Фаговый дисплей мышиных миниантител: получение и использование тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ЛАМАН АЛЕКСАНДР ГЕОРГИЕВИЧ

ФАГОВЫЙ

ДИСПЛЕЙ МЫШИНЫХ МИНИАНТИТЕЛ: ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ.

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в группе молекулярных аспектов иммунологии репродукции Филиала Института биоорганической химии

им М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук.

Научные руководители: док.хим.наук Несмеянов В.А.

канд.биол.наук Бровко Ф.А.

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАН док.хим.наук Габибов А.Г.

канд.биол.наук Шемякин И.Г.

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской Академии Наук.

Защита состоится октября 2003 г. в 10 часов на заседании Специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117977, г.Москва, ул.Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «Аа> ® 9 2003 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук

В.А.Несмеянов

'<¿.00?-А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Антитела являются одним из эффекторных компонентов иммунной системы. Высокоспецифичное, высокоаффинное взаимодействие антител с антигенами позволяет использовать их в исследовательских, аналитических и терапевтических целях. Исторически первым источником антител была сыворотка иммунных животных и человека. Дальнейшим развитием способов получения антител явилось создание гибридомной технологии получения моноклональных антител. К достоинствам моноклональных антител можно отнести высокую специфичность, химическую однородность, возможность получения в больших количествах. К недостаткам - то, что технология получения моноклональных антител разработана для мыши и крысы и является трудноприменимой в случае антител человека, в то время как для терапии требуются именно человеческие иммуноглобулины. Затруднения возникают и в тех случаях, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается преодолеть толерантность к антигену.

Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител. Основой метода является создание комбинаторной библиотеки, в которой вариабельные участки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов соединены случайным образом и представлены на поверхности нитевидного бактериофага. Каждый бактериофаг, как и В-лимфоцит, экспрессирует антитело единственной специфичности. При достаточно большом размере библиотеки репертуар вариабельных участков будет сравним с репертуаром антител в организме. Фаги, несущие антиген-связывающие фрагменты антител (scFv, Fab) нужной специфичности, могут быть отобраны на иммобилизованном антигене [McCafferty, 1990].

К достоинствам метода можно отнести возможность отбора клонов-продуцентов миниантител in vitro, минуя стадию иммунизации животных, возможность получения антител к аутоантигенам, токсинам и слабоиммуногенным соединениям, отсутствие необходимости использования лабораторных животных и поддержания долговременных культур клеток эукариот; сокращение времени получения индивидуальных клонов до 1014 дней по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии, относительную простоту получения миниантител и их низкую себестоимость, возможность создания гибридных молекул антител с маркерными белками.

В настоящей работе возможности данного подхода продемонстрированы созданием представительной библиотеки мышиных миниантител (эсру) и получением на основе этой библиотеки миниантител к антигенам различной природы.

Цель работы.

Целями датой работы было создание комбинаторной библиотеки миниантител мыши в формате фагового дисплея, получение на ее основе веру к белковому антигену -гранулоцитарному колонийстимулирующему фактору человека (й-СЭР) и фитогормону -транс-зеатину создание тест-системы определения й-СБН.

Научная новизна и практическая ценность работы.

С использованием современных подходов к клонированию специфических последовательностей ДНК из спленоцитов неиммунной мыши получена библиотека миниантител, экспрессируемых фагмидой рНЕМ. Предложены оригинальные схемы направленного отбора фагмидных клонов, несущих высокоаффинные миниантитела к конформационным эпитопам белкового антигена. Для й-СБР получена пара миниантител к пространственно-разобщенным эпитопам, на основе которой создана иммуноферментная тест-система для его количественного определения в растворе. Поскольку в-СвР применяется в онкологии для восстановления числа нейтрофилов при лейкопении, вызванной радио- или химиотерапией, данная тест-система может использоваться для контроля уровня О-СвИ в сыворотке крови пациентов. Впервые получены миниантитела, к природному цитокинину - транс-зеатину, с помощью которых можно проводить тестирование образцов растительной ткани на содержание цитокининов. Сконструированная библиотека может служить источником получения миниантител, к любым другим антигенам.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на /О? страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, основных результатов и выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из ¿¿У наименований.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ. Работа докладывалась на V чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова «Биоорганика-2000» (13-20 ноября 2000 г., Москва-Пущино); международном симпозиуме «Signalling Systems of Plant Cells» (5-7 June, 2001,Moscow, Russia); Международном симпозиуме «Intracellular Signalling in Plant and animal Systems», (9-14 September, 2001. Kyiv, Ukraine) и 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology (15-22 Septeber, 2002, Pushcino, Russia).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Конструирование библиотеки миниантител.

Амплификация фрагментов генов вариабельных областей иммуноглобулинов.

С целью создания библиотеки scFv из селезенок 3-х мышей были выделены клетки, представляющие собой смешанную популяцию, содержащую как В- и Т-лимфоциты, так и эритроциты, клетки соединительной ткани и др. Мы использовали обогащение спленоцитов мононуклеарными клетками путем центрифугирования в градиенте фикол-триомбраст (d= 1,077). В результате было получено порядка 108 клеток, большая часть которых была представлена клетками лимфоидного ряда. Из полученной фракции клеток выделяли РНК и ДНК для последующей амплификации вариабельных участков антител.

Дня выделения и амплификации вариабельных участков антител использовали набор олигонуклеотидов, охватывающий 32 варианта FR1 участков и 4 варианта J-сегментов генов вариабельных областей иммуноглобулинов [Clackson, 1991; Orlandi, 1989; Ward, 1989]. Участки отжига праймеров на мРНК и структура кодируемого фрагмента схематически изображены на рис.1.

Для синтеза первой цепи кДНК тяжелой цепи IgG использовали праймер CH1FOR, для синтеза первой цепи кДНК легкой цепи использовали олигонуклеотид CtcFOR. Эти олигонуклеотиды частично захватывают прилегающий к J-сегменту участок первого константного домена тяжелой (у) и лех кой (к) цепей иммуноглобулинов. Так как более 90% легких цепей иммуноглобулинов мыши представлены к-цепями, последовательности, кодирующие Я.-цепи, не использовались при синтезе кДНК легких цепей.

Для амплификации V-генов тяжелых цепей иммуноглобулинов мыши использовали пару праймеров: VH1FOR-2 и VH1BACK. Праймер VH1FOR-2 комплементарен последовательности мРНК, кодирующей J-сегмент, a VH1BACK соответствует последовательности мРНК, кодирующей FR1 Ig мыши. Для амплификации легких цепей (к) Ig мыши использовали праймеры Vk4FOR и Vk2BACK. Праймеры Vk4FOR комплементарны последовательностям мРНК, кодирующим J-сегменты к-цепей,

a Vk2BACK соответствует последовательности мРНК, кодирующей FR1 к-цепей Ig мыши.

VBACK VFORCFQR

Рис.1. Взаимное расположение участков отжига антителоспецифических праймеров. V BACK и V FOR - обобщенные обозначения праймеров VH1BACK, Vk2BACK и VH1FOR-2, Vk4FOR соответственно, которые использовались для амплификации кодирующих последовательностей Ig; С FOR - обобщенное обозначение праймеров CH1FOR и CkFOR, которые использовались для синтеза первой цепи кДНК.

Для синтеза первой цепи кДНК проводили 4 реакции обратной транскрипции с использованием 20 мкг РНК в каждой. Реакционную смесь после синтеза кДНК использовали для амплификации фрагментов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.

С целью увеличения представительности вариабельных фрагментов в популяции амплифицированной ДНК мы использовали в качестве матрицы как кДНК, так и геномную ДНК. Для геномной ДНК нами было поставлено по 50 независимых лолимеразных цепных реакций для легких и тяжелых цепей. В каждую реакцию брали по 300 нг ДНК, что по данным теоретических расчетов соответствует количеству ДНК, которое содержится в 1-5x105 клеток. Количество амплифицированных фрагментов в пересчете на одну реакцию амплификации существенно не отличалось в случае использования геномной ДНК или кДНК. Однако ввиду нестабильности РНК в процессе ее выделения и дальнейших манипуляций часть молекул могла деградировать, понижая тем самым представительность амплифицированных фрагментов по сравнению с исходным материалом. На наш взгляд параллельное использование для ПЦР-амплификации как ДНК, так и РНК оправдано с точки зрения охвата максимального разнообразия последовательностей, кодирующих вариабельные фрагменты иммуноглобулинов, и уменьшения количества проводимых реакций амплификации.

Продукты амплификации ДНК легких и тяжелых цепей вариабельных областей иммуноглобулинов анализировали в 2% агарозном геле. Фрагменты амплифицированной ДНК нужных размеров выделяли после препаративного разделения в легкоплавкой агарозе методом электроэлюции. В результате было получено 10,5 мкг ДНК фрагментов

Рис.2.

Электрофорез фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР в 2% агарозном геле.

1- амплификация фрагментов соответствующих У-областям тяжелых цепей %

2- амплификация фрагментов соответствующих У-областям легких цепей íg;

3- маркеры длин ДНК: р'ТО9К/ЕсоЯТ + РТг191ШтЙ.

Клонирование объединенных фрагментов легких и тяжелых цепей в Е.соН.

Для объединения фрагментов легких и тяжелых цепей традиционно используется линкер (01у48ег)з. Эта последовательность, находясь между двумя функциональными доменами, не препятствует правильной укладке каждого из них и в то же время обеспечивает пространственное сближение, необходимое для функционирования молекулы в целом. Для создания такой конструкции были синтезированы олигонуклеотиды Ш-Нпк и РЯк-Нпк. з'-Концевая область олигонуклеотида Ш-Нпк комплементарна З'-концевой области олигонуклеотида РКк-Ппк. В результате отжига и достройки с помощью фрагмента Кленова мы получили фрагмент двухцепочечной ДНК длиной 94 п.н. С одной стороны эта ДНК песет последовательность 5'-концевой области ^ сегмента тяжелой цепи иммуноглобулинов, а с другой - З'-концевой области РИЛ-домена легкой цепи. Фрагменты антител были объединены посредством линкерного участка с помощью ПЦР (рис.3). Полученные конструкции были пригодны для клонирования в

легкой цепи и 8,5 мкг ДНК фрагментов тяжелой цепи. 1 2 3

2862 п. о.

1202 п.о.

517 п.о.

396 и.о. 344 п.о. 205 п.о.

Е.соИ в составе подходящего вектора и кодировали эсРу фрагменты в последовательности Ун-Ипкег-Уь.

^ 2 Рис.3. Объединение фрагментов ДНК,

кодирующих легкие и тяжелые цепи ^ посредством «линкера».

1- Амплифицированная ДНК эсКу;

2- маркеры длин ДНК: рГСШ/ЕсоЮ +

„о,., рТг19Я/НшЙ + рТ21911/А11Й + .

2862 и.о.

рТ219КЯач1.

1444 п.о. 1202 п.о.

В качестве вектора для создания библиотеки мы выбрали фатмиду pHENl. Наш выбор был обусловлен несколькими факторами: данная фагмида обеспечивает довольно высокий уровень экспрессии scFv в составе гибридного белка с gill фага fd, фагмида pHENl может реплицироваться как обычная плазмида, а также, благодаря наличию orí репликации фага fd, в случае котрансфекции фагом помощником может упаковываться в фаговые частицы. При комплементации в присутствии фага-помощника в среднем одна копия рекомбинантного белка будет включаться в состав вирусной частицы, что не сказывается на инфекционности последней. При клонировании в несупрессорных штаммах данный вектор позволяет получать секретируемые scFv.

Фрагменты ДНК, кодирующие scFv, были лигированы с вектором по сайтам рестрикции Sfll и Noll. Для клонирования был использован штамм E.coli TGI с эффективностью трансформации не менее 109к.о.е. на 1 мкг pHENl.

Было проведено 80 электропораций с использованием 10 лигазных смесей. Для каждой электропорации выход трансформантов составлял от 0,5 х106 до 5х106. В результате была получена библиотека scFv представительностью не менее 2x108 независимых клонов. Полученная библиотека была амплифицирована и использована в

виде фаговых частиц для получения антител против гранулоцитарного колонийстимулирукмцего фактора.

