лангерганса поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека [10]. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом первого типа, применяли инсулины крупного рогатого скота или свиньи. Однако со временем в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, вызывая нежелательные аллергические реакции. Тем более что потребности в препарате инсулина не могут быть покрыты инсулином животного происхождения из-за ограниченности сырьевой базы [11].

Существенный вклад в развитие современной фармакологии вносит технология получения рекомбинантных ДНК с помощью методов генной инженерии. Созданные штаммы кишечной палочки, дрожжей, культивируемых клеток растений и животных используются для получения гормонов, большинства известных ферментов, противовирусных вакцин и т.д. С появлением технологии рекомбинантных ДНК впервые стало возможным производить инсулин в крупных масштабах. Так в 80-е годы XX века американской компанией Genentech разработана технология производства генно-инженерного инсулина человека (ГИЧ), которая впоследствии была коммерциализирована корпорацией Eli Lilly [12]. В настоящее время ежегодное производство активной фармацевтической субстанции (АФС) инсулина во всем мире превышает 15000 кг [13]. К лидирующим производителям ГИЧ относятся такие зарубежные фирмы, как Eli Lilly (США), Sanofi-Aventis (Германия-Франция),

Novo Nordisk (Дания). В нашей стране исследования в области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина.

Разработка конкурентоспособной высокоэффективной технологии получения фармацевтических препаратов ГИЧ и других терапевтических белков является одним из основных направлений современной отечественной биотехнологии. Не менее важно производство аналогов ГИЧ, таких как инсулин-аспарт, инсулин-лизпро, инсулин-гларгин, которые существенно улучшают физиологическую динамику инсулина в крови.

Современные стандарты качества, принятые как в нашей стране, так и за рубежом предъявляют очень высокие требования к чистоте рекомбинантного инсулина человека, предназначенного для производства инъекционных лекарственных препаратов [14, 15, 16]. Однако разделение инсулина и близкородственных ему белков является сложной задачей из-за сходства их физико-химических характеристик. Основной целью данной работы была разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения и очистки ГИЧ и его фармацевтических аналогов, ее оптимизация, разработка контроля производства ГИЧ.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Изучить и оптимизировать процесс ферментативного расщепления РП с образованием инсулина.

1.1. Определить оптимальную температуру для проведения ферментативного гидролиза;

1.2. Определить оптимальное соотношение ферментов;

1.3. Определить оптимальную концентрацию РП;

1.4. Изучить процесс ферментативного расщепления РП с предварительным блокированием аминогрупп.

2. Разработать и оптимизировать очистку инсулина методом ВЭЖХ на аналитическом уровне.

2.1. Определить оптимальную неподвижную фазу (размер частиц, пористость, длина алкильной прививки);

2.2. Изучить сорбенты различных производителей и выбрать оптимальные;

2.3. Определить оптимальный состав подвижной фазы (органический модификатор, буферные вещества, рН);

3. Масштабировать результаты ВЭЖХ очистки от аналитического до производственного уровня, рассчитать производительность процесса.

4. Разработать и валидировать метод контроля производства инсулина.

5. Провести валидацию процесса очистки инсулина от примесей.

6. Разработать процесс получения аналогов инсулина из соответствующих рекомбинантных предшественников (ферментативный гидролиз).

7. Разработать эффективный способ очистки аналогов от примесей.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Инсулин

Инсулин является полипептидным гормоном, играющим ключевую роль в процессах обмена веществ. Основная функция инсулина состоит в том, что в мышцах, печени и жировой ткани он усиливает анаболитические и ингиби-рует катаболитические процессы. В частности, инсулин повышает скорость синтеза гликогена, жирных кислот, белков, а также стимулирует гликолиз. Существенное значение имеет стимуляция проникновения глюкозы, ряда других Сахаров, а также аминокислот в клетки мышц и жировой ткани. Способствуя транспорту глюкозы в указанные клетки, гормон снижает ее содержание в крови (так называемый гипогликемический эффект). Инсулин инги-бирует такие катаболические процессы, как распад гликогена [17]. Он тормозит также гликонеогенез путем снижения уровня ферментативной активности пируват-карбоксилазы и фруктозо-1,6-бисфосфатазы. Показано, что инсулин увеличивает также активность пируват-дегидрогеназы, ацетил-СоА-карбоксилазы и глицеролфосфат-ацетилтрансферазы [18]. Действие инсулина во многом противоположно действию адреналина и глюкагона [17]. Наиболее мощным нейромедиатором, стимулирующим секрецию инсулина Р-клетками, служит ацетилхолин. Секрецию инициирует связывание на поверхности клеток ацетилхолина или карбамоилхолина с мускариновыми хо-линергическими рецепторами, которые сопрягаются посредством G-белков с фосфолипазой С, генерирующей из фосфатидилинозит-4,5-бис-фосфата ино

У Азит-1,4,5-трифосфат, мобилизующий Са из внутриклеточных пулов, и диа-цилглицерин; последний служит активатором протеинкиназы С. Т.Биден [19] обнаружил также, что пищевые раздражители после метаболического превращения опосредованно передают на Р-клетки сигнал, резко повышающий чувствительность к Са2+ секреторного аппарата и, по-видимому, связанный с активацией протеинкиназ.

Интересна методология биосинтеза инсулина в клетке [20]. Инсулин является продуктом протеолиза другой белковой молекулы - проинсулина (Рис. 3) [21; 22].

Рис. 3. Схематическое изображение проинсулина человека (серым цветом показана аминокислотная последовательность, соответствующая С-пептиду; белым - инсулину).

Проинсулин синтезируется в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме (3-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в виде предшественника - препроинсулина (молекулярная масса примерно 11500 Да) [23; 24; 25; 26]. Лидерная последовательность, состоящая из 23 аминокислотных остатков, направляет молекулу предшественник в аппарат Гольджи и там отщепляется [27; 28]. В результате образуется молекула проинсулина (молекулярная масса примерно 9000 Да), принимающая конформацию, необходимую для правильного образования дисульфидных мостиков. Затем проинсулин расщепляется трипсиноподобным ферментом на инсулин, С-пептид и два дипептида и депонируется в секреторных гранулах [18; 29; 30]. Далее содержимое этих гранул секретируется в воротную вену [18; 31]. Помимо инсулина образуется также эквимолярное количество С-пептида и 2-3 % проинсулина и его производных (продуктов неполного протеолиза проинсулина) [17,

19]. До попадания в периферическую кровеносную систему, инсулин и С-пептид направляются в печень, где деградирует 50 % инсулина, в то время как С-пептид не подвергается никаким воздействиям. Впервые структура молекулы инсулина установлена Сенджером в 1951 г [32].

Рис. 4. Схема расположения дпсульфидных связей в молекуле инсулина.

Молекула инсулина - полипептид, состоящий из двух цепей (Рис. 4): А и В. Молекулярная масса инсулина равна 5807,6 Да. Аминокислотная последовательность инсулина человека приведена ниже (Рис. 5). Цепи инсулина кова-лентно связаны между собой двумя дисульфидными связями А7-В7 и А20-В19. Также в молекуле инсулина имеется еще одна дисульфидная связь в А-цепи: А6-А11 [33]. А- и В-цепи у представителей большинства видов животных имеют по 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно.

Среди животных инсулинов различного происхождения в обеих цепях во многих положениях встречаются аминокислотные замены, не оказывающие влияния на биологическую активность гормона, однако наиболее распространенными являются замены по 8, 9 и 10 положению А-цепи (Таблица 1). Из этого следует, что данный участок, скорее всего, не имеет критического значения для биологической активности инсулина.

Таблица 1. Замены в аминокислотной последовательности различных инсулинов.

Млекопитающее А-цепь В-цепь

8 9 10 30

Человек Thr Ser lie Thr

Свинья, собака, кашалот Thr Ser lie Ala

Кролик Thr Ser lie Ser

Бык, коза Ala Ser Val Ala

Овца Ala Gly Val Ala

Лошадь Thr Gly lie Ala

Сейвал Ala Ser Thr Ala

С другой стороны, некоторые участки и области молекулы обладают высокой консервативностью. К ним относятся:

1. положения трех дисульфидных мостиков;

2. гидрофобные остатки в С-концевом участке В-цепи;

3. С- и N-концевые участки А-цепи.

Использование химических модификаций и замен отдельных аминокислотных остатков в этих участках помогли идентифицировать структуру активного центра инсулина. Расположенный на С-конце В-цепи гидрофобный участок участвует также в димеризации инсулина.

Цинк, концентрация которого в [3-клетках островков Лангерганса достигает высоких значений, формирует комплексы с инсулином и проинсулином. Ин-сулины всех позвоночных образуют димеры с помощью водородных связей между пептидными группами остатков В24 и В26 двух мономеров, которые при высоких концентрациях, в свою очередь, реорганизуются в гексамеры, содержащие по два атома цинка в каждом. Наличие такой высокоупорядо-ченной структуры существенно облегчило изучение кристаллической структуры инсулина.

