Органофосфатгидролаза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Органофосфатгидролаза.

1.1. Фосфорорганические нейротоксины.

1.1.1. Структура, свойства, токсичность.

1.1.2. Способы деградации фосфорорганических соединений.

1.2 Органофосфатгидролаза.

1.2.1. Физико-химические характеристики, субстратная специфичность.

1.2.2. Структура активного центра, механизм действия.

Глава 2 Стабилизация органофосфатгидролазы.

Глава 3 Гидролитические ферменты, имеющие сходный активный центр.

Глава 4. Комплексы металлов как модели активных центров фосфат-гидролизующих ферментов.VAfeJJ&Sfl.

Актуальность проблемы. Проблема деградации и детекции нейротоксичных фосфорорганических соединений, к числу которых относятся широко применяемые в сельском хозяйстве пестициды, такие как паратион, кумафос, деметон-S, и боевые отравляющие вещества - зарин, зоман и VX, является крайне актуальной, поскольку сотни тысяч тонн этих веществ, произведенные в последние полвека, представляют серьезную экологическую угрозу [1,2]. Уничтожение запасов боевых отравляющих веществ осуществляется в настоящее время путем сжигания или обработкой щелочью. Однако эти способы деградации имеют множество недостатков: являются неэкологичными и вызывают значительную коррозию оборудования и контейнеров. Кроме того, после обработки щелочью часть фосфорорганических соединений (около 1%) остается непрогидролизовавшейся, и в таких концентрациях также токсичной для человека. По этой причине в последнее десятилетие получил развитие ферментативный способ деградации фосфорорганических соединений, основанный на использовании органофосфатгидролазы, первоначально выделенной из бактерий Pseudomonas diminuta. Этот способ предполагается использовать преимущественно для детоксикации боевых отравляющих веществ, неразложившихся в результате воздействия щелочи, и для деградации и детекции фосфорорганических пестицидов. Органофосфатгидролаза проявляет высокую каталитическую активность по отношению к триэфирам фосфорной кислоты, kcat для реакции гидролиза параоксона, катализируемого органофосфатгидролазой составляет по разным литературным данным от 3 до 10х103 с"1. Фермент проявляет максимальную каталитическую активность при рН 8.5-9.0. Поскольку фосфорорганические соединения мало растворимы в воде, ферментативный гидролиз таких соединений проводится в присутствии органических растворителей, которые снижают стабильность фермента. Поэтому, важным направлением исследования данного фермента является изучение влияния на него различных эффекторов и иммобилизующих агентов с целью повышения его стабильности и активности при использовании для уничтожения токсичных органофосфатов.

В последнее время усилия исследователей направлены на поиск катализаторов, способных катализировать реакцию гидролиза фосфорорганических соединений при значениях рН, близких к нейтральным. Обнаружение катализаторов с нейтральным и слабокислым рН-оптимумом действия открыло бы новые возможности их применения: например, для обработки одежды и кожных покровов людей, подвергшихся воздействию фосфорорганических нейротоксинов и позволило бы уменьшить коррозию оборудования. Механизм действия органофосфатгидролазы до сих пор вызывает споры в литературе [4346]. Исследование механизма действия этого фермента представляет собой интерес, поскольку с одной стороны, это позволит предложить пути изменения субстратной специфичность органофосфатгидролазы и увеличения ее активности по отношению к боевым отравляющим веществам, а с другой, откроет возможность поиска фермента со сходным активным центром или дизайна низкомолекулярного катализатора, имитирующего органофосфатгидролазу. Важно отметить, что замена известных химических способов деградации фосфорорганических соединений на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.

Цель работы. Целью настоящей работы является установление механизма действия органофосфатгидролазы, изучение ее поведения в водно-органических системах и создание стабильного катализатора на ее основе для деградации фосфорорганических нейротоксинов, а также поиск и создание эффективных и более стабильных, чем органофосфатгидролаза, катализаторов гидролиза триэфиров фосфорной кислоты, которые могли бы проявлять активность при нейтральных и слабо-кислых значениях рН и были бы I более специфичны к тиоловым эфирам и эфирам тиофосфорной кислоты, более широко применяемых, чем параоксон и значительно более устойчивых к деградации существующими методами.

