Закономерности взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом и их использование при получении ферментсодержащих полимерных материалов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

Перминов Петр Анатольевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ХИТОЗАНА С ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ

02 00 06 - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ООЗ174402

Москва - 2007

003174402

Работа выполнена на кафедре аналитической, физической и коллоидной химии Московского государственного текстильного университета имени А Н Косыгина

Научный руководитель доктор химических наук

Кильдеева Н Р

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Зеленецкий А Н

доктор химических наук, профессор Варламов В П

Ведущая организация Институт элементоорганических

соединений им АН Несмеянова РАН

Защита диссертации состоится « 8ъ ноября 2007 года в УЛ часов на заседании диссертационного совета Д 212 139 01 при Московском государственном текстильном университете им А Н Косыгина по адресу 119071, Москва, Малая Калужская, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного текстильного университета им А Н Косыгина

Автореферат разослан « А » октября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук Зубкова Н С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка биологически активных полимерных систем с заданными свойствами имеет большое значение для создания новых материалов, предназначенных для применения в медицине, биотехнологии, экологии и других областях Полисахарид хитозан обладает комплексом уникальных свойств, таких как биосовместимость, гидрофильность, биологическая и сорбционная активность, биоразлагаемость Растворимость хитозана в разбавленных водных растворах кислот, наряду с волокно- и пленкообразующей способностью и наличием реакционно-способных аминогрупп облегчает модификацию этого полимера и переработку его в полимерные изделия

Модификация бифункциональными сшивающими реагентами, наиболее распространенным из которых является глутаровый альдегид (ГА), позволяет получить на основе хитозана пленки, микрокапсулы, гранулы, волокна, нерастворимые в воде, но обладающие высокой впагоудерживающей способностью гидрогели и композиционные материалы и зафиксировать в их структуре лекарственные соединения, ферменты и другие белки Несмотря на то, что ГА широко используется в различных областях, и в особенности в биохимии, не сформировалось единого мнения о механизме реакции ГА с белками, а тем более с хитозаном Изучение закономерностей взаимодействия хитозана с ГА позволит определить перспективы использования этой системы для получения новых материалов для биотехнологии и медицины, а также выбрать оптимальные условия их получения

Работа выполнена в соответствии с основными направлениями научных исследований кафедры аналитической, физической и коллоидной химии МГТУ в рамках госбюджетной темы N9 06-635-42 единого заказ-наряда Федерального агенства по образованию и гранта молодых ученых МГТУ, а также в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006гг» (Комплексный проект ЖС-КП 4/002),

Целью работы являлось установление закономерностей и формирование представлений о механизме взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом, и разработка на этой основе различных ферментсодержащих полимерных систем

Для достижения поставленной цели необходимо было изучить влияние рН на свойства растворов хитозана и ГА, провести квантовохимическое моделирование реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с различными формами ГА, изучить кинетику реакции сшивки хитозана ГА и кинетику гелеобразования в растворах хитозана в присутствии ГА, исследовать свойства образующихся гелей, а также разработать метод получения на основе гелеобразующих систем ферментсодержащих полимерных материалов

Научная новизна полученных результатов. В диссертационной работе впервые показано, что особенности реакции с ГА в растворах хитозана связаны с наличием равновесных форм ГА, соотношение между которыми может меняться в зависимости от рН, а также высокой степенью протонирования аминогрупп хитозана, снижающей их реакционную способность в реакции с карбонильными группами

Показано, что увеличение реакционной способности ГА в реакции с аминогруппами хитозана, наблюдаемое с ростом рН, связано с увеличением подвижности протона при соседнем с карбонильной группой атоме углерода, играющего ключевую роль в реакции альдольной конденсации, предшествующей образованию его а,р-ненасыщенных производных

На основании анализа значений тепловых эффектов реакции взаимодействия глкжозамина и триглюкозамина с различными формами ГА, полученных методом квантовохимического моделирования, установлено, что наиболее вероятным является взаимодействие депротонированных аминогрупп с сопряженными с ОС-связью карбонильными группами олигомерной формы ГА

Предложен механизм взаимодействия хитозана с ГА, заключающийся в образовании альдиминной связи, инициирующей рост олигомерной цепи на хитозане, и последующей межмолекулярной сшивке путем кротоновой конденсации олигомерных цепей модифицированного хитозана или (в зависимости от рН) взаимодействия с аминогруппами макромолекул немодифицированного хитозана

Установлена взаимосвязь состава ферментсодержащих гелеобразующих систем на основе хитозана или его сульфатированного производного, степени связывания белка и каталитических характеристик иммобилизованных в полимерных материалах различной физической формы ферментов трипсина и органофосфатгидролазы

Практическая значимость. Показана возможность использования реакции сшивки хитозана и его производных для получения ферментсодержащих полимерных систем разной физической формы (гидрогелей, пленок микрокапсул, волокнистых биокатализаторов) Разработан метод иммобилизации органофосфатгидролазы путем гелеобразования белоксодержащей композиции на основе сульфата хитозана и ГА, позволяющий сохранить до 70% активности фермента Разработка «Волокнистый биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксинов» получила Золотую медаль на Всероссийской выставке научно - технического творчества молодежи (Москва, ВВЦ, 2005г)

Исследование процесса сшивки хитозана ГА показало присутствие в образцах сшитого хитозана продуктов кротоновой конденсации ГА, содержащих карбонильные группы и С=С-связи, что заставляет рекомендовать исключить использование реакции с ГА для разработки материалов, контактирующих с живыми тканями

Публикации Основные результаты диссертации изложены в 12 печатных работах, в том числе, 1 патенте, 4 статьях в научных журналах, 8 -в сборниках статей и материалах конференций

Апробация работы Результаты работы были представлены на VII и VIII Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана » (СПб-Репино, 2003, Казань, 2006), XII Intemetional Workshop on bioencapsulation (Spain, Vitoria, 2004), Всероссийских научно-технических конференциях «Современные технологии и оборудование текстильной промышленности (Москва, 2004 и 2005), Международной научно-практической конференции «Современные энергосберегающие тепловые технологии» (Москва, 2005), XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2006),

III Всероссийской научной конференции «Фи-зико-химия процессов переработки полимеров» (Иваново, 2006), V Международной конференции «Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов» (Москва, 2006)

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 152 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 117 наименований Работа содержит 17 таблиц и 52 рисунка

Содержание работы Во введении дана общая характеристика работы, обоснована ее актуальность и сформулированы цели исследования Обзор литературы состоит из двух разделов первый посвящен использованию хитозана и его производных в процессах иммобилизации ферментов, второй раздел включает сведения о взаимодействии глутарового альдегида с аминокислотами, белками и другими полимерами В методическом разделе приведены характеристики исходных соединений, описаны способы получения полимерных материалов на основе хитозана и ГА и методы исследования, включающие УФ- и ИК-спектроскопию, ЯМР-спектроскопию, электронную сканирующую микроскопию, методы ядерной магнитной релаксации и квантово-химического моделирования, реологический и физико-механический методы, кинетические методы определения ферментативной активности

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Закономерности процесса сшивки хитозана глутаровым альдегидом

Взаимодействие белков и других аминосодержащих полимеров с ГА происходит при комнатной температуре и в физиологическом интервале рН, т е в условиях, исключающих денатурацию белка, и является перспективным методом получения иммобилизованных препаратов таких конформационно-чувствительных биологически активных соединений как ферменты Традиционные представления объясняют рН-зависимость реакции сшивки белков ГА снижением реакционной способности протонированных аминогрупп в реакции с карбонильными группами