При восстановлении дисульфидных связей и последующем их окислении, третичная структура практически не восстанавливается (очень низкий выход) [33]. Это объясняется наличием прогормона - проинсулина, полипептидная цепь которого включает последовательность из 30-35 аминокислот, отсутствующая в инсулине. Это связывающий пептид (С-пептид от английского connecting - связывающий); который расположен между карбоксильным концом В-цепи и N-концом А-цепи будущего инсулина. Проинсулин обладает способностью к формированию правильно расположенных дисульфидных связей после обработки восстанавливающими агентами и последующей рена-турации. После замыкания дисульфидных мостиков, стабилизирующих молекулу проинсулина в целом, трипсиноподобная протеиназа "вырезает" С-пептид [10]. Точки воздействия этой протеиназы предопределены двумя факторами - пространственной структурой проинсулина и присутствием в его полипептидной цепи двух пар катионных аминокислот, расположенных в последовательности следующим образом: В-цепь - Arg Arg - С-пептид - Lys Arg - А-цепь (Рис. 6).

651 66 Arg-Gly

12

Lys 1

H-Phe

71 S ■ S

76 S S

Проинсулин

85 86 Asn- OH

19

30 -Tre

Gin ■ 63

H-Gly

-l-JL

H-Phe

6 S i S

HO Gin

20

11 S ■ s

19

-Glu-Arg-Arg 33f 321 31

Инсулин 21

Asn- OH

30

-Thr-OH

-Glu-H

С-пептид

Рис. 6. Схема отщепления С-пептида от проинсулина под действием трипсиноподобной протеиназы.

Трипсиноподобная протеиназа узнает пары аминокислот с катионными боковыми группами типа Arg-Arg и Lys-Arg и расщепляет пептидную связь на С-конце таких пар. В результате образуется С-пептид (Рис. 7) вместе с последовательностью Lys-Arg на С-конце и, связанные дисульфидными мостиками, цепи А и В. Причем на С-конце цепи В оказываются два остатка аргинина, отщепление которых является завершающей стадией получения активной формы гормона. Данный процесс осуществляет специализированная метал-лозависимая карбоксипептидаза [10].

Н — Arg -Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly- Pro

OH — Arg-Lys-Gln-Leu-Ser-Gly -Glu-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Leu-Ser- Gly-Ala-Gly Рис. 7. Аминокислотная последовательность С-пептида проинсулина человека.

В растворах инсулиновые молекулы существуют в состоянии равновесия между мономерной, димерной, тетрамерной и гексамерной формами [34]. При низких концентрациях, сравнимых с концентрациями в крови, преобладает мономерная форма, которая является биологически активной, так как именно она способна взаимодействовать с инсулиновым рецептором [35]. При более высоких концентрациях в кислой или щелочной среде (рН 8,0 и выше) в отсутствии ионов цинка гормон способен к самоассоциации в диме-ры, а в присутствии катионов цинка в нейтральной или слабоосновной среде - в гексамеры (Рис. 8). В результате биосинтеза инсулин накапливается в организме в форме кристаллического цинк-связанного инсулина в везикулах островковых клеток, высвобождаясь по мере увеличения концентрации глюкозы в крови [36]. И хотя хорошо известно, что гексамер существует в трех конформациях (R6, T3R3 и Т6), зависящих от конформации мономерной единицы, тем не менее, до сих пор не ясно, какая из конформаций реализуется при накоплении в клетках островков Лангерганса [37; 38; 39; 40]. Инсулиновые молекулы можно кристаллизовать в различных конформаци-онных состояниях [41]. Впервые кристаллическая структура инсулина была определена еще в 1969 году и представляла собой гексамер, в котором объединялись три димера вокруг двух ионов цинка [42; 43]. В последствии были описаны гексамерные структуры, содержащие и по четыре иона цинка [44] .В гексамере, содержащем два иона цинка, области в мономерных единицах BIBS и В20-В30 отталкиваются а-спиральным участком В9-В19 [45]. Поэтому это конформационное состояние носит название напряженного (tense, Т-состояние).

А-цепь М

S-цепь В в

Рис. 8. Схематическое изображение возможных структур инсулина человека: А-мономер; Б-днмер; В-гскеамер R-6, стабилизированный катионам» цинка и резорцином (по две молекулы в каждой днмер-ной субъедииице, одна молекула - в центре гексамера); Г-гексамер Т-б, стабилизированный двумя катионами цинка.

Ионы металла координируют остатки гистидинов в положениях В10 всех трех димеров. В каждом мономере димера А и В-цепи образуют компактную молекулу, включающую две а-спирали А-цепи и одну а-спираль В-цепи (состояние Т6).

В конформации, содержащей четыре иона цинка, при высоких концентрациях хлорид-ионов три N-конца В-цепи (остатки аминокислот в положениях В1-В8) ассоциируются в а-спираль. Подобная конформация называется R6, или ослабленной (relaxed) [46]. Переход из Т6 в R6 состояние возможен при связывании молекулы с такими лигандами, как фенол, крезол, метилпарабен, резорцин и т.д. [35]. Подобное связывание происходит по участкам молекулы инсулина, названным гидрофобными карманами. В состоянии T3R3 (несимметричная структура, в которой 4 иона цинка координируются В10-гистидинами) имеется три таких кармана, а в состоянии R6 — шесть. Известно, что фенол и его производные можно использовать в лекарственных препаратах инсулина и как антибактериальные консерванты [47], и как добавки, препятствующие протеканию реакций дезамидирования [48]. Показано, что соединения фенольного ряда способствуют также стабилизации T3R3 и R6 гексамеров, увеличивая тем самым устойчивость молекулы к термической денатурации и полимеризации [35].

выводы

1. Был изучен и оптимизирован процесс ферментативного расщепления РП с образованием инсулина.

1.1. Разработан метод производственного контроля содержания дТИ, побочного продукта ферментативного гидролиза, в растворах ГИЧ. Метод основан на ион-парной ОФ ВЭЖХ. Продемонстрировано, что метод позволяет получать разделение между пиками инсулина и дТИ не менее 1,8. Время анализа составило 20 мин.

1.2. Определена оптимальная температура для проведения ферментативного гидролиза, составившая +6 ± (-1)°С.

1.3. Определено оптимальное соотношение ферментов, составившее:

- соотношение РП/трипсин: от 1/11000 до 1/7500;

- соотношение РП/карбоксипептидазаВ: от 1/7000 до 1/5500;

- соотношение трипсин/карбоксипептидаза В: 1,5/1,0.

1.4. Определена оптимальная концентрация РП, составивашая 9,75 ± 0,25 мг/мл;

1.5. Разработан процесс ферментативного расщепления РП с предварительным блокированием аминогрупп с тем, чтобы минимизировать образование дТИ. Обратимая модификация аминогруппы лизина (В29) в составе РП позволила избежать узнавания его трипсином и минимизировать образование побочного продукта гидролиза, дТИ. Определено, что наименьшее содержание дТИ и максимальный выход ГИЧ наблюдаются при использовании цит-раконового ангидрида в концентрации 0,25-0,5 г/г. После деблокирования аминогрупп получаемого в результате гидролиза инсулина содержание примесного дТИ не превышало 0,5 %.

2. Была разработана эффективная схема очистки инсулина методом ВЭЖХ на аналитическом уровне.

2.1. Для этого первоначально был изучен процесс волокнообразования ГИЧ в растворах с низким значением рН. Образование волокон инсулина в хромато-графических подвижных фазах является следствием агрегации его молекул и приводит к физическому блокированию внутренних пор сорбентов, снижая их срок эксплуатации, производительность процесса очистки, качество разделения. Продемонстрировано, что волокнообразование практически исключается в подвижных фазах, содержащих органические кислоты, такие как уксусная и молочная.

2.2. Определен оптимальный состав подвижной фазы (этиловый спирт в качестве органического модификатора, уксусная кислота (рН 3,0-3,5), этил-ацетат в качестве вытесняющего агента).

2.3. Определена оптимальная неподвижная фаза для производственного процесса (размер частиц 15 мкм, пористость 20 нм, длина алкильной прививки С8).

2.4. Изучены сорбенты различных производителей и выбран оптимальный для производственных целей (YMC Basic С8-15 мкм-20 нм).

3. Масштабированы результаты ВЭЖХ очистки от аналитического до производственного уровня, производительность процесса составила не менее 2 г инсулина / л сорбента * ч. Оптимальная нагрузка составила 10-15 мг инсулина / мл сорбента. Рассчитаны оптимальные размеры производственной ВЭЖХ колонны, а именно внутренний диаметр и высота слоя сорбента. Экспериментально подтверждено, что высота слоя сорбента должна быть 1015 см, диаметр должен быть не ниже 100 см.

