Органофосфатгидролаза: получение генетически-модифицированных аналогов и анализ каталитических характеристик тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ. ф 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ферменты, катализирующие гидролиз ФОС.

1.2. Органофосфатгидролаза.

1.2.1. Кинетические характеристики и субстратная специфичность ОРН.

1.2.2. Структура активного центра и механизм действия ОРН.

1.3. Экспрессия гена, кодирующего синтез ОРН в различных биологических объектах

1.4. Факторы, обуславливающие высокоэффективную экспрессию генов в клетках Е. coli.

1.4.1. Конфигурация эффективного экспрессионного вектора.

1.4.2. Направленная локализация синтеза белков. ф 1.4.3. Молекулярные шапероны и протеолиз.

1.4.4. Условия культивирования.

1.5. Гибридные белки, выделение и их свойства.

1.5.1. Полигистидинсодержащие белки и генетические конструкции для их получения

1.5.2. Носители для выделения Швб-содержащих белков.

1.5.3. ОРН в составе гибридных белков.

1.6. Комплексообразование металлов с остатками гистидина в белках.

1.7. Белки, содержащие неприродные аминокислоты в структуре молекулы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и приборы.

2.1.1. Реактивы. ф 2.1.2. Ферменты.

2.1.3. Бактериальные штаммы.

2.1.4. Питательные среды.

2.1.5. Составы растворов.

2.1.6. Синтетические олигонуклеотиды.

2.1.7. Приборы.

2.2. Методы.

2.2.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой

2.2.2. Определение рН оптимума действия фермента.

2.2.3. Исследование термостабильности.

2.2.4. Определение температурного оптимума.

2.2.5. Определение состава холоформ ферментов His6-OPH и OPH-His6.

2.2.6. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

2.2.7. Трансформация компетентных клеток.

2.2.8. Выделение плазмидной ДНК из 200 мл культуральной жидкости.

2.2.9. Выделение плазмидной ДНК кипячением из малых объемов культуральной жидкости.

2.2.10. Проведение рестрикции ДНК и выделения фрагментов электрофорезом в агарозном геле.

2.2.11. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.12. Определение первичной структуры ДНК.

2.2.13. Конструирование плазмиды pTES-OPH.

2.2.14. Конструирование плазмиды pTES-His6-OPH для биосинтеза His6-OPH.

2.2.15. Конструирование плазмиды pTES-OPH-His6 для биосинтеза OPH-His6.

2.2.16. Определение уровня экспрессии и активности фермента. Изучение кинетики роста клеток Е. coli.

2.2.17. Определение влажности биомассы.

2.2.18. Определение растворимости белка.

2.2.19. Выделение и очистка ОРН.

2.2.20. Подготовка криоПААГ носителей.

2.2.21. Определение емкости криоПААГ носителей.

2.2.22. Выделение и очистка His6-OPH и OPH-His6 с использованием криоПААГ.

2.2.23. Определение концентрации белка.

2.2.24. Выделение и очистка His6-OPH на Ni-NTA агарозе.

2.2.25. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле (SDS-электрофорез).

2.2.26. Биосинтез F-замещенного аналога His6-OPH.

2.2.27. Масс-спектрометрический анализ 3-F-Tyr-His6-OPH.

2.2.28. Компьютерное моделирование структуры белков.

2.2.29. Синтез и очистка пептида His6.

2.2.30. Обработка результатов измерений.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Разработка высокоэффективной системы биосинтеза ОРН в клетках Е. coli, выделение и очистка рекомбинантной ОРН.

3.1.1. Получение высокоэффективной системы биосинтеза рекомбинантной ОРН.

3.1.1.1. Конструирование плазмиды pTES-OPH.

3.1.1.2. Влияние условий культивирования клеток Е. coli на экспрессию гена, кодирующего синтез ОРН.

3.1.1.2.1. Влияние выбранного штамма на биосинтез ОРН в клетках Е. coli.

3.1.1.2.2. Влияние температуры культивирования на растворимость синтезируемого белка.

3.1.1.2.3. Влияние концентрации ИПТГ на уровень синтеза ОРН в клетках Е. coli

3.1.1.2.4. Кинетика роста клеток Е. coli DH5a/pTES-OPH при различных концентрациях ИПТГ в культуральной среде.

3.1.1.2.5. Влияние состава среды, используемой для культивирования штамма-продуцента ОРН, на выход растворимой формы фермента.

3.1.1.3. Влияние шаперонов на фолдинг ОРН.

3.1.2. Выделение и очистка рекомбинантной ОРН.

3.1.2.1. Выделение и очистка ОРН из клеток Е. coli DH5a, трансформированных плазмидой pTES-OPH.

3.1.2.2. Выделение ОРН с применением FPLC.

3.2. Разработка высокоэффективной системы биосинтеза аналогов ОРН в клетках Е. coli, их выделение и очистка.

3.2.1. Генетические конструкции для биосинтеза полигистидинсодержащих аналогов ОРН.

3.2.1.1. Конструирование плазмид для экспрессии генов, кодирующих полигистидинсодержащие аналоги ОРН.

3.2.1.1.1.Конструирование плазмиды pTES-His6-OPH для биосинтеза His6-OPH

3.2.1.1.2. Конструирование плазмиды pTES-OPH-His6 для биосинтеза OPH-His

3.2.1.2. Оптимизация условий экспрессии плазмид pTES-His6-OPH и pTES-OPH-His6 в клетках Е. coli W3110, DH5a и SG13009[pREP4].

3.2.1.2.1. Анализ биосинтеза His6-OPH и OPH-His6 в клетках Е. coli W3110.

3.2.1.2.2. Влияние условий культивирования штаммов-продуцентов His6-содержащих аналогов ОРН на выход белков в растворимой форме.

3.2.2. Очистка полигистидин-содержащих аналогов ОРН.

3.2.2.1. Выделение и очистка на аффинном носителе Ni-NTA-агарозе.

3.2.2.2. Очистка His6-OPH на макропористых криоПААГ носителях.

3.2.2.2.1. Влияние состава препарата на степень очистки №зб-содержащей ОРН

3.2.2.2.2. Влияние хелатирующего лиганда и металла на эффективность выделения и очистки Швб-содержащей ОРН.

3.2.2.3. Выделение OPH-His6.

3.3. Физико-химические свойства генетически-модифицированных аналогов ОРН.

3.3.1. рН-зависимость каталитической активности ОРН, His6-OPH, OPH-His6.

3.3.2. Зависимость каталитической активности ОРН, His6-OPH, OPH-His6 от температурных условий проведения ферментативной реакции.

3.3.3. Исследование каталитических характеристик ОРН, His6-OPH, OPH-His6.

3.3.4. Влияние ионов металла на каталитическую активность ОРН, His6-OPH, OPH-His

3.3.5. Гидролиз БОВ под действием ОРН и His6-OPH.

3.4. Получение и свойства фтор-тирозинсодержащего аналога органофосфатгидролазы

3.4.1. Влияние З-F-Tyr на кинетику роста клеток-продуцентов модифицированного белка His6-OPH.

