Электростатический солевой эффект во взаимодействиях ацетилхолинэстеразы и трипсина с катионными лигандами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

ИНСТИТУТ химии АН ЭСТОНИИ

На правах рукописи

В.АЛШГУ

ЭЛЕКТР0СТАТИЧЕС1С!Й СОЖВОЯ Э522КТ ЕО ВЗМ*ЮЯЕ8СТБ!ШХ АЦЕТИЯХОЛШСТЕРАЕИ И ТРИПСЖ С КАТКОШШИ ЖГАВДШ

02.00.03 Органическая химия

I

Авторсфэрат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Таллинн 1991

Работа выполнена в лаборатории биоорганической химии Института химической и биологической физики Академии наук Эстонии.

Научный руководитель:

доктор химических наук

профессор А.А.ААВИКСААР

Официальные оппоненты:

доктор химических наук

профессор

У.Э.-Р.КИРСО

доктор химических наук

Я.Л.ЯРВ

Ведущая организация: Институт экспериментальной биологии Академии наук Эстонии

Защита диссертации состоится ____1991 г.

в ../Л., часов на заседании Специализированного совета по присуждению ученой стейени кандидата химических наук в Институте химии АН Эстонии (шифр К-017.05.01) по адресу: 200108 Таллинн, ул. Академия тез, 15.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте химии АН Эстонии. •

Автореферат разослан "/к".----1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат химических наук А.Ю.Эрм

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУЭЛЬНООТЬ Т8КМ, ИССЛЭДОВЯЛЛв $ЯЗ!Е:0-ХтпаСКЯХ основ

спэцпфгшостя дэСствил фэруэнтов прзводат к нзобходшгсетя кага-ЧЭСТЕ9НПОГО учйтз ВЛШШШ1 среди на узнавгниэ отдельных структурных элекэнтов субстратов центрам связывания в фэргэнтах. Так как многаэ штаболнты а биологически активные вацэстпа ег.гзет в сЕовм состбэ 20НЕН9 группировка п солешэ вфрзкт нэ-посрвдствэнно связаны с проявлением иегнонных взогаюдеЁстккЗ в хтэгаескп. реакциях, то их пзучешэ в фергэптатавных процессах котат дать кпфориацпэ о гахенЕзмах узнцвання зарягзшшх субстратов фэр/энт&чя.

В литература использовано несколько подходов для описанзя солевых зффэктов в фэр;ентатпв.'1ых реакциях, по пи одой из них нэ дал возмсЕноста построения обцзй количественной теории влияния электролитов на электростатические взаэьгадэйствзя в фэрлентах. В связи с этан дальнейшее изучения захонокзрностеЭ проявления солэвчх эффектов в ферментативных реакциях является актуальной задачей в хтапеской эпэгадалогии.

Цель и задачи исследования. Задачей настоящей работа било

оиигимвтйчёилОй ЬССЛодОВоНКд СОЛсЫжХ ЗффоКТСВ В СЦС

тагаюлинэстеразы и трипсша с катионшш лигаздаггл. Выбор объектов исследования был обусловлен тем фактом, что оба фермента обладают ярко выраженной спатфггаостью по отношению к катионнш субстратам, молекулярной основой которой считает1 наличие в их активных центрах специального "анионного пункта" для взаимодействия с катиошшки группами в субстратах и других специфических лигандах.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работа на основе теории полиэлектролитов предложен новый подход дая описания солевых эффектов в реакциях хдлинэстераз с катноннкии субстрата;.!:-!, учитыващкй тот факт, что холинэстеразы при оптимальных для их действия значениях рН являются полаанионюга. В результате исследования влияния многих солей в широком интервале их концентраций на реакции ацетнлхолинэстеразы с зарягенншет

субстратами и ингибиторами получено экспериментальное доказательство применимости теории Ыанншга для объяснения закономерностей проявления электростатического солевого аффекта во взаимодействии заряженных лигандов с глобулярными биополимерами -ферментами. Показано, что в согласии с выводами теории поли-електролитов, параметры елёктростатического солевого аффекта в рэакциях холинэстераз зависят от общего заряда на поверхности фермента.

Установлено, что влияние солей на гидролиз катионных субстратов под действием трипсина заключается в конкурентном шггибировашш активности фермента моновалентными катионами. Эффективность связывания ионов металлов и других катионных лигандов в активном центре трипсина при этом зависит от общего заряда его молекулы.