Научная новизна. Детально исследованы кинетические закономерности реакции ферментативного гидролиза параоксона в присутствии органичес-ких аминов, на основании полученных кинетических данных предложен механизм действия ОФГ. Продемонстрирована необходимость присутствия ионов металла в активном центре фермента для эффективного гидролиза триэфиров фосфорной кислоты на примерах ферментов различных классов. Исследованы кинетические закономерности реакций гидролиза фосфорорганических соединений, катализируемых ОФГ в присутствии органических растворителей различной природы. Определены кинетические параметры реакции для различных бинарных водно-органических систем в отсутствии и присутствии полиэлектролитов, показана высокая стабильность нековалентного фермент-полиэлектролитного комплекса против инактивации органическими растворителями. Разработан метод иммобилизации фермента в гель поливинилового спирта в присутствии полиэлектролита, позволяющий получить высокоактивный и стабильный препарат фермента.

Созданы металлокомплексные катализаторы гидролиза фосфорорганических нейротоксинов на основе циклометаллированных комплексов платины и палладия, имитирующие действие ОФГ. Показано, что механизм катализа гидролиза трифосфатов циклоплатинированными и циклопалладированными арилоксимами включает связывание субстрата через комплексообразование с ионом металла, что повышает электрофильность атома фосфора, и последующую внутримолекулярную атаку координированным нуклеофилом, в роли которого выступает оксимат-ион. Полученные катализаторы обладают высокой активностью и демонстрируют высокую специфичность по отношению к серусодержащим эфирам фосфорной кислоты. Каталитическая активность созданных катализаторов более чем на 4 порядка превосходит лучшие литературные аналоги. Найдено, что изученные комплексы способны промотировать гидролиз нейротоксина деметона-S, являющегося аналогом VX-газов.

1. Органофосфатгидролаза

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из настоящего обзора видно, что использование органофосфатгидролазы является весьма перспективным как для детоксикации фосфорорганических соединений, так и в создании биосенсоров и других аналитических систем для детекции пестицидов и боевых отравляющих веществ. Однако, при всех достоинствах этого фермента, таких как высокая каталитическая активность и достаточно высокая стабильность при хранении, он обладает целым рядом существенных недостатков. Среди них щелочной рН-оптимум действия, инактивация в присутствии органических растворителей, низкая специфичность по отношению к эфирам тиофосфорной кислоты вследствие слабой координации иона металла в активном центре с атомом серы субстрата, невысокие по сравнению с параоксоном скорости гидролиза P-S связи в VX-газах и их аналогах. Таким образом, представляется интересными следующие пути повышения эффективности гидролиза фосфорорганических соединений: с одной стороны, это изучение кинетических закономерностей влияния на органофосфатгидролазу органических растворителей, что позволит оптимизировать систему для проведения реакций гидролиза нерастворимых в воде фосфорорганических соединений, использование иммобилизации и взаимодействия с полиэлектролитами для получения стабильного биокатализатора, а также исследование механизма действия органофосфатгидролазы, до сих пор вызывающего дискуссии в литературе.

С другой стороны - это изучение возможности гидролиза фосфорорганических соединений другими гидролитическими ферментами и создание искусственных металлокомплексных катализаторов, обладающих другой субстратной специфичностью, рН-оптимумом действия и не подвергающихся влиянию органических растворителей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1.1. Приборы и материалы

Органофосфатгидролаза - выделена из генно-инженерного штамма Е. coli DH5a, модифицированного плазмидой рОР419 согласно методике [5] (см. ниже). Штамм предоставлен проф. J. Wild, Texas А&М University.

Ферменты: субтилизин, активность 12 ед/мг, производства Fluka, трипсин, активность 10000 ед/мг, производства Sigma, папаин, активность 16-40 ед/мг, производства Sigma, термолизин, активность 50-100 ед/мг, производства Sigma, карбоксипептидаза А, активность 50 ед/мг, производства Sigma, кислая фосфатаза из зародышей пшеницы, активность 0.15-0.5 ед/мг, производства Fluka.

