Специфичность и каталитические свойства ацетилхолинэстеразы, модифицированной ионом N, N-диметил-2-фенилазиридиния тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

ИНСТИТУТ ХИМИИ АКАДЕМИИ НАУК ЭСТОНИИ

На правах рукописи

СЕПП Армии Вальтерович

СПЕЦИФИЧНОСТЬ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ,

МОДИФИЦИРОВАННОЙ ИОНОМ 1М, 1\1-ДИМЕТИЛ-2-ФЕНИЛАЗИРИДИНИЯ

02.00.03 Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Таллин, 1990

Работа выполнена в лаборатории биоорганической химии и на кафедре органической химии Тартуского университета

Научный руководитель:

доктор химических наук Я.Л. ЯРВ

Официальные оппоненты:

доктор химических наук A.A. Аавиксаар доктор биологических наук Е.В. Розенгарт

Ведушая организация:

Межфакультетская научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и виоорганической химии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится "2Ч" декабря 1990 г. в часов на

заседании специализированного совета К-017.05.01 Института химии АН Эстонии по адресу: 200026 Таллинн, Академия тез 15.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химии АН Эстонии.

ноября 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

А. Эрм

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Специфичность ферментативного катализа можно рассматривать как результат ряда одновременных взаимодействий между молекулой субстрата и активным центром фермента. При этом, однако, существует возможность, что эти взаимодействия являются взаимосвязанными, т.е. проявление одного фактора специфичности контролируется'присутствием другого. Это может выражаться в функциональной взаимосвязи нескольких участков активного центра. Примером может служить ацетилхолинэстераза, активная поверхность которой содержит, по меньшей мере, два участка: анионный и эстеразный центры. Проявление в катализе и того и другого центра в отдельности изучено весьма подробно, механизмы же их взаимодействия и роль этого фактора в определений эффективности катализа, тем не менее, далеко неясны.

Целью настоящей работы явилось изучение роли анионного центра в функционировании эстеразного центра ацетилхолинэсте-разы путём количественного анализа специфичности и каталитических свойств фермента, модифицированного ионом 11,и-диме-тил-2-фенилазиридиния. Данное соединение является аффинным модификатором анионного центра ацетилхолинэстеразы, которое при ковалентном связывании с белком имитирует влияние катион-ной группы молекул, взаимодействующих с этим центром.

Научная новизна. Установлено, что ковалентное связывание иона М,Ы-диметил-2-фенилазиридиния в анионном центре ацетилхолинэстеразы оказывает на каталитические свойства фермента такое же влияние, как обратимое связывание ионов тетраалкил-аммония. Обнаружено, что алкильная группа н-алкансульфонил-хлорилов взаимодействует в эстеразном центре ацетилхолинэстеразы с участком, где локализована ацильная часть сложноэфир-ных субстратов в их реакции с ферментом. В результате связывания ионов Ы^-диметил-2-фенилазиридиния в анионном центре ацетилхолинэстеразы увеличивается, во-первых, специфичность фермента относительно строения алкильных групп алкансульфонилхлоридов, и во-вторых, скорость стадии ацилиро-вания фермента в реакции со сложноэфирными субстратами.

Практическая ценность работы. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что при анализе корреляционных зависимостей структура-активность надо иметь в виду возможность появления отклонений от аддитивности в результате

взаимозависимых эффектов разных участков активной поверхности фермента. Из полученных данных также вытекает принципиальная возможность получения ферментов с заданными каталитическими свойствами путём ковалентного модифицирования регуляторного центра аналогами обратимых эффекторов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 6 докладов. Результаты работы доложены автором на международной конференции по химической физике ферментативного катализа, Таллинн, 1987, на 5-ой конференции молодых ученых социалистических стран, Пущино-на-Оке, 1988, на 14-ом сьезде IUB, Прага, 1988, на 11-ой международной конференций по химии фосфора, Таллинн, 1989, на 3-ей конференции по холинэстеразам, Ла Гранд Мот, 1990.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, 3 глав, в которых излагаются результаты, части обсуждения результатов, выводов и списка литературы (175 наименования). Работа изложена на 152 страницах, включает 26 таблиц и 41 рисунок.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1■ Материалы и методы исследования