Селекция миниантител к С-С5К

Традиционный способ отбора клонов-продуцентов миниантител из комбинаторных библиотек подразумевает закрепление лиганда на подложке (иммунопланшет, нитроцеллюлозная мембрана и др.), его взаимодействие с библиотекой в виде фаговых частиц, удаление неспецифически связавшихся частиц и элюцию фагов, несущих специфичные к данному лиганду миниантитела путем разрушения комплекса лиганд-миниантитело. На данном этапе работы мы стремились получить миниантитела, которые узнавали бы О-СБР в растворе, в его нативной конформации. Для этого библиотеку в виде фаговых частиц инкубировали с в-СЭР, находящимся в растворе. При этом для того, чтобы выделить образовавшиеся комплексы несущие антитела с антигеном, использовали взаимодействие биотин-стрептавидин. Стрептавидин был иммобилизован на подложке, а биотин заранее присоединен к антигену (Рис.4).

Для выделения антител против О-СБР мы провели 4 раунда селекции, постепенно уменьшая концентрацию в-СЭР на каждом последующем этапе от Ю^М до10"8М. Обогащенную таким образом библиотеку рассевали на агаризованную среду с плотностью примерно 500 колоний на одну чашку Петри. Колонии анализировали методом иммуноскрининга на чашках с помощью биотинилированного О-СЗР и стрептавидин-фосфатазного конъюгата. Клоны, которые давали наиболее яркий сигнал, были использованы в дальнейшей работе.

Для удобства анализа и выделения веру к О-СЭР в 3' концевую область отобранных клонов бсРу был введен участок, кодирующий олигопептид, узнаваемый имеющимися у нас моноклональными антителами ЛИКБ-2, специфичными к фрагменту 59-72 интерлейкина-2 человека. Экспрессируемые конструкции были проанализированы на связывание с О-СЗР и антителами ЛНКБ-2. Клоны, продуцирующие ясру и дающие положительный сигнал в обоих тестах, бьши использованы для определения константы аффинности миниантител методом непрямого иммуноферментного анализа по методу Веагу (Веа1у е1 а!., 1987).

Рис.4. Схема проведения раунда аффинной селекции.

При вычислении константы аффинности по этому методу необходимо знать точную концентрацию только одного из компонентов реакции. Поскольку миниантитела, в отличие от полноразмерных иммуноглобулинов, имеют только один центр связывания с антигеном, для нас не важно какой из двух компонентов будет использован в качестве определяющего компонента. Ввиду того, что стандартный препарат О-СЗБ с известной концентрацией был у нас в наличии, мы проводили иммуноферментный анализ для определения констант аффинности по следующей схеме. Периплазменный экстракт, содержащий секретируемые миниантитела, вносили в лунки иммунопланшета в концентрациях 10 мкг/мл суммарного белка, 5 мкг/мл и 2,5 мкг/мл, при этом по данным электрофоретического анализа содержание миниантител в экстракте составляло примерно 20% от общего количества белка. После блокирования свободных участков связывания на планшете в лунки вносили в двоичных разведениях биотинилированный С-С8Р. Количественную оценку связавшегося О-СЙР проводили после взаимодействия со стрептавидин-пероксидазным конъюгатом по данным фотометрического анализа образования окрашенного продукта окисления ортофснилендиамина. Для вычисления

констант аффинности строили графики титрования, где по оси абсцисс откладывали значения -1о§2(разведения G-CSG), а по оси ординат - величину оптической плотности при Х=492нм. Расчет проводили по формуле: Ка=1/(2[Лг']-[/1г]), где [Аг] - концентрация антигена, соответствующая точке перегиба на кривой титрования при концентрации антител Со, [Агг\ - концентрация антигена, соответствующая точке перегиба на кривой титрования при концентрации антител Со/2 (рис.5).

Для проанализированных миниантител, секретируемых клетками Е coli в периплазматическое пространство и культуральную среду, Ка составляли от 0,2x105М"' до 1,8х107М"'. Миниантитела с наибольшей аффинностью экспрессировались клетками клона 97. Кривые титрования представлены на рис. 5.

Рис.5. Определение константы аффинности миниантител клона 9т. с использованием непрямого ИФА. [Ag] =0.835 х Ю"7М, [Ag'] = 0.7 х 10"7 М. Ка= 1.8 х 107 NT1.

1 1

1 2 3 4 5 6 7 -1о&(разведения)

Для фагмидных библиотек размером 107-108 клонов типично получение высокоспецифичных, но низкоаффинных антител с константами аффинности порядка 10®М"1. Однако в нашем случае были получены антитела с Ка 1,8х107М~\ Это может быть объяснено условиями отбора рекомбинантных фагмид, а именно концентрацией лиганда на последней стадии отбора (10~8М) и уменьшением времени инкубации лиганда с фаговыми частицами от 2 ч для первого раунда обогащения до 15 мин на последнем. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что даже в библиотеке бсРу

сравнительно небольшой представительности присутствуют среднеаффинные антитела, однако для их выделения требуются жесткие методы отбора клонов.

Создание тест-системы для количественного определения

Для обнаружения антигена в сложных смесях макромолекул чувствительности прямого иммуноферментного анализа может оказаться недостаточно ввиду малой доли антигена по отношению к другим компонентам. В этом случае повысить эффективность детекции удается с помощью сэндвич-варианта твердофазного ИФА, когда на поверхности планшета вначале иммобилизуют антитела, затем осуществляют взаимодействие с образцом, после чего детектируют искомый антиген с помощью антител, связывающихся с другой его антигенной детерминантой. Традиционный подход предполагает перебор всех возможных комбинаций полученных антител. В нашей работе мы использовали другой вариант отбора, основанный на методе, предложенном О. Мтепкоуа и соавт. [О. Мтепкоуа, 2000], с изменениями применительно к конкретной задаче. Отбор пары всБу осуществлялся непосредственно на нитроцеллюлозном фильтре, причем он осуществлялся по отношению к ранее выделенному и охарактеризованному веру 97 против О-СЙР. Основной вклад в фоновый сигнал при любом методе иммунохимической детекции вносят бактериальные белки, адсорбированные на поверхности фильтра. Во избежание этого фильтр предварительно покрывали антителами 9Е10, взаимодействующими с тиус-пептидом, расположенном на С-конце миниантител. Таким образом, после блокирования мест сорбции мембрана становилась недоступной для неспецифических взаимодействий. Клетки, полученные после проведения двух раундов обогащения библиотеки, рассевали на ЬВ-агар с плотностью 200-300 колоний на чашку диаметром 85мм и растили при 30°С до размера колоний 0,2-0,5мм без индукции. Фильтр с преадсорбированными антителами 9Е10 пропитывали ПТХ}, накладывали на поверхность чашки и инкубировали в течение 5-6 часов. После снятия фильтра с чашки и отмывки, проводили инкубацию с С-С8Р (1мкг/мл) для формирования комплекса 9Е10-всРу-О-СЭР. Далее фильтр инкубировали с препаратом эсРу97 Комплекс бсРу-ОСЗР-бсРу97 образовывался только в том случае, если эпитопы для и тестируемых веру

были пространственно разделены. Поскольку веру содержат на С-конце участок узнавания антител ЛНКБ-2 против интерлейкина-2, обнаружение образовавшихся комплексов проводили с помощью этих антител. В нашей работе мы использовали биотшшлированные ЛНКБ-2 и конъюгат стрептавидин-пероксидаза с последующим проявлением при помощи хемилюминисцентного субстрата. Выделенные в результате такого подхода клоны (2а, 2Ь, 2с, 2с1,2е и И) были протестированы в качестве «нижних»

антител в сэндвич-ИФА. Оказалось, что для пар 97 с этими антителами чувствительность анализа не позволяла достоверно детектировать антиген (0-С8Р) при его концентрации менее 50 нг/мл, т.е. чувствительность системы была довольно низкой.

Проверка эффективности работы этих миниантител в различных условиях показала, что после электрофореза в-СвР в денатурирующих условиях антитела 97 теряют способность связываться с ним. Аналогичными свойствами обладали и вторые антитела из пары. Такое поведение миниантител можно объяснить их чувствительностью к конформационным изменениям молекулы й-СБР в присутствии детергента. Взаимодействие этих антител с антигеном нарушалось также при тепловой денатурации последнего. Подобные антитела могут служить удобным инструментом при оценке степени денатурации белка в процессе выделения, но в то же время совершенно непригодны для количественного анализа белков после обработки их детергентами. Для определения денатурированного белка необходимы антитела, узнающие линейную последовательность аминокислот.

Для получения таких антител использовали иную схему селекции. Антиген (О-С8Р) предварительно денатурировали нагреванием в присутствии 1% БОЯ и ЮмМ 2-меркаптоэтанола, затем разбавляли в 10 раз и иммобилизовывали на нитроцеллюлозном диске. Выбор нитроцеллюлозы в качестве сорбента был продиктован тем, что сорбция белка на пластике в присутствии детергентов малоэффективна. Было проведено 3 раунда аффинного обогащения с использованием

1012,10", Ю10 фашидных частиц и 1, 0,1 и 0,05 мкг иммобилизованного на нитроцеллюлозе О-СЭР. После 3-го раунда проводили отбор клонов, продуцирующих О-СЯР-специфичные бсРу. При отборе клонов применяли процедуру, аналогичную описанной для поиска сэндвич-пары. Около 80% проанализированных клонов давали положительный сигнал. Для дальнейших экспериментов было взято 10 колоний. Анализ продуктов экспрессии проводили в варианте дот-блотта. На поверхность нитроцеллюлозного фильтра наносили О-СЭР (0,5 мкг в точку), затем культуральный супернатант после культивирования клеток-продуцентов в течение 30 часов при 30°С и индукции 1РТО. Проявление осуществляли с использованием антител 9Е10 и конъюгата кроличьих антимышиных антител с пероксидазой.

Отбор осуществляли по интенсивности сигнала, получаемого на реплике с чашки. В этом случае велика вероятность огбора как наиболее аффинных, так и наименее токсичных для клетки миниантител. Если миниантитело токсично, то размер колонии относительно мал, в то время как интенсивность сигнала довольно велика. В остальных

случаях высокого уровня сигнала отбираемые антитела обладают высокой аффинностью и (или) весьма эффективно экспрессируются в периплазматическое пространство и культуральную жидкость. В случае отобранных нами для дальнейшего анализа колоний реализовались обе ситуации. Для дальнейшей характеристики удобно отбирать клоны, обладающие стабильностью в условиях индукции. Для этого проводили твердофазный иммуноферментный анализ супернатантов после длительного выращивания клеток в условиях индукции. Было отобрано 4 клона, дающие наиболее выраженный сигнал. Далее определяли константы аффинности по методу, описанному выше. Для антител (бсРу) Р4, Р6, П6 и Р20 они оказались равны: 8х107М'\ 7хЮ7М"', 2.5х109М"' и 2.5х107М"' соответственно. Антитела, полученные путем селекции на денатурированном О-СЭР, безусловно должны опознавать денатурированный О-СвР. Но в том случае, когда линейный эпитоп экспонирован и доступен для взаимодействия с антителами, велика вероятность того, что они будут узнавать антиген и в нативной конформации. Эти свойства были проверены в вестерн-блот и дот-блот анализах с использованием очищенного в-СЭР и лизата клеток-продуцентов эсру к й-СЗР (рис.6).

Рис.6. А) Вестерн-блот анализ очищенного G-CSF после электрофореза в денатурирующих условиях. Проявление с помощью миниантител клонов F6 (1), F16 (2) и F20 (3). Б) Дот-блот анализ G-CSF. Ряд 1 - нативный G-CSF, 2 - G-CSF денатурированный кипячением в присутствии 1% SDS. Проявление с помощью миниантител клонов 9-¡ (А), 2а (В), F6 (С), F16 (D) и F20 (Е), фон конъюгата - F.