Параоксон (Sigma) - препарат перед использованием очищался следующим образом: 1 мл препарата растворяли в 250 мл дихлорметана, продукты гидролиза экстрагировали водой, отделяли органическую фазу, добавляли осушитель - MgSC>4 и отфильтровывали. Дихлорметан упаривали на роторном испарителе. Очищенный параоксон растворяли в

•л бидистилированной воде (концентрация 1x10" М). Полученный раствор хранили при температуре 0-4 °С.

Паратион, (Sigma), метил-паратион (Fluka), кумафос (Fluka), деметон-S (ChemService, США) использовались без дополнительной очистки.

Органические растворители: этанол, этилацетат - препараты марки ч.д.а. («Реахим»), ацетонитрил - препарат марки ос.ч. («Реахим»), диметилсульфоксид (DMSO), диметилфорамид (DMFA) - препараты фирмы Sigma, дихлорметан - препарат марки х.ч.(«Реахим»), толуол - препарат марки ч.д.а. («Реахим»), декан - препарат марки х.ч. («Реахим»), использовались без дополнительной очистки.

Диметиловый эфир тетраэтиленгликоля (Aldrich) очищали перед использованием перегонкой.

Полиэлектролиты - полибрен и поливинилсульфат калия (Sigma) использовались без дополнительной очистки

Поливиниловый спирт, производства ПО «Азот», г. Невинномыск. Глутаровый альдегид, 25%-ный водный раствор, Sigma

Амины: диэтиламин (Sigma), диизопропиламин (Sigma), триэтиламин (Sigma), морфолин (Sigma), /-бутиламин (Sigma), диметилбензиламин (Sigma), пиперидин (Sigma), пиридин, препарат марки ос.ч. («Реахим») перед использованием очищались перегонкой. Имидазол (Sigma), пиперазин (Sigma) использовались без дополнительной очистки. Буферы:

CHES (2-[К-циклогексиламино]этансульфоновая кислота, рКа 9.3), препарат фирмы Sigma HEPES (К-[2-гидроксиэтил]пиперазин-Ы'-[2-этансульфоновая кислота, рКа 7.5], препарат фирмы Sigma

MES (2-[Ы-морфолино]этансульфоновая кислота, рКа 6.1), препарат фирмы Sigma

TRIS (Трис[гидроксиметил]аминометан, рКа 8.1) препарат производства ICN

Pharmaceuticals

Тетраборат натрия (Na2B4O7xl0H2O), препарат производства ICN Pharmaceuticals

Борная кислота (Н3ВО3), препарат фирмы Sigma

5,5-диэтилбарбитурат натрия, препарат фирмы Reanal

Ацетат натрия, препарат марки ч.д.а., производства «Реахим»

Цитрат натрия, препарат марки ч.д.а., производства Reanal

Гидроксид калия, препарат марки ч.д.а., производства Reanal

Перхлорат натрия (NaC104), производства Fluka

Вода тяжелая-D , препарат производства «Реахим», использовался без дополнительной очистки

Приборы:

31

Спектры ПМР и Р записывали на приборах Varian VXR 400 и Brucker с рабочей частотой 400 и 300 МГц соответственно. В качестве растворителя применяли дейтерированные ацетонитрил, хлороформ, метанол и воду.

Спектрофотометрические исследования проводились на спектрофотометрах Beckman-25 (США), Hitachi 150-20 (Япония) и Shimadzu (Япония), оборудованных термостатируемой ячейкой.

1.2. Выделение и очистка органофосфатгидролазы

Для культивирования клеток использовали жидкую питательную среду следующего состава:

КН2Р04-2.31 г/л К2НР04 -12.54 г/л триптон - 12.0 г/л дрожжевой экстракт - 24.0 г/л глицерин - 4.0 мл/л СоС12х6Н20 - 237 мг/л рН среды 7.4

Перед посевом культуры в среду добавляли раствор ампицилина (концентрация в среде 50 мг/л).

Для получения инокулята производили посев культуры петлей с чашек Петри в 20 мл среды LB (триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5г/л, NaCl - 5г/л, ампицилин 50 мг/мл). 12 часовой инокулят вносили в колбу, содержащую 300 мл полноценной питательной среды, культуру растили при 27°С, при постоянном перемешивании (200 об/мин). Полученную биомассу отделяли центрифугированием (5000 g, центрифуга Beckman J-6), взвешивали и ресуспендировали в 10 мМ фосфатном буфере, рН 6.9, соотношение биомасса/буфер 1/5. Клетки разрушали обработкой ультразвуком (частота 44 кГц) 4 раза по 45 секунд, между обработками биомассу выдерживали в течение 1 минуты во льду. Полученную массу отделяли центрифугированием 15000 g в течение 30-45 мин.