рН 2%-го раствора хитозана в 2%-ной уксусной кислоте составляет 4,1 Степень протонирования аминогрупп при этом рН а=0,9, те только 10% аминогрупп наиболее реакционноспособны в реакциях нуклрофильного присоединения Увеличить число депротонированных аминогрупп в растворе хитозана возможно добавлением NaOH в количестве, не приводящем к осаждению полимера Для определения рН-пределов растворимости хитозана разной молекулярной массы эквиконцентрированные (2%-ные) растворы хитозана в 2%-ной уксусной кислоте были турбодиметрически оттитрованы раствором NaOH с определением рН точки помутнения Результаты титрования показали, что область рН-стабильности растворов хитозана увеличивается с уменьшением его молекулярной массы (рис1) Добавление 0,5М раствора NaOH в раствор хитозана с ММ 180 кДа до рН=5,6 позволяет, сохранив гомогенность раствора, увеличить до 47% число депротонированных аминогрупп

7,5

7 -

ir о н

К

6,5 -

6 -

5,5

0,5

1 1,5 %(ММ),[кДа]

2,5

Рис 1 - Зависимость рН точки помутнения 2%-ных растворов хитозана в 2%-ной уксусной кислоте при титровании раствором NaOH от молекулярной массы хитозана

фирмы Merck при рН 3,1, соответствующем водного раствора, рН 4,1, соответствующем рН 2%-го раствора хитозана в

Величина рН может влиять на равновесие между разными формами ГА в его водных растворах линейным мономерным диальдегидом и его гидратами, циклическим полуацеталем, а также олигомерными продуктами альдольной и кротоновой конденсации (схема 1), а следовательно, и на реакционную способность ГА в его реакции с аминогруппами хитозана Для формирования представлений о возможном механизме реакции ГА с аминогруппами хитозана

методом ЯМР-спектроскопии были изучены растворы ГА рН коммерческого 25%-го

В 13С ЯМР-спектрах обнаруживает ся 17

сигналов атомов углерода Сложный

(1) характер

спектров объяснется присутствием в растворе приведенных на схеме 1 пяти основных форм ГА (А -Е) По данным интегрирован ия 1Н-ЯМР-спектров при рН 3

соотношение форма Е форма О свободный альдегид (формы А и В) гидратированный альдегид (формы В и С) составляет 1 1 12 1 63 0 87, практически такое же соотношение наблюдается рН 4 2 - 1 1 50 1 56 0 97, а при рН 5 6 - 1 2 02 2 09 1 38, содержание форм А, В и С существенно выше, чем циклических продуктов ОиЕ

но.

А ОН НО' В он с

D CIS Е trans

nn

Ho^r'NrVNjH

F G

н

На основании результатов ЯМР-спектроскопии на 1Н и 13С нельзя утверждать о присутствии а,р-ненасыщенных производных ГА (схема 1,продукты альдольной в и кротоновой Н конденсаций) в растворах ГА в количестве, большем 2-4% даже при рН 5,6 Однако, данные 1Н и 13С ЯМР-спектров показывают увеличение подвижности протона при соседнем с карбонильной группой атоме углерода при рН 5 6 И этот факт указывает на увеличение в этих условиях реакционной способности ГА в реакции альдольной конденсации, предшествующей образованию , его а,р-ненасыщенных производных Действительно результаты УФ-спектроскопии растворов ГА показывают медленный рост оптической плотности во времени в области А=230-240 нм, соответствующей поглощению С=С-связей, сопряженных с карбонильными группами, при рН 5,6 и 7,0, который не наблюдается при 4,1

Для установления наиболее реакционноспособной формы ГА в реакции с аминогруппами хитозана с использованием методов квантово-химического моделирования был проведен расчет энтальпий образования глюкозамина, остатком которого является мономерное звено хитозана, пяти различных форм ГА, а также продуктов их взаимодействия с протонированной и депротонированной аминогруппами глюкозамина В качестве критерия оценки вероятности протекания реакции был использован ее тепловой эффект, который рассчитывали по следствию из закона Гесса АгН = -£АНчюд

Тепловые эффекты реакций взаимодействия глюкозамина, содержащего как депротонированную, так и протонированную аминогруппу, с мономерным ГА в его линейной негидратированной форме и форме полуацеталя, рассчитанные с помощью обеих программ, оказались положительными, что указывает на низкую реакционную способность этих

ГА приводит к повышению его реакционной способности в реакции с

аминогруппой глюкозамина (ДГН = -16,5 кДж/моль), что может быть обусловлено изменением величины положительного заряда на атоме углерода карбонильной

группы Наиболее устойчивые основания Шиффа образует олигомерный продукт кротоновой конденсации ГА, взаимодействующий с 1МН2-группой глюкозамина по карбонильной группе, находящейся в сопряжении с двойной связью (схема 2), что является следствием эффекта резонанса Однако результаты расчетов свидетельствуют о более низкой вероятности

форм Гидратирование одной или двух карбонильных групп

>/ I

сгп

(2)

образования азометинов с протонированой аминогруппой глюкозамина Очевидно, при протонировании аминогруппы такая реакция трудно осуществима, так как вакантная электронная пара азота, занятая протоном, уже не может быть электронодонором и проявляет более слабые нуклеофильные свойства в реакции присоединения, чем депротонированная Для изучения кинетики реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с ГА методом УФ-спектроскопии при рН 4,1был использован хитозан с ММ 3 кРа„ растворимый в воде во всем диапазоне рН (рис 2)

Образование продуктов

конденсации хитозана с ГА сопровождается увеличением поглощения в широкой области

длин волн Возникновение области 260-300 связано с азометинов (Лс=м: того область

200-300 нм максимума в нм в основном образованием =272 нм), кроме Л=285 нм

200 220

240 ,260 280 л, нм

300 320 340

Рис 2- УФ-спектры совместного раствора хитозана (3 кДа) и ГА (3-7) (ГА/ЫН2=2,0 моль/моль, рН 4,1) 1 - спектр ГА, 2 -спектр хитозана, 3-12 мин, 4-30 мин, 5 - 45 мин, 6-90 мин, 7 - 900 мин

соответствует поглощению

карбонильных групп, сопряженныж с С=С-связями В пользу

появления структур -С-С-СНО, наряду с альдиминовыми связями, свидетельствует спектр,

полученный через 15 часов после начала реакции (спектр 7, рис 2), на котором заметно, что увеличение поглощения в диапазоне длин волн А=260-300 нм является результатом наложения двух максимумов,

соответствующих областям

поглощения соединений,

содержащих эти структуры и основания Шиффа Эти факты, а также появление на спектре 7 (рис 1) в области Л=230 нм выраженного плеча максимума поглощения С=С-связей, сопряженных с карбонильной группой, могут объясняться помимо очевидного увеличения во времени концентрации альдиминных связей вследствие конденсации карбонильных групп ГА и депротонированных аминогрупп хитозана увеличением концентрации продуктов фотоновой конденсации ГА, протекающей параллельно с образованием оснований Шиффа

Растворы хитозана с ММ 180 кДа с концентрацией ,1,3% и рН 4,1 и рН 5,6 были использованы для изучения влияния условий реакции на скорость гелеобразования в присутствии ГА Время гелеобразования закономерно уменьшалось с ростом соотношения rA/NH2, причем при рН 5,6 оно было существенно меньше, чем при рН 4,1, что особенно заметно при низких концентрациях ГА в реакционной смеси (рис 3) Уменьшением соотношения TA/NH2 при рН 4,1 до 1 моль/моль можно увеличить время гелеобразования в

системе до суток Увеличение молекулярной массы хитоэана приводит к уменьшению времени гелеобразования в эквиконцентрированных растворах Переход от псевдопластической жидкости к пространственно-сшитой структуре геля, происходящий в растворе хитозана в присутствии ГА, соответствует завершению гелеобразования, но не реакции сшивки хитозана ГА Об этом свидетельствует кинетика измечения модуля упругости гелей, полученных в разных условиях (рис 4) Рост модуля упругости во времени указывает на образование дополнительных сшивок, фиксирующих структуру геля

Время, мин

Рис 3 - Зависимость времени Рис 4 - Кинетика изменения модуля гелеобразования в растворе хитозана и упругости гелей хитозана, сшитых ГА ГА от соотношения rA/NH2 Концентрация Соотношение TA/NH2 2,5 (1), 1,0 (2,3,5), раствора хитозана 1,31 %, ММ хитозана 0,4 (4) и рН 4,1 (1-3) и 5,6 (4,5) 180 кДа, рН 4,1 (1) и 5,6 (2) Концентрация хитозана в реакционной