А)

Как видно из этих рисунков, некоторые из полученных антител узнавали как денатурированный, так и нативный в-СвР, что указывает на то, что эпитоп, к которому

они были получены, экспонирован во внешнюю среду и доступен для антител. Антитела F4, F6, F16 и F20 попарно в различных комбинациях были протестированы в сэндвич-варианте ИФА. Наиболее удачным вариантом оказалась пара антител F20 и F16, причем миниантитело F20 было использовано в качестве нижнего компонента сэндвича, a F16 в составе фаговой частицы - в качестве верхнего. Детекцию проводили с использованием кроличьей антисыворотки против фага М13 и пероксидазного конъюгата козьих антикроличьих антител. Оказалось, что минимальная концентрация G-CSF, которую можно достоверно детектировать при помощи этой системы составляет 50 пкг/мл (рис.7).

концентрация G-CSF (пкг/мл)

Рис.7. Чувствительность анализа G-CSF при использовании сэндвич-пары F20-F16.

С целью получения препаратов растворимых scFv используют нссупрессорные штаммы Ecoli. Мы в своей работе использовали штамм Ecoli BL21. Клетки, трансфорированные соответствующими плазмидами выращивали в условиях индукции IPTG в течение двух суток при температуре 30°С. Миниантитела выделяли из осветленного супернатанта.

Выделение секретируемых миниантител иммуноаффинной хроматографией.

При создании библиотеки изначально была предусмотрена возможность очистки scFv с помощью иммуноаффинной хроматографии с использованием моноклональных антител 9Е10, узнающих /иус-последовательность в С-концевой области молекулы миниантитела. Для приготовления иммуноаффинного сорбента моноклональные антитела

9Е10 иммобилизовывали на BrCN-активированную сефарозу 4В CL. После нанесения образца элюцию проводили 8 M мочевиной. Несомненным преимуществом такого способа выделения является его универсальность в том смысле, что нет необходимости подбирать условия для различных клонов - продуцентов миниантител. Однако недостаткам этого способа выделения является воздействие хаотропного агента. Удаление мочевины в процессе диализа приводил к агрегации миниантител, вследствие чего количественный выход активных scFv существенно снижался. Выделенные миниантитела хранили в 1 M растворе мочевины.

Выделение секретируемых миниантител ионообменной хроматографией.

Методику выделения миниантител с помощью ионообменной хроматографии с применением системы FPLC и носителя MonoQ мы отрабатывали на примере scFv против G-CSF. Для клона 97 образец scFv высокой чистоты (>90%) удавалось получить при следующих условиях: осветленный и сконцентрированный культуральный супернатант диализовали против 20мМ буфера трис-HCl, pH 8,0, и наносили на колонку MonoQ H/R 5/5, уравновешенную этим же буфером. Элюцию осуществляли градиентом концентрации NaCl от 0 до 1 М.

1 2 3 4 56 7 8

Номера фракции

Рис.8. Хроматография scFv F16 на колонке MonoQ при pH 8,0. линия 1- оптическая плотность элюата, линия 2 - концентрация NaCl в элюирующем буфере. Стрелки с цифрами от 1 до 8 показывают фракции, взятые для Western-блот анализа.

Однако для других всБу иммунохимически активный продукт выходил в широком диапазоне фракций, что свидетельствует о неоптимальном режиме хроматографии (рис.8,9).

123456789 123456789

Рис.9. Анализ фракций scFv F16 после хроматографии на колонке MonoQ при pH 8,0. а) - белки, окрашенные после электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, б) - детекция белков с помощью моноклональных антител 9Е10.

Для оптимизации условий хроматографии (pH) проводили определение изоэлектрической точки растворимых scFv. Для всех проанализированных scFv значение pi лежало в диапазоне 5,5-6,0. Поэтому в качестве рабочего буфера в дальнейшем мы использовали 20 мМ MOPS или натрий-фосфатный буфер с pH 6,5. При хроматографии на MohoQ H/R 5/5 scFv выходили одним пиком при концентрации NaCl 150-170мМ (рис.10, И).

1 2 3

Рис. 10. Хроматография бсРу Р16 на колонке Мопор при рН 6,5. линия 1-оптическая плотность элюата, 2 - концентрация ЫаС1 в элюирующем буфере. Стрелки с жирными цифрами от 1 до 3 показывают фракции, взятые для Westem-блoт анализа.

12 3 12 3

— 33 kD 21 kD 14 kD

Рис.11. Анализ фракций scFv F16 после хроматографии на колонке MonoQ при рН 6,5. а) - белки, окрашенные после электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, б) - детекция белков с помощью моноклональных антител 9Е10.

Чистота препарата миниантител в этом случае составляла не менее 90%, причем в этих условиях эффективно выделялись как scFv, так и гибридный белок scFv - pill фага М13, получаемый при экспрессии в супрессорных штамах E.coli.

Селекция и характеристика миниантител к транс-зеатину.

Другим объектом для оценки качества полученной библиотеки scFv являлся транс-зеатин - один из ключевых фитогормопов, ответственных за рост и развитие растений. С точки зрения химической структуры он является Ы'-замещенным пурином (рис.12). Несмотря на большой объем данных о роли транс-зеатина в регуляции деления и дифференцировки клеток, механизм действия этого вещества до сих пор недостаточно изучен. Использование антител, специфичных к транс-зеатину, может позволить в прояснить молекулярные аспекты его функционирования. Поэтому одной из задач нашей работы было получение миниантител к транс-зеатйну.

Поскольку транс-зеатин является низкомолекулярным соединением и не может напрямую бьггь сорбирован на твердой фазе, в качестве аффинного лиганда для обогащения библиотеки мы использовали ряд его конъюгатов с белками (овальбумин-транс-зеатин, бычий сывороточный альбумин-транс-зеатин) и полисахаридами (транс-зеатин-сефароза). Для определения констант аффинности полученных антител использовали конъюгаты транс-зеатин-биотин и транс-зеатин-овальбумин-биотин.

Синтез конъюгатов транс-зеатина.

Для получения конъюгатов с транс-зеатинрибозидом последний предварительно окисляли N8104, а затем конденсировали с белками или аминогексил-сефарозой в щелочной среде (рис.13). При окислении транс-зеатина периодатом натрия не затрагивается двойная связь в заместителе при Ы6 аденина. Реакция происходит количественно и в очень мягких условиях. Образование шиффового основания между альдегидной группой окисленной рибозы и аминогруппами белков также происходит довольно быстро (2 часа). После восстановления шиффового основания боргидридом натрия образуется устойчивая в широком диапазоне рН связь Я-С-МН-Яь

Н2К

Н

НО-г/0-^1 КаЮ4 но-1

но V 7

I-Г СН СН

но он

СН СН

II II о о

(1) (2)

но

г0"?1

СН СН --- Н2С сн2

КО Н N ОН

Г~г~1 ШЕ

Рис.13. Схема синтеза конъюгатов транс-зеатина. Я - белок или сефароза, И.1 - транс-зеатин.

Эффективность конъюгации транс-зеатина с носителями оценивали спектрофотометрически по наличию характерных для этих соединений максимумов поглощения. При соотношении белок: окисленный зеатинрибозид 1:9 на 1 моль белка

приходилось приблизительно 8,8 молей остатков зеатина., а при соотношении 1:1,1 -приблизительно 1моль остатков зеатина на 1моль белка. Для аффинной селекции миниаптител использовали белки с максимальным содержанием, а для определения констант диссоциации и специфичности антител - с эквимолярным содержанием белок-зеатин.

Схема синтеза конъюгата зеатин-биотин приведена на рис.14. После окисления транс-зеатинрибозида периодатом натрия соединение (2) конденсировали с гидразвдом биотина, а образовавшееся производное (4) восстанавливали боргидридом натрия до (5). Полноту протекания реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии на Клеэе^е! 60 Р254. На всех стадиях реакции происходили практически количественно. Выход конечного продукта составил 56% от теоретического. Возможно потери связаны с недостаточной эффективностью выделения на последней стадии. Для синтеза конъюгата зеатин-овальбумин-биотин мы воспользовались ранее полученным конъюгатом зеатин-овальбумин (с мольным соотношением зеатин:овальбумин 1:1 ) и И-оксисукцинимидным эфиром биотина.

О

Я2—С—Ш—М12 НОп/0 ШР4 но-, (?)

"ъГ яо\ /

I-г сн сн

но он

сн сн

II II о о

(1) (2)

-► СН СН -С%СНа

II I I I

к й" *га ын

II 1 I

наш ® и

II II

о=с с=о о=с с=о

II 11

(4) (5) Рис. 14. Схема синтеза конъюгата зеатин-биогин. Крзеатин, Яг-биотин.

Селекция миниантител к транс-зеатину.

Применение нескольких матриц для аффинной селекции диктовалось тем, что исходная библиотека 8сРу может взаимодействовать как с целевым лигандом, так и с носителем. Смена носителя на различных раундах селекции и/или детекции веру против

транс-зеатина позволяет многократно повысить специфичность самого процесса и получить антитела с наибольшей специфичностью. В целом мы опирались на предыдущие результаты по селекции антител к белковому антигену. Использованные на различных раундах концентрации транс-зеатина в пересчете на белковый носитель или аффинный сорбент составляли 10"6,10"7, 10'8М. Кроме того, концентрацию фаговых частиц понижали от 1013 до Ю11 в мл от первого к третьему раунду, а время инкубации сокращали от 12 до 0,5 часов. Это позволяло отбирать ясру с наибольшей аффинностью. После трех раундов аффинной селекции было отобрано 12 клонов, дававших отчетливый сигнал после индукции 1РТО.

Важной характеристикой бсРу к транс-зеатину является отсутствие перекрестной реакции с цис-зеатином и аденозином. Активным природным фитогормоном является именно транс-изомер зеатина, а цис-зеатин, также присутствующий в клетках растений, не

обладает активностью цитокининов. Поэтому для дальнейшего использования пригодны

*

лишь антитела, не взаимодействующие с аденозином и цис-зеагином. Для отбора таких миниантител анализировали связывание с конъюгатом овальбумин-зеатин в присутствии

аденозина на нитроцсллюлозном фильтре. Детекцию осуществляли с помощью хемилюминисцентной системы ЕСЬ. Для девяти из двенадцати проанализиорованных клонов было показано уменьшение сигнала, что свидетельствовало о конкурентном взаимодействии транс-зеатина и аденозина с миниантителами. Оставшиеся три клона (2.1, г5 и г12) использовали в дальнейшей работе для определения констант аффинности и специфичности по отношению к природному гормону.

Для определения констант аффинности воспользовались следующей процедурой: на иммунопланшете иммобилизовывали препараты белков периплазмы Е.соИ, содержащие миниантитела, затем наносили конъюгаты, содержащие зеатин и биотин. Детекцию осуществляли с помощью коныогата стрептавидин-пероксидаза. Было использовано два коныогата транс-зеатина: транс-зеатин-биотин и транс-зеагин-овальбумин-биотин.

Поскольку при селекции миниантител использовали конъюгаты зеатина с овальбумином и бычим сывороточным альбумином, не исключена возможность отбора бсРу имеющих специфичность не только к зеатину, но и ближайшему окружению. Именно поэтому для характеризации отобраных клонов кроме конъюгата транс-зеатин-овальбумин-биотин был использован также конъюгат транс-зеатин-биотин, позволяющий получить более корректные результаты. Следует отметить, что значения Кд, полученные с использованием обоих конъюгатов, существенно не отличались. При определении специфичности миниантител по отношению к структурным аналогам зеатина конъюгат

зеатин-биотин давал более выраженные кривые и меньший уровень фона, но и в этом случае результаты, полученные с использованием двух различных конъюгатов, не отличались.

Константы аффинности определяли по методу Веа1у [Веа1у, 1987]. Для клонов г1, г5 и г12 они составили 1.25хЮ7М"', 1.3х107М"' и 1.7хЮ7М"' соответственно.