3.4.2. Выделение и очистка модифицированного белка F-Tyr-His6-OPH.

3.4.3. Свойства F-Tyr His6-OPH.

ВЫВОДЫ.

Современные методы ведения сельского хозяйства в экономически развитых странах мира и в России предполагают обязательное использование пестицидов в режиме, строго регламентируемом ГОСТами (4-6 кг/га) [1]. Более 40% от общего объема применяемых в мире пестицидов составляют фосфорорганические соединения (ФОС), которые представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфосфоновых кислот, а также их производные (табл. 1, стр.11). Большинство ФОС имеют относительно низкую водорастворимость, способны аккумулироваться в почве и сточных водах, а естественное разложение ФОС протекает со сравнительно низкими скоростями. Все это приводит к накоплению ФО-пестицидов в различных сельскохозяйственных продуктах. Даже после жесткой технологической обработки и длительных сроков хранения продукты питания все еще содержат ФОС [2, 3]. Более того, ФОС находят даже в текстильных изделиях, выработанных из натурального хлопкового сырья, собранного с обработанных пестицидами полей [4].

ФОС также находят широкое применение в качестве бытовых инсектицидов для уничтожения муравьев, тараканов и других насекомых в жилищах, на приусадебных участках, а также с целью защиты домашних и сельскохозяйственных животных от различных паразитов (клещей, блох и т.п.), следствием чего является обнаружение ФОС в домашней пыли [5, 6]. Именно этот факт определяет отношение к ФОС, как к серьезнейшему антропогенному фактору [7].

Следует также заметить, что к рассматриваемой группе веществ, состоящей преимущественно из пестицидов, относятся также и фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ) (табл. 1), запасы которых должны быть уничтожены, согласно Международной конвенции об уничтожении химического оружия [8-10].

На современном этапе развития человечества, существует и приобретает определенную реальность угроза химического терроризма, предполагающего использование не только химического оружия массового поражения, но и его аналогов, в частности ФО-пестицидов [11]. В связи с этим поиск эффективных путей деградации ФОС становится чрезвычайно актуальной проблемой.

Существует несколько путей проникновение ФОС в организм человека и животных - диффузия через кожу, ингаляторное и пероральное проникновение с водой и продуктами питания. Все ФОС являются ингибиторами холинэстераз, следствием этого является накопление холина в синапсах центральной и периферической нервной системы, оказывающее нервно-паралитическое воздействие. Даже в незначительных количествах

ФОС способны вызывать у человека острые отравления вплоть до летального исхода [12, 13].

Показано, что ФОС оказывает мутагенное воздействие на млекопитающих. Так, у жителей территорий, прилегающих к сельскохозяйственным зонам, подвергавшимся когда-либо обработке ФОС, и у людей, которые были задействованы в производстве и применении ФОС [14-16], возникают хромосомные аберрации лимфоцитов [17].

Согласно экономическим расчетам, отказ от применения столь токсичных для человеческого организма соединений неизбежно привел бы к сокращению всего урожая в мире на 50% и вызвал бы рост цен на сельскохозяйственную продукцию в 4-5 раз [18]. Невозможность отказа от применения ФОС приводит к тому, что актуальнейшей экологической и научной проблемой становится их обнаружение и детоксикация. Решением этой проблемы занимаются ученые многих стран мира на протяжении нескольких десятков лет, но именно в последние пять лет интенсивность проводимых исследований резко увеличилась. На сегодняшний день известно о существовании национальных экологических и научных программ [19-22], предусматривающих колоссальные капиталовложения для решения проблем, связанных с применением ФОС и уничтожением ранее произведенных запасов, в европейских странах, преимущественно занимающихся сельским хозяйством (Италии, Греции, Испании, Польше и др.). Мониторинг содержания ФО-пестицидов в продуктах сельского хозяйства, водах рек и муниципальных отходах [23-25] - одна из основных задач таких программ. Аналогичные исследования проводятся также в США [26,27]. Китае [28] и Японии [29].

В последнее время основное внимание уделяется проведению работ по детоксикации различных ФОС с помощью биологических систем, а значит, без риска применения жестких химических методов деградации, отрицательно влияющих на состояние окружающей среды. Как правило, «мягкие» условия включают неагрессивные среды и температурный режим в пределах 25-50°С. В связи с этим наблюдается рост интереса к ферментам, способным катализировать гидролиз ФОС с образованием продуктов, во-первых, менее токсичных, чем исходные субстраты, и, во-вторых, определение которых проще, чем гидролизуемых ФОС. К числу таких ферментов относится органофосфатгидролаза (ОРН), которая катализирует гидролиз фосфотриэфирных связей широкого ряда фосфорорганических субстратов.

Уничтожение ФОВ проводится согласно утвержденному методу [30], при этом применение фермента возможно на стадии дезактивации остаточных количеств ФОВ в составе реакционных масс, а также для обработки загрязненных территорий и объектов помещений, оборудования, реакторов, транспортных средств и тары для хранения), задействованных в технологии деградации ФОВ.

Основные генно-инженерные работы с ОРН направлены на интенсивное изучение структуры активного центра фермента, а также на изменение субстратной специфичности фермента и увеличение сродства к соединениям, представляющим собой БОВ. Природные штаммы, обладающие ОРН-активностью, не могут быть рассмотрены в качестве продуцентов данного фермента ввиду крайне низких уровней его синтеза в клетках (0,0085 мг белка из 1 г клеток). В связи с этим создание новых систем для биосинтеза ОРН в клетках Е. coli является весьма актуальным.

Биотехнологическое применение ОРН предполагает использование эффективных способов выделения и очистки фермента. Современое решение такой задачи предполагает модификацию ферментов путем введения аминокислотных последовательностей в молекулы белков для последующей иммобилизации на металл-хелатирующих хроматографических носителях. Исследование свойств гибридных белков является необходимым условием для решения фундаментальных задач изучения взаимосвязи структуры белковой молекулы со свойствами, и так как в связи с тем, что гибридные партнеры могут оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на свойства целевых белков, подвергнутых модификации. Кроме того, тип и характеристика носителя, используемого для хроматографического выделения гибридных белков, определяет скорость и качество процесса. Макропористые носители на основе криогелей полиакриламида (криоПААГ) являются новым словом в хроматографии, поскольку они формуются в виде монолитного блока, что позволяет получать желаемые размеры и формы носителя. Макропористая матрица обеспечивает высокие скорости потока элюента и гарантирует простоту выполнения самой процедуры выделения и очистки белка. Использование такого подхода для разработки способов очистки ОРН несомненно актуально и может иметь практическую значимость для биотехнологии.

Таким образом, разработка высокоэффективных способов получения ОРН или ее аналогов в клетках Е. coli является актуальной для применения фермента на практике, решения задач детекции ФОС в различных объектах in situ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Выделен ген, кодирующий синтез ОРН, на основе которого получена новая экспрессионпая плазмида pTES-OPH, позволяющая синтезировать ОРН в клетках Е. coli. Оптимизация условий биосинтеза ОРН позволила увеличить выход активной формы ОРН в 4 раза. Показано, что использование коэкспрессии с системой молекулекулярных шаперонов GroEL и GroES снижает агрегацию ОРН в тельца включения, и увеличивает выход растворимой формы фермента более чем в 2 раза.