смеси 1,31% (1,2,4,5) и 1,9% (3) Если допустить, что в реакции сшивки глутаровым альдегидом принимают участие две его карбонильные группы, то теоретически возможная модификация аминогрупп бифункциональным сшивающим реагентом должна быть достигнута при эквимольном соотношении альдегидных групп ГА и аминогрупп хитозана, что с учетом степени протонирования соответствует соотношению ГА/ЫН2 0,24 моль/моль рН 5,6, а при 4,1 - 0,05 моль/моль 0,5 Однако изучение кинетики изменения вязкости в растворах хитозана в присутствии ГА и изменения модуля упругости гелей обнаружило рост этих показателей при увеличении содержания ГА в системе свыше 0,4 моль/моль Эти результаты свидетельствуют о более сложном механизме взаимодействия аминогрупп хитозана с ГА

Учитывая установленный нами состав растворов ГА при различном рН и результаты теоретических расчетов теплот реакций взаимодействия модельных соединений с различными формами ГА, можно предположить, что первой стадией процесса сшивки является образование оснований Шиффа в результате взаимодействия депротонированных аминогрупп хитозана с моно- или дигидратированной формой ГА с образованием продукта (схема 3)

OCH-(CH2)3-CH=N-Chitosan (3)

Образование оснований Шиффа однозначно подтверждается результатами ИК-спектроскопии (рис 5) Наиболее существенные изменения в спектрах сшитых образцов наблюдаются в области 3000-2800 см"1 и 1700-

Рис 5 - Фурье ИК-спектры образцов хитозана (1) и хитозана, сшитого ГА (2-4) 1 - исходный хитозан, 2-4 - хитозан, сшитый ГА при рН 4,1 (2) и 5,6 (3, 4) и соотношении ГА/ЫН2 0,4 (2, 3) и 2,5 (4) моль/моль

О наличии азометиновой группы в продукте взаимодействия хитозана с ГА следили по пику валентных колебаний связи С=1Ч, который благодаря высокому коэффициенту экстинкции легко обнаруживается в приведенных спектрах на частоте 1634 см'1 С увеличением числа протонированных аминогрупп в хитозане (увеличение рН с 4,1 до 5,6) интенсивность этого пика возрастает

Известно, что альдиминные связи в основаниях Шиффа неустойчивы и легко гидролизуются в водной, а тем более в кислой среде, что не происходит в продуктах взаимодействия хитозана и ГА Учитывая уже отмечавшееся отсутствие значимых концентраций продуктов кротоновой конденсации ГА можно предположить, что резонансные структуры, стабилизирующие продукт взаимодействия хитозана с ГА, возникают в последующих стадиях реакции сшивки хитозана По-видимому, образование альдиминной связи активирует присоединенную молекулу ГА, и инициирует рост олигомерной цепи за счет избыточного содержания ГА в растворе (схема 4). В пользу этого свидетельствуют полосы поглощения альдегидных групп в ИК-спектрах продуктов взаимодействия хитозана и ГА при 1706 см"1, а также увеличение ее интенсивности с ростом концентрации ГА (рис 5) Эта полоса появляется только в образцах хитозана, сшитого при более высоком значении рН (5,6), при котором, как было показано, возрастает подвижность протона, находящегося в а-положении к карбонильной группе и играющего ключевую роль в реакции альдольной конденсации

Дальнейшие превращения с образованием уже сшитого продукта могут происходить путем конденсации аминогрупп хитозана с карбонильными группами модифицированного хитозана (схема 5) или путем альдольной и

кротоновой конденсации олигомерных цепрй модифицированного хитозана (схема 6) Результаты ИК-спектроскопии не исключают возможность

получения как

(ОН)2НС-(СН2)з-<

НС=М-сМозап СН2-(СН2)2-СНО

ОН НС=М—СМовап (ОН)2НС-(СН2)з-СН—СН-(СН2)2—сно

-н2о

НС=М—СЬЛовап (ОН)2НС—(СН2)з-СН=С—(СН2)2—сно

н2о

-н2о

НС—N—СЬ^оэап ОСН—(СН2)3-СН=С—(СН2)2~СНО

продукта, как согласно схеме 5, так и схеме 6 Однако как увеличение числа

альдегидных групп в образце сшитогр' при высокой концентрации ГА хитозана (спектр 4, рис 5), так и рост (4) модуля упругости геля, полученного в аналогичных условиях (рис 4),

свидетельствует о том, что при избытке ГА и рН 5,6 в реакционной смеси

вероятнее образование соединения(4)

НС=Ы—СМовап СМоадп—МН2 + ОСН—(СН2)3—СН=С—(СН2)2-СНО

-н2о

СМОБап—Ы=СН—(СН2)3—СН=С-(СН2)2—СНО

НС=И—СМовап

Следует отметить, что длина олигомерных цепей в модифицированном

(5) или сшитом хитозане может быть различной, поэтому химическое строение

продуктов взаимодействия хитозана с ГА, в особенности полученных в разных

(6) условиях, может сильно различаться С уменьшением рН длина олигомерных цепей и,

соответственно, число карбонильных групп должны уменьшаться, что подтверждается результатами ИК-спектров хитозана, сшитого ГА при 4,1

Равновесная степень набухания сшитых систем, образующихся в результате гелеобразования в растворах хитозана в присутствии ГА, в зависимости от условий их получения изменяется в несколько раз и может достигать 11000% Увеличение степени сшивки при росте соотношения ГА/ЫН2 и числа депротонированных аминогрупп (с увеличением рН) приводит к синерезису геля и сопровождается выделением некоторого • количества воды Набухший гель хитозана, сшитого ГА, имеет высокопористую структуру, характеризующуюся замкнутыми порами размером 50-100 мкм (рис 6а) Удаление воды при высушивании приводит к контракции пор и

нс=м—СМоБап )

2 ОСН—(СН2)3— СН=С—(СН2)2—СНО

-н,о

НС=Ы—СМовап

I

ЭН)2НС—(СН2)з—сн=с—сн2—с=сн ОНС (СН2)2

ОСН—(СН2)з—СН—С—СН=М—СМовап

уменьшению их размеров (рис. 66). В процессе сушки при 40°С & результате релаксационных процессов происходит переход структуры сшитого полимера в равновесное состояние, характеризующееся меньшей {выше чем на порядок) злага удержи вающей способностью.

Рис, 6 - Микрофотографии сколов геля 6) - гель после высушивания при 40°С

6)

хитозана, сшитого ГА. а) — набухший гель;

2 Получение ферментсодержащих полимерных материалов на основе хитозана с использованием реакции сшивки ГА

Изучение взаимодействия аминогрупп хитозана с ГА и гелеобразования в растворах хитозана, являющегося результатом сшивки ГА, показало, что исследуемый процесс позволяет в широких вредела* регулировать время гепеобразования и свойства формирующихся систем, и это явилось предпосылкой для разработки различных форм полимерных материалов, в том числе содержащих иммобилизованные ферменты. Установленные а работе закономерности были использованы для получения микрокапсул, пленок, гидрогелей и волокнистых б и о катал иза торов.

Микрокапсулы получали методам высокочастотного разбиения струи на установке, сконструированной в лаборатории криогенной техники Московского энергетического института. Капсулы формовали из растворов хитозана, содержащих ГА и трипсин, в теплое (40°С) растительное масло и после промывки исследовали изменение активности полученных микрокапсул при многократном гидролизе специфического субстрата. Показано, что скорость гидролиза А^бензоил-Ь-аргинина в течение семи циклов практически не изменялась, что свидетельствует о необратимой иммобилизации трипсина.