4. Разработан метод контроля производства инсулина более оперативный (длительность анализа 23,5 мин), чем метод, рекомендуемый фармакопейной статьей. Достоверность результатов анализа была доказана валидационной процедурой, в ходе которой оценивались линейность, правильность, точность, предел обнаружения, нижний предел количественной оценки, специфичность, устойчивость к изменению температуры, составу подвижных фаз, смене хроматографических колонок.

5. Проведена валидация процесса очистки инсулина от примесей. Подтверждено, что разработанный процесс воспроизводим, предсказуем и позволяет получать АФС ГИЧ качества, соответствующего фармакопейным требованиям.

6. Разработан процесс получения аналогов инсулина из соответствующих рекомбинантных предшественников (ферментативный гидролиз).

7. Разработан эффективный способ очистки аналогов от примесей. Полученные фармацевтические аналоги инсулина обладали активностью не менее 27,5 МЕ/мг и чистотой, удовлетворяющей стандартам качества. АФС аналогов были переданы на клинические испытания.

Разработанная технология выделения и очистки позволила получать соответствующую фармакопейным требованиям АФС с суммарным выходом до 220240 мг инсулина / мЗ культуральной жидкости.

Разработанная технология в настоящее время успешно реализуется на Опытном биотехнологическом производстве Учреждения российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю .А.Овчинникова.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Опубликованные статьи:

1. Гусаров Д.А., Востриков В.В., Ручко Е.А., Ласман В. А., Михалев А.В., Баи-рамашвили Д.И. / Использование ОФ ВЭЖХ для очистки генноинженерного инсулина человека // Биотехнология. 2006. №2. С. 44-49.

2. Gusarov D., Lasman V., Bayramashvili D. / Methods for protecting silica sor-bents used in high-performance liquid chromatography from strongly adsorbed impurities during purification of human recombinant insulin // J. Chromatogr. B. 2007. V.853. P.354-359.

3. Gusarova V., Vorobjeva Т., Gusarov D., Lasman VBayramashvili D. / Size-exclusion chromatography based on silica-diol for the analysis of the pro insulin fusion protein // J. Chromatogr. A. 2007. V.l 176. P. 157-162.

4. Гусаров Д.А., Гусарова В Д., Баирамашвили Д.И., Миронов А. Ф. / Генно-инженерный инсулин и его фармацевтические аналоги // Биомедицинская Химия. 2008. Т.54. №6. С.624-642.

5. Гусаров Д. А., Гусарова В Д., Михалев А.В., Ласман В.А., Баирамашвили Д.К, Миронов А. Ф, Сенаторова Н.К., Сенаторов А.В. / Валидация метода контроля производства генно-инженерного инсулина человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №1. С.55-61.

6. Gusarov D., Nekipelova К, Gusarova V., Lasman V., Bayramashvili D. / Displacement effect during HPLC preparative purification of human insulin // J. Chromatogr. B. 2009. V.877. P. 1216-1220.

7. Гусаров Д. А., Гусарова В.Д., Миронов А. Ф., Баирамашвили Д.И. /Инсулины пролонгированного действия: структура и фармакологический эЭффект // Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №1. С.3-11.

8. Гусарова В.Д., Гусаров ДА., Шепелъ Е.Н., Михалев А.В., Ласман В.А. / Аналитическое определение содержания ВЗО-дезтреонин-инсулина в растворах генно-инженерного инсулина человека // Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №1. С.28-33.

9. Гусарова В.Д., Гусаров Д. А., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И., Мирошни-ков А.И. / Оптимизация промышленного получения рекомбинантного предшественника инсулина человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №4. С.510-518.

10. Некипелова В.О., Гусаров ДА., Ласман В.А., Баирамашвили Д.И., Миронов А.Ф.,, Швец В.И. / Образование фибрилл генно-инженерного инсулина человека в условиях хроматографической очистки // Биотехнология. 2009. №3. С.49-53.

Опубликованные патенты:

Баирамашвили Д.И., Гусаров ДА., Давыдов В.И., Зинченко А.А., Косарев С.А., Ласман В.А., Мирошников А.И., Михалев А.В., Шибанова Е.Д. / Способ получения генно-инженерного инсулина человека // Патент Российской Федерации №2322504 С1, заявка 26.06.2006, опубликован 20.04.2008 Бюл №11.

Опубликованные тезисы докладов и конференций:

1. Гусаров Д. А., Востриков В.В. / Подбор и сравнительная оценка условий разделения инсулина и А21-дезамидоинсулина на ОФ ВЭЖХ // XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления биологии и биотехнологии», тезисы докладов и стендовых сообщений под ред. к.х.н. Т.В.Овчинниковой и Т.И.Соркиной, Москва, 2005.

2. Гусаров Д. А., Ручко Е.А., Востриков В.В., Михалев А.В., Баирамашвили Д.И. / Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в производстве генноинженерного инсулина человека // Третий Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2005.

3. Гусаров Д. А., Ласман В. А., Баирамашвили Д.И. / Сравнение технологий очистки генноинженерного инсулина человека (ГИЧ) с помощью гидрофобной хроматографии и ОФ ВЭЖХ // Московская Международная Конференция «Биотехнология и Медицина», материалы конференции, Москва, 2006.

4. Гусарова В.Д., Ласман В. А., Гусаров Д. А., Баирамашвили Д.И. / Оптимизация процесса ферментативного расщепления рекомбинантного белка в производстве субстанции инсулина человека // Московская Международная Конференция «Биотехнология и Медицина», материалы конференции, Москва, 2006.

5. Михалев А.В., Шепелъ Е.Н., Ласман В.А., Гусаров Д.А., Баирамашвили Д.И. / Аналитическое определение содержания ВЗО-дезтреониноинсулина (дТИ) в растворах генноинженерного инсулина человека (ГИЧ) // Московская Международная Конференция «Биотехнология и Медицина», материалы конференции, Москва, 2006.

6. Gusarov D., Lasman V., Bobruskin A., Bayramashvili D. / Pilot Plant Scale Purification of the Human Insulin and Human Growth Hormone by Reversed Phase HPLC and Hydrophobic Interaction Chromatography: Methods comparison and Qualification //Advancements, Applications and Theory in Downstream Processing, 5th ШС/RPC Bioseparation Conference, abstracts, Switzerland, Interlaken, 2007.

7. Гусаров Д. А., Ласман В. А., Баирамашвили Д.И. / ВЭЖХ в производстве терапевтических рекомбинантных белков // Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2009.

8. Гусарова В Д., Гусаров Д. А., Воробьева Т.В., Ласман В. А., Баирамашвили Д.И. / Оптимизация фолдинга и рефолдинга рекомбинантного препроинсули-на // Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2009.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю искреннюю признательность моему научному консультанту, доктору Д.И.Баирамашвили, за ценные советы и критику во время написания диссертации и полезные дискуссии, а также всем коллегам по работе, инженерам Опытного биотехнологического производства ИБХ РАН, ученым лаборатории спектральных исследований ИБХ РАН, которые помогли при выполнении отдельных экспериментов.

Особо благодарю В.А.Ласмана, В.Д.Гусарову, А.В.Михалева, А.А.Зинченко, а также моего научного руководителя профессора А.Ф.Миронова за неоценимые комментарии и предложения.

1.G., Best C.H. / The 1.ternal Secretion of the Pancreas // J.1.b. Clin. Med. 1922. V.7. P.251-266.

2. Barfoed H.C. / Insulin Production Technology// Chem. Eng. Prog.1987. V.83. P.49-54.

3. Ladish M.R., Kohlmann K.L. / Recombinant Human Insulin // Biotechnol. Prog. 1992. V.461. P.469-478.

4. KJe/dsen Т., Ludvigsen S., Diers /., Balschmidt P., Sorensen A.R.,

5. Kaarshotm N.C. / Engineering Enhanced Protein Secretory Expression in Yeast With Application to Insulin // J. Biolog. Chem. 2002. У.211. P. 18245-18248.

6. Klyushnichenko V., Brush R., Bulychev A. / Feasibility of International

7. Technology Transfer for the Production of Recombinant Human Insulin. Parti: Preparing for Product-Specific Manufacturing on a Global Scale //Bioprocess International. 2004. V.2. P.45-59.

8. Баирамашвили Д.И. / Генно-инженерный Инсулин Человека: Успехи и Перспективы // Рос. Хим. Ж. 2005. T.XLIX. №1. С.34-45.

9. Zimmet P., AtbertiК. / Shaw Global and Societal Implication of the

10. Diabetes Epidemic// Nature. 2001. V.414. P.782-787.

11. Ten S., McLaren N.K. / Management of Type-1 and Type-2 Diabetes in

12. Paediatric Endocrinology // Endocrinology Web Textbook, ln:New, M.(Ed.), 2004. P.1-289.

13. Bhatnagar S., Srivastava D., Jayadev M.S.K., DubeyA.K. / Molecular

14. Variants and Derivatives of Insulin for Improved Glycemic Control in Diabetes // Progress in Biophysics and Molecular Biology. 2006. V.91. P.199-228.