Ацетилхолинэстеразу (К.Ф. 3.1.1.7) яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxlana), очищенную до гомогенности методом аффинной хроматографии, получили из Института химической и биологической физики АН Эстонии. Концентрация нативного фермента определялась титрованием активных центров 0,0-диэтил-паранитрофенилфосфатом по методу Берри. Химически модифицированная ацетилхолинэстераза была синтезирована при обработке нативного фермента и,11-диметил-2-фенилазиридинием, который получили из гидрохлорида М,и-диметил-2-хлоро-2-фенилэтил-амина, синтезированного ранее на кафедре органической химии Тартуского университета.

Сложные эфиры получали при реакции соответствующих спиртов с уксусным ангидридом. Все использованные сложные эфиры, в том числе и коммерческие, были подвергнуты ректификации . Чистоту веществ проверяли методом газовой хроматографии ("Chrom 5", ЧССР, носитель 10* Carbowax 2ОМ).

О,О-диэтилтиофосфаты (CH3CH20)P(0)SR при R=(CH2)n-CH3 (п=4,5 и 7) nor,;, чали реакцией диэтилхлорофосфата с соответствующими меркатидами натрия. Полученные продукты подвергали

очистке на колонке силнкагеля ICN Pharmacenticals (ФРГ). Элюентом выла смесь ацетона с гексаном (1:4) . Остальные фосфорорганические ингибиторы при R=C2H5, н-С3Н7, н-Сен13, н-С„Н,_ выли синтезированы ранее на кафедре органической химии

о Ii

Тартуского университета.

А.лкансульфонилхлориды RS02C1 (R=-CH(CH3 ) 2 ,-СН2СН(СН3) 2 И -(СН2)2СН(СН3)) были получены при реакции натриевых солей соответствующих алкансульфокислот с фосфорпентахлоридом. Натриевые соли алкансульфокислот были получены реакцией соответствующих алкилбромидов с сульфитом натрия. Все алкан-сульфонилхлориды, в том числе коммерческие (R=-cnH2n+i при n=l-4, Aldrich), были использованы после ректификации.

Для измерения активности нативного фермента применялся спектрофотометрический метод Эллмана при Л=412 нм. Условия реакции: 0.15 M фосфатный буфер, рн=7.5, 25°С. Концентраций 5,5-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) и ацетилтиохопина были 1 мМ. Активность модифицированного фермента определяли по скорости гидролиза п-нитрофенилацетата при Д =402 нм (0.15М фосфатный буфер, рН=7.5, 1.7* ацетонитрила, 0.7 иИ субстрата). Значение молекулярной активности модифицированного фермента относительно п-нитрофенилацетата ам=э300сек . Спектрофотометрические измерения проводились на приборе "DU8" (Beckman).

Кинетику ацетилхолинэстеразного гидролиза сложноэфирных субстратов измеряли на рН-стате RTS-822 фирмы "Radiometer" (Дания) в 0.15М растворе KCl. Реакции провели при 25°С под атмосферой, освобождённой от С02.

Кинетику необратимого ингибирования ацетилхолинэстеразы фосфорорганическими ингибиторами и алкансульфонилхлоридами измеряли по уменьшению активности фермента в псевдомономоле-кулярных условиях при 1000 кратном избытке ингибиторов в 0.15 M фосфатном буфере при рН=7.5, 25°С. За ходом реакций наблюдали, отбирая из реакционной смеси аликвоты и измеряя активность фермента спектрофотометрическим методом. Время реакции в случае алкансульфонилхлоридов не превышало 25% от значения времени полураспада ингибиторов в реакции гидролиза.

Кинетику щелочного гидролиза алкансульфонилхлоридов измеряли на рН-стате RTS-822 фирмы "Radiometer" (Дания) (0.15М KCl, 1.75% ацетонитрил). Реакции провели под атмосферой, освобожденной от СО^.