Далее мы исследовали взаимодействие зсБу с аденозином и транс-зеатином методом конкурентного анализа. Миниантитела были иммобилизованы на планшете для ИФА и в лунки внесен конъюгат транс-зеатинрибозид-овальбумин-биотин (10"7М) в смеси с аденозином или цис-зеатином в убывающих концентрациях от 10~5до 10"7 М. Количественную оценку связывания бсРу с транс-зеатинрибозид-овальбумин-биотином проводили после инкубации со стрептавидин-пероксидазным конъюгатом.

Рис. 15. Конкурентный анализ йсРу клонов 25 и 7.12. Концентрация транс-зеатинрибозид-овальбумин-биогина 10"7М.

10 10"" 10" концентрация цис-зеатина (М)

Как видно из графиков (рис.15), с увеличением в растворе концентрации цис-зеатина сигнал от связывания зсБу клонов Ъ\ и 212 с транс-зеатинрибозид-овальбумин-биотином уменьшается. Сигнал уменьшается примерно на половину при концентрации цис-зеатина 2x10"6 М. Для клона г5 такого уменьшения сигнала выявлено не было, что позволяет нам сделать вывод о том, что это миниантитело специфично взаимодействует с антигеном на плашке и распознает именно транс-конформацию зеатина.

Для выделения в гомогенном виде секретируемых миниантител к транс-зеатину проводили иммуноаффинную хроматографию на колонке с иммобилизованными моноклональными антителами 9Е10 в описанных выше условиях.

G-CSF и транс-зеатин были первыми объектами, послужившими антигенами для выделения миниантител из сконструированной библиотеки scFv мыши. Методические приемы, разработанные в ходе выполнения данной работы помогут в дальнейшем проводить эффективный поиск scFv к другим антигенам, имеющим значение как для фундаментальных исследований, так и для практического применения.

ВЫВОДЫ.

1. Методом полимеразной цепной реакции получены гены вариабельных областей иммуноглобулинов мыши и на их основе создана библиотека мышиных одноцепочечных миниантител в формате фагового дисплея представительностью 2х108 независимых рекомбинантных клонов.

2. Выделены фагмидные клоны, экспрессирующие миниантитела к гранулоцитарному колонийстимулирующему фактору человека и транс-зеатину.

3. Получена растворимая форма миниантител к названным выше антигенам. Миниантитела выделены в гомогенном виде и охарактеризованы.

4. Выявлена пара миниантител к неперекрывающимся эпитопам гранулоцитарного колонийстимулирукяцего фактора, и создана тест-система, позволяющая обнаруживать его в концентрации 50 пкг/мл.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Улитин А.Б., Маркова Е.В.,.Мареева Т.Ю, Быстрое Н.С., Бровко Ф.А., Несмеянов В.А. Получение миниантител против гранулоцитарного колоний-стимулирующего фактора человека с использованием комбинаторной библиотеки scFv мыши. Биоорганическая химия, 2002, №2, Т. 28, стр. 126-134.

2. Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Беликов В.А., Ракова Н., Мареева Т.Ю., Бровко Ф.А. Несмеянов В.А. Комбинаторные библиотеки вариабельных областей иммуноглобулинов: получение миниантител к антигенам различной природы. V чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова «Биоорганика 2000», 13-20 ноября 2000 г., Москва-Пущино, стр.87.

3. Velikov V.A., Laman A.G., Shepelyakovskaya A.O., Rakova N.Yu., Izotova N.N., Brovko F.A., Kulaeva O.N. Obtaining of miniantibodies against phytohormone zeatin riboside using scFv mice combinatory library. Signalling Systems of Plant Cells. International Symposium, Abstracts, 5-7 June, 2001. Moscow, Russia, p. 116

4. Velikov V.A., Shepelyakovskaya A.O., Laman A.G., Suvorova P.G., Brovko F.A.. Production of miniantibodies against zeatin in bacterial cells. International Symposium Intracellular Signalling in Plant and animal Systems, Abstracts, 9-14 September, 2001. Kyiv, Ukraine, p. 83

5. Laman A.G., Shepelyakovskaya A.O. The production of miniantibodies against human granulocyte colony-stimulating factor using the murine scFv combinatory library. 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology. Abstracts, 15-22 September, 2002, Pushchino, Russia, p.71.

if

I

!

i

If

i

Подписано в печать 29.08.2003 г. Формат 60 х 841/1б.

Объем 1,5 п. л. Тираж 100 экз. Заказ 2631.

ГУП Серпуховская типография Министерство по делам печати и информации Московской области

Il 13 83 3

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация и доменная организация иммуноглобулинов.

1.2. Клонирование иммуноглобулинов и их фрагментов. 12 1.2.1. Экспрессия иммуноглобулинов и их фрагментов в гетерологичных системах.

1.3. Создание комбинаторных библиотек антител.

1.3.1. Метод фагового дисплея. Основные принципы.

1.3.2. Строение нитевидного фага и его жизненный цикл.

1.3.3. Геном фага fl и его продукты.

1.3.4. Векторы для фагового дисплея.

1.3.5. Векторы на основе нитевидных фагов, используемые для создания библиотек миниантител.

1.3.6. Другие векторы, используемые в методе фагового дисплея.

1.4. Библиотеки миниантител. Конструирование и практическое использование.

1.4.1. Конструирование библиотек, основанных на комбинации синтетических CDR3.

1.4.2. Применение scFv.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Конструирование библиотеки миниантител.

2.1.1. Амплификация фрагментов генов вариабельных областей иммуноглобулинов.

2.1.2. Клонирование объединенных фрагментов легких и тяжелых цепей в E.coli.

2.2.1. Селекция миниантител к гранулоцитарному колонийстимулирующему фактору.

2.2.2. Создание тест-системы для количественного определения G-CSF.

2.3. Выделение миниантител.

2.3.1. Выделение секретируемых миниантител иммуноаффинной хроматографией.

2.3.2. Выделение секретируемых миниантител ионообменной хроматографией.

2.4. Получение и характеристика миниантител к транс-зеатину.

2.4.1. Синтез конъюгатов транс-зеатина.

2.4.2. Селекция миниантител к транс-зеатину. 73 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Олигонуклеотиды и праймеры.

3.2. Выделение мононуклеарных клеток.

3.3. Выделение РНК.

3.4. Выделение ДНК

3.5. Синтез кДНК.

3.6. Амплификация ДНК генов вариабельных областей иммуноглобулинов.

3.7. Получение линкера.

3.8. Сборка и амплификация объединенных фрагментов тяжелых и легких цепей Ig.

3.9. Клонирование scFv.

3.10. Амплификация библиотеки scFv.

3.11. Биотинилирование G-CSF.

3.12. Селекция G-CSF-специфичных клонов.

3.13. Первичный анализ селектированной библиотеки методом иммуноскрининга на чашках.

3.14. Клонирование последовательности ДНК, кодирующей антигенную детерминанту IL2 для антител ЛНКБ-2.

3.15. Синтез конъюгата биотина с транс-зеатином.

3.16. Синтез конъюгатов зеатинрибозида с BSA, овальбумином и аминогексилсефарозой.

3.17. Селекция клонов, специфичных к транс-зеатину.

3.18. Выделение секретируемых миниантител методом иммуноаффинной хроматографии.

3.19. Выделение секретируемых миниантител методом ионообменной хроматографии.

3.20. Определение констант аффинности миниантител. 91 ВЫВОДЫ. 93 Список литературы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. БСА - бычий сывороточный альбумин;

ИФА - иммуноферментный анализ; к.о.е. - колониеобразующая единица;

МА - моноклональное антитело;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

ТЕ - 10 мМ Трис-HCl, рН 7,6,1 мМ ЭДТА;

ФСБ - фосфатно-солевой буфер;

ФСБ-Т - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,1% Tween-20; ЭДТА - этилендиаминтатраацетат; DTT - дитиотреитол; dNTP-дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;

G-CSF — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор;

Био-GCSF- биотинилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор;

Ig — иммуноглобулин

IPTG - изопропил p-D-тиогалактопиранозид; scFv - одноцепочечные мини-антитела;

2xYT - культуральная среда, содержащая в 1 литре 16г гидролизата лактальбумина, Юг дрожжевого экстракта и 5г NaCl; SDS - додецилсульфат натрия.

Антитела (Ig) - один из инструментов иммунной системы, медиатор гуморального иммунитета. Они продуцируются потомками В-лимфоцитов - плазматическими клетками и обладают уникальным сродством к антигену, индуцировавшему их выработку. Связывание антитела с антигеном запускает каскад реакций, приводящий к удалению антитела из организма, а именно, активацию системы комплемента, усиление фагоцитоза.

Высокоспецифичное, высокоаффинное взаимодействие антитела с антигеном позволяет использовать антитела в исследовательских, аналитических и терапевтических целях. Антитела широко используются в иммуноанализе (ИФА, РИА и проч.), позволяя детектировать и количественно определять пикомолярные концентрации вещества в сложных смесях, например в сыворотке крови. Широчайшим образом антитела используются в настоящее время для анализа субпопуляционного состава клеток крови (метод проточной цитометрии), что позволяет характеризовать иммунный статус организма. С помощью изотопно-меченных антител проводится локализация в организме очагов опухолевого роста. В терапевтических целях антитела применяются для нейтрализации токсинов. Разрабатываются подходы к использованию антител в терапии злокачественных опухолей. Антитела находят применение в научных исследованиях для выделения (иммуноаффинная хроматография) и характеристики биомолекул.

Исторически первым источником антител была сыворотка иммунных животных и человека. Получаемые таким образом антитела содержат набор иммуноглобулинов различных классов и подклассов, специфично узнающих свой антиген. Различные антитела сыворотки узнают несколько участков (эпитопов) антигена. Таким образом, сыворотка полиспецифична, что в ряде случаев является недостатком. Дальнейшим развитием способов получения антител явилось создание гибридомной технологии, которая позволяет получать антитела, продуцируемые одним клеточным клоном, узнающие один эпитоп и сохраняющие свои свойства во многих генерациях гибридной клетки. К достоинствам моноклональных антител можно отнести высокую специфичность, возможность получения их в больших количествах и одинаковой специфичности. К недостаткам можно отнести то, что технология получения моноклональных антител разработана для мыши и крысы и является трудно применимой в случае антител человека, в то время как для терапевтических нужд требуются именно человеческие иммуноглобулины. Затруднения возникают и в тех случаях, когда иммунизация животных по. какой-либо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител. В 1990 году было показано, что антиген-связывающие. фрагменты aimiTen(scFv, Fab), представленные на поверхности нитевидного фага, могут быть отобраны на иммобилизованном антигене [McCafferty, 1990]. Основной идеей метода является создание комбинаторной библиотеки, в которой вариабельные участки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов соединены случайным образом и представлены на поверхности бактериофага. Каждый бактериофаг, как и В-лимфоцит, экспрессирует антитело единственной специфичности. При достаточно большом размере библиотеки репертуар вариабельных участков будет сравним с репертуаром антител в организме. К достоинствам метода можно отнести следующие:

1. Возможность отбора антител in vitro, минуя стадии иммунизации животных.

2. Отсутствие необходимости использования лабораторных животных и поддержания : долговременных культур клеток эукариот.

3. Время получения индивидуальных клонов-продуцентов миниантител составляет 10 - 14 дней, по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии.

4. Относительная простота получения антител и их низкая себестоимость.

6.

Возможность создания гибридных молекул с маркерными белками за короткое время. Возможность получения антител к аутоантигенам и слабоиммуногенным соединениям.

С целью решения стоящих перед Институтом задач нам представлялось актуальным создание комбинаторной библиотеки миниантител мыши, в частности, получение на се основе scFv к интересующим нас антигенам - гранулоцитарному колониестимулирующему фактору человека (G-CSF) и природному фитогормону - транс-зеатину.

G-CSF - цитокин, стимулирующий рост гранулоцитов и активирующий нейтрофилы [Cteven, 1987]. Он представляет собой гликозилировапный полипептид с молекулярной массой 19 кДа. G-CSF применяется в онкологии для восстановления числа нейтрофилов при лейкопении, вызванной радио- или химиотерапией. Для анализа G-CSF в процессе производства и клинического применения необходимы тест-системы, причем наиболее удобными в настоящее время являются иммунохимические тест-системы на основе антител.