15. Степанов B.M. / Молекулярная биология. Структура и функции белков//Москва, Высшая школа, 1996. С.1-182.

16. Древаль А.В. / Массовая Инсулинофобия // Москва, Профессионал-центр, 2003. С.1-160.

17. PetridesD., Sapidou E., Calandranis J. / Computer-Aided Process Analysis and Economic Evaluation for Biosynthetic Human Insulin Production A Case Study // Biotechnol. Bioeng. 1995. V.48. P.529-541.

18. United States Pharmacopeia. Philadelphia, PA. USA. 2000. (USP24). Suppl. 3.

19. British Pharmacopoeia 1988. London: H.M. Stationary Office. 1988. P.1-312.

20. Фармакопейная Статья Предприятия ФСП 42-0452361302 // 2002. С.1-44.

21. СтрайерЛ. / Биохимия // Москва, Мир, 1985. С.1-514.

22. Марри Р., Гренер Д. Мейерс П. I Биохимия человека // Москва, Мир, 1993. С. 1-486.

23. Biden T.J. / Signal Transduction Events in the Regulation of Insulin // Australian Physiology and Pharmacology Society. 1997. V.28. №1. P.84.

24. Евстигнеева P.П. / Тонкий Органический Синтез // Москва, Химия, 1991. С.1-115.

25. Howell S.L., Young D.A., Lacy Р.Е. / Isolation and Properties of Secretory Granules From Rat Islets of Langerhans. 3. Studies of the Stability of the Isolated Beta Granules//J. Cells Biol. 1969. V.41.1. P.167-176.

26. Kemmler W., Steiner D.F., Borg J. / Studies on the Conversion of Proinsulin to Insulin. 3. Studies in vitro With a Crude Secretion Granule Fraction Isolated From Rat Islets of Langerhans// J. Biol. Chem. 1973. V.248. P.4544-4551.

27. Воюшин K.E. / Инсулин // Москва, Мир, 2002. T.1. С.1-142.

28. Kemmter W., Peterson J.D., Steiner D.F. / Studies on the Conversion of Proinsulin to Insulin: III. Conversion in vitro With Trypsin and Car-boxypeptidase В //J. Biol. Chem. 1971. V.246. P.6786-6791.

29. Given B.D., Cohen R.M., Shoe/son R.M., Frank B.H., Rubenstrein A.H., TagerH.S. / Biochemical and Clinical Implications of Proinsulin Conversion Intermediates//J. Clin. Invest. 1985. V.76. P.1398-1405.

30. Steiner D.F., Oyer P.F. / The Biosynthesis of Insulin and a Probable Precursor of Insulin by a Human Islet Cell Adenoma. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. V.57. P.473-480.

31. Docherty K., Carrot R.J., Steiner D.F. / Conversion of Proinsulin to Insulin: Involvement of 31,000 Molecular Weight Thiol Protease// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V.79. P.4613-4617.

32. Mackin R.B. / Proinsulin: Recent Observations and Controversies // Cell. Mol. Life Sci. 1998. V.54. P.696-702.

33. Cowley D.J., Mackin R.B. / Expression, Purification and Characterization of Recombinant Human Proinsulin // FEBS Lett. 1997. V.402. P.124-130.

34. Munte C.EVilela L., KalbitzerH.R., GarrattR.C. / Solution Structure of Human Proinsulin C-Peptide // FEBS J. 2005. V.272. P.4284-4293.

35. Sanger F., Tuppy H. / Studying Influence of Introduction of Insulin in Cells of a Liver// Biochem. J. 1951. V.46. P.463-481.

36. Альберте Б., БрейдЛ., Льюис Дж. I Молекулярная Биология Клетки // Москва, Мир, 1994. С.1-426.

37. Brange J. / Galenics of Insulin // Berlin: Springer-Verlag, 1987. P.1-179.

38. HuusK., HavelundS., Olsen H.B., WeetM.van de, FrokjaerS. / Thermal Dissociation and Unfolding of Insulin // Biochemistry. 2006. V.45. P.4014-4024.

39. Blundell T.L., Dodson, G., Hodgkin, D., Merco/a, D. I Insulin: the Structure of the Crystal and Its Reflection in Chemistry and Biology // Adv. Protein Chem. 1972. V.26. P.279-402.

40. Grant P. Т., Frank В.H. / Differences in the Nature of the Interaction of Insulin and Proinsulin With Zinc// Biochem. J. 1972. V.126. P.433-440.

41. Goldman J., Carpenter F.H. / Zinc Binding, Circular Dichroism, and Equilibrium Sedimentation Studies on Insulin (Bovine) and Several of Its Derivatives // Biochemistry. 1974. V.13. P.4566-4574.

42. Summerell J.M., OsmandA., Smith G.H. / An Equilibrium-Dialysis Study of Binding of Zinc to Insulin // Biochem. J. 1965. V.95. P.31.

43. Emdin S.O., Dodson G.G., Gutfie/d J.M., Gutfie/dS.M. / Role of Zinc in Insulin Biosynthesis. Some Possible Zinc Insulin Interactions in the Pancreatic B-Cell // Diabetologia. 1980. V.19. P.174-182.

44. Whittingham J.L., Scott D. J., Chance K., Wilson A., Finch J., Brange J., Dodson G.G. / Insulin at pH 2: Structural Analysis of the Conditions Promoting Insulin Fibre Formation //J. Mol. Biol. 2002. V.318. P.479-490.

45. Adams M.J., Blundell T.L., Dodson E.J., Dodson G.G., Vijayan M„ Baker E.N., Harding M.M., Hodgkin D.C., Rimmer В., SheatS.I Structure of Rhombohedral 2-Zinc Insulin Crystals // Nature. 1969. V.22. P.491-495.

46. Peking Insulin Structure Group, Peking Rev. 1971. V.40. P.10-16.

47. Shlichtkrull J., Brange J., Christiansen A.H., Hallund O., Heding L.G., Jorgensen K.H., Munkgaard S., Rasmussen M., Sorensen E„ Vol-undA.A. / Monocomponent Insulin and Its Clinical Implications // Horm. Metab. Res. 1974. V.5. P.134-143.

48. Ciszak E., Smith G.D. / Crystallographic Evidence for Dual Coordination Around Zinc in the T3R3 Human Insulin Hexamer// Biochemistry. 1994. V.33. P.1512-1517.

49. CiszakE., Beals J.M., Frank B.H., Baker J.C., Carter N.D., Smith G.D. / Role of C-terminus B-chain Residues in Insulin Assembly: the Structure of Hexameric LysB28ProB29-Human Insulin // Structure. 1995. V.3. P.615-622.

50. Derewenda U., Derewenda Z., Dodson E.J., Dodson G.G., Reynolds C.D., Smith G.D., Sparks C., Swenson D. / Phenol Stabilizes More Helix in a New Symmetrical Zinc Insulin Hexamer// Nature. 1989. V.338. P.594-596.

51. Brange J., LangkjaerL. / Chemical Stability of Insulin. 3. Influence of Excipients, Formulation, and pH //Acta Pharm. Nord. 1992. V.4.1. P.149-158.

52. Овчинников ЮЛ. / Биоорганическая химия // М: Просвещение, 1987. С.1-815.

53. Миргородская О.А., Казанина ГЛ., Миргородская Е.П. / Протео-лиз Проинсулина Человека, Катализируемый Нативным, Модифицированным и Иммобилизованным Трипсином // Биоорганическая химия. 1997. Т.23. №2. С.91-97.

54. Morihara К., Ока Т., TsuzukiН. / Semi-Synthesis of Human Insulin // United States Patent №4.400.465, 1983.

55. Morihara К., Oka Т., TsuzukiH. / Semi-Synthesis of Human Insulin // United States Patent №4.511.505, 1985.

56. Van Dedem G. W.K., Van Houdenhofen F.E.A. i Modified Porcine Insulin and Its Use for Preparing Human Insulin // United States Patent №4.840.897, 1989.

57. ObermeierR. / Process for the Manufacture of Human Insulin // United States Patent №4.029.642, 1977.

58. Chance R.E., Hoffmann J.A. / Process for Producing an Insulin // United States Patent №4.421.685, 1983.

59. Belagae R.M., DiMarchiR.D., Heath W.F.,jr„ Long H.B. / A-C-B Pro-insulin, Method of Manufacturing and Using Same, and Intermediates in Insulin Production // United States Patent №5.304.473, 1994.