2. Разработан эффективный способ выделения и очистки рекомбинантной ОРН с применением FPLC. Показано, что разработанная экспрессионная система Е. coli DH5a/pTES-OPH позволяет получать более 12 мг ОРН в растворимой форме из 1 г биомассы, что превышает известные зарубежные аналоги в 8-10 раз.

3. Разработаны новые генно-инженерные конструкции, кодирующие синтез ОРН, содержащей Изб-последователыгость на N- (His6-OPH) и С-конце (OPH-His6) молекулы белка.

4. Разработан способ выделения полигистидинсодержащих аналогов ОРН с использованием макропористых носителей на основе криогеля ПААГ, модифицированного хелатирующими лигандами. Наиболее эффективным для получения гомогенного препарата модифицированного фермента является носитель на основе Со -ША-криоПААГ. В результате очистки может быть получено 4,5 мг His6-OPH с удельной активностью 7300 ед/мг и 4,1 мг OPH-His6 с удельной активностью 5710 ед/мг из 1 г биомассы.

5. Установлено, что модифицированные белки His6-OPH и OPH-His6 имеют смещенные рН-оптимумы действия на 0,5-1,0 и 1,0-1,5 единицы рН, соответственно, в щелочную область по сравнению с известными характеристиками для ОРН. Выявлены различия в зависимостях активностей ферментов ОРН, His6-OPH и OPH-His6 от природы металла. Показано, что полученные ферменты имеют по ряду субстратов на порядок улучшенные каталитические константы, а также повышенную термостабильиость, что существенно увеличивает их практическую значимость.

6. Выявлены сложные зависимости активности OPH-His6 от рН и концентрации субстрата. Выдвинуто предположение о наличии конформационных изменений в молекуле белка, вызванных появлением второго каталитического центра в молекуле ОРН, содержащей Шэб-последовательность на С-конце, которое подтверждено кинетическими методами.

7. Биосинтетическим путем получен аналог His6-OPH, содержащий F-Tyr в структуре молекулы. Масс-спектрометрически подтверждена полная замена остатков Туг на F-Tyr в молекуле F-Tyr-His6-OPH. Установлено, что диапазон оптимального рН действия F-Tyr-His6-OPH смещен в кислую область на 2,0-2,5 единицы рН по отношению к рН-оптимуму His6-OPH. Показана существенная термостабилизация F-Tyr-His6-OPH по отношению к не содержащему фтор белку.

1. Мельников Н.Н. Пестициды: Химия, технология, применение. // М.: Химия. 1987. С. 712.

2. Coulibaly К. Temperature and рН decomposition of organophosphate pesticides in water and beef muscule. // PhD. Int. Order # DA 9508801. 1994. Kansas: Kansas Univ. P. 179.

3. Luchini L. C., Peres Т. В., deAndrea, M. M. Monitoring of pesticide residues in a cotton crop soil. // J. Environ. Sci. Health B. 2000. V. 35. P. 51-59.

4. Lemley A., Hedge A., Obendorf S.K., Hong S., Kim J., Muss T.M., Varner C.J. Selected pesticide residues in house dust from farmers' homes in central New York State. // Bull. Environ. Contam. and Tox. 2002. 69(2). P. 155-163.

5. Obendorf S.K., Lemley A.T., Hedge A., Kline A.A., Tan K., Dokuchayeva T. Distribution of pesticide residues within homes in central New York state //Arch. Environ. Contam. Toxicol, (in press).

6. Wheelis M. Biotechnology and chemical weapons control. // Pure Appl. Chem. 2002. V. 74 (12). P. 2247-2251.

7. Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожения (исправленный вариант). 8 августа 1994 г. PTS PC OPCW. 1994. С. 191.

8. Федеральный закон "Об уничтожении химического оружия". Принят Государственной Думой 25 апреля 1997 г. // Российская газета. 6 мая 1997. С. 4-5.

9. Федеральная целевая программа "Уничтожение запасов химического оружия в Российской Федерации". Утверждена постановлением Правительства РФ от 21 марта 1996 г. №305 (в редакции постановления Правительства РФ от 5 июня 2001 г. №501).

10. Gallo М., Lawryk N. Organic phosphorous pesticides. // The Handbook of Pesticide Toxicology. Academic press, San Diego, С A, 1991.

11. Alavanja M.C., Hoppin J.A., Kamel F. Health effects of chronic pesticide exposure: cancer and neurotoxicity. // Ann. Rev. Public Health, 2004. V. 25. P. 155 197.

12. Краснюк E. П., Лубянова И. П. Профессиональные заболевания работников сельского хозяйства. // Ред. Ю.И.Кундиев, Е.П.Краснюк. К.: Здоровье. 1989. С. 38-50.

13. Coronado G.D., Thompson В., Strong L., Griffith W. C., Islas I. Agricultural task and exposure to organophosphate pesticides among farmworkers. //Environ. Health. Perspect. 2004. V.l 12 (2), P. 142-147.

14. Задорожный В. А., Петров Б. P., Олефиренко В. Ф., Кириленко В. А. Профессиональные дерматозы и профилактика в условиях производства пестицидов. // Вестник дерматол. и венерол. 1981. Т. 6. С. 48-51.

15. Захаренко В. А. Гербициды // М.: Агропромиздат. 1990. С. 240.

16. Leoni V., Cariechia А. М., Comi R., Martini F., Rodolico S., Vitali M. Risk assessment of organophosphorus pesticide dietary intake for the population of the city of Rome (Italy). // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1995. V. 54 (6). P. 870-877.

17. Sogorb M. A., Vilanova E. Enzymes involved in the detoxification of organophosphorus, carbamate and pyrethroid insecticides through hydrolysis. // Toxicol. Lett. 2002. V. 128 (1-3). P. 215-228.

18. Курочкин И. H. Биосенсорные системы для целей химической и биологической безопасности: Дисс. док. хим. наук. М: МГУ им.М.В. Ломоносова. 2003. С. 385.

19. Mulchandani A., Chen W., Mulchandani P., Wang J., Rogers K.R. Biosensors for direct determination of organophosphate pesticides. // Biosensors and Bioelectronics. 2001. V. 16 (4), P. 225-230.

20. Pei L., Omburo G., McGuinn W. D., Petricovics L, Dave K., Raushel F. M., Wild J. R., DeLoach J. R., Way J. L. Encapsulation of phosphotriesterase within murine erythrocytes. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1994. V. 124 (2). P. 296-301.

21. Raushel F., Holden H. M. Phosphotriesterase: an enzyme in search of its natural substrate. //Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 2000. V. 74. P. 51-93.