Для статистической обрлботки экспериментальных данных

применяли пакет программ "Statgraf" (Statistical Graphics Company, США) для ПЭВМ IBM PC/XT.

2. Гидролиз алкансульфонилхлоридов

Константы скорости мелочного гидролиза алкансульфонилхлоридов при 25°С приведены в Табл. 1. Как видно, наибольшей скоростью гидролизуется метансульфонилхлорид и наименьшей изопропансульфонилхлорид. Варьирование более удаленных частей алкильных групп не оказывает существенного влияния на реакционную способность сульфонилхлоридов. Наблюдаемые различия в реакционной способности обусловлены изменениями в энтропии активаций (Рис. 1).

Таблица 1.

Константы скорости щелочного гидролиза алкансульфонилхлоридов RS02C1 при 25°С

Nr R к М_1с~/ Hr R

1 снз 3000+400 5 сн(сн3)2 83+3

2 С2Н5 405+8 6 СН2СН(СН3)2 255+14

3 С3Н7 330+4 7 (СН2)гСН(СН3)2 274+20

4 С4Н9 330 + 3

2. Реакция сульфонилирования ацетилхолинзстеразы

Увеличение длины неразветвленной углеводородной .группы алкансульфонилхлоридов уменьшает константы скорости ингибиро-вания нативного фермента. Это указывает на взаимодействие алкильных групп алкансульфонилхлоридов с этим участком поверхности фермента, где располагается ацильная часть ацетатов при субстратной реакции. Дополнительный дестабилизирующий вклад изоалкильных групп уменьшается при удалений участка разветвления от сульфонилхлоридной группы (Табл. 2). Существование дестабилизирующих взаимодействий между алкиль-ными группами алкансульфонилхлоридов и активной поверхностью фермента выражается также в увеличений энтальпии активации в случае менее реакционноспособных соединений (Рис. 2).

Эффекты ионов тетраалкиламмония на скорость реакции ингибирования ацетилхолинзстеразы алкансульфонилхлоридами достигают насыщения при повышении их концентрации. Рассчитанные по этим зависимостям константы диссоциации комплексов

кон-м~1с"*

Рис. 1 Зависимость констант скорости щелочного гидролиза алкан-сульфонилхлоридов И302С1 от температуры. И=СН, (О),

2 5

3 7

4 9

). И-С3Н7 (Д), и-С Нд (А), И-С5Н11 (+•) при 25 С.

Ж-.103 Т

Рис. 2 Зависимость бимолекулярной константы скорости ингибирования ацетилхолинэстеразы с алкансульфонилхлоридами К302С1 от температуры. К=СН3 (О), с2н5 (О), с3н7 (О) , С4Нд (О). и-С3Н? И , и-с4н9 (Д^, И-С5Н11 (+).

Таблица 2.

Константы скорости реакции алкансульфонилхлоридов Н302С1 с нативной ацетилхолинэстеразой при 25°С

И к11М-1с*1

Иг

ким"1с"1'

1 СН3

2 С2н5

3 с3н7

4 С4Н9

13.1+1 6.0+0.2 0.7+0.03 0.38+0.01

5 СН(СН3)2

6 сн2сн(сн3)2

7 (СН2)2СН(СН3)2

0.03+0.001

0.19+0.02

1.77+0.08

фермента с ионами тетраалкиламмония совпадают с константами ингибированин гидролиза ацетилхолина этими же лигандами. Это свидетельствует о том, что влияние ионов тетраалкиламмония на скорость алкансульфонилирования фермента связано их взаимодействием с анионном центром фермента.

Наибольший эффект ускорения реакции сулфонилирования обнаружили в случае ионов тетраэтиламмония (Рис. 3). С другой стороны, реакций метан- и этансульфонилхлоридов ускоряются больре, чем реакций пропан- и бутансульфонилхлоридов (Рис. 4).