60. KroeffE.P., Owens R.A., Campbell E.L., Johnson R.D., Marks H.I. / Production Scale Purification of Biosynthetic Human Insulin by Re-versed-Phase High Performance Liquid Chromatography// J. Chromatogr. 1989. V.2. P.45-61.

61. Chance R.E., Hoffman J.A., KroeffE.P. / Peptides: Synthesis-Structure-Function // Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Pierce Chemical Company, Rockford, 1981. P.721-728.

62. Burnett J.P. / Experimental Manipulation of Gene Expression // Academic Press, New York, 1983. P.259-277.

63. Frank B.H., Chance R.E. / Therapeutic Agents Produced by Genetic Engeneering // Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Pierce Chemical Company, Rockford, 1981. P.138-146.

64. FrankB.H., Prouty W.E., Heiney R.E., Walden M.R. / Process for Transforming a Human,Insulin Precursor to Human Insulin // United States Patent, №5.457.066, 1995.

65. Obermeier R., GeigerR., Grau U. / Process for Converting Preproin-sulin Analogs into Insulins // United States Patent №4.639.333, 1987.

66. Hansen F.B., Balschmidt P. / Human Insulin Analogs and Preparations Containing them // United States Patent №5.149.777, 1992.

67. Shin H.-Ch., Chang S.-Gu, Kim D.-E., Kim Ch.-S. / Proinsulin Derivative and Process for Producing Human Insulin // United States Patent №5.962.267, 1999.

68. Yomota C., Yoshii Y., Takahata Т., Okada S. / Separation of B-3 Monodesamidoinsulin From Human Insulin by High-Performance Liquid Chromatography Under Alkaline Conditions // J. Chromatogr. A. 1996. V.721. P.89-96.

69. SergeevN. V., Gloukhova N.S., Nazimov /. V., Miroshnikov A.I. / Monitoring of Recombinant Human Insulin Production by Narrow-Bore Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography, High

70. Performance Capillary Electrophoresis and Matrix-Assisted LASER Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry // J. Chro-matogr. A. 2001. V.907. P.131-144.

71. Oliva A., Farina J., Llabres M. / Development of Two High-Performance Liquid Chromatographic Methods for the Analysis and Characterization of Insulin and its Degradation Products in Pharmaceutical Preparations//J. Chromatogr. A. 2001. V.749. P.25-34.

72. Kje/dsen T. / Yeast Secretory Expression of Insulin Precursors // Application of Microbiological Technology. 2000. V.54. P.277-286.

73. Kjeldsen T.B., Ludvigsen S., Kaarsholm R.C. / Method for Making Insulin Precursors and Insulin Precursor Analogs // United States Patent Application №20010023069, 2001.

74. Anniba/iN. / Expression of Human Insulin Precursor in P.Pastoris // United States Patent Application №20030104607, 2003.

75. Moloney M.M., Boothe J., Keon R., Nykiforuk C., Van Rooijen G. / Methods for the Production of Insulin in Plants // United States Patent Application №20050039235, 2005.

76. Arakawa E. / The Production of Gamma-lnterferon in Plants // United States Patents № 4.956.282, 1997.

77. Arakawa E. / The Production of Gamma-lnterferon in Plants // United States Patents № 5.550.038, 1999.

78. Shin H.-Ch., Chang S.-Gu, Kim D.-E., Kim Ch.-S. I The Production Human Serum Albumin in Plants // United States Patents № 5.650.307, 1999.

79. Shin H.-Ch., Chang S.-Gu, Kim D.-E., Kim Ch.-S. i The Production Human Serum Albumin in Plants // United States Patents № 5.716.802, 2001.

80. Nilsson J., Jonasson P., Samue/sson E., Stah/S., Uhlen M. / Integrated Production of Human Insulin and Its C-Peptide // J. Biotech-nol. 1996. V.48. №3. P.241-250.

81. Jonasson P., Nygren P.A., Jonasson B.L. / Gene Fragment Polymerization Gives Increased Yyields of Recombinant Human Proinsulin C-Peptide // Gene. 1998. V.210. №2. P.203-210.

82. Sun H., Tana J., Ни M. / Preparization of Tyr-C-Peptide From Genetically Altered Human Insulin Precursor//Appliement of Biochemical Biotechnology. 1995. V.55. №3. P.167-174.

83. Chang S.-G., Kim D.-Y., ChoiK.-D., Shin J.-M., Shin H.-C. i Human Insulin Production From a Novel Mini-Proinsulin Which Has High Receptor-Binding Activity// Biochem. J. 1998. V.329. P.613-635.

84. Liu M., Ramos-Castaneda J., Arvan P. i Role of the Connecting Peptide in Insulin Biosynthesis // J. Biolog. Chem. 2003. V.278. №1.1. P.14798-14805.

85. SchaffnerJ., Winter J., Rudolph R. and Schwarz E. / Cosecretion of Chaperones and Low-Molecular-Size Medium Additives Increases the Yield of Recombinant Disulfide-Bridged Proteins // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67. P.3994-4000.

86. Winter J., Neubauer P., Glockshuber R., Rudolph R. / Increased Production of Human Proinsulin in the Periplasmic Space of Escherichia Coli by Fusion to DsbA // J. Biotechnol. 2000. V.84. P. 175-185.

87. Kang Y., Yoon J. W. / Effect of modification of connecting peptide of proinsulin on its export//J. Biotechnol. 1994. V.36. P.45-54.

88. Rosenbusch J.P. / Structural and Functional Properties of Porin Channels in E. Coli Outer Membranes // Experientia. 1990. V.46. P.167-173.

89. Winter J., Lilie H., Rudolph R. / Recombinant Expression and in vitro Folding of Proinsulin are Stimulated by the Synthetic Dithiol Vec-trase-P// FEMS Microbiology. 2003. V.213. P.225-230.

90. Woycechowsky K.J., Wittrup K.D., Raines R.T.I A Small-Molecule Catalyst of Protein Folding in vitro and in vivo // Chem. Biol. 1999. V.6. P.871-879.

91. Diers I., Kieldsen T. / Method for Making Insulin Precursors and Insulin Analog Precursors // United States Patent Application №20030040601,2003.

92. PfefferS.R., Rothman J.E. / Biosynthetic Protein Transport and Sorting by the Endoplasmic Reticulum and Golgi // Ann. Rev. Biochem. 1987. V.56. P.829-852

93. Thim L., Hansen M. Т., Norris K. / Secretion and Processing of Insulin Precursors in Yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V.83.1. P.6766-6770.

94. Kjeldsen T.B., Ludvigsen S. / Method for Making Insulin Precursors and Insulin Precursor Analogues Having Improved Fermentation Yield in YeastII United States Patent Application №20020137144, 2002.

95. Cereghino G.P.L., Cregg G.M. / Application of Yeast in Biotechnology: Protein Production and Genetic Analysis. //Curr. Opin. Biotech-nol. 1999. V.10. P.422-427.

96. Панин Jl.E., Тузиков Ф.В., Потеряева О.Н. / Синтез Фрагментов Инсулина и Изучение их Физико-Химических и Иммунологических Свойств // Биоорганическая Химия. 1997. Т.23. №12. С.953-960.

97. Ludvigsen S., Roy М., Thogersen Н. I Insulin Human // New-York, Biochemistry. 1994. P.7998-8006.

98. NadlerJ.L., Baion T. W., Yamaguchi Y. / Method of Enhancing Insulin Action // United States Patents №6316458, 2001.

99. Tchelingerian, J.-L. / Insulin Conjugates and Methods of Use Thereof // United States Patent Application № 20030153490, 2003.

100. Кпюшниченко B.E., Якимов СЛ., Мальцев К.В., Арутюнян A.M., Иванов А.Е., Вульфсон А.Н. / Генно-Инженерный Инсулин Человека: 1. ВЭЖХ в Анализе Продуктов Основных Стадий Производства // Биоорганическая химия. 1992. Т. 18. №2. С. 1478-1486.

101. Зинченко А.А., Нокель Е.А., Толстое Д.Н., Гордеева Е.А., Баирамашвили Д.И., Мирошников А.И. / Способ Выделения Карбокси-пептидазы В // Патент РФ №2177997, 2002.

102. MansurM. / Expression, Purification and Characterization of Porcine Pancreatic Carboxypeptidase В from Pichia Pastoris for the Conversion of Recombinant Human Insulin // Enzyme and Microbial Technology. 2007. V.40. P.421-429.

103. Диксон М., УэббЭ. / Ферменты // Москва, Мир, 1966. С.2-146.

104. Poreth J., Fiodin P. / Gel Filtration: A Method for Desalting and Group Separation // Nature. 1983. V.2. P.1657-1659.

105. Смирнов А. В., Гукасова E.A., Баирамашвили Д.И., Мирошников А.И. / Способ Получения Гидрофильного Геля // Патент РФ, № 2187363, 2002.