Введением дополнительных отрицательных зарядов в молекулу трипсина с помощью химического модифицирования получены препараты фермента, которые по селективности действия на .специфические катионные субстраты при низких концентрациях солей более чем в 200 раз превышают нативный трипсин. Учитывая устойчивость sтих препаратов в отношении автолиза, они могут найти практическое применение для гидролиза белковых субстратов в аналитических целях. Практическую ценность для исследователей специфичности и механизмов действия ферментов представляют также предложенные в работе методы анализа экспериментальных данных по влиянию среды на кинетику ферментативных реакций на основе теории полиэлектролитов.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 7 докладов на научных конференциях. Результаты работы доложены на З-ей международной конференции по холинэстеразам (Гранд Мот, Франция, 1990), на 14-ом Международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988), на Международой конференции "Химическая физика ферментативного катализа" (Таллинн, 1987), на VI Всесоюзном симпозиуме по инженерной анзимологии (Каунас, 1989), на VII Биохимической конференции Прибалтики (Каунас, 1990), на V Всесоюзной конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа" (Москва, 1987), на VII Республиканской конференции молодых учбных-

ходиков (Таллинн, 1987).

Объбн работы: 104 страниц ийвинописвого текста, в той числе 19 таблиц и 17 рисунков. Диссертация состоят из ввэдзнпя, 5 глав и выводов. В литературное части рассмотрены возмогные механизмы влияния солей на связывание зарягжшшх лагандов белками н прэдагдущке работа по исследовании солевых эффектов в реакциях холкнэстераз и трипсина.

СОДЕРВАКИЕ РАБОТЫ

I. Материалы и методы исследования.

Ацетилхолниэстераза (К® 3.1:1.7) из яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxíала) - фэрмеят, очищенный Р.Э.Раба сф^гшной хроматографией до гомогенности. Ацатилхолинзстераза из электрл-ческого органа электрического угря - препарат фирмы "Signa" с удельной активностью 1000 ед/мг.

Трипсин - препарат фзрш *Спофа". Метиловый эфир Н-карбо-бензокси-Ь-аргинина был синтезирован Н.Поярковой (Институт бпо-органической химии АН УССР, Киев). Остальные, субстраты и ингибиторы были коммерческими препаратам.

За гидролизом суостратов следили спектрофотометрлческл на приборе "Beckman UV 5260" или титрикэтрически на рН-стате фирмы "Radiometer" (Дания).

Анализ кинетических данных по ферментативному гидролизу субстратов проводили в рамках трехстадийной реакционной схемы:

Кз кг, к^

Е + S ^-►ES —«- ЕА —>-Е + Р2 , (I)

где ES - нековалентный фермент-субстратный комплекс, ЕА - ацил-фермент. Константы скорости второго порядка kn = k^/Kg определяли в псевдомономолекулярных условиях IS10 « Км(каж) из экспериментальных кинетических кривых методом Рудакова. Константа *2 • *3

^ат = ^ + кз и ^(каж) = Ч ' V(W из

зависимости начальных скоростей гидролиза от концентрации

субстрата по ыэтоду нелинейной рагрэсснн.

Обратвгюе ннгкбарованве ферментативного щцролгза исследовалось в псевдомоводалекудярных усговдох. В прасутствни обратимых ингибяторов (I):

с 1 + • (2>

Константа аигабаровавЕЯ определяла ез линейных зависимостей kj-j/üff^ от Ш."

Концэнтрацщ! ЛХЭ определяла из начальна! скоростей гндро-тз& в 2,3 Ш растворе ацэтилхолжа при 25°С, pH 7,5 в 0,1591 KCl, кстользуя значение ыолекулярпой активности 6,33-Ю"3 с-1 доз фзр^энта ез еда кобры и 10,8«Ю3 с-1 для форешнта из электрического угря. Концентрация активных центров трипсина определяла татровзннэм фермента реагентом Ноулса.

2. Влияние солэйда связывание катюшшх субстратов н ингибиторов с ацетилхолзнэстеразой.

В работе изучено влияние солэй на кинетику ацетнлхолкнзс-теразвэго гидролиза катионных субстратов и на константы ингиби-ровзния етой реакции мультивалентными заркханкынн снгнбшюра'а! - галламином и гексаметонием. Обсуздается возжшность применения разных моделей для описания обнаруженных солевых аффектов. Сделан вывод, что уравнение Дебая-Бренстеда не дабт адекватного отрааания наблюдаемых явлений: (I) в растворах солей двухвалентных катионов проявляются отклонения от единое зависимости кинетических параметров от ионной силы, (2) наблюдаемые изменения в кинетических константах по величине существенно превышают эффекты, которые можно объяснить на основе теории Дебая--Хюккеля.