Система раствор хитозана - ГА может быть использована для получения высоконабухающих пленок, при этом полимерная пленка может быть сформирована не только на твердой подложке, но и на любой другой поверхности, например, на волокне или ткани. Для иммобилизации ферментов органефосфатпедролазы и трипсина был выбран метод, заключающийся в формировании на поверхности хлопчатобумажной бязи тонкой гелеобразной ферментсодержащей полимерной пленки. В качестве пленкообразующих полимеров испопьзават хитозан и сульфат хитозана (СХ). Выбор сульфата хитозана обусловлен его растворимостью е широком диапазоне рН.

Триэфиры ортофосфорной кислоты, используемые как пестициды и инсектициды, а также в качестве боевых отравляющих веществ, по характеру токсикологического действия относятся к нейротоксинам Проблема их детоксикации является крайне актуальной Ключевым ферментом в процессе биодеструкции, катализирующим гидролиз фосфорэфирной связи в ортофосфатах, является органофосфатгидролаза (ОФГ) Волокнистые материалы, содержащие иммобилизованную ОФГ, могут быть использованы для удаления и детоксикации следов нейротоксинов с поверхности оборудования, а также в качестве средства гигиены и индивидуальных средств защиты (салфетки, респираторы) Разработка и изучение свойств волокнистого биокатализатора, содержащего иммобилизованную ОФГ, проведены в рамках совместных исследований с научной группой Е Н Ефременко (кафедра химической энзимологии Химического факультета МГУ имени М В Ломоносова) 4

Активный центр ОФГ содержат ионы Со3+ и координационную воду, поэтому носитель должен обладать влагоудерживающей способностью, а условия иммобилизации ограничены величиной рН>7,5 Это явилось причиной низкой активности ОФГ (7-8% активности нативного фермента), иммобилизованной на бязи с использования композиций на основе растворов хитозана Эквиконцентрированные растворы СХ (Мм 120 кДа) из-за более низкой молекулярной массы, а также благодаря наличию в его макромолекулах S03H-rpynn значительно менее структурированы по сравнению с растворами хитозана, что позволило использовать концентрацию раствора, а не рН в качестве параметра для варьирования времени гелеобразования в процессе сшивки ГА (рис 7)

При выбранном составе композиции была изучена эффективность иммобилизации различных количеств ОФГ в гелях СХ с использованием бязи в качестве подложки (рис 8) Было показано, что в то время как активность биокатализаторов на основе СХ при увеличении количества вводимого белка возрастает, эффективность иммобилизации снижается вследствие увеличения влияния диффузионных факторов на гетерогенно-каталитическую реакцию Постоянство значений

эффективности иммобилизации при введении свыше 0,4 мг белка на 1 г катализатора связано с десорбцией фермента из биокатализатора

3

t п а

160 Í140 j" 120 И 00 80 60 40

8. 20 и

о

3456789 10 Концентрация сульфата хитозана, %

Рисунок

7 - Зависимость времени гелеобразования от концентрации СХ (рН 8,0, соотношение fA/NH2 0,24 моль/моль)

■60

50

40 -

30

20

^ Ю СО

О

о

• •

В результате

проведенных исследований был выбран состав композиций на основе 7%-го раствора СХ (рН 8,0) при мольном соотношении ГА/МН2 0,24 моль/моль и 0,3 мг наносимого белка на 1 г бязи Определены кинетические параметры

реакций гидролиза различных субстратов параоксона,

паратиона, кумафоса и хлорпирифоса, катализируемых иммобилизованным препаратом ОФГ (таблица 1) Значения Км

иммобилизованного фермента, полученные для различных субстратов, были выше аналогичных параметров для формы ОФГ, что следствием диффузионных ограничений, обусловленных наличием пространственных затруднений для диффузии субстратов и продуктов реакции в объеме геля, а также наличием сильнозаряженных групп носителя

Таблица 1 - Кинетические параметры реакции гидролиза различных субстратов, катализируемой препаратами растворимой и иммобилизованной ОФГ

2 4 6

Масса введенной ОФГ, мг/г

8

Рис 8 - Зависимость эффективности иммобилизации от массы вводимой ОФГ для препаратов тканевого биокатализатора, полученных на основе СХ

растворимой является

Субстрат Растворимая форма ОФГ Иммобилизованная форма ОФГ

Км, мМ Vmax, мкМ/мин Утах/ Км *10"3, мин"1 Км, мМ Углах, мкМ/мин Vmax/ Км *10"3 мин

Параоксон 0,46±0,03 32,1 ± 1,2 70 ± 2,5 1,36+0,07 21,31+0,8 15,8 ±0,1

Паратжш 1,54±0,05 9,7 ±0,5 6,3 ± 1,0 3,43 ±0,1 6,42 ± 0,3^ 1,9 ±0,3

Кумафос 1,58±0,06 9,4 ±0,4 5,9 + 1,5 5,71 ±0,2 6,21 ± 0,4 1,1 ±0,2

Хпорпири-фос 1,59±0,04 9,1 ±0,4 5,7 ±1,0 4,71 + 0,4 6,19 ±0,6 1,3 ±0,2

Таким образом, показана возможность использования разработанного препарата иммобилизованной ОФГ для детоксикации фосфорорганических нейротоксинов путем гидролиза эфирной связи в триэфирах ортофосфорной кислоты

выводы

1 Установлены закономерности процесса сшивки хитозана ГА, показано, что основным фактором, влияющим на механизм реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с ГА и характер гелеобразования в растворах хитозана в присутствии ГА, является концентрация ионов водорода

2 Установлено соотношение между равновесными молекулярными формами в растворах ГА при различных рН, соответствующих рН растворов хитозана, при этом не обнаружено значимых концентраций продуктов альдольной и кротоновой конденсации диальдегида

3 С использованием квантово-химических расчетов показано, что наиболее вероятным процессом при взаимодействии хитозана с ГА является образование оснований Шиффа депротонированными аминогруппами хитозана с сопряженными с С=С-связью карбонильными группами олигомерной формы ГА Из мономерных форм наиболее реакционноспособная форма - линейный гидрат ГА

4 Предложен механизм сшивки хитозана ГА Установлено, что увеличение реакционной способности ГА в реакции с аминогруппами хитозана, скорости гелеобразования в растворах хитозана и модуля упругости геля при увеличении рН и соотношения ГА - аминогруппа связаны как с уменьшением степени протонирования аминогрупп, так и с изменением механизма сшивки хитозана ГА

5 Получены гидрогели хитозана, способные удерживать до 10000% воды, удаление которой при высушивании приводит к релаксационным процессам и резкому снижению способности к набуханию

6 Показана возможность использования реакции сшивки хИтозана или сульфата хитозана ГА для получения ферментсодержащих микрокапсул, гелей, пленок и волокнистых биокатализаторов Получены образцы с

I высокой стабильностью, сохраняющие до 70-100% активности нативного 1 фермента Показана эффективность применения биокатализатора, содержащего органофосфатгидролазу для детоксикации фосфорорганических нейротоксинов

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1 Перегудов А А , Перминов П А , Филиппова H В , Ефременко Е H , Кильдеева H Р Разработка новых форм биокатализаторов для деградации фосфорорганических нейротоксинов/ В сб научных трудов молодых ученых «Современные проблемы биологии, экологии и химии» - Ярославль - 2003 -С 169-172

2 Кильдеева H Р, Вихорева Г А, Ефременко Е H, Перминов П А Использование хитозана и его производных для иммобилизации белков/ Мат-лы Седьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» - M , ВНИРО - 2003 - С 395-398

3 Peregudov А , Kildeeva N , Permmov Р , Vikhoreva G , Efremenko E Chitosan gels with entrapped enzyme hydrolyzing pesticides and chemical warfare agents/ Mater XII Inter Workshop on bioencapsulation - Spain, Vitoria -2004 -P 230-233

4 Ефременко E H, Перегудов A A, Кильдеева H P, Перминов П А, Варфоломеев С Д Способ получения биокатализатора и биокатализатор для гидролиза фосфорорганических соединений/ Патент РФ № 2261911 2005 Приоритет от 18 03 2004