Готовили 10% раствор стрептомицин сульфата в 25 мМ TRIS буфере, рН 7.0. Раствор добавляли по каплям к полученной биомассе (конечная концентрация 1%), процедуру проводили во льду, полученную суспензию оставляли на 15 минут, затем отделяли центрифугированием 15000g в течение 30 минут.

Измеряли объем супернатанта, добавляли сульфат аммония до концентрации 45%, затем осадок отделяли центрифугированием 15000g, в течение 35-40 минут. Ресуспендировали осадок, содержащий органофосфатгидролазу в 40 мл фосфатного буфера, концентрация 10 мМ. рН 6.9. Полученный раствор подвергали диализу (2 л 10 мМ фосфатного буфера, рН 6.8) с одной сменой буферного раствора.

Раствор, содержащий органофосфатгидролазу, наносили на 100 мл колонку с SP-сефарозой (Pharmacia) (скорость нанесения 0.5 мл/мин), уравновешенной тем же фосфатным буфером (рН 6.8). пропускали через колонку тот же буфер, пока оптическая плотность станет менее 0.1 при Я=280, затем через колонку пропускали градиент КС10-0.5 М в фосфатном буфере, рН 6.9. Органофосфатгидролаза сходит с колонки при концентрации КС1 150-175 мМ.

Полученные фракции, содержащие органофосфатгидролазу, объединяли и подвергали диализу против 50 мМ TRIS буфера, рН 8.3 (2 литра, с одной сменой буферного раствора), затем наносили на 10 мл колонку с DEAE, предварительно уравновешенную тем же буфером. Органофосфатгидролаза проходит через колонку, не связываясь с носителем, примеси при этом остаются на колонке.

Полученный фермент концентрировали с использованием концентратора Amicon (Amicon, USA), растворяли в 10 мМ буферном растворе триэтаноламина рН 7.4 (концентрация 1.3 мг/мл), хранили в холодильнике при температуре 4°С.

1.3 Кинетические исследования ферментативного гидролиза параоксона.

1.3.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой органофосфатгидролазой.

За скоростью исследуемой реакции следили спектрофотометрически на спектрофотометрах Beckman-25 и Hitachi 150-20, снабженных термостатируемыми кюветными отделениями, по накоплению продукта 4-нитрофенолят аниона (£=17000 моль" 'см"!, /1=405 нм). Для определения каталитической активности органофосфатгидролазы в водных растворах использовали 0.05 М CHES буфер, рН 9.0. Для определения каталитической активности фермента в водно-органических смесях готовили систему вода - органический растворитель требуемого состава, в качестве водного компонента использовали водный буферный раствор. Для определения активности фермента в присутствие органических аминов использовали 0.2 М CHES буфер. В качестве запасного раствора субстрата использовали 0.01 М водный раствор параоксона. В типичном эксперименте в спектрофотометрическую кювету, содержащую буферный раствор добавляли различные аликвоты запасного раствора субстрата. Реакцию инициировали внесением в кювету аликвоты запасного раствора органофосфатгидролазы

Я 7 в триэтаноламине. Концентрация фермента в кювете составляла 10 -10" М. Расчет скоростей ферментативной реакции проводили по начальным линейным участкам кинетических кривых (v0=-tga). Максимальную скорость ферментативной реакции (Vm) и константу Михаэлиса (Кт) определяли с использованием двойных обратных координат l/v0-l[S]. Для определения типа и констант ингибирования ферментативную реакцию проводили при различных концентрациях субстрата и ингибиторов с последующим анализом экспериментальных данных в координатах Диксона l/v0-[ I ]. Для определения типа активации органофосфатгидролазы анализировали кинетические кривые, полученные при различных концентрациях субстрата и активатора в координатах [S]/v0 -[S] и l/v0- 1/[S],

Скорость ферментативной реакции в двухфазных водно-органических системах определяли спектрофотометрически по накоплению 4-нитрофенолят аниона в водной фазе. Водную фазу отбирали из реакционной системы через определенные промежутки времени, измеряли ее оптическую плотность и затем исследуемую фазу вносили обратно. Ферментативную реакцию проводили при постоянном перемешивании.