В работе показано, что солевые эффекты в реакциях ацетил-холинэстераз описываются в рамках теории Мэннинга. По теории полиалектролитов, сформулированной Мэннингом в 1969 году, на молекулах полиэлектролитов, плотность зарядов которых превышает определённое критическое значение, происходит частичная нейтрализация зарядов за сЧбт связывания (конденсации) противоионов. -

В результате этого процесса плотность зарядов на цепа линейного полиэлектролита уменьшается до критического значения, которое в водном растворе с одновалентными противоионами при 25°С составляет единицу заряда на 7,1 8.

Согласно этой теории, влияние солей на сродство юлианиова к катнонным лигандам описывается уравнением (Record, Lotaan, deHaseth, 19Т6)

рКр = pg° - lg[Me+z] (3)

где Kq - наблюдаемая константа диссоциации комплекса катионный лигаад-полианион, - константа диссоциации при концентрации противоконов Шэ+21 - J U, Z^ - заряд лиганда, г - заряд катиона соли а ф+г - фракция конденсированных противогонов на заряд полианиона. Значения ф для мово- и дввадентных катионов связаны по уравнению

Фг+ = <1 + Ф+)/4 (4)

Теория Ыэннинга успешно применяется для описания различных свойств растворов линейных полиэлектролитов.

Из рис. I видно, что в реакции ацетилхолинэстеразы из яда кобры с 2-(Н-метилморфолиннй)зталацетатом наблвдаются линейные зависимости lg kjj от ig с разными наклонена в зависи-

мости от заряда катиона соли. Аналогичная картина получена такгэ для фермента из электрического угря. Поскольку кп = kg/Kg, п kg в этих реакциях нэ зависит от концентрации соли, то наблвдаекые на рас. I прямые когно рассматривать как под-тверздение соблюдения уравнения (3) в случае ацетилхолинэстеразы с Kg в качестве Кр.

Известно, что в реакциях ацетилхолинэстераз, кромэ солевкх эффектов электростатического происхоздения, проявляются эффекта высаливания и всаливания. Для учЗта этих эффектов экспериментальные данные по зависимостям )сХ1 от концентрации соли в общем случае следует анализировать по уравнению

рКд = рХ° - lg[Ke+zl + ДаеС , (5)

где Дзг - разница коэффициентов высаливания переходного и исходного состояний реагентов и Cg - концентрация соли.

б

19 1Ме*4|

Рис. I. Влияние солей на скорость ферментативного гидролиза ' 2-(Н-метилморфолинии)этилацетата под действием ацетил-холиастеразы из яда кобры; рН 7,5, температура 25°С, о - КС1, а - NaCl, • - KN03, □ - MgCl2, в - СаС12.

Так как k^ ацетилхолинэстеразного гидролиза субстратов не зависит от концентрации соли вместо KQ можно использовать значения kjj. Необходимость учбта эффектов высаливания значительно затрудняет точное определение значения ф+г, так как между аргументами функции (5), Cs и lg fHe+zl, во многих ограниченных выборках данных имеется взаимная корреляция (г ? 0,75). В настоящей работе для ацетилхолинэстеразы из яда кобры при рН 7,5 и температуре 25°С используют значение <J>+ = 0,49, которое было получено Т. Кесватера при анализе данных по влиянию солей на реакцию 14 катионных. ингибиторов и субстратов с ацетилхолин-эстеразой.

Для дальнейшей проверки предложенного подхода изучали влияние КС1 и MgClg на константы ингибирования ацетилхолин-астеразы мультивалентными ингибиторами гексаметонием (ZT = +2)

и галл амином = +3). Как видно "из рис. 2, при высоких концентрациях, где эффекты высаливания значительны, проявляется отклонение от линейности.

-lalMe*^

Рис. 2. Влияние KCl (о) и MgClg (в) на константу ингибирования ацетилхолинэстеразы ионвми гексаметония при pH 7,5 и температуре 25°С. Наклоны прямых соответствуют вычисленным значениям из таблицы I.

Результаты обработки экспериментальных данных по влиянию солей на константы ингибирования ацетилхолинэстеразы приведены в таблице I вместе со значениями 2ь>ф+„, вычисленными по уравнениям (3) и (4), исходя из значения ф+ - 0,49. Хорошее соответствие между наблюдаемыми в эксперименте и вычисленными значениями в таблице I показывает, что с помощью предложенного подхода можно описывать влияние различных электролитов на электростатическое слагаемое свободной энергии образования комплексов ацетилхолинэстеразы с ионными лигандами, используя только один эмпирический параметр, Ф+.