22. Guo J., Zhang X. A new analysis method with GC or GC-MS for the quick detection of pesticide residues in vegetables. // J. Chromatogr. Sci. 2005. V. 43 (3). P. 158-162.

23. Sode K, Nakamura H. Compatibility of phosphotriesterase from Flavobacterium sp. with detergents. // Biotechnol. Lett. 1997. V. 19 (12). P. 1239-1242.

24. Сборник инструктивно-методических документов по проблеме уничтожения химического оружия. Часть II. Фосфорорганические отравляющие вещества. Т. I. М.: ФУ "Медбиоэкстрим". 2001. С. 208.

25. Walker С. The classification of esterases which hydrolyse organophosphates: Recent developments. // Chem. Biol. Interac. 1993. V. 87. P. 17-24.

26. Hoskin E. C, Walker J. E., Mello С. M. Organophosphorus acid anhydrolase in slime mold duckweed and mung bean: a continuing search for a physiological role and a natural substrate. // Chem. Biol. Interact. 1999. V. 119. P. 399-404.

27. Rosenberg A., Alexander M. Microbial cleavage of various organophosphorus insecticides. //Appl. Environ. Microbiol. 1979. V. 37. P. 886-891.

28. Racke K., Coats J. Enhanced degradation of isofenphos by soil microorganisms. // J. Agric. Food Chem. 1987. V. 35. P. 94-99.

29. Home I., Sutherland T. D., Oakeshott J. G., Russell R. J. Cloning and expression of the phosphotriesterase gene hocA from Pseudomonas monteilii Cll. // Microbiol. 2002. V. 148. P. 2687-2695.

30. Rani N. L., Lalithakumari D. Degradation of methyl parathion by Pseudomonas putida. II Can. J. Microbiol. 1994. V. 40. P. 1000-1006.

31. Nelson L. M. Biologically induced hydrolysis of parathion in soil: isolation of hydrolyzing bacteria. // Soil Biol. Biochem. 1982. V. 14. P. 219-222.

32. Daughton C. G., Hsies D. P. H. Accelerated parathion degradation in soil by inoculation with parathion-utilizing bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. 1977. V. 34. P. 175-184.

33. Johnson L.M., Talbot H.W. Jr. Detoxification of pesticides by microbial enzymes. // Experientia. 1983. V. 39 (11). P. 1236-1246.

34. Megharaj M., Madhavi B. R., Sreenivasulu C, Umamaheswari A., Venkateswarlu K. Biodegradation of methyl parathion by soil isolates of microalgae and cyanobacteria // Bull. Environ. Coniam. Toxicol. 1994. V. 53. P. 292-297.

35. Megharaj M., Venkateswarlu К., Rao A.S. Metabolism of monocrotophos and quinalphos by algae isolated from soil. //Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1987. V. 39. P. 251-256.

36. Sethanathan N., Yoshida T. A. Flavobacterium sp. that degrades diazinon and parathion. // Can. J. Microbiol. 1973. V. 19. P. 873-875.

37. Siddaramappa R., Rajaram K. P., Sethunathan N. Degradation of parathion by bacteria isolated from flooded soil. // Appl. Microbiol. 1973. V. 26. P. 846-849.

38. Ortiz-Hernandez M.L., Quintero-Ramirez R., Nava-Ocampo A.A., Bello-Ramirez A.M. Study of the mechanism of Flavobacterium sp. for hydrolyzing organophosphate pesticides. // Fundam. Clin. Pharmacol. 2003. V. 17 (6). P.717-723.

39. Mulbry W., Kearney P. C. Degradation of pesticides by microorganisms and the potential for genetic manipulation. // Crop. Prot. 1991. V. 10. P. 334-346.

40. Mulbry W. W., Karns J. S. Parathion hydrolase specified by the Flavobacterium opd gene: Relationship between the gene and the protein. // J. Bacteriol. 1989. V. 171 (12). P. 67406746.

41. Dumas D. P., Caldwell S. R., Wild J. R., Raushel E. M. Purification and properties of the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. II J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 19659-19665.

42. Dumas D. P., Durst H. D., Landis W. G., Raushel F. M„ Wild J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. II Arch. Biochem Biophys. 1990. V. 277 (1). P. 155-159.

43. Singh В. K., Walker A., Morgan J. A. W., Wright D. J. Biodegradation of chlorpyrifos by Enterobacter strain B-l4 and its use in bioremediation of contaminated soils. // Applied and Enviromental Microbiology. 2004. V. 70 (8). P. 4855-4863.

44. DeFrank J., Beaudry W., Cheng Т., Harvey S., Stroup A., Szafraniec L. Screening of halophilic bacteria and Alteromonas species for organophosphorus hydrolyzing enzyme activity. // Chem. Biol. Interact. 1993. V. 87. P. 141-148.

45. DeFrank J. J, Cheng T.-C. Purification and properties of an organophosphorus acid anhydrase from halophilic bacterial isolate. //J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 1938-1943.

46. Home I., Sutherland T. D., Harcourt R. L., Russel R. J., Oakeshott J. G. Identification of an opd (Organophosphate Degradation) Gene in Agrobacterium Isolate. // Appl. Enviromen. Microbiology. 2002. V. 68. V. 7. P. 3371-3376.

47. Mulbry W. W. Characterization of a novel organophosphorus hydrolase from Nocardiodes simplex NRRL B-24074. // Microbiol. Res. 2000. V. 154 (4). P. 285-288.

48. Nelson L. M. Biologycally-induced hydrolysis of parathion in soil: isolation of hydrolyzing bacteria. // Soil Biol. Biochem. 1982. V. 14. P. 219-222.

49. Kams J. S., Muldoon M. Т., Mulbry W. W., Derbyshire M. K., Kearney P. C. Use of microorganisms and microbial systems in the degradation of pesticides. // Biotechnol. in Agricul. Chem. ACS Symposium Series. 1987. V. 334. P. 156-170.

50. Omar S. A. Availability of phosphorus and sulfur of insecticide origin by fungi. Biodegradation. 1998. V. 9 (5). P. 327-336.

51. Hasan H. A. Fungal utilization of organophosphate pesticides and their degradation by Aspergillus jlavus and A. sydowii in soil. // Folia Microbiol (Praha). 1999. V. 44 (1). P. 77-84.

52. Scharff E. I., Koepke J., Fritzsch G., Lucke C., Ruterjans H. Crystal structure of diisopropylfluorophosphatase from Loligo vulgaris. II Structure with Folding & Design. 2001. V. 9 (6). P. 493-502.

53. Koepke J., Scharff E.I., Lucke C., Ruteijans H., Fritzsch G. Atomic resolution crystal structure of squid ganglion DFPase. // Acta crystallogr. Sec. D. 2002. V. 58 (10). P. 1757-1759.

54. DiSioudi B. D., Grimsley J. K., Lai K., Wild J. R. Modification of near active site residues in organophosphorus hydrolase reduces metal stoichiometry and alters substrate specificity. //Biochemistry. 1999. V. 38 (10). P. 2866-2972.