1.3.2. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона в присутствии субтилизина, трипсина, папаина, термолизина и карбоксипептидазы А.

Готовили раствор соответствующего фермента в воде, концентрация 0.5 мг/мл. За скоростью исследуемой реакции следили также, как описано выше для органофосфатгидролазы. Для определения каталитической активности ферментов по отношению к параоксону в водных растворах использовали 0.05 М CHES буфер, рН 8.5, 9.0,0.05 HERES-буфер, рН 7.5, 8.0, и 0.05 М MES-буфер, рН 7.0.

1.3.3. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона в присутствии кислой фосфатазы.

Готовили раствор кислой фосфатазы в воде концентрация 0.5 мг/мл, аликвоту раствора

•3 вносили в 1x10" М раствор параоксона в 0.05 М цитратном буфере с соответствующим значением рН. Раствор параоксона без фермента использовали в качестве контроля. Отбирали аликвоты 50 рл из исследуемого и контрольного образцов и вносили их через определенные промежутки времени в спектрофотометрическую кювету объемом 2 мл, содержащую буферный раствор CHES, 0.05 М, рН 9.0. По разнице оптических плотностей контрольного и исследуемого образцов (А.=405 нм) рассчитывали количество прогидролизовавшегося параоксона. Кинетических параметров ферментативной реакции рассчитывали также, как это было описано выше для органофосфатгидролазы.

1.4 Иммобилизация органофосфатгидролазы

1.4.1. Химическая модификация криогеля ПВС глутаровым альдегидом

15 мл суспензии гранул криогеля ПВС в дистиллированной воде отфильтровывали на пористом фильтре под вакуумом для удаления свободной жидкости. 5 г влажного геля суспендировали в 15 мл 0.1 М НС1 и добавляли 10 мл 25%-го раствора глутарового альдегида. Активацию проводили при 20°С при перемешивании в течение 1 часа. После окончания реакции жидкую фазу сливали, а активированный гель промывали сначала дистиллированной водой, затем 0.1 М фосфатным буфером, рН 7.4 и вновь дистиллированной водой до полного отсутствия следов глутарового альдегида. Количество введенных альдегидных группировок, определяли по связыванию с гистидином. К навеске активированного криогеля (0.5 г) добавляли 2.5 мл раствора гистидина (концентрация 0.5 мг/мл) в 0.2 М фосфатном буфере, рН 7.7. Перемешивали в течение 5 часов, после чего измеряли оптическую плотность в супернатанте (Х=212 нм, s=5450 NT'cm"1) и сравнивали с исходным раствором гистидина. Для полученного модифицированного носителя количество альдегидных групп составило 0.7 мкМ на грамм влажного геля.

1.4.2. Иммобилизация органофосфатгидролазы на алъдегидо-содержащем криогеле ПВС К навеске активированного носителя (1 г), дважды промытой фосфатным буфером рН 7.4 добавляли раствор органофосфатгидролазы с концентрацией белка 0.1 мг/мл в том же буфере. Соотношение раствор/носитель 5 мл/г. Иммобилизацию фермента проводили в течение 5 часов при температуре 4°С при перемешивании. Затем гранулы криогеля промывали 0.1 М TRIS-буфером, рН 8.0 при перемешиваний в течение 2-х часов.

1.5. Приготовление комплекса органофосфатгидролазы с полиэлектролитом Готовили водный раствор фермента разбавлением исходного препарата (1.3 мг/мл) в 5 раз 0. 05 М буфером CHES (рН 9.0). Готовили раствор полиэлектролита с концентрацией 5.2 мг/мл в воде. Приготовление комплекса органофосфатгидролазы с полиэлектролитами осуществляли путем смешения водных растворов фермента и полиэлектролита в соотношении 1:1. Конечная концентрация полиэлектролита в комплексе 2.6 мг/мл, конечная концентрация фермента 0.13 мг/мл.

1.6. Синтез циклометаллированных комплексов с арилоксимами.