Параметры уравнения (5) для описания влияния

Таблица I солей на

связывание катионных лигандов ацетилхолинэстеразой яда кобры при pH 7,5 и температуре 25°С.

Лиганд

Заряд лиганда

Соль

наблюдаемый

вычисленный

Субстрат +1 СаС12 о,зз±о,ог 0,37

Гексаметоний +2 KCl 1,00±0,01a 0,98

BgCl2 0,77±0,09 1,43i0,096 0,74

Галл амин +3 KCl 1,44

MgCl2 1,02i0,07 1,15

а)

Азе = 0,17i0,Q4

б)

Дае = 0,82±0,64

Из числа факторов, влияющих на ф+, в работе варьировали заряд белка. Повышение pH реакционной среды от 7,5 до 8,5, что приводит к увеличению общего отрицательного заряда белха, в случае ацетилхолинэстеразы из электрического органа электрического органа электрического угря привело к увеличению ф+ от 0,48 до 0,60. На рисунке (3) приведены данные по влиянию KCl и %С12 на гидролиз 2-(М-метилморфолиний)этилацетата ацетилхолинэстеразой, в которой свободные аминогруппы модифицированы даангидридом пиромеллитовой кислоты, в результате чего в молекулу белка введено около 30 новых отрицательных зарядов. Такое модифицирование фермента привело к увеличению ф+ до 0,60 и ф+2 до 0,42 (вычисленное по ф+ = 0,60 значение <J>+2 = 0,40).

Изучали также влияние KCl на активность препарата ацетилхолинэстеразы, часть карбоксильных групп которой была модифицирована трис-(гидроксиметил)аминометаном с помощью карбоди-имида. При pH 7,2, когда молекула модифицированного фермента несвт небольшой положительный заряд (pl препарата 7,5), солевой эффект в гидролизе ацетилтиохолина был значительно меньшим, чем' в случае нативной ацетилхолинэстеразы.

Рис. 3.

Влияние КС1 (о) и М£С12 (в) на гидролиз 2-(И-метил-морфо линий') этилацетата под действием ацетилхолинэсте-разы из яда кобры, модифицированной диангидридом пиромеллитовой кислоты. Условия опытов: рН 7,5 и температура 25°С.

- 1д 1ме">

3. Влияние солей на гидролиз ннзкомолэкулярных катиотшх субстратов трипсином.

На рис. 4 показано влияние КС1 на взаимодействие трипсина с субстратами, метиловым эфиром 11-ацетил-Ь-лизина и метиловым эфиром М-карбобензокси-Ь-аргинина, а также обратимым ингибитором бензамидином. Из рисунка видно, что КС1 одинаково влияет на константа связывания и на бимолекулярные константы скорости гидролиза. В согласии с этим, отдельные измерения показали, что кд гидролиза М-карбобензокси-Ь-аргинина не зависит от концентрации соли.

Из' рисунка 5 видно, что влияние солей на трипскновый гидролиз п-нитроанилида бензоиларгинина сильно зависит от природы катиона, и для всех солей соблюдаются линейные зависимости от (Ме+1. Полученные результаты показывают, что влияние солей на гидролиз катионных субстратов заключается в конкурентном ингибировании активности фермента моновалентными катионами.

РИС. 4.

Влияние KCl на взаимодействие трипсина с катионными лиган-дами при pH 8,5 и температу-

ре 25°С;

о - kjj гидролиза

метилового »Jupa N-ацетилли-зина, v - Kg метилового эфира К-карбоОензаксиарпши на, а - Kj инг^Оирдвания трипсина бензамидином.

- ■■ 1 ■"— --—1 / v

V / / V

* - д чЬ т •

»

0.5 СШ'М

1.0

Рис. 5.

Влияние солей на трипсановый гидролиз п-нитроанилида бензоиларгкнина при pH 8,3 и температуре 25°С, в 0,05 М трис-HCl; ^ - CsCl, д.- NaN03, о - KCl, о - KNO-j, а - NH4C1, v - L1C1.

Значения констант ингибировання для разных катионов приведены в таблице 2. Из таблицы, в частности, видно, что, с одной стороны, введение гидрофобных заместителей в аммониевые ион приводят к увеличении сродства трипсина к ингибитору, а с другой стороны, объемистый тетраметилашониевый ион является относительно слабым ингибитором. Константы шггибирования активности трипсина катионами металлов по величине вполне сравнила с константами для алхилачмониевых ингибиторов.