55. Wu F., Li W.-S., Chen-Goodspeed M., Sogorb M., Raushel F. M. Rationally Engineered Mutants of Phosphotriesterase for Preparative Scale Isolation of Chiral Organophosphates // JACS. 2000. V. 122. P. 10206-10207.

56. Kuo J. M., Chae M. Y., Raushel F. M. Perturbations to the Active Site of Phosphotriesterase. // Biochemistry. 1997. V.36. P. 1982-1988.

57. Watkins L. M., Mahoney H. J., McCulloch J. K., Raushel F. M. Augmented Hydrolysis of DFP in Engineered Mutants of Phosphotriesterase. //J. В. C. 1997. V. 272. P. 25596-25627.

58. Shim H., Hong S. В., Raushel F. M. Hydrolysis of Phosphodiesters through Transformation of the Bacterial Phosphotriesterase. // J. В. C. 1998. V. 273. P. 17445-17450.

59. Cho С. M.-H., Mukhandani A., Chen W. Bacterial cell surface display of organophosphorus hydrolase for selective screening of improved hydrolysis of organophosphate nerve agents. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68 (4). P. 2026-2030.

60. Shimazu M., Mukhandani A., Chen W. Thermally triggered purification and immobilization of elastin-OPH fusions. // Biotechnol. Bioeng. 2003. V. 81 (1). P. 74-79.

61. Wu C.-F., Valdes J. J., Rao G., Bentley W. E. Enhancement of organophosphorus hydrolase yield in Escherichia coli using multiple gene fusions. // Biotechnol. Bioeng. 2001. V. 75 (1). P. 100-103.

62. Zhang X.-Z., Cui Z.-L., Hong Q., Li S.P. High-Level Expression and Secretion of Methyl Parathion Hydrolase in Bacillus subiilis WB800. //Appl. Environ. Microbiology. 2005. V. 71 (7) P. 4101-4103.

63. Kaneva I., Mulchandani A., Chen W. Factors influencing parathion degradation by recombinant Escherichia coli with surface-expressed organophosphorus hydrolase. // Biotechnol. Prog. 1998. V. 14. P. 275-278.

64. Donarski W. J., Dumas D. P., Heitmeyer D. P., Lewis V. E., Raushel F. M. Structure-activity relationships in the hydrolysis of substrates by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4650-4655.

65. Grimsley J. K., Scholtz J. M., Pace C. N., Wild J. R. Organophosphorus hydrolase is a remarkably stable enzyme that unfolds through a homodimeric intermediate. // Biochemistry. 1997. V. 36 (47). P. 14366-14440.

66. Omburo G. A., Kuo J. M., Mullins L. S., Raushel F. M. Characterization of the zinc binding site of bacterial phosphotriesterase. //J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 13278-13283.

67. Shim H., Raushel F. M. Self-Assembly of the binuclear metal center of phosphotriesterase. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 7357-7364.

68. Omburo G. M., Mullins L. S., Raushel F. M. Structural characterization of the divalent cation sites of bacterial phosphotriesterase by 113Cd NMR spectroscopy. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 9148-9155.

69. Hong S. В., Raushel F. M. Stereochemical preferences for chiral substrates by the bacterial phosphotriesterase. // Chem. Biol. Interact. 1999. V. 119. P. 225-234.

70. Hong S. В., Raushel F. M. Stereochemical constraints on the substrate specificity of phosphotriesterase. // Biochemistry. 1999. V. 38(4). P. 1159-1165.

71. Lewis V. E., Donarski W. J., Wild J. R., Raushel F. M. Mechanism and stereochemical course at phosphorus of the reaction catalyzed by a bacterial Phosphotriesterase. // Biochemistry. 1989. V. 27. P. 1591-1597.

72. Benning M. A., Kuo J. M., Raushel F. M., Holden H. M. Three-dimensional structure of Phosphotriesterase: an enzyme capable of detoxifying organophosphate nerve agents. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 15001-15007.

73. Benning M. A., Kuo J. M., Raushel F. M., Holden H. M. Three-dimensional structure of the binuclear metal center of Phosphotriesterase. // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 7973-7978.

74. Vanhooke J. L., Benning M. A., Raushel F. M., Holden H. M. Three-dimensional structure of the zinc-containing phosphotriesterse with the bound substrate analog diethyl-4-methylbenzylphosphonate. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 6020-6025.

75. Benning M. M., Shim H., Raushel F. M., Holden H. M. High Resolution X-ray structures of different metal-substituted forms of Phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. II Biochemistry. 2001. V. 40. P. 2712-2722.

76. Hong S.-B., Raushel F. M. Metal-Substrate Interactions Facilitate the Catalytic Activity of the Bacterial Phosphotriesterase. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 10904-10912.

77. Hong S.-B., Kuo J. M., Mullins L. S., Raushel F. M. C02 is Required for the Assembly of the Binuclear Metal Center of Phosphotriesterase. // JACS. 1995. V. 117. P. 7581-7582.

78. Wilkins R. G. Kinetics and mechanisms of reaction of transition metal complexes, 2nd Thoroughly revised Edition, VHC. 1991.

79. Benning M. M., Hong S. В., Raushel F. M., Holden H. M. The Binding of Substrate Analogs to Phosphotriesterase. // JACS. 2000. V. 275. P. 30556-30560.

80. Aubert S.D., Li Y., Raushel F.M. Mechanism for the hydrolysis of organophosphates by the bacterial phosphotriesterase. // Biochemistry. 2004. V. 43(19). P. 5707-5715.

81. Sergeeva V. S., Efremenko E. N., Kazankov G. M., Varfolomeyev S. D. Double effect of organic amines (activation and inhibition) on the Phosphotriesterase. // J. Molec.Catalysis B:Enzymatic. 2000. V. 10 (6). P. 571-576.

82. Danilova I. G., Ryabov A. D., Varfolomeev S. D. Mechanism of biexponential inactivation of organophosphate hydrolase by 1,10-phenantroline. A kinetic and second derivative UV spectral study // J. Mol. Cat., Part A: Chemical. 1997. V. 118. P. 161-166.

83. Rochu D., Beaufet N., Renault F., Viguie N., Masson P. The wild type bacterial Co(2+)/Co(2+)-phosphotriesterase shows a middle-range thermostability. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1594. P. 207-218.

84. Dave К. I., Lauriano C., Xu В., Wild J. R., Kenerley С. M. Expression of organophosphate hydrolase in the filamentous fungus Gliocladium virens. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 41. P. 352-358.

85. Payne G. F., DelaCruz N., Copella S. J. Improved production of geterologous protein from Streptomyces lividans. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. V. 33. P. 395-400.

86. Dave К. I., Miller L. L., Wild J. R. Characterization of Organophosphorus Hydrolases and the genetic manipulation of the Phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. II Chem. Biol. Interact. 1993. V. 87. P. 55-68.

87. Dumas D. P., Wild J. R., Raushel E. M. Expression of Pseudomonas Phosphotriesterase activity in the fall armyworm confers resistance to insecticides. // Experientia. 1990. V. 46. P. 729-731.