106. Podesta A., Tiana G., MiianiР., Маппо М. / Early Events in Insulin Fibrillization Studied by Time-Lapse Atomic Force Microscopy.// Bio-phys J. 2006. V.90 (2). P.589-597.

107. Grudzielanek S., Jansen R., Winter R. / Solvational Tuning of the Unfolding, Aggregation and Amyloidogenesis of Insulin // J. Mol. Biol. 2005. V.351. P.879 -894.

108. Ahmad A., Uversky V. N. Hong D., Fink A. L. / Early Events in the Fibrillation of Monomeric Insulin // J. Biol. Chem. 2005. V.280. P.42669-42675.

109. Yu C.M., Chin C. Y., Franses E. /., Wang N.-H. L. / In situ Probing of Insulin Aggregation in Chromatography Effluents with Spectrotur-bidimetry// J. Colloid and Interface Science. 2006. V.299. P.733-739.

110. Nett/eton E. J., Tito P., Sunde M., Bouchard M., Dobson С. M„ Robinson C. V.I Characterization of the Oligomeric States of Insulin in Self-Assembly and Amyloid Fibril Formation by Mass Spectroscopy // Biophys. J. 2000. V.79. №2. P.1053-1065.

111. Ahmad A., Millett /. S., Doniach S., Uversky V. N., Fink A. L. / Partially Folded Intermediates in Insulin Fibrillation // Biochemistry.2003. V.42. P.11404-11416.

112. LouX., Zhu Q., LeiZ., Van Dongen J.L., Meijer E. W. / Simulation of Size Exclusion Chromatography for Characterization of Su-pramolecular Complex: a Theoretical Study//J. Chromatogr. A.2004. V.1029. P.67-75.

113. Yu C.M., Mun S., Wang N.-H.L. / Theoretical Analysis of the Effects of Reversible Dimerization in Size Exclusion Chromatography//J. Chromatogr. A. 2006. V.1132. P.99-108.

114. Yu C.M., Mun S., Wang N.-H.L. / Phenomena of Insulin Peak Fronting in Size Exclusion Chromatography and Strategies to Reduce Fronting // J. Chromatogr. A. 2008. V.1192. P.121-129.

115. Шматченко В. В., Шматченко Н.А., Байдусь А.Н., Купцов В.Н., Ноздрин В.Н., Степанов А.В. II Заявка на изобретение №2006137635А, 2008.

116. Obermeier R., Ludwig J., Sabel W. / Process for Isolating Insulin by High-Pressure Liquid Chromatography// United States Patent №5977297, 1999.

117. Купцов B.H., Байдусь A.H., Шматченко H.A., Борисов Н.В., Гор-кун Т.А., Борисова Т.Ю., Степанов А.В. / Оптимизация Условий Ферментативного Гидролиза При Производстве Генно-Инженерного Инсулина Человека. // Биотехнология. 2006. № 4. С.27-32.

118. BairamashviliD.I., Rabinovich M.L. I Russia Through the Prism of the World Biopharmaceutical Market // Biotechnol. J. 2007. V.2.1. P.801-817.

119. DickhardtR., Unger В., Grafe С. / Chromatographic Process for Purification of Insulin // United States Patent №5621073, 1997.

120. Sfevers W„ Bicker R., Desch D., Von Eysmondt J., KellerR., Richard F. / Procedure for the Chromatographic Purification of Insulins // United States Patent №6710167, 2004.

121. Thim L., Hansen M. Т., Sorensen A.R. / Secretion of Human Insulin by a Transformed Yeast Cell // FEBS Letters. 1987. V.212. №2.1. P.307-312.

122. LakhiariH., Legendre E., Muller D., Josefonvicz J. / High-Performance Affinity Chromatography of Insulin on Coated Silica Grafted with Sialic Acid // J. Chromatogr. B. 1995. V.664. P.163-173.

123. LackhiariH., Muller D. / Purification of IgG and Insulin on Supports Grafted by Sialic Acid Developing "Thiophilic-Like" Interactions // J. Chromatogr. B. 2005. V.818. P.53-59.

124. KunkelA., GunterS., Dette Ch., Watzig H. / Quantitation of Insulin by Capillary Electrophoresis and High-Performance Liquid Chromatography. Method Comparison and Validation // J. Chromatogr. A. 1997. V.781. P.445-455.

125. HoyerG.L., Nolan P.E., jr., LeDouxJ.H., Moore L.A. / Selective Stability-Indication High-Performance Liquid Chromatography Assay for Recombinant Human Regular Insulin // J. Chromatogr. A. 1995. V.699. P.383-388.

126. Sergeev N. V., Nazimov /. V., MiroshnikovA.I. / An Effective Analytical Procedure for Gradual Control of Recombinant Human Insulin Production //American Biotechnology Laboratory. 2001. V.9. P.52.

127. Mandrup G. / In-Process Control of Insulin Production by High-Performance Liquid Chromatography//Trends in Anal. Chem. 1992. V.11. №10. P.389-395.

128. Староверов C.M. / Хроматография в Отечественной Фармацевтической Промышленности // Рос. Хим. Фарм. Ж. 2003. T.XLVII. №1. С.111-118.

129. Калинин Ю.Т., Степанов А.В., Байдусь А.Н. / Способ Промышленного Получения Рекомбинантного Инсулина Человека // Описание Изобретения к Патенту Российской Федерации № 2003104596/13, 2003.

130. Lloyd L.L., Millichip М.1., Watkins J.M. / Reversed-Phase Poly (Sty-rene-Divinylbenzene) Materials Optimized for Large Scale Preparative and Process Purification of Synthetic Peptides and Recombinant Proteins//J. Chromatogr. A. 2002. V.944. P.169-177.

131. Protein Purification, Handbook// Protein Separations' Handbook Collection, Amersham Biosciences, Sweden, 2003.

132. European Pharmacopeia 4th Edition, Strasbourg, France, 2002, 4.02 version.

133. Hua Q.-X., Weiss M.A. / Mechanism of Insulin Fibrillation. The Structure of Insulin Under Amyloidogenic Conditions Resembles a Protein-Folding Intermediate // J. Biol. Chem. 2004. V.279. №20. P.21449-21460.

134. Grudzielanek S., Smirnovas V., Winter R.I Solvation-Assisted Pressure Tuning of Insulin Fibrillation: From Novel Aggregation Pathways to Biotechnological Applications // J. Mol. Biol. 2006. V.356. P.497-509.

135. Jansen R., Grudzielanek S., Dzwolak W., Winter R. / High Pressure Promotes Circularly Shaped Insulin Amyloid // J. Mol. Biol. 2005. V.338. P.203-206.

136. Mauro M., Craparo E.F., Podesta A., Bulone D., Carrotta R., Martorana V., Tiana G., Biagio P.L.S. / Kinetics of Different Processes in Human Insulin Amyloid Formation // J. Mol. Biol. 2007. V.366. P.258-274.

137. Majors R.E. / The Role of the Column in the Preparative HPLC // LCGC North America. 2004. V.22. №5. P.416-428.

138. Dickhardt R., UngerB., HafnerL. / Process for the Purification of Insulins by Chromatography // United States Patent № 5245008, 1993.

139. Стыскин Е.Л., ИциксонЛ.Б., Брауде Е.В. / Практическая Высокоэффективная Жидкостная Хроматография // М: Наука, 1986. С.1-282.

140. LiuX., SzabelskiP., KaczmarskiК., Zhou D., Guiochon G. / Influence of Pressure on the Chromatographic Behavior of Insulin Variants Under Non-Linear Conditions // J. Chromatogr. A. 2003. V.988. P.205-218.

141. Degerman M., Jakobsson N., NHsson B. / Modeling and Optimization of Preparative Reversed-Phase Liquid Chromatography for Insulin Purification //J. Chromatogr. A. 2007. V.1162 (1). P.41-49.

142. Swadesh J.K. / HPLC. Practical and Industrial Applications, Second Edition // CRC Press, USA, NY, 2001. P.1-480.

143. CazesJ., ScottR.P.W. / Chromatography Theory, Marcel Dekker, Inc., USA, NY, 2002. P.1-486.

144. PurcellA.W., Aguilar M.i., Hearn M. T. W. / Conformational Effects in Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography of Polypeptides. I. Resolution of Insulin Variants // J. Chromatogr. A. 1995. V.711. P.61-70.

145. Lough W.J., Wainer i.W. / High Performance Liquid Chromatography. Fundamental Principles and Practice // Blackie Academic & Professional, London, Glasgow, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras, 2000. P.1-282.

146. A WHO Guide To Good Manufacturing Practice (GMP) Requirements, Part 2: Validation // Geneva: World Health Organization, 1997. P.1-100.

147. Давлетбаева Л.Р., Исрафилов А.Г., Нигматуллин P.P., Хафизо-ва Р.Н. / Валидация Аналитических Методов Исследования // Уфа: Микроген, 2000. С.34-47.

148. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation // Rockville, MD, USA: US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, 2001. P.1-22.

149. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutaicals for Human Use, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Q2(R1)) // ICH, Geneva, 2005. P.1-13.

150. Sandal I J.M., Millership J.S., Collier P. S., McElnayJ.C. / Development and Validation of an HPLC method for the Determination of Spironolactone and Its Metabolites in Paediatric Plasma Samples // J. Chromatogr. B. 2006. V.839. P.36-44.

151. Guiochon G., FeiingerA., ShiraziD.G., KattiA.M. / Fundamentals of Preparative 12 and Nonlinear Chromatography // Elsevier, San Diego, CA, 2006. P.1-262.

152. The MathWorks Inc., Optimization Toolbox For Use with MATLAB // MathWorks, 26 Natick, MA, 2005.

153. PoncinA. / Eurogentec Biologies Experience In the Field of Validation of the Biopharmaceutical Processes //Advancements, Applications and Theory in Downstream Processing, 5th HIC/RPC Biosepa-ration Conference, abstracts, Switzerland, lnterlaken, 2007.

154. Rodrigues R.C.R., Araujo J.M.M., Mota J.P.B. / Optimal Design and Experimental Validation of Synchronous, Asynchronous and Flow-Modulated, Simulated Moving-Bed Processes Using a Single-Column Setup // J. Chromatogr. A. 2007. 1162. P.14-23.

155. Reichard O., Niisson B.-Y., Rosenqvist U. / The Effect of Long-Term Intensified Insulin Treatment in the Development of Microvascular Complications of Diabetes Mellitus // N. Engl. J. Med. 1993. V.329. P.304-309.

156. WangP.H., Lau J., Chalmers T.C. / Meta-Analysis of Effects of Intensive Blood-Glucose Control on Late Complications of Type 1 Diabetes//Lancet. 1993. V.341. P.1306-1309.

157. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, / Hypoglycaemia in the Diabetes Control and Complications Trial // Diabetes, 1997. V.46. P.271-286.

158. Starke A.A., Heinemann L., Hohmann A., Berger M. / The Action Profiles of Human NPH Insulin Preparations // Diabet. Med. 1989. V.6. P.239-244.

159. Jehle P.M., Micheler C., Jeh/e D.R., Breitig D., Boehm B.O. / Inadequate Suspension of Neutral Protamine Hagedorn (NPH) Insulin in Pens//Lancet. 1999. V.354. P.1604-1607.

160. Kelendorf K., Bojsen J., Deckert T. / Clinical Factors Influencing the Absorption of 1251-NPH Insulin in Diabetic Patients // Horn. Metab. Res. 1983. V.15. P.274-278.

161. Brange J.J. V., Norn's K., Hansen M. T. / Insulin Analogues and Method of Preparing the Same // European Patent Application №0214826, 1989.

162. Mrke E.A. / Artificially Prepared Analogs of Human Insulin // Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1979. V.360. P.1619-1632.

163. Shoe/son S., Fickova M., Haneda M., Nahum A., Musso G., Kaiser E. Т., Rubenstern A.H., Tager H. I Insulin Receptor Essential Sites for Binding Insulin // Proc. Nat. Acad. Sci. 1983. V.80. P.7390-7394.

164. Kobayashi M., Haneda M., Maegawa H., Watanabe N., Takada Y., Shigeta Y., Inouye К i Receptor Binding and Biological Activity of SerB24.-lnsulin, an Abnormal Mutant Insulin// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. V.29. P.49-57.

165. Schwartz S, Modi P. i Pharmacodynamics of Oral Insulin in Healthy Volunteers // Diabetologia. 2000. V.43 (Suppl 1). P.A202.

166. Dreier К / The Bioactivity of Insulin Analogues From in vitro Receptor Binding to in vivo Glucose Uptake // Diabetes Metab. Rev. 1992. V.8. P.259-285.

167. Howey D.C., Bowsher R.R., Brunelle R.L., Woodworth J.R. / Lys (B28), Pro (B29).-human Insulin. A Rapidly Absorbed Analog of Human Insulin // Diabetes. 1994. V.43. P.396-402.

168. LindholmA. I New Insulins in the Treatment of Diabetes Mellitus // Best Practice & Research Clinical Gastroenterology. 2002. V.3.1. P.475-492.

169. TsuiE., BarnieA., Ross S., ParkesR., Zinman B. / Intensive Insulin Therapy With Insulin Lispro // Diabetes Care. 2001. V.24. P.1722-1727.

170. LuntH., KendallD., Moore M.P., Scott R.S., Cole D., Frampton C.M., Си/lens M. / Prospective Audit of Conversion from Regular to Lispro Insulin During Routine Clinical Care // Intern. Med. J. 2004. V.34. P.320-323.

171. Schernthaner G., Wein W., Shnawa N., Bates P.C., Birkett M.A. / Preprandial vs Postprandial Insulin Lispro A Comparative Crossover Trial in Patients With Type 1 Diabetes // Diabet. Med. 2004. V.21. P.279-284.

172. Woodworth J., HoweyD., BowsherR. I Lys (B28) Pro (B29). Human Insulin: Dose Ranging versus Humulin // Diabetes. 1993. V.42. P.54A.

173. Ter Braak E.W., Woodworth J.R., Bianchi R., Cerimele В., Erkelens D. W., Thijssen J.H., Kurtz D. I Injection Site Effects on the Pharmacokinetics and Glucodynamics of Insulin Lispro and Regular Insulin // Diabetes Care. 1996. V.19. P.1437-1440.

174. DeFeiiipis M.R., Bakaysa D.L., Bell M.A., Heady M.A., LiS., Pye S., Youngman KM., RadziukJ., Frank B.H. i Preparation and Characterization of a Co-Crystalline Suspension of LysB28,ProB29.-Human Insulin Analogue // J. Pharm. Sci. 1998. V.87. P.170-176.

175. Balschmidt P., Brange J.J. V. / Human Insulin Analogs // United States Patent Application №0020013269, 2002.

176. Brange J., Ribel U., Hansen J.F., Dodson G., Hansen M. Т., Have-lund S., Malberg S.G., Norris F., Norris K., SnelL. / Monomeric Insulins Obtained by Protein Engineering and Their Medical Implications // Nature. 1988. V.333. P.679-682.

177. Brange J. / The New Era of Biotech Insulin Analogues // Diabetolo-gia. 1997. V.40. P.S48-S55.

178. Owens D.R., Zinman В., BoHi G.B. / Insulins Today and Beyond // Lancet. 2001. V.358. P.739-746.

179. Heinemann L., Kapitza C., Starke A.A., Heise T. / Time-Action Profile of the Insulin Analogue B28Asp // Diabet. Med. 1996. V.13.1. P.683-684.

180. Lindhoim A., McEwen J., RiisA.P. / Improved Postprandial Glyceric Control With Insulin Aspart. A Randomised Double-Blind CrossOver Trial in Type 1 Diabetes // Diabetes Care. 1999. V.22. P.801-805.

181. Home P.D., Lindhoim A., Hyiieberg В., Round P. / Improved Glyceric Control With Insulin Aspart: a Multicenter Randomized Double-Blind Crossover Trial in Type 1 Diabetic Patients. UK Insulin Aspart Study Group // Diabetes Care. 1998. V.21. P.1904-1909.

182. Bott U., Ebrahim S., Hirschberger S., Skoviund S.E. I Effect of the Rapid-Acting Insulin Analogue Insulin Aspart on Quality of Life and Treatment Satisfaction in Patients With Type 1 Diabetes // Diabet. Med. 2003. V.20. P.626-634.

183. Robinson R.T.C.E., Harris N.D., Ireland R.H., Lindhoim A., Heller S.R. / Comparative Effect on Human Soluble Insulin and Insulin Aspart Upon Hypoglycaemia-lnduced Alterations in Cardiac Repolarization // Br. J. Clin. Pharmacol. 2003. V.55. P.246-251.

184. PettittD.J., Ospina P., KolaczynskiJ.W., Jovanovic L. / Comparison of an Insulin Analog, Insulin Aspart, and Regular Human Insulin With1.sulin in Gestational Diabetes Mellitus // Diabetes Care. 2003. V.26. P.183-186.

185. Airaghi L., LoriniM., TedeschiA. / The Insulin Analog Aspart: a Safe Alternative in Insulin Allergy// Diabetes Care. 2001. V.24. P.2000.

186. Yasuda H., Nagata M., Moriyama H., Fujihira K., Kotani R., Yamada K., Ueda H., Yokono K. / Human Insulin Analog Insulin Aspart Does Not Cause Insulin Allergy // Diabetes Care. 2001. V.24. P.2008-2009.