Таблица 2

Константа конкурентного ннгибнрования гидролиза катиоиянх субстратов под действием нативного (К1) и модифицированного (К"°Д) трипсина различными катионами.

Катион К1, Ы мМ К1/К^од

П+ 1,5±0,2 83±2 18,0

На+ 0,72±0,05 4112 17,6

(СНз)^ 0,67±0,0б

К* 0,2810,01 9,8*0,6 28

0,18±0,01 5,6+0,4 32

Сз+ 0,12±0,01 5,4±0,3 22

СН^Нз 0,13±0,01 -

^Н^Нз 0,040±0,0005 -

Для оценки какой вклад в энергию связывания катионных лигандов вносят заряженные группы, не входящие в активный центр фермента, изучали препарат трипсина , в котором аминогруппы лизинов были модифицированы пиромеллитовым диангидридом (ПЫК-трипсин). На рисунке 6 представлены данные по влиянию различных солей на гидролиз п-нитроанилида Л-бензоиларгинина под действием модифицированного трипсина.

Соблюдение линейных зависимостей с наклоном I в координатах (1с°1/к11-1) от [Ме+1 на рисунке 6 показывает, что механизмом влияния солей в этих условиях является конкурентное

ингибирование. Константы ингибирования модифицированного трипсина также приведены в таблице 2. Сродство ПМК-трипсина к катионам в среднем в 23 раза превышает сродство нативного фермента.

- 19 ) М е' )

Рис. 6. Влияние солей на гидролиз п-нитроанилида бензоиларги-нина под действием трипсина, модифицированного диангид-ридом гшромеллитовой кислоты. Условия опытов: температура 25°С, рН 8,3 Б 0,005 М трис-НС1; V - Ь1С1, V -- д - 11аС1, а - КС1, о - Сэа, о - Ш4С1.

Скорость гидролиза субстрата п-нитроанилида бензоиларги-нина под действием ПМК-трипсина при низких концентрациях соли была в 250 раз выше, чем в случае нативного трипсина, и кХ1 достигала значения 1,72-Ю4 1Г1с~1. При этом молекулярная .активность ПМК-трипсина а°пт = 0,55 при оптимальной концентрации субстрата (3опт = 50 цМ) в 13 раз превышает ккат трипсино-вого гидролиза этого субстрата.

Значения к21 гидролиза этилового эфф(; Н-ац9тал-1«-тирозина для ИЖ-трипспна и нативного трипсина были равны. Из рис. 7 видно, что на гидролиз нейтрального субстрата этилового эфира Ы-ацетпл-Ь-тирозина соли сказывает влияние только по механизму высаливания.

Полученные результаты показывают, что в реакции трипсина отсутствует первичный солевой эффект как в стадии связывания, так и в последущих стадиях, несмотря на то, что специфтшскиэ субстраты этого фер&энта имеют в своем состава катионнув груп-,' пировку, а на "дне" полости связывания боковой цепи субстрата находятся отрзщательно зарягеннвя группа Азр-189.

4. О механизмах влияния солей на связывание спецга|ичоских катионных лзгандов с трипсином и ацетилхолинэстеразой.

Полученные данные показывают, что обнаруженные отрицательные солевые эффекты в связывании катионных лигандов с ацетал-холикэстеразой или трипсином в обоих случаях обусловлены диссоциацией связанных с ферментом катионов среды в процессе связывания. Механизмы связывания катионов при этом, однако различны.

"Анионные пункт" в активном центре трипсина обладает способностью специфического связывания моновалентных неорганических катионов, и последние конкурируют в активном центре с катионныш субстратами. В работе показано, что введение дополнительных отрицательно зарязенных групп в молекулу фермента привело к повышению сродства активного центра к катионам, по всей вероятности, за счйт создания дополнительного отрицательного потенциала на ферменте.

"Анионный пункт" в молекуле ацетшшзлинэстеразы, по-видимому, не обладает повышенной способностью связывания неорганических катионов по сравнению с другими анионными группами на молекуле фермента. Вследствие этого катионы соли связаны на ацетилхолинэстеразе в делокализованном виде (конденсированы), и их влияние описывается в рамках конденсационной теории полиэлектролитов.