Рис. 3

Влияние ионов

тетраалкиламмония

(спн2п+1)4К+ на скоР°сть реакции ацетилхолинэс-

теразы с алкансульфонил-

хлоридами ЕЭО^С! и=снз

(О), с2н5 (•), С3Н? (□),

С4Нд (В) при 25°С.

Рис. 4 Зависимость константы скорости ингибированин ацетил-холинэстеразы при 25°С от длины алкильной группы алкансульфонилхлоридов спн2п+1302с1 В присутствии ионов тетраалкиламмония

К=СН3 (О), с2к5 (•), с3н7 (□), с4нд (в

П

Г

Модификация анионнонго центра ацетилхолинэстеразы ионом N, II- диметил- 2-фенилазирилиния ускоряет больше всего реакцию фермента с этансульфонилхлоридом {Рис. 5). При этом проявляется аналогия с влиянием тетрапропил- и тетрабутиламмоние-вых ионов на скорость сульфонилирования ацетилхолинэстеразы (см. Рис. 3) . Следовательно, влияние катионных соединений на скорость этой реакции зависит от их объема.

Рис. 5. Изменение скорости реакции ингибиро-вания ацетилхолинэстеразы с н-алкансульфонилхлори-

дами Спн2п+1302С1 при 25°с в результате модифицирования анионного центра с ионом N,И-диметил-2-фенил-азиридиния.

3. фрсфорилирование модифицированного фермента

Бимолекулярная константа скорости реакции химически модифицированной ацетилхолинэстеразы с 0,0-диэтил-тиоалкил-фосфатами не зависит от гидрофобности уходящей группы БЕ1 и имеет среднее значение 0.12+0.02 М-1с-1 (Табл. 3). Это указывает на существенные изменения в активном центре фермента и на отсутствие взаимодействий уходящей группы фосфорорганических ингибиторов с гидрофобной поверхностью модифицированного фермента. По литературным данным можно сказать, что наличие таких взаимодействий является характерной для нативного фермента, где зависимость бимолекулярной константы скорости ингибирования описывается уравнением:

1од(к1)=-1.2 + 0.6-п . (1)

Так как логарифм среднего значения бимолекулярной константы скорости ингибирования модифицированной ацетилхолинэстеразы совпадает с константном членом уравнения (1), можно сделать вывод, что взаимодействия фермента с кислотной частью 0,0-диэтилтиоалкилфосфатов не изменились значительно в результате, реакции модифицирования м,и-диметил-2-феннлазиридинием.

Таблица 3.

Бимолекулярные константы скорости ингибйрования химически модифицированной ацетилхолинэстеразы фосфорорганическими соединениями (СН3СН20)2Р(0)БК при 25°С.

Иг И к1 М_1с_:1 Иг И к1 М-1с-1

1 С2Н5 О.11+0.02 5 (СН2)5СН3 0.09+С.01

2 (СН2)2СНЭ 0.085+0.02 6 (СН2)6СН3

3 (СН2)3СН3 0.14+0.04 7 (СН^СНд

4 (СН2)4СН3 0.14+0.03 вещества недостаточно растворимые

4. Реакция модифицированной ацетилхолинэстеразы со сложно-эфирными субстратами

Скорость реакции гидролиза неионных сложноэфирных субстратов с химически модифицированной ацетилхолинэстеразой описывается уравнением Михаэлиса-Ментен:

k_-ftEl.ES]

---------, (2)

Кш + ^

где к . - каталитическая константа, К - константа Михаели-сах ш

са, [Е] и [Э] - концентрации фермента и субстрата. Это позволяет анализировать полученные константы к^.^ и Кт (Табл. 4) в соответствии с общепринятой схемой действия ацетилхолинэстеразы (3) ,

КЭ к2 кз

Е+Э ЕЭ ЕА —Е+Р . (3)

Р1

В отличии от нативнои ацетилхолинэстеразы, где максимальная скорость гидролиза неионных сложноэфирных субстратов лимитирована стадией ацилирования и значение 1од(кса^.) описывается уравнением:

1од(кса4) = 1°д(ксаг)° + ?*■ о* + ? п . (4) В случае модифицированного фермента, однако, 1од(кса<_) не зависит от гидрофобности (Рис. 6) и от электроотрицательности (Рис. 7) уходящей группЕГ"субстрата, как можно подемонстрировать с помощью уравнения:

аюя1кса4)=юв1кса1) -f.il = Юд(кса^° + о* . (5) В соответствии со схемой (3) это значит, что в случае модифицированного фермента максимальная скорость гидролиза неионных сложных эфиров лимитирована стадией деацилирования (к2>>к3).