Траис-зсатин это один из ключевых фитогормонов, ответственных за рост и развитие растений. Несмотря на большой объем данных о роли транс-зсатина в регуляции деления и дифференцировки клеток, механизм действия этого вещества до сих пор недостаточно изучен. Использование антител, направленных против транс-зеатина, может позволить прояснить молекулярные аспекты его функционирования.

Таким образом, в задачи данного исследования входило: 1-. Создание представительной библиотеки фагового дисплея мышиных миниантител. 2. Проверка качества полученной библиотеки на примере получения фагмидпых клонов, .экспрессирующих мшшантитела к белковому антигену - G-CSF и гаптену - транс-• зеатину.

3. Получение, выделение и характеристика миниантител к G-CSF.

4. Создание на основе полученных миниантител тест-системы для количественного определения G-CSF.

5. Получение, выделение и характеристика миниантител к транс-зеатину.

ВЫВОДЫ.

1. Методом полимеразной цепной реакции получены гены вариабельных областей иммуноглобулинов мыши, и на их основе создана библиотека мышиных одноцепочечных миниантител в формате фагового дисплея представительностью 2x108 независимых рекомбинантных клонов.

2. Выделены фагмидные клоны, экспрессирующие миниантитела к гранулоцитарному колонийстимулирующему фактору человека и транс-зеатину.

3. Получена растворимая форма миниантител к названным выше антигенам. Миниантитела выделены в гомогенном виде и охарактеризованы.

4. Выявлена пара миниантител к неперекрывающимся эпитопам гранулоцитарного колонийстимулирующего фактора, и создана тест-система, позволяющая обнаруживать его в концентрации 50 пкг/мл.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенное исследование показывает, что полученная библиотека scFv мыши может быть использована для получения миниантител к антигенам различной природы. Методические приемы, разработанные в ходе выполнения данной работы помогут в дальнейшем проводить эффективный поиск scFv к другим антигенам, представляющим интерес как для фундаментальной науки, так и для практического применения.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

В работе использовали ферменты фирмы "Promega" (США), кнъюгаты для иммуноферментного анализа фирмы "Bio-Rad" (США), акриламид, метилен-бис-акриламид, Трис, Твин-20, ор/яо-фенилендиамин, периодат натрия, зеатин, зеатин-рибозид фирмы "Sigma" (США), остальные реактивы - отечественного производства, квалификации ч.д.а. и о.с.ч. G-CSF был любезно предоставлен В.Г.Коробко.

3.1. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ И ПРАЙМЕРЫ.

Для амплификации и клонирования ДНК фрагментов генов вариабельных областей иммуноглобулинов мыши использовали следующие праймеры: CH1FOR- эквимолярная смесь: CTCAATTTTCTTGTCCACCTTGTTGC CTCGATTCTCTTGATCAACTCAGTCT TGGAATGGGCACATGCAGATCTCT CkFOR: CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC. VH1BACK: AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG Vk2BACK: GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA Vk4FOR - эквимолярная смесь: CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC CCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC

VH1FOR-2: TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC

VH1BACKSFI: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGAGGTSM-ARCTGCAGSAGTCWGG

Vk4F0RN0T - эквимолярная смесь:

GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC

GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC

GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC

GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC

JH-link:

GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTTGGGCGGTGGTGGGTCG FRK-link:

TGGAGACTGGGTGAGCTCAATGTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCC

Для создания адаптера, кодирующего антигенную детерминанту IL2 для МА LNKB2 использовали следующие праймеры:

IL-sense:GGCCGCACTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTACA IL-anti-sense:

GGCCTGTAAATTTAGCACTTCCTCCAGAGGTTTGAGTTCTTCTTCTAGTGC

Все праймеры были синтезированы в ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Н.С. Быстровым.

3.2. ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК.

У мышей линии BALB/C в возрасте 2 месяцев и весом 20 г извлекали селезенку и измельчали ее в гомогенизаторе со стеклянным пестиком в буфере следующего состава: 50 мМ NaH2P04/Na2HP04, 150 мМ NaCl, рН 7,6 (ФСБ). Взвесь клеток (107 клеток/мл) наслаивали на раствор фикола (d= 1,077) в соотношении суспензия клеток: фикол = 3 : 1 и центрифугировали в течение 15 минут 1500 х g при комнатной температуре. Интерфазу, содержащую мононуклеарные клетки, отбирали и промывали 2 раза ФСБ [S.V. Hunt, 1987]. Для выделения РНК (ДНК) использовали лимфоциты, выделенные из селезенок трех мышей.

3.3. ВЫДЕЛЕНИЕ РНК.

Лимфоциты лизировали в 1 мл раствора, содержащего 4 М гуанидинроданид, 2% саркозил, 0,2 М 2-меркаптоэтанол. Лизат прогревали при 60°С в течение 10 мин, затем добавляли равный объем фенола, рН 4,0, ХА объема 1 М СНзСООЫа, рН 4,0, Vi объема хлороформа и энергично встряхивали. Смесь охлаждали до 4°С, затем центрифугировали при 3000 х g в течение 10 мин. Водную фазу отбирали и экстрагировали смесью фенол-хлороформ (1:1) до исчезновения интерфазы. К водной фазе добавляли 3 объема этанола и смесь выдерживали при температуре -20°С в течение 2 ч. РНК осаждали центрифугированием при 10000 х g в течение 30 мин. Осадок промывали 70% этанолом и после центрифугирования растворяли в 100 мкл воды, не содержащей РНКаз. К раствору РНК добавляли LiCl до концентрации ЗМ. Высокомолекулярную РНК осаждали в течение ночи при 0°С. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в 100 мкл 0,3 М ацетата натрия, рН 5,0 и разделяли на 5 равных частей. В каждую пробирку добавляли 2,5 объема этанола. Препараты РНК хранили под спиртом при -20°С вплоть до последующего использования. Для оценки качества и количества выделенной РНК использовали одну порцию препарата. РНК осаждали центрифугированием, растворяли в 100 мкл воды, для электрофореза использовали 2, 5,10 и 20 мкл полученного препарата.

3.4. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК.

Клетки селезенки суспендировали в ФСБ, охлажденном во льду, в концентрации 108 кл./мл, добавляли 10 объемов раствора, содержащего 0,5 М ЭДТА, рН 8,0, 100 мкг/мл протеиназы-К и 0,5% саркозила. Суспензию лизированных клеток помещали в водяную баню с температурой 50°С на 3 ч, периодически перемешивая. Аккуратно, без резких встряхиваний, ДНК трижды экстрагировали равным объемом фенола. После третьей экстракции ДНК диализовали против 4 л раствора 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, несколько раз меняя буфер до тех пор, пока оптическое поглощение диализата при длине волны 270 нм не стало менее 0,05. К препарату ДНК добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М и 0,6 объема изопропанола. Высокомолекулярную ДНК собирали, наматывая ее на стеклянную палочку, промывали 70% этанолом, подсушивали на воздухе, затем в течение ночи растворяли в буфере ТЕ (ЮмМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, рН 8,0) при 4°С [9]. Количество выделенной ДНК определяли спектрофотометрически по величине оптического поглощения при длине волны 260 нм.

3.5. СИНТЕЗ кДНК.

Для синтеза первой цепи кДНК тяжелой цепи Ig использовали праймер CH1FOR, для синтеза первой цепи кДНК легкой цепи использовали олигонуклеотид CkFOR. Двадцать мкгРНК (одну аликвоту) растворяли в 68 мкл 1мМ раствора ванадил-рибонуклеозидных комплексов, добавляли 5 мкл 5мМ смеси dNTP, 5мкл 0,1 М ДТТ, 20пкмоль CH1FOR, 20пкмоль CkFOR, 10 мкл 10х буфера для ревертазы (Amersham, Англия). Смесь прогревали 5 мин при 67°С, затем медленно охлаждали до комнатной температуры, добавляли 4 мкл RNasin (Amersham, Англия) до 0,5 ед./мкл и 4 мкл обратной транскриптазы AMV-RT (20 ед./мкл, Amersham, Англия). Смесь инкубировали 1 ч при 42°С.

3.6. АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК ГЕНОВ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ.

Для амплификации вариабельных областей тяжелых цепей Ig использовали пары праймеров VH1FOR-2 и VH1BACK, а для амплификации легких цепей (к) - праймеры Vk4FOR и Vk2BACK. Для амплификации тяжелых цепей брали 30 мкл (1/3 об.) смеси, полученной после синтеза первой цепи кДНК, для легких цепей - 10 мкл (1/10 об.) смеси. В случае использования в качестве исходной матрицы геномной ДНК для постановки одной реакции брали по 300 нг выделенной геномной ДНК. Амплификацию проводили в реакционной смеси следующего состава: первая цепь кДНК (или ДНК), праймеры (10 мкМ для тяжелой цепи и 30 мкМ для легкой цепи), 0,25 мМ dNTP, 50 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 50мМ Трис-HCl, рН 9,0, 0,02% Твин-20, 5 ед. Taq-полимеразы в объеме 100 мкл. Для уменьшения неспецифической амплификации проводили 5 циклов амплификации в режиме: денатурация - 94°С, 1 мин., отжиг - 1мин., элонгация - 74°С, 2 мин. Стадия отжига проводилась при следующих значениях температуры: ti=65°C, t2=64°C, t3=63°C, t4=62°C, t5=61°C. Далее проводили 30 циклов амплификации при температуре отжига 60°С и тех же временных параметрах. Продукты амплификации анализировали электрофоретически в 2% агарозном геле.

3.7. ПОЛУЧЕНИЕ ЛИНКЕРА.

Линкер для соединения фрагментов тяжелых и легких цепей получали путем отжига и достройки с использованием фрагмента Кленова двух олигонуклеотидов JH-link и FRx-link. Для отжига брали по 500 пкмоль олигонуклеотидов JH-link и FRK-link, 10 мМ Трис-HCl рН 8,0, 5 мМ MgCh, 50 мМ NaCl и 50мМ dNTP в общем объеме 50 мкл. Смесь нагревали до 90°С, инкубировали 5 мин, затем медленно в течение 0,5 ч температуру понижали до 50°С, инкубировали 20 мин, после чего немедленно охлаждали, поместив пробирку в лед. К смеси добавляли 10 ед. фрагмента Кленова и инкубировали 20 мин при 37°С. По окончании реакции в пробирку добавляли ЭДТА до конечной концентрации 0,5 мМ. Для удаления фрагмента Кленова смесь экстрагировали равным объемом фенола. Затем добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М и равный объем изопропанола. ДНК осаждали центрифугированием при 30000 х g и температуре 4°С. ДНК линкера очищали электрофорезом в ПААГ в неденатурирующих условиях. Разделение проводили в 10% ПААГ (29:1) в трис-боратном буфере (0,089 М трис-борат, 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА, рН=8,0). После окончания разделения гель помещали в раствор, содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия в таком же буфере. После 45 мин окрашивания пятно, соответствующее ДНК линкера, визуализировали в УФ-свете и вырезали соответствующий участок геля. Кусочек геля, содержащий ДНК, гомогенизировали в пробирке, добавляли равный объем элюирующего буфера (0,5 М ацетат аммония, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и инкубировали в течение ночи при 37°С. Пробу центрифугировали при 10000 х g в течение 20 мин при комнатной температуре, отбирали надосадочную жидкость, осадок еще раз экстрагировали равным объемом того же буфера. Два супернатанта объединяли и фильтровали через ватман-ЗММ. ДНК осаждали центрифугированием после добавления 2-х объемов этанола. Осадок растворяли в 400 мкл ТЕ, количество ДНК определяли по величине оптического поглощения при длине волны 260 нм [Маниатис Т. И др., 1984].

3.8. СБОРКА И АМПЛИФИКАЦИЯ ОБЪЕДИНЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ТЯЖЕЛЫХ

И ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ IG.