1.6.1.Общая методика синтеза циклометаллированных комплексов Pt(II) с замешенными ацетофеноноксимами.

К раствору 0.05 моль исходного комплекса PtCl2(dmso)2 в метаноле добавляли эквимолярное количество соответствующего ацетофеноноксима. Реакционную смесь перемешивали в течение 30-40 ч на магнитной мешалке при температуре 50°С с обратным холодильником. Степень превращения реагентов определяли с использованием тонкослойной хроматографии. Полученный раствор упаривали на роторном испарителе, при постепенном упаривании растворителя выпадали кристаллы, которые отфильтровывали, промывали холодным метанолом и высушивали на воздухе. По этой методике синтезированы комплексы 6а-6д. Выходы 50-60%. Синтезированные комплексы охарактеризованы спектрами ПМР и данными элементного анализа. 1.6.2. Синтез циклометаллированного комплекса Pt(IV) (комплекс 8)

Раствор комплекса 6а в метаноле кипятили на магнитной мешалке в присутствии соляной кислоты в течение 24 часов. Полученный раствор упаривали на роторном испарителе на 3/4, и оставляли в холодильнике. Выпавшие кристаллы отфильтровывали и сушили на воздухе. Выход составляет 60%. Полученный комплекс охарактеризован спектром ПМР и данными элементного анализа [163].

1.6.3 Синтез циклопалладированного комплекса Pdfll) с ацетофеноноксимом (комплекс 7) Комплекс синтезировали согласно методике [143], выход комплекса составил 50%, комплекс охарактеризован спектром ПМР и данными элементного анализа.

1.6.4. Синтез ииклоплатинированного комплекса Ptfll) с ацетофеноноксимом (комплекс йй

Комплекс синтезировали по той же методике, что и комплекс Pd(II), выход комплекса составил 58%, комплекс охарактеризован спектром ПМР и данными элементного анализа. 1.7. Кинетические исследования гидролиза эфиров фосфорной кислоты в присутствии циклоплатиннрованных и циклопалладированных арилоксимов.

Кинетика гидролиза параоксона, паратиона, метил-паратиона и кумафоса в присутствии циклоплатинированных и циклопалладированных арилоксимов изучалась спектрофотометрически при температуре 25°С и ионной силе 0.01 М в буферных растворах ацетата, 5,5'-диэтилбарбитурата с общей концентрацией 5x10"J М. Общая методика исследований была следующей: готовили раствор фосфорорганического соединения (концентрация 1x10"4 М) в соответствующем буфере из запасного раствора фосфорорганического соединения в ацетонитриле (концентрация 1x10" М). К раствору органофосфата в буфере добавляли аликвоту запасного раствора комплекса в ацетонитриле (концентрация 1x10"2 М), так, чтобы концентрация комплекса в буферном растворе составляла 5x10"7 - 5x10"5 М. Смесь термостатировали в кювете спектрофотометра. Кинетику гидролиза изучали, наблюдая за оптической плотностью раствора на длинах волн, соответствующих накоплению продукта: для 4-нитрофенола (рКв= 7.20, Я=405 нм, 8=17.000 моль"'см"1 для депротонированной формы, А,=320 нм для протонированной формы), для 7-хлоро-8-гидроксобензопирона Я=384 нм, е=9,000 моль"'см"1. Наблюдаемые константы скорости определялись из анализа полных кинетических кривых в координатах для реакции первого порядка:

In (AJ(kx-A(t))=kt, либо из обработки кинетической кривой по методу Гугенгейма [161]. Константы, определенные различными методами для одной и той же реакции удовлетворительно совпадали между собой.

Каталитическая константа скорости для данного комплекса при данном значении рН среды рассчитывалась из зависимости значений наблюдаемых констант скорости от концентрации комплекса обработкой ее по методу наименьших квадратов.

1.8. Определение кинетического изотопного эффекта реакции гидролиза паратиона, катализируемой комплексом 6в

Кинетический изотопный эффект растворителя (D2O) для 6г определяли при 25°С, в боратном буферном растворе как отношение констант скоростей второго порядка. Константы скорости второго порядка определяли по методике, описанной выше. рН буферного раствора рассчитывали как pD=pH+0.4, где рН - показания рН-метра.