Рис. 6 Зависимость 1од(кса^) гидролиза соединений 1-9 из Табл. нативной (о) (Ярв и пр., 1976) и химически модифицированной (в) ацетилхо-линэстеразами от гидрофоб-ности уходящей группы субстратов.

ч? $

3

Рис.

Зависимость

<31од(ксаг) гидролиза соединений 1-3 и ю-13 из Табл. Ц нативной (в) (Ярв и др., 1976) и химически модифицированной (в) ацетилхолинэстеразами от электронегативности уходящей группы субстратов .

В условиях к2>>1с3 и при постоянстве к3 в рамках реакционной серии константа Михаэлиса является функцией Ке и к2.

Пш К = Пл к2>>к3 к2>>к3 % + к3

кз кз

К = К ----

(6)

В связи с этим можно ожидать, что рК^ модифицированного фермента кроме гидрофобности (п) зависит также от электроотрицательности (о ) уходящих групп субстратов в соответствии с уравнением:

?Кт = РКт° + ?*<** + <7>

где и -р- коэффициенты интенсивности гидрофобного и индукционного взаимодействий, соответственно.

4

о

Таблица 4.

Кинетические константы гидролиза сложноэфирных субстратов СН_С(О)ОИ с химически модифицированной ацетилхолинэстеразой■

Кг, И К щ (М)

1 снз 12.0+0'. 8 1. ■ з+о ■2Е-01

2 С2Н5 12.6+0.5 1, .2+0 .2Е-01

3 С3Н7 11.0+0.5 1. . 1+0 .2Е-02

4 с4н9 8.4+0.2 3. .4+0 .4Е-03

5 С5Н11 6.0+0.4 2, .0+0 .4Е-03

6 С6Н13 5.6+0.4 9, .0+1 .0Е-04

7 С7Н15 4.4+0.7 5, .1 + 1 .0Е-04

8 с2н4сн(сн3)2 7.8+0.4 8, .8+1 .ЗЕ-04

9 с2н4с(снэ)3 7.1+0.5 2 .5+0 .4Е-03

10 сн2сн=сн2 11.1+0.4 4 .1+0 .7Е-03

11 СН2С=СН 8.10+0.2 1. .0+0 .1Е-03

12 СН2СН2С1 16.0+0.7 3 .4+0 •6Е-03

13 С6Н5(фенил) 15.0+0.3 9 .0+0 .7Е-04

Зависимость рК от п для соединений 1-9, для которых * т

=0, представлена на Рис. 8 вместе с данными для нативного фермента по данным литературы.

Рис. 8 Зависимость рКт от гидрофобности уходящей группы для соединений 1-9 из Табл. 4 для нативного (О) и химически модифицированного (О) ферментов.

Как видно, химическое модифицирование анионного центра приводит к уменьшению Кт- Изменяется также взаимодействие фермента с более удаленными частями уходящих групп субстратов и значение п=2 является в обеих случаях "критическим", так как

при п>2 значение ^ уменьшается. Кроме того, модифицированный фермент не способен различить линейные и разветвленные группы в случае соединений с п >2. В связи с этим можно сказать, что включение иона N,11-диметил-2-фенилазиридиния в анионный центр ацетилхолинэстеразы затрагивает взаимодействие более удаленных частей уходящих групп субстратов с поверхностью фермента.