5 Миронов А В , Бухаров А В , Кильдеева H Р , Перминов П А Получение микрокапсул на основе хитозана методом вынужденного капиллярного распада струи/ В сб трудов II Международной научно-фактической конференции «Современные энергосберегающие технологии» (СЭТТ-2005) -М,МЭИ -2005 -т 1 -С 391-392

6 Efremenko Е , Peregudov А , Kildeeva N , Perminov P, Varfolomeyev S New enzymatic immobilized biocatalysts for detoxification of organophosphorus compounds//Biocatalysis and Biotransformation -2005 -V 23(2) - P 103-108

7 Никоноров В В, Перминов П А, Кильдеева Н Р Закономерности структурообразования в растворах хитозана в присутствии сшивающего реагента для получения волокнистых биокатализаторов// Хим волокна - 2006 - №2 - С 9-11

8 Кильдеева Н Р , Вихорева Г А , Гальбрайх Л С , Миронов А В , Бонарцева Г А , Перминов П А, Ромашова А Н Получение биодеградируемых пористых пленок для использования в качестве раневых поьрытий// Прикладная биохимия и микробиология -2006 -т 42 - №6 - С 716-720

9 Перминов П А, Кильдеева Н Р , Вихорева Г А, Владимиров J1 В , Акопова Т А , Бабак В Г Изучение взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом/ Мат-лы Восьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» - Казань -2006 - С 119-122

10 Перминов П А , Миронов А В , Ромашова А Н , Никоноров В В Исследование полимерных систем - носителей биологически активных компонентов и разработка на их основе текстильных композиционных материалов/ В сб научных трудов, выполненных по итогам конкурса фантов молодых исследователей «ГРАНТ-2005» - М , МГТУ - 2006 - С 3-8

11 Кильдеева Н Р , Вихорева Г А , Владимиров J1 В , Тимофеева Л М , Перминов П А Биологически активные системы на основе сшитого хитозана/ В сб статей XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем», ч 1 - 2006 - С 384-390

12 Перминов П А , Кильдеева Н Р , Тимофеева Л М , Абронин И А, Бабак В Г , Никоноров В В Структурообразование в растворах хитозана в присутствии сшивающего реагента при получении биологически активных полимерных материалов// Известия ВУЗов (Химия и химическая технология) - 2007 - т 50 -вып 3-С 53-56

i

/

Подписано в печать 03 10 07 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ Услпечл 1,0 Заказ 349 Тираж 80 МГТУ им АН Косыгина, 119071, Москва, ул Малая Калужская, 1

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

X. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1-1 Хитозан и его производные в процессах иммобилизации ферментов

1.2 Взаимодействие глутарового альдегида с аминосодержащими полимерами.

2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Реактивы.

2.3 Методы исследования.

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Закономерности процесса сшивки хитозана ГА.

3.1.1 Влияние рН на равновесие в растворах хитозана и глутарового альдегида.

3.1.2 Квантовохимическое моделирование реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с глутаровым альдегидом.

3.1.3 Изучение кинетики взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом.

3.1.4 Обсуждение механизма взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом.

3.1.5 Изучение свойств гелей хитозана, сшитого глутаровым альдегидом.

3.1.6 Изучение процесса сшивки хитозана глутаровым альдегидом в присутствии белка.

3.2 Получение ферментсодержащих полимерных материалов на основе хитозана с использованием реакции сшивки ГА.

3.2.1 Получение микрокапсул на основе хитозана, сшитого ГА.И

3.2.2 Иммобилизация ферментов на тканевом носителе с использованием гелеобразующих систем на основе хитозана.

3.2.2.1 Изучение иммобилизации органофосфатгидролазы на волокнистом материале с использованием полимерных композиций на основе хитозана.

3.2.2.2 Использование гелеобразующих систем на основе хитозана и сульфата хитозана для получения волокнистого биокатализатора, содержащего трипсин.

3.2.3 Использование гелеобразования в системе хитозан-ГА для модификации фермента при получении пленок на основе полигидроксибутирата.

ВЫВОДЫ.

Актуальность темы. Разработка биологически активных полимерных систем с заданными свойствами имеет большое значение для создания новых материалов предназначенных для применения в медицине, биотехнологии, экологии и другго областях. Полисахарид хитозан обладает комплексом уникальных свойств, таких кар биосовместимость, гидрофильность, биологическая и сорбционная активность, биоразлагаемость. Растворимость хитозана в разбавленных водных растворах кислот наряду с волокно- и пленкообразующей способностью и наличием реакционно-способных аминогрупп облегчает модификацию этого полимера и переработку его е полимерные изделия.

Модификация бифункциональными сшивающими реагентами, наиболее распространенным из которых является глутаровый альдегид (ГА), позволяет получить на основе хитозана пленки, микрокапсулы, гранулы, волокна, нерастворимые в воде, но обладающие высокой влагоудерживающей способностью гидрогели и композиционные материалы и зафиксировать в их структуре лекарственные соединения, ферменты и другие белки. Несмотря на то, что ГА широко используется в различных областях, и в особенности в биохимии, не сформировалось единого мнения о механизме реакции ГА с белками, а тем более с хитозаном. Изучение закономерностей взаимодействия хитозана с ГА позволит определить перспективы использования этой системы для получения новых материалов для биотехнологии и медицины, а также выбрать оптимальные условия их получения.

Работа выполнена в соответствии с основными направлениями научных исследований кафедры аналитической, физической и коллоидной химии МГТУ в рамках госбюджетной темы № 06-635-42'единого заказ-наряда Федерального агенства по образованию и гранта молодых ученых МГТУ, а также в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006гг.» (Комплексный проект ЖС-КП.4/002).

Целью работы являлось установление закономерностей и формирование представлений о механизме взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом, и разработка на этой основе различных ферментсодержащих полимерных систем.

Для достижения поставленной цели необходимо было изучить влияние рН на свойства растворов хитозана и ГА, провести квантовохимическое моделирование реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с различными формами ГА, изучить кинетику реакции сшивки хитозана ГА и кинетику гелеобразования в растворах хитозана в присутствии ГА, исследовать свойства образующихся гелей, а также разработать метод получения на основе гелеобразующих систем ферментсодержащих полимерных материалов.

Научная новизна полученных результатов. В диссертационной работе впервые показано, что особенности реакции с ГА в растворах хитозана связаны с наличием равновесных форм ГА, соотношение между которыми может меняться в зависимости от рН, а также высокой степенью протонирования аминогрупп хитозана, снижающей их реакционную способность в реакции с карбонильными группами.

Показано, что увеличение реакционной способности ГА в реакции с аминогруппами хитозана, наблюдаемое с ростом рН, связано с увеличением подвижности протона при соседнем с карбонильной группой атоме углерода, играющего ключевую роль в реакции альдольной конденсации, предшествующей образованию его а,р-ненасыщенных производных.

На основании анализа значений тепловых эффектов реакции взаимодействия глкжозамина и триглюкозамина с различными формами ГА, полученных методом квантовохимического моделирования, установлено, что наиболее вероятным является взаимодействие депротонированных аминогрупп с сопряженными с С=С-связью карбонильными группами олигомерной формы ГА.

Предложен механизм взаимодействия хитозана с ГА, заключающийся в образовании альдиминной связи, инициирующей рост олигомерной цепи на хитозане, и последующей межмолекулярной сшивке путем кротоновой конденсации олигомерных цепей модифицированного хитозана или (в зависимости от рН) взаимодействия с аминогруппами макромолекул немодифицированного хитозана.

Установлена взаимосвязь состава ферментсодержащих гелеобразующих систем на основе хитозана или его сульфатированного производного, степени связывания белка и каталитических характеристик иммобилизованных в полимерных материалах различной физической формы ферментов трипсина и органофосфатгидролазы.