Для сборки тяжелых и легких цепей Ig проводили ПЦР амплификацию в реакционной смеси, содержащей буфер для Taq полимеразы, 2,5 мМ MgCh, 30 мкМ праймеры VH1BACK и Vk4FOR, 20 нг линкера, по 100 нг амплифицированных легких и тяжелых цепей, 250 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и одну единицу Taq ДНК-полимеразы. Двадцать пять циклов амплификации проводили в следующем режиме: 94°С - 1,5 мин, 72°С - 2,5 мин. Продукты амплификации анализировали после электрофоретического разделения в 2 % агарозном геле. Фрагмент размером 800-900 пар оснований выделяли с помощью электроэлюции. Для внесения сайтов рестрикции Sfil и Noil проводили 15 циклов ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы фрагментов ДНК, полученных на предыдущем этапе, и праймеров VH1BACKSFI и VK4FORNOT. Циклы амплификации проводили в следующем режиме: 94°С - 1 мин, 50°С - 1 мин, 74°С - 1,5 мин. Амплифицированный фрагмент выделяли после электрофоретического разделения продуктов реакции в 2% агарозном геле.

3.9. КЛОНИРОВАНИЕ scFv.

Клонирование scFv осуществляли в клетках Е. coli штамма TG1 в составе плазмиды pHENl. Для этого проводили рестрикцию ДНК собранных scFv и ДНК pHENl по сайту Sfil в реакционной смеси, содержащей в 50 мкл ДНК (5 мкг pHENl или 1 мкг scFv), буфер для Sfil (10 мМ Трис-HCl, рН 7,9, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT), 0,1 мг/мл БСА и 20ед Sfil. Реакционные смеси инкубировали 4 ч при 56°С, затем добавляли 39 мкл воды, 5мкл 1М NaCl, 5мкл 10х буфера для Noll (100 мМ трис-HCl, рН 7,9, 1,5 М NaCl, 100 мМ MgCl2, 1% Triton Х-100) и 20ед Notl. После инкубации в течение 4 ч при 37°С ДНК pHEN подвергали дефосфорилированию при помощи Shrimp Alkaline Phosphatase (USB) согласно инструкции фирмы производителя. После выполнения этих процедур гидролизованные фрагменты ДНК scFv и pHENl очищали электрофоретически в 1% агарозном геле.

Для одной реакции лигирования scFv с вектором pHENl использовали 200нг гидролизованного фрагмента scFv и 1мкг вектора pHENl, буфер для Т4 -ДНК лигазы, 1мМ АТФ, 100 мкг/мл БСА и 20 ед (Weiss) Т4 -ДНК лигазы. Лигирование осуществляли в течение двух часов при комнатной температуре в объеме 50 мкл. После фенольной депротеинизации лигазной смеси ДНК осаждали этанолом и хранили под спиртом при -20°С до момента использования в электротрансформации клеток E.coli.

Для приготовления компетентных клеток культуру клеток E.coli штамма TG1 выращивали в среде 2xYT при 37°С и интенсивной аэрации до концентрации, соответствующей Абоо=0,5. Культуру охлаждали во льду 30 мин, затем клетки осаждали центрифугированием при 4°С в течение 15 мин при 3000 х g. Осадок суспендировали в охлажденном 10% глицерине, приготовленном на воде milliQ, в объеме, равном исходному объему культуральной жидкости. Процедуру повторяли два раза, после чего клетки суспендировали в 10% глицерине, в объеме равном 1/1000 объема исходной культуральной жидкости. Суспензию клеток разливали в пробирки по 50мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

Электропорацию проводили в 0,2-см кюветах с использованием 50 мкл компетентных клеток и 50-100 нг ДНК, полученной после переосаждения лигазной смеси. Немедленно после электрического импульса (2500В) в кювету добавляли 1мл среды 2xYT, содержащей 1% глюкозы и ЮмМ MgCh, клетки аккуратно суспендировали, переносили в стерильные пробирки и инкубировали в течение одного часа при 37°С.

3.10. АМПЛИФИКАЦИЯ БИБЛИОТЕКИ scFv.

После электропорации клетками иннокулировали 200 мл среды 2xYT с 1% глюкозой и 100 мкг/мл ампициллина, отбирали аликвоту для определения титра трансформантов, а оставшуюся часть инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день отбирали аликвоту ночной культуры (2 мл) и иннокулировали ею 200 мл указанной выше среды. Клетки растили до Абоо^ОД после чего 5 мл культуры переносили в колбу с 20 мл той же среды, добавляли 0,5 - 1-10пк.о.е. М13 К07 и инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С. Клетки осаждали при 4000 х g в течение 10 мин, суспендировали в 10 мл среды 2xYT и добавляли к 300 мл среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Инкубацию проводили при интенсивной аэрации в течение ночи при 37°С.

Для выделения фагмидных частиц культуру клеток E.coli, содержащую рекомбинантную pHENl и фаг М13 К07, выращенную в течение ночи, центрифугировали 10 мин при 8000 х g. К супернатанту добавляли 1/5 объема ПЭГ/NaCl (20% ПЭГ 6000, 2,5М NaCl) и инкубировали 1 ч при 4°С. После центрифугирования образовавшийся осадок суспендировали в 1/10 объема буфера ТЕ и еще раз осаждали ПЭГ/NaCl в аналогичных условиях. Осадок ресуспендировали в 1/100 объема буфера ТЕ, отделяли нерастворимые агрегаты центрифугированием и определяли титр фагмидных частиц после трансдукции и рассева на агаризованную среду с ампициллином.

3.11. БИОТИНИЛИРОВАНИЕ G-CSF.

К раствору рекомбинантного человеческого G-CSF (0,3 мг/мл) в 0,1М Na-карбонат/бикарбонатном буфере, рН 9,5, добавляли 70 мМ N-оксисукцинимидный эфир биотина в диметилформамиде в молярном соотношении белок: эфир биотина « 1:3 и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 1М NH4CI (20 мкл NH4CI на 1 мг белка). Реакционную смесь диализовали против 1000 объемов ФСБ.

3.12. СЕЛЕКЦИЯ G-CSF-СПЕЦИФИЧНЫХ КЛОНОВ.

Для поиска клонов, специфичных к нативному G-CSF, вначале в лунки 96-луночного планшета для ИФА вносили по 100 мкл раствора стрептавидина в 0,1 М Na-карбонат/бикарбонатном буфере, рН 9,5, (10 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 4°С, затем в лунки вносили по 100 мкл смеси, содержащей 1% БСА и 5% лошадиной сыворотки в ФСБ и инкубировали еще 2 ч при 4°С. Между стадиями планшет промывали 5 раз ФСБ, затем 5 раз ФСБ с 0,1%Твин -20. 1012 к.о.е. фагмидной библиотеки в объеме 100 мкл инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с биотинилированным G-CSF (био-G-CSF) в концентрации 2 мкг/мл для первого раунда, 200 нг/мл, 100 нг/мл и 10 нг/мл для второго, третьего и четвертого, соответственно. Смесь, содержащую прединкубированные с био-G-CSF scFv-фагмидные частицы, вносили в лунки планшета с иммобилизованным стрептавидином и оставляли при комнатной температуре на 1 ч при умеренном перемешивании на орбитальном шейкере. С целью удаления неспецифически сорбировавшихся фагмидных частиц после инкубации планшет промывали как описано выше. Для диссоциации комплекса стрептавидин / био-G-CSF / scFv в лунки добавляли по

100 мкл 0,2 М глицин-HCl буфера, рН 2,0, инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, после чего содержимое лунок переносили в пробирку и немедленно нейтрализовали добавлением 1/12 объема 1М Триса. К полученному элюату добавляли 400 мкл суспензии клеток E.coli TGI, находящихся в экспоненциальной фазе роста. Смесь инкубировали 1 ч при 37°С, после чего ею иннокулировали 200 мл среды 2хУТ с 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Культуру растили в течение ночи при 37°С и интенсивной аэрации. После этого выделяли фагмидные частицы, которые использовали для последующих циклов аффинной селекции.

Для поиска клонов, специфичных к линейным эпитопам G-CSF, антиген (G-CSF) предварительно денатурировали нагреванием в присутствии 1% SDS и ЮмМ меркаптоэтанола, затем разбавляли в 10 раз и иммобилизовывали на нитроцеллюлозном диске. Места неспецифической сорбции блокировали 1% БСА. Инкубацию с библиотекой scFv и все дальнейшие процедуры проводили так же, как для нативного GCSF.

3.13. ПЕРВИЧНЫЙ АНАЛИЗ СЕЛЕКТИРОВАННОЙ БИБЛИОТЕКИ МЕТОДОМ

ИММУНОСКРИНИНГА НА ЧАШКАХ.

Вариант 1: Клетки E.coli, инфицированные фагмидными частицами, выделенными после четвертого раунда иммуноселекции, высевали на чашки Петри с агаризованной средой 2xYT, содержащей 100мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, и инкубировали в течение ночи при 30°С. После подсчета числа выросших колоний с чашек снимали реплики на нитроцеллюлозные фильтры. Фильтры перекладывали на поверхность среды 2xYT, содержащей 1мМ IPTG, и инкубировали 2 ч при 30°С. Фильтры-реплики отмывали от клеток E.coli 5 раз буфером ТСБ-Т (20мМ Трис-НС1 рН=7,5, 150мМ NaCl, 0,1%Твин-20), затем помещали на 30 мин в раствор, содержащий 1% БСА и 5% лошадиной сыворотки в буфере ТСБ-Т. После этого фильтры инкубировали 15 мин при комнатной температуре в ТСБ-Т с биотинилированным антигеном (20 нг/мл).

После пятикратной отмывки буфером ТСБ-Т по 15 мин фильтры инкубировали в ТСБ-Т со стрептавидин-фосфатазным конъюгатом (Amersham, Англия, рабочее разведение 1:3000) 30 мин при комнатной температуре. Последующие обработки велись согласно инструкции фирмы производителя. Колонии, дающие наиболее выраженный сигнал, были отобраны для дальнейшего анализа.

Вариант 2: Отличается от варианта 1 тем, что нитроцеллюлозные фильтры, прежде чем накладывать на чашки с колониями Е. coli сенсибилизировали MA 9Е10, реагирующими с тус-последовательностыо, расположенной в С-концевой области scFv, и блокировали свободные участки инертным белком (БСА или желатином). Детекцию в этом случае осуществляли при помощи биотинилированного антигена и стрептавидин-фосфатазного конъюгата, как и в первом варианте.

3.14. КЛОНИРОВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ АНТИГЕННУЮ ДЕТЕРМИНАНТУ IL2 ДЛЯ АНТИТЕЛ ЛНКБ-2.

Адаптор IL2 получали в результате гибридизации праймеров IL-sense и IL-anti-sense при температуре 55°С в течение 10 мин. Фагмиды, отобранные после первичного анализа, были гидролизованы с помощью Notl и лигированы с адаптером IL2. Полученной ДНК трансформировали клетки E.coli BL21 и отбирали по 10 клонов для дальнейшего анализа. Каждой из 10 колоний иннокулировали 1 мл среды 2xYT и растили при 30°С в присутствии 100 мкг/мл ампициллина и 1мМ IPTG в течение 16 ч. Клетки осаждали центрифугированием, а супернатант использовали для ИФА с антителами ЛНКБ-2.

3.15. СИНТЕЗ КОНЪЮГАТА БИОТИНА С ТРАНС-ЗЕАТИНОМ.