88. Mulbry W. W., Del Valle P., Karns J. S. Biodegradation the organophosphate insecticide coumaphos in highly contaminated soils and in liquid wastes. // J. Pest. Sci. 1996. V. 48. P. 149155.

89. Dave К. I., Phillips L., Luckow V. A., Wild J. R. Expression and post-translational processing of a broad-spectrum organophosphorus-neurotoxin-degrading enzyme in insect tissue culture. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1994. V. 19. P. 271-284.

90. Phillips J. R., Xin J. H., Kirby K., Milne C. P., Krell P. O., Wild J. R. Transfer and expression of an organophosphate insecticide-degrading gene from Pseudomonas in Drosophila melanogaster. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 8155-8159.

91. McDaniel C. S., Harper L. L., Wild J. R. Cloning and sequencing of a plasmid-borne gene (opd) encoding a Phosphotriesterse. // J. Bacteriol. 1988. V. 170 (5). P. 2306-2311.

92. Serdar С. M., Murdock D. C., Rhode M. F. Parathion hydrolase gene from Pseudomonas diminuta MG: subclonong, complete nucleotide sequence, and expression of the mature portion of the enzyme in E. coli. // BioTechnology. 1989. V. 7. P. 1151-1153.

93. Harper L., McDaniel C., Miller C., Wild J. Dissimilar plasmids isolated from Pseudomonas diminuta MG and a Flavobacterium sp. (ATCC 27551) contain identical opd genes. II Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54 (10). 2586-2589.

94. Serdar C., Cuneyt M. Hydrolysis of cholinesterase inhibitors using parathion hydrolase. United States Patent No. 5,589,386. 1996.

95. Makrides S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. II Microbiological Rewiews. 1996. V. 60 (3). P. 512-538.

96. Brosius J. Compilation of superlinker vectors. // Methods Enzymol. 1992. V. 216. P. 469483.

97. Das A. Overproduction of proteins in Escherichia coli: vectors, hosts, and strategies. // Methods Enzymol. 1990. V. 182. P. 93-112.

98. Duffaud G. D„ March P. E., Inouye M. Expression and secretion of foreign proteins in Escherichia coli. II Methods Enzymol. 1987. V. 153. P. 492-507.

99. Vasquez J. R., Evnin L. В., Higaki J. N., Craik C. S. An expression system for trypsin. // J. Cell. Biochem. 1989. V. 39 (3). P. 265-276.

100. Poole E. S., Brown С. M., Tate W. P. The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli. //EMBO J. 1994. V. 14. P. 151-158.

101. Mottagui-Tabar S., Bjornsson A., Isaksson L. A. The second to last amino acid in the nascent peptide as a codon context determinant. // EMBO J. 1994. V. 13. P. 249-257.

102. Wilkinson D. L., Harrison R. G. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. II BioTechnology. 1991. V. 9 (5). P. 443-448.

103. Bardwell J. C. A. Building bridges: Disulphide bond formation in the cell. // Mol. Microbiol. 1994. V. 14. P. 199-205.

104. Bardwell J. C. A., McGovern K., Beckwith J. Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. II Cell. 1991. P. 67. P. 581-589.

105. Ellis R.J., Hartl F.U. Principles of protein folding in the cellular environment. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. V. 9 (1). P. 102-110.

106. Schlieker Ch., Bukau В., Mogk A. Prevention and reversion of protein aggregation by molecular chaperones in the E.coli cytosol: implications for their applicability in biotechnology. // J. Biotechnol. 2002. V. 96. P. 13-21.

107. Saibil H. Molecular chaperones: containers and surfaces for folding, stabilising and unfolding proteins. //Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. V. 10. P. 251-258.

108. Goloubinoff P., Gatenby A. A., Lorimer G. H. GroE heat-shock proteins promote assembly of foreign prokaryotic ribulose bisphosphate carboxylase oligomers in Escherichia coli II Nature. 1989. V. 337. P. 44-47.

109. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins from E.coli. To fold or to refold. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V. 66. P. 197-238.

110. Sareen D., Sharma R., Vohra R.M. Chaperone-assisted overexpression of an active D-carbamoylase from Agrobaclerium tumefaciens AM 10. // Protein Expr. Purif. 2001. V. 23 (3). P. 374-379.

111. Martin J. Protein folding assisted by GroEL/GroES chaperoning systems. // Biochemistry (Mosc). 1998. V.63(4). P. 374-381.

112. Yasukawa Т., Kaneiishii C., Maekawa Т., Fujimoto J., Yamamoto Т., Ishii S. Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 25328-25331.

113. Pace C.N., Shirley B.A., McNutt M., Gajiwala K. Forces contributing to the conformational stability of proteins. // FASEB J. 1996. V. 10. P. 75-83.

114. Dyson M.R., Shadbolt S.P., Vincent K.J., Perera R.L., McCafferty J. Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. // BMC Biotechnol. 2004. V. 4 (1). P. 32.

115. Lobacz В., Wolska K.I. Escherichia coli defects caused by DnaK and DnaJ proteins overproduction. // Acta Microbiol. Pol. 1997. V. 46 (4). P. 393-397.

116. Georgiou G., Valax P. Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli. II Curr. Opin. Biotechnol. 1996. V. 7. P. 190-197.

117. Varshavsky A. The N-end rule: Functions, mysteries, uses. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 96. P. 12142-12149.

118. Humphreys D. P., Weir N., Mountain A., Lund P. A. Human protein disulfide isomerase functionally complements a dsbA mutation and enhances the yield of pectate lyase С in Escherichia coli. Hi. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 28210-28215.

119. Liljeqvist S., Stahl S., Andreoni C., Binz H., Uhlen M., Murby M. Fusions to the cholera toxin В subunit: influence on pentamerization and GM1 binding. // J. Immunol. Methods. 1997. V. 210 (2). P. 125-135.

120. Talmadge K., Gilbert W. Cellular location affects protein stability in Escherichia coli. И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79 (6). P. 1830-1833.

121. Lee S.Y. High cell-density culture of Escherichia coli. II Trends Biotechnol. 1996. V. 14. P. 98-105.

122. Yamane Т., Shimizu S. Fed-batch techniques in microbial processes. // Adv. Biochem. Eng. 1984. V. 30. P. 147-194.

123. Lee J., Lee S.Y. Park S., Middelberg P.J. Control of fed-batch fermentation. // Biotech. Advances. 1999. V. 17. P. 29-48.

124. Yee L., Blanch H. W. Recombinant Protein. Expression in high cell density fed-batch cultures of Escherichia coli. II Bio/Technology. 1992. V. 10. P. 1550-1556.

125. Sanden A.M., Bostrom M., Markland K., Larsson G. Solubility and proteolysis of the Zb-MalE and Zb-MalE31 proteins during overproduction in Escherichia coli. II Biotechnol. Bioeng. 2005. V. 90 (2). P. 239-247.

126. Hansen L.H., Knudsen S., Sorensen S.J. The effect of the lacY gene on the induction of IPTG inducible promoters, studied in Escherichia coli and Pseudomonas fluorescens. II Curr. Microbiol. 1998. V. 36. P. 341-347.