Практическая значимость. Показана возможность использования реакции сшивки хитозана и его производных для получения ферментсодержащих полимерных систем разной физической формы (гидрогелей, пленок микрокапсул, волокнистых биокатализаторов). Разработан метод иммобилизации органофосфатгидролазы путем гелеобразования белоксодержащей композиции на основе сульфата хитозана и ГА, позволяющий сохранить до 70% активности фермента. Разработка «Волокнистый биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксинов» получила Золотую медаль на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, ВВЦ, 2005 г).

Исследование процесса сшивки хитозана ГА показало присутствие в образцах сшитого хитозана продуктов кротоновой конденсации ГА, содержащих карбонильные группы и С=С-связи, что заставляет рекомендовать исключить использование реакции с ГА для разработки материалов, контактирующих с живыми тканями.

Публикации Основные результаты диссертации изложены в 12 печатных работах, в том числе, 1 патенте, 4 статьях в научных журналах, 8 - в сборниках статей и материалах конференций.

Апробация работы Результаты работы были представлены на: VII и VIII Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана » (СПб-Репино, 2003; Казань, 2006), XII Internetional Workshop on bioencapsulation (Spain, Vitoria, 2004), Всероссийских научно-технических конференциях «Современные технологии и оборудование текстильной промышленности (Москва, 2004 и 2005), Международной научно-практической конференции «Современные энергосберегающие тепловые технологии» (Москва,

2005), XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2006), III Всероссийской научной конференции «Физико-химия процессов переработки полимеров» (Иваново, 2006), V Международной конференции «Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов» (Москва,

2006).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, обсуждения

ВЫВОДЫ

1. Установлены закономерности процесса сшивки хитозана ГА; показано, что основным фактором, влияющим на механизм реакции взаимодействия аминогрупп хитозана с ГА и характер гелеобразования в растворах хитозана в присутствии ГА, является концентрация ионов водорода.

2. Установлено соотношение между равновесными молекулярными формами в растворах ГА при различных рН, соответствующих рН растворов хитозана, при этом не обнаружено значимых концентраций продуктов альдольной и кротоновой конденсации диальдегида.

3-. С использованием квантово-химических расчетов показано, что наиболее вероятным процессом при взаимодействии хитозана с ГА является образование оснований Шиффа депротонированными аминогруппами хитозана с сопряженными с С=С-связью карбонильными группами олигомерной формы ГА. Из мономерных форм наиболее реакционноспособная форма - линейный гидрат ГА.

4. Предложен механизм сшивки хитозана ГА. Установлено, что увеличение реакционной способности ГА в реакции с аминогруппами хитозана, скорости гелеобразования в растворах хитозана и модуля упругости геля при увеличении рН и соотношения ГА - аминогруппа связаны как с уменьшением степени протонирования аминогрупп, так и с изменением механизма сшивки хитозана ГА.

5. Получены гидрогели хитозана, способные удерживать до 10000% воды, удаление которой при высушивании приводит к релаксационным процессам и резкому снижению способности к набуханию.

6. Показана возможность использования реакции сшивки хитозана или сульфата хитозана ГА для получения ферментсодержащих микрокапсул, гелей, пленок и волокнистых биокатализаторов. Получены образцы с высокой стабильностью, сохраняющие до 70-100% активности нативного фермента. Показана эффективность применения биокатализатора, содержащего органофосфатгидролазу для детоксикации фосфорорганических нейротоксинов.

1. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука, 2002. - 368 с.

2. Quitina у Quitosano: obtencion, caracterization у aplicationes. / Editora: Ana Pastor de Abram. // Fondo Editorial, 2004.

3. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 400 с.

4. Ueno Н., Mori Т., Fudjinaga Т. Topical formulations and wound healing applications of chitosan // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2001. - v. 52. - № 2. - p. 105-115.

5. Krajewska B. Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review // Enzyme and Microbial Technology. 2004. - 35 (2-3). - p. 126-139.

6. Вихорева Г.А., Гальбрайх JI.C. Пленки и волокна на основе хитина и его производных // В кн. «Хитин и хитозан: получение, свойства и применение», М.: Наука, 2002, с. 254-279.

7. Е.А. Марквичева. Хитозан и его производные в биоинкапсулировании. // В кн. «Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение», М.: Наука, 2002, с. 315 — 326.

8. Kushwaha V., Bhowmick A., Behera В.К., Ray A.R. Sustained release of antimicrobial drugs from polyvinylalcohol and gum arabica blend matrix // Artif. Cells Blood. Substit.Immobil.Biotechnol.- 1998.-v.26.-p. 159-172.

9. Draye J.P., Delaey В., Van de Voorde A., Van Den Bulcke A., De Reu В., Schacht E. In vitro and in vivo biocompatibility of dextran dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel films // Biomaterials. -1998. v. 18. - p. 1677-1687.

10. Agren M. An amorphous hydrogel enhances epithelialisation of wounds // Acta Derm. Venereol. 1998. - v. 78. - p. 119-122.

11. Segal H., Hunt B.J. The effects of alginate and non-alginate wound dressings on blood coagulation and platelet activation // J. Biomater. Appl. 1998. - v. 12. - p. 249-257.

12. Ueno H., Yamada H., Tanaka I., Kaba N., Matsuura M., Okumura M., Kadosawa Т., Fujinada T. Accelerating effects of chitosan for healing at early phase of experimental open wound in dogs // Biomaterials. 1999. - v. 20. - p. 1407-1414.

13. Loke W.K., Lau S.K., Yong L.L., Khor E., Sum C.K. Wound dressing with sustained anti-microbial capability // J. Biomed. Mater. Res. 2000. - v. 53. - p. 8-17.

14. Г.А. Вихорева, К.П. Хомяков, И.Ю. Сахаров, JI.C. Гальбрайх. Иммобилизация протеолитических ферментов в пленках и губках карбоксиметилхитина // Хим. волокна. 1995. - № 5. - с. 34-37.

15. Вихорева Г.А., Шаблыкова Е.А., Кильдеева Н.Р. Модификация хитозановых пленок глутаровым альдегидом с целью регулирования их растворимости и набухания // Хим. волокна. 2001. - № 3. - с. 38-42.

16. Елфимова Г.С., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Гальбрайх Л.С. Использование производных хитина и хитозана для модификации протеолитических ферментов // Матер. V конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», с. 268-269.

17. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Гальбрайх Л.С. Получение биологически активных волокнистых материалов с заданными свойствами // Хим. волокна. 2000. -№6.-с. 21-24.

18. Mansouri S., Lavigne P., Corsi К., Benderdour M., Beaumont E., Fernandes J.C. Direct Force Measurements between siRNA and Chitosan Molecules Using Force Spectroscopy // Eur. J. Biopharm. 2004. - v. 57. - № 1. - p. 1-8.

19. Sabnis S., Block L.H. Chitosan as an Enabling Excipient for Drug Delivery Systems. I. Molecular Modifications // Int. J. Biol. Macromol. 2000. - v. 27. - № 3. - p. 181-186.

20. MacLaughlin F.C., Mumper R.J., Wang J. e.a. // J. Control. Release. 1998. - v. 56. - № 1. - p. 259-272.

21. M. Koping-Hoggard, Y.S. Mel'nikova, K.M. Varum e.a. // J. Gene Med. 2003. -v. 5,-№2.-p. 130-141.

22. Кильдеева H.P. Разработка биологически активного полимерного раневого поьфытия на основе хитозана // Вестник МГТУ. 2005. - с. 107-109.

23. Бабак В.Г., Ринодо М. Коллоидные свойства водорастворимых производных хитина и хитозана: теория и применение. // Матер. V конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», с. 206 210.

24. Лукина И.Г., Бабак В.Г. Межфазные свойства смешанных растворов хитозана и додецилсульфата натрия // Матер. V конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», с. 236-238.

25. Папков С.П. Студнеобразное состояние полимеров. -М.: Химия, 1974.255 с.