Корреляционный анализ по уравнению (4) для субстратов 14 и 10-12, у которых п<2, привел к следующим результатам: рКт°=-0.5+0.4, £>*=3.0+0.5 и -^ = 1.5+0.3 К=0.81 50=0.3.

Зависимость рК от электронегативности уходящей группы ш

является особенностью модифицированного фермента, так как в

*

случае нативной ацетилхолинэстеразы о =0.

Бимолекулярная константа скорости к^ является единственным параметром который не зависит от скорость-лимитируюрей стадии реакции (3),

к2

кХ1 = . (6) к

з

Это позволяет прямо сравнить каталитические свойства нативной и химически модифицированной ацетилхолинэстераз с помощью корреляционного уравнения:

1од(к1:г) = 1од(к1:г)0 + р*. 6* (7)

Зависимость 1од(к1:г) от гидрофобности для соединении 1-9 из таблицы 4 приведена на Рис. 9. Обиии вид этой зависимости совпадает с результатами для рКт на Рис. 7. Корреляционный анализ в соответствии с уравнением (7) для соединении 1-3 и 10-12, у которых п<2,

Рис. 9 Зависимость 1од(к1:1) от гидрофобности уходящей группы для соединений 1-9 из Табл. 4 для нативного' (данные из Ярв и др. 1976)(О) И химически модифицированного (О) ферментов.

привел к следующим результатам: 1од(к11)о=3 6+0 4

^>*=3.4+0.6 И ^=1.4+0.2, ИвО. 93, 50=0.27. Как ВИДНО, ЭТИ результаты совпадают с соответствующими параметрами для рКм. Это является следствием того, что оба эти параметра зависят от тех же элементарных констант Кз и к^.

4. Влияние химической модификаций анионного центра ацетил-

холинэстеразы на элементарные стадий катализа

Как было отмечено выдое, бимолекулярная константа

скорости ктт не зависит от скорость-лимитируюией стадии

» .

катализа. При сравнивании значении ив уравнении (6) со соответствующими значениями (Э =3 и -^=1.5 (Ярв и др. 1976) для нативного фермента видно, что они совпадают в пределах точности их определения. Единственное различие обнаруживается в значении 1од(к11)°, которое увеличивается при модифицировании фермента от 1.6 до 3.5. Следовательно, специфичность фермента относительно неионлых уходящих групп субстрата не меняется в результате модифицирования анионного центра.

Коэффициент гидрофобного взаимодействия в случае нативного фермента является суммой коэффициентов -Р и *р ь для стадий связывания и ацилирования,

так как для этих стадий соблюдаются следующие уравнения: рке = рКа° + • п , (8)

1од(к2) = 1од(к2)° п + 6*. (9)

Поскольку параметр К является комбинацией Кз> к2 и к3> получим из (8) и (9):

РКт = РКш° + + ^а ,п " <10)

Последнее уравнение предоставляет возможность понимания зависимости рК^ от структуры субстратов в случае модифицированного фермента, где чувствительность к гидрофобному эффекту дважды превышает -^^О,8 для нативного фермента. Предполагая, что в случае модифицированного фермента также соблюдяются соотношения (8) и (9), чувствительность рКм относительно гидрофобного взаимодействия является суммой соответствующих вкладов на стадиях связывания и ацилирования. На основе вышеприведенных результатов естественно предположить, что значения и не изменились в результате модифицирования фермента, так как их сумма осталась постоянной. К сожалению, в случае модифицированного фермента невозможно определить значения констант к2 и Ке, что не допускает прямой проверки

этого предположения.

Если химическая модификация анионного центра ацетил-холинэстеразы не изменила чувствительности этого фермента относительно структуре уходящих групп сложноэфирных субстратов на стадиях связывания и ацилирования, ускорение их ацетилхолинэстеразного гидролиза в бимолекулярных условиях реакции связано взаимодействиями только ацильной части субстратов с активной поверхностью фермента.