Зеатинрибозид окисляли периодатом натрия; для этого навеску транс-зеатинрибозида (0,8 г) растворяли в 200мкл 0,1М водного раствора NaI04 и через 2 ч добавляли 15 мкл этиленгликоля. К раствору окисленного зеатинрибозида добавляли 15 мкл 1М раствора карбоната натрия (рН 9.0) и 2.4 мг биотингидразида (3 эквивалента по отношению к исходному зеатинрибозиду). Реакционную смесь оставляли на 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляли 300 мкл 0,4 М раствора NaBH4 для восстановления продукта конденсации биотингидразида и зеатинрибозида. Восстановление вели в течение 4 ч при комнатной температуре, после чего добавляли 60 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 5,0), а еще через 10 минут рН реакционной смеси доводили до 7,0 добавлением 1 М раствора аммиака. После этого реакционную смесь упаривали в роторном испарителе до маслообразного состояния и анализировали с помощью ТСХ на пластинках Kieselgel 60 F254 в системе метанол-.хлороформ (20:80). Оптимальное соотношение растворителей подбирали опытным путем. Конечный продукт конденсации и восстановления имел Rf = 0,43 в системе метанол:хлороформ (20:80). Продукт конденсации (биотин-зеатинрибозид) выделяли после разделения компонентов реакционной смеси препаративной ТСХ в системе метанол:хлороформ (20:80) путем соскабливания носителя в зоне, соответствующей Rf = 0,43 и многократной экстракции смесью метанол-хлороформ (1:1), а затем этанолом. Все фракции объединяли и высушивали. Для дальнейшего использования готовили маточный раствор в 50 % этаноле с концентрацией 10 мг/мл.

3.16. СИНТЕЗ КОНЪЮГАТОВ ЗЕАТИНРИБОЗИДА С BSA, ОВАЛЬБУМИНОМ И

АМИНОГЕКСИЛСЕФАРОЗОЙ.

Окисление зеатинрибозида периодатом натрия проводили так же, как и в предыдущей методике. 1,7 мкмоль БСА (115 мг) или овальбумина (60 мг) растворяли в 5 мл НгО, рН раствора доводили до 9,0 добавлением 5% раствора К2СО3 (120ц1). К полученному раствору белка добавляли 5 мл 3 мМ раствора окисленного зеатинрибозида и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляли боргидрид натрия

100 мкл 0,4 М раствора) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Полученный конъюгат диализовали против ФСБ, затем к нему добавляли глицерин до конечной концентрации 20% и хранили при -20°С. Для получения конъюгата зеатинрибозида с аминогексилсефарозой 5 г аминогексилсефарозоы (Pharmacia) суспендировали в 5 мл НгО, далее синтез конъюгата проводили так же, как описано выше.

3.17. СЕЛЕКЦИЯ КЛОНОВ СПЕЦИФИЧНЫХ К ТРАНС-ЗЕАТИНУ.

Селекцию осуществляли так же, как для поиска миниантител к G-CSF. В качестве антигена на разных этапах селекции использовали конъюгаты зеатинрибозида с БСА, овальбумином или сефарозой. Инкубацию библиотеки scFv с антигеном в форме конъюгатов с различными носителями всегда проводили в присутствии БСА (1 мг/мл) и овальбумина (1 мг/мл). В качестве антигена для тестирования клонов использовали зеатин-рибозид-овальбумин.

3.18. ВЫДЕЛЕНИЕ СЕКРЕТИРУЕМЫХ МИНИАНТИТЕЛ МЕТОДОМ ИММУНОАФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

Для выделения антител, секретируемых клетками в культуральную среду, отобранными фагмидными частицами инфицировали штамм E.coli BL21, который не несет мутации supE. Трансформированные клетки выращивали в 100 мл среды 2xYT в течение ночи при 30°С в присутствии 100 мкг/мл ампициллина и 1мМ IPTG, осаждали центрифугированием, а супернатанты концентрировали в 10 раз при помощи концентрирующей ячейки Amicon с использованием мембраны YM 10. Дальнейшую очистку проводили путем иммуноаффинной хроматографии на Sepharose 4B-CL с иммобилизованными антителами 9Е10 либо ЛНКБ2. Иммуноаффинный сорбент готовили по стандартной методике, включающей стадию активации сефарозы BrCN [Дин, 1988]. Емкость синтезированного аффинного сорбента была 2 мг Ig (9Е10 или ЛНКБ-2)/мл.

Сконцентрированный культуральный супернатант пропускали через колонку, содержащую 2 мл аффинного сорбента. Для удаления неспецифически сорбировавшихся белков колонку промывали 1 М NaCl. Элюцию миниантител с аффинной колонки осуществляли 8М мочевиной.

3.19. ВЫДЕЛЕНИЕ СЕКРЕТИРУЕМЫХ МИНИАНТИТЕЛ МЕТОДОМ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

Альтернативный способ выделения миниантител включал ионообменную хроматографию на колонке MonoQ с использованием FPLC. При этом сконцентрированный культуральный супернатант предварительно диализовали против буфера А (20 мМ натрий-фосфатный буфер или 20 мМ MOPS, рН 6,5). Элюцию миниантител с колонки осуществляли градиентом концентрации NaCl от 0 до 1 М. Степень очистки миниантител оценивали по результатам электрофореза и Western-blot-анализа, которые проводили с использованием MA 9Е10 по общепринятой методике [Beisiegel, 1986].

3.20. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ АФФИННОСТИ МИНИАНТИТЕЛ.

Константы аффинности определяли по методу, предложенному Beatty [Beatty, 1987] с использованием непрямого ИФА. Иммуноферментный анализ проводили по следующей схеме. Периплазменный экстракт, содержащий секретируемые миниантитела, вносили в лунки иммунопланшета по 100 мкл в концентрациях 10 мкг/мл суммарного белка, 5 мкг/мл и 2,5 мкг/мл, при этом по данным электрофоретического анализа содержание миниантител в экстракте составляло примерно 20% от общего количества белка. Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем, для блокирования свободных участков связывания, в лунки вносили 1% раствор БСА, приготовленный на ФСБ, и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После этого в лунки вносили в двоичных разведениях биотинилированный антиген. Между стадиями лунки отмывали пять раз ФСБ-Т. Количественную оценку связавшегося антигена проводили после взаимодействия со стрептавидин-пероксидазным конъюгатом по данным фотометрического анализа образования окрашенного продукта окисления OPD. Для вычисления констант аффинности строили графики титрования, где по оси абсцисс откладывали значения -^гСразведения биотинилированного антигена), а по оси ординат величину оптической плотности при Х=492нм. Расчет проводили по формуле: Ка=1/(2[Лг']-[Лг]), где [Аг] - концентрация антигена, соответствующая точке перегиба на кривой титрования при концентрации антител Со, [Аг'] - концентрация антигена, соответствующая точке перегиба на кривой титрования при концентрации антител Со/2.

1. Дин П., Джонсон У., Мидл. Ф. Аффинная хроматография. Методы: Пер. с англ. М.: Мир, 1988. (P.D.G .Dean, W.S.Johnson and F.A.Middle. Affinity chromatography. IRL Press, Oxford-Washington DC, 1985).

2. Клаус Г.Г.Б. Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. М.: Мир, 1990. {Klaus G.G.B. Lymphocytes: A practical approach. National Institute for Medical Research, UK, 1987).

3. Маниатис Т., Фритч И., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. (Maniatis Т., Fritsch Е.Е., Sambrook J. Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

4. Al-Lazikani, В., Lesk, A.M., and Chothia, C. Standart conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J. Mol. Biol., 1997, vol. 273, pp. 927-948.

5. Altenschmidt, U., Schmidt, M., Groner, B. & Wells, W. Targeted therapy of schwannoma cells in immunocompetent rats with anerb2-specific antibody toxin. Int. J. Cancer, 1997, vol. 73, pp. 117-124.

6. Ayala, M., Duenas, M., Santos, A., Vazquez, J., Menendez, A., Silva, A. and Gavilondo, J.V. Bacterial single chain antibody fragments, specific for carcinoembryonic antigen. BioTechniques, 1992, vol. 13, pp. 790-799.

7. Barbas, C.F., Bain, J.D., Hoekstra, D.M. & Lerner, R.A. Semisynthetic combinatorial antibody libraries: a chemical solution to the diversity problem. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, pp. 4457-4461.

8. Barbas, C.F., Amberg, W„ Simoncsits, A., Jones, T.M. & Lerner, R.A. Selection of human anti-hapten antibodies from semi-synthetic libraries. Gene, 1993, vol. 137, pp. 57-62.

9. Beaty, J.D., Beaty, B.G., & Vlahos, W.G. J. Immunol. Meth., 1987, vol. 100, pp. 173-179.

10. Beisiegel, U. Protein blotting. Electrophoresis, 1986, vol.7, pp. 1-18.

11. Barbie, V. & Lefranc, M.P. The human immunoglobulin kappa variable (IGKV) genes and joining (IGK) segments. Exp. Clin. Immunogenet., 1998, vol. 15, pp. 171-183.

12. Becerril, B. Poul, M. &Marks, J.D. Toward selection of internalizing antibodies from phage display. Biochem. AndBiophys. Res. Com., 1999. vol. 225, pp. 386-393.

13. Berkover, I., The promise and pitfalls of monoclonal antibody terapeutics. Curr. Opin. Biotechnol., 1996, vol. 7, pp. 622-628.

14. Better, M., Chang C.P., Robinson R.R. and Horwitz A.H. Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody fragment. Science, 1988, vol. 240, pp. 1041-1043.

15. Betz, A.G., Neuberger, M.S. & Milstein, C. Determination intrinsic and antigen-selected mutational horspots in immunoglobulin genes. Immunol.Today, 1993, vol. 14, pp. 405-411.

16. Bird, R.E., Hardman, K.D., Jacobson, J.W., Johnson, S., Kaufman, B.M., Lee, S.-M., Lee, Т., Pope, S.H., Riordan, G.S. and Whillow, M. Single chain antigen binding proteins. Science 1998, vol. 242, pp. 423-426.

17. Bouanani, M., Bataille, R., Piechachaczyk, M., Salhy, S.L., Pau, В., & Bastide, M. Autoimmunity to human thyroglobulin-respective epitopic specificity patterns of antihuman. Artritis Rheumatol, 1991, vol. 34, pp. 1585-1593.

18. Boulianne, G.L., Hozumi, N. and Shulman, M.J. Production of functional chimeric mouse/human antibodies. Nature, 1984, vol. 312, pp. 643-646.

19. Brissette, J.L., Rassel, M. Secretion and membrane integration of a filamentous phage, encoded morphogenetic protein. J.Mol Biol., 1990, vol. 211, pp. 565-580.

20. Buchner, J. and Rudolph, R. Renaturation, purification, and characterization of recombinant Fab-fragments produced in Escherichia coli. Bio/Technology, 1991, vol. 9, pp. 157-161.

21. Caroll, W.L., Mendel, E. and Levy, S. Hybridoma fusion cell lines contain an aberrant kappa transcript. Mol Immunol, 1988, vol. 25, pp. 991-995.

22. Chothia, С & Lesk, A.M. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, pp. 901-917.

23. Chothia, C., Lesk, A.M., Gherardi, E.M., Walter, G., Marks, J.D., Llewelyn, M.B & Winter, G. Structural repertoire of the human VH segments. J. Mol. Biol., 1992, vol. 227, pp. 799-817.

24. Chothia, C., Gelfand, I. and Kister, A. Structural determinants in the sequences of immuniglobulin variable domain. J. Mol. Biol, 1998, vol. 278, pp. 457-479.

25. Clackson, Т., Hoogenboom, H.R., Griffits, A.D. & Winter, G. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature, 1991, vol. 352, pp. 624-628.

26. Clackson, T. & Wells, J.A. In vitro selection from protein and peptide libraries. TIBTECH., 1994, vol. 12, pp. 173-184.

27. Cox, J.P., Tomplinson, I.M. & Winter, G. A directory of human germ-line V kappa segments reveals a strong bias in their usage. Eur. J. Immunol, 1994, vol. 24, pp. 827-836.

28. Cteven, С. Clark & Robert Kamen. Science. 1987, vol. 236, pp. 1229-1236.

29. Davis, N.G., Boeke, J.D. &Model, P. Fine structure of membrane anchor domain. J. Mol Biol, 1985, vol. 181, pp. 111-121.

30. Deng, S.J., C.R. MacKenzie, J. Sadowska, J. Michnievicz, N.M. Young, D.R. Bundle and S.A. Narang. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J. Biol Chem., 1994, vol. 269, pp. 9533-9538.