26. Кильдеева Н.Р., Бабак В.Г., Вихорева Г.А., Гальбрайх JI.C. Новый подход к созданию высоконабухающих перевязочных средств // Вестник МГУ (Сер. Химия). -2000.-т. 6.-с. 423-425.

27. Кильдеева Н.Р., Бабак В.Г., Меркович Е.А., Чеснокова О .Я. Включение ферментов в оболочки из пав-полиэлектролитных комплексов на основе хитозана // Матер. VI Междунар. конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана», с. 350-352.

28. Babak V., Kildeyeva N., Merkovich E. The production of chitosan surfactant complex gel capsules for enzyme delivery // Proceed. IntM. Simp. Control. Rel. Bioact. Mater. - 2001. - v. 28. - Controlled Release Society, Iuc. p. 61-65.

29. Гальбрайх JI.C. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение // Соросовский образовательный журнал. 2001. - т. 7. - № 1. - с. 51-56.

30. Кайминын И.Ф. Физико-химические свойства хитозана и возможности его практического использования // Матер. V конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», с. 230-231.

31. Вихорева Г.А., Кильдеева Н.Р., Горбачева И.Н. и др. Исследование композиций целлюлоза-хитозан. Твердофазная модификация, реология, пленки // Хим. волокна. 2000. - № 6. - с. 14-18.

32. Зеленецкий А.Н., Акопова Т.А., Кильдеева Н.Р., Вихорева Г.А., Оболонкова Е.С., Жаров А.А. Иммобилизация трипсина на полисахаридах при интенсивном механическом воздействии // Известия Академии наук. Серия химическая. 2003. -№9.-с. 1963-1967.

33. Efremenko Е., Peregudov A., Kildeeva N., Perminov P., Varfolomeyev S. New enzymatic immobilized biocatalysts for detoxification of organophosphorus compounds. // Biocatalysis and Biotransformation. 2005. - 23 (2). - p. 103-108.

34. Вихорева Г.А., Кильдеева H.P., Устинов М.Ю., Ночевкина Ю.Н. Получение хитозановых пленок и исследование их деградируемости // Хим. волокна. 2002. - № 6.-с. 29-33.

35. Peh К., Khan Т., Gh'ing Н. Mechanical, bioadhesive strength and biological evaluations of chitosan films for wound dressing // J. Pharm. Sci. 2000. - v. 3. - № 3. - p. 303-311.

36. Mi F.L., Tan Y.C., Liang H.C. e.a. In vitro evaluation of a chitosan membrane cm-linked with genipin//J. Biomater. Sci. Polym. Ed.-2001.-v. 12.-№ 8.-p. 835-850.

37. Смирнова JI.A., Сергеева M.B., Пастухова H.B. // Матер. VI Междунар. конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана», с. 57-58.

38. M.N.V. Ravi Kumar. A review of chitin and chitosan applications // Reactive & Functional Polymers. 2000. - v. 46. - p. 1-27.

39. Paul W., Sarma S.P. Chitosan, a drug carrier for the 21st century: a review // Pharma Sci. 2000. - № 10. - p. 5-22.

40. Yao K.D., Peng Т., Yu, J.J., Xu M.X., Goosen M.F.A. Microcapsules/microspheres related to chitosan, J.M.S. Rev. Macromol. Chem. Phys. -1995.-v. 35.-p. 155.

41. Hjerten S. The separation of agarose spheres for chromatography of molecules and particles // Biochem. Biophys. Acta. 1964. - v. 79. - №2. - p. 393-398.

42. Porath J., Jansen J.C. and Laas T. Agar derivatives for chromatography, electrophoresis, and gel-bound enzymes. I. Desulfated and reduced cross-linked agar and agarose in spherical bead form //Cromathogr. Sci. 1971. - № 60. - p. 160.

43. Margel S., Offarim F. Novel effective immunoadsorbents based on agarose-polyaldehyde microsphere beads: Synthesis and affinity chromatography //Anal biochem. -1983.-v. 128.-P. 342.

44. Margel S. //Appl. Biochem. Biotechnol. 1983. - №8. - p. 523.

45. Chitumbo K., Brown W. The separation of oligosaccharides on cellulose gels // J. Polym. Sci. 1971. -№36. - p. 279-292.

46. Миронов А.В., Веденина О.Л., Вихорева Г.А. и др. Получение гранулированного хитозана. // Хим. волокна. 2005. - № 1.-е. 26-29.

47. Remunan-Lopez С., Portero A., Lemos М. а.о. Chitosan microspheres, for the specific delivery of amoxycillin to the gastric cavity // S.T.P. Pharma Sci. 2000. - v. 10. -№ l.-p. 69-76.

48. Ohya Y., Cai R., Nishizawa H., Нага K., Ouchi T. Preparation of PEG-grafted chitosan nanoparticles as peptide drug carriers //S.T.P. Pharma Sci. 2000. - v. 10. - № 1. -P. 77-82.

49. Zhou Yong-Guo, Yang Yue-Dong, Guo Xue Min a.o. // J. Appl. Chem., 2002, v. 19, №12, p. 1178-1182.

50. Acharya A.S., Suseman L.G., Manning J.M. Schiff base adducts of glutaraldehyde with haemoglobin // J. Biol. Chem. 1983. v. 285. - № 4. - p. 2296-2302.

51. Jameela S.R., Jayakrishnan A. Glutaraldehyde cross-linked hitosan microspheres as a long acting biodegradable drug delivery vehicle: studies on the in vitro release of mitoxatrone and in vivo degradation. //Biomaterials. 1995. -№ 16. - p. 769-775.

52. Leong K.W., Mao H.Q., Truong-Le V., Roy K, Walsh S.M, August J.T. DNA-polycation nanospheres as nonviral gene delivery vehicles //J. Cont. Rel. 1998. - № 53. -P. 183-193.

53. Conti В., P.Giuchedi, I. Genta and U. Conte. The preparation and in vivo evaluation of the wound-healing properties of chitosan microspheres // S.T.P. Pharma Sciences.-2000.-v. 10.-№ l.-p. 101-104.

54. Polk A., Amsden В., De Yao K., Peng Т., Goosen MF. Controlled release of albumin from chitosan-alginate microcapsules // J. Pharm. Sci. 1994. - v. 83. - 178-185.

55. Huguet ML, Dellacherie E. Calcium alginate beads coated with chitosan: effect of the structure of encapsulated materials on their release // Process Biochem. 1996. - v. 31.-745-751.

56. Gaserod O.//Biomaterials. 1998.-v. 19.-p. 1815-1825.

57. Bartkowiak A., Hungeler D. // Chemistry of materials. 2000. - v. 12. - №1. - p. 206-212.

58. Роговина C.3., Акопова T.A., Вихорева Г.А., Горбачева И.Н., Зеленецкий А.Н. // Высокомолекул. соед. А Б. 2000. 42, № 9, с. 1489 - 1494, 2 ил. Библ. 4. Рус.; рез. англ. -РЖХ. -01. 04.-19 Ф. 34.

59. Peug Chaughong, Wang Juting. Получение производных хитозана: синтез аддуктов типа оснований Шиффа и втораминов хитозана и краун-эфиров. // Polym. J. 1998. - 30, № Ю. - с. 843 - 845. - Англ. - РЖХ. - 22 Ф. 47.

60. Серейкайте Й., Бассус Д., Бобнис Р. и др. Дивинилсульфон как сшивающий реагент для олигомерных белков // Биоорганическая химия. 2003. - т. 29. - № 3. - с. 254-257.

61. Michael F., Evers J. Macromol. Chem. 1949. - v. 3. - № 2/3. - p. 200-209.

62. Demand 2288105 (France); РЖБхим, 1977, 14Ф420.

63. Demand 53-41488 (Japan) / Tagaki К.; РЖБхим, 1979,11X619.

64. Pat. 2219172 (France) / Batakai L., Horvath I., Horvath-Fehu E. et al.;Chem. Abstrs, 1978, v. 88, 3710.

65. De Abreu R.A., De Vries J., De Kok A., Veeger C. Eur. J. Biochem., 1979, v. 97, №2, p. 379-387.

66. Коршак В. В., Штильман М. И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука, 1984. - 261 с.