На основе полученных результатов можно сделать ряд выводов о влиянии химической модификации фермента на элементарные стадии гидролиза перечисленных в таблице 4 ацетатов. Скорость стадии деацетилирования ацетилхолинэстеразы не

изменилась при афинном модифицировании акионного центра, так 4 -1

как конста.чта к3=10 с для модифицированного фермента имеет

такое же значение как к3 для нативного фермента.

Скорость стадии ацетилирования ацетилхолинэстеразы

увеличивается в результате химического модифицирования

анионного центра фермента не менее чем в 100 раз, поскольку

для всех субстратов должно соблюдаться условие к2>10000с * и

в случае наименее активных субстратов значения к для

-1 г

нативного фермента не превышают 100 - 200 с

В условиях к2>>к3 для стадии связывания субстрата получим:

к2

К = К —-— и К >>К . (11)

э ш , э т

3

Из Рис.6, однако, видно, что значения Км для модифицированного фермента и Кд для нативного фермента имеют весьма близкие значения. Следовательно, эффективность связывания неионного субстрата при модификации анионного центра ацетилхолинэстеразы не увеличивается, или даже несколько уменьшается .

На основе следующей трехцентровой модели, приведенной представленной в литературе для описания специфичности нативной ацетилхолинэстеразы в реакциях со сложноэфирными

субстратами и необратимыми ингибиторами, ^

ч ч ч

можно резюмировать эффекты химического модифицирования на строение эстеразного центра. Во-первых, связывающие свойства подцентра о^, где распологается уходящая группа ацетатов, остались практически неизменными в пределах участка, способного взаимодействовать с н-бутильной группой. Во-втоых, в подцентре о2> который взаимодействует с ацильной частью ацетатов и алкильной группой алкансульфонилхлоридов, произошло конформационное изменение, в результате чего повышается эффектиЕ юсть связывания групп с тетраэдрической конфигурацией . Вс 'ретих, подцентра о3, который в нативном ферменте взаимодей ггвует с уходящей группой фосфорорганических ингибиторов, в модифицированном ферменте не проявляется.

На основе представленной модели можно также объяснить отсутствие заметных изменений во взаимодействиях кислотной части изученных фосфорорганических ингибиторов в реакциях ингибирования модифицированной ацетилхолинэстеразы. Одна из этоксигрупп взаимодействует с этой частью подцентра о^, связывающие свойства которой не изменились и другая с подцентром о^ где эффекты на связывание более длинных групп были минимальные.

В итоге, в результате модификации анионного центра ацетилхолинэстеразы стабилизируется активированное состояние стадии ацилирования фермента, когда на стадии нековалентного связывания имеет место дяже некоторая дестабилизация фермент-субстратного комплекса. Это возможно, если ковалентная модификация анионного центра ацетилхолинэстеразы ионом N,N-диметил-2-фенилазиридиния приводит эстеразный центр фермента к конформации, которая является оптимальной для помещения групп с тетраэдрической конфигурацией у атома, взаимодействующего с гидроксильной группой каталитического остатка серина.

Последний вывод поддерживается данными ускорения реакции ацетилхолинэстеразы с алкансульфонилхлоридами, так как тетра-эдрическая конфигурация этих соединений очевидно в некоторой степени имитирует активированное состояние сложноэфирных субстратов на стадии ацилирования.

Вышеизложенный механизм очевидно используется в случае гидролиза ацетилхолина для увеличения скорости этой реакции в результате конформационного изменения, индуцированного в результате взаимодействия триметиламмониевой группы этого соединения с анионным центром фермента.

выводы

1. Реакционная способность алкансульфонилхлоридов нбо2С1 в

реакции мелочного гидролиза определяется стерическими

свойствами заместителя И (11=СН„, С„Н_, н-С„Н_, н-С,Н„, изо-

3 2 5 3 7 4 9

С3Н?, ИЗО-С4Нд, ИЗО-С5Н11).

2. Реакционная способность алкансульфонилхлоридов ИБС^С! в реакций ингибирования ацетилхолинзстеразы определяется взаимодействием с тем же участком эстеразного центра фермента, который является и участком локализации ацильной части сложных эфиров в субстратной реакции.