187. Ушакова О.В., Шапиро И.А. / Фармакоэкономическое Обоснование Перевода Больных Сахарным Диабетом 1-го Типа на Ин-сулиновый Аналог Короткого Действия «Аспарт» (Новорапид) // Проблемы Эндокринологии. 2006. Т.52. С.9-12.

188. Plank J., Wutte A., BrunnerG., Siebenhofer A., Semlitsch В., SommerR., Hirschberger S., Pieber T.R. / A Direct Comparison of Insulin Aspart and Insulin Lispro in Patients With Type 1 Diabetes // Diabetes Care. 2002. V.25. P.2053-2057.

189. Homko C„ DeluzioA., Jimenez C., Kolaczynski J. W., Boden G. / Comparison of Insulin Aspart and Lispro: Pharmacokinetic and Metabolic Effects // Diabetes Care. 2003. V.26. P.2027-2031.

190. Von Mach M.A., Brinkmann C., Hansen Т., Weilemann L.S., Beyer J. / Differences of Pharmacokinetic and Pharmacodynamic of Insulin Lispro and Aspart in Healthy Volunteers // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2002. V.110. P.416-419.

191. Rakatzi /., Ramrath S., Ledwig D., Dransfeld O., Barte/s Т., Seipke G., eckel J. / A Novel Insulin Analog With Unique Properties // Diabetes, 2003. V.52. P.2227-2238.

192. Rakatzi I., Seipke G., Eckel J. i LysB3, GluB29. Insulin: a Novel Insulin Analog With Enhanced Beta-Cell Protective Action // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V.310. P.852-859.

193. BeckerR., FrickA., Wesseis D., Schoitz H. / Pharmacodynamic and Pharmacokinetics of a New, Rapidly Acting Insulin Analog, Insulin Glulisine // Diabetes. 2003. V.52. P.A110.

194. DaiieyG., Rosenstock J., Moses R.G., Ways K. / Insulin Glulisine Provides Improved Glycemic Control in Patients With Type 2 Diabetes // Diabetes Care. 2004. V.27. P.2363-2368.

195. Anderson J.H.,jr., De Fellipis M.R., Frank B.H., Havel H.A. / Insulin Analog Formulations// United States Patent №5547929, 1996.

196. Gonda I., Rubsamen R.M. / Method of Delivering Insulin Lispro // United States Patent №5970973, 1999.

197. Piakogiannis R., Nathan J.P., Rosenberg J.M. / Clinical Q&A: How Are Insulin Glargin and Insulin Aspart Different From the "Older Insulins"? // Drug Topics. 2000. V.144. P.41.

198. BolliG.B., Owens D.R. / Insulin Glargine // Lancet. 2000. V.356. P.443-445.

199. BolliG.B., DiMarchiR.D., Park G.D., Pramming S., Koivisto V.A. / Insulin Analogues and Their Potential in the Management of Diabetes Mellitus // Diabetologia. 1999. V.42. P.1151-1167.

200. Tan C. Y., Wilson D.M., Buckingham B. i Initiation of Insulin Glargine in Children and Adolescents With Type 1 Diabetes // Pediatric Diabetes. 2004. V.5. P.80-86.

201. Yki-Jarvinen H. i Insulin Therapy in Type 2 Diabetes: Role of the Long-Acting Insulin Glargine Analogue // European Journal of Clinical Investigations. 2004. V.34. P.410-416.

202. Aiemzadeh R., Ellis J.N., Holzum M.K., Parton E.A., Wyatt D. T. / Beneficial Effects of Continuous Subcutaneous Insulin Infusion and

203. Flexible Multiple Daily Insulin Regimen Using Insulin Glargine in Type 1 Diabetes // Pediatrics. 2004. V.114. P.e91-e95.

204. SchoberE., Schoenle E., Van Dyk J., Wernicke-Panten К / Comparative Trial Between Insulin Glargine and NPH Insulin in Children and Adolescents With Type 1 Diabetes // Diabetes Care. 2001. V.24. P.2005-2006.

205. Gomez-Perez F.J., Rull J.A. / Insulin Therapy: Current Alternatives //Archives of Medical research. 2005. V.36. P.258-272.

206. Wang F., Carabino J.M., Vergara C.M. / Insulin Glargin: A Systematic Review of a Long-Acting Insulin Analogue // Clinical Therapeutics. 2003. V.25. №3. P.1541-1577.

207. McKeage K, Goa K.L. / Insulin Glargine: A Review of Its Therapeutic Use as a Long-Acting Agentfor the Management of Type 1 and 2 Diabetes Mellitus // Drugs. 2001. V.61. P.1599-1624.

208. BergerM. / Safety of Insulin Glargine // Lancet. 2000. V.356. P.2013-2014.

209. Kiess W., Raile K., GallerA., Kapellen T. i Insulin Detemir Offers Improved Glycemic Control Compared With NPH Insulin in People With Type 1 Diabetes // Diabetes Care. 2004. V.27. P.2567-2568.

210. Ambler R.P. i Enzymatic Hydrolysis with Carbozipeptidases // Methods in Enzymology, V.25, part В Ed. by C.H.W.Hirs and S.N.Timasheff, Academic Press NY and London, 1972. P.143-154.

211. Gray W.R. / End-group Analysis Using Dansyl Chloride // Methods in Enzymology, V.25, part В Ed. by C.H.W.Hirs and S.N.Timasheff, Academic Press NY and London, 1972. P.121-138.

212. Владимирова Б.Г., Потапенко Н.А., Левина Н.Б., Модянов Н.Н. И Биологические Мембраны. 1990. Т.7. С.1256-1270.

213. Dixon Н.В., Perham R.N. / Reversible Blocking of Amino Groups with Citraconic Anhydride / Biochem. J. 1968. V.109. P.312-314.

214. Shetty J.K., Kinsella J.E. / Ready Separation of Proteins from Nucleoprotein Complexes by Reversible Modification of Lysine Residues // Biochem. J. 1980. V.191. P.269-272.

215. MossavaraliS., HosseinkhaniS., Ranjbar В., MiroliaeiM. / Stepwise Modofocation of Lysine Residues of Glucose Oxidase with citraconic anhydride // International Journal of Biological Macromolecules. 2006. V.39. P.192-196.

216. Sangeetha K., Abraham Т.Е. / Chemical Modification of Papain for Use in Alkaline Medium // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2006. V.38. P.171-177.

217. RozetECeccato A., Hubert C., Ziemons E., Oprean R., Rudaz S., Boulanger В., Hubert Ph.l Analysis of Recent Pharmaceutical Regulatory Documents on Analytical Method Validation // J.Chromatogr.A. 2007. V.1158. P.111-125.

218. Dejaegher В., Vander Y. Heydenl Ruggedness and Robustness Testing//J.Chromatogr.A. 2007. V.1158. P.138-157.

219. Novitsky T.J. // Пирогены немикробного происхождения, Бюллетень ЛАЯ-те ст. 2002. Т.2. С.5.

220. Ситников А.Г., Травина ПЛ., Багирова B.J1. // Современные подходы к определению пирогенности, М: Мир, 2007.

221. Wettings D.A. // A Practical Handbook of Preparative HPLC, Elsevier, Amsterdam, 2006. P.1-180.

222. Colin H, CoxG.B. II Large Scale Liquid Chromatography, Encyclopedia of Separation Science, Elsevier, Acad.Press, 2000. P.685-690.

223. CoxG.B., SnyderL.R. II Displacement Effects in Preparative Gradient High-Performance Liquid Chromatographic Separations / J.Chromatogr.A., 590, 1992, P.1-17.

224. Horvath C., NahumA., FrentzJ.H. II High-Performance Displacement Chromatography / J.Chromatogr. 218, 1981, P.365.

225. Vigh Gy., Varga-Puchony Z., Szepesi G., Gazdag M. Я Semi-Preparative High-Performance Reversed-Phase Displacement Chromatography of Insulins / J.Chromatogr. 386, 1987, P.353.

226. Kromidas S., Practical Problem Solving in HPLC, Weinheim, Germany, Willey-VCH, 2002. P.1-178.

227. Giddings J.C., Dynamics of Chromatography, NY, USA, Marcel Dekker, 1965. P. 1-56.

228. Anderson L., UngerF. //ACS Symposium Series, No.231, American Chemical Society, Washington, DC, 1983. P.1-101.

229. Drugs and Pharmaceutical sciences, vol.167. Endotoxins: Pyrogens, LAL Testing and Depyrogenation, Third Edition, edited by Williams K.L., Marcel Dekker, Inc., IN, USA, 2007. P.1-440.

230. Li Y., Lander R., Manger W., Lee A. / Determination of Lipid Profile in Meningococcal Polysaccharide Using Reversed-Phase Liquid Chromatography// J. Chromatogr. B. 2004. V.804. P.353-358.

231. Патрушев Jl.И., Баирамашвили Д.И., Мирошников А.И. // Патент Российской Федерации №2267534, 2006.