67. Zauns R., Kuhm P. An alternative approach to traditional chrome tanning // JALKA.- 1995.-v. 90.-p.177-181.

68. Пантелеева Л.Г., Федорова JI.C., Цвирова И.М., Белова A.C. Вирулицидная, туберкулоцидная и фунгицидная активность новых средств из группы поверхностно-активных веществ // Дезинфекционное дело. 1998. -№3. - с. 16-18.

69. Relyveld М.Е.Н. Preparation de vaccins antitoxiques et antimicrobiens a'l'aide du glutaraldehyde // Compt. rend. Acad. Sci.(Ser. D). 1973. -№ 277. - p. 613.

70. Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б. и др. Кинетические исследования взаимодействия р-галактозидазы с глутаровым альдегидом // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - т. 33. - №2. - с. 166-171.

71. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: Пер. с англ. М.: «Мир», 1982. - т. 2 - 515е., ил.

72. Wipple Е.В. and Ruta М. Structure of aqueous glutaraldehyde // J. Org. Chem. -1974. v. 39. - №12. - p. 1666-1668.

73. Фрейдлин Г.Н. и др. Глутаровый альдегид. Сер. "Производство мономеров". М., НИИТЭХИМ, 1983.

74. Richards F.M., Knowless J.R. Glutaraldehyde as a protein cross-linking reagent // J. Mol. Biol. 1968. - v. 37. -№1. - p. 231-234.

75. Hardy P.M., Nicholls A.C., Rydon H.N. The nature of glutaraldehyde in aqueous solution // Chem. Commun. 1969. - №10. - p. 565-566.

76. Korn A.H., Feiarheller S.H., Filachione E.M. // J. Mol. Biol. 1972. - v. 65. -№3. - p. 525-529.

77. Monsan P., Puzo G., Mazarguil H. Etude du mecanisme d'etablissement des liaisons glutaraldehyde-proteines // Biochimie. 1975. - v. 57. -p. 1281-1292.

78. Несмеянов A.H., Несмеянов H.A. Начала органической химии, т. 1. М.: Мир, 1974, 664 с.

79. Margel S., Rembaum A. Synthesis and characterization of poly glutaraldehyde: a potential reagent for protein immobilization and cell separation // Macromolecules. 1980. -№13.-p. 19-24.

80. Bowes J.H., Cater C.W. Crosslinking of collagen // J. Appl. Chem. 1965. - v. 15.-p. 296-304.

81. Roberts G.A.F., Taylor K.E. The formation of gels by reaction of chitosan with glutaraldehyde // Macromol. Chem. 1989. - v. 190. -p. 951-960.

82. Гудкин JI.P., Кузнецова Н.П. Особенности реакции глутарового альдегида с глутаминовой кислотой // Журнал прикладной химии. 1997. - т. 70. - вып. 5. - с. 820-823.

83. Кузнецова Н.П., Мишаева Р.Н., Гудкин Л.Р. Исследование олигомеризации глутарового альдегида при его конденсации с глицином // Журнал прикладной химии. 1999. - т. 72. - вып. 7. - с. 1171-1177.

84. Кузнецова Н.П., Мишаева Р.Н., Писарев О.А., Гудкин JI.P. Исследование кинетики реакции глутарового альдегида с аминокислотами // Журнал прикладной химии. 2000. - т. 73. - вып. 5.-е. 796-801.

85. Кузнецова Н.П., Гудкин JI.P., Кольцова С.В., Мишаева Р.Н. Особенности поликонденсации белков с глутаровым альдегидом // Высокомолекулярные соединения (сер. А). 1996. - т. 38. -№10. - с. 1668-1673.

86. Knaul J.Z., Hudson S.M., Creber К.М. Crosslinking of chitosan fibers with dialdehydes: proposal of a reaction mechanism // J. Polym. Sci.: part B: Polymer Physics. -1999.-v. 37.-p. 1079-1094.

87. Kang et al. pH-sensitivity of hydrogels based on complex forming chitosan: polyether interpenetrating polymer network // J. of Applied Polym. Sci. 1993. - v. 48. - p. 343-354.

88. Tomihata K., Ikada Y. Crosslinking of hyaluronic acid with glutaraldehyde // J. of polymer science: part A: Polymer Chemistry. 1997. - v. 35. - p. 3553-3559.

89. Тимофеева Т.А., Голяндо П.Б., Жирнов О.П. Адсорбция на синтетических мембранах и иммуногенные свойства апротинина, конъюгированного с помощью глутарового альдегида // Биоорганическая химия. 1999. - т. 25. - № 4. - с. 264-269.

90. Кузнецова Н.Н., Самсонов Г.В. Исследование поликонденсации макромолекул биополимеров // Высокомолекулярные соединения. 1985. - т. 27 (А). -№12.-с. 2611-2614.

91. Платэ Н. А., Васильев А. Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986.-296 с.

92. Казанская Н.Ф., Кост О.А. Модифицирование трипсина водорастворимым полиэтиленимином // Биоорганическая химия. 1975. - т. 1. -№9. - с. 1332-1336.

93. Казанская Н.Ф., Кост О.А., Березин И.В. Свойства трипсина, модифицированного глутаровым альдегидом // Биоорганическая химия. 1975. - т. 1. -№9. - с. 1337-1344.

94. Rembaum A., Margel S., Levy J. Polyglutaraldehyde: a new reagent for coupling proteins to microspheres and for labeling cell-surface receptors // J. Immunological Methods. 1978. - v. 24. - p. 239-250.

95. Elcin J. Murat, Sacar Mehmet. Acrylamid grafted poly (ethylene terepthalate) fibers activated by glytaraldehyde as support for urease 11 Appl. Biochem. and Biotechnol. -1996.-v. 60.-№l.-p. 19-32.

96. Юданова Т.Н., Скокова И.Ф., Вирник А.Д. и др. Непрерывные способы иммобилизации террилитина на целлюлозных волокнистых материалах // Биотехнология. 1985. - №6. - с. 98-102.

97. Алешина Е. Ю. Получение и свойства полимерных композиций и пленочных материалов на основе поливинилового спирта, содержащего протеазу С и полигексаметиленгуанидин. //Дисс. . к.х.н. М.: МГТУ им. А.Н. Косыгина, 2003. с. 22 - 24.

98. Меркович Е.А., Карруэтт M.-JL, Бабак В.Г. и др. Вискозиметрическое исследование кинетики начальной стадии гелеобразования в растворах хитозана в присутствии глутарового альдегида // Коллоидный журнал. 2001. - №3. - с. 383-388.

99. Справочник биохимика: Пер. с англ./ Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. -М.: Мир, 1991.-544 е., ил.

100. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. 5-е изд., перераб. и доп. М.: Химия. 1979. - 480 е., ил.

101. Inagami Т., Stertevant J.M. // J. Biol. Chem. -1960. 235. - p. 1019-1026.

102. Преч Э., Бюльманн Ф., Аффольтер К. Определение строения органических соединений. М.: Мир, 2006,438 с.

103. Кнорре Д.Г., Крылова Л.Ф., Музыкантов B.C. Физическая химия. Учеб. для биол. фак. университетов и пед. вузов. Изд. 2-е, испр. и доп. М.: Высш. шк., 1990,416 с. '

104. Агрономов А.Е. Избранные главы органической химии. М.: Химия, 1990.- 560 е., ил.

105. Миронов А.В., Вихорева Г.А., Кильдеева Н.Р., Успенский С.А. Причины нестабильности вязкостных свойств уксуснокислотных растворов хитозана // Высокомолекулярные соединения (Сер. Б). 2007. - т. 49. - №1. - с. 136-138.

106. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Дронова М.В., Гальбрайх Л.С. Текстильные материалы медицинского назначения с комбинированным биологическим действием: получение и свойства. // Текстильная химия. 1998. - №1 (13). - с. 96-102.