127. Donovan R.S., Robinson S.W., Glick B.R. Review: optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac promoter.// Ind. Microbiol. 1996. V.16. P.145-154.

128. Terpe K. Overview of tag protein fusion: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 60. P. 523-533.

129. Sassenfeld H.M., Brewer S.J. A polypeptide fusion designed for purification of recombinant proteins. // Bio.Technology. 1984. V. 2. P. 76-81.

130. Nagai K., Thogersen H. C. Synthesis and sequence specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. II Methods Enzymol. 1987. V. 153. V. 461-481.

131. Норр Т., Pricket K., Price V., Libby R., March C., Ceretti D., Urdal D., Conlon P. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. // Bio.Technology. 1988. V. 6. P. 1204-1210.

132. Lellouch A.C., Geremia R.A. Expression and study of recombinant ExoM, a betal-4 glucosyltransferase involved in succinoglycan biosynthesis in Sinorhizobium meliloti. II J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 1141-1148.

133. Xu Z., Bae W., Mulchandani A., Mehra R. K., Chen W. Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose. // Biomacromolecules. 2002. V. 3. P. 462-465.

134. Watanabe Т., Ito Y., Yamada Т., Hashimoto M., Sekine S., Tanaka H. The role of the C-terminal domain and type III domains of chitinase A1 from Bacillus Circulans WL-12 in chitin degradation. //J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 4465-4472.

135. Cantor E. J., Chong S. Intein-mediated rapid purification of Cre recombinase. // Protein Expr. Purif. 2001. V. 22. P. 135-140.

136. Sweda P., Pladzyk R., Kotlowski R., Kur J. Cloning, expression, and purification of the Staphylococcus simulans lysostaphin using the intein-chitin-binding domain (CBD) system. // Protein Expr. Purif. 2001. V. 22. P. 467-471.

137. Smith D. В., Johnson K. S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. // Gene. 1988. V. 67. P. 31-40.

138. Uhlen M., Forsberg G., Moks Т., Hartmanis M., Nilsson B. Fusion proteins in biotechnology. // Curr. Opin. Biotechnol. 1992. V. 3 (4). P. 363-369.

139. Uhlen M., Nilsson В., Guss В., Lindberg M., Gatenbeck S., Philipson L. Gene fusion vectors based on the gene for staphylococcal protein A. // Gene. 1983. V. 23. P. 369-378.

140. Uhlen M., Moks T. Gene fusions for purpose of expression: an introduction. // Methods Enzymol. 1990. V. 185. P. 129-143.

141. Bucher M.H., Evdokimov A.G., Waugh D.S. Differential effects of short affinity tags on the crystallization of Pyrococcus furiosus maltodextrin-binding protein. // Biol. Cryst. 2002. V. 58. P. 392-397.

142. Hoffman A., Roedeer R.G. Purification of his-tagged proteins in non-denaturing conditions suggests a convenient method for protein interaction studies. // Nucleic Acid Res. 1991. V. 19. P. 6337-6338.

143. Hochuli E., Dobeli H., Schacher A. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. // J. Chromatography. 1987. V. 411. V. 177-184.

144. Stuber D., Matile H., Garotta G. In "Immunological Methods". // I. Lefkovits, B. Pernis. (eds.) 1990. V. 4. P. 121-152.

145. Kowolik C., Hengstenberg W. The lactose transporter of Staphylococcus aureus -overexpression, purification and characterization of the histidine-tagged domains IIC and IIB. // Eur. J. Biochem. 1998. V. 257. P. 389-394.

146. Chen H.-M., Chen K.-T. Production and characterization of glutathione-S-transferase fused with a poly-histidine tag. // Enz. Microbiol .Technology. 2000. V. 27. P. 219-226.

147. Hung M., Gibbs C., Tsiang M. Biochemical characterization of rhinovirus RNA-dependent RNA polymerase. // Antiviral. Res. 2002. V. 56 (2). P. 99-114.

148. Goel. A., Colcher D., Koo J., Booth В., Pavlinkova G., Batra S. Relative position of the hexahistidine tag effects binding properties of a tumor-associated single-chain Fv construct. // Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 1523 (1). P. 13-20.

149. Yang S., Park N., Lee Т., Cha J. Expression, purification and characterization of a recombinant levan fructotransferase. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2002. V. 35. P. 199-203.

150. Woestenenk E. A., Hammarstrom M., van den Berg S., Hard Т., Berglund H. His-tag effect on solubility of human proteins produced in Escherichia coli: A comparison between four expression vectors. // J. Struct. Funct. Genomics. 2004. V. 5. P. 217-229.

151. Mohanty A. K., Wiener M. C. Membrane protein expression and production: effects of polyhistidine tag length and position. // Protein Expr. Purif. 2004. V. 33. P. 311-325.

152. Sachdev D., Chirgwin J. M. Order of fusions between bacterial and mammalian proteins can determine solubility in Escherichia coli. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 244. P. 933-937.

153. Karlsson J., Saloheimo M., Siika-aho M., Tenkanen M., Penttila M., Tjerneld F. Homologous expression and characterization of Cel61A(EG IV) of Trichoderma reesei. II Eur. J. Biochem. 2001. V. 268 (24). P. 6498-6507.

154. Yang S., Park N., Lee Т., Cha J. Expression purification and characterization of recombinant levan fructotransferase. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2002. V. 35 (3). P. 199-203.

155. Reznik G. O., Yu Y., Tarr G. E., Cantor C. R. Native disulfide bonds in plasma retinol-binding protein are not essential for all-trans-retinol-binding activity. // J. Proteome Res. 2003. V. 2. P. 243-248.

156. Ma H.-H., Yang L., Yang X.-Y., Xu Z.-P., Li B.-L. Bacterial expression, purification and in vitro N-miristoylation of fusion hepatitis B. virus preSl with the native-type N-terminus. // Protein Expr. Purif. 2003. V. 27. P. 49-54.

157. Fujihara A., Tomatsu H., Inagasaki S., Tadaki Т., Utshida C., Himeno H., Muto A. Detection of tmRNA-mediated trans-translation products in Bacillus subtilis. // Genes Cells. 2002. V. 7 (3). P. 343-350.

158. The Qiagen bench guide: protocols, hints, and tips for molecular biology labs. 2001.

159. Gaberc-Porekar V., Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography. //J. Biochem. Biophys. Meth. 2001. V. 49. P. 335-360.

160. Porath. J. Immobilized metal ion affinity chromatography. // Protein. Expr. Purif. 1992. V. 3.P. 263-281.

161. Janknecht R., de Martynoff G., Lou J., Hipskind R.A., Nordheim A., Stunnenberg H.G. Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus. // PNAS. 1991. V. 88. P. 8972-8976.

162. Chaga G., Bochkariov D. E., Jokhadze G. G., Hopp J., Nelson P. Natural poly-histidine tag for purification of recombinant proteins on cobalt(II)-carboxymethylaspartate crosslinked agarose. // J. Chromatography. 1999. V. 864. P. 247-256.