1.9. Измерение активационных параметров реакции гидролиза паратиона в присутствии комплекса 6а.

Активационные параметры реакции определяли по методике, описанной выше при температурах 20-50°С, рН буферного раствора доводили при каждом значении температуры до 9.5. Полученные значения каталитических констант анализировали в координатах In k^ - 1/Т и In (к/Г) - 1/Т. Энергию активации рассчитывали из уравнения In k = - E/RT, энтальпию активации рассчитывали из соотношения АН" = Еа- RT, энтропию активации определяли из уравнения k =/t£T/hxexp(-(AH5'-TAS'7RT)), при 25°С, кв-константа Больцмана, h - постоянная Планка.

1.10. Кинетические исследования гидролиза деметона-S в присутствии циклоплатинированных и циклопалладированных арилоксимов.

Кинетика гидролиза деметона-S в присутствии комплексов 6-7 изучалась спектрофотометрически при температуре 25°С и ионной силе 0.01 М в буферных растворах ацетата, 5,5'-диэтилбарбитурата с общей концентрацией 5x10"3 М. Общая методика исследований была следующей: готовили раствор деметона-S (концентрация от 1х10"5 до 5xlO"5 М) в соответствующем буфере из запасного раствора деметона-S в ацетонитриле (концентрация 1x10"2 М). К раствору деметона-S в буфере добавляли аликвоту раствора комплекса в ацетонитриле (концентрация 1х 10"2 М), так, чтобы концентрация комплекса в буферном растворе составляла 1х 10"6 - 5x10"5 М. Смесь термостатировали в кювете спектрофотометра. Записывали изменения спектра поглощения реакционной смеси от времени, определяли длину волны, на которой изменение поглощения максимально, и затем при этой длине волны записывали кинетическую кривую. Наблюдаемые константы скорости определялись из анализа полных кинетических кривых в координатах для реакции псевдо первого порядка:

In (Аоо/(Аоо-А(?))=к/,

Константу скорости второго порядка рассчитывали из уравнения кШбгл=к?х[комплекс].

1. Гидролиз фосфорорганических соединений в присутствии гидролитических ферментов разных классов.

Вопрос о роли ионов металла в активном центре органофосфатгидролазы до сих пор остается спорным [43-48]. Кроме того, гидролиз фосфорорганических соединений, катализируемый органофосфатгидролазой имеет ряд недостатков, среди которых щелочной рН-оптимум действия фермента и высокая каталитическая эффективность только по отношению к модельному субстрату - параоксону. Представлялось интересным исследовать способность ряда ферментов с различными активными центрами, как металлзависимых, так и имеющих другие функциональные группы, катализировать гидролиз фосфорорганических соединений, чтобы прояснить существенность для катализа иона металла, не участвующего в координации субстрата и наметить пути поиска фермента, способного гидролизовать фосфорорганические нейротоксины при более кислых значениях рН. Была исследована возможность катализа реакции гидролиза параоксона в присутствии субтилизина, трипсина, папаина, 2п2+-карбоксипептидаза А, Zn2+-,Со2+-термолизин и кислой фосфатазы, выделенной из зародышей пшеницы. Показано, что в интервале рН 6.5-9.0 и концентрации параоксона в реакционной системе 0.5-1.2 мМ термолизин, субтилизин и карбоксипептидаза А не проявляют никакой активности по отношению к субстрату.

Гидролиз параоксона наблюдался в присутствии трипсина. Механизм гидролиза параоксона этой сериновой протеазой по всей видимости аналогичен механизму взаимодействия фосфорорганических нейротоксинов с остатком серина в активном центре ацетилхолинэстеразы. Процесс гидролиза параоксона в присутствии трипсина не носит каталитического характера, по всей видимости, вследствие необратимого фосфорилирования остатка серина v

Трипсин проявляет минимальную активность (за 1 сутки при рН 9.0 гидролизуется менее

Папаин проявляет примерно такую же активность в реакции гидролиза параоксона, что и трипсин, однако скорость реакции увеличивается примерно 2-3 раза при добавлении нуклеофила (имидазола) (реакция имеет рН-оптимум 8.0, идет в присутствии DTT). Экспериментальные данные, полученные для исследованных ферментов суммированы в Таблице 8.