31. Duenas, M., Ayala, M., Vazquez, J., Ohlin, M., Soderlind, E., Borrebaeck, C.A.K. & Gavilondo, J. A point mutation in a murine immunoglobulin V-region strongly influences the antibody yield in Escherichia coli. Gene, 1995, vol. 158, pp. 61-66.

32. Dunker, A.K., Ensing, L.D., Arnold, G.E. & Roberts, L.M. A model for fd phage penetration and assembly. FEBS Lett., 1999, vol. 292, No 1,2, pp. 271-274.

33. Emery, S.C. & Harris, W.J. Strategies for humanizing antibodies. In C.A.K. Borrebaeck (Ed.), Antibody Engineering, Oxford University Press, New York. 1995, pp. 159-183.

34. Fominaya, J. & Wels, W. J. Biol Chem., 1996, vol. 271, pp. 10560-10568.

35. Gao, С., Mao, S., Lo, C.-H. L., Wursching, R. & Lerner A.R. Making artificial antibodies: A format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, vol 96, pp. 6025-6030.

36. Glockshuber, R., Malia, M., Pfitzinger, I. & Pliickthun, A. A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv fragments. Biochemistry, 1990, vol. 29, pp. 1362-1367.

37. Grabher R., & Ernst, W. The baculovirus expression system as a tool for generation diversity by viral surface display. Comb. Chem. High Throughput Screen, 2001, vol. 4, No 1, pp. 185-192.

38. Gray, C.W. Three-dimensional structure of complexes of single-stranded DNA-binding proteins with DNA. Ike and fd gene 5 proteins from left-handed helices with single-stranded DNA. J. Mol. Biol, 1989, vol. 208, pp. 57-64.

39. Guy-Caffey, J.K., Rapoza, M.P., Jolley, K.A., & Webster, R.E. Membrane localization of a viral assembly protein. J. Bacteriol, 1992, vol. 174, pp. 2460-2465.

40. Guy-Caffey, J.K., & Webster, R.E. The membrane domain of a bacteriophage assembly protein: membrane insertion and growth inhibition. J. Biol. Chem., 1993, vol. 268, pp. 5496-5503.

41. Hendricks, M.B., Luchette, C.A, & Banker, M.J. Enhanced expression of an immunoglobulin-based vector in myeloma cells mediated by co-amplification with a mutant dihydrofolate reductase gene. Bio/Technology, 1989, vol. 7, pp. 1271-1274.

42. Henes, J., Jermutus, L., Weber-Bornhauser, S., Bosshard, H.R., & Pluckthun, A. Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95, pp. 14130-14235.

43. Hill, D.F. & Petersen, G.B. Nucleotide sequence of bacteriophages fl DNA. J. Virol., 1982, vol. 44, pp. 32-46.

44. Hoogenboom, H.R., Griffith, A.D., Jonson, K. S., Chiswell D.J., Hudson, P. & Winter, G. Multi-subunit proteins of filamentous phage: Methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Asids Res., 1991, vol. 19, pp. 4133-4137.

45. Horabin, J.L. & Webster, R.E. An amino acid sequence with directs membrane insertion causes loss of membrane potential. J. Biol Chem., 1988, vol. 263, pp. 11575-11583.

46. Horwitz, A.H., Chang, C.P., Better, M., Hellstrom, K.E. & Robinson, R.R. Secretion of functional antibody and Fab fragments from yeast cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, pp. 8678-8682.

47. Kelley, R.F. & O'Cornell, M.P. Thermodynamic analysis of an antibody functional epitope.

48. J. Immunother., 1994, vol. 15, pp. 42-52. Kirpotin, D., Park, J., Hong, K., Zalipsky, S., Li, W., Capter, P., Benz, C. & Papahadjopoulos, D.

49. Biochemistry, 1997, vol. 36, pp. 66-75. Kischenko, G., Batliwala, H. & Makowsky, L. Structure of foreign peptide, displayed on the surface of bacteriophage M13 .J. Mol. Biol., 1994, vol. 241, pp. 208-213.

50. Knappik, A. & Pliickthun, A. Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding. Protein Eng., 1995, vol. 8, pp. 81-89.

51. Kohler, G. & Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975, vol. 256, pp. 52-53.

52. Kreber, C., Spada, S., Desplancq, D., Kreber, A., Ge, L. & Pliickthun, A. Selectively-infective phage (SIP): A mechanistic dissection of a novel in vivo selection for protein-ligand interactions. J. Mol. Biol, 1997, vol. 268, pp. 607-618.

53. Makowski, L. Structural constraints on the display of foreign peptides on filamentous bacteriophages. Gene, 1993, vol. 128, pp. 5-11.

54. Marks, J.D., Griffiths, A.D., Malmqvist, M., Clackson, T.P., Bye, J.M. & Winter, G. By-passing immunization; building high affinity human antibodies by chain shuffling. Biotechnology (NY), 1992, vol. 10, pp. 779-783.

55. Marlow, KJ. Advanced recombinant Therapies. Range of diseases respond to recombinant antibodies. Genetic Engineering News, 2001, vol. 21(17):1, pp. 38-39, 89-90.

56. Maruyama, N., Maruyama, H. & Brenner, S. A Afoo phage vector for the expression of foreign proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, vol. 91, pp. 8273-8277.

57. Marvin, D.A., Hale, R.D., Nave, C. & Helmer Citterich, M. Molecular modes and structural comparison of native and mutant class I bacteriophages. J. Mol. Biol, 1994, vol. 235, pp. 260286.

58. Mateo, C., Moreno, E., Amour, K., Lombardero, J., Harris, W. & Perez, R. Humanization of a mouse monoclonal antibody that blocks the epidermal growth factor receptor: recovery of antagonistic activity. Immunotechnol, 1997, vol. 3, pp. 71-81.

59. Matsuda, F. & Honjo, T. Organization of the human immunoglobulin heavy-chain locus. Advan. Immunol, 1996, vol. 62, pp. 1-29.

60. McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. & Chiswell, D. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature, 1990, vol. 348, pp. 552-554.

61. Morrison, S.L., Johnson, M.J., Herzenberg, L.A. & Oi, V.T. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen binding domains. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, vol. 82, pp. 6851-6855.

62. Morrison, S.L. Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science, 1985, vol. 229, pp. 12021207.

63. Neuberger, M.S., Williams, G.T. & Fox, R.O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature, 1984, vol. 312, pp. 604-608.

64. Niwa, M., Maruyama, H., Fujimoto, Т., Dohi, K. & Maruyama, N. Affinity selection of cDNA libraries by lambda phage surface display. Gene, 2000, vol. 256, No 1-2, pp. 229-236.

65. Novotny, J., Bruccoleri, R.E. & Saul, F.A. On the attribution of binding energy in antigen-antibody complexes McPC 603, D1.3, and HyHEL-5. Biochemistry, 1989, vol. 28, pp. 4735-4749.

66. Oh. J., Davies, D.R., Lawson J., Arnold, G.E. & Dunker, A.K. Isolation of chloroform-resistent mutants of filamentous phage: localization in models of phage structure. J. Mol. Biol., 1999, vol. 287, pp.449-457.

67. Orlandi, R., Gussow, D.H., Jones, P.T. & Winter, G. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1989, vol. 86, pp. 3833-3837.

68. Pallares, N., Frippiat, J.P., Giudicelli, V. & Lefranc, M.P. The human immunoglobulin lambda variable (IGLV) genes and joining (IGLJ) segments. Exp. Clin. Immunogenet., 1998, vol. 15, pp. 8-18.

69. Parmley, S.F. and Smith, G.P. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene, 1988, vol. 73, pp. 305-318.

70. Pasqualini, R., Koivunen, E & Ruoslanti, E. Alfa-v-integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands. Nature, 1997, vol. 15, pp. 542-546.

71. Reff, M.E. High-level production of recombinant immunoglobulins in mammalian cells. Curr.

72. Opin. Biotechnol, 1993, vol. 4, pp. 573-576. Reiter, Y., Brinkmann, U., Lee, B. & Pastan, I. Engineering antibody Fv fragments for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. Nat. Biotechnol, 1996, vol. 14, pp. 1239-1245.

73. Schier, R., Bye, J., Apell, G., McCall, A., Adams, G.P., Malmqvist, M., Weiner, L.M. & Marks, J.D. Isolation of high-affinity monomeric human anti-c-erbb-2 single chain Fv using affinity-driven selection. J. Mol. Biol, 1996(a), vol. 255, pp. 28-43.

74. Schier, R., Balint, R.F., McCall, A., Apell, G., Larrick, J.W. & Marks, J.D. Identification of functional and structural amino acid residues by parsimonious mutagenesis. Gene, 1996, vol. 169, pp. 147-155.

75. Scott, J.K. & Smith, G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. Scince, 1990, vol. 249(4967), pp. 386-390.

76. Sidhu, S.S., Weiss, G.A. & Wells, J.A. High copy display of proteins on phage for functional selections. J. Mol Biol, 2000, vol. 286, No 2, pp. 487-495.

77. Skerra, A., I. Pfitzinger and A. Pltickthun. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli: Scince, 1988, vol. 240, pp.1028-1041.

78. Sieber, V., Pltickthun, A. & Schmid, F. Selectin proteins with improved stability by phage based method. Nature Biotechnol, 1998, vol. 16, pp. 955-960.

79. Simons, G.F.M., Konings, R.N.H. & Shoenmarkers, J.G.G. Genes VI, VII and genes IX of M13 code for minor capsid proteins of the virion. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1981, vol. 78, p. 41944198.

80. Sokoloff, A.V., Bock, I., Zhang, G., Sebestyen, M.G. & Wolff, J.A. The interaction of peptides with the innate immune system studied with use of T7 phage peptide display. Mol. Therapy, 2000, vol. 2, No2, pp. 131-139.

81. Soumillion, P., Jaspers, L., Bouchet, S., Marchland-Brynaert, J., Winter, G. & Festrez, J. Selection of (5-lactamase on filamentous bacteriophage by catalytic activity. J. Mol Biol., 1994, vol. 237, pp. 415-422.

82. Sternberg, N. & Hoes, R. Display of peptides and proteins on the surface of bacteriophage X. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995, vol. 92, pp. 1609-1613.

83. Thompson, K.M. Human monoclonal antibodies. Immunol. Today, 1988, vol. 9, pp. 113-117.

84. Tomlinson, I.M., Walter, G., Marks, J.D., Llewelyn, M.B. & Winter, G. The repertoire of hnman germline VH sequences reveals about 50 groups of VH segments with different hypervariable loops. J. Mol. Biol., 1992, vol. 227, pp. 776-698.

85. Tomlinson, I.M., Cox, J.P., Gherardi, E., Lesk, A.M. & Chothia, C. The structural repertoire of the human V kappa domain. EMBOJ., 1995, vol. 14, pp. 4628-4638.

86. Tomlinson, I.M., Walter, G., Jones, P.T., Dear, P.H., Sonnhammer, E.L.L. & Winter,G. The imprint of somatic hypermutation on the repertoire of human germline V genes. J. Mol. Biol., 1996, vol. 256, pp.813-817.

87. Ulrich, H.D., Patten, P.A., Yang, P.L., Romesberg, F.E. & Schultz, P.G. Expression studies of catalitic antibodies. Proc. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, pp. 11970-11911.

88. Yamamoto, M., Kominato, Y & Yamamoto, F. Phage display cDNA cloning of protein with carbohydrate activity. Biochem. And Biophys. Res. Com., 1999, vol. 255, pp. 194-199.

89. Virnekas, В., Ge, L., Plukthun, A., Schneider, К. C., Wellnhofer, G. & Moroney, S. E. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl Acids Res., 1994, vol. 22, pp. 5600-5607.

90. Wagner, S.D., Milstein, С. & Neuberger, M.S. Codon bias targets mutation. Nature, 1995, vol. 376, pp. 732.

91. Williams, S. C., Frippiat, J.P., Tomlinson, I. M., Ignatovich, 0., Lefranc, M. P. & Winter, G. Sequence and evolution of the human germline V-lambda repertoire. J. Mol. Biol., 1996, vol. 264, pp. 220-232.