выводы '

1. На основе теории полиэлектролитов Мэннинга предложен новый подход для описания солевых эффектов при связывании катионных лигандов ацетилхолинэстеразами, учитывающий полианионный характер фермента. В согласии с теорией найдены линейные зависимости мезду логарифмами констант связывания катионных лигандов и молярной концентрацией катионов соли, охватывающие лиганда различной зарядности, что позволяет электростатический солевой эффект в реакциях холинэстераз описать с использованием лишь одного эмпирического параметра, характеризующего данные фермент.

2. С помощью ковалентного модифицирования различных заряженных групп на поверхности фермента вне активного центра доказано их участив в определении величины и характера проявления электростатического солевого эффекта в реакциях холинэстераз.

3. Установлено, что влияние солей на гидролиз катионных субстратов под действием трипсина заключается в конкурентном кнгибировании активности фермента моновалентными катионами; двухвалентные катионы ингибирующими свойствами не обладают. Первичный солевой эффект в реакциях трипсина не наблюдается.

4. Установлено существенное влияние поверхностного заряда трипсина на связывание катиошшх лигандов (й его активном центре. Введение отрицательных зарядов в молокулу фермента модифицированием аминогрупп лизиновых остатков диангидридом пиро-меллитовой кислоты привело к более чем 10-кратному увеличению эффективности связывания катионных лигандов в активном центре трипсина. Скорость гидролиза субстрата, п-нитроанклида бензокл-аргинина, под действием модифицированного трипсина при низких концентрациях солей при этом была в 250 раз выше, чем в случае нативного фермента.

5. Отрицательные солевые эффекты при связывании катионных лигандов с' ацетилхолинэстеразами и трипсином обусловлены диссоциацией связанных с ферментом катионов из реакционной среды. Механизмы связывания ионов при этом различны: конденсация катионов на полианионе для ацетилхолинэстераз, и связывание в активном центре для трипсина.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. V.Tougu, A.Fedak, T.Kesvatera, A.Aavlksaar. Acetylcholinesterase as a polyelectrolyte In reaction with catlonlc substrates. - FEBS Lett., 1987, v. 255, N 1-2,

p. 77-81.

2. В.Тыугу, Т.Кесватера, А.Аавиксаар. О влиянии неорганических солей на реакцию трипсина с катиошшми субстратами. - Изв. АН ЭССР. Химия, 1987, т. 36, JS 3, С. 232-234.

3 .А.Аавиксаар,В.Тыугу,Т.Кесватера.Влияние неорганических

солей на реакцию . трипсина с катионными субстратами. Отсутствие первичного солевого эффекта. - В: Химия биологически активных веществ (Сборник научных трудов) С. 78-79, Нальчик, 1988.

4. V.Tougu, T.Kesvatera. Salt effect on multivalent llgand binding by acetylcholinesterase. - III International Meeting on Chollnesterases, Program and abstracts, p. 138, La Grande-Motte, France, 1990.

5. A.Aavlksaar, T.Kesvatera, V.T5ugu, M.Kosk. Electrostatic eifects In serine protease kinetics. - 14th International Congress of Biochemistry. Abstracts, v. 4, p. 74, Praha, 1988.

6. V.Tougu, A.Pedak, T.Kesvatera, A.Aavlksaar. Counterlon condensation model In description of salt effects In finding of catlonlc substrates and inhibitors with aevtyieholin-esterase. - In: Chemical Physics of Enzyme; Catalysis. Abstracts, p. 126, Tallinn, 1987.

7. В.Тыугу, Т.Кесватера. Влияние зарядов лиганда и фермента на связывание катиошшх обратимых ингибиторов в каталитическом

центра ацетилхолинэстерази. - Материалы VII биохимической конференции Прибалтийских республик, EksperlL-.ent.lne В1о1ов13а, 1990, й 2, с. 170-171.

8. А.Аагшксаар, В.Тыугу, В.Шиюпнис, Т.Кесватера. Новая интерпретация солевых эффектов .в форментативни/ реакциях. В: Инженерная Энзимология. Материалы VI всесоюзного симпозиума, ч. I, с. 5-6, Вильнюс, 1988.

9. В.Тыугу. О влиянии солей моновалентных катионой на трипси-ковыЯ гидролиз п-нитроаншшда 11-бвнзоиларгинина. Тезисы докладов VII республиканской конференции молодых учйных-хи-миков. ч. I, с. 13, Таллинн, 1987.

10. В.Тыугу. О применении теории полиэлектролитов дл:: описания солевых эффектов в реакциях ацетилхолинэстеразц. - Тезисы докладов VII республиканской конференции молодых у-'них-хи-миков. ч. I, с. 12, Таллинн, 1987.