163. Chaga G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. //J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 49. P. 313-334.

164. Kumar A., Plieva F. M., Galaev I., Mattiasson B. Affinity fractionation of lymphocytes using a monolithic cryogel.//J. Immun. Meth. 2001. V. 283 (1-2). P. 185-194.

165. Lozinsky V. I., Galaev I. Yu., Plieva F. M., Savina I. N., Jungvid H., Mattiasson B. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest. // Trends in Biotechnol. 2003. V. 21 (10). P. 445-451.

166. Richins R. D., Mukhandani A., Chen W. Expression, immobilization, and enzymatic characterization of cellulose-binding domain-organophosphorus hydrolase fusion enzymes. // Biotechnol. Bioeng. 2000. V. 69 (6). P. 591-596.

167. Wu C.-F., Cha H. J., Valdes J. J., Bentley W. E. GFP-visualized immobilized enzymes: Degradation of paraoxon via organophosphorus hydrolase in a packed column. // Biotechnol. Bioeng. 2002. V. 77 (2). P. 212-218.

168. Wu C.-F., Valdes J. J., Bentley W. E. Effects of in situ cobalt ion addition on the activity of a GFP-OPH fusion protein: the fermentation kinetics. // Biotechnol. Prog. 2003. V. 17. P. 606611.

169. Hay R. W., Govan N. The CoN4(OH)(OH2).2+ (N4=trpn, cyclen and tren) promoted hydrolysis of the phosphotriester 2,4-dinitrophenyl diethyl phosphate. // Transition Met. Chem. 1998. V. 23. P. 721-725.

170. Meng Z., Yamazaki Т., Sode K. Enhancement of the catalytic activity of an artificial Phosphotriesterase using molecular imprinting technique. // Biotechn. Letters. 2003. V. 25. P. 1075-1080.

171. Zhu L., dos Santos O., Koo C.W., Rybstein M., Pape L., Canary J. Geometry-dependent phosphodiester hydrolysis catalysed by binuclear copper complexes. // Inorg. Chcm. 2003. V.42. P. 7912-7920.

172. Viladkar S., Kamaluddin N. M. Hydrolysis of 4-nitrophenyl phosphate by (amino acidato)zinc complexes. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993. V. 66. P. 2922-29261.

173. Freeman H.C., Guss J.M., Healy M.I., Martin R.P., Nockolds C.E., Sarkar B. The structure of a mixed amino-acid complex: L-histidinato-L-threoninatoaquocopper(II) hydrate. // Chem. Commun. 1969. V. 5. P. 225-226.

174. Breslow R. Bifunctional acid base catalysis by imidazole groups in enzyme mimics. // J. Mol. Catal. 1994. V. 91. P. 161-174.

175. Schatz J. Synthesis and characterization of imidazole-substituted calix4.arenes as simple enzyme-mimics with acyl-transferase activity. // Tetrahedron Lett. 2001. V. 42. P. 7837-7840.

176. Неорганическая биохимия под ред. Г. Эйхгорна, пер. с англ. М., Мир, 1978- Т.1

177. Yamazaki Т., Meng Z., Mosbach К., Sode К. A novel amperometric sensor for organophosphate insecticides detection employing polymer mimicking the active center of phosphotriesterase. // Electrochemistry. 2001b. V. 69. 969-972.

178. Liu H., Ho Y., Hsu Ch. Molecular simulations to determine the chelating mechanisms of various metal ions to the His-tag motif: a preliminary study. // J. Biomol. Struct. Dynamics. 2003. V. 21. P. 31-41.

179. Pojitkov A., Efremenko E. N., Varfolomeyev S. D. Unnatural amino acids in enzymes and proteins. // J. Molec. Catalysis B: Enzymatic. 2000. V. 10 (1-3). P. 47-55.

180. Varfolomeyev S. D., Aliev Т. K., Efremenko E. N. Postgenomic chemistry: New problems and challenges. // Pure Appl. Chem. 2004. V. 76 (9), P. 1781-1798.

181. Gueguen P., Padron M., Perbal В., Herve G. Incorporation of amino acid analogs during the biosynthesis of Escherichia coli aspartate transcarbamylase. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 615(1). V. 59-69.

182. Dominguez M.A., Thornton K.C., Melendez M.G., Dupureur C.M. Differential effects of isomeric incorporation of fluorophenylalanines into PvuII endonuclease. // Proteins. 2001. V. 45 (1). P. 55-61.

183. Варфоломеев С. Д., Ефременко Е. Н., Верхуша В. В., Вржещ П. В. Синтетические аналоги аминокислот в клетках и белках. // Вестник МГУ Сер. хим. 2000. Т. 41 (6). С. 352354.

184. Varfolomeyev S., Efremenko Е., Krupyanko P., Vijesch P. // in: Biocatalytic technology and nanotechnology, Ed. G.E. Zaikov, Nova Science Publishers, Inc., New York. 2004. P. 105.

185. Yoder N. C., Kumar K. N. Fluorinated amino acids in protein design and engineering. // Chem. Soc. Rev. 2002. V. 31(6). P. 335-341.

186. Gettins P. G. 1H- and 19F-NMR approaches to the study of the structure of proteins larger than 25 kDa. // Int. J. Biol. Macromol. 1994. V. 16 (5). P. 227-235.

187. Chartrain M., Salmon P. M., Robinson D. K., Buckland В. C. Metabolic engineering and directed evolution for the production of pharmaceuticals. // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 209-214.

188. Ishida H., Kyakuno M., Oishi S. Molecular design of functional peptides by utilizing unnatural amino acids: toward artificial and photo-functional protein. // Biopolymers. 2004. V. 76(1). P. 69-82.

189. Simonian A. L., Efremenko E. N., Wild J. R. Discriminative detection of neurotoxins in multi-component samples. //Anal. Chem. Acta. 2001. V. 444 (2). P. 179-186.

190. Клонирование ДНК. Методы, под ред. Гловера Д. 1988. М. Мир. С. 162

191. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование 1984, М.: Мир. С. 239.

192. Birnboim Н.С., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening. // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. P. 1513-1523.

193. Smith B. J. Protein sequencing protocols. // Humana Press. Totowa. 1997.

194. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248254.

195. Rappsilber J., Moniatte M., Nielsen M. L., Podtelejnicov A. V., Mann M. Experienses and perspectives of MALDI MS and MS/MS in proteomic research. // Int. J. Mass Spectrom. 2003. V. 226. P. 223-237.

196. Gottesman S., Halpern E., Trisler P. Role of sulA and sulB in filamentation by Ion mutants of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1981. V. 148 (1). P. 265-273.

197. Диксон M, Уэбб E.C., Ферменты, т. 2, 3 изд., Мир, Москва, 1982, гл. 8, с. 657.

198. Kim К., Cole Р.А. Kinetic analysis of a protein tyrosine kinase transition state in the forward and reverse directions. Hi. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 6851-6858.