3. Ионы н-тетраалкиламмония (С Н_ ,,)(п=1-4) в резуль-

П ¿П+Х 4

тате ускорения реакций соединения с короткой алкильной частью, увеличивают специфичность ацетилхолинзстеразы относительно н-алкансульфонилхлоридов.

4. Ковалентное связывание иона N,Ы-диметил-2-фенилазирилиния в анионный центр ацетилхолинзстеразы оказывает качественно такое же влияние, как и обратимое связывание тетраалкилам-мониевых ионов.

5. Химическая модификация анионного центра ацетилхолинзстеразы ионом N.Ы-диметил-2-фенилазиридиния приводит к увеличению константы скорости стадии ацилирования не менее, чем в сто раз. Константа связывания субстрата не изменилась или даже увеличилась, константа скорости стадии' деацилирова-ния осталась неизменной.

6. Предложен механизм действия активного центра ацетилхолинзстеразы, предполагающий, что связывание катионной триметиламмониевой части уходящей группы ацетилхолина в анионном центре фермента индуцирует в эстеразном центре конформационное изменение, приводящее к стабилизированию активированного комплекса стадии ацилирования в результате уменьрения стерических препятствий к ацильной части субстрата

7. При анализе корреляционных зависимостей структура-активность необходимо иметь в виду возможности появления отклонений от аддитивности в результате синергизма факторов взаимодействия лиганда с центром связывания.

8 Полученные результаты указывают на принципиальную возможность изменения специфичности ферментов путём ковалент-ного связывания аналогов обратимых лигандов с центрами регуляции.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. Сепп А.В. Влияние тетраалкиламмониевых ионов на реакцию сульфонилирования ацетилхолинэстеразы.- Тезисы докладов VII республиканской конференций молодых ученых химиков, Таллинн, 1987, с. 10.

2. Palumaa P., Sepp A., Langel 0., Jarv J., Zorko M. Interaction of cholinesterases with alkylsulfonylchlorides.-In: Abstracts of 18th FEBS Meeting, Ljubljana, 1987, p.120.

3. Sepp A., Jarv J. Acetylcholinesterase inhibition with alkanesulfonyl chlorides. Regulation by tetraalkylammonium ions.- Abstracts of the Intenational Conference on Chemical Physics of Enzyme Catalysis., Academy of Sciences, Tallinn, 1987, p.125.

4. Сепп А.В. Каталитические свойства ацетилхолинэстеразы, модифицированной Г1,М-диметил-2-фенилазиридинием. Реакция алкансульфонилирования.Тезисы 5-ой конференциий молодых учёных социалистических стран по биоорганической химий, АН СССР, Пущино, 1988, стр. 70.

5. Sepp A., Jarv J. Allosteric mechanism of acceleration of acetyl cholinesterase reaction with alkanesulfonylchlorides.-14th International Congress of Biochemistry, Abstracts, 14th July, Prague 1988, p.142.

6. Sepp A., Jarv J. Acetylcholinesterase Inhibition by Alkanesulfonylchlorides. Regulation by Tetraalkylammonium Ions.- Bioorg. Chem., 1989, v. 17, pp. 79-85.

7. Sepp A., Palumaa P., Langel tj. , JSrv J., Zorko M. Spatial Orientation of n-Alkanesulfonylchlorides in the Active Center of Cholinesterases.- Bioorg. Chem., 198Э, v. 17, pp. 131-140.

8. Сепп A.В., Ярв Я.Л. Каталитические свойства ацетилхолинэстеразы, модифицированной 11,Н-диметил-2-фенилазиридинием. Реакция алкансульфонилирования,- Биоорг. хим., 1989, т. 15, No 11, с. 1499-1503.

9. Sepp A. Chemical modification of the anionic centre of acetylcholinesterase with N,N-dimethyl-2-phenylaziridinium accelerates the acylation step of catalysis.- In: 3rd International Meeting on Cholinesterases, May 12-18th, La Grande Motte, France, 1990